Локализация и характеристика мурамиллептидсвязывающих молекул клеток иммунной системы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Головина, Татьяна Николаевна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1996 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Локализация и характеристика мурамиллептидсвязывающих молекул клеток иммунной системы»
 
Автореферат диссертации на тему "Локализация и характеристика мурамиллептидсвязывающих молекул клеток иммунной системы"

Российская Академия Наук

Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биоорганической Химии р ^ д М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

— | [о^

На правах рукописи

Головина Татьяна Николаевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУРАНИЛПЕПТИДСВЯЗЫВАВДИХ МОЛЕКУЛ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук В.А.Несмеянов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Н.В.Бовин

доктор медицинских наук Б. В.Пинегин

Ведущая организация:

Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится 24 апреля 1996 г. в 10 часов на заседании специализированного совета, Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. по адресу: 117871, ГСП-7, Москва. В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и О. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 22 марта 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Мурамилпептиды - класс соединений, открытый в результате поиска иммуноактивного компонента клеточ-1ых стенок микобактерий, входящих в состав полного адъюванта Е>рейнда, широко используемого при иммунизации зксперименталь-шх животных. Минимальным фрагментом клеточной стенки, который «ожет заменить целые бактерии в полном адъюванте Фрейнда, яв-]яется М-ацетилмурамоил-Ь-аланил-Б-изоглутамин (МДП). МДП об-тадает широким спектром биологических эффектов, среди которых (аиболее важны адъювантная активность, стимуляция неспецифи-{еской резистентности к бактериальным и вирусным инфекциям, шрогенное и сомногенное действие. Во многих лабораториях ми-)а, в том числе и в России, были синтезированы аналоги МДП с 1рко выраженной иммуномодулирующей активностью..

Большая группа М-ацетилглюкозаминсодержащих мурамилпепти-юв была синтезирована в лаборатории химии пептидов ИБХ им. 1.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, и среди них М-ацетилглю-юзаминил-(Р1-4)-М-ацетилмурамоил-аланил-С-изоглутамин (ГМДП), (бладающий помимо выраженной адъювантной активности и противо-щухолевым действием. Иммуномодулирующая и противоинфекционная живность ГМДП открыли возможность его клинического использо-1ания. В 1995 г таблетированная лекарственная форма ГМДП-"Ли~ :опид"- была зарегистрирована в Государственном Реестре ле-:арственных средств Российской Федерации. Однако, для создания :овых эффективных лекарственных препаратов на основе ГМДП тре-'уется знание механизма его"действия, который, несмотря на зна-ительное число исследований, до настоящего времени остается евыясненным.

Наличие связи между биологической активностью мурамилпеп-идов и их пространственной конфигурацией, а также насыщаемый ;арактер зависимости доза-ответ говорят в пользу рецепторного еханизма действия. Однако полученные к началу данной работы ведения о рецепторах мурамилпептидов и их локализации явля-ись противоречивыми. Хотя МДП-связывающие молекулы и были об-аружены на поверхности макрофагов, были опубликованы данные о ом, что биологическое действие МДП является результатом его роникновения внутрь клетки-мишени (макрофага) и взаимодейс-вия со специфическими внутриклеточными рецепторами. Ничего не

- г -

было известно о наличии МП-связывающих молекул на других типе клеток. Поэтому для понимания механизма действия мурамилпегт дов и, в частности, ГМДП, идентификация и характеристика внут риклеточных ГМДП-связывающих молекул представляли собой акт} альную задачу.

Цель работы. Данная работа является составной частью исследс ваний молекулярного и клеточного механизма действия ГМДП, прс водимых в лаборатории иммунохимии Института биоорганическс химии им. М. М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Целями настоящей работы являлись идентификация, выделен« и характеристика ГМДП-связывающих белков иммунокомпетентнь клеток, прежде всего, макрофагов.

Научная новизна и практическая значимость работы. С использс ванием флюоресцентно-меченого производного ГМДП было впервь определено число внутриклеточных сайтов связывания ГМДП в им мунокомпетентных клетках различной этиологии. С использование иод(125)-меченного производного ГМДП охарактеризованы молеку лярные массы макрофагальных ГМДП-связывающих белков. Впервь показано, что ГМДП-связывающие белки могут быть элюированы субклеточных фрагментов макрофагов высокой концентрацией КС1 а в случае клеток У/ЕН1-3 также и хелатирующими агентами. Раз работаны схемы очистки ГМДП-связывающих белков с молекулярным массами 32 и 34 кДа из клеток ШП-З и перитонеальных макрофа гов мыши. Эти белки выделены в гомогенном состоянии, и показа на их идентичность гистонам Н1.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложен на следующих симпозиумах: 11-ом Съезде Европейской Федераци Иммунологических Обществ (Эспоо, Финляндия, 1991), симпозиума "Структура и функции регуляторных полипептидов" (Москва, 1992 и "Современные тенденции в исследовании лейкозов" (Ст.-Петер бург. 1994), 3-м международном симпозиуме по биоорганическо химии (Дагомыс', Россия. 1995).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опуб ликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложен на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментально части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего и 300 наименований. Работа содержит 32 рисунка и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Определение числа специфических ГМДП-связывающих сайтов внутри различных клеток-мишеней.

Сведения о клетках-мишенях мурамилпептидов являются противоречивыми. и поэтому начальным этапом работы по выделению и очистке ГМДП-связывающих белков было, во-первых, определение того, какие иммунные клетки способны связывать ГМДП (рис.1) и. во-вторых, определение числа ГМДП-связывающих сайтов у иммуно-компетентных клеток различной этиологии.

Рис.1. Строение ГМДП.

В работе использовали следующие клетки: прилипающие клетки перитонеального экссудата мышей Balb/c. мышиную миеломоноци-тарную линию WEHI-3, Т-лимфоцитарные линии EL-4 (мышиная), JURKAT (человеческая) и RLS (крысиная); мышиные миеломные линии PAI и SP-2/0, а также нейробластому человека IMR-32. Исследования проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием меченого флуоресцеинизотиоцианатом лизин-содержа-щего аналога ГМДП - ГМДП-Lys-FluTC - у которого флюоресцеино-вая группировка присоединена к е-аминогруппе лизина (рис.2).

Биологическая активность ГМДП-Lys-FluTC проверялась в тестах на индукцию экспрессии 1а-антигенов и на адъювантную активность. ГМДП-Lys-FluTC усиливал экспрессию 1а-антигенов на перитонеальных макрофагах мыши, хотя и несколько слабее, чем ГМДП; адьювантная активность ГМДП-Lys-FluTC при ответе мышей Balb/c на овальбумин была на уровне ГМДП.

Рис.2. Строение ГМДП-Ьуз-ПиТС.

ИНТЕНСИВНОСТЬ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

Рис.3. Определение числа специфических внутриклеточных центро связывания ГМДП методом проточной цитофлюориметрии.

Для количественного определения ГМДП-связывавдих центров в одной клетке были использованы флюоросферы с известным содержанием флюореецеина (Coultronics, Франция).

Исследуемые клетки инкубировали с 1 мкМ ГМДП-Lys-FluTC. Для ингибирования специфического связывания вносили немеченный ГМДП в соотношении 1:1, 1:10 и 1:100 к меченому аналогу. После отмывки клеток от избытка метки определяли положения максимумов флюоресценции для клеток, обработанных ГМДП-Lys-FluTC. в отсутствие (общее связывание) и в присутствии ГМДП (неспецифическое связывание) (рис.3). Число специфических мест связывания определяли как разность между общим и неспецифическим связыванием.

Обработка ГМДП-Lys-FluTC нативных клеток в условиях, препятствующих эндоцитозу (4°С, наличие 0,01% азида натрия в среде инкубации) не приводила к заметному изменению флюоресценции клеток по сравнению с необработанными. На всех изученных мишенях число связавшихся с интактными клетками молекул ГМДП-Lys-FluTC не превышало 1000 на клетку, предела чувствительности цитофлюориметра (не менее 1000 молекул флюореецеина на клетку).

Однако, если клетки были обработаны параформальдегидом. а затем клеточные мембраны перфорированы обработкой мягким неионным детергентом н-октил-р-О-глюкопиранозидом. то при добавлении ГМДП-Lys-FluTC интенсивность флюоресценции резко возрастала, что говорило о наличии внутриклеточных центров связывания ГМДП.

При этом у перитонеальных макрофагов, клеток WEHI-3, Т-лимфоцитарных линий JURKAT, RLS и EL-4. а также нейробласто-мы IMR-32 наблюдалось дозозависимое ингибирование связывания ГМДП-Lys-FluTC при внесении избытка немеченого ГМДП. что свидетельствовало о наличии сайтов специфического связывания. У миеломных клеточных линий PAI и SP-2/0 ингибирования связывания не наблюдалось. Результаты определения числа внутриклеточных ГМДП-связывающих сайтов представлены в таблице 1.

Табл.1. Число мест связывания ГМДП в клетках различной этиоло гии, определенное методом проточной цитофлюориметрии

Число специфических внутриклеточных сайтов % специфического связывания по отношению к общем:

Перитонеальные

макрофаги мыши 98000+5900 63%

WEHI-3 30350±1760 35%

JURKAT. 40700+2440 23%

RLS 32800+1640 25%

EL-4 22300+1100 11%

IMR-9 75000+7800 13%

PAI - -

SP-2/0 - —

2. Изучение связывания ГМДП-Ьуз-ПиТС с субклеточными фрагментами ШШ-3.

Большой интерес представлял вопрос о том, являются ли ГМДП-связывающие белки интегральными мембранными белками или нет. Для того, чтобы получить ответ на этот вопрос, мы изучали связывание ГМДП-Ьуэ-РШТС с субклеточными фрагментами клеток ИЕН1-3, полученными при разрушении клеток гипотоническим шоком и обработанными высокими концентрациями соли или хелатирующими агентами.

Связывание ГМДП-Ьуэ-ПиТС с субклеточными фрагментами Ш-Н1-3 изучали методом поляризации флюоресценции с использованием спектрофлюориметра ННасй1-МРГ4 (Япония). В качестве величины анизотропии флюоресценции в каждой точке брали среднее значение из тридцати рассчитанных по формуле [1] значений анизотропии флюоресценции в этой точке.

(Iiu-III)-G(IU-IL)

г=- [1]

(Im-In)+2G(Itx-It)

где 1ш и Гц - интенсивности флюоресценции в плоскостях параллельной и перпендикулярной плоскости вертикально поляризованного возбуждающего света. 11Х и 1Ц - светорассеяние клеточной суспензии в плоскостях параллельной и перпендикулярной плоскости падающего света, в - приборная константа, определяемая при горизонтально поляризованном возбуждающем свете как отношение ^„Лцо (1ю и 1ц0 - интенсивности флюоресценции в плоскостях перпендикулярной и параллельной плоскости горизонтально поляризованного возбуждающего света).

Рис.4. Связывание ГМДП-Ьуз-ПиТС с фрагментами ШШ-3: исходные фрагменты (о), фрагменты после обработки 2 М КС 1 (*). фрагменты после обработки 0.01 М ЭДТА (•).

В результате обработки 2 М KCl или 0.01 М ЭДТА способное! субклеточных фрагментов WEHI-3 связывать ГМДП-Lys-FluTC резв падала (рис.4), что позволяло сделать предположение, что клеток WEHI-3 внутриклеточные мишени ГМДП не являются интег ральными мембранными белками, а принадлежат к белкам, чье свя зывание с субклеточными структурами определяется электростати ческими взаимодействиями, что и было подтверждено в ходе даль нейших экспериментов (п.4).

3. Фотоаффинное мечение внутриклеточных ГМДП-связывающи молекул перитонеальных макрофагов мыши.

По результатам оценки числа специфических внутриклеточны ГМДП-связывающих сайтов у различных клеток, а также процент специфического связывания по отношению к общему для дальнейше работы по характеристике и выделению ГМДП-связывающих молеку использовали перитонеальные макрофаги и клетки WEH1-3.

С целью предварительной характеристики внутриклеточны ГМДП-связывающих молекул перитонеальных макрофагов мыши бы использован метод фотоаффинного мечения, позволяющий ковалент но присоединить радиоактивно меченный лиганд к рецептору. Дл; ковалентного связывания ГМДП с рецептором было синтезирован! радиоактивно меченное фотоактивируемое производное - N-аце тилглюкозаминил-(ßl-4)-Л-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутамил-] -(3-[1251]-4-азидосалицилоил)лизин или rMHn-Lys(Cl25I]Azs; (рис.5).

HOCH, HOCH,

Н.ОН

ОН ш|

H.C-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-I

I II сн, о

СН (CH,J —С NH СН (СН,)—NH—С-¿ONH, О ¿оон «

О

соон

Рис.5. Строение ГМЛП-Lys{[1231}AzS).

После инкубации перфорированных 0,001% дигитонином перито-неальных макрофагов с ГМДП-Ьуз([1251]АгБ) в отсутствие или в присутствии избытка немеченого ГМДП клетки облучали УФ-светом, после чего лизировали горячим буфером для приготовления элект-рофоретических образцов и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с последующей радиоавтографией. В результате было показано наличие ряда меченых белков, однако лишь часть из них связывала радиоактивный лиганд специфически за счет мурамоилпептидной группировки.

Радиоавтограф ПААГ после БОБ-электрофореза модифицированных белков перитонеальных макрофагов мыши представлен на рисунке 6.

Связывание ГМЛП-Ьуэ([12 51]АгБ) с белками, молекулярные массы которых лежали в пределах 31-34 кДа и 37-39 кДа полностью подавлялось при добавлении 1000-кратного избытка немеченого ГМДП. Связывание с белком с молекулярной массой в интервале 43-47 кДа при добавлении 1000- и 10000-кратного избытка немеченого ГМДП ингибировалось лишь частично. В то же время связывание этого белка с 1251~меченым аналогом полностью ингибировалось 100-кратным избытком конъюгата ГМДП-ЬузСАгБ), что свидетельствовало в пользу того, что в связывании с белком 43-47 кДа участвует вся молекула ГМДП-Ьуз(АгБ).

В противовес полученным нами данным Тепи еС а1 было показано, что связывание МДП-Ьуэ([1251]АгБ) с внутренним рецептором альвеолярных макрофагов кролика, имеющим близкую по вели-

ГМДП-Ьуз(С125I]АгБ) и 3 мМ ГМДП; цифры слева указывают положение белков с известными молекулярными массами.

дорожка

вая дорожка ГМДП-Ьуэ([12 51]АгБ),

Рис.6. Фотоаффинное мечение белков перитонеальных макрофагов мыши. Радиоавтограф ПААГ: - ле-

3 мкМ правая 3 мкМ

чине молекулярную массу 40-45 кДа, может быть полностью подавлено избытком немеченого МДП. В настоящее время остается неясным. осуществляют ли мурамоилпептидсвязывающие молекулы кролика (40-45 кДа) и мыши (43-47 кДа) аналогичные функции или нет.

4. Характеристика ГМДП-связывающих белков с использованием вестерн-блот анализа.

Радиоактивно-меченые производные ГМДП имеют ряд существенных недостатков при использовании их для детектирования ГМДП-связывающих белков в процессе их очистки, а именно, быстрое падение удельной радиоактивности у меченых 1251 производных. В то же время одной из наиболее удобных меток является остаток биотина. Биотинилированное производное ГМДП (ГМДП-био-тин) получали путем конъюгации ГМДП-Ьуэ и Ы-оксисукцинимидного эфира О-биотинаминокапроновой кислоты. Методом проточной ци-тофлюориметрии было показано, что ГМДП-биотин связывался с внутриклеточными ГМДП-связывающими сайтами клеток ШЕН1-3, и это связывание подавлялось при внесении избытка немеченого ГМДП. К сожалению, чувствительность, достигаемая с помощью этого соединения, была недостаточна для визуализации ГМДП-свя-зывающих белков. Поэтому в качестве биотинилированного производного ГМДП использовали (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1), синтезированное в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН. Это соединение представляет собой смешанный конъюгат ГМДП-Ьуэ и биотина с линейным полимером полиакриламида с молекулярной массой 30-40 кДа. (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) содержит 20 мольных процентов ГМДП-Ьуз, и 5 мольных процентов биотина.

Доступность остатков ГМДП в конъюгате (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1) для взаимодействия с ГМДП-связывающими белками была проверена на примере моноклональных антител против ГМДП. Конъюгат связывался с антителами против ГМДП, и это связывание ингибирова-лось ГМДП дозозависимым образом (рис.7 и 8).

Данное свойство (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В!) было использовано для поиска ГМДП-связывающих белков в мышиных и крысиных перитоне-альных макрофагах, клетках ИЕН1-3.

Рис.7. Связывание

(ГМДП-Ьуз)-ПАА-СВ1) с монокло-нальными антителами против ГМДП в твердофазном ИФА. Отрицательный контроль: связывание с теми же антителами (С1с)-ПАА-(В1).

Рис.8. Конкурентное ингибиро-вание взаимодействия

(ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) с ан-ти-ГМДП МА в присутствии ГМДП.

Так как после обработки 2 М КС1 субклеточные фрагменты Н1-3 утрачивали способность связывать ГМДП-Ьуз-ПиТС (рис.4, стр.7) можно было ожидать, что после осаждения обработанных КС1 фрагментов центрифугированием при 102000х§ в течение 60 мин ГМДП-связыващие белки могут быть обнаружены в КС1-супер-натанте. С использованием метода вестерн-блот анализа в КС1-супернатанте Ю1-3 были обнаружены белки с молекулярными массами 32 кДа (Б32) и 34 кДа (Б34), связывавшие (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1), причем это связывание полностью ингибиро-валось внесением избытка немеченого ГМДП. Кроме этого, белки с молекулярными массами 19 кДа и 17 кДа также связывали (ГМДП-Ьув)-ПАА-(В1). и это связывание ослаблялось, но не подавлялось полностью в присутствии ГМДП (рис.9. А). ГМДП-связы-вающие белки с близкими молекулярными массами были найдены в КС1-супернатанте перитонеальных макрофагов мыши (рис.9. Б) и в макрофагах крысы (рис.9. В).

Вероятно, две белковые полосы Б32 и Б34, имеющие близки значения молекулярных масс, обнаруженные у перитонеальных мак рофагов мыши методом вестерн-блот анализа, соответствуют широ кой полосе 31-34 кДа, выявленной при фотоаффинном мечении. то же время ГМДП-связывающие сайты белка 37-39 кДа. выявляемо го с использованием фотоаффинного мечения, в процессе электро фореза с БОБ, вероятно, претерпевали необратимую денатурацию так как вестерн-блоттингом этот белок не выявлялся.

ГМДП ингибировал связывание (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В!) с белкам] Б32 и Б34 дозозависимым образом. Дисахарид И-ацетилглюкозами нил- ((31-4) -£1-ацетилмурамовая кислота не влиял на связывание, < дипептид А1а-0-1С1п ингибировал связывание лишь частичн! (рис. Ю).

Обработка протеолитическими ферментами различной специфичности, а именно трипсином, папаином и проназой, интактных перитонеальных макрофагов мыши и клеток ИЕН1-3 не изменяла молекулярных масс ГМДП-связывающих белков и не отменяла их способность связывать (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1). Это свидетельствовало с недоступности Б32 и Б34 для протеолиза, и наиболее вероятно{ причиной этого являлась их внутриклеточная локализация.

А.

Б.

о-

30-

20-

М—

I

94—

67—

9467—

43-

30-

20-

20—

И—

I

12 12 12

Рис.9. Вестерн-блоттинг белков: А - КС1-элюата клеток WEHI-3; Б - КСЬэлюата перитонеальных макрофагов мыши; В - белков перитонеальных макрофагов крыс И15ТА1?. Обработка реплик 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуз)—ПАА-(В1) (1); обработка реплик 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуг)-ПАА-(В1) и 5 мг/мл ГМДП (2). Визуализация зонда по стандартной методике стрептавидин-пероксидазой.

Рис.ю. Вестерн-блоттинг белков перитонеальных макрофагов мыши. Обработка реплики: 1) 1 мкг/мл (ГМД1Н,уз)-ПАА-(В1); 2) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 2,5 мг/мл ГМДП; 3) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 5 МГ/МЛ ГМДП: 4) 1 МКГ/МЛ (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-{В1) и 2.5 иг/т дисахарида; 5) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 2,5 мг/мл дипептида. Визуализация зонда по стандартной методике стрептавидин-пероксидазой.

5. Выделение ГМДП-связывающих белков клеток №Н1-3.

. Попытки использовать для очистки ГМДП-связывающих белков аффинные сорбенты, несущие в качестве лигандов ГЩЩ, ГМДП-Ьуз или антиидиотипические моноклональные антитела против ГМДП не привели к положительному результату либо по причине недостаточной аффинности связывания лигандов с рецепторами ГМДП, либо из-за стерических препятствий. Это обстоятельство привело к необходимости поиска альтернативных путей очистки ГМДП-связывающих белков.

Для выделения ГМДП-связывающих белков ИЕНЬЗ использовали тот факт, что в этих клетках белки Б32 и Б34 могут быть элюи-рованы с субклеточных фрагментов 0.01 М ЗДТА. После ряда предварительных опытов было выяснено, что для очистки ГМДП-связывающих белков наиболее приемлемой является ВЭЖХ на анионо-об-менной колонке ОЕАЕ ТБК 5РИ (ЬКВ). Колонку уравновешивали в 0.002 М Трис-НС1 рН 7.6, содержавшем 0.002 М ЭДТА. Элюцию проводили в 0-0.5 М градиенте НаС1. ГМДП-связывающую активность определяли с использованием вестерн-блот анализа.

Профиль элюдаи белков ЭДТА-супернатанта с колонки дЕ, ТБК-5РИ (ЬКВ) представлен на рис.11. ГМДП-связывающие бет элюировались в 0.5 М №С1 практически после всех остальш белков ЭДТА-супернатанта. БОБ-электрофорез ГМДП-связывающ] белков из клеток 1№Ш-3. полученных в результате ионообменш хроматографии ЭДТА-супернатанта представлен на рис. И (встаг ка).

Рис.И. Профиль элюции белков ЭДТА-элюата ИЕН1-3 с колоню ВЕАЕ ТБК-5РШ (ЬКВ). Колонка уравновешена в 2 мМ Трис-НС] рН7.6, с 2 мМ ЭДТА; элюция линейным градиентом ИаС1 (0-0.5 М). Вставка: электрофорез в ПААГ очищенных ГМДП-связывающих белков клеток WEHI-3. Цифры слева указывают положение белков с .известными молекулярными массами.

6. Выделение ГМДП-связывающих белков перитонеальных макрофагов мыши.

При наработке ГМДП-связывающих белков из перитонеальных макрофагов выяснилось, что, в отличие от клеток ИЕН1-3. макро-фагальные белки Б32 и Б34 элюировались с субклеточных фрагментов лишь высокими концентрациями соли и не элюировались ЭДТА. Необходимость элюции белков высокой концентрацией соли затрудняло применение ионообменной хроматографии для их очистки, так как при диализе или обессоливании эти белки практически полностью терялись вследствие адсорбции. Поэтому для очистки мак-рофагальных ГМДП-связывающих белков использовали гель-фильтрацию.

Субклеточные фрагменты, получаемые после разрушения клеток осмотическим шоком, сначала обрабатывали 0.01 М ЭДТА, осаждали центрифугированием при 102000хя в течение 60 мин и лишь после этого обрабатывали 2 М КС1 для получения КС1-супернатанта. Эта стадия сразу позволяла освободиться от целого ряда сопутствующих белков. ГМДП-связывающие белки выделяли из КС1-супернатан-та методом ВЗЖХ на гель-фильтрационной колонке С 2000 БИ, уравновешенной в 0.002 М Трис-НС1, рН 7.6, содержавшем 0.002 М ЭДТА и 0.5 М ИаС1 (рис.12).

Рис.12. Профиль элюции белков КСХ-элюата перитонеальных макрофагов мыши с колонки с 2000 БДО. Элюция 2 мМ Трис-НС1 рН 7.6, содержащим 2 мМ ЭДТА и 0.5 М ИаС!, скорость потока 0.5 мл/мин.

ГМДП-связывающие белки выходили двумя пиками, соответствовавшими молекулярным массам 130-140 кДа и 25-30 кДа. Электрофорез в ПААГ показал, что высокомолекулярный пик представляет собой олигомер, состоящий из Б32 и Б34 в эквимолярных количествах. Второй, низкомолекулярный ГМДЛ-связывающий пик содержал белок Б34 с небольшой примесью Б32 (рис.13, А, Б).

А.

Б.

1 г X 4 S • 7 • » W Н « "

04—

67-

i

30— 2014-

•fe*

84 ¡i>".

- у ;

Рис. 13. А - SDS-электрофорез в 12% ПААГ; Б- вестерн-блоттинг фракций после ВЭЖХ-гель-хроматографии , реплики обрабатывали 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1), визуализация зонда стрептави-дин-пероксидазой. Цифры слева указывают положение белков с известными молекулярными массами; цифры сверху указывают номера фракций.

Для определения N-концевых последовательностей ГМДП-связывающие белки Б32 и Б34 после SDS-электрофореза в ПААГ электро-форетически переносили на мембрану Immobllon. Секвенирование производили на мембранных репликах на автоматическом твердофазном секвенаторе 470А (Applied Blosystems, США). Однако N-концёвые аминокислоты ГМДП-связывающих белков оказались блокированными. Для идентификации этих белков были получены трип-тические фрагменты ГМДП-связывающих белков, и у двух из них определены аминокислотные последовательности, что позволило идентифицировать ГМДП-связывающие белки, как белки семейства гистонов HI (рис.14).

АсБЕААРААРАААРРАЕКАРАКтАНКРАСУНКЮ^СРРУЗЕШКАУААЗКЕКЗСУЗЬАА 1ККШАШПШМН5РШЬС1К5ЬУ5КС11УйТКСТаА5С5ГКЬМККАА5СЕАКР0АККА СААКАККРАСААККРККАТСААТРККААККТРККАККРААААУТККУАКБРККАКУТКРККУ КБАБКАУКРКААКРКУАКАККУААККК

1) КА5СРРУБЕ1ЛТ; 2) АЬАААСУБУЕК

Рис.14. Аминокислотная последовательность гистона Н1А мыши и двух триптических фрагментов ГМДП-связывающих белков; подчеркнуты участки молекулы гистона Н1. идентичные этим фрагментам.

Известно, что гистоны Н1, имея молекулярную массу около 21.5 кДа, из-за высокого содержания лизина при ББЗ-форезе мигрируют как белки с массами 31-35 кДа. То, что число внутриклеточных центров связывания, определенное методом цитофлюоримет-рии, значительно меньше числа молекул гистона Н1 в клетке, указывает на то, что входящие в состав хроматина молекулы Н1 являются менее доступными для связывания. Это подтверждается тем фактом, что Н1 в составе хроматина значительно слабее реагируют с рядом анти-Н1 антител по сравнению с гистонами Н1 в свободном состоянии, а в некоторых случаях связывания не наблюдается вовсе.

Небезынтересно, что ГМДП-связывающие белки из миеломоноци-тарных клеток №Н1-3 в процессе выделения ведут себя как белки с кислыми свойствами, в то время как известно, что гистоны Н1 богаты лизином и являются основными белками. Причиной этого может являться как посттрансляционная модификация, а именно фосфорилирование, гистонов Н1 в интенсивно пролиферирующих клетках ИЕН1-3. так и то. что гистоны Н1 могут выделяться в комплексе с фрагментами ДНК, которые и придают белкам кажущиеся кислые свойства.

7. Функциональные аспекты взаимодействия ГМДП с гистонами Н1.

Гистоны Н1 - белки хроматина, одной из функций которых является понижение общей генной активности. Они экранируют ряд ре-гуляторных последовательностей ДНК. расположенных в линкерных участках. Взаимодействие ГМДП и его аналогов с гистонами Н1

может приводить к ослаблению связи последних с хроматином, результате чего регуляторные участки ДНК становятся доступным: для факторов транскрипции и ферментов.

Проведенные нами эксперименты показывают, что ГМДП конку рирует с ДНК за связывание с гистоном Н1 (рис.15). Дозозависи мость ингибирования указывает на наличие конкурентных отношений между ДНК и ГМДП за участки связывания на молекуле Н1.

Изменения, вызываемые ГМДП в структуре хроматина при связывании с гистоном Н1. повышают чувствительность последнего 1 расщеплению микрококковой нуклеазой (рис.16). Усиление эндо-нуклеазного расщепления в присутствии ГМДП наблюдалось в случае использования 0,4 Ед нуклеазы на 100 мкг хроматина и ш наблюдалось при более высокой концентрации фермента (4 Ед).

Рис.15. Конкурентное ингибиро-вание взаимодействия

(ГМДП-Ьув)-ПАА-(В1) с гистоном Н1 в присутствии ДНК фага X.

N

V

а б

Рис.16. Расщепление хроматина из ядер эритроцитов курицы микрококковой нуклеазой: а) 0.4 Ед нуклеазы; б) 0,4 Ед нуклеазы и 70 мкМ ГМДП.

ВЫВОДЫ.

1. Определено число специфических внутриклеточных сайтов связывания ГМДП в клетках различной этиологии, а именно в макрофагах, Т-лимфоцитах и клетках нейробластомы. Среди исследованных клеток наибольшее число специфических ГМДП-связыващих сайтов - 98000+5900 г обнаружено внутри перитонеальных макрофагов мыши.

2. Показано, что внутриклеточные ГМДП-связывающие белки макрофагов имеют молекулярные массы 32, 34 и 38 кДа.

3. Выделены в гомогенном виде ГМДП-связывающие белки макрофагов и клеток WEHI-3 с молекулярными массами 32 и 34 кДа. Частичным секвенированием показана их идентичность гистонам Hi.

4. Показано, что взаимодействие ГМДП с хроматином приводит к повышению чувствительности хроматина к эндонуклеазному расщеплению.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Golovlna T.N.. Sumaroka M.V., Lltvlnov I.S.. Khaldukov

5.V., Nesmeyanov V.A. Intracellular muramyl-peptide-bindlng molecules of macrophages.- Abstracts of the 11th Meeting of European Federation of Immunological socletes. Espoo. Finland, 1991. 13b-18.

2. Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaldukov S.V.,. Golovlna T.N.. Kamraz M.V., Komaleva R.L., Andronova T.M., Makarov E.A.. Nesmeyanov V.A. Ivanov V.T. Muramyl peptlde-binding sites are located inside target cells. FEBS Letters, 1991, V. 295. pp. 48-50.

3. Golovlna T.N., Khaldukov S. V., Samochvalova L.V.. Shebzuc-hov Yu.V., Litvinov I.S., Macarov E.A., Nesmeyanov V.A. Mura-myl-peptide binding sites-location and molecular characteristics. -Abstracts of Symposium "Structure and function of regulatory polypeptides". Moscow, June 26-30, 1992, p.23.

4. Golovlna T.N., Khaldukov S.V.. Litvinov I.S., Samochvalova L. V., Nesmeyanov V.A. Intracellular muramyl peptlde-binding molecules.- Abstracts of the 8th International Congress of Immunology. Budapest. Hungary. August 23-28, 1992, p.578.

5. Mareeva Т. Yu.. Kotova 0. V.. Golovlna T.V., Nesmeyanov V.A. Production and characterization of monoclonal antl-idiotypic antibodies to muramylpeptide. - FEBS Letters. 1994. v. 356, p. 13-16.

6. Nesmeyanov V.A., T.V. Golovlna, T.I. Valyaklna, Т.M. Andro-nova. V.T. Ivanov. Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides. - In "Immunotherapy of Infections", Ed. Noel Maslhi, Marcel Dekker. Inc., 1994, p. 213-223.

7. T.N.Golovlna, M.V.Sumaroka, L.V.Samokhvalova. Yu.Shebzuk-hov. Т.M. Andronova. V.A.Nesmeyanov. Biochemical characterization of glucosamlnylmuramyldipeptide binding sites of murine macrophages. FEBS Letters, 1994, v.356, p.9-12.

8. Т.Н.Головина, M. В. Сумарока, Л.В.Самохвалова. Ю.В.Шебзухов, Е.А.Макаров, В.А.Несмеянов. Идентификация полипептидов из пе-ритонеальных макрофагов мыши, узнающих глюкозаминилмурамоилди-пептиды. Биоорганическая химия. 1995 т.21, N4, с.268-274.

9. V.A.Nesmeyanov. T.N.Golovlna. Т.Yu.Mareeva. Khaidukov S.V. Molecular recognition of glucosamlnylmuramylpeptldes. - Abstracts of the 3-d International Symposium on Bloorganlc Chemistry, Dagomys, Russia, September 17-23, 1995.

10. T.N.Golovlna. L.V.Samokhvalova, I.S. Lltvinov, V.A. Nesmeyanov. Biochemical characterization of GMDP binding sites on murine macrophages. -'Abstracts of the 3-d International Symposium on Bloorganlc Chemistry. Dagomys. Russia. September. 17-23, 1995.