Получение искусственных биокатализаторов на основе антител, способных осуществлять "ковалентный катализ" тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им М В. ЛОхМОНОСОВА

На правах рукописи

Решетняк Андрей Васильевич

ПОЛУЧЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ, СПОСОБНЫХ ОСУЩЕСТВЛЯТЬ "КОВАЛЕНТНЫЙ КАТАЛИЗ"

Специальность 02.00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

2 4 МАЙ 2007

003060202

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им МВ Ломоносова и в лаборатории биокатализа Инеппута биоорганической химии им ММ ШемякинаиЮА Овчинникова РАН

Научные руководители

Официальные оппоненты

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габпбович,

Кандидат биологических наук Пономаренко Наталья Александровна

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич

Доктор химических наук, профессор, Румш Лев Давидович

Ведущая организация'

Институт биохимии им А H Баха РАН

Защита диссертации состоится 29 мая 2007 года, в 16 00 на заседании специализированного совета Д501 001 41 по химическим наукам при МГУ им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр40, Институт физико-химической биологии им А H Белозерского МГУ им M В Ломоносова, ^уд 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского Государственного Университета им MB Ломоносова

Автореферат разослан 27 апреля 2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ИГ Смирнова

Актуальность проблемы

«Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов Разработка путей создания искусственных ферментов, способных осуществлять ковалентный катализ, является актуальной задачей энзимологии, биохимии и молекулярной биологии Решение такой задачи может помочь понять пути эволюции биокаталитических функций Создание искусственных биокатализаторов может найти так же практическое применение в фармацевтике и биотехнологии Стратегии их получения в последнее время расширились до функциональной селекции комбинаторных библиотек диверсифицированных белковых доменов Лиганды, способные взаимодействовать с активным центром ферментов, в том числе аналоги переходных состояний реакции, конформационные ингибиторы и суицидальные субстраты/ингибиторы, были использованы для аффинного и ковалентного отбора функциональных молекул ферментов Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в «ковалентном катализе» Эффективная дискриминация на основании такой функциональной реакционной способности имеет широкое применение для идентификации и селекции потенциальных биокатализаторов

Каталитические антитела (абзимы) - новый тип неферментативных биокатализаторов - представляют интерес как с точки зрения исследования структурно-функциональных закономерностей, обуславливающих их каталитическую функцию, так и с позиций исследования механизма биокатализа, в частности изучения кинетических закономерностей исследуемых превращений Эта перспективная область науки развивается чрезвычайно бурно и сочетает в себе элементы иммунологии, энзимологии, молекулярной биологии, органической химии и генетической инженерии Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора Направленный дизайн каталитических антител поможет создать методологию получения биокатализаторов заданной специфичности В настоящей работе сделана попытка получить антитела, с каталитической функцией используя механизм-зависимые ингибиторы сериновых гидролаз в

3

качестве специфических «ловушек» способных взаимодействовать с активными белковыми молекулами В качестве источника каталитических антител были использованы три лини мышей МЫ., ЖВ/Ж^У и БЛЛ, являющихся моделями различных аутоиммунных заболеваний, а так же полусинтетическая библиотека генов иммуноглобулинов человека Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы являлось получение каталитических антител, способных осуществлять "ковалентный катализ" и гидролизоватъ амидную связь, а так же структурно-функциональный анализ полученных антител Для выполнения работы были сформулированы следующие задачи 1) Провести реакционную иммунизацию аутоиммунных мышей линий МЫ,, и

NZB/NZW гаптеном ЬАЕЕЕУ-РЬоэ, конъюгированным с белком КЬН Изучить специфичность и каталитическую активность полученных в результате иммунизации антител 2)Осуществить химическую селекцию полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека на биотинилированный п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3 2 1]октан фенилфосфонат (В^Х) 3) Исследовать каталитическую активность рекомбинантных одноцепочечных антител и провести их структурно-функциональный анализ

Научная новизиа и практическая значимость работы. В настоящей работе проведена реакционная иммунизация пептидил дифенил фосфонатом (ЬДЕЕЕ-УРк«) Впервые показано, что полученные поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз Разработан метод получения специфичных искусственных биокатализаторов, основанный на иммунизации аутоиммунных модельных животных реакционно-способными гаптенами и получены их кинетические характеристики

Проведена селекция полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека на способность ковалентно взаимодействовать с суицидальным ингибитором сериновых гидролаз (п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3 21]октан фенилфосфонат) Получены рекомбинантные одноцепочечные фрагменты антител ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз

Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе»

Показано, что отобранные рекомбинантные антитела могут осуществлять

катализ гидролиза амидной связи

Биокатализаторы иммуноглобулиновой природы могут быть применены

для терапии различных заболеваний Среди потенциальных мишеней

каталитических антител можно назвать поверхностные белки вирионов,

цитокины, различные патогены белковой природы Терапевтические средства

на основе каталитических антител могут обладать рядом важных преимуществ,

среди которых высокая специфичность связывания мишени и возможность

длительного существования в кровотоке

Кроме того, антитела, способные ковалентно взаимодействовать с

токсичными фосфорорганическими соединениями, могут выступать в качестве

специфических «каталитических акцепторов» или «ловушек» для

фосфорорганических соединений - отравляющих веществ (ОВ), и их аналогов

В течение многих лет предпринимаются попытки получить эффективные

антидоты к этим отравляющим веществам В их качестве может выступать

ацетилхолинэстераза, однако гораздо эффективнее представляется

использование антител, имитирующих способность фермента являться

специфическими акцепторами этих соединений Свойства антител делают их

идеальным инструментом для дизайна диагностических агентов нового

поколения, основанных на технологии рекомбинантной ДНК

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4

статьи Результаты диссертации были представлены на 20-ом ШМВМ

Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Киото, 2006),

XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-

химической Биологии и Биотехнологии" (Москва, 2006), Международной

Конференции Биокатализ 2005 (С -Петербург - Кижи - Валаам, 2005)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка

цитируемой литературы Диссертация изложена на_страницах и содержит_

рисунков и_таблицы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для получения абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными

свойствами, были использованы механизм-зависимые ингибиторы сериновых

гидролаз Их главным свойством является мимикрия стабильного переходного

5

состояния реакции и образование ковалентной связи ингибитор-фермент Существует большое число ингибиторов сериновых гидролаз, образующих стабильные ковалентные комплексы по типу ацил-фермент Одним из первых и хорошо изученных необратимых ингибиторов сериновых гидролаз является диизопропилфторфосфонат (ДФП) Пептидил фосфонаты и фтор фосфонаты являются производными ДФП и изучались весьма интенсивно Для получения каталитических антител механизм-зависимые ингибиторы на основе фосфонатов могут быть использованы в двух направлениях 1) реакционная иммунизация и 2) реакционная селекция

ИНДУКЦИЯ ЭПИТОП-СПЕЦИФИЧЕСКОГО

КАТАЛИТИЧЕСКОГО ОТВЕТА МЕТОДОМ «РЕАКЦИОННОЙ ИММУНИЗАЦИИ».

Суть метода «реакционной иммунизации» заключается в индукции антител, которые в отличие от «традиционных» связываются с гаптеном ковалентно Это связывание обусловливается химическими реакциями, которые протекают между антителом и химически активным гаптеном Выбор активного гаптена определяет тип реакции, протекающей между ним и взаимодействующим антителом, и, следовательно, тип катализируемой антителом реакции Образование ковалентного интермедиата с фтор производными фосфонатов было показано для каталитических эстеролитических антител 17Е8 (Zhou, Guo et al 1994, Guo, Huang et al 1995) и 9A8 (Kolesnikov, Kozyr et al 2000) Эти факты позволяют утверждать, что ковалентный каталитический аппарат сериновых гидролаз в абзимах может быть воспроизведен Для получения специфического абзима методом реакционной иммунизации необходимо, чтобы гаптен представлял собой структуру, «голова» которой содержит механизм-зависимый ингибитор протеазы, а «хвост» - пептидильную цепь, соответствующую по длине участку, взаимодействующему в активном центре фермента В качестве полипептидныой цепи была выбрана небольшая последовательность Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val, соответствующая аминокислотным остаткам 265-270 гликопротеина вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) - gpl20 Ранее было показанно (Pollard, Meier et al 1991), что специфичное расщепление по этому сайту приводит к тому, что gpl20 теряет свою способность связываться с рецептором CD4, что не позволяет вирусу инфецировать CD4+ клетки Данный пептид был модифицирован по С-концевой аминокислоте группой механизм-

зависимого ингибитора - дифенил фосфонатом Такой пептид относится к пептидил а-аминоалкилфосфонатам Схема его синтеза и структура представлены на рисунке 1 Необходимо отметить, что важным свойством выбранного гаптена является низкая неспецифическая реакционная способность и высокая стабильность в водных растворах

1НВЙАсОН

нл Нйл ,9 АсОН8ад5*2" Iм3 8 „„'»Ч«" О

оЛ-х

СбН5

НзС о

В0С-1№А1а.еМ!Ви).С»<1Еи)011(!Ви) • _р--'освн5 -.-вОС4.еи.АЫЗЦ18фЭДВи)-©1и(1^Уа1Явд

^ ос,н5 I

и>с сн,

Рисунок 1 Схема синтеза пептидил фосфоната - ЬАЕЕЕУ-РЬоэ

На первом этапе был синтезирован защищенный по свободной аминогруппе дифенил 1-(М-бензилоксикарбонил)-аминоалкилфосфонат в реакции соконденсации трифенилфосфита, изобутаналя и бензилкарбамата (рис 1) Защитную группу удаляли, выделенный дифенил-4-аминоалкилфосфонат анализировали и использовали для дальнейшей работы Методами элементного анализа и ПМР-спектроскопии было показано, что полученный на данном этапе дифенилвалилфосфонат является аналогом соответствующей аминокислоты с заменой карбоксильной группы на дифенилфосфонат

Синтез защищенного по Ы-концевой аминогруппе и боковым группам пептида Вос-Уа1-А1а-(иВи)С1и-(иВи)Ыи-(иВи)С1и проводили по стандартной процедуре для Вос-производных аминокислот Защитные труппы были выбраны таким образом, чтобы условия деблокирования не привели к деградации фосфонатной группы Последующая конденсация полученного пептида с фосфонатным производным валина была произведена путем активации свободной карбоксильной группы дициклогексилкарбодиимидом Очистку пептидил дифенил фосфоната проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в возрастающем градиенте ацетонитрила и анализировали методом масс-спектрометрии (МАЬВ1-ТОБ) Снятие защитных групп проводили 100%-ной трифторуксусной кислотой Полученный таким образом пептидилфосфонат

не требовал дополнительной очистки и после преципитации был использован на следующих этапах работы

Поскольку известно, что малые молекулы в большинстве случаев являются слабыми иммуногенами, для проведения эффективной иммунизации синтезированные реакционные пептиды были конъюгированы с KLH Для присоединения N-концевой аминогруппы пептида к доступным аминогруппам KLH был выбран метод с предварительной активацией носителя при помощи бис[сулфосукцинимидилсуберата] (BS3, Pierce) и последующим присоединением гаптена Для эффективной детекции каталитических антител N-конец синтезированного пептидил фосфоната был модифицирован активированным эффиром биотина

Природные каталитические антитела (ДНК гидролизующие и протеолитические) часто обнаруживают при различных аутоиммунных патологиях человека и у модельных животных (Shuster, Gololobov et al 1992, Paul, Volle et al 1989, Ponomarenko, Durova et al 2002) Было также показано, что при иммунизации аналогом переходного состояния мышей линий SJL и MRL/lpr частота появления гидролитических абзимов значительно выше, чем в случае контрольной линии Balb/c (Tawfik, Chap et al 1995) Поэтому для получения эпитоп-специфических абзимов использовали три линии мышей MRL/lpr, NZB/NZW Fi и SJL - являющихся моделями различных аутоиммунных заболеваний

Иммунизацию мышей данных линий проводили по ранее опубликованной схеме получения каталитических антител к аналогам переходного состояния ферментативных реакций (Tawfik, Chap et al 1995) Сравнительный анализ специфического иммунного ответа на антиген у разных иммунизированных мышей всех трех линий проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA) В качестве антигена был использован исходный пептидилфосфонат, меченный биотином, биотинилированный Val-фосфонат и нитрофенилметил-п-биотинилфенилметилфосфонат, для которого ранее была показана специфическая ковалентная модификация активного центра абзимов (Kolesnikov, Kozyr et al 2000) (рис 2) Антитела всех трех линий иммунизированных мышей обладают высокой специфичностью к модифицированному пептидному фрагменту антигена, не взаимодействуют в условиях данного эксперимента со свободным Val-фосфонатом, в то же время связываются с более активным и менее специфичным модифицирующим

1 0.9

! а^

о.) gj

ал 0,1 0.3 0.! 0.1 а

' 1

■ettUEEEV-fti«

. .'¡ПИЩ- ВЧ1

агентом (Метил-р-иитрофенил биотшшлфенил метилфосфонат). Важно отмстить, что в среднем у новозеландских гибридов количество антиген-

специфических антител было несколько выше по сравнению с двумя другими

аутоиммунными линиями, в то время как антитела мышей линии МЯЬ обладали наибольшей аффиностью ло отношению к метил-р-нулрафекии биотинийфенил метилфосфокату.

Дальнейшее изучение типа взаимодействия полученных антител с реакционным пептидом проводилось на аффинно очищенных препаратах ^О, Иммобилизованный па мембране ковалентяый комплекс антиген-антитело

Рисунок 2. Иммуноферментный анализ сывороток мышей линий 8Л, МЙ1. и N23/143™ иммунизированных пелтидипфосфо катом Сыворотки крови адсорбировали на иммуноглзкшетах, о иммобилизованными козьими антителами к Рс фрагменту антител мыши, инкубировали с соответствующим антигеном и проявку вели при помощи стрептавидина. коньюгироеакногоспероксидазойхрена.

детектировали

методом

имму н об лоттин га.

Iii

контроль_

«

I

-I й

116 — 66 —-45 — 35 —

25 — 18

Г* I

[¡Y'.'YH

LAEEEVPhos

т &

Не

— ы и

электрофореграмма

£

I Ui

СО ■ (/)

я* й

сс. N 2 z

* - иимун.

контроль | LAEEEVPhos

116 — 66 -45 — 35 — 25 -

18—i

Не

— Lc

1 ' .. стреттта нидин- HRP

Рисунок 3. Электрофореграмма и иммуноблоттинг поликлональных антител (1 мкг), выделенных из иммунизированных мышей линий SJl MRL и NZB/N2W F1, после реакции пегттидил фоофонатом-|.АЕЕЕ\/-Р|1о5(0.1 ыкМ), Трипсин (1 мкг), БСА(5 мкг) и поли клона льны е IgG, выд пленные из мыши линии BAL В/с (1 мкг] были использованы в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно.

Результаты данного эксперимента, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о наличии в препаратах пол ик л опальных антител, выделенных

из аутоиммунных мышей, иммунизированных «реакционным» пептидом Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val-PO(OPh)2, как легких, так и тяжелых цепей иммуноглобулинов, способных к ковалентной модификации пептидом Те в результате реакционной иммунизации образовались антитела,способные ковалентно взаимодействовать с гаптеном и строго специфичным к пептидной компоненте

В результате скрининга панели гибридом, полученных из селезенок опытных мышей, были отобраны 7 моноклональных антител, способных к ковалентной модификации реакционным пептидил фосфонатом Причем в двух случаях модификации подвергались легкие цепи антител, а в пяти - тяжелые

ДНК, соответствующая вариабельным доменам данных антител, была наработана методом ПЦР, и определена их нуклеотидная последовательность Одноцепочечные антитела были экспрессированны в прокариотической системе Рекомбинантные антитела Ell и Е6 обладали каталитической активностью по отношению к низкомолекулярному субстрату LAEEEV-MCA Кинетические параметры гидролиза амидной связи составили kcat - 1,1 ± 0,5 х 10"3 min"1, Km = 53 ±14 мкМ для антитела Е6 и kcat =3,2 ± 0,7 х 10"4min"1, Km = 48 ±11 мкМ для антитела El 1

Проведенные эксперименты показали принципиальную возможность получения специфичных к антигену каталитических антител методом реакционной иммунизации

РЕАКЦИОННАЯ СЕЛЕКЦИЯ АНТИТЕЛ ИЗ СИНТЕТИЧЕСКОЙ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА.

Механизм-зависимая селекция комбинаторных библиотек является эффективным инструментом для получения новых биокатализаторов Использование необратимых ингибиторов позволяет проводить селекцию' по способности активных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы Отбор по ковалентному взаимодействию имеет ряд преимуществ и позволяет применять весьма жесткие условия селекции Более того, условия реакции и выбор реагента могут изменяться для достижения кинетической или термодинамической селективности На сегодняшний день примеры химической селекции в применении к фаговому дисплею антител были в основном сфокусированы на нековалентном связывании с аналогами переходного

состояния или на ковалентной реакционной способности су ицни дальних субстратов.

В работе была использована полусинтетическая библиотека сегментом вариабельных фрагментов ген нов иммуноглобулинов человека Griffin. 1 (MR С, Center for proieing engineering, UK). Библиотека была построена на основе зародышевых линий 49 сегментов вариабельных регионов тяжелых цепей, а гак же 26 и 21 сегмента вариабельных регионов к и легких цепей соответственно.

А : : I I .I'1

Vi» ШЁЯНГЗ

nsa

*" г

Vk яй'шеш mrsim па

I ■ ■ : 1 ' .

^ r.' ffli 'ISffl

-W&L

1® LÍBS pdB promoter Ша

(соШ1 UI:

Uj^ Я

.1 .авва-л

îinker

tag attd Ijypsm

pHEN2

Риунок 4. A - создание синтетического репертуара тяжелых и пегких цепей (Griffiths, Williams et al 1994). Б - карта библиотеки, построенной на основе вектора pHEN2 и синтетического репертуара сегментов генов иммуноглобулинов человека.

Третий гипервариабельный участок как тяжелых, так и легких цепей был рандоме визирован методом ПЦР (Griffiths, Williams et al, 1994), Гены вырожденных одноценочечсьсх антител (ScFv) были проклонированы в фагемидный вектор р!ШЫ2. Представительность библиотеки составляет 1,2х 101". Схематически библиотека Griffin. 1 представлена на рисунке 4.

Для проведения химической селекции и скрининга были использованы п-тштро фенил 8-Метш1-8-азабицикло[3.2Л ]октан фепилфосфопаг (X) и его биотшшлированный аналог (Bt-X) (рис. 5),

V-V Б л HjC, NH л . о н /?

О о BtX Ц И1-Л N 0 2

л

Рисунок 5 Структура n-нитрсфенил 8-метил-8-эзабицикпо[3,2.1]октзн фенил фосфоната (А) и его би оти н и ли ро ванного аналога (Б).

Данный фосфонат был разработан как ингибитор сериновых гидролаз (Tramontano, Ivanov et al 2000), и ранее был использован для детекции протеолитической активности у природных антител при различных аутоиммунных нарушениях (Paul, Tramontano et al 2001) Благодаря п-нитрофенильной группе он является весьма реакционно способным по отношению к сериновым гидролазам В отличие от фтор производных фосфонатов устойчив в водных растворах и не проявляет неспецифической реакционноспособности по отношению к инертным белкам

Для селекции активных фаговых антител, способных ковалентно взаимодействовать с фосфонатом Bt-X, была использована следующая схема

1 Реакцию фаговых частиц с биотинилированным фосфонатом проводили в растворе Для достижения специфичности реакции варьировали концентрацию фосфоната Bt-X (от 40 до 1 мкМ) и температуру реакции (комнатная температура - 22°С и 37°С)

2 Избытка биотинилированного фосфоната удаляля двухкратным переосаждения фаговых частиц раствором ПЭГ/NaCl

3 Адсорбцию фаговых частиц проводили в лунках с иммобилизованным стрептавидином, предварительно проинкубированных с раствором БСА Для оценки специфичности селекции в качестве отрицательного контроля использовали лунки, так же, предварительно прединкубированные раствором БСА и биотина

4 Для удаления неспецифической сорбции лунки промывали нейтральным буфереом ФБС, содержащим Твин, и кислым Трис-глициновым буфером (рН 2,7)

5 Элюцию фаговых частиц проводили раствором трипсина

6 Наличие полноразмерных вставок генов одноцепочечных антител проверяли методом ПЦР Для оценки специфичности селекции сравнивали титр фаговых частиц, полученных при элюции из экспериментальных и контрольных планшетов

7 Фаговые частицы, показавшие хорошее соотношение титра экспериментальных фагов к контрольным и высокий процент полноразмерных вставок, использовали для амплификации и дальнейших раундов селекции

По описанной выше схеме были проведены три раунда селекции После

третьего раунда селекции поликлональные одноцепочечные антитела (ScFv)

12

были проэкспрессированны в клетках НВ2151. Растворимые Беру были

вьщелены из периплазм этической фракции методом мето л ло-хс латной

хроматографии с использованием сорбента №->1ТЛ. Полученные

рекомбинантные антитела были использованы Для реакции с ЕЯ-Х. Продукты

реакции разделяли в пол иак рилами дном геле (ПААГ) и детектировали методом

яммуноблоттинга с использованием стрептавидина, ко ныогиров энного с

иероксидазой храма. Наличие рекомбинзнтных ЭсРу, контролировали

гибридизацией с мономональными антителами к бхН^в тэгу(рис. 6).

■ -,НШ-6'Н"-№Р--В отличие от отбраных после

12 14 5 6 РМ" 12 3 4 5

третьего раунда селекции, контрольное рекомбинаятное

одноцепочечное антитело к

.....

. . ; .> тиреоглобулину не взаимодействовало

' ¿Мр-^.фь с ЕК-Х, что свидетельствует

. о специфичности ковалеятной

»»

модификации. Полученные

рисунок 6. Мммуноблоттмнг поликлональных

БсРу после реакции с В1-Х Дорожка 1 Ю результаты позволили сделать вывод о пугдарованных кпонов, собранных после

третьего раунда селекции; 2 общий пулл том, что селекция прошла успешно, И клонов, отобранных после третьего раунда

селекции; 3 общий пулп клонов, отбракных поликлон альные антитела,

после второго раунда селекции; 4

отрицательный контроль рекомбинактное полученные после третьего раунда, антитело к тиреогло 6 у л ину; 5

неевлектированная библиотека епЛВп.1; 6 0,1 способны КОВалйНТНО

мкг трипсина. Проявку иммуноблотинга

осуществляли стрептавидином, взаимодействовать с В1-Х

коньюгированным с пероксидээой хрена или

ыонотлонапьмымиати1елану1ка*Н15э™тоггу, фосфонатом. Кроме того, селекция коньюгироеэннымислероксидазойхрена.

позволила существенно повысить

уровень экспрессии растворимых поликлональнш антител.

Девяносто шесть клонов после третьего раунда селекции были выбраны

для дальнейшего изучения. Клоны показавшие в ПЦР анализе наличие

полноразмерного фрагмента одноцепочечных антител, были использованы для

экспрессии, Периплазматичсская фракция была выделена для каждого

индивидуального клона и была использована в реакции с В!-Х фосфонатом.

Реакционные смеси были проанализированы методом иммуноб лоттинга. 11

5сРу были отбраны на основании специфического мечения ЗеЬЧ' полосы в

области 28 кДа (детекцию вели при помощи стрептавидина, коныогировашгого

с пераксидазой хрена) и эффективной экспрессии. 7 рекомбинантных антител

не способных к ко&алситной модификации, но показавших хороший уровень

13

экспрессии, были выделены методом металло-хелатной хроматографии и после рекции с биотинилированным фосфонатом использованы для яммуноферменткого анализа ELISA. Связывание с антигеном оценивали по сравнению с антителом из не селектирован я ой библиотеки, антителом, связывающем тире о глобулин и двумя антителами, способными взаимодействовать с Bt-X к о валентно. Данные ИФА анлиза приведены на рисунке 7.

В результате 'грех раундов селекции из библиотеки были отобраны хорошо экспреесирующиеся растворимые одноцеп очечные антитела, способные взаимодействовать с Bt-X фосфонатом либо

ковалентно, либо

нековалеитно,

Нуклеотндная п о с ледо пате ль н о сть была определена дли всех отбранных ScFv. На основании сравнения их первичных последовательностей были выделены 8 (из 11) уникальных «реакционных» клонов (способных

взаимодействовать е Bt-X фосфонатом ковалентно) и б (из 7) связывающих клонов. Зародышевые линия и семейства тяжелых и легких цепей всех отобранных антител приведены в таблице I.

Легкие цепи всех отобранных ScFv, как связывающих, так и реакционных, за исключением S.9, принадлежат к V/.1 еемейетву, причем DPL-3 сегмент

Рисунок 7 Иммуно ферментный анализ ScFv, после реакции с Bt-X. Адсорбцию ScFv проводили в лунках с иммобилизованным сгрептавидиноы, прадаарительно проинкубированных с раствором БСА Детекцию комплекса ScFv ■■ Bt-X проводили при помощи стрептавидина, конъюгированногослероксидаэойхрена. S.1, S3,S7, S9j $11, S14, S17 рекомбинантные антитела, отобран ые после третьего раунда не способные взаимодействовать с Bt-X ковалентно. М ScFv из неселектироранной библиотеки. anti-TyfFv одноцепочечное антитело к тиреогл обули ну, Bt-X биотинилировзннь!Й фосфонат инкубировали с реакционным оуффером и наносили на иммунопланшет. А.5 и А.17 ScFv отобраные после третьего раунда взаимодействующие с фосфонатом ковалентно.

является наиболее распространенным УН4 и УН1 семейства тяжелых цепей встречаются наиболее часто среди связывающих клонов, однако УН4 является основным семейством среди реакционных клонов (только А.21 относится к УН1 семейству)

Таблица 1.

Клон Легкая цепь Тяжелая цепь Кол копий

Сем Сегмент CDR3 * Сем Сегмент CDR3

Связывающие клоны

S 1 VX1 DPL-3 AAWDDSLV VH1 DP-14 NLNWDS 1

S3 VX1 DPL-3 AAWDDSLGA VH3 DP-45# ESGAPDS 1

S 7 VX1 DPL-3 AAWDDSLQG VH1 DP-7 DHLGAGG 1

S 9 VX3 DPL-16 NSRDSSGY VH4 DP-67 RVRDRVL

S 11 VX1 DPL-2 AAWDDSLSAP VH3/VH 4 DP-47/ DP-67 STEGEQS 1

S 14 VM DPL-3 AAWDDSLLSP VH1 DP-10 MYDMQKS 1

Реакционные клоны

А 1 VM DPL-3 AAWDDSLDAF VH4 DP-66 FDAPNTRA 1

А 46 VX1 DPL-3 AAWDDSLFSP VH4 DP-66 F GGQQVP 1

А 5 VX1 DPL-3 AAWDDSLGT VH4 DP-65 FGTRGNTH 1

А 43 VX1 DPL-3 AAWDDSLSAL VH4 DP-65 0TV1DNT 1

А7 VX1 DPL-3 AAWDDSLGGP VH4 DP-71 FGGQQVP

А 49 VX1 DPL-3 AAWDDSLGT VH4 DP-71 HEGPLSAAQ 1

А 21 VX1 DPL-3 AAWDDSLRSP VH1 DP-3 DREL 1

А 17 VX1 DPL-5 GTWDSSLNP VH4 DP-67 LTQ5SHNDA N 2

* AAWDDSL, GTWDSSL, NSRDSSG Указанные

последовательности не варьировались в библиотеке Griffin 1

Для связывания с Bt-X фосфонатом необходимо наличае либо VAJ DPL3, либо VH4 DP-67 сегментов антител, при этом для ковалентного взаимодействия комбинация DPL3 сегмента и VH4 семейства является предпочтительной, исключения составляют только А.17 и А.21 Легкая цепь антитела А.17 относится к VX1 семейству, DPL5 сегменту, а тяжелая - к VH4, DP-67 DPL5 и DPL3 являются очень близкими сегментами, и между ними просматривается

высокая степень гомологии Весьма интересно, что сегмент DP-67 представлен только в одном «реакционном» клоне (А.17), однако он является одним из основных сегментов среди связывающих антител, причем только в случае DP-67 сегмент легкой цепи может быть изменен с DPL3 на другой сегмент или даже семейство |

Антитело А.21 относится к VA.1 и VH1 семействам и к DPL3 и DP-3 сегментам Оно имеет высокую гомологию с S.l, S.7 и S.14 связывающими ScFv, однако третий гипервариабельный регион антитела АЛ сильно отличается от гипервариабельных регионов связывающих антител

Третий гипервариабельный регион тяжелых цепей реакционных клонов имеет некий консервативный консенсус, а последовательность FGGQQVP встречается в двух различных клонах (в четырех, принимая во внимание количество копий одного и того же клона) Из чего можно сделать предположение, что, по всей видимости, третий гипервариабельный регион тяжелых цепей принимает непосредственное участие в «ковалентном катализе»

Все «реакционные» клоны были охарактеризованы по кинетике взаимодействия с небиотинилированным фосфонатом X Детекцию протекания реакции во времени проводили спектрофотометрически по образующемуся окрашенному продукту (п-нитрофенолу) Кинетику взаимодействия ферментов с необратимыми ингибиторами, как правило, описывают в виде двух стадийного процесса- 1) образование обратимого нековалентного комплекса фермент-ингибитор и 2) более медленный процесс образования ковалентной связи между ингибитором и ферментом (Kitz and Wilson 1962) Схематически этот процесс можно изобразить в виде

к, ^ _ . ^

Е + I

к,

обратимый ковалентный

комплекс комплекс

Типичные кинетические кривые реакции антител с фосфонатом X приведены на рисунке 8 на примере одноцепочечного антитела А.17

time, niin

Рисунок 8 Кинетические кривые реакции 18 мкМ А17 с различным количеством фосфоната X Врезка - лианеризация кинетических кривых в соответствии со схемой Китца - Уилсона

Таблица 2. Кинетические параметры реакции ScFv с фосфонатом X

Клон кг, 1/мин Кдяс, мкМ кг/Кдис, М"'мин1

А.17 151±21 2119

А.5 0,035±0,002 35±23 1000

А 21 0,032±0,005 71±18 451

А.43 0,017±0,004 81+43 210

А.46 0,021 ±0,004 89+49,1 236

А.49 0,012±0,004 5б±14 214

А.7 0,037+0,003 213±86 174

В таблице 2 приведены кинетические характеристики для всех реакционных веру Сравнивая кинетические параметры различных антител, можно заметить, что константа скорости первого порядка к2, являющаяся основной характеристикой скоростъ-лимитирующего процесса, образования ковалентной связи, варьируется в очень узком диапазоне (от 0,012 мин"1 до 0,037 мин"1) для большинства антител Однако одно из антител (А.17) оказалось практически на порядок более реакционно способным (к2=0,32 мин"1)

17

1 2 3 4 5 6 7

Константа диссоциации так же варьировалась в довольно узком диапазоне (от 35 до 200 мкМ) Полученные данные можно сравнить с опубликованными ранее результатами по реакции фосфоната X с сериновыми гидролазами (Tramontano, Ivanov et al 2000) Значения констант скорости составляли 1800, 2600 и 4100 М"'мин"1 для реакции бутирилхолинэстеразы, химотрипсина и трипсина с фосфонатом X соответственно Т е, наиболее активное антитело А.17 обладает реакционной способностью, сравнимой с таковой для природных сериновых гидролаз |

Реакция А.17 с Bt-X фосфонатом ингибировалась прединкубацией с ингибиторами сериновых протеаз, такими как аминоэтилбензенсульфонил фторидом (AEBSF) и аналогами валина и фенилаланина карбоксильная группа, которых заменена на дифенил фосфонат В то же время прединкубация с более активными фтор фосфонатами, такими как зарин и кумаринил этил п-трифторацетамидофенилметилфосфонат, не приводили к ингибированию

реакции фосфорилирования А.17 Bt-X (рис |9) Что свидетельствует о специфичности активного центра, отобранного в результате селекции на Bt-X фосфонат

Протекание реакции между реакцио: фосфонатом и антителами было также подтверждено при помощи прямого метода масс-спектрометрии SELDI (данные не приводятся) Было показано, что в результате реакции одноцепочечных антител с биотинилированным фосфонатом происходит увеличение массы антител, соответствующее ровно одному остатку фосфоната

Для определения нуклеофильного остатка, участвующего в ковалентном катализе, наиболее активное антитело А.17 было

промодифицировано биотинилированным

фосфонатом Bt-X Модифицированное и контрольное антитело было подвержено исчерпывающему трипсинолизу, и триптический гидролизат был проанализирован методом масс-спектрометрии SELDI (рис 10)

18

Рисунок 9 Иммунодетекция реакций антитепа А17 с механизм-зависимыми ингибиторами сериновых протеаз А17 (1 мкМ) инкубировали 1ч на 37°С с 5мм

АЕВБР (дорожка 1), 5мМ валил фосфоната (дорожка 2), 5мМ фенилаланин фосфоната (дорожка 3), с 100 мкМ зарина (дорожа 4), 100 мкМ кумаринил этил п-трифторацетамидофенилметилфо сфоната (дорожка 5), 100 мкМ X (дорожка 6) и с ФБС буфером (дорожка 7) Затем все образцы инкубировали 1ч при 37*С со 100 мкМ В1-Х, разделяли в ПААГ и использовали для иммуноблоттинга Проявку иммуноблотинга осуществляли стрептавидином, коньюгированным с перокеидазой хрена

2000 9000 4000

Рисунок 10 ЗЕЮ1 масс-спектр триптического гидролизата одноцепочечного антитела А.17 (верхний спектр) и антитела А17, модифицированного ЕИ-Х фосфонатом (нижний спектр)

Полученные данные были проанализированы при помощи программы GPMAW 7 01 Молекулярная масса каждого пика была соотнесена с пептидами, образующимися в результате гидролиза одноцепочечного антитела А.17 трипсином (таб 3)

Таблица 3.

SELD1 MW От ДО заря Д Последовательность пептидов MW** теор

1873 181- 196 +1 LLIYDNNKRPSGIPDR 1872,00

2124 240-259 +1 LTVLGAAAHHHHHHGAAEQK 2123,34

2374 45-65 +1 GLEWIGSIYHSGSTYYNPSLK 2373,63

3060 152-180 +1 VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK. 3059,36

3443 152-180 202-239 +2 VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK* SGTSATLGITGLQTGDEADYYi-GTWDSSLNPVFGGGTK* 6886,45

3827 202-239 +1 SGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLNPVFGGG TK. 3828,09

После модификации

3704 152-180 +1 (VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK)-Bt-X 3706,17

3767 152-180 202-239 +2 (VTISC SGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK)-Bt-X* SGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLNPVFGGGTK* 7533,26

*Цнстеины, выделенные жирным шрифтом, образуют дисульфидную связь

**приведенны средние молекулярные массы

Модификации Bt-X фосфонатом подвергается пептид одноцепочечного антитела 152- 180 VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK Данный пептид

соответствует первому гипервариабельному региону легкой цепи фланкирующим его первому и второму каркасным участкам Модифицированный пептид был дополнительно очищен методом аффинной хроматографии с использованием стрептавидин-сефарозы и подвержен тандемной масс спектрометрии МС/МС анализ показал, что ковалентной модификации подвергается ТугЗб легкой цепи (данные не приводятся) Для подтверждения данных, полученных методом тандемной масс-спектрометрии, модифицированный пептид 152 - 180 антитела А.17 гидролизовали химиотрипсином, и полученный образец анализировали методом прямой масс-спектрометрии Было показано, что в результате гидролиза химотрипсином пептида 152 - 180 образуются два основных продукта VTISCSGSSSNIGNNYVSW (MW = 2032,0 Да) и YQQLPGTAPK+phosph (MW = 1748,1 Да)

Аналогичным образом для одноцепочечного антитела А.7, было показано, что Туг32 является нуклеофильным остатком, участвующем в «ковалентном катализе». Для других антител удалось получить МС/МС спектр непосредственно методом тандемной масс спектрометрии, не выделяя меченый пептид из гидролитической смеси пептидов Для модификации «реакционнь!х» антител был использован небиотинилированный фосфонат X Интересно отметить, что ТугЗб, расположенный во втором каркасном регионе легкой цепи, является нуклеофильным остатком только в случае наиболее активного антитела А.17, во всех остальных случаях Туг32, расположенный в первом гипервариабелыюм регионе легкой цепи, принимает участие в «ковалентном катализе» Тирозины 32 и 36 являются весьма консервативными аминокислотными остатками в белках иммуноглобулиновой природы

Одним из преимуществ работы с рекомбинантными антителами является

возможность быстрого осуществления сайт направленного мутагенеза ¿ля

подтверждения масс спектрометрических данных тирозины 32 и 36 легкой цепи

были заменены на фенилаланин в двух наиболее активных клонах - А.17 и А.5

Фенилаланин является полным аналогом тирозина, но не содержит

гидроксильную группу, способную принимать участие в «ковалентном

катализе» Поэтому замена тирозина на фенилаланин не должна сказаться на

структуре антител, но должна кардинальным образом повлиять на их

каталитические свойства Кроме того, тирозин 36 антитела А.17 был заменен на

серии Серин, так же как и тирозин, содержит гидроксильную группу,

20

способную выступать в качестве нуклеофила при ковалентном катализе, однако расположение гидроксильной группы в третичной структуре белка сильно различается в случае тирозина и серина Интересно исследовать, каким образом скажется на активности замена тирозинового остатка на сериновый

Антитела А. 17 и

ь о "э3 А.5 и их мутанты были

& $

X X? X Л5 _Лг Л проэкспрессированы,

А ^ Д Л А Д ь i1 ь лГ

^ ^ ^ ^ £ / £ концентрация

рекомбинантных

стрептавидин .. антител была

HRP

пронормирована

Полученные препараты

анти-myc , были использованы в

антитела ^«ш *** i и- м

реакции с Bt-X фосфонатом В качестве

Рисунок 11 Иммуноблоттинг реакционной смеси антител А17 и

А 5 и их мутантов с биотинилированным фосфонатом Bt-X отрицательного

Верхний рисунок проявку проводили стрептавидином,

конъюгированным с пероксидазой хрена, нижняя контроля было

моноклональными антитепами к с-Мус эпитопу

использовано

одноцепочечное антитело к тиреоглобулину Детекцию протекания реакции вели методом иммуноблоттинга (рис 11)

Замена тирозина 32 на фенилаланин приводит к полной потере активности по отношению к Bt-X фосфонату в случае антитела А.5, однако это практически не влияет на активность антитела А.17 При этом замена тирозина 36 на фенилаланин приводит к прямо противоположному результату - активность антитела А 5Y36F сохраняется на том же уровне, что и активность антитела дикого типа Мутанты A.17Y36F и A.17Y32,36F оказываются неактивными в реакции с фосфонатом Неактивным оказался так же и мутант ScFv А.17, сожержащий замену тирозина 36 на серин Таким образом, результаты мутагенеза двух «реакционных» антител полностью подтвердили масс-спектрометрические исследования Было также показано, что в случае антитела А.17 важно не только наличие аминокислотного остатка, содержащего гидроксильную группу в положении 36 легкой цепи, но и расположение этой гидроксильной группы в активном центре

А.17, как наиболее реакционно способный, был проверен на амидазную

активность на небольшой библиотеке метилкумарин амидных субстратов

21

После трех стадийной очистки одноцепочечное антитело не катализировало гидролиз типичных трипсиновых субстратов Pro-Phe-Arg-MCA или Boc-Gly-Gly-Arg-MCA Однако при этом наблюдалось ускорение гидролиза двух гидрофобных субстратов (Phe-MCA и Boc-Ala-Ala-Phe-MCA) Амидазная активность отсутствовала в препарате мутированного антитела A.17Y36p| и ингибировалась в результате прединкубации А.17 с фосфонатом X Амидазная активность А.17 так же исчезала в результате иммуноадсорбции антителами к с-шус эпитопу, иммобилизованными на агарозу Гидролиз субстрата Phe-MCA, рекомбинантным одноцепочечным антителом А.17 подчиняется кинетической схеме Михаэлиса-Ментен (kcat= 2,1 ± 0,8 х lO^min"1, Km = 47 ±12 мкМ)

Заключение

В описанном выше исследовании химическая селекция была применена для поиска белковых молекул, проявляющих ковалентную реакционную способность - химическую особенность, являющуюся универсальной Для катализа Сайт связывания одноцепочечных антител был использован в качестве матрицы, лишенной химического аппарата, для каталитической функции Химические свойства и понимание структуры полученных «реакционных» молекул могут пролить свет на понимание основных элементов природных и искусственных ферментов

Одноцепочечные антитела, полученные в этой работе, могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в качестве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств (directed enzyme evolution)

ВЫВОДЫ:

1 Показана принципиальная возможность получения методом реакционной иммунизации каталитических антител, способных специфично ковалентно взаимодействовать с пептидил дифенил фосфонатом

2 В результате реакционной селекции фаг-дисплейной библиотеки получены рекомбинантные антитела, способные осуществлять «ковалентный катализ»

3 Проведен структурно-функциональный анализ полученных рекомбинантных антител Показано, что для ковалентного взаимодействия с реакционным фосфонатом необходимо наличие УАЛ и УН4 семейств зародышевых линий легкой и тяжелой цепей антител соответственно

4 Методом масс-спектрометрии определены аминокислотные остатки, проявляющие нуклеофильные свойства при ковалентном катализе Показана роль данных остатков в ковалентном катализе при помощи сайт направленного мутагенеза

5 Исследована кинетика модификации одноцепочечных антител реакционным фосфонатом Оценены кинетические параметры реакции амидолиза, катализируемой антителом А.17

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

А Г Габибов, А Фрибуле, Д Тома, А В Демин, Н А Пономаренко, И И Воробьев, Д Пиле, М Паон, Е С Александрова, Г Б Телегин, А В Решетняк, О.В Григорьева, НВ Гнучев, К А Малышкин, ДД Генкин (2002) Антитела - протеазы подходы к индукции каталитического ответа Биохимия, 67,1413-1426

И И Воробьев, Н А Пономаренко, А В Решетняк, О М Дурова, В К Мисиков, С В Сучков, А Г Габибов (2004) Каталитические антитела' в медицине специфическая деградация аутоантигенов и новые подходы к инактивации патогенов Молекулярная медицина 3,48-55 Ponomarenko NA, Vorobiev II, Alexandrova ES, Reshetnyak AV, Telegin GB, Khaidukov SV, Avalle B, Karavanov A, Morse HC 3rd, Thomas D, Fnboulet A, Gabibov AG (2006) Induction of a protem-targeted catalytic response in autoimmune prone mice antibody-mediated cleavage of HIV-1 glycoprotein GP120 Biochemistry, 45,324-30

Решетняк А В , Арментано M Ф., Морзе Г С , Фрибуле А , Маккер С П , Трамонтано А, Кнорре В Д, Габибов А Г и Пономаренко Н А (2007) Механизм-зависимая селекция библиотек генов иммуноглобулинов для получения ковалентных биокатализаторов Доклады Академии Наук, т 415, н 268-270.

Reshetnyak А V , Armentano М F , Ponomarenko N А , Durova О , Ziganshm R, Gololobov G , Morse Illrd H С , Gabibov A G, Tramontano A Reactive selection of antibodies with nucleophihc residues poised for covalent catalysis // 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress // June 18-23, 2006 Kyoto, Japan, Abstracts, !p 386 |

Решетняк А В , Пономаренко H A, Дурова О М, Зиганшин Р X, Арментано М -Ф, Трамонтано А А и Габибов А Г Эволюция ковалентного катализа в искусственных ферментах полученных из полусинтетической библиотеки генов Ig V // XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные Направления Физико-химической Биологии и Биотехнологии" // Москва, 7-10 февраля, 2006, Сборник тезисов, с 8 Reshetnyak А V Screening of semisynthetic phage display library for catalytic antibodies with biotinylated phosphonate ester // International Conference Fundamentals & Applications "Biocatalysis" // June 19-23, 2005, Abstracts 99

Подписано в печать 18 04 2007 г Исполнено 19 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 387 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Искусственные ферменты.

2.1.1 Искусственные ферменты на основе циклодекстринов.

2.1.2 Синтетические полимеры с фермент-подобной каталитической активностью.

2.1.3 Инженерия ферментов.

2.1.4 Целенаправленное изменение ферментов.

2.1.5 Метод фагового дисплея как инструмент для целенаправленного изменения ферментов.

1.1 Каталитические антитела.

2.2.1 Антитела на аналоги переходных состояний.

2.2.2 Абзимы, содержащие кофакторы.

2.2.3 Введение каталитических аминокислотных остатков в связывающий центр антитела путем химической модификации или сайт-направленного мутагенеза.

2.2.4 Реакционная иммунизации.

2.2.5 Природные каталитические антитела.

2.2.6 Природные протеолитические антитела.

2.2.7 Каталитические антиидиотипические антитела.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Индукция эпитоп-специфического каталитического ответа методом «реакционной иммунизации».

3.2 Реакционная селекция антител из синтетической библиотеки генов иммуноглобулинов человека.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Химические реактивы и материалы.

4.2 Методы.

Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем являются каталитическими и происходят при участии высокоспецифичных и эффективных биокатализаторов-ферментов. «Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов. Разработка путей создания искусственных ферментов, способных осуществлять ковалентный катализ, является актуальной задачей энзимологии, биохимии и молекулярной биологии. Решение такой задачи может помочь понять пути эволюции биокаталитических функций. Создание искусственных биокатализаторов может найти также практическое применение в фармацевтике и биотехнологии. Стратегии их получения в последнее время расширились до функциональной селекции комбинаторных библиотек диверсифицированных белковых доменов. Лиганды, способные взаимодействовать с активным центром ферментов, в том числе аналоги переходных состояний реакции, конформационные ингибиторы и суицидальные субстраты/ ингибиторы, были использованы для аффинного и ковалентного отбора функциональных молекул ферментов. Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в «ковалентном катализе». Эффективная дискриминация на основании такой функциональной реакционной способности имеет широкое применение для идентификации и селекции потенциальных биокатализаторов.

В ряду каталитически активных молекул особое место занимают рибозимы -каталитические РНК, и абзимы - каталитические антитела. Антитела представляют собой белковые молекулы, способные взаимодействовать с высокой специфичностью практически со всеми природными или синтетическими антигенами. Разнообразие антител, в отличие от ферментов, практически не лимитировано. Высокая вариабельность и специфичность антител делает их идеальными матрицами для создания искусственных биокатализаторов. Каталитические антитела представляют интерес как с точки зрения исследования структурно-функциональных закономерностей, обуславливающих их каталитическую функцию, так и с позиций изучения механизма биокатализа, в частности анализа кинетических закономерностей рассматриваемых превращений. Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. Направленный дизайн каталитических антител поможет создать методологию получения биокатализаторов заданной специфичности. В настоящее время имеются широкие возможности для получения биокатализаторов de novo, основываясь на свойстве гипервариабильности суперсемейства иммуноглобулинов. С помощью каталитических антител (абзимов) удалось осуществить биокаталитические превращения, для которых нет соответствующих ферментативных аналогов. Следует заметить, что значительный прогресс, достигнутый в абзимологии за столь короткий срок, указывает на огромные практические возможности этой области науки. Однако эффективный катализ антителами реакций, проходящих через образование высокоэнергетических переходных состояний и достигаемый ферментами с помощью сложного комплекса механизмов, в настоящий момент до конца не реализован. Зачастую абзимы характеризуются невысокими скоростями катализируемых реакций. В настоящий момент представляется очевидным, что катализ путем стабилизации переходного состояния реакции может обеспечить лишь умеренный уровень ускорения реакции. В то же время, при катализе реакций природными ферментами обнаруживаются дополнительные механизмы, такие как дестабилизация исходного субстрата, сближение каталитически активных групп и атакуемой химической связи в активном центре, динамика активного центра и ряд других. Направленное получение абзимов, обладающих несколькими свойствами ферментов, является сложной задачей и требует комбинированных подходов в получении каталитически активных молекул. В связи с этим особый интерес вызывает развитие новых методологий в получении абзимов. Количество реакций, катализируемых антителами, равно как и методик их получения, неуклонно растет. Современная абзимология опирается на синтез разнообразных аналогов переходных состояний реакций, введение кофакторов и каталитических групп в уже существующие антитела, сайт-направленный мутагенез. Большинство известных каталитических антител было получено данными методами, однако, развиваются и альтернативные подходы - получение антиидиотипических антител, реакционная иммунизация, поиск и клонирование природных каталитических антител, а так же различные методологии скринига и селекции каталитических молекул из комбинаторных библиотек.

Особого внимания в современной абзимологии, имеющей как чисто фундаментальные, так и прикладные задачи, заслуживают реакции, субстратами которых являются биополимеры. Биокатализаторы иммуноглобулиновой природы могут быть применены для терапии различных заболеваний. Среди потенциальных мишеней каталитических антител можно назвать поверхностные белки вирионов, цитокины, различные патогены белковой природы. Терапевтические средства на основе каталитических антител могут обладать рядом важных преимуществ, среди которых высокая специфичность связывания мишени и возможность длительного существования в кровотоке.

Кроме того, антитела, способные ковалентно взаимодействовать с токсичными фосфорорганическими соединениями, могут выступать в качестве специфических «каталитических акцепторов» или «ловушек» для фосфорорганических соединений -отравляющих веществ (ОВ), и их аналогов. В течение многих лет предпринимаются попытки получить эффективные антидоты к этим отравляющим веществам. В их качестве может выступать ацетилхолинэстераза, однако гораздо эффективнее представляется использование антител, имитирующих способность фермента являться специфическими акцепторами этих соединений. Свойства антител делают их идеальным инструментом для дизайна диагностических агентов нового поколения, основанных на технологии рекомбинантной ДНК.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Показана принципиальная возможность получения методом реакционной иммунизации каталитических антител, способных специфично ковалентно взаимодействовать с пептидил дифенил фосфонатом.

2. В результате реакционной селекции фаг-дисплейной библиотеки получены рекомбинантные антитела, способные осуществлять "ковалентный катализ".

3. Проведен структурно-функциональный анализ полученных рекомбинантных антител. Показано, что для ковалентного взаимодействия с реакционным фосфонатом необходимо наличие VII и VH4 семейств зародышевых линий легкой и тяжелой цепей антител соответственно.

4. Методом масс-спектрометрии определены аминокислотные остатки, проявляющие нуклеофильные свойства при ковалентном катализе. Показана роль данных остатков в ковалентном катализе при помощи сайт направленного мутагенеза.

5. Исследована кинетика модификации одноцепочечных антител реакционным фосфонатом. Оценены кинетические параметры реакции амидолиза, катализируемой антителом А.17.

1. Breslow, R.e., Artificial Enzymes. 2005: WILEY-VCH Verlag GmbH& Co.KGaA. 1-31.

2. Gouverneur, V.E., et al., Control of the exo and endo pathways of the Diels-Alder reaction by antibody catalysis. Science, 1993.262(5131): p. 204-8.

3. Ulrich, H.D., E.M. Driggers, and P.G. Schultz, Antibody catalysis of pericyclic reactions. Acta Chem Scand, 1996.50(4): p. 328-32.

4. Breslow R., E.K., A g-Cyclodextrin Thiazolium Salt Holoenzyme Mimic for the Benzoin Condensation. Tetrahedron Lett., 1988.29: p. 1635-1638.

5. Hilvert D., R.B., Functionalized Cyclodextrins as Holoenzyme Mimics of Thiamine-Dependent Enzymes. Bioorganic Chemistry, 1984.12: p. 206-220.

6. Breslow, R., Artificial enzymes. Science, 1982. 218(4572): p. 532-7.

7. Emert J., R.B., Modification of the Cavity ofBeta-Cyclodextrin by Flexible Capping. J. Am. Chem. Soc., 1975.97(3): p. 670-671.8. . Czarniecki M.F., В., Very Fast Acylation of Beta-Cyclodextrin by Bound p-Nitrophenyl

8. Ferrocinnamate. J. Am. Chem. Soc., 1978.100(24): p. 7771-7772.

9. Breslow R., O.L.E., An 'Artificial Enzyme' Combining a Metal Catalytic Group and a Hydrophobic Binding Cavity. J. Am. Chem. Soc., 1970.92(4): p. 1075-1077.

10. Koltz, I.M., Suh, J., Artificial Enzymes, ed. R. Breslow. 2005: WILEY-VCH Verlag GmbH& Co.KGaA. 63-88.

11. Klotz, I.M., G.P. Royer, and A.R. Sloniewsky, Macromolecule—small molecule interactions. Strong binding and cooperativity in a model synthetic polymer. Biochemistry, 1969.8(12): p. 4752-6.

12. Royer, G.P., Klotz, I.M., Enhanced rates due to apolar interactions between polymer and substrate. J. Am. Chem. Soc., 1969.91(21): p. 5885-5886.

13. Suh, J., Hah, S. S., Organic Artificial Proteinase with Active Site Comprising Three Salicylate Residues. J. Am. Chem. Soc., 1998.120(39): p. 10088-10093.

14. Socolich, M., et al., Evolutionary information for specifying a protein fold. Nature, 2005. 437(7058): p. 512-8.

15. Russ, W.P., et al., Natural-like function in artificial WW domains. Nature, 2005. 437(7058): p. 579-83.

16. Minshull, J., et al., Predicting enzyme function from protein sequence. Curr Opin Chem Biol, 2005.9(2): p. 202-9.

17. Russ, W.P. and R. Ranganathan, Knowledge-based potentialfunctions in protein design. Curr Opin Struct Biol, 2002.12(4): p. 447-52.

18. Schultz, P.G., J. Yin, and R.A. Lerner, The chemistry of the antibody molecule. Angew Chem Int Ed Engl, 2002.41(23): p. 4427-37.

19. Fletcher, M.C., et al., Creation of a ribonuclease abzyme through site-directed mutagenesis. Nat Biotechnol, 1998.16(11): p. 1065-7.

20. Altamirano, M.M., et al., Directed evolution of new catalytic activity using the alpha/ beta-barrel scaffold. Nature, 2000.403(6770): p. 617-22.

21. Quemeneur, E., et al., Engineering cyclophilin into a proline-specific endopeptidase. Nature, 1998.391(6664): p. 301-4.

22. Bolon, D.N. and S.L. Mayo, Enzyme-like proteins by computational design. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(25): p. 14274-9.

23. Dwyer, M.A., L.L. Looger, and H.W. Hellinga, Computational design of a biologically active enzyme. Science, 2004.304(5679): p. 1967-71.

24. Looger, L.L., et al., Computational design of receptor and sensor proteins with novel functions. Nature, 2003.423(6936): p. 185-90.

25. Aharoni, A., A.D. Griffiths, and D.S. Tawfik, High-throughput screens and selections of enzyme-encoding genes. Curr Opin Chem Biol, 2005. 9(2): p. 210-6.

26. Fernandez-Gacio, A., M. Uguen, and J. Fastrez, Phage display as a tool for the directed evolution of enzymes. Trends Biotechnol, 2003.21(9): p. 408-14.

27. Kaur, J. and R. Sharma, Directed evolution: an approach to engineer enzymes. Crit Rev Biotechnol, 2006.26(3): p. 165-99.

28. Wong, T.S., D. Zhurina, and U. Schwaneberg, The diversity challenge in directed protein evolution. Comb Chem High Throughput Screen, 2006.9(4): p. 271-88.

29. Chen, W. and G. Georgiou, Cell-Surface display of heterologous proteins: From high-throughput screening to environmental applications. Biotechnol Bioeng, 2002. 79(5): p. 496-503.

30. Lee, S.Y., J.H. Choi, and Z. Xu, Microbial cell-surface display. Trends Biotechnol, 2003. 21(1): p. 45-52.

31. Kawarasaki, Y., et al., Enhanced crossover SCRATCHY: construction and high-throughput screening of a combinatorial library containing multiple non-homologous crossovers. Nucleic Acids Res, 2003.31(21): p. el26.

32. Freeman, A., et al., Screening of large protein libraries by the cell immobilized on adsorbed bead approach. Biotechnol Bioeng, 2004. 86(2): p. 196-200.

33. Tawfik, D.S. and A.D. Griffiths, Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat Biotechnol, 1998.16(7): p. 652-6.

34. Varadarajan, N., et al., Engineering of protease variants exhibiting high catalytic activity and exquisite substrate selectivity. Proc Natl Acad Sci USA, 2005.102(19): p. 6855-60.

35. Hoess, R.H., Protein design and phage display. Chem Rev, 2001.101(10): p. 3205-18.

36. Smith, G.P. and V.A. Petrenko, Phage Display. ChemRev, 1997.97(2):p. 391-410.

37. Winter, G., et al., Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol, 1994.12: p. 433-55.

38. Smith, G.P., Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 1985. 228(4705): p. 1315-7.

39. Widersten, M., et al., Use of phage display and transition-state analogs to select enzyme variants with altered catalytic properties: glutathione transferase as an example. Methods Enzymol, 2000. 328: p. 389-404.

40. Widersten, M. and B. Mannervik, Glutathione transferases with novel active sites isolated by phage display from a library of random mutants. J Mol Biol, 1995. 250(2): p. 115-22.

41. Hansson, L.O., M. Widersten, and B. Mannervik, Mechanism-based phage display selection of active-site mutants of human glutathione transferase Al-1 catalyzing SNAr reactions. Biochemistry, 1997.36(37): p. 11252-60.

42. Hansson, L.O., M. Widersten, and B. Mannervik, An approach to optimizing the active site in a glutathione transferase by evolution in vitro. Biochem J, 1999.344 Pt 1: p. 93100.

43. Baca, M., et al., Phage display of a catalytic antibody to optimize affinity for transition-state analog binding. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(19): p. 10063-8.

44. Takahashi, N., et al., In vitro abzyme evolution to optimize antibody recognition for catalysis. Nat Biotechnol, 2001.19(6): p. 563-7.

45. Soumillion, P., et al., Phage display of enzymes and in vitro selection for catalytic activity. Appl Biochem Biotechnol, 1994.47(2-3): p. 175-89; discussion 189-90.

46. Soumillion, P., et al., Selection ofbeta-lactamase on filamentous bacteriophage by catalytic activity. J Mol Biol, 1994. 237(4): p. 415-22.

47. Vanwetswinkel, S., B. Avalle, and J. Fastrez, Selection ofbeta-lactamases and penicillin binding mutants from a library ofphage displayed TEM-1 beta-lactamase randomly mutated in the active site omega-loop. J Mol Biol, 2000. 295(3): p. 527-40.

48. Danielsen, S., et al., In vitro selection of enzymatically active lipase variants from phage libraries using a mechanism-based inhibitor. Gene, 2001. 272(1-2): p. 267-74.

49. Paul, S., et al., Phosphonate ester probes for proteolytic antibodies. J Biol Chem, 2001. 276(30): p. 28314-20.

50. Cesaro-Tadic, S., et al., Turnover-based in vitro selection and evolution of biocatalysts from a fully synthetic antibody library. Nat Biotechnol, 2003. 21(6): p. 679-85.

51. Yin, J., J.H. Mills, and P.G. Schultz, A catalysis-based selection for peroxidase antibodies with increased activity. J Am Chem Soc, 2004.126(10): p. 3006-7.

52. Pedersen, H., et al., A methodfor directed evolution andfunctional cloning of enzymes. Proc Natl Acad Sci USA, 1998.95(18): p. 10523-8.

53. Demartis, S., et al., A strategy for the isolation of catalytic activities from repertoires of enzymes displayed on phage. J Mol Biol, 1999.286(2): p. 617-33.

54. Heinis, C., et al., Selection of catalytically active biotin ligase and trypsin mutants by phage display. Protein Eng, 2001.14(12): p. 1043-52.

55. Atwell, S. and J. A. Wells, Selection for improved subtiligases by phage display. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(17): p. 9497-502.

56. Brunet, E., et al., A novel strategy for the functional cloning of enzymes using filamentous phage display: the case of nucleotidyl transferases. Nucleic Acids Res, 2002. 30(9): p. e40.

57. Jestin, J.-L., P. Kristensen, and G. Winter, A Methodfor the Selection of Catalytic Activity Using Phage Display and Proximity Coupling. Angewandte Chemie International Edition, 1999.38(8): p. 1124-1127.

58. Xia, G., et al., Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 2002.99(10): p. 6597-602.

59. Fa, M., et al., Expanding the substrate repertoire of a DNA polymerase by directed evolution. J Am Chem Soc, 2004.126(6): p. 1748-54.

60. Strobel, H., D. Ladant, and J.L. Jestin, In vitro selection for enzymatic activity: a model study using adenylate cyclase. J Mol Biol, 2003.332(1): p. 1-7.

61. Ponsard, I., et al., Selection of metalloenzymes by catalytic activity using phage display and catalytic elution. Chembiochem, 2001.2(4): p. 253-9.

62. Schultz, P.G. and R.A. Lerner, From molecular diversity to catalysis: lessons from the immune system. Science, 1995. 269(5232): p. 1835-42.

63. Pauling, L., Chem Eng News, 1946.36: p. 1375-77.

64. Jenks, W.P., Catalysis in Chemistry andEnzymology. New York: McGraw-Hill., 1969.

65. Tramontano, A., K.D. Janda, and R.A. Lerner, Catalytic antibodies. Science, 1986. 234(4783): p. 1566-70.

66. Pollack, S.J., J.W. Jacobs, and P.G. Schultz, Selective chemical catalysis by an antibody. Science, 1986.234(4783): p. 1570-3.

67. Benkovic, S.J., Catalytic antibodies. Annu Rev Biochem, 1992. 61: p. 29-54.

68. Hilvert, D., Critical analysis of antibody catalysis. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 751 -93.

69. Shokat, K.M. and P.G. Schultz, Catalytic antibodies. Annu Rev Immunol, 1990.8: p. 335-63.

70. Tanaka, F., Catalytic antibodies as designer proteases and esterases. Chem Rev, 2002. 102(12): p. 4885-906.

71. Charbonnier, J.B., et al., Structural convergence in the active sites of a family of catalytic antibodies. Science, 1997.275(5303): p. 1140-2.

72. Gigant, В., et al., Crossreactivity, efficiency and catalytic specificity of an esterase-like antibody. J Mol Biol, 1998.284(3): p. 741-50.

73. Tawfik, D.S., et al., Efficient and selectivep-nitrophenyl-ester-hydrolyzing antibodies elicited by ap-nitrobenzylphosphonate hapten. Eur J Biochem, 1997.244(2): p. 619-26.

74. Kristensen, 0., et al., A structural basis for transition-state stabilization in antibody-catalyzed hydrolysis: crystal structures of an abzyme at 1. 8 A resolution. J Mol Biol, 1998.281(3): p. 501-11.

75. Miyashita, H., et al., Site-directed mutagenesis of active site contact residues in a hydrolytic abzyme: evidence for an essential histidine involved in transition state stabilization. J Mol Biol, 1997.267(5): p. 1247-57.

76. Miyashita, H., et al., A common ancestry for multiple catalytic antibodies generated against a single transition-state analog. Proc Natl Acad Sci USA, 1994.91(13): p. 6045-9.

77. Suzuki, H., et al., A catalytic antibody that accelerates the hydrolysis of carbonate esters. Prediction of the binding-site structure of the substrate. J Protein Chem, 1998.17(3): p. 273-8.

78. Tramontano, A., Ammann, A.A. and Lerner R.A., Antibody catalysis approaching the activity of enzymes. Am. Chem. Soc., 1988.110(7): p. 2282 2286.

79. Blackburn, G.M., et al., Catalytic antibodies. Biochem J, 1989.262(2): p. 381-90.

80. Janda, K.D., et al., Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science, 1988.241(4870): p. 1188-91.

81. Thayer, M.M., et al., Structural basis for amide hydrolysis catalyzed by the 43C9 antibody. J Mol Biol, 1999.291(2): p. 329-45.

82. Miyashita, H., et al., Prodrug activation via catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(11): p. 5337-40.

83. Landry, D.W., et al., Antibody-catalyzed degradation of cocaine. Science, 1993. 259(5103): p. 1899-901.

84. Mets, В., et al., A catalytic antibody against cocaine prevents cocaine's reinforcing and toxic effects in rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(17): p. 10176-81.

85. Janda, K.D., Weinhouse, M.I., Schloeder, D.M., Lerner, R.A. and Benkovic, S.J., Bait and switch strategy for obtaining catalytic antibodies with acyl-transfer capabilities. J. Am. Chem. Soc., 1990.112(3): p. 1274 1275.

86. Wentworth, P., Jr., et al., A bait and switch hapten strategy generates catalytic antibodies for phosphodiester hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1998.95(11): p. 5971-5.

87. Iverson, B.L. and R.A. Lerner, Sequence-specific peptide cleavage catalyzed by an antibody. Science, 1989.243(4895): p. 1184-8.

88. Baldwin, E. and P.G. Schultz, Generation of a catalytic antibody by site-directed mutagenesis. Science, 1989.245(4922): p. 1104-7.

89. Mahy, J.P., et al., Hemoabzymes. Different strategies for obtaining artificial hemoproteins based on antibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1998. 75(1): p. 103-27.

90. Luo, G.M., et al., Generation of selenium-containing abzyme by using chemical mutation. Biochem Biophys Res Commun, 1994.198(3): p. 1240-7.

91. Zhu, Z.Q., et al., Some physicochemical and enzymic properties of selenium-containing abzyme. Biochem Biophys Res Commun, 1994.202(3): p. 1645-50.

92. Ding, L., et al., Biochemical characterization of selenium-containing catalytic antibody as a cytosolic glutathione peroxidase mimic. Biochem J, 1998. 332 (Pt 1): p. 251-5.

93. Qi, D.H., et al., Protection of myocardial mitochondria against oxidative damage by selenium-containing abzyme m4G3. Appl Biochem Biotechnol, 1999. 82(3): p. 167-73.

94. Wirsching, P., et al., Reactive immunization. Science, 1995.270(5243): p. 1775-82.

95. Lerner, R.A. and C.F. Barbas, 3rd, Using the process of reactive immunization to induce catalytic antibodies with complex mechanisms: aldolases. Acta Chem Scand, 1996. 50(8): p. 672-8.

96. Barbas, C.F., 3rd, et al., Immune versus natural selection: antibody aldolases with enzymic rates but broader scope. Science, 1997. 278(5346): p. 2085-92.

97. Sinha, S.C., C.F. Barbas, 3rd, and R.A. Lerner, The antibody catalysis route to the total synthesis ofepothilones. Proc Natl Acad Sci USA, 1998.95(25): p. 14603-8.

98. Shabat, D., et al., Multiple event activation of a generic prodrug trigger by antibody catalysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999.96(12): p. 6925-30.

99. Shamis, M., H.N. Lode, and D. Shabat, Bioactivation of self-immolative dendritic prodrugs by catalytic antibody 38C2. J Am Chem Soc, 2004.126(6): p. 1726-31.

100. Sinha, S.C., et al., Prodrugs of dynemicin analogs for selective chemotherapy mediated by an aldolase catalytic Ab. Proc Natl Acad Sci USA, 2004.101(9): p. 3095-9.

101. Shabat, D., et al., In vivo activity in a catalytic antibody-prodrug system: Antibody catalyzed etoposide prodrug activation for selective chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U SA, 2001.98(13): p. 7528-33.

102. Rader, C., et al., A humanized aldolase antibody for selective chemotherapy and adaptor immunotherapy. J Mol Biol, 2003.332(4): p. 889-99.

103. Stewart, J.D. and S.J. Benkovic, Transition-state stabilization as a measure of the efficiency of antibody catalysis. Nature, 1995. 375(6530): p. 388-91.

104. Paul, S., et al., Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science, 1989.244(4909): p. 1158-62.

105. Shuster, A.M., et al., DNA hydrolyzing autoantibodies. Science, 1992.256(5057): p. 6657.

106. Mei, S., et al., Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. J Biol Chem, 1991. 266(24): p. 15571-4.

107. Gao, Q.S., et al., Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J Biol Chem, 1994.269(51): p. 32389-93.

108. Sun, M., et al., Proteolytic activity of an antibody light chain. J Immunol, 1994.153(11): p. 5121-6.

109. Gao, Q.S., et al., Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. J Mol Biol, 1995.253(5): p. 658-64.

110. Gololobov, G.V., et al., DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1994.47(2-3): p. 305-14; discussion 314-5.

111. Ponomarenko, N.A., et al., Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. J Immunol Methods, 2002.269(1-2): p. 197-211.

112. Gabibov, A.G., et al., DNA-hydrolyzing autoantibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3): p. 293-302; discussion 303.

113. Gololobov, G.V., et al., Cleavage of supercoiledplasmid DNA by autoantibody Fab fragment: application of the flow linear dichroism technique. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(1): p. 254-7.

114. Gololobov, G.V., et al., DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody В V 0401: origins of catalytic activity. Mol Immunol, 1997.34(15): p. 1083-93.

115. Tawfik, D.S., et al., Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition-state analog: is there a linkage to autoimmunity? Proc Natl Acad Sci USA, 1995.92(6): p. 2145-9.

116. Nishi, Y., Evolution of catalytic antibody repertoire in autoimmune mice. J Immunol Methods, 2002.269(1-2): p. 213-33.

117. Thiagarajan, P., et al., Monoclonal antibody light chain withprothrombinase activity. Biochemistry, 2000.39(21): p. 6459-65.

118. Thiagarajan, P. and S. Paul, Prothrombin cleaving antibody light chains. Chem Immunol, 2000.77: p. 115-29.

119. Paul, S., et al., Characterization of thyroglobulin-directed andpolyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease. J Immunol, 1997.159(3): p. 1530-6.

120. Li, L., et al., Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J Immunol, 1995.154(7): p. 3328-32.

121. Ponomarenko, N.A., et al., Autoantibodies to myelin basic protein catalyze site-specific degradation of their antigen. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(2): p. 281 -6.

122. Lacroix-Desmazes, S., et al., Catalytic activity of antibodies against factor VIII in patients with hemophilia A. Nat Med, 1999.5(9): p. 1044-7.

123. Shuster, A.M., et al., Anti-idiotypic and natural catalytically active antibodies. Mol Biol (Mosk), 1991.25(3): p. 593-602.

124. Bronshtein, I.B., et al., DNA-specific antiidiotype antibodies in the sera of patients with autoimmune diseases. FEBS Lett, 1992.314(3): p. 259-63.

125. Avalle, В., D. Thomas, and A. Friboulet, Functional mimicry: elicitation of a monoclonal anti-idiotypic antibody hydrolizing beta-lactams. Faseb J, 1998.12(11): p. 1055-60.

126. Lefevre, S., et al., A suicide-substrate mechanism for hydrolysis of beta-lactams by an anti-idiotypic catalytic antibody. FEBS Lett, 2001.489(1): p. 25-8.

127. Avalle, В., et al., Catalytic mechanism of an abzyme displaying a beta-lactamase-like activity. Appl Biochem Biotechnol, 2000.83(1-3): p. 163-9; discussion 169-71,297-313.

128. Izadyar, L., et al., Monoclonal anti-idiotypic antibodies as functional internal images of enzyme active sites: production of a catalytic antibody with a cholinesterase activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1993.90(19): p. 8876-80.

129. Kolesnikov, A.V., et al., Enzyme mimicry by the antiidiotype antibody approach. Proc Natl Acad Sci USA, 2000.97(25): p. 13526-31.

130. Aleksandrova, E.S., et al., A structure-activity study of a catalytic antiidiotype antibody to the human erythrocyte acetylcholinesterase. Bioorg Khim, 2002.28(2): p. 118-25.

131. Guo, J., et al., Mechanistically different catalytic antibodies obtained from immunization with a single transition-state analog. Proc Natl Acad Sci USA, 1995.92(5): p. 1694-8.

132. Zhou, G.W., et al., Crystal structure of a catalytic antibody with a serine protease active site. Science, 1994.265(5175): p. 1059-64.

133. Антонов, B.K., Химия протеолиза. 1991, Москва.

134. Oleksyszyn, J. and J.C. Powers, Irreversible inhibition of serine proteases by peptide derivatives of (alpha-aminoalkyl)phosphonate diphenyl esters. Biochemistry, 1991. 30(2): p. 485-93.

135. Pollard, S.R., et al., CD4-binding regions of human immunodeficiency virus envelope glycoprotein gp!20 defined by proteolytic digestion. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(24): p. 11320-4.

136. Theofilopoulos, A.N. and F.J. Dixon, Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv Immunol, 1985.37: p. 269-390.

137. Knight, J.G., D.D. Adams, and H.D. Purves, The genetic contribution of the NZB mouse to the renal disease of the NZB x NZW hybrid. Clin Exp Immunol, 1977.28(2): p. 352-8.

138. Bernard, C.C. and P.R. Carnegie, Experimental autoimmune encephalomyelitis in mice: immunologic response to mouse spinal cord and myelin basic proteins. J Immunol, 1975. 114(5): p. 1537-40.

139. Fujii, I., et al., Evolving catalytic antibodies in aphage-displayed combinatorial library. Nat Biotechnol, 1998.16(5): p. 463-7.

140. Janda, K.D., et al., Chemical selection for catalysis in combinatorial antibody libraries. Science, 1997.275(5302): p. 945-8.

141. Griffiths, A.D., et al., Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. Embo J, 1994.13(14): p. 3245-60.

142. Tramontano, A., et al., Inhibition and labeling of enzymes and abzymes by phosphonate diesters. Appl Biochem Biotechnol, 2000.83(1-3): p. 233-42; discussion 242-3,297-313.

143. Goletz, S., et al., Selection of large diversities of antiidiotype antibody fragments by phage display. J Mol Biol, 2002.315(5): p. 1087-97.

144. Kitz, R. and I.B. Wilson, Esters of methanesulfonic acid as irreversible inhibitors of acetylcholinesterase. J Biol Chem, 1962. 237: p. 3245-9.

145. Okerberg, E.S., et al., High-resolution functional proteomics by active-site peptide profiling. Proc Natl Acad Sci USA, 2005.102(14): p. 4996-5001.

146. Лебедев, А.Т., Масс-спектрометрия в органической химии. Методы в Химии. 2003, Москва: БИНОМ Лаборатория знаний. 493.

147. Kabat, Е.А., Wu,T.T., Perry,Н.М., Gottesman,K.S. and Foeller,C., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 1991.

148. Wang, J.C., Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002.3(6): p. 430-40.

149. Tramontano, A., K.D. Janda, and R.A. Lerner, Chemical reactivity at an antibody binding site elicited by mechanistic design of a synthetic antigen. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(18): p. 6736-40.

150. Angeles, T.S., et al., Isoabzymes: structurally and mechanistically similar catalytic antibodies from the same immunization. Biochemistry, 1993.32(45): p. 12128.-35.

151. Martin, M.T., et al., Mechanistic studies of a tyrosine-dependent catalytic antibody. Biochemistry, 1991.30(40): p. 9757-61.

152. Erhan, S. and L.D. Greller, Do immunoglobulins have proteolytic activity? Nature, 1974. 251(5473): p. 353-5.

153. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 1977.74(12): p. 5463-7.

154. Arkin, M.R. and J. A. Wells, Probing the importance of second sphere residues in an esterolytic antibody by phage display. J Mol Biol, 1998. 284(4): p. 1083-94.

155. Ponomarenko, N.A., et al., Catalytic activity of autoantibodies toward myelin basic protein correlates with the scores on the multiple sclerosis expanded disability status scale. Immunol Lett, 2006.103(1): p. 45-50.

156. Ponomarenko, N.A., et al., Induction of a protein-targeted catalytic response in autoimmune prone mice: antibody-mediated cleavage of HIV-1 glycoprotein GP120. Biochemistry, 2006.45(1): p. 324-30.

157. Laemmli, U.K., Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970.227(5259): p. 680-5.

158. Lee, S.Y. and S. Rasheed, A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques, 1990.9(6): p. 676-9.

159. Hixson, C.S. and E.G. Krebs, Affinity labeling of catalytic submit of bovine heart muscle cyclic AMP-dependentprotein kinase by 5'-p-fluorosulfonylbenzoyladenosine. J Biol Chem, 1979.254(16): p. 7509-14.