Атомно-силовая микроскопия кристаллов лизоцима ромбической модификации тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы, одновременно с бурным развитием биотехнологий, возрос интерес к выращиванию кристаллов белков, нуклеиновых кислот, вирусов и других биологических объектов из водных растворов. Этот интерес вызван тем, что только закристаллизованные биологические объекты позволяют определить их структуру и понять механизм работы этих молекулярных машин, что крайне важно для создания новых биологических технологий. Важнейшую роль в определении структуры белков играет качество получаемых из них кристаллов. Единственным путем к получению совершенных кристаллов является глубокое понимание механизмов их роста. С появлением, некоторое время назад, in situ атомно-силовой микроскопии, позволяющей детально визуализировать растущую поверхность кристалла, наука получила новые возможности для решения этой проблемы.

В настоящей работе проведено подробное исследование морфологии поверхности и механизмов роста белкового кристалла. Несомненным преимуществом белков как объекта исследования методами атомно-силовой микроскопии является достаточно большой размер молекул, который облегчает наблюдение элементарных актов кристаллизации, что пока невозможно для неорганических соединений. В качестве объекта исследования выбран кристалл лизоцима. Лизоцим представляет собой модельный белок с полностью расшифрованной внутренней структурой и биологическими функциями, который довольно легко поддается кристаллизации. Первые исследования кристаллизации лизоцима были проведены в работе Abraham Е Р and Robinson R (1937). Имеется информация о свойствах водных растворов лизоцима (Guilloteau et al 1992, Ries-Kautt et al 1989, Schwartz et aI 2000,), а так же о его кристаллографических формах. В работах Vekilov et al (1993) и Rong et al (2000) изучалась кинетика роста, наиболее легко получаемой, тетрагональной модификации лизоцима, для которой также имеются данные по морфологии поверхности (см. Главу 1). В данной работе изучалась ромбическая модификация, практически не исследованная до настоящего времени.

Целями настоящей диссертационной работы были:

- исследование структуры поверхности растущего кристалла на молекулярном уровне, сравнение поверхностной структуры кристалла со структурой в объеме, наблюдение ступеней и изломов;

- определение механизма роста кристалла, изучение кинетики движения ступеней, выяснение статистики изломов, скорости их появления и движения.

Работа состоит из трех глав и заключения.

В первой главе описана экспериментальная установка, подготовка и проведение эксперимента и первичная обработка экспериментальных результатов, так же дается обзор некоторых свойств исследуемых кристаллов и растворов.

Во второй главе приведены результаты исследования морфологии поверхности растущего кристалла. Достигается визуализация поверхности с молекулярным разрешением. Обсуждаются эффекты изменения периода решетки на поверхности. Проводится наблюдение ступеней и изломов.

В третьей главе описаны механизм и кинетика роста кристалла. Наблюдаются источники ступеней. Исследуется статистика изломов. Приводятся экспериментальные данные по кинетике роста. Проводится обсуждение полученных данных в рамках теории одномерного зародышеобразования.

Основные результаты диссертационной работы сформулированы в Заключении.

Литература к Введению

Abraham Е Р and Robinson R 1937 Crystallization of lysozyme Nature 140 24

Guilloteau J P, Ries-Kautt M M and Ducruix A F 1992 Variation of lysozyme solubility as a function of temperature in the presence of organic and inorganic salts J. Cryst. Growth 122 223-230

Rong L, Yamane T and Niimura N 2000 Measurement and control of the crystal growth rate of tetragonal hen-egg-white lysozyme imaged with an atomic force microscope J. Cryst. Growth 217 161-169

Ries-Kautt M M and Ducruix A F 1989 Relative effectiveness of various ions on the solubility and crystal growth of lysozyme J. Biol Chem. 264 745748

Schwartz M A and Berglund К A 2000 In situ monitoring and control of lysozyme concentration during crystallization in a hanging drop J. Cryst. Growth 210 753-760

Vekilov P G, Ataka M and Katsura T 1993 Laser Michelson interferometry investigation of protein crystal growth J. Cryst. Growth 130 317-320

2.3. Основные результаты Главы 2

Методом in situ атомно-силовой микроскопии исследована морфология поверхности кристаллов лизоцима ромбической модификации.

Достигнута визуализация растущей грани кристалла с молекулярным разрешением. На грани (010) обнаружено удвоение параметров элементарной ячейки в направлениях осей а и Ь, что свидетельствует о реконструкции поверхности, находящейся в контакте с раствором.

Впервые удалось визуализировать изломы, находящиеся на торце элементарной ступени. Наличие изломов разной глубины свидетельствует либо о наличии примесей на поверхности кристалла, либо о том, что на поверхность садятся целые кластеры строительных единиц.

1. Forsythe E L, Snell E H, Malone С С and Pusey M L 1999 Crystallization of chicken egg white lysozyme from assorted sulfate salts J. Cryst. Growth 196 332-343

2. Guilloteau J P, Ries-Kautt M M and Ducruix A F 1992 Variation of lysozyme solubility as a function of temperature in the presence of organic and inorganic salts J. Cryst. Growth 122 223-230

3. Kubby J A and Boland J J 1996 Scanning tunneling microscopy of semiconductor surfaces Surf. Sci. Rep. 26 61-204

4. H, Nadarajah A and Pusey M 1999 Determing the molecular-growth mechanism of protein crystal faces by atomic force microscopy Acta Cryst. D55 1036-1045

5. Michinomae M, Mochizuki M and Ataka M 1999 Electron microscopiic studies on the initial process of lysozyme crystal growth J. Cryst. Growth 197 257-262

6. Oki H, Matsuura Y, Komatsu H and Chernov A A 1999 Refined structure of orthorhombic lysozyme crystallized at high temperature: correlation between morphology and intermolecular contacts Acta Cryst. D55 114-121

7. Ries-Kautt M M and Ducruix A F 1989 Relative effectiveness of various ions on the solubility and crystal growth of lysozyme J. Biol. Chem. 264 745748

8. Steinrauf L К 1959 Preliminary X-ray data for some new crystalline forms of P-laktoglobulin and hen egg-white lysozyme Acta Cryst. 12 77-79

9. ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМ И КИНЕТИКА КРИСТАЛЛИЗАЦИИ

10. Модель движения ступеней путем образования одномерныхзародышей (обзор литературы)31.1. Основные механизмы роста кристаллов.

11. Пусто вероятность того, что в данный излом за время dt попадет частица, равна со+dt, а вероятность отрыва ее от излома равна co'di. При равновесии ю+=ссГ и излом хаотически диффундирует вдоль ступени.л

12. При малых s, когда c/s»\/p0, излом с большой вероятностью может отступить до соседнего излома и, если тот противоположного знака, аннигилировать с ним. В результате изломы хаотически блуждают.

13. Подобная зависимость размера одномерного зародыша от пересыщения была получена в работе Zhang et al 1990.

14. Соответствующие выражения были получены в работах Воронков 1970 и Van der Erden 1993. Рассмотрим соображения последнего, т. к. они более наглядны. Рассуждения ведутся в тех же предположениях что и выше.

15. Дц» ср=2/3 и не зависит от пересыщения, но при 5~1 и больше ср1 /9возрастает пропорционально 5 . Расчет по (5) показывает, что (6) справедливо при м?/къТ>5, при меньшей энергии образования излома зависимость ср от пересыщения более слабая.

16. Рассчитанное по (4) время установления стационарной плотности изломов при увеличении пересыщения от 0 до 5 уменьшается при увеличении \vvis.

17. При малой плотности изломов (большие w и низкие температуры) отличия от (1) практически нет, но при большой плотности изломов разница будет существенной. Тем не менее, соотношение (6): ср°=ср°(1+5)1/2 остается справедливым.

18. К сожалению, до сих пор нет каких-либо экспериментальных данных о зависимости р(^).

19. В условиях равновесия концентрация изломов на ступени (1) не зависит от ее длины, так как w определяется короткодействующими силами химической связи. Однако в неравновесных условиях это не так.

20. Выберем на ступени какую-нибудь точку, тогда приход в нее излома означает продвижение ступени вперед на расстояние а. Поэтому скорость ступени:1. V=avр (8)

21. Таким образом, скорость ступени определяется плотностью изломов, а последняя зависит от длины ступени. Вид этой зависимости был получен в Frank (1974), а затем Онищенко и др. (1996). Ход рассуждений изложен здесь по последней работе.

22. Поясним здесь, что двойка появляется из-за того, что аннигилирующие изломы движутся навстречу друг другу, а появление экспоненты и интеграла легко понять, предварительно прологарифмировав произведение бесконечного числа сомножителей.

23. Аналогично можно получить:1. X X

24. Ур+(х) = / |ехр-2\р(у)с!уУк Используя свойство (10) имеем:

25. Р О) = — |ехр-2 (~у)с!у.ск1. V X X

26. Дифференцируя это выражение по х, получаем:1. Лх V V х ; V

27. Так как р(£)=0, для нахождения р(Ь) с учетом (7) имеем соотношение:р = л1р: ~P~tgкоторое легко преобразуется к виду:л!р1 Р2 .p/px=smLpx^\-p2/p13)

28. Из (13) видно, что при £роо«1 р=1роЛ а при р=роо. Сучетом (8) и (7), получается, что в первом случае V-aJlL, а во втором V=apooV. Эти соотношения совпадают с (9).

29. Проинтегрировав, получаем:быть найдено из условия x=Lo„ и райяться v^-alnf 1Чр/ртУ.

30. Методика определения пересыщения

31. Данные по растворимости Со(7) для широкого интервала температур взяты из Ataka and Asai (1988) (см. рис. 2).

32. Источники ступеней. Описание дислокационных источников.

33. Рис. 16 Два последовательных АСМ-изображения 001.-ступеней на грани (010). Интервал времени между кадрами 304 с. Размер кадров 9x9 мкм . Статистика изломов (см. таблица 3) получена по трем ступеням отмеченным стрелками.