Каталитический синтез углеводородов и кислородсодержащих соединений из СО и Н2 на полиферментной системе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА. ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. Н.Д.ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

КИЯШКО СТАНИСЛАВ ВЕНИАМИНОВИЧ

КАТАЛИТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ УГЛЕВОДОРОДОВ И КИСЛОРОДСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ КЗ СО И Н2 НА ПОЛИФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЕ.

02.00.03 - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории метаболизма анаэробных бакте Института биологии Казанского научного центра РАН и лаборат каталитических реакций окислов углерода Института органичес химии ии. Н.Д.Зелинского РАН

Научные руководители: доктор-химических наук,

профессор Лапидус А.Л.

кандидат химических наук, ст.н.с. Мухитова Ф.К.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук Веденяшш А»А.

Доктор химических наук, профессор Варфоломеев С

Институт нефтехимического синтеза им.А.В.Топчиева Р.

Защита диссертации состоится "п 1992 г.

в ¿О часов на заседании Специализированного Совета К 002.6; по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН по адре< 117913, Москва, Ленинский проспект, 4-7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН.

Автореферат разослан " » 1992 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук —- Т.В.Васина

I. Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Соотношение мировых запасов нефти и угля как основных источников углеводородного сырья позволяет считать весьма важной роль угля в топливно-энергетическом балансе страны. Основным продуктом газификации углей, сланцев и других твердых углеродсодержа-щих материалов является смесь оксида углерода и водорода. Синтезы органических соединений на основе этой смеси (синтез-газа) перспективны для замены нефтяного сырья на нетрадиционное. Реализация таких синтезов важна также для решения ряда экологических проблем, связанных с загрязнением воздушного бассейна отходами химических, нефтехимических и металлургических производств.

Основной задачей в развитии синтеза Фишера-Тропша является создание новых высокоактивных и селективных катализаторов.

Одним из направлений поиска таких катализаторов может быть применение микроорганизмов для конверсии оксида углерода в органические соединения. Имеются сообщения о возможности синтеза метана из СО и Н2 биологическими системами.

Преимуществом биокатализаторов го сравнению с традиционными каталитическими системами являются их высокая селективность и активность в мягких условиях. Эти катализаторы уже нашли применение при осуществлении некоторых химических процессов. Однако, сведений о возможности их использования в синтезе жидких углеводородов из СО и И^ к началу нашего исследования практически не было.

Целью работы явилось изучение процесса синтеза углеводородов и кислородсодержащих соединений из оксида углерода и водорода при катализе ферментными системами о. йези1Гиг±сапз шт.2198: изучение влияния условий осуществления синтеза на его основные показатели, изучение некоторых аспектов механизма процесса.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые для одновременного синтеза углеводородов и кислородсодержащих соединений из оксида углерода и водорода применена ферментная система, полученная на основе анаэробных микроорганизмов. Показано, что рН реакционной среды, температура,давление и состав исходного газа влияют на выходы и состав продуктов синтеза.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии в клетках и. е!е-эи1Гиг!сапэ шт.2198 ферментных систем, способных строить жидкие углеводороды Сд-С24 03 фрагментов Ср Эти данные представляют интерес для выяснения возможной роли сульфатредуцирущих бактерий в образовании

углеводородов из оксида углерода в природе. Кроме того, протекающий i мягких условиях синтез углеводородов и кислородсодержащих соединена! из СО и Hg является удобным способом получения компонентов моторнш тошшв на основе угля, природного газа, выбросов промышленных производств.

Поскольку клетки d. desuifuricans шт.2198 содержат высокоактивные гидрогеназы, данные по кинетическим свойствам этих ферментов важны для специалистов,использующих эти гидрогеназы в биотехнологических процессах.

Апробация работы. Отдельные результаты работы докладывались на v и vi конференциях молодых ученых КИБ РАН (Казань, 1986,1988), Всесоюзных конференциях "Химический синтез на основе Сj-молекул" (Москва, 1987, 1991), v Всесоюзной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа"(Москва, 1987), vi и vii Международных симпозиумах по связи между гомогенным и гетерогенным катализом (Пиза,Италия, 1989, Токио, Япония, 1992), iv и v Всесоюзных конференциях по механизму каталитических реакций (Москва, 1987, 1990).

Публикации. По полученным результатам опубликовано 13 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на чь стр. машинописного текста, содержит Д табл. и 25_ рис. Список цитированной литературы включает 227 наименований. Работа состоит из введения, шести глав, выводов и списка цитированной литературы.

В главе I приведены литературные сведения о механизмах активации СО и синтеза Фишера-Тропша. В главе 2 приведены литературные сведения о продуктах микробиологического восстановления оксида углерода и об основных механизмах этого процесса. В главе 3 изложены методики приготовления биокатализатора, проведения экспериментов, анализа исходных веществ и продуктов синтеза, математической обработки экспериментальных данных. В главах 4-6 приведены экспериментальные данные и обсуждены полученные результаты.

II. Объекты и методы исследования.

Приготовление биокатализатора. Для приготовления биокатализатора ИСПОЛЬЗОВаЛИ сульфатредуцирущую бактерию Desulfovibrio desuifuricans шт.2198 (Ин-т микробиологии РАН). Бактерии выращивали в анаэробных условиях при соблюдении правил стерильности. Клетки собирали центрифугированием и разрушали ультразвуковым дезинтегратором УЗДН-2Т. Суспензию центрифугировали, в качестве биокатвлизатора использовали надосадочную

жидкость.

Проведение реакции. В пенициллиновые флаконы вносила по 2мл 0.05М Tris-Hci буфера рН 8.0-8.5. Флаконы многократно ваккуумировали и продували смесью CO/Hg нужного состава. Реакцшо начинали введением биокатализатора до конечной концентрации 2-5 мг/мл. Для проведения реакции под давлением использовали автоклав емкостью 0.15 л, разработанный и изготовленный. СКВ ИОХ РАН.

Анализ продуктов реакции. Углеводороды из реакционной смеси экстрагировали хлороформом в течение 24 часов и анализировали с помощью хроматографа "СЬгож-З" на колонке 250 СМ С I00-I2G mesh Chromaton N + зу. Apieson l. Температура термостата 60 - 270°С, программа - Ю°/мин. Газ-носитель - гелий, 35 мл/мин, детектор пламенно-ионизационный, температура детектора - 210°, испарителя - 270°, расход Hg 20 мл/мин, воздуха - 200 мл/глин.

Кислородсодержащие продукты,содераацяеся в водной фазе,анализировала на ТОМ 2© приборе на колонке 120 СМ С 100-120 mesh Chromosorb-lOl + 4'л Reopiex—4оо. Температура термостата 80-210°, программа - Ю°/мин. Газ-носитель - гелий, 80 мл/мин, детектор пламенно-ионизационный, остальные параметры такие же.

Для анализа радиоактивных продуктов хлороформный экстракт отмывали водой и вносили в сцинтилляционные флаконы со сцинтилляционной жидкостью ЖС-I. Кислородсодержащие продукты анализировали в реакционной смеси после экстракции углеводородов в сцинтилляционной жидкости ЖС-7. Радиоактивность определяли на счетчике "Deita-зоо" фирмы "Тгасог

Analytic".

Выход продуктов выражали в микромолях в виде суммы концентраций продуктов, умноженных на число атомов углерода в их молекулах. УВ- выход углеводородов, КС - выход кислородсодержащих соединений, 0 - общий выход.

Математическая обработка. Подученные данные обрабатывали на микро-ЭВМ "Электроника-60" и ibm рс-ат/286 по специально разработанным программам, а также с использованием пакетов "statgraphics" и "harward

GRAPHICS".

Список сокращений. КС - кислородсодержащие продукты; УВ - углеводороды;

Ссо, ссоз - концентрация оксида углерода в газовой фазе; Скат - концентрация катализатора; r - коэффициент парной корреляции; сх - константа Андерсрна-Шульца-Флорн;

ву2+, ву+ - окисленная и восстановленная формы переносчика

электронов бензилвиологена; му2+. т+ - окисленная и восстановленная формы переносчика

электронов метилвиологена; е, г - биокатализатор (фермент).

III. Основные результаты.

I. Синтез углеводородов и кислородсодержащих соединений на ферментных системах о. аезии-ш^сапэ шт.2193.

В слабощелочных буферных растворах (рН=7.5 - 8.5), при комнатно! температуре и атмосферном давлении экстракты клеток о. аези^иг^сапэ шт.2198 катализируют синтез углеводородов и некоторых кислородсоде! жащих соединений из оксида углерода и молекулярного водорода. Продукт ми синтеза являются алифатические углеводороды С8 - линейного изо—строения, алифатические спирты: метанол, этанол, н- и изо- прош нол, а также уксусная кислота. Общий выход органических соединений в углероду составляет 6.6 мкмоль за два часа реакции.

При повышении рН от 6.5 до 7.8 общий выход органических соедине ний и выход углеводородов, изменяется мало (рис. I). При увеличении р от 7.8 до 9.0 общий выход продуктов и выход углеводородов возрастают два с половиной раза. Выход кислородсодержащих соединений мало завися от рН и лишь незначительно возрастает при увеличении рН от 7.8 до 8.2 Оптимум рН, наблвдаемый для процесса ферментативного синтеза органиче ских соединений из СО и Е^, соответствует условиям оптимального функ

Выход, мкмоль

4 -

3 -

2 -

1 -

6.5 7.0 7.3 8.0 8.3 9.0

Рис. I. Влияние рН на выход продуктов синтеза. — КС, -+- - УВ. -х— общий. Ссо=10%, Т=25°С, Р=атм, ъ=120мин.

20 30 4,0 30 60 70 80

Рис.2. Влияние температуры на выход продуктов синтеза.

-*- - КС, н--УВ, -х- - общий.

0^=1056, рН=8.2,Р=атмд=120мин.

цшнирования ферментов (гидрогеназ и СО-дегидрогеназы), по-видимому ответственных за активацию обоих субстратов.

Распределение продуктов синтеза по молекулярной массе не подчиняется уравнению Щульца-Флори \?п=п*ап_1*с1-со2, где уп - массовая доля продукта с числом атомов углерода п; <»=к /с^+к^ - константа Щульца-Флори. Поэтому коэффициент парной корреляции к, получаемый при регрессионном анализе молекулярно-массового распределения продуктов, не превышает 0.4. В составе кислородсодержащих продуктов в интервале рН 7.59.0 преобладает уксусная кислота. С ростом рН уменьшается соотношение н-/изо- углеводородов, что отражает увеличение выхода разветвленных молекул.

Выход углеводородов мало зависит от температуры синтеза, тогда как образование кислородсодержащих соединений зависит от этого параметра (Рис. 2). При повышении температуры от 20 до 40°С выход кислородсодержащих продуктов резко возрастает, главным образом, за счет образования уксусной кислоты. При дальнейшем росте температуры до 70° С выход кислородсодержащих соединений немного снижается. Таким образом, температурный оптимум синтеза органических соединений из СО и Н2 в присутствии полиферментной системы составляет 40-50°С.

Зависимость выхода органических соединений от давления газовой смеси СОЛЬ, приведена на рис. 3.

Выход кислородсодержащих соединений с ростом давления от атмосферного до 4 Ша колеблется мало, однако, при этом изменяется соотношение компонентов: возрастает выход спиртов и отношение спиртов к уксусной кислоте. Содержание спиртов в кислородсодержащих продуктах при 2.0 Ша достигает 70%.Выход углеводородов, а также о'бщий выход продуктов, при увеличении давления от атмосферного до 4.0 МПа проходит через

гвыжод, мкмоль Рис.з. Зависимость выхода

продуктов от давления. - КС, -+— УВ, -х— общий. СС0=Ю%, рН=8.2, Т=25°С, 1=120мин

Р.МПа

1.о г. о з. о 4.о 5. о е. о

максимум, соответствующий 3.0 Ша. при котором общий выход органичЕ ких соединений по углероду составляет 38.5 мкмоль, а производите, ность биокатализатора достигает 0.018 г/г катализатора/час. В этих j ловиях в продуктах реакции преобладают алифатические углеводорс (=70%), содержание изо- алканов в которых может достигать 70Ж. При повышении давления до 5.0 Ша происходит, вероятно, общее ингис рование полиферментной системы, либо ее компонентов, что приводит снижению выходов углеводородов.

Зависимость выхода продуктов ферментативного синтеза органичеи соединений из СО и Hg от концентрации оксида углерода в исходном г« приведена на рис. 4.

Выход, мкмоль

10..

8-.

X Рис.4. Зависимость выхода органических соединений от конце! * трации СО в синтез-газе

(00 + %)

со рН=8.2, Т=25°С, Р=атм, 1=120мин.

20 4,0 ВО 80 100 — КС, -н-— УВ, -х— общий.

При малых концентрациях оксида углерода в синтез-газе (=10 %) г блюдается наибольший выход органических соединений. Увеличение соде жания СО до 25-303! приводит к уменьшению выхода продуктов почти вдвс Дальнейший рост концентрации СО до 50 % приводит к некоторому увели* нию выхода продуктов. При концентрации СО около 80 % вновь уменьшает выход органических соединений. В отсутствие водорода в газовой фг синтез органических соединений не прекращается, а общий их выход ( ставляет более половины того, который отмечен при малых концентрац! СО.

Выход углеводородов изменяется с ростом концентрации СО симба' общему выходу.Зависимость выхода кислородсодержащих соединений от кс центрации СО имеет противоположный характер.

Анализ распределения продуктов синтеза по молекулярной массе I изменении концентрации СО показывает, что при малых концентрат оксида углерода экспериментальное распределение не соответствз уравнению Щульца-Флори (рис.5).

Рост концентрации СО приводит к повышению степени корреляции Э1 перимэнтального распределения с уравнением Щульца-Флори. При конце] рации оксида углерода выше 40 % коэффициент корреляции превышает ОЛ Это свидетельствует о преобладающем вкладе стадии прямого вклвзче]

фрагментов С^- (груш СНх и СОНу.) в растущую углеводородную цепь. При концентрации СО больше 70 % коэффициент корреляции приближается к единице, константа « при атом такта приближается к I. Тот факт, что механизм роста углеводородной цепи образующихся продуктов синтеза отра-

константа Шульца—$>лори 1. О- ■ коэффициент корреляции,

Рис.5. Молекулярно-массовое распределение продуктов синтеза из СО и

рН=8.2, Т=25°С, Р=атм,1=120мин. -•— константа Шульца-Флори, -+— коэффициент корреляции.

жается на их составе, свидетельствует, по-видимому, о том, что рост цепи - также медленная стадия, близкая по скорости к стадии генерации восстановителя, причем соотношение скоростей этих стадий зависит от условий синтеза.

Выше было показано (рис.4), что синтез возможен н в отсутствие водорода, за счет Еодорода, образующегося из вода при окислении СО. Поэтому было изучено влияние концентрации оксида углерода на синтез органических соединений из смеси со + аг при отсутствии водорода в газовой фазе (рис.6).

коэффициент корреляции 1 О-. ю1 вызгад углеводородов, мкмоль РИС.6. ВЛИЯНИЙ ."КОНЦвНТраЦИИ СО В

смеси СО + Аг'на выход углеводородов и коэффициент корреляции в отсутствии Ег,.

рН=8.2, Т=25°С, Р=атм, t=I20мин.

-*— выход углеводородов,

. . -(-— коэффициент корреляции, "со *

о. 8-о. 6+

о. 4-

6..

4- ■

о. 2-- 2--

/

А

20 40 60 80 100

Вид графиков зависимости выхода углеводородов от концентрации СО в отсутствие (рис.6) и в присутствии Н2 (рис.4), несколько отличен. В области низких концентраций СО в аргоне выход углеводородов значительно меньше, чем из смеси СО + Н2 при равной концентрации СО. Такой характер влияния водорода в газовой фазе свидетельствует, по-видимому, о том, что лимитирующей является стадия генерации восстановителя.

В присутствии водорода в газовой фазе возрастание коэффициен1 корреляции наступает значительно раньше, и уже после_соотношения СО:. =2:3 величина й меняется мало. Выход углеводородов возрастает толы при значении соотношения С0:Н^ более чем 9:1. Возможно, это обусловь но тем, что в качестве фрагментов С^ выступают только группы СЕ^.

Зависимость общего выхода продуктов синтеза от соотношения СО:] при росте давления от 0.5 до 5.0 МПа представлена на рис.7. При давле нии 1.0 - 5.0 МПа, увеличение соотношения С0:Но приводит к снижен] общего выхода продуктов синтеза. При давлении до 3.0 МПа минимум выхс да продуктов приходится на соотношение С0:В^1:2. При больших значеш ях соотношения СО:£¡2 общий выход продуктов синтеза несколько увелич! вается. Повышение давления до 4.0 - 5.0 МПа приводит к сдвигу минимум выхода продуктов до 60% СО. Наибольший выход органических соединен! наблвдается при концентрациях СО ЮЖ и 100%.

40- •

30-.

20-.

10-.

Выход общий, мкмоль

С '/i СО

+

О го 40 бО 80 1ÖO

Рис.7. Зависимость общего выхода органических соединений от концентрации СО при различных давлениях. рН=8.2,Т=25°С,t=120мин.

- 0.5 МПа, -1--2.0 МПа, -х- - 3.0 МПа, -о- - 5.0 МПа

Выход углвводородов зависит от соотношения C0:Hg аналогично об щему выходу продуктов синтеза. Для выхода кислородсодержащих сое дине ний наблвдается обратная картина. В составе углеводородов преобладаю разветвленные молекулы. При соотношении С0:1^>1:3 и давлениях выше 2. МПа содержание изо-алканов в углеводородах может достигать 95Ж. Макси мзльный выход линейных молекул составляет 60Ж при давлениях до 1.0 МП и соотношении 00:1^1:9.

Значительное влияние на состав и выход продуктов синтеза органи ческих соединений оказывает концентрация биокатализатора. Общий выхо, органических соединений имеет минимум, соответствущий концентраци 4.5 мг/мл. Производительность биокатализатора при этом уменьшается д< 0.005 г/г катализатора/час. Увеличение концентрации катализатора при

водят к резкому возрастанию выхода органических соединений (в восемь раз при двукратном увеличении концентрации катализатора). Производительность возрастает до 0.02 г/г к-ра/час.

2. Состав и некоторые свойства биокатализатора.

2.1. Состав биокатализатора.

Использованный в работе биокатализатор - гомогенная каталитическая система, основу которой составляют индивидуальные белки, либо полиферментные комплексы, в состав которых входят ионы металлов в той или иной форме. Для характеристики каталитической системы определяли количество грамм-ионов металлов на условный моль средней брутто-форму-лы экстракта (Табл. I).13

Таблица I.

Металлы, входящие в состав биокатализатора.

Металл Содержание, г-ион/моль

Мд Э.ОМО"43

Са 4.63x10"®

Ре 4.67хЮ"9

Мп 2.26х10~10

N1 2.11х10~10

Мо 8.58х10_11

В наибольшем количестве биокатализатор содержит кальций и магний, которые, как известно, участвуют во многих биохимических процессах. Из переходных металлов больше всего железа, которое, по данным литературы, может присутствовать в форме железо-серных кластеров, либо быть включенным в октаэдрические хелатные комплексы. Можно предположить, что именно железо, а также никель и марганец, в первую очередь ответственны за протекание синтеза углеводородов и кислородсодержащих продуктов из СО и Об их состоянии и функциях в биологических системах известно немного, однако, есть данные, что N1 и мо, наряду с железом, входят в состав СО-дегидрогеназ и гидрогеназ - ферментов, субстратами которых являются оксид углерода и водород соответственно.

Данные получены совместно с м.н.с. П.И.Слшяевым в ИОХ РАН.

Важные данные о строении биокатализатора могут быть получены . изучении реакций окисления Hg и его образования, которые протекают условиях реально осуществляемого процесса синтеза углеводородов и ки лородсодержащих соединений из СО и Hg на ферментной системе. Ниже пр ведены некоторые данные, полученные нами в этом направлении.

2.2. Активность биокатализатора в реакциях окисления -восстановления водорода.

Активность биокатализатора в реакциях окисления-восстановлен водорода изучают, как правило, в црисутствии искусственных переносч ков электронов, чаще всего, красителей метил- и бензилвиологена.

Температурный оптимум реакции окисления Hg составляет *80°С, во становления протонов воды - я£0°С. Оптимальный рН реакции окисления зависит от концентрации субстрата и соответствует значениям 7.3 и 8. Согласно литературным данным, это свидетельствует о присутствии в би катализаторе каталитических центров типа NiFeSe и Fe соответственно.

На рис. 8, приведено семейство кинетических кривых, описыващ зависимость скорости окисления молекулярного водорода от давлен последнего при разных концентрациях акцептора электронов. Из предста:

ЛеННЫХ ДаНННХ ВИДНО, ЧТО В*ЭКСТраКТе КЛеТОК D. desulfuricans шт.21

присутствуют одновременно два фермента, способных окислять молекуля; ный водород. Анализ экспериментальных данных привел к следующим кив тическим уравнениям:

9 р О

2к * с СА]

V,

М С1 + К2* СА]}2

1 + к_ саз = —5-

К1

для фермента, активного при малых концентрациях субстрата (ГГ1), ]

САЗ

К,

м

к. * с1 + к„сазэ

1 2

для фермента, активного при больших концентрациях субстрата (1Т2). Здесь ум - максимальная скорость ферментативной реакции из уравнения Михаэлиса-Ментен, Ку - константа Михаэлиса из того же уравнения:

VM * CS3 м

V - У0/[ Е] - - , - константа скорости связывание

км + с водорода с активным центром фермеь

к2- то же для переносчика электронов, саз - его концентрация, к'- ки

станта скорости, связанная с переносом электронов.

^ мкМ Н хмин 1*мг 1

с

400- -

300--

гоо-

юо-

5 Ю 15 го гз ЗО 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

Рис. 8. Зависимость скорости окисления водорода от его парциального давления при разных концентрациях акцептора электронов бензилвиологена. Т=30°С, Р=атм, рН=7.5

-•- -0.1 мМ ву2"1", -+- -0.5 ММ ву2*, -х- -1.0 мМ ву2*, -о- -2.0 мМ ву2* При ингибировании активности обеих гидрогеназ повышенной концентрацией субстрата величина Км перестает зависеть от концентрации акцептора электронов и становится равной к"1.

Кинетику образования водорода из воды при катализе гидрогеназами о^ези1Гиг1сап£: шт.2198 иллюстрирует семейство кинетических кривых на рис.9.

I. 5 3. О 3. 5 6. о 6. 5 7. О 7. 5 8. О

Рис.9. Зависимость скорости образования Н2 из воды от рН при разных концентрациях донора электронов му2*. Т=30°С, Р=атм. 0.2 мМ му2*"; -+- 0.6 мМ му2*; -х- 1.0 мМ му2+; -о- 2.0 мМ му2"1". Оптимум рН 5.6 относится к гидрогеназе с активным центром состава

Fes. Второй пик активности при рН 6.7, по нашему мнению, можно отнеси к гидрогеназе с каталитическим центром состава NiFeSe.

Анализ экспериментальных данных привел к следующим кинетически? уравнениям:

2к'* к| * САЗ2 С1 + КЕ* ГАЗЭ2

* CAI

для гвдрогеназы, активной при рН до 6.0 и

Kj* С1 + KgK [АЗЭ

при рН больше 6.0.

При интибировании цроцесса выделения водорода возрастащими количествами субстрата (протонов) величина Ку для обоих ферментов перестает зависеть от концентрации переносчика электронов и становится равной К^ На основании экспериментальных данных предложена обобщенная схема гид-рогеназвого катализа (схема 2.1.).

Окись углерода, являющаяся универсальным ингибитором щцрогеназ, оказывает значительное воздействие на скорость выделения водорода

а'еа'

ЕА*

2 2 е<-► еа«->а£а

Тк.

]К1 fi р •»■к + ки ■»•

.е«--»-» :

(рис.10)

н2е«--»-> hgea<-¿> hgeag

Н+А'ЕА'Н+<

Г1 г-

•еа'«->н+еа' +

IX Г

-» Е

Тк |

-2

—-» н+е

-1

н еа'н

-1 +

(2.1)

Рис.10. Влияние концентрации окиси углерода на скорость выделения Hg из HgO.

T=3Q°C, Р=атм, рН=7.5, Сму2+=100мИ.

20 40 бО 80 1СЮ

i

Скорость образования водорода из вода резко уменьшается в присутствии оксида углерода и при концентрации СО в газовой фазе, равной 30%, выделение водорода не обнаруживается вовсе. При дальнейшем увеличении концентрации СО наблюдается небольшой пик активности по выделению водорода с максимумом при 60% СО. При IC0S СО в газовой фазе обнаружено значительное количество водорода, что, по-видимому, не связано с высокой устойчивостью гидрогеназ к оксиду углерода. Вероятно, образование водорода в этих условиях связано с другим процессом, например, с окислением СО:

Е + СО -► Е*СО

Е*СО + ОН" -»>Е*СООН

Е*СООН~ -► ЕН~ + С02

ЕН~ + Н20 -» Е + Н2 + ОН"

3. Некоторые аспекты механизма синтеза органических соединений из СО и Hg.

3.1. Происхождение атомов углерода и водорода в молекулах продуктов.

В состав биокатализатора входят органические соединения, из которых формально возможно образование продуктов (углеводороды из лшш-дов, уксусная кислота и т.д.). Поэтому были поставлены эксперименты с биокатализатором, органические компоненты которого метили изотопом 14С. Опыты показали, что включения углерода из биокатализатора в углеводорода не происходит. При проведении синтеза из смеси 10% СО и 90%Нg, а также с использованием чистого оксида углерода радиоактивность катализатора до и после реакции составляла 0.29+0.01 mkci.

Распределение углерода из субстрата (СО) между различными продук-

Таблица 2.

Включение метки в продукты восстановления СО экстрактами клеток D.desulfuricans .

СО/Е^Г.Э, Т=25°, рН=8.2, Р=атм.

Количество Количество по-глощенной14С0 Распределение метки, mkci/%

введенной 14С0, мкмоль углеводороды спирты кислоты со2

mkCi У. mkCi Ji mkCi У. mkCi У.

39.51 1.001 2.5 0.593 59.2 0.276 27.6 0.132 13.2

тами изучено при помощи оксида углерода, меченого изотопом 14С. Оно цр ведено в табл. 2. Вся поглощенная метка распределяется между углеводородами, кислородсодержащими соединениями и С02. На долю углеводородов приходится 59 % радиоактивности, кислородсодержащих соединений -28 %, С02 - 13 %.

Из представленных данных можно заключить, что углерод из органических компонент биокатализатора в продукты синтеза не включается, а углеродные скелеты продуктов строятся исключительно из СО, введенного в реакцию.

Кинетические изотопные исследования с использованием 14С0 с высокой радиоактивностью позволили определить последовательность появления в реакционной смеси различных соединений. Результаты представлены на рис. II.

Оказалось,что продукты образуются в первые же секунды реакции. Вначале образуется больше кислородсодержащих соединений, затем их количество уменьшается и далее остается постоянным, что позволяет предположить, что именно они служат предшественниками в синтезе углеводородов. Количество углеводородов, небольшое в первые секунды опыта, возрастает. Увеличичивается и общий выход продуктов синтеза.

Для доказательства этого предположения была использована уксусная кислота, меченая изотопом *4С по первому, либо по второму положению

Таблица 3.

Включение 14С в углеводороды из 14СЙ3С00Н и СЕ314С00Н.

Состав газовой смеси. мкс! в углеводородах при использовании

СНз14С00Н 14С%С00Н

100% Нз 10Ж С0+90Ж Нз 0.109 ± 0.005 0.072 ± 0.003 0.417 ± 0.005 0.310 1 0.005

(табл. 3.). Уксусная кислота расходуется в синтезе, и метка обнаруживается в углеводородах, причем метка во втором положении (по метильной группе) включается в углеводорода в четыре раза чаще, чем метка в первом положении (по карбоксильной группе). По-видимому, это свидетельствует о том, что процесс роста углеводородных цепей может происходить с конденсацией и декарбоксилированием уксусной кислоты. В отсутствие оксида углерода (100% 1^) несколько увеличивается полнота использована углерода уксусной кислоты. По-видимому, это свидетельствует о том, что включение углерода из уксусной кислоты в продукты мало зависит от наличия СО в газовой фазе и определяется только восстановительным потен-

цпалои реакционной среда. Большая радиоактивность продуктов в отсутствие оксида углерода объясняется, вероятно, тем, что метка в продуктах

включение трития,мкС1

4 .

3 -

2 ■

1 -

углеводороды,мкмоль

В. 54.

4-. 3--

1ссГ<

1—ь

о. 1 1 ю

Рис.11. Динамика включения 14С в продукты синтеза. рН=8.2,Т=25°С,Р=атм. -•- КС, -+- УВ, -х- общий.

включение трития, мкС1

О. 3 О. 25- • О. 2 •• 0.15-. О. 1 -. О. 05-.

О го 40 60 80 100

Рис.12. Выход углеводородов и включение трития в про'дукты в системе со+н2+т2о. Условия см.рис.12. -+- УВ, -х- включение трития.

X включение трития,мкС1

д'' углеводороды, нкмо/ш^

О. 3 О. 25- -О. 2 ■ -0.15-■ О. 1 - ■ О. 05- ■

углеводороды .мкмоль

80 ЮО

20 40 60 80 ЮО

Рис. 13.Выход углеводородов и вклю- Рис. 14.Выход углеводородов и включение трития в продукты в системе чение трития в продукты в системе СО + Аг + ТгО. Условия см.рис.12. со + Т2 + н£о. Условия см.рис.12. . —ь- УВ, -х- включение трития. -+- УВ, -х- включение трития.

не "разбавляется" углеродом из СО.

Таким образом, из приведенных экспериментальных данных следует, что углеродные цепи синтезируемых продуктов строятся из углерода СО, введенного в синтез.

Для решения вопроса о происхождении атомов водорода, изучалось включение трития в углеводорода из третированной воды в присутствии водорода и без него, и из газообразного трития при различных концентрациях оксида углерода (рис.12-14).

Оказалось, что включение трития в продукты синтеза из тритирова-

о

иной воды мало зависит от соотношения СОгН^ В то же время, включени трития в углеводороды из газообразного трития зависит от соотношени СОгНз в газовой фазе, и до соотношения СО: 1^=4:1 хорошо коррелирует выходом углеводородов. Это свидетельствует,по-видимому, о том, что пр: малых концентрациях СО процесс синтеза органических соединений обеспе чивается восстановителем за счет окисления молекулярного водорода. Со гласно данным рис. 8, в этой области концентраций Е^ наблюдается мак симальная скорость окисления водорода. В то же время, слабая зависи мость скорости включения трития в углеводороды из воды от соотношени С0:Н/>, и высокая абсолютная скорость включения трития, свидетельству ет, по-видимому, о том, что генерация восстановителя из воды являете; необходимой стадией в синтезе органических соединений при любом соотношении субстратов. На основании данных, полученных при использовани трития, можно заключить, что включение водорода из газообразного водорода и из воды может происходить тремя путями: при окислении молекулярного водорода, при окислении СО, при образовании водорода из воды.

3.2. Некоторые аспекты механизма синтеза.

Из литературы известно, что живые клетки способны строить длинны! углеводородные цепи. Эти процессы происходят при участии промежуточного соединения ацетил-коэнзима А (ацетил-КоА). Чтобы выяснить роль аце-тил-КоА в синтезе органических соединений из СО и Н^ были поставлен] эксперименты с КоА и ацетил-КоА (табл.4).

Таблица 4.

Выход продуктов синтеза в присутствии ацетил-КоА.

ССО=10Ж, Р=атм, Т=25°С, рН=8.2.

Состав реакционной смеси выход продуктов,мкмоль/мг общий выход мкмоль/мг

НС ОС

буфер+зкетракт буфер+экстракт+КоА буфер+экстракт+Ац-КоА I.12*0.02 о^о.огг 0.50-0.012 0.70^0.015 х.во^.оз 1.60-0.05 1.82-0.03 2.20-0.05 2.10-0.06

Эксперимент показал, что добавление ацетил-КоА (равно как и КоА] практически не влияет на общий выход органических соединений. В этиз условиях увеличивается количество кислородсодержащих продуктов; количество углеводородов, напротив, пропорционально уменьшается.

Как следует из табл.4, избыток интврмедиата, по-видимому, не способствует удлинению углеводородной цепи, но происходит его расщепление

с образованием уксусной кислоты и соответствующих спиртов. При этом не происходит значительных изменений в составе кислородсодержащих соединений, а некоторое увеличение количества уксусной кислоты при добавлении ацетил-КоА мошо объяснить щелочным гидролизом последнего в условиях эксперимента (рН=8.2).

По-видимому, механизм синтеза углеводородов на ферментной системе существенно зависит от применяемых условий. В рядэ случаев он включает стадии образования одноуглеродных фрагментов н их последующей полимеризации либо конденсации. Тогда коэффициент корреляции молекуляр-но-массового распределения уравнению Шульца-Флори пряблЕЕЭзтся к единице. При концентрациях СО до 50% синтез, вероятно, осуществляется путем конденсации многоуглеродных фрагментов. В ряде случаев предшественниками углеводородов являются кислородсодержащие соединения и, в частности, уксусная кислота.

Из литературы известно, что анаэробные микроорганизмы (в том числе, использованные в работе сульфатредуцирующие бактерии) имеют механизм восстановления групп С0т до СНх - так называемый, цикл тетрагид-рофолиевой кислоты (цикл ТГФ). Известно также о существовании специализированного переносчика групп СН^ - фермента корриноидной природа (КоЕ).Исходя из этих и приведенных выше экспериментальных данных,можно представить следующую последовательность реакций, приводящих к наблюдаемым продуктам (здесь Е - полиферментный комплекс):

ферменты цикла ТГФ, +4Н, КоЕ 3.1 СО -> ОуСоЕ + НгО

При помощи ферментов цикла ТГФ оксид углерода последовательно восстанавливается до 5-формил-ТГФ, 5,10-метенил-ТГФ, 5,10-метилен-ТГФ, 5-метил-ТГФ.

Рост цепи, по нашему мнению, начинается с образования активного водорода (либо гидрвд-иона) на каталитическом центре в процессе окисления оксида углерода:

+со _ -со з.г Е + он"-> Е-он -> Е-соон --—► Е-н

Дальнейшая судьба гидрид-иона может быть троякой. Он может ре-комбинировать с протоном (например, в реакции с Н^О), при этом образуется молекулярный водород (реакция 3.3):

+н о

э.з Е-н —,---» Е-он + н_

2+ +

_.г+ г где а и а -окисленная и

_ . _ г + м+ 1 восстановленная формы ак-

* ь цептора электронов.

+СН_КоЕ

3.5 Е-Н --—:-► Е-СН3 + КоЕ

При наличии в реакционной среде акцептора электронов с окисл тельно-восстановительным потенциалом »-340 мВ может произойти отр! двух электронов; при этом образуются протон и восстановленный акцепт« (реакция 3.4). Внедрение группы -й^-, образовавшейся в цикле Т1Ф, г связи Е-Н приводит к образованию группы СНд- и зарождению цепи (реа] ция 3.5).

Последовательное внедрение груш -С^- по связи растущая цепь каталитический центт? представляет собой реакцию роста цепи (3.6):

+ пСН КоЕ

з.в Е~сн3 ---► Е-и где ¡г= -ссн2эп-сн3

Обрыв цепи происходит при карбоксилировании радикала к (образу ются карбоновые кислоты, реакция 3.7):

+со +он

3.7 Е-К

3.8

3.9

+ОН

Е-сок -► Е + й-соон

Е + и-он

+СО - +пСН КоЕ

-> н-Е-й -=-► й-Е-к -* Е + ки

-СО -пКоЕ

При присоединении гидроксильной группы образуются спирты, (реашц 3.8), при присоединении другого радикала й , либо водорода образуют« углеводороды (реакция 3.9).

Можно предположить, что активация СО может осуществляться на дез типах активных центров; металлических (Fe.Ni.Mn), либо ферментных це! трах другого типа (например, ферментов ацетил-КоА-цути). При активащ СО на металлических центрах реализуется механизм, включающий образовг нив групп'СЕ^ и их последующую полимеризацию с образованием углеводе родных смесей, подчинящихся распределению Андерсона-Щульца-ФлорЕ По-видимому, учитывая малое содержание упомянутых металлов в биокатг лизаторе, можно ожидать, что повышение содержания СО в газовой смес приведет к увеличению вероятности его активации на этих центрах, е следовательно, к росту коэффициента корреляции уравнению Щульца-Флорг

Отсутствие в продуктах синтеза углеводородов С-^-С^, которое бш неоднократно подтверждено в экспериментах, можно объяснить двумя ирг чинами. Во-первых, возможно, структура фермента позволяет десорбирс ваться только углеводородным цепям с числом углеродных атомов более 7 Во-вторых, можно допустить, что вначале образующиеся кислородсодержа щие фрагменты быстро создают структуры С^-С^, дегидратация которых

превращением в соответствующие углеводороды, либо десорбция с активного центра медленнее, чем рост углеродной цепи.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано, что в слабощелочных буферных растворах (рН 8.0) при комнатной температуре и атмосферном давлении экстракты клеток Desulfovibrio desulfuricans ШТ8ММ 2198 КаТЭЛИЗИруюТ СИНТеЗ

органических соединений из СО и Е^. Основными продуктами являются смесь алифатических углеводородов С8 - С24, метиловый и этиловый спирты, уксусная кислота.

2. Показано, что температура, рН буферного раствора, соотношение реагентов COiHg, давление газовой смеси, концентрация биокатализатора в реакционной смеси влияют на выходы органических продуктов синтеза и их соотношение. При изменении условий проведения процесса можно селективно получать различные продукты. В частности, селективность процесса по изо-алканам может достигать 95%, а по кислородсодержащим продуктам 50-55Ж.

3. Установлено, что в присутствии примененной ферментной системы из СО и HgO при комнатной температуре и атмосферном (либо повышенном) давлении также образуются смеси алифатических углеводородов CQ - С24 и кислородсодержащих соединений Cj - С^.

4. При помощи меченых соединений (I4C0,3H2,3î^0) показано.что углеродный скелет продуктов реакции строится только из молекул реагирующей СО, а водород в продукты реакции включается как из воды, так и из газообразного водорода.

5. Изучено распределение продуктов синтеза по молекулярным массам и его зависимость от условий проведения процесса. С применением метода расчета состава алифатических углеводородов в соответствии с функцией Бульца-Флори установлено, что рост цепи может протекать с участием мо-аоуглеродных (й^) либо многоуглеродных фрагментов.

6. Изучен элементный состав биокатализатора. Показано, что в состав ферментной системы входят Fe, ni. мп. являвшиеся активными ком-хонентами гетерогенных катализаторов синтеза углеводородов из СО и Hg.

7. Изучена кинетика сопутствующих синтезу органических продуктов га СО и Hg реакций окисления молекулярного водорода и восстановления цютонов воды при катализе экстрактами клеток d.desuifurleans. Показа-io, что в состав биокатализатора входит не менее двух гидрогеназ с каталитическими центрами типа NiFeSe и Fe.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах: Лапидус А.Л., Мухитова Ф.К., Кияшко C.B., Гробовенко С.Я., Беляе-

ва М.И, .Ферментативный синтез углеводородов и кислородсодержащих соединений из СО и ^.//Доклада АН СССР. Т.300. n.2. C.368-37I. 1988.

2. Lapidus A. L. , Grobovenko S.Y. , Mukhitova F.К. . Kiyashko S. V. Enzyme-catalyzed synthesis of hydrocarbons and oxygen-containing со mpounds from CO and Hg.//J. Mol.Catal. V.56. P.260-2S5. 1989.

3. Мухитова Ф.К., Кияшко С.В. и др. Каталитический синтез углэводоро дов и кислородсодержащих соединений из СО и Hg на ферментных сист мах.//Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Химический синтез на основе Cj-молекул". Москва. С.54. 1987.

4. Kiyashko S. V. , Mityashina S. Y. , Mukhitova F.K. Enzymatic synthesi of organic compounds on CO and Hg. //18-th FEBS Meeting. Ljubljana P. 102. 1987.

5. Мухитова Ф.К., Кияшко C.B., Лапидус А.Л., Гробовенко С.Я. Ферментативный синтез углеводородов и кислородсодержащих соединений из и ¡^.//"Вопросы физиологии и биохимии сульфатредуцирувдих бактери П/ред. Лещинской И.Б., Беляевой М.И. Казань. С.84-91. 1987.

6. Kiyashko S.V. , Mityashina S. Y. , Mukhitova F.K. Catalytic reduction of carbon oxides by the extracts of D. desulfuricans. //14-th international congress on biochem. Prague. Abstracts. V.III. P.35 WE011. 1988.

7. Lapidus A. L. , Grobovenko S.Y. , Mukhitova F.K. , Kiyashko S.V. //Pri VI Int. Symp. RHHC Pisa. Italy. 25-29 Sept. 1989.

8. Лапидус А.Л., Кияшко C.B., Мухитова Ф.К., Гробовенко С.Я. Некоторые вопросы механизма синтеза углеводородов из СО и Hg в нрисутст вии ферментных систем.//v Всес. конф. по мех-му кат. реакций. Тез докл. Москва. С.17-18. 1990.

9. Кияшко С.В., Мухитова Ф.К., Давыдова М.Н., Гробовенко С.Я. Механизм действия гомогенных биокатализаторов в синтезе Фшпера-Тропша //III Всес. конф. "Химический синтез на основе Cj-молекул''.Тез. докл. Москва. С.82. 1991.

10. Lapidus A.L.. Kiyashko S.V. , Grobovenko S. Y. , Mukhitova F. K.//Pr< VII Int. Symp. SHHC Tokyo. Japan. May 17-21. 1992.