Изучение механизма действия мурамилсодержащих гликопептидов методом проточной цитофлуориметрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Российская Академия Наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биоорганической Химии им. М-М-Шемякина

На правах рукописи УДК 577.27

Хайдуков Сергей Валерьевич

Изучение механизма дейстшгя мурамилсодерзкащих глшсопептидов методом проточкой цито^луоримстрии

02.00.10 Биоорганическая химия, полня природных и ^ггзиологически екткеных веществ

Автореферат

киссертгцки на соискание у-гекой степени •кндкдата хмьдачгских наук

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина РАЕ

Научный руководитель:

Кандидат химических наук ВА. Несмеянов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Б.ВЛинегин кандидат биологических наук А-М.Сапоззвпсов

Ведущая организация: Центральный НИИ Туберкулеза РАМН.

Защита состоится " 1992 г.

в ^?чае на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганкческой химии им. М.М.Шемякина РАН по адресу: 117871, ГСП Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина РАН. Автореферат разослан "Л " 1992 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

м ^уд-уа.рьпуть рт^бд^у. Мурамилсопержашис гяикопептиды известны как соединения, обладающие авъювантным и противоопухолевым эффектами, а также индуцирующие неспецжрическую резистентность к вирусным и Бактериальным инфекциям. Молекулярный и клеточных! механизмы их биологического действия недостаточно изу-: чены, а имеющиеся данные довольно противоречивы. В литературе встречаются сведения о том. что первичными мишенями действия «»урамилпептидов являются как макрошаги, raí: к Т- и В-клетки. Мурамилпептипы влияют на продукцию интерлейккна-1 и усиливают противоопухолевое действие макрофагов, оказывгзот комитогенное действие на тимошггы и периферические Т-лимдвшгты. усиливают, пролиферацию активированных В-лимфоиитов. В тэ же время нет данных о влиянии мурамилпегггидов на процесс распознавания антигена имму:чскомпггектныш<! клетками.

Иммунологическое распознавание белков пренстааляет собой сложный процесс, вклпчаюший в себя их захват антигсн-препстивляющими клетками, процессинг, экспрессию на клеточной мгайране в комплексе с антигенами гистосовместимости II класс?, -л "пугпстагление" их в тггом вине Т-лкм^оцитам-хеллерам. В роли предкгзляюншх гкгиген клеток могут ьистулзть ьдакро<раги и другие типы клеток, экспрес-скрующие рлггкгены гистосовместимости П клааа (для мышей 1а-. антигены). В процессе ьгммунного ответа прожходит модуляция экспссссля этих апткгекоз под действием цктозяшов, прежде всего гсэтер^ерокэ-у. Таким образом, дгишле антигены играют существенную рель в имицигики иммунного ответа, а модуляпия их зхгпрессии является ззд-ективньм механизмом иммунорегулздии. Развитие им-¡лунной реютии сопровождается модуляцией и других гнтиггнов лейкоцитоз, например рецепторов иитокияоб, мелегул адгезии, рецепторе 2 Рсчррзгментов х^ммуноглобулиноь и некоторых других мембранных маркеров.

Настоящая работа посвящена изучению влияния х;урамилсоцержа-iitiíx глкггопегггмлов ка экспрессию мембрашых етпя-еноз каерофагов (в частности ¡а-антигенов) и кехоторые «pyiкшии зтж клеток.

„__bOSCTSigLlFfignj. Делыо »«стоящей работы являлось изучение

методом проточной иктодалуорнмгтркл влияния мурам-ллсоаср-z'zmuz гликапепптов ira экспрессию Ь-антигеноз, рецептора интер-лгйкик:-2 (IL-2K) и ■тагогг.гггрггло активность макрофагов.

В засачи работы входило соггршенстг.оганче иитскрлуори-метричесхого покхода к анализу механизма действия mmmvhomo-дуляторов.

показано, что мурамилсодержащие гликопептиды модулируют экспрессию антигенов главного комплекса гистосоеместимости II класса и рецептора IL-2 на поверхности макрофагов. Данный зфоект реализуется щ ч вЕпосредственном действии мурамилпептидов на макрофаги, а не опосредован цитоккками. которые могут секретироваться поц их влиянием Т-клетками. Он наблюдается как in vitro, так 12 in vivo. Обработка макрофагов мурамилпептидами значительно повышает их фагоцитарную активность. Внутри макрофагов обнаружены специфические центра связывания мурамилпептидов.

Методические подходы. разработанные в ванной работе, могут быть использованы яля быстрого определения биологической активности и отбора синтетических аналогов мурамилпептидов, которые могут найти применение ъ клинике. Эти методические подходы могут бьггь использованы для анализа активности не только мурЕМШШелтипов, но и других иммуномодуляторов.

По материалам диссертация опубликовано 13

работ.

Anpo6aimp,. „табртут. Результаты настоящего исследования доложены на ряде всесоюзных и международных сиштозгтумсз: на симпозиуме "Стртктура, биосинтез и яункши молекулярных элементов иммунной системы" ( Пущине, 1987 ), 5-ой конференции молодых ученых по органической и биоорганичеегмй химии (Бехине, ЧСФР, 2989), Дергом Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 19S9), И-ом Съезде Европейской фекераадш Иммунологических Обществ (Эспоо, Финляндия, 1991), симпозиуме "Структура и Функции регуляторных лолипгггшдов" (Mccxsa, 19Э2 ).

Диссертация изложена на 96 страницах, состоит из вгедения, 3 глш и-выводов, содержит 18 рисунков, 6 схем и 2 таблицы, в списка литературы цитировано 135 названия. В глагс 1 приведен обзор литературных дшньа "Модуляция экспрессии мембранных рецепторов лейкоцитов как механизм кммунорегулядаи", в главе II додержатся результаты исследований и их с&ужкение, в глазе 1П извожены методики экспериментов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Инициация и развитие иммунного ответа приставляют собой результат серии межклеточных взаимодействий, в которых поверхностные антигены и рецепторы иммунокомгггентных клеток играют такую же важную роль, как и растворимые медиаторы иммунных реакций. Регуляция иммунного ответа включает в себя каскад лимфокинов ( Farrar JJ et ai. ), идиотип/анти-идиотипические взаимодействия (Jerne N.K.) и модуляцию экспрессии поверхностных рецепторов иммунйкомпетентных клеток, в частности антигенов главного комплекса гистосовместимости ( Stuart et al.), Fc-рецепторов (Warren el al.) и рецептора IL-2 ( Lee "et al. ). Модуляция экспрессии мембранных рецепторов является результатом как взаимодействия их со специфическими лигандами, так и действия цитокинов, образующихся при течении иммунной реакции, наиболее активным среди которых является интероерон-у (IFN-y). Похожим действием обладают фактор некроза опухолей-а ( TNF-а ), иютрлейкин-4 (IL-4) и некоторые другие цитокины. Разли'шые бактериальные продукты, такие как липополмсахарид, и некоторые агенты, имеющие адъювактвую активность (ионыберияия, полный адъювапт ©ргйнда) споссбнывлклть hä экспрессию 1а-аятигеноз.

Большая группа соединений. обладающее адысвантными свойствами, а именно мурамилсодержащие гзвкопептидьг, были синтезированы в различных лабораториях мира, в том числе в лаборатории химии пептидов ИБХ им. МЛЫПемякина РАН. Среди дисахгрид- и тетрвсахгрипсонержащих мурамклпмгпоюз обнаружены сильные адъюзантьг, в частности №агетклгл»я.озаминил-/? 1 —4-N-аыетилмурамил-гланил-1)-изоглутамин (ГМДП).

В рамках изучения молекулярного и клеточного механизмов биологического действия мурамилпептидог нгмя было выдвинуто предположение о том, что иммувомодулирующая агтишость этих соединения по крайней мере частично обусловлена усилением под их действием экспрессии поверхностных рецепторов лейкоцэтов, участвующих в распознавании антигена, стимуляции прсли<рерззии и ди^Ферегаш-ровки л^л^гцитоз. а. частности усилением экспрессии антигенов глааюго Ймпяекга гистосошосткмости П класс: представляющими гнтиген клетками.

В данном исследовании был применен метод лазерной проточной цитофлуориметраи-сортировки, являющийся мощным орудием в арсенале современной иммунологии, онкологии, молекулярной биологии и клеточной инженерш:. Он обладает целым рядом незаменимых преимуществ, а именно: высокой чувствительностью (до 1000 молекул флуоресцеина на поверхности частицы ), возможностью анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные для каждой из клеток, возможностью исследовать выборку-от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток. Кроме этого, он позволяет в одном эксперименте получить несколько характеристик популяции таких, как размеры клеток, гранулярность их цитоплазмы, а при наличии соответствующих флуоресцентных красителей анализировать до четырех типов флуоресценции. Отдельно следует отметить возможность стерильного разделения клеток, что позволяет выделять индивидуальные типы клеток для дальнейшего проведения. необходимых исследований.

«Г

1. Изучение действия мурзмззлпептидов на экспрессию 1а-антигенов и рецептора IL-2

Обработка клеток перитонеального эксудата ( КПЗ) мышей Balb/c in vi!ro ГМДП в течении 18 ч приводила к заметному увеличению числа la-положительных клеток, причем величина эффекта была пропорциональна дозе ГМДП (рис. 1). В интервале концентраций ГМДП 0,1100 мкг/мл зависимость {¡мела линейный характер ( рис. 2 ); максимальный э$§>ект достигался при 100 мкг/мл. Несколько возрастала ( г 1,3 раза ) и интенсивность флуоресценции клеток, о чем свидетельствовал сдвиг на гистограмме максимума пика флуоресценции снеток в сторону увеличения интенсивности по сравнению с контролем. Напротив, аналог ГМДП, содержащий остаток L-глутвмина вместо D-глутьмина (L-L-ГМДП) и лишенный адыозантной аизЕвнссти, не- оказывал заметного влияния на экспрессию Ia-шгшгенов. Неактивен был в этом тесте и дисахарид GkNAc-j31—4-MurNAc ( ГМ ). Следует отметить, что для математической обработки полученных гистограмм была использована программа MDA23S (Coulter. США.), суть которой ^-^заключается в наложении контрольной гистограммы на опытную с последующим

£

вычитанием первой мз второй. Полученная разность, выраженная б процентах, отражает изменение количества позитивных клеток. В случае неполного расхождения пиков, т.е. когда изменения плотности антигенов иг поверхности клеток невелики (что наблюдалось в наших экспериментах), то значение, которое она дает, является минимальным.

Еиажгс» музргсцаеда

Рис. 1.' З^хрект ГМДП кц зкспрьссшо 1а-ашигенов перито-нгалшм(.;л макро<ркгамг« мкнп:. Результат .«тематической обработки гистотргмм по программе Ш)А.В5.

ВглЪ^.Ь'г^ 1С с сорят. 5.:ло хтскгзако, что М}'ра~«шжпечт1ет ( МДП ) в нилкго:*« йетлглтргдаа 30-300 ихтЬля не спсссбен индуцировать г:хпвасаао к-штлтеноь иг. мыфэфхмг юшш. В клипс: условиях зг:спер:а;^:-л~ ЭДШ, г.отя к проявлял слабую • Ьгсгимутаругощую г«тчи5ссггь нрк о^ень низках кешгстрелхях (оштошангя 201-щентрг.ция 0,1 ют/мл ). но гамел-ю уступал г зтом плане П\£ДП

(рис. 2). Возможно, этим объясняется меньшая алыоаантная активность МДП по сравнению с ГМД17. Таким образом, способность индуцировать экспрессию Ь-антигеисв для кзучениых соединения коррелировала с И£ биологической активностью.

Основываясь на этих результатах, была проверена способность индуцировать экспрессию 1а-антиггнов у ряда мурилшгагттшав, синтезированных з нашем институте (см. Табл. 1). Большинство проверенных аналогов ГМДП. в том числе и "симл.р" ГМДП ([Пу1ДП]?), обладали меньшей Та-мозулируюпкй актизысстыо, чем сам

ГМДП. Только ГМДП-Ьуз-стероил и ГМ-А1а-Г)-0!и обладали более высокой максимальной активностью в нашей тест-сютемг при сопоставимых с ГМДП концентрациях.

Концентрация (мкг/ме)

Рис. 2. Зависимость изменения числа 1а-поло2сительных клеток (%) от концентрации ГМДП (1). ГМ (2), МДП (3) и Ь-Ь-ШДП (4).

Следует отметить, что во всех случаях наблюдалась корреляция между наличием (или отсутствием) адъювантной активности и способностью индуцировать экспрессию 1а-антигепов. В связи с этим представляет интерес ГМДП-ЬуБ как соединение, которое может быть

использовано для синтеза флуоресцентно- и изотопномеченных производных ГМДП. с помощью которых возможно исследование рецептора мурамилпепткдов на клетках-мишенях. Существенный интерес для медицины представляет аналог с остатком П-Ои вместо Г>-01п, так как зто соединение не обладает пирагшным :<р<ректом.

Тасшша 1. Действие аналогов ГМДП на зкепрагоо Ь-аиитшов перитшеалшыки иахрофагахи ишш

Муракия-пстгады Вмрастаиие числа ¡а-пшкнятельяы): ¡слетж(2)

ШкгДл 31 ккг/ет Шнкг/кл Йшг/ил 100 цкг/н

ггщп' 7.5 10.3 ¡7.9 23.5 ш

ь-иедп пд 0.6 и 2.7 нд

1ЩП)2 кд 9*5 13.0 119.61 Ей

ГМДП-Ьуз на 9.0 14.6 и НД

гм Ей 2.2 2.0 0.5 НД

ГК-НШННЯп ал 19.4 21.0 Ш21 НЯ

ВД1Ыу9-сгер!пл ЕЛ 20.0 25.5 ЕЕ Ей

ГЩП-Акаивтш НД О 2.1 3.1 НД

гащнозд яа 3.2 3.0 Ш НД

ЩП(0Ви1) Ей 1.0 ш 7.3 НД

и.о. - не определялось

Известно, что перитоаеальный эгсудат содерзагг кроме магрскрггов и другие типы ¡теток. Анализ КПЗ с испогьзовакием двух видов светорассеяния ( малоуглового и под углом 9СР ) показал, что КПЗ содержат как минимум две субпопуляпии кее-гок: различающихся размерами м гранулярностью шггошкама. Было проведено ткшфозаш» КПЗ с использованием коммерческих мокэклокаяьных антител против различных ди<р<ререт1кровочЕнх маркеров иммуно-компетентных клеток. Сказалось, что КПЗ содержат клетки следующих фенотипов: 58 - 62% Мас-1+ (магрофегов), 2-3% Ьу1-2+ ( Т-супрессоров и натуральны: киллеров), 7-13% ЦТ4+- (Т-хелпероз), 287

35% Ia+ ( м-'-г^схргов и Б-плеток ) к 15-20% Ig+ (В-ютетсх). Следует отметить, что -:ругвше выеокогранулярные клетки несли только Мас-1 и 1а-антигекы.

Тах как 1СПЭ гетерогенны по размерам к гранулярности цитоплазмы, они feuu-í разделены, на основании этих параметров, на две субпопуляция (рис. 3). Каждая из них по-стдельности была обработана ГМДП, а после инкубации анализ показал, что экспрессия 1а-антигенов повыхагтея только на крупных высокогранулярных клетках, т.е. макрофагах.

toS. от

о

(D

О

о

сч.

В

• . ■.•¿zw+i.11' ¡ • . •

-i-1—

203

i--¡—

405

FS

■680

880 10ЭС1

fi

Рис. 3 Дзухпаргьгстричесхая гистограмма распределения клеток в зависимости от 1хх размеров ( Р5 ) и гранулярности цитоплазмы ( 55). А - мгхкис слпБограауляркые, В - ¡фуппие зысогогранулярные.

Представленные выше данные не исключали гозможности увеличения экспрессии Ь-гнтигенов на поверхности макрофагов опосредовано, в результате секреция под действием ГМДП лим<рокииов другими клетками, прежде всего Т-лим<роцитами, примесь которых присутствует в КПЗ. Поэтому была проверена способность ГМДП модулировать экспрессию 1а-антмгенов в присутствии циклоспорина А ( СбА ). Было поспало, что сам по себе СхА слабо, но ингибирует

экспрессию 1а-антигснсв на поверхности перитонеаль.гых макрофагов. а также влияет т экспрессию Ь-ангмгснов стнмулкрозанными Г МДП перитоиеальными макрошагами. В то же время, дозазависимое гинибирование экспрессии 1а-аптнгеиоз вызванное СзА не приводило к исчсзкоеен.чю эффекта ГМДП: уровень экспрессии 1а-антигенов оставался выше, чем у клеток не почзергавшихся обработке ГМДП (рис. 4). Таким образом, если Ь-инвунируюшгя аэттзпость ГМДП и опосредована пигокинами. то лишь частично.

о

Ьч М 1—"

К о

¡:о

(х

м гг

ГМДП 10 мкг / С$А 1 мкг

ГМДП 10 мкг/ С*А0.1 мкг

^ГМДП10 мкг/ С<А 0.01 мкг

| Ч ГМДП Юмкг/ма \

Сг>А 1 мкг /мл

С: А 0.1 жг/кл

С5А 0.01 мкг! мл

! . ________ : НОРМА \

1 ю ТОО "ООО

ИНТЕНСИВНОСТЬ ФЛУОРЕСЦ€ХЩ11И

Гмс. 4. Дгйстзке ГМДП к С:Л яг акскрвгаго Ь-агггигсноа пгротокггльнымк макрофагами мыта.

Для выяснения роли шптажнов было про&ереж '.тдахе дгйствиг ГНГОТ на клэт-^р'.кдагло >?челомочопит?рную ггжгк1 '«яаткнмх

о

клеток ^УЕШ-З. Ргзупьтаты свидетельствуют. что ГЩЩ повышает экспрессию и в этом случае, т.е. действие ГМДП

направленно непосредственно на макрофаги ( рис. 5 ). Ввиду того, что к числу иэвзстшя индукторов 1а-гнтигенов относится ТТчТ-а, а макрофаги относятся к разряду клеток способных его продуцировать, было изучено, не секретируют ли этот <рагтср клетки \УЕН1-3 под действием ГМДП. С помощью чувствительных к ТМР-а клеток линии 1.929 было показано, что в культуралькей среде стимулированных ГМДП клеток У^ЕШ-З Т№-а отсутствует. Долевая зависимость индукции 1а-антигенов на клетках \"/ЕШ-3 отличалась от таковой для пгритонеальных макроф^-ов наличием максимума при более низкой концентрации ГМДП - ОД мхг/мд против 100 мкг/мл для макрофагов. Тавог различие может объясняться либо спецификой (большей чувствитеяьностью) клеток \У"ЕШ-3, либо, в случае перито-неальных клеток, суггмарным действием ГМДП и цитокинов.

<4

Интенсивность флуоресценции

Рис. 5. Экспрессия к-антигенов клетками мышиной миело-моноцитарной линия WEШ-3 после 18 ч инкубации. А - контроль, В -0,1 мкг/мл ГМДП.

Кинетика индукции 1а-антигенов ск лая ГМДП. так и для интерферона-у характеризовалась наличием затух максимумов (рис. 6): через 6 и 18 ч. Посяе первого максимума уровень Ь-знтигенов быстро падал: повторная индукция сопровождалась пттггпьчым (по крайней мере 48 ч) сохранением их уровня. По-шидалому, такой характер

зависимости говорил о наличии двух субпопуляций макрофагов -"быстро" я "медленно отвечающих" . Для подтверждения этого КПЗ были разделены с помощью цитарлуориметра на две группы: 1а-положмтелыше и 1а-отрицательные. Каждая из них была индивидуально обработана ГМДП и после инкубации в течении 6, 9, и 18 ч проанализированы на наличие 1а-антигенов. Выяснилось, что в 1а-отрицательяоЯ субпопулянии появлялись клетки начинающие экспрессироватъ Ь-анютена и количество их возрастало по мере инкубации с ГМДП, Иначе вела себя 1а-положителъная субпопуляция: после обработай ГМДП в течении 6 ч клетки повышали уровень зкспресси 1а-антигеяов, а к 18 ч он падал (рис. 7). Таким образом, "быстро отвечающие" клетки - это субпопуляция, уже несущая 1а-анткгены: ГМДП вызывает у них возрастание уровня экспрессии la-антигенов; "медленно отвечающие" - la-отрицательные клетки, у которых ГМДП вызывает de novo синтез этих антигенов.

60

40

20

0 3 6 9 12

18

-48

Время (час)

Рис. 6. Кинетика изменения числа la-положительных клеток при инкубации макрофагов ш viiro с ГМДП (А. 20 мкг/мл) и интерфероном-7 ( В, 400 едУмл).

Была проверена способность ГМДП индуцировать экспрессию la-антигенов на макрофагах in vivo при введении з перитонеальную полость мышей. Результаты представлены на рис. 8. И в этом случае при введении ГМДП за 18 ч до анализа наблюдалось увеличение числа la-положительных клеток. Использованная доза ГМДП ( 150

п

мкг/мышь ) являлась оптимальней для апъпвзнтного действия т \']\'о. Через 48 ч уровень экспрессии ]а-антигеноз в отличие от опытов из упго падал практически до нормы. Этот <ракт объясняется либо быстрым удалением ГМДП из организма (что хорошо известно), либо функционированием б организме механизмов как усиления, как и ослабления экспрессии 1а-анткгенов (что также отмечено).

20-

1 О

ЕМЗ 1а-

т

—с г

ш ¡т^==п.

18

Зредолх (час)

Рис. 7. Кинетика экспрессии под действием ГМДП 1а-антигенов 1я+ и 1а- перитонеальными макрофагами мыши.

Интеасшнесть флуоресценции

Рис. 8. Экспрессия Ь-алтагенов тер«гс?»ег.»ышш4 • шаро^еги'л после инъекции ГМДП (150 нет, Б) гааг ьабу.{ грашзогс $оар5.та?л1 физраствора (А) г перктокезльку» пол есть мсти. Бргьгя псслс инъекции (г) 18 ч, (б) 48 ч.

Известно, что мурамилсодгржашие гликокгяткпы повышают цитотохсичкость мякрофчгоа. Обработка мзкро<ратов интерлсйкином-2 ( 11.-2 ) вызывает тот же эффект, поэтому было проверено действие ГМПП на модуляцию экспрессии рецептора 11.-2 ( 11X211 ). Было обнаружено, что ГЛЩП вызывает появление ГЬ-ЛК :-:зк на перитонеаяьчых макросргтах, так и клетках \УЕШ-3 ( рис. 9 ). Как и а случае с модуляцией экспрессии Га-антигенов. дойный зф<ргхт является дозазгзисчмкм. и максимальный Эффект для клеток "*УсН1-3 достигается при более низких концентрациях (0,1 мкг/мл ), чем для макрсхрагов (1 мкг/мл).

Концентрация (мкх/мл)

F.kc. 9. Влияние ГМВП на экспрессию рецептора интерлейхина-2 игрьтолсальиымя макроусгзмм мыши (2) и мышиной мяеломоиоцм-тэрноа линей клеток WEHI-3 (1).

Таким образом, мурамилсодержаздие глжопепткды облсдаюшиг биологической активностью вызывают усиление экспрессии антигенов гастосовместамости II класса представляющими гнтиген клетками перитсиеалького зксудатг. а именно макроуггами. Механизмы усиления и икцухцки экспрессии 1а-йнтигепоз под згйстЕ«см ГМДП на клетки нахояетяихся в разных стадиях зрелости, по-видимому, различаются. Менее зрелые макрсрага начинают зкспресс'чровать 1а-антигенк за счет биосинтеза de novo. Способность мурамклпепткдоэ повышать содержанке. мРНК,. продуктов генов главного комплекса гистосовместамости была отмечена для моноцитов (Vermeulen M.W. et al.). Более зрелые макрофаг?! в сеою очередь усиливают экспрессию 1а-антигеков. Эти о<ргректы могут приводить к улучшению презентации

процессирозанных белков Т-клеткам-хелперам. поскольку- взаимосвязь между усилением экспрессии 1а-антигенов и усилением презентации в настоящее время хорошо документирована (БЫтасЫ е1 а1„ Еуахи е! а!.).

С другой стороны мурамилпептиды повышают шгготоксическую активность макрофагов, и такой же способностью обладает 11.-2. Таким образом, появление рецептора 11.-2 под действием мурамилпептидов на поверхности макрофагов позволяет вовлекать в процесс их активации интерлейкин-2.

2. Изучение влияния ГМДП на фагоцитарную активность макрофагов

Модуляции экспрессии 1а-антигенов и рецептора 11.-2 макрсхраггми под действием мурамклпептидов предполагает их ьззимодсйствме с клетками, проведение сигнала внутрь клетки и, как следствие, изменение функциональных особенностей клеток.

С целью выявления механизма передачи сигнала была проверена способность взаимодействовать с макрофагами биологически активного аналога ГМДП - ГМДП-Ьув, коньюгирсганного с флуоресцеином ( ГМДП-Луз-ШИТЦ ). Активность этого соединения была проверена в тесте на индукцию экспрессии 1а-актигенов и на адыовантную активность. В связи с тем, что ГМДП-Ьуг-ОЙТЦ интенсивно флуоресцирует, для анализа 1а-якдукции были использованы антитела, меченые ТРИТЦ (тетраметилродаминизотио-цигнатом) и флуоресцирующие в отличной от ©ИТЦ области спектра. Показано, что ГМДП-ЬуЕ-ФИТЦ обладает способностью модулировать экспрессию 1а-антигенов, хотя она несколько слабее чем у ГМЦП-ьуз. Обработка нативных перитонеальных макрофагов в условиях, препятствующих фагоцитозу ГМДП-ЬуБ-ШИТЦ, не присолила к заметному изменению интенсивности флуоресценции клеток по сравнению с необработанными. Это свидетельствовало о том, что либо молекулы, способные специфически взаимодействовать с ГМДПТ.уг-ФИЩ на поверхности клеток отсутствуют, либо количество их меньше, чем позволяет регистрировать чувствительность прибора, т.е. менее 1000 молекул на клетку.

После обработки клеток ¿¡-октилглюкозкдом, ' приводящей образованию пор в клеточной мембране, и добавления ГМДП-Ьуз-ФИТЦ интенсивность флуоресценции резко увеличивалась по

«л

сравнению с клетками, не обработанными ГМД'I-Lyx-iDMTIJ, что говорило о наличии внутриклеточных центров связывания ГМДП. Даяния зэ-эгкт был специфическим, так как он позозависимо иигкбирогался как ГМДП-Lys, так и самим ГМДП ( рис. 10 ), но не трппептадом - Ala-D-Glu-Lys.

Наличие внутриклеточных специфических цегггров связывания поставило вопрос о путях возможного проникновения мурамил-соцеркетгах глиггопаптжгов внутрь клетки. Наиболее вероятным ¡¿ытлядгл знаоцитоз - процесс, весьма характерный для макрофагов, изчестн.ых га:г .клетки-фагоциты. Поэтому был охарактеризован зидошггоз ГМШТ-1.у£-ФИТ11 мгкрсхрагами. В условиях приближенных к (рксиологячесгим и добавлении ГМДП-ьуа-ФИТЦ наблюдалось гремязгвисимое усиление интенсивности флуоресценции клеток'(рис. 11), что свидетельствовало об активном зндоцитозе.

У !

м ^ J" I + 1GQ мкг ГМДП-Lys

[Lwvw^ .^'"-у,._______________

1'

J .(' + 10 мгг ГМДП-Lys

^__Jib___—4—-

j i

r

Г •• I, + 5 MKT ГМДП-Lys

''it--......

J ': i rMliII-Lys-фИТЦ

^ : 4_ : ;

—гТтТГя r—r -r-rrrriTf--i ~i -ТПтт---гт'гтпп i

.1 1 IB 100 1069

Интенсивность флуоресценции

Рис. !0. Взаимодействие ГМДП-1_у5-ФИТЦ с перитонеальными макрофагами после их обработки £-октилглкжозидом и ингибирование этого взаимодействия ГМДП-Lys.

Очевидно, что проникновение ГМДП в клетки и его действии на экспрессию мембранных антигенов могли повлиять на функциональны; свойства макрофагов. Поскольку сшюи из важнейших функции макрофагов является фагоцитоз, была проверена способность клеток фагоцитировать в присутстьии ГМДП. Для изучения этого процесса и влияния на него ГМДП в кэчестге субстрата использовали инактивированные микроорганизмы вйрауИососс-.« гизтаз. кояъюги-рованные с флуореецеином (51.аигеи5-(СИТЦ). Было показано, что клетки леритонеального эксудата фагоцитируют ь'-аити.-ФИТЦ, причем количество клеток, включивших внутрь чсоя флуоресцирующие частицы', возрастает в процессе инкубации в течении 60 мин, после чего остается неизменным. О5рьбо"ъ*д перитонеаш>ных макрофагов ГМДП (10 мкг/мл) в течения 18 ч нерзд добавлением 51.аш сиБ-ШЙТЦ заметно ускоряло процесс фагацнгеза (рис. 12). Кроме этого, увеличивалось число фагоцитирующих клеток и количество фагоцитируемых кмм частии по сравнению с необргбста!ШЫМй клетками, о чгм свидетельствовало как возрастание количества флуоресцирующих клеток, гак и возрастание иктснсныгасти ил свечения.

т

I/ \

|Ч

«г ¡и

и

1Л

V

л

/ аПЕйСИйШЬ КСТРЕЕЦЕЗДЗП

Овя

1й Ш)

БСки

30««

Рис. П. Кикетига энпоамтогз П;1ДП-ьу5-ФМТЦ клетками перкто-кггльного эксудата при 37° С.

Наличие этих эффектов было проверено и при одновременном внесении БиаигеиБ-фИТЦ и ГМДП. После 30 мин инкубации перито-неальных макрофагов с ГМДП и Биаигеш-ФИТЦ . цитофлуори-метрическзяй апализ клеток показал, что и в этом случае нсблюдается такой же эффект, как и при предварительной обработке клеток ГМДП в течении 18 ч, яо он был менее выраженным.

и

Р

я

а

60

40

20

ч о М

20 40 60

Время (мин)

80

Рис. 12. Изменение кинетики фагоцитоза Биаигеиз-ФИТЦ перитонеальнкми макрофагами мыши после кх предварительной инкубации с ГМДП в течении 18 ч. 1 - контроль, 2 - 1 мкг/мл ГМДП, 3 -10 мкг/мл ГМДП.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что для реализации своего биологического эффекта мурамилсоцержапше гликопептшш должны быть интернализоззны микрофагами, где они взаимодействуют с внутриклеточными структурами. Это взаимодействие приводит к усилению фагоцитирующей активности я индуцирует экспрессию 1а-актатеноз и рецептора П.-2, играющих важную роль в ининигпии иммунного ответа. Эти Эффекты несомненно вносят вклад в им1.1упомодулирующую активность мурамклсодерзкащих гликопеп-ткдов.

ВЫВОДЫ

1. Иммунсактившде мурамилсодерасгшие гликопептиды повышают экспрессию антигенов гистосовместимости П класса на

перитонеальных макрофагах мышей и миеломоноцитарной линии клеток WEHI-3. Данный Эффект проявляется как in vivo так и in vilro. и является позазависимым.

2.-Повышение экспрессии 1а-антигенов коррелирует с наличием у гликопептидов адъювантной активности. На основании этого эффекта предложена тест-система для быстрой оценки биологической активности мурамилсодержаших гликопептидов.

3. ГМДП модулирует экспрессию рецептора IL-2 на перитонеальных макрофагах мыши и миеломоноцитарной линии клеток WEHI-3 in vilro.

4. ГМДП попадает внутрь макрофагов за счет зндоцитоза, где взаимодействует с внутриклеточными мурамилпептид-связывающими центрами. ГМДП усиливает фагоцитарную активность макрофагов.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Nesmeyanov VA., Khaidukov S.V., Komaleva R.L. Effect of N-acetylglucosanrinyl-/31 —4-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-is6glutan2ine (GMDP) and synthetic analogs on expression oi leukocyte surfase antigens. Abstracts of 6-th Internelional coi^ress of Immunology. Toronto 1986, p.167.

2. Хайдуков СВ.. Комалева PЛ-,Несмеяков ИЛ. Влияние N-вдетил-

глюкозаминил-/3( 1-4 )-К-ацетилмурамил-Г-аланил-1)-изоглутгмина

(ГМДП) и его синтетических аналогов на экспрессию антигенов поверхности лейкоцитов. Тезисы докладов симпозиума "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы". Пущино, 1987. Стр. 40.

3. Несмеянов В.А., Хайдуков СВ., Комалева PJL, Андронова Т.М., Иванов В.Т. Влияние N-ацетилглюкозаминил-Д 1 —4-К-ацеталмурамил-Ь-аланил-1>изоглутамина на экспрессию 1а-антигенов макрофагами мыши. - Биолог, мембраны, 1989, т. 6, N.3, стр. 245-249.

4. Khaidukov S.V., Komaleva RJL, Nesmeyanov VA. Mechanism of immunomodulatory activity of muramylpeptides. Abstracts of. Sixth Confe-rence of Young Scientists on organic and bioorganic chemistry. Bechyne 1989,-p. 173.

5. Nesmeyanov VA, Khaidukov S.V- Komaleva Rl_, Aodraoova T.M., Ivanov V.T. Muramylpeptides augment expression of .macrophage surface antigens. Abstracts of 1 USSR-Japan Symposium "Receptors:. Structure and Function". Moscow, 1989, p. 46. :

6. Khaidukov S.V., Koraaleva R.L.. Nesmeyanov V.A. Mechanism of immunomodulatory activity of muramvlpeptides. Abstracts of International cwsgress of Immunology. Berliae (West), 1989. p. 81.

7. Хгйдуков C.B.. Ковалева Р.Л. Влияние мурамилсовержащих гликопептидов на экспрессию антигенов мембран иммунокомпс-тентных клеток. Перзый Всесоюзный иммунологический съезд. Сочи, 1989. Тезисы докладов. Том 1, стр. 124.

8. Nesnseyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Acdronova T.M., Ivaoov V.T. Muramylpeptides augment expression of Ia-antigene on mouse macrophages. - Biomedical Science. 1990, Vol. 1, N 2, pp. 151-154.9. Nasmeyanov УЛ., Khaidukov S.V., Komaleva R.L. Suaiaroka M.V. The

study of meiecuiar mechanism of muramylpeptide biological activity. Abstracts of Symposium "Molecular factors of hematopoiesis and stem cell". Moscow. 1990, p. 156.

10. Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Sumaroka M.V. Nesmeyaaov V.A. The study of rocchacism of muraznylpeptide biological activity. Abstracts of 11-th Meeting of European Federation of Immunological societies. Espoo, 1991, p. 136-19.

11. Golovins T.N., Sumaroka M.V,, Litvinov 15-, Khaidukov S.V., Nesjaeyanov V.A. Intracellular aauramyl peptids-biadbg molecules of macrophages. Abstracts of 11-th Meeting of European Federation of Immunologic;! societies. Espoo, 1991, p. 136-1S.

12. Suaaroka M.V., Lityjnov I.S., Khaidukov S.V., Goiovina T.N., Kaffiraz M.V., Kcn-ueva R.L., Androso-va T.M., Makfrov E.A., Nesmeyaaov V.A. Ivanov V.T. Murasyl pepude-bisdiag sites are located inside target cells. FEES Letters, 1991, V. 295, pp. 48-50.

13. Khaidukov S.V., Koamlsva R.L., Nesmeyanov V.A. Effect of fliiifasiylpaptides on murine peritoneal exudate cells (MfECs). Abstracts of SymposiuiB "Structure and function of regulatory polypeptides". Moscow, 1992, p. 32.