Кинетические закономерности пролиферации лимфоидных клеток человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.ВЛОМОНОСОВА

7Г5—ОЯ-

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

• 3 О Ч- ии (

На правах рукописи

ГРИШИНА ЗОРИНА ВЛАДИМИРОВНА

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

02.00.15 - химическая кинетика и катализ 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-1997

Работа выполнена на кафедре химической этимологии Химического факультета и в отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, Московский государственный университет им. М. В Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор С. Д. Варфоломеев Научные консультанты:

кандидат биологических наук, н.с. В. В. Куликов кандидат химических наук, с.н.с. М. Г. Сергеева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор О. М. Полторак доктор биологических наук, профессор Р. И. Якубовская

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится " 4 " марта 1997 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 2.2" января 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук О.АКост

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выяснение механизмов пролиферации лимфоидных клеток (нормальных лимфоцитов и трансформированных клеток лимфоцитарного происхождения) является ключом к пониманию основных принципов регуляции развития иммунного ответа и возникновения различных патологий иммунной системы, таких как неопластическая трансформация иммунных клеток и аутоиммунные заболевания.

В настоящее время широко исследуются иммуномодулируюшие свойства различных эндогенных веществ, реализующих взаимосвязь иммунной и нейроэндокринной систем в процессе поддержания гомеостаза, в том числе регуляторных пептидов - эндорфинов и энкефалинов. Однако механизм действия этих веществ на пролиферацию лимфоцитов - ключевой этап развития иммунного ответа, до сих пор не ясен, при этом данные различных исследователей по эффектам модуляции не согласуются между собой.

В результате исследований последних лет получено множество экспериментальных фактов модуляции процессов пролиферации лимфоидных клеток различными физиологически активными веществами. Однако систематизация и интерпретация этих фактов представляется крайне сложной в связи с отсутствием данных по кинетике исследуемых процессов, что обусловлено ограниченными возможностями экспериментальных методик. Одним из наиболее перспективных направлений в развитии представлений о механизмах регуляции пролиферации лимфоидных клеток является компьютерное моделирование процессов пролиферации. Разработка таких моделей позволит приблизиться к пониманию механизма действия иммуномодуляторов и предсказывать их эффекты по результатам экспериментов itt machina.

Цель работы. Целью данной работы является экспериментальное и теоретическое исследование кинетики процессов пролиферации лимфоидных клеток человека in vitro и принципов модуляции этих процессов при действии физиологически активных веществ. Поставленные задачи включали исследование пролиферации аутокринных лимфоидных клеток, кинетический анализ пролиферации лимфоидных клеток с

различным типом факторной зависимости, изучение влияния (3-эндорфина и морфина на кинетику пролиферации лимфоцитов здоровых доноров, разработку имитационной компьютерной модели пролиферации аутокринных лимфоидных клеток in vitro, анализ по результатам экспериментов in machina возможных механизмов модуляции пролиферации лимфоидных клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. 1. При сравнительном кинетическом анализе роста популяций лимфоидных клеток показано, как различия по типу факторной зависимости отражаются в кинетике процессов пролиферации и механизмах ее инактивации. 2. Показано, что классический антагонист опиатных рецепторов налоксон не блокирует эффекты морфина, а обладает собственным модулирующим действием на пролиферацию лимфоцитов. 3. Впервые показан противоположный эффект морфина на пролиферацию лимфоидных клеток разных типов, что является значимым при выборе анальгетиков для больных с различными иммунопатологиями. 4. Разработана оригинальная компьютерная имитационная модель пролиферации аутокринных лимфоидных клеток in vitro на основе имитационного алгоритма, который никогда ранее не применялся в моделировании биологических процессов. 5. По результатам моделирования предложена схема кинетических экспериментов по исследованию эффектов иммуномодуляторов на пролиферацию лимфоидных клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на I Международном конгрессе Международного Общества Нейроиммуномодуляции (Флоренция, 1990); на Всесоюзном симпозиуме по биохимии рецепторных систем (Таллинн, 1990); на IV Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, 1994); на VI Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского" (Москва, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (147 ссылок). Работа изложена на 89 страницах машинописного текста, содержит также 5 таблиц и 28 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кинетические закономерности пролиферации аутокршшых лимфоидных клеток.

Ключевым процессом для осуществления пролиферации лимфоцитов и большинства трансформированных лимфоидных клеток является реализация действия специфического ростового фактора. Существует два типа факторной зависимости: паракринный, при котором специфические ростовые факторы продуцируются другими клетками, и аутокринный, при котором клетка продуцирует собственный фактор роста. Регуляция пролиферации лимфоидных клеток ростовыми факторами осуществляется как по паракринному, так и по аутокринному механизму. Тип факторной зависимости клеток определяет, в конечном итоге, скорость роста клеточной популяции и механизмы инактивации пролиферации. Однако кинетика пролиферации аутокринных лимфоидных клеток до сих пор не изучалась.

Объектом данного исследования являлись клетки человеческой лимфоидной линии В-клеточного происхождения Namalva, которые секретируют аутокринный фактор роста В-клеток (ФРВК).

На рис.1 А представлена кривая роста популяции клеток Namalva (кривая 1). Для сравнения приведена ростовая кривая паракринных В-лимфоцитов периферической крови человека, пролиферация которых стимулировалась добавлением ФРВК (по данным Варфоломеева и др. в ДАН СССР 1987, Т.297, С.975).

Для описания кинетики пролиферации лимфоидных клеток в культуре нами было предложено следующее уравнение:

N^No-exp-Gio-eM-t), (1.1),

где Ng - число клеток, способных к пролиферации в начальный момент времени, ро - начальная удельная скорость роста популяции, f(t) определяет удельную скорость пролиферации.

Из уравнения (1.1) может быть получена следующая анаморфоза:

ln[ln(N/N0)/t]= 1п(цо) + f(t) (1.2).

Данные рис Л А, преобразованные в координаты уравнения (1.2), представлены на рисЛБ. Видно, что в случае В-лимфоцитов (кривая 2) f(t) может быть приближена прямой: f(t)=-A t, A.=const,

з

Время,часы

Рис.1. Кинетика роста популяции клеток Катала (1) и В-лимфоцитов человека, стимулированных ФРВК (2).

А - ростовые кривые.

Б - данные ростовых кривых в координатах уравнения (1.2). Пунктиром обозначена линеаризация. Жизнеспособность клеток оценивали при окрашивании трипановым синим.

то есть инактивация пролиферации определяется механизмом "запрограммированного экспоненциального отказа", который реализуется в течение всего времени роста клеточной популяции. Кривая 1 отражает активный аутокринно стимулируемый рост клеточной популяции №та1уа на начальном этапе и инактивацию пролиферации, обусловленную истощением ростовой среды при значительном увеличении численности клеток. Из анализа кривой 1 следует, что пролиферация клеток Катала в течение первых 72 час. опережает во времени экспоненциальный рост (при Д^О). Начальный участок этой кривой можно приблизить прямой Д0=Х По данным рис.1 Б были определены

кинетические параметры пролиферации цо и константы функции КО Ос и Для обоих типов клеток:

первичные В-лимфоциты клетки №та1уа Но = (5.0 ± 0.45)хЮ~2(час"1)щ) = (9.1 ± 1.64)х10-3(час-1) 1 = (1.2± 0.12)х10_2(час"1) х = (1.3 ± 0.35)х10-2(час"1) Таким образом, в результате кинетического анализа пролиферации лимфоидных клеток, различающихся по типу факторной зависимости, были выявлены существенные различия удельной скорости роста клеточных популяций на начальном этапе процесса, а также в механизмах его инактивации.

Существующие методы синхронизации культур позволяют обеспечить синхронную пролиферацию клеток. На рис.2 представлена кинетика синтеза ДНК синхронизированных клеток №та1уа. Видно, что кинетика синтеза ДНК в данном случае имеет периодический характер. В результате обработки данных рис.2 были определены

длительность цикла и Я-фазы для клеток Namalva: 21-24 час. и 6-7 час. соответственно.

На рис.3 приведены данные проточной цитофлюорометрии синхронизированных клеток №та1уа. Тестирование проводилось каждые 3 час. в течение 30 час. В результате обработки кинетических данных по распределению клеток в цикле были определены длительность цикла - 22 час. и отдельных фаз: 0( - 11 час., Б - 6 час., в2+М - 5 час. Полученные результаты согласуются с параметрами, определенными по данным тимидинового теста.

Для выяснения стадии реализации действия аутокринного фактора в клеточном цикле были получены кинетические данные распределения по фазам цикла клеток Ыашака, которые длительное время культивировались в условиях недостаточности аутокринного фактора, после добавления в систему стандартного образца ФРВК. Обнаружено, что к началу эксперимента произошло накопление большинства клеток в врфазе (-70%) и, следовательно, их синхронизация. Через б час. после начала культивирования клеток в присутствии фактора наблюдалось заметное увеличение доли клеток в Б- и Ог+М-фазах. Полученные результаты позволили заключить, что лишение клеток аутокринного фактора приводит к блокированию клеток на поздних стадиях в)-фазы, близкой к границе

Время, часы Рнс.2. Кинетика пролиферации

синхронизированных клеток Ыата1уа. Пролиферативкую активность определяли по включению [3Н1-тимидина. Время инкубации клеток с меткой - 2 час.

Рис.3. Кинетика распределения по фазам клеточного цикла синхронизированных клеток Шта1уа по данным проточной цитофлюорометрии.

Гистограммы распределения клеток в зависимости от времени отбора проб.

2. Влияние морфина и p-эндорфнна на кинетику пролиферации лимфоидных клеток.

В настоящее время для исследований пролиферации лимфоцитов in vitro широко используется метод активации пролиферации лимфоцитов митогенами (растительными лектинами, бактериальными липополисахаридами). Этот метод позволяет моделировать in vitro процессы развития неспецифического иммунного ответа, происходящие in vivo.

Приводимые в литературе данные по эффектам опиоидных пептидов на митоген-стимулированную пролиферацию лимфоцитов здоровых доноров не согласуются между собой. Не существует также однозначного мнения о блокировании этих эффектов антагонистами опиатных рецепторов. Следует отметить, что, как правило, эффекты опиоидных пептидов на митоген-стимулированную пролиферацию оценивались в одной временной точке, а кинетика процесса не рассматривалась в связи с большой трудоемкостью экспериментов.

2.1. Влияние морфина, p-эндорфина и налоксона на кинетику митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

В ходе исследований действия морфина и p-эндорфина на пролиферацию лимфоцитов, активированных лектинами фитогемагглютинином (ФГА) и митогеном фитолаки (МФ), было установлено, что влияние эффекторов реализуется на ранних стадиях взаимодействия клеток с митогенами. Поэтому во всех экспериментах митогены и эффекторы добавляли одновременно.

Мы провели исследование влияния различных концентраций морфина (10-9-10-6М), а также 10'7М и 10"9М p-эндорфина на кинетику митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов 12 доноров. На рис.4 представлены данные по влиянию 10"6М морфина на кинетику синтеза ДНК ФГА-стимулированных лимфоцитов двух доноров. Из рис.4 видно, что в присутствии морфина меняется величина и время достижения максимума пролиферативных кривых, причем характеристики этих изменений отличаются в зависимости от донора. В ходе исследований было установлено, что как морфин, так и p-эндорфин оказывают комплексные эффекты, величина и направленность которых

МНПК различных

125 150 175 0 25 Время, часы

Рис.4. Кинетика ФГА-стимулированной пролиферации доноров (А и Б) под действием 10'6М морфина: 1 - в отсутствие морфина (контроль); 2 - в присутствии морфина. Пролиферативную активность оценивали по включению [3Н|-тимидина каждые 24 час. Время инкубации с меткой - 24 час.

определяются индивидуальными особенностями донора, концентрацией эффектора и временем экспозиции. При этом систематизировать наблюдаемые эффекты оказалось невозможным. Определенно можно консгатировать лишь модулирующее действие морфина и р-эндорфина на митоген-сгимулированную пролиферацию лимфоцитов.

В исследованиях кинетики митоген-стимулированной пролиферации были получены данные, которые однозначно свидетельствуют, что классический антагонист опиатных рецепторов налоксон не блокирует эффекты, оказываемые морфином, и обладает собственным модулирующим действием на пролиферативную активность лимфоцитов.

Известно, что статус донора определяет исходные параметры исследуемой клеточной системы: соотношение численности различных типов лимфоцитов, базальные уровни внутриклеточного цАМФ и продуцирования цитокинов и т.д. Однако осуществлять детальный анализ этих параметров в рамках наших экспериментов не представляется возможным. Одним из подходов к решению проблемы индивидуальных особенностей клеток донорской крови является изучение модуляции пролиферации в более простых и стандартизованных системах, таких как линии лимфоидных клеток.

2.2. Влияние морфина на пролиферацию трансформированных лимфоидных клеток.

Известно, что на лимфовдных клетках существуют специфические участки связывания опиоидных пептидов, однако влияние

морфина на

пролиферацию этих клеток до сих пор не изучалось. Мы

исследовали действие 10_6М морфина на кинетику пролиферации лимфоидных клеток человека,

происходящих от лимфоцитов различных типов: В-лимфомы №та1та и Т-лимфомы Уигка1. Данные по эффектам морфина на пролиферативную активность клеток в зависимости от времени представлены на рис.5. Из рис.5 видно, что морфин активирует пролиферацию клеток Уигкаи но супрессирует пролиферацию клеток ЫатаЬ/а. Во всех случаях блокирование эффектов морфина налоксоном не наблюдалось.

Можно предположить, что обнаруженный нами противоположный эффект морфина на пролиферацию исследуемых клеточных линий отражает различия по его влиянию на пролиферативную активность В- и Т-лимфоцитов. В таком случае эффект морфина на пролиферацию лимфоцитов периферической крови можно представить как суперпозицию его эффектов на различные типы лимфоцитов. По нашему мнению, исследование процессов пролиферации в системах лимфоидных клеток позволяет приблизиться к пониманию механизмов регуляции этих процессов и их модуляции для лимфоцитов.

200 «175

РЗ

Е ¡«0

к 125

Н

® 100 о и

2 50

5

га 25

- 2 гЬ

- гЬ л-

контроль 1 - ш

[-5- //

-

48 час

72 час

96 час

Рис.5. Влияние 10"бМ морфина на пролиферацию клеток Иата^а (1) и Уигкас (2) в зависимости от времени инкубации. Пролиферативную активность оценивали по включению [3Н|-тимидина. Время инкубации с меткой - 24 час. Морфин добавляли в начальный момент времени. Данные представлены в % от контроля. Контроль - пролиферация клеток в отсутствие морфина.

3. Имитационная компьютерная модель пролиферации аутокринных лимфоидных клеток in vitro.

3.1. Схема модели.

На рис.6 представлена схема последовательности событий в клеточном цикле аутокринных лимфоидных клеток. Перед началом эксперимента клетки

переносятся в новую ростовую среду, после чего необходимо определенное время для восстановления внутриклеточных процессов Gi-фазы до нормального уровня (процесс

адаптации).

Ключевым процессом Gj-фазы клеточного цикла аутокринных клеток является синтез специфического ростового фактора и реализация его действия через рецептор, что является необходимым условием для осуществления перехода клеток из Gr в S-фазу. В условиях недостаточности фактора движение клеток по циклу блокируется на поздних стадиях Gj-фазы, близких к границе Gt/S (t.Ri), клетки постепенно покидают цикл, деградируют и гибнут. После завершения каждого митоза (t.R2) часть клеток выходит из цикла в состояние G0. Увеличение их количества обуславливает инактивацию пролиферации при истощении ростовой среды.

Схема кинетической модели пролиферации аутокринных лимфоидных клеток представлена на рис.7. Символами Yo-Yg на схеме обозначена последовательность стадий клеточного цикла, длительность которых определяется в соответствии с временными детерминантами клеточного цикла параметром Т с соответствующим индексом. Начало отсчета времени в модели соответствует началу культивирования клеток в эксперименте. Все клетки в начальный момент времени находятся в Yq. Начальная концентрация фактора в модельной системе определяется равной нулю.

Рне.б. Схема клеточного цикла

аутокринных лимфоидных клеток.

G„

Gi

Рнс.7. Схема модели пролиферации аутокринных лимфоидных клеток in vitro.

Yo - совмещенная стадия адаптации и ранних стадий Gi-фазы первого цикла;

Yj - стадия синтеза аутокринного фактора;

Y2 - стадия взаимодействия клеток с фактором (точка R[ рис.6);

Yj - стадия проведения внутриклеточного сигнала;

Y4 - S-фаза;

Ys - Gi+M-фаза;

Yj - ранние стадии Gj-фазы;

Y7 - состояние Gq клеток, покидающих цикл (из точки R-г рис.6); Yg - стадия деградации клеток после выхода из состояния Y2; F - баланс аутокринного фактора в системе.

Баланс аутокринного фактора в системе (F) описывается уравнением:

dF/dt= S-Yi - D-F- k-R-Y2 (3.1),

где Yj и Y2 обозначают количество клеток, находящихся на стадиях Yj и Y2 соответственно; S - скорость продуцирования фактора клеткой; D - коэффициент, определяющий скорость деградации фактора в системе; R - количество фактора, обеспечивающее пролиферацию клетки при продвижении по циклу, R соответствует количеству мест связывания фактора на клетке; к - коэффициент реализации перехода Y2-*Y"3 в данный момент времени: к=0, если F<M, и к=1, если F>M, где М - минимальная концентрация фактора в системе для перехода клеток в S-фазу; величина М определяется в соответствий со значением Kj рецептор-факторного комплекса.

3.2. Компьютерный алгоритм модели.

На основании схемы модели (рис.7) нами была разработана оригинальная компьютерная программа, реализованная в среде Turbo Pascal с сопряженной графикой. В программе использован имитационный алгоритм, который, насколько нам известно, никогда ранее не применялся в моделировании биологических процессов. Данный алгоритм позволяет обеспечить контроль за большим количеством групп объектов и условиями протекания различных процессов в системе в режиме текущего времени. Количество объектов в группе определяется как целое и отличное от нуля. Таким образом, если рассматривать количество групп, равное количеству объектов в системе, то фактически можно контролировать поведение каждого объекта.

Определение количества групп и числа клеток в каждой группе реализуется на начальном этапе при моделировании перехода Yo~>Y(. Скорость перехода клеток из стадии Y0 в Yj описывается функцией нормального распределения f^t, Та, No) с максимумом в момент времени Тд/2, результатом интегрирования которой в интервале времени [0; Та] является начальное число клеток в системе N0. По предварительным результатам моделирования мы показали, что

именно функция нормального распределения наиболее адекватно описывает наличие генетически детерминированных различий по

скорости адаптации в клеточной

популяции. На рис.8 представлены кривые перехода клеток в стадию Yi при различном количестве групп. Было установлено,

15 20 25 Время, часы

Рис.8. Моделирование перехода Уо-»У|.

Данные по количеству клеток в стадии Уо при различном количестве групп клеток: 1 - и-*»; 2 - п=30; 3 - п=10. Т,=30 час.

что количество групп клеток, равное 30 (кривая 2), обеспечивает достаточную точность при моделировании процессов пролиферации во временном интервале, соотносимом с периодом культивирования клеток в эксперименте.

В условиях блокировки перехода ^2~>Уз происходит объединение групп клеток в стадии У2 с последующим необратимым выходом части клеток в стадию У8 вне цикла. Количество клеток, покидающих цикл, определяется коэффициентом Р1 в зависимости от количества клеток в У 2-

После окончашм пребывания группы клеток в стадии ¥5 их число удваивается. После этого часть клеток, определяемая коэффициентом Рг^С*. ^5), переводится в состояние ¥7 и в дальнейшем рассматривается как отдельная группа. Значение Му5) определяется как суммарное число клеток, прошедших стадию ¥5 к данному моменту времени. Это позволяет учитывать ухудшение качеств ростовой среды в процессе роста клеточной популяции. С момента времени, когда значение коэффициента Р2 оказывается равным единице, то есть в условиях истощения ростовой среды, все группы клеток из ¥5 полностью переходят в ¥7, и пролиферация в системе заканчивается.

Скорость гибели клеток в группе, которая переходит в стадию ¥7 в момент времени 1;, определяется функцией нормального распределения с максимумом в момент времени (^+Ту7)/2, результатом интегрирования которой в

интервале времени 1[+Ту7] является число клеток в данной группе. Аналогично определяется скорость гибели клеток в каждой группе в стадии

3500

75 100 125 150 Время, часы Рис.9. Расчетные данные по количеству

жизнеспособных клеток (ростовая кривая). Символами обозначены экспериментальные данные по росту популяции клеток №та1уа.

3.3. Определение значений параметров модели.

Верификация компьютерной модели пролиферации аутокринных лимфоидных клеток проводилась по результатам наших исследований кинетики пролиферации клеток ЫатаЬ/а. Для определения значений параметров были использованы экспериментальные данные длительности фаз цикла клеток ЫатаЬ'а и литературные данные. Значения параметров Та, Ту7, Р) и Р2, были установлены в результате анализа серий расчетных ростовых кривых. В качестве критерия выбора значений параметров рассматривалось соответствие расчетной ростовой кривой экспериментальным данным по кинетике роста клеток Ыата1уа (рис.9). Значения параметров модели, соответствующие кривой рис.9, представлены в табл.1 с указанием способа их определения.

Разработанная нами компьютерная имитационная модель позволяет контролировать кинетику роста клеточной популяции, распределения клеток по фазам цикла и инактивации пролиферации, а также баланс аутокринного фактора при модуляции процессов пролиферации аутокринных лимфоидных клеток.

Таблица 1. Значения параметров модели для расчетной ростовой кривой рис.9.

Параметр Значение Размерность Определение

N0 ЗхЮ3 кл/мл эксп.+лит. данные

Тя 30 час модель

Ту1 4 час эксп.+лит. данные

Туз 1 час эксп.+лит. данные

ТУ4 6 час эксп. данные

Ту5 5 час экса, данные

Ту« 6 час эксп.+лит. данные

Ту7 132 час модель

ТУ8 24 час лит. данные

Б 2х 105 молекул юг1 час-1 лит. данные

О 0.5 час"1 лит. данные

К 103 молекул/кл лит. данные

м 101и молекул/мл лит. данные

р| 0.1 час*1 модель

р2 З.бхШ"7 час-1 модель

Следующим этапом экспериментов in machina было исследование процессов пролиферации аутокринных лимфоидных клеток при изменении значений параметров модели относительно значений, представленных в табл.1.

Из анализа результатов моделирования при различных значениях длительности стадии адаптации (TJ следует, что рост клеточной популяции при Та<22 час. можно соотнести с пролиферацией синхронизированных клеток в эксперименте, при этом уменьшение значения Та соответствует повышению степени синхронизации клеток. Расчетные кривые количества клеток в состоянии Y4 (S-фазе) в таком случае имели периодический характер по аналогии с данными рис.2. Было обнаружено, что при Та<12 час. количество фактора в системе меняется в зависимости от времени на два и более порядка.

На рис.10 представлены расчетные ростовые кривые при различных значениях параметра Р2, определяющего скорость выхода клеток из цикла в зависимости от суммарного числа клеточных делений к данному моменту времени (см.3.2), то есть инактивацию пролиферации в системе при истощении ростовой среды. Из данных рис.10 следует, что значение Pj определяет величину максимума ростовых кривых. Если определить значение Р2 как 1/N0, то клетки пройдут по циклу не более 2-х раз (кривая 1). При уменьшении значения Р2 в идеальном случае до нуля (кривая 4) происходит

неограниченный рост клеток. Подобные условия создаются при культивиро вании лимфоидных клеток в проточных реакторах, в которых максимальная плотность клеток в десятки раз превышает таковую в условиях замкнутой

культуральной системы.

о а

й

о UÎ

0 50 100 150 200 250 300 350

Время,часы

Рис. 10. Расчетные ростовые кривые

аутокринных лимфоидных клеток при различных значениях параметра Р2:

1 - 3.33х10-6(час-'); 2 - З.бхЮ^час"1); 3 - 1х10-7(час-'); 4 - Р2 -> 0.

Значения остальных параметров - табл.1.

3500

100 125 150 175 0 25 Время, часы

50 75 100 125 150 175 Время, часы

Рис. 11. Моделирование пролиферации аутокринных лимфоедных клеток при различных значениях скорости синтеза фактора Б:

1 - 2х105 молекул -кл"1 -час*1;

2 - 1х105 молекул -кл"1 -час'1;

3 - 8х104 молекул кл"' -час"1. Расчетные ростовые кривые (А), данные по количеству клеток в стадии У4 (Э-фазе) (Б) и по балансу аутокринного фактора в системе Р (В).

Согласно литературным данным существуют иммуномодуляторы, воздействующие на синтез факторов лимфоидными клетками. Рассмотрим модуляцию пролиферации в модельной клеточной популяции при изменении скорости синтеза фактора Б (рис.11). Кривая 3 рис.11 соответствует критическому значению параметра 8, при котором пролиферация клеток в системе невозможна. Из анализа кривой 2 рис.11 следует, что при значительном уменьшении скорости синтеза фактора происходит синхронизация клеток в первом цикле, степень которой повышается с каждым последующим циклом.

Таким образом, анализ результатов моделирования позволяет заключить, что модуляция пролиферации клеток может сопровождаться их синхронизацией. Это необходимо учитывать в исследованиях эффектов иммуномодуляторов на различные процессы жизнедеятельности лимфоидных клеток, так как результаты тестирования могут существенно различаться в зависимости от времени с момента начала эксперимента.

3.4. Определение пролиферативной активности в модельной системе.

Традиционным способом оценки пролиферативной активности лимфовдных клеток является тимидиновый тест в одной временной точке. Рекомендуемое время инкубации клеток с [3Н]-тимидином варьируется от 2 до 18 час. Мы предположили, что одной из причин несогласованности данных по эффектам некоторых иммуномодуляторов на пролиферацию лимфоидных клеток является разнообразие временных параметров тимидинового теста. Для выяснения этого вопроса мы провели ряд экспериментов in machina.

Данные по уровню пролиферативной активности в модельной

системе были получены пролиферативных кривых -количества клеток в стадии Y4 (S-фазе). Интегральные значения числа клеток определялись в интервале времени [(24-п - т); (24-п)] (п={ 1,2,3,4,5}, т - интервал интегрирования), что

имитирует проведение

тимидинового теста в экспериментах in vitro.

На рис.12А-Б

представлены результаты моделирования пролиферации частично синхронизированных клеток. Модуляция пролиферации в данной модельной системе (кривая 2 по сравнению с кривой 1) обеспечивается увеличением длительности Огфазы первого цикла: TGI*=Ta-KrY14-TY3. На

рис.12В-3 представлены результаты интегрирования данных рис. 12Б при различных значениях т. Сопоставление данных

интегрировании расчетных

25 50 75 100 Время, часы Рис. 12. Моделирование пролиферации аутокринкых лимфоидных клеток при различных значениях длительности Gi-фазы первого цикла Tgi*: I - TGi»=I6 час.; 2 - Toi*=24 час. Расчетные ростовые кривые (А) и данные по количеству клеток в стадии Y4 (Б).

£

о Й

Т=8 "ЕЮ. Д д

-

- ^ 1 1 1 1 V

рис.12Б и рис.12В-3 позволяет

заключить, что при значениях т, много меньших длительности клеточного цикла, возможно перекрывание интервала

интегрирования с отрезком времени, в течение которого в 8-фазе минимальное число клеток.

Следовательно, при продолжительности инкубации с меткой много меньшей длительности цикла, возможно получение искаженных данных о существенном снижении уровня или даже отсутствии синтеза ДНК. Из анализа данных рис. 12В-3 следует, что эффекты

модуляции (данные кривой 2 относительно 1), определенные в одной временной точке, могут отличаться по знаку и по величине в зависимости от времени. Для оценки эффектов необходимо рассматривать кинетику процессов.

В соответствии с данными выводами были предложены следующие изменения традиционной схемы экспериментов по оценке эффектов модуляторов на пролиферацию лимфоидных клеток: I) проведение тимидинового теста каждые сутки в течение всего периода пролиферации клеток; 2) продолжительность инкубации клеток с меткой - не менее 20 час.

100 125 о Время, часы

Рис.12 (Продолжение).

Уровень пролиферагнвной активности в модельной системе. Результаты интегрирования данных рис.12Б при различных значениях i:

т={2(В); 4(Г); 8(Д); 12(E); 13(Ж); 24(3)} час. в - кривая 1, А - кривая 2.

4. Моделирование пролиферации лимфоидных клеток. 4.1. Паракринная пролиферация в модельной системе.

Необходимым условием для осуществления пролиферации паракринных клеток in vitro является добавление в культуральную систему специфического ростового фактора. Для моделирования процессов пролиферации паракринных лимфоидных клеток может быть использована модель аутокринной пролиферации при отсутствии синтеза фактора и начальной концентрации фактора F0 в системе, достаточной для реализации пролиферации клеток.

На рисЛЗА представлена расчетная ростовая кривая, полученная в результате моделирования паракринной пролиферации лимфоидных клеток при F0= 1012молекул/мл и значениях параметров, при которых величина и время достижения максимума расчетной ростовой кривой совпадают с аналогичными характеристиками ростовой кривой первичных В-лимфоцитов (см. рис.1А). На рисЛЗБ представлены данные рисЛЗА, преобразованные в координаты уравнения (1.2). Видно, что результаты моделирования достаточно хорошо совпадают с экспериментальными данными. В результате линеаризации данных рисЛЗБ были определены значения параметров уравнения (1.1) для роста модельной популяции (для сравнения см. значения параметров для В-лимфоцитов на стр.4):

МО = (5-0 ± 0.12)х10"2(час"1)Х. = (1.2 ± 0.03)х10-2(час-').

Время, часы

Рис.13. Моделирование паракринной пролиферации лимфоидных клеток. Начальная концентрация фактора в системе Ро=10'гмолекул/мл. Начальная плотность клеток Ыо=8хЮ4клеток/мл. А - Расчетная ростовая кривая. Б - Данные А в координатах уравнения (1.2). Символами обозначены данные по пролиферации В-лимфоцитов человека (см. рис.1).

4.2. Модуляция аутокриниой пролиферации в модельных системах с различными параметрами синтеза фактора.

Рассмотрим пролиферацию аутокринных лимфоидных клеток в двух модельных системах с различными скоростями синтеза фактора: избыточной (А) и не достаточной (Б) для обеспечения оптимального роста. Расчетные кривые роста популяций представлены на рис. 14А и Б (кривые 1). Предположим, что модуляция процесов пролиферации реализуется в увеличении скорости синтеза фактора и длительности Орфазы первого цикла - значений параметров Б и Та в терминах модели. Кривые 2 на рис. 14А и Б соответствуют росту модельных популяций при увеличении Б и Та на 50%. На рис.МВ представлены данные по пролиферативной активности в системах А и Б, определенные при интегрировании соответствующих пролиферативных кривых для т=24 час. (см. гл.3.4). Из рис.14 следует, что в модельных

0 25 50 75 100 125 150 0 25 50 75 100 125 150

Время, часы

га I ф, в

_ '/ау,' ш 1

контроль ■у* / -- -- Щ ж тк г / /' / ^ ---

- / и/ Ж Ш 1§Р 1

- ; / /// Ш ШЛЛ л . / у

- §й# щ ш . / ^ Шй

48 час

72 час

96 час

Рис.14. Моделирование пролиферации аутокринных лимфоидных клеток при различных параметрах скорости синтеза фактора Б |м-л/кл/час]. Расчетные ростовые кривые: А: 1 - 5=1.5хЮ5, Та=30 час.;

2 - 5=2.25x10*, Та= 45 час. Б: 1 - 5=9.3х104, Та=30 час.;

2 - 5= 1.5x105, Та= 45 час. В - Пролиферативная активность в зависимости от времени. Данные 2 представлены в % от данных 1. Символами обозначены данные по влиянию 10"6М морфина на пролиферацию клеток Ыатака (в) и Уигкаг (А) (см. рис.5).

системах А и Б в течение первых 96 час. наблюдаются противоположные эффекты модуляции пролиферативной активности клеток, обусловленные различиями параметров синтеза аутокринного фактора в системах.

Результаты моделирования позволяют предположить, что обнаруженные нами противоположные эффекты морфина на пролиферацию аутокринных по ФРВК клеток №та1уа и по интерлейкину-2 клеток Уигка! (см. рис.5) отражают различия этих клеток по начальному уровню синтеза факторов.

ВЫВОДЫ

1. Исследована кинетика митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови человека под действием морфина и р-эндорфина. Обнаружено, что их модулирующие эффекты определяются временем экспозиции с клетками, а также исходными характеристиками клеточной системы. Показано, что классический антагонист опиоидных рецепторов налоксон не блокирует эффекты морфина и обладает собственным модулирующим действием на пролиферацию лимфоцитов.

2. Обнаружен противоположный эффект морфина на лимфоидные клетки различных типов: ингибирование пролиферации клеток, происходящих от В-лимфоцитов, и активация пролиферации клеток, происходящих от Т-лимфоцитов.

3. Разработана оригинальная компьютерная имитационная модель пролиферации аутокринных лимфоидных клеток /л у/7го, которая позволяет контролировать кинетику процессов в клеточном цикле и механизмы инактивации пролиферации.

4. Установлены кинетические закономерности пролиферации аутокринных лимфоидных клеток Шта^а. В исследованиях кинетики пролиферации синхронизированных клеток определены длительности фаз клеточного цикла и стадия действия аутокринного фактора. По экспериментальным данным выполнена верификация модели пролиферации аутокринных лимфоидных клеток.

5. В модельной системе проведен анализ кинетических закономерностей процессов пролиферации аутокринных лимфоидных клеток и модуляции этих процессов. По результатам моделирования предложена оптимальная схема проведения экспериментов по исследованию действия модулирующих агентов на пролиферацию лимфоидных клеток.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В

СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Варфоломеев С.Д., Лещенко ("Гришина) З.В.. Куликов В.В. Кинетические закономерности аутокринной пролиферации клеток В-лимфомы человека в культуре. (1991) Докл. АН СССР Т.320, №3, С.716-720.

2. Сергеева М.Г., Лещенко (Гришина) З.В.. Куликов В.В., Варфоломеев С.Д. Роль иммунной системы в механизмах действия наркотических веществ. (1991) Нейрохимия Т.11, №1, С.89-102.

3. Сергеева М.Г., Гришина З.В.. Варфоломеев С.Д. Влияние морфина на кинетику митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови человека. (1992) Иммунология №5, С.62-63.

4. Сергеева М.Г., Гришина З.В.. Варфоломеев С.Д. Модуляция пролиферации лимфоцитов периферической крови и трансформированных лимфоидных клеток человека морфином. (1992) Иммунология №6, С.63-64.

5. Sergeeva M.G., Grishina Z.V.. Varfolomeyev S.D. Morphine effect on proliferation of normal and tumor cells of immune origin. (1993) Immunol. Lett, v.36, p.215-218.

6. Сергеева М.Г., Гришина 3.B.. Варфоломеев С.Д. Механизм действия морфина на пролиферацию лимфоцитов человека. (1995) Иммунология. №5, С.35-38.

7. Varfolomeev S.D., Sergeeva M.G., Leshchenko (Grishina) Z.V. The kinetics of the mitogen-stimulated proliferation of human lymphocytes under influence of morphine. Abstracts of 1-st Int. Congress Int. Society of Neuroimmunomodulation, Firenze, Italy, 1990, p.209.

8. Сергеева M.Г., Лещенко (Гришина) З.В.. Варфоломеев С.Д. Характеристика опиоидных рецепторов на клетках крови и роль морфина как иммуномодулятора. Тезисы Всесоюзного симпозиума по биохимии рецепторных систем, Таллинн, 1990.

9. Grishina Z.V.. Sergeeva M.G.. New approach to modeling of cell cycle events of lymphoid cells. Abstracts of the 4th European Cell Biology Congress, Praga, Czech Republic. Cell Biology International, 1994, v.18, p.495.

10. Grishina Z.V.. Sergeeva M.G. Suppression of human blood lymphocyte proliferation upon in vitro preincubation of cells with morphine. Abstracts of First European Congress of Pharmacology, Milan, Italy, 1995, p.331.