Локализация и характеристика мурамилпептидсвязывающих молекул клеток иммунной системы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Российская Академия Наук

Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биоорганической Химии им.Н.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи

Головина Татьяна Николаевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУРАМШШПТИДСВЯЗЫВАЩИХ МОЛЕКУЛ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук В.А.Несмеянов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Н. В.Бовин

доктор медицинских наук Б. В.Пинегин

Ведущая организация:

Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится 24 апреля 1996 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, по адресу: 117871, ГСП-7, Москва. В-437. ул. Миклухо-Маклая. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 22 марта 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Мурамилпептиды - класс соединений, открытый в результате поиска иммуноакти'вного компонента клеточных стенок микобактерий, входящих в состав полного адъюванта Фрейнда, широко используемого при иммунизации экспериментальных животных. Минимальным фрагментом клеточной стенки, который может заменить целые бактерии в полном адъюванте Фрейнда, является Г1-ацетилмурамоил-Ь-аланил-0-изоглутамин (МДП). МДП обладает широким спектром биологических эффектов, среди которых наиболее важны адъювантная активность, стимуляция неспецифической резистентности к бактериальным и вирусным инфекциям, пирогенное и сомногенное действие. Во многих лабораториях мира, в том числе и в России, были синтезированы аналоги МДП с ярко выраженной иммуномодулирующей активностью..

Большая группа И-ацетилглюкозаминсодержащих мурамилпепти-дов была синтезирована в лаборатории химии пептидов ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, и среди них И-ацетилглю-козаминил-(Р1-4)-И-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамин (ГМДП), обладающий помимо выраженной адъювантной активности и противоопухолевым действием. Иммуномодулирующая и противоинфекционная активность ГМДП открыли возможность его клинического использования. В 1995 г таблетированная лекарственная форма ГМДП-"Ли-копид"- была зарегистрирована в Государственном Реестре лекарственных средств Российской Федерации. Однако, для создания новых эффективных лекарственных препаратов на основе ГМДП требуется знание механизма его'действия, который, несмотря на'значительное число исследований, до настоящего времени остается невыясненным.

Наличие связи между биологической активностью мурамилпеп-тидов и их пространственной конфигурацией, а также насыщаемый характер зависимости доза-ответ говорят в пользу рецепторного механизма действия. Однако полученные к началу данной работы сведения о рецепторах мурамилпептидов и их локализации являлись противоречивыми. Хотя МДП-связывающие молекулы и были обнаружены на поверхности макрофагов, были опубликованы данные о том, что биологическое действие МДП является результатом его проникновения внутрь клетки-мишени (макрофага) и взаимодействия со специфическими внутриклеточными рецепторами. Ничего не

было известно о наличии МП-связывающих молекул на других типах клеток. Поэтому для понимания механизма действия мурамилпепти-дов и. в частности, ГМДП. идентификация и характеристика внутриклеточных ГМДП-связывающих молекул представляли собой актуальную задачу.

Цель работы. Данная работа является составной частью исследований молекулярного и клеточного механизма действия ГМДП. проводимых в лаборатории иммунохимии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Целями настоящей работы являлись идентификация, выделение и характеристика ГМДП-связывающих белков иммунокомпетентных клеток, прежде всего, макрофагов.

Научная новизна и практическая значимость работы. С использованием флюоресцентно-меченого производного ГМДП было впервые определено число внутриклеточных сайтов связывания ГМДП в иммунокомпетентных клетках различной этиологии. С использованием иод(125)-меченного производного ГМДП охарактеризованы молекулярные массы макрофагальных ГМДП-связывающих белков. Впервые показано, что ГМДП-связывающие белки могут быть элюированы с субклеточных фрагментов макрофагов высокой концентрацией KCl. а в случае клеток WEHI-3 также и хелатирующими агентами. Разработаны схемы очистки ГМДП-связывающих белков с молекулярными массами 32 и 34 кДа из клеток WEHI-3 и перитонеальных макрофагов мыши. Эти белки выделены в гомогенном состоянии, и показана их идентичность гистонам Н1.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на следующих симпозиумах: 11-ом Съезде Европейской Федерации Иммунологических Обществ (Эспоо. Финляндия. 1991), симпозиумах "Структура и функции регуляторных полипептидов" (Москва, 1992) и "Современные тенденции в исследовании лейкозов" (Ст.-Петербург. 1994), 3-м международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, Россия, 1995).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 300 наименований. Работа содержит 32 рисунка и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Определение числа специфических ГМДП-связывающих сайтов внутри различных клеток-мишеней.

Сведения о клетках-мишенях мурамилпептидов являются противоречивыми, и поэтому начальным этапом работы по выделению и очистке ГМДП-связывающих белков было, во-первых, определение того, какие иммунные клетки способны связывать ГМДП (рис.1) и, во-вторых, определение числа ГМДП-связывающих сайтов у иммуно-компетентных клеток различной этиологии.

HOCH, HOCH2

Ii '"' | 1—ff—NH—?H—COOH о CH, О C0NH2

Рис.1. Строение ГМДП.

В работе использовали следующие клетки: прилипающие клетки перитонеального экссудата мышей Balb/c, мышиную миеломоноци-тарную линию WEHI-3, Т-лимфоцитарные линии EL-4 (мышиная), JURKAT (человеческая) и RLS (крысиная): мышиные миеломные линии PAI и SP-2/0, а также нейробластому человека IMR-32. Исследования проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием меченого флуоресцеинизотиоцианатом лизин-содержа-щего аналога ГМДП - ГМДП-Lys-FluTC - у которого флюоресцеино-вая группировка присоединена к е-аминогруппе лизина (рис.2).

Биологическая активность ГМДП-Lys-FluTC проверялась в тестах на индукцию экспрессии 1а-антигенов и на адъювантную активность. ГМДП-Lys-FluTC усиливал экспрессию 1а-антигенов на перитонеальных макрофагах мыши, хотя и несколько слабее, чем ГМДП; адьювантная активность ГМДП-Lys-FluTC при ответе мышей Balb/c на овальбумин была на уровне ГМДП.

н,он

Рис.2. Строение ГВДП-Ьуз-ПиТС.

иттнсивкхлъ флюоресценции

Рис.3. Определение числа специфических внутриклеточных центров связывания ГМДЛ методом проточной цитофлюориметрии.

Для количественного определения ГМДП-связывающих центров в одной клетке были использованы флюоросферы с известным содержанием флюоресцеина (Coultronlcs, Франция).

Исследуемые клетки инкубировали с 1 мкМ ГМДП-Lys-FluTC. Для ингибирования специфического связывания вносили немеченный ГМДЛ в соотношении 1:1, 1:10 и 1:100 к меченому аналогу. После отмывки клеток от избытка метки определяли положения максимумов флюоресценции для клеток, обработанных ГМДП-Lys-FluTC, в отсутствие (общее связывание) и в присутствии ГМДП (неспецифическое связывание) (рис.3). Число специфических мест связывания определяли как разность между общим и неспецифическим связыванием.

Обработка ГМДП-Lys-FluTC нативных клеток в условиях, препятствующих эндоцитозу (4°С, наличие 0,01% азида натрия в среде инкубации) не приводила к заметному изменению флюоресценции клеток по сравнению с необработанными. На всех изученных мишенях число связавшихся с интактными клетками молекул ГМДП-Lys-FluTC не превышало 1000 на клетку, предела чувствительности цитофлюориметра (не менее 1000 молекул флюоресцеина на клетку).

Однако, если клетки были обработаны параформальдегидом, а затем клеточные мембраны перфорированы обработкой мягким неионным детергентом н-октил^-О-глюкопиранозидом, то при добавлении ГМДП-Lys-FluTC интенсивность флюоресценции резко возрастала, что говорило о наличии внутриклеточных центров связывания ГМДП.

При этом у перитонеальных макрофагов, клеток WEHI-3, Т-лимфоцитарных линий JURKAT, RLS и EL-4, а также нейробласто-мы IMR-32 наблюдалось дозозависимое ингибирование связывания ГМДП-Lys-FluTC при внесении избытка немеченого ГМДП, что свидетельствовало о наличии сайтов специфического связывания. У миеломных клеточных линий PAI и SP-2/0 ингибирования связывания не наблюдалось. Результаты определения числа внутриклеточных ГМДП-связывающих сайтов представлены в таблице 1.

Табл.1. Число мест связывания ГМДП в клетках различной этиологии, определенное методом проточной цитофлюориметрии.

Число специфических внутриклеточных сайтов % специфического связывания по отношению к общему

Перитонеальные

макрофаги мыши 98000+5900 63%

WEH1-3 30350+1760 35%

JURKAT 40700+2440 23%

RLS 32800+1640 25%

EL-4 22300+1100 11%

IMR-9 75000+7800 13%

PAI - -

SP-2/0 — —

2. Изучение связывания ГМДП-ЬуБ-ПиТС с субклеточными фрагментами ИЕН1-3.

Большой интерес представлял вопрос о том. являются ли ГМДП-связывающие белки интегральными мембранными белками или нет. Для того, чтобы получить ответ на этот вопрос, мы изучали связывание ГМДП-Ьуз-Г1иТС с субклеточными фрагментами клеток ИЕН1-3, полученными при разрушении клеток гипотоническим шоком и обработанными высокими концентрациями соли или хелатирующими агентами.

Связывание ГМДП-ЬуБ-ПиТС с субклеточными фрагментами Ш-Н1-3 изучали методом поляризации флюоресценции с использованием спектрофлюориметра ниас111-МРЕ4 (Япония). В качестве величины анизотропии флюоресценции в каждой точке брали среднее значение из тридцати рассчитанных по формуле [1] значений анизотропии флюоресценции в этой точке.

(1т-1ц)-С(1и1-1и)

г=- [1]

(1ц1-1ц)+2С(11.1-^)

где Iin и IL1 - интенсивности флюоресценции в плоскостях параллельной и перпендикулярной плоскости вертикально поляризованного возбуждающего света. IIt и IL - светорассеяние клеточной суспензии в плоскостях параллельной и перпендикулярной плоскости падающего света, G - приборная константа, определяемая при горизонтально поляризованном возбуждающем свете как отношение ILo/Iii0 dto и Ij ю ~ интенсивности флюоресценции в плоскостях перпендикулярной и параллельной плоскости горизонтально поляризованного возбуждающего света).

I0J0-

т 1

2

Т

4 КОНЦЕНТРАЦИЯ

ГМДПЧу»-ПиТС("М)

Рис. 4. Связывание ГМДГЫуз-Р1иТС с фрагментами ИЕН 1-3: исходные фрагменты (о), фрагменты после обработки 2 М КС1 (*). фрагменты после обработки 0.01 М ЭДТА (•).

В результате обработки 2 М КС1 или 0.01 М ЭДТА способность субклеточных фрагментов №ЕН1-3 связывать ГМДП-Ьуэ-ПиТС резке падала (рис.4), что позволяло сделать предположение, что 1 клеток ИЕН1-3 внутриклеточные мишени ГМДП не являются интегральными мембранными белками, а принадлежат к белкам, чье связывание с субклеточными структурами определяется электростатическими взаимодействиями, что и было подтверждено в ходе дальнейших экспериментов (п.4).

3. Фотоаффинное мечение внутриклеточных ГМДП-связывающих молекул перитонеальных макрофагов мыши.

По результатам оценки числа специфических внутриклеточных ГМДП-связывающих сайтов у различных клеток, а также процента специфического связывания по отношению к общему для дальнейшей работа по характеристике и выделению ГМДП-связывающих молекул использовали перитонеальные макрофаги и клетки 1*/ЕН1-3.

С целью предварительной характеристики внутриклеточных ГМДП-связывающих молекул перитонеальных макрофагов мыши был использован метод фотоаффинного мечения, позволяющий ковалент-но присоединить радиоактивно меченный лиганд к рецептору. Для ковалентного связывания ГМДП с рецептором было синтезировано радиоактивно меченное фотоактивируемое производное - Ы-аце-тилглюкозаминил-01-4)-М-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутамил-И -(3-[1г51]-4-азидосалицилоил)лизин или ГМДП-Ьуэ([12 51]АгБ) (рис. 5).

Рис.5. Строение ГМДП-Ьуз([1231]А23).

После инкубации перфорированных 0,001% дигитонином перито-неальных макрофагов с ГМДП-Lys([125I]AzS) в отсутствие или в присутствии избытка немеченого ГМДП клетки облучали УФ-светом, после чего лизировали горячим буфером для приготовления элект-рофоретических образцов и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с последующей радиоавгографией. В результате было показано наличие ряда меченых белков, однако лишь часть из них связывала радиоактивный лиганд специфически за счет мурамоилпептидной группировки.

Радиоавтограф ПААГ после SDS-электрофореза модифицированных белков перитонеальных макрофагов мыши представлен на рисунке 6.

Связывание ГМДП-Lysi[125I]AzS) с белками. молекулярные массы которых лежали в пределах 31-34 кДа и 37-39 кДа полностью подавлялось при добавлении 1000-кратного избытка немеченого ГМДП. Связывание с белком с молекулярной массой в интервале 43-47 кДа при добавлении 1000- и 10000-кратного избытка немеченого ГМДП ингибировалось лишь частично. В то же время связывание этого белка с 1251-меченым аналогом полностью ингибировалось 100-кратным избытком конъюгата ГМДП-Lys(AzS), что свидетельствовало в пользу того, что в связывании с белком 43-47 кДа участвует вся молекула ГМДП-Lys(AzS).

В противовес полученным нами данным Tenu et al было показано, что связывание МДП-Lys([1251]AzS) с внутренним рецептором альвеолярных макрофагов кролика, имеющим близкую по вели-

ГМДП-Ьуз([1251]АгЭ) и 3 мМ ГМДП; цифры слева указывают положение белков с известными молекулярными массами.

дорожка

ГМДП-LysЦ125I]AzS),

вая дорожка

Рис.6. Фотоаффинное мечение белков перитонеальных макрофагов мыши. Радиоавтограф ПААГ: - ле-

3 мкМ правая 3 мкМ

20—

чине молекулярную массу 40-45 кДа, может быть полностью подавлено избытком немеченого МДП. В настоящее время остается неясным. осуществляют ли мурамоилпептидсвязывающие молекулы кролика (40-45 кДа) и мыши (43-47 кДа) аналогичные функции или нет.

4. Характеристика ГМДП-связывающих белков с использованием вестерн-блот анализа.

Радиоактивно-меченые производные ГМДП имеют ряд существенных недостатков при использовании их для детектирования ГМДП-связывающих белков в процессе их очистки, а именно, быстрое падение удельной радиоактивности у меченых 1251 производных. В то же время одной из наиболее удобных меток является остаток биотина. Биотинилированное производное ГМДП (ГМДП-био-тин) получали путем конъюгации ГМДП-Ьуэ и И-оксисукцинимидного эфира О-биотинаминокапроновой кислоты. Методом проточной ци-тофлюориметрии было показано, что ГМДП-биотин связывался с внутриклеточными ГМДП-связывающими сайтами клеток УОЬЗ, и это связывание подавлялось при внесении избытка немеченого ГМДП. К сожалению, чувствительность, достигаемая с помощью этого соединения, была недостаточна для визуализации ГМДП-свя-зывающих белков. Поэтому в качестве биотинилированного производного ГМДП использовали (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(ВП, синтезированное в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН. Это соединение представляет собой смешанный конъюгат ГМДП-Ьуэ и биотина с линейным полимером полиакриламида с молекулярной массой 30-40 кДа. (ГМДП'-Ьуз)-ПАА-(В1) содержит 20 мольных процентов ГМДП-Ьуэ, и 5 мольных процентов биотина.

Доступность остатков ГМДП в конъюгате (ГМШЫуз)-ПАА-(В1) для взаимодействия с ГМДП-связывающими белками была проверена на примере моноклональных антител против ГМДП. Конъюгат связывался с антителами против ГМДП, и это связывание ингибирова-лось ГМДП дозозависимым образом (рис.7 и 8).

Данное свойство (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1) было использовано для поиска ГМДП-связывающих белков в мышиных и крысиных перитоне-альных макрофагах, клетках 1УЕН1-3.

Рис.7. Связывание

(ГМДП-Ьуг)-ПАА-(Вх) с монокло-нальными антителами против ГМДП в твердофазном ИФА. Отрицательный контроль: связывание с теми же антителами (С1с)-ПАА-(В1).

ю-

«40-

»■

юнцЕитши имэгитмшп ллятл<*м)

Рис.8. Конкурентное ингибиро-вание взаимодействия

(ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) с ан-ти-ГМДП МА в присутствии ГМДП.

55Г

Так как после обработки 2 М КС1 субклеточные фрагменты Ш-Н1-3 утрачивали способность связывать ГМДП-Ьуз-ПиТС (рис.4, стр.7) можно было ожидать, что после осаждения обработанных КС1 фрагментов центрифугированием при 102000хя в течение 60 мин ГМДП-связывающие белки могут быть обнаружены в КС1-супер-натанте. С использованием метода вестерн-блот анализа в КС1-супернатанте ИЕН1-3 были обнаружены белки с молекулярными массами 32 кДа (Б32) и 34 кДа (Б34), связывавшие (ГМДП-Ьуэ)-ПАА- (В1), причем это связывание полностью ингибиро-валось внесением избытка немеченого ГМДП. Кроме этого, белки с молекулярными массами 19 кДа и 17 кДа также связывали (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1), и это связывание ослаблялось, но не подавлялось полностью в присутствии ГМДП (рис.9. А). ГМДП-связывающие белки с близкими молекулярными массами были найдены в КС1-супернатанте перитонеальных макрофагов мыши (рис.9. Б) и в макрофагах крысы (рис.9. В).

Вероятно, две белковые полосы Б32 и Б34. имеющие близкие значения молекулярных масс, обнаруженные у перитонеальных макрофагов мыши методом вестерн-блот анализа, соответствуют широкой полосе 31-34 кДа, выявленной при фотоаффинном мечении. Е то же время ГМДП-связывающие сайты белка 37-39 кДа. выявляемого с использованием фотоаффинного мечения, в процессе электрофореза с БОБ, вероятно, претерпевали необратимую денатурацию, так как вестерн-блоттингом этот белок не выявлялся.

ГМДП ингибировал связывание (ГМДЛ-Ьуз)-ПАА-(В1) с белками Б32 и Б34 дозозависимым образом. Дисахарид Н-ацетилглюкозами-нил-(Р1-4)-Н-ацетилмурамовая кислота не влиял на связывание, а дипептид А1а-0-Ю1п ингибировал связывание лишь частично (рис.10).

Обработка протеолитическими ферментами различной специфичности, а именно трипсином, папаином и проназой, интактных перитонеальных макрофагов мыши и клеток У/ЕН1-3 не изменяла молекулярных масс ГМДП-связывающих белков и не отменяла их способность связывать (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1). Это свидетельствовало о недоступности Б32 и Б34 для протеолиза, и наиболее вероятной причиной этого являлась их внутриклеточная локализация.

А.

Б.

В.

зо-

20-

14-

I

I

94—

67-

О-

20—

14-

I

9467—

43—

30-

20—

Рис.9. Вестерн-блоттинг белков: А - КС1-элюата клеток WEHI-3; Б - КС1-элюата перитонеальных макрофагов мыши; В - белков перитонеальных макрофагов крыс И15ТА1?. Обработка реплик 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) (1); обработка реплик 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 5 мг/мл ГМДП (2). Визуализация зонда по стандартной методике стрептавидин-пероксидазой.

V' • .4

ч*^

* Г"

я 4 1 Г»' .'.Г V

1 2 3 4 5

Рис.10. Вестерн-блоттинг белков перитонеальных макрофагов мыши. Обработка реплики: 1) 1 мкг/мл (ГМЛП-Ьуэ)-ПАА-(В1); 2) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 2.5 мг/мл ГМДП; 3) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В!) и 5 мг/мл ГМДП; 4) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 2,5 мг/мл дисахарида; 5) 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) и 2.5 мг/мл дипептида. Визуализация зонда по стандартной методике стрептавидин-пероксидазой.

5. Выделение ГМДП-связывагощих белков клеток ШП-З.

Попытки использовать для очистки ГМДП-связывающих белков аффинные сорбенты, несущие в качестве лигандов ГМДП. ГМДП-Ьуэ или антиидиотипические моноклональные антитела против ГМДП не привели к положительному результату либо по причине недостаточной аффинности связывания лигандов с рецепторами ГМДП. либо из-за стерических препятствий. Это обстоятельство привело к необходимости поиска альтернативных путей очистки ГМДП-связывающих белков.

Для выделения ГМДП-связывающих белков ИЕН1-3 использовали тот факт, что в этих клетках белки Б32 и Б34 могут быть элш-рованы с субклеточных фрагментов 0.01 М ЭДТА. После ряда предварительных опытов было выяснено, что для очистки ГМДП-связы-вающих белков наиболее приемлемой является ВЭЖХ на анионо-об-менной колонке БЕАЕ ТБК 5РИ (ЬКВ). Колонку уравновешивали в 0.002 М Трис-НС1 рН 7.6, содержавшем 0.002 М ЭДТА. Элюцию проводили в 0-0.5 М градиенте №С1. ГМДП-связывающую активность определяли с использованием вестерн-блот анализа.

Профиль элюции белков ЭДТА-супернатанта с колонки БЕА ТЭК-бРУ/ (ЬКВ) представлен на рис. 11. ГМДП-связывающие белк элюировались в 0.5 М ИаС1 практически после всех остальнь белков ЭДТА-супернатанта. БОБ-электрофорез ГМДП-связывающи белков из клеток *Я2Н1-3. полученных в результате ионообменно хроматографии ЭДТА-супернатанта представлен на рис. 11 (встав ка).

Рис. 11. Профиль элюции белков ЭДТА-элюата \"/ЕН1-3 с колонки БЕАЕ TSK-5PW (ЬКВ). Колонка уравновешена в 2 мМ Трис-НС1 рН7.6, с 2 мМ ЭДТА; элюция линейным градиентом ИаСХ (0-0.5 М). Вставка: электрофорез в ПААГ очищенных ГМДП-связывающих белков клеток Цифры слева указывают положение белков с .из-

вестными молекулярными массами.

6. Выделение ГМДП-связывающих белков перитонеальных макрофагов мыши.

При наработке ГМДП-связывающих белков из перитонеальных макрофагов выяснилось, что, в отличие от клеток ИЕН1-3. макро-фагальные белки Б32 и Б34 элюировались с субклеточных фрагментов лишь высокими концентрациями соли и не элюировались ЭДТА. Необходимость элюции белков высокой концентрацией соли затрудняло применение ионообменной хроматографии для их очистки, так как при диализе или обессоливании эти белки практически полностью терялись вследствие адсорбции. Поэтому для очистки мак-рофагальных ГМДП-связывающих белков использовали гель-фильтрацию.

Субклеточные фрагменты, получаемые после разрушения клеток осмотическим шоком, сначала обрабатывали 0.01 М ЭДТА. осаждали центрифугированием при 102000хи в течение 60 мин и лишь после этого обрабатывали 2 М КС1 для получения КС1-супернатанта. Эта стадия сразу позволяла освободиться от целого ряда сопутствующих белков. ГМДП-связывающие белки выделяли из КС1-супернатан-та методом ВЭЖХ на гель-фильтрационной колонке в 2000 БУ/, уравновешенной в 0.002 М Трис-НС1. рН 7.6, содержавшем 0.002 М ЭДТА и 0.5 М №С1 (рис. 12).

Рис.12. Профиль элюции белков КС1-элюата перитонеальных макрофагов мыши с колонки С 2000 БИ. Элюция 2 мМ Трис-НС1 рН 7.6, содержащим 2 мМ ЭДТА и 0.5 М №С1. скорость потока 0.5 мл/мин.

ГМДП-связывающие белки выходили двумя пиками, соответствовавшими молекулярным массам 130-140 кДа и 25-30 кДа. Электрофорез в ПААГ показал, что высокомолекулярный пик представляв! собой олигомер, состоящий из Б32 и Б34 в эквимолярных количествах. Второй, низкомолекулярный ГМДП-связывающий пик содержал белок Б34 с небольшой примесью Б32 (рис.13. А, Б).

А. Б.

1 Щ...............~.......

67— - -

зо-2014-

fl

'5?

•< ...! •

•§- -щ

и-

Рис. 13. А - SDS-электрофорез в 12% ПААГ; Б- вестерн-блоттинг фракций после ВЭЖХ-гель-хроматографии , реплики обрабатывали 1 мкг/мл (ГМДП-Ьуз)-ПАА-(В1), визуализация зонда стрептави-дин-пероксидазой. Цифры слева указывают положение белков с известными молекулярными массами; цифры сверху указывают номера фракций.

Для определения N-концевых последовательностей ГМДП-связывающие белки Б32 и Б34 после SDS-электрофореза в ПААГ электро-форетически переносили на мембрану Immobllon. Секвенирование производили на мембранных репликах на автоматическом твердофазном секвенаторе 470А (Applied Blosystems, США). Однако N-концёвые аминокислоты ГМДП-связывающих белков оказались блокированными. Для идентификации этих белков были получены трип-тические фрагменты ГМДП-связывающих белков, и у двух из них определены аминокислотные последовательности, что позволило идентифицировать ГМДП-связывающие белки, как белки семейства гистонов HI (рис.14).

Ас5ЕААРААРАААРРАЕКАРАКККААККРАСУЕНМ5СРРЖШКАУАА5КЕК5СУ5ЬАА ЬККАиААСУРУЕКМЗШКЬИЛЗЬУБКС IШТ^ТЙ АБСЗЕЮЖКА АБСЕ АКРОАККА СААКАККРАСААККРККАТСААТРККААККТРККАККРААААУТККУАКЗРККАКУТКРККУ КЗАЗКАУКРКААКРКУАКАККУААККК

1) KASGPPVSEL.IT; 2) АЬАААСУОУЕК

Рис.14. Аминокислотная последовательность гистона Н1А мыши и двух триптических фрагментов ГМДП-связывающих белков; подчеркнуты участки молекулы гистона Н1. идентичные этим фрагментам.

Известно, что гистоны Н1, имея молекулярную массу около 21.5 кДа, из-за высокого содержания лизина при БОБ-форезе мигрируют как белки с массами 31-35 кДа. То, что число внутриклеточных центров связывания, определенное методом цитофлюоримет-рии. значительно меньше числа молекул гистона Н1 в клетке, указывает на то. что входящие в состав хроматина молекулы Н1 являются менее доступными для связывания. Это подтверждается тем фактом, что Н1 в составе хроматина значительно слабее реагируют с рядом анти-Н1 антител по сравнению с гистонами Н1 в свободном состоянии, а в некоторых случаях связывания не наблюдается вовсе.

Небезынтересно, что ГМДП-связывающие белки из миеломоноци-тарных клеток ИЕН1-3 в процессе выделения ведут себя как белки с кислыми свойствами, в то время как известно, что гистоны Н1 богаты лизином и являются основными белками. Причиной этого может являться как посттрансляционная модификация, а именно фосфорилирование, гистонов Н1 в интенсивно пролиферирующих клетках У/ЕН1-3, так и то, что гистоны Н1 могут выделяться в комплексе с фрагментами ДНК, которые и придают белкам кажущиеся кислые свойства.

7. Функциональные аспекты взаимодействия ГМДП с гистонами Н1.

Гистоны Н1 - белки хроматина, одной из функций которых является понижение общей генной активности. Они экранируют ряд ре-гуляторных последовательностей ДНК. расположенных в линкерных участках. Взаимодействие ГМДП и его аналогов с гистонами Н1

может приводить к ослаблению связи последних с хроматином, е результате чего регуляторные участки ДНК становятся доступным* для факторов транскрипции и ферментов.

Проведенные нами эксперименты показывают, что ГМДП конкурирует с ДНК за связывание с гистоном Н1 (рис.15). Дозозависи-мость ингибирования указывает на наличие конкурентных отношений между ДНК и ГМДП за участки связывания на молекуле Н1.

Изменения, вызываемые ГМДП в структуре хроматина при связывании с гистоном Н1. повышают чувствительность последнего * расщеплению микрококковой нуклеазой (рис.16). Усиление эндо-нуклеазного расщепления в присутствии ГМДП наблюдалось в случае использования 0,4 Ед нуклеазы на 100 мкг хроматина и не наблюдалось при более высокой концентрации фермента (4 Ед).

И1

ьМ

в,¿23 1ДЗ 24 3 1» Л КОЛИЧЕСТВО КОНКУРИРУЮЩЕГО АГЕНТА (юсг)

Рис. 15. Конкурентное ингибиро-вание взаимодействия

(ГМДП-Ьуэ)-ПАА-(В1) с гистоном Н1 в присутствии ДНК фага X.

Рис.16. Расщепление хроматина из ядер эритроцитов куриць микрококковой нуклеазой: а) 0.4 Ед нуклеазы; б) 0,4 Ед нуклеазы и 70 мкм ГМДП.

ВЫВОДЫ.

1. Определено число специфических внутриклеточных сайтов связывания ГМДП в клетках различной этиологии, а именно в макрофагах, Т-лимфоцитах и клетках нейробластомы. Среди исследованных клеток наибольшее число специфических ГМДП-связывающих сайтов - 98000+5900 т обнаружено внутри перитонеальных макрофагов мыши.

2. Показано, что внутриклеточные ГМДП-связывающие белки макрофагов имеют молекулярные массы 32. 34 и 38 кДа.

3. Выделены в гомогенном виде ГМДП-связывающие белки макрофагов и клеток WEHI-3 с молекулярными массами 32 и 34 кДа. Частичным секвенированием показана их идентичность гистонам HI.

4. Показано, что взаимодействие ГМДП с хроматином приводит к повышению чувствительности хроматина к эндонуклеазному расщеплению.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Golovlna Т.N., Sumaroka M.V., Lltvinov I.S.. Khaldukov

5. V.. Nesmeyanov V.A. Intracellular muramyl-peptlde-blndlng molecules of macrophages.- Abstracts of the 11th Meeting of European Federation of Immunological sociétés. Espoo, Finland, 1991, 13b-18.

2. Sumaroka M.V., Lltvinov I.S., Khaldukov S.V., Golovlna T.N., Kamraz M.V., Komaleva R.L., Andronova T.M., Makarov E.A., Nesmeyanov V.A. Ivanov V.T. Muramyl peptlde-blndlng sites are located inside target cells. FEBS Letters, 1991, V. 295, pp. 48-50.

3. Golovlna T.N., Khaldukov S.V., Samochvalova L.V., Shebzuc-hov Yu.V., Lltvinov I.S., Macarov E.A., Nesmeyanov V.A. Mura-myl-peptlde binding sites-location and molecular characteristics. -Abstracts of Symposium "Structure and function of regulatory polypeptides". Moscow, June 26-30, 1992, p.23.

4. Golovlna T.N., Khaldukov S.V., Lltvinov I.S., Samochvalova L.V., Nesmeyanov V.A. Intracellular muramyl peptlde-blndlng molecules.- Abstracts of the 8th International Congress of Immunology, Budapest, Hungary, August 23-28, 1992, p.578.

5. Mareeva Т. Yu., KotovaO.V.. Golovlna Т. V., Nesmeyanov V. A. Production and characterization of monoclonal antl-idiotyplc antibodies to muramylpeptlde. - FEBS Letters, 1994, v. 356, p. 13-16.

6. Nesmeyanov V.A.. T.V. Golovlna, T.I. Valyakina. T.M. Andro-nova. V. T. Ivanov. Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides. - In "Immunotherapy of Infections", Ed. Noel Maslhl, Marcel Dekker, Inc., 1994, p. 213-223.

7. T. N. Golovlna, M. V.Sumaroka. L.V.Samokhvalova, Yu.Shebzuk-hov, Т.M.Andronova, V.A.Nesmeyanov. Biochemical characterization of glucosamlnylmuramyldlpeptlde binding sites of murine macrophages. FEBS Letters, 1994, v.356, p.9-12.

8. Т.Н.Головина, M.В.Сумарока, Л.В.Самохвалова, Ю.В.Шебзухов, Е.А.Макаров, В.А.Несмеянов. Идентификация полипептидов из пе-ритонеальных макрофагов мыши, узнающих глюкозаминилмурамоилди-пептиды. Биоорганическая химия. 1995 т.21, N4, с. 268-274.

9. V.A.Nesmeyanov, T.N.Golovlna, Т.Yu.Mareeva. Khaldukov S.V. Molecular recognition of glucosamlnylmuramylpeptldes. - Abstracts of the 3-d International Symposium on Bioorganlc Chemistry, Dagomys, Russia, September 17-23, 1995.

10. T.N.Golovlna, L.V.Samokhvalova, I.S. Litvinov, V.A. Nesmeyanov. Biochemical characterization of GMDP binding sites on murine macrophages. --Abstracts of the 3-d International Symposium on Bioorganlc Chemistry. Dagomys, Russia. September. 17-23, 1995.