Биомеханика поверхности немышечных клеток тема автореферата и диссертации по механике, 01.02.08 ВАК РФ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЛАТВИЙСКОЙ ССР У 3

ЛАШЙОТЙ ШЧЮ-ИСОЩОВАТгЛЬСШ ИНСТИТУТ у

травматологии и ортсщда

На правах рукописи

ТЕРЕЩЕНКО Виктор Алексеевич

УДС 531/534:57+576.72 ЕИСМЕХАНИКА ПОВЕРХНОСТИ НЕНШЕЧНЫХ КЛЕТОК

01.02.08 - биомеханика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

РИГА - 1990

Работа выполнена и Севастопольском приборостроительном институте.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Регкрер С.А.

доктор физико-математических наук Смолянинов В. В.

доктор технических наук, профессор Кнотс И. В.

Ведущая организация - Институт прикладной физики АН СССР

Защита состоится "....."..............1990 г. в "...."часов на

заседании специализированного совета Д 081.02.01 при Латвийском НИИ травматологии и ортопедии /226005, г.Рига, ул. Дунтес, 12/22/.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Латвийского J НИИ травматологии и ортопедии /г.Рига, ул. Дунтес, 12/22/.

Автореферат разослан "....."................. 1990 г.

Учёный секретарь '

специализированного совета, • .

кандидат медицинских науй , И. К. ВИЖА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важность исследований по биомеханике клеточной поверхности определяется не только фундаментальность» _ проблемы биологической подвижности, но и необходимостью решения рада проблем цитофизиологии, раннего морфогенеза, общей биологии, медицины, клеточной и генной инженерии, где информация о механических свойствах клеточной поверхности насущно необходима. В настоящее время клеточной поверхности уделяется,повышенное внимание, поскольку изменения формы клетки, их взаимного располокения, awe- -боидное движение, дифференцировка есть результат разнообразных изменений, как з цитоплазме и ядре клетки, так. и в структуре клеточной поверхности. Интерес к биомеханике клеточной поверхности продиктован необходимостью решения вопросов селекции, сохранения генофонда /криоконсервация/, искусственного воспроизводства- видов /микрохирургия клетки/,' а также вопросов медицины, связанных с регуляцией клеточкой подвижности /онкология, иммунология/. Однако-; проведение исследований поверхности живых клеток существенно тормозится из-за отсутствия простого и надежного приборного оснащения экспериментов, а такие теоретических предпосылок.этих исследований. Изменения свойств клеточной поверхности, помимо очевидной сложности её структуры, ввдвигают особые требования к методике постановки и проведения экспериментов. Согласно современным представлениям в ответ на внешние стимулы в цитоплазме происходит обратимое желатинирование /золь-гель переход/, которое сопровождает многие процессы жизнедеятельности клетки. В цитоплазме обнаружены сократительные актиновые филаменты, значительная часть которых расположена под'цитоплазматической мембраной в кортикальном слое, а также в фибрилярных структурах,образующих динамичный трехмерный "каркас" в борозде деления яйцеклеток, в местах контакта клеток с субстратом и соседними клетками.

Очевидная сложность материала клеточной поверхности и изменения его свойств в клеточном цикле, а также несовершенство приборного оснащения и методического обеспечения экспериментов накладывают определенные ограничения на исследования комплекса ыембрана-кортекс. Неудобства связаны и с сезонностью /нерестовый период/ этих исследований в полевых условиях.

Работы выполнялись в соответствии с Координационным планом НИР АН СССР по проблеме I.I0.5 "Биомеханика".

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работа было исследование механических свойств клеточной поверхности и юс изменений в локомоторном и клеточном циклах, а также разработка теоретических положений для исследований механики.клетояной поверхности. 'Задачи исследований; I. создание приборов и методических приёмов регистрации изотропного растяжения клеточной поверхности; 2. изучение механических аспектов амёбоидного движения с построением теоретических основ клеточной подвишости; 3. поиск приемлемых, легко воспроизводимых в лабораторные условиях кл«тччных моделей, которым свойственны все признаки живого объекта и изучение механических свойств их поверхности; 4. выяснение общих закономерностей в механических свойствах клеточной поверхности и их изменений по ходу клеточного цикла.

Научная новизна. На основании полученных в диссертации данных сформулирован ряд новых положений, которые выносятся на защиту! I. экспериментально и теоретически показана функциональная значимость оболочки оплодотворения в период эмбриогенеза и гиалинового слоя бластомеров при делении дроблении; 2.0 использованием--нового объекта - сферических-клеточных моделей /СКМ/, получаемых обработкой кофеином фрагментов плазмодия миксомицета,изучены ранее неизвестные закономерности в изменении состояния клеточной поверхности и установлена их идентичность состоянии поверхности бластомеров ранних зародышей морских ежей в отсутствии гиалинового слоя; 3. физиологически важные изменения комплекса мембрана-кор-, текс отображают изменения в состоянии гранулоплазмы, её положения относительно клеточной поверхности и все внутриклеточные-движения связаны с событиями происходящими на границе раздела клеточная поверхность-гиалоплазма-граяулошгазма; 4. радрайогаш теоретически е основы биомеханики клеточной поверхности и построена математическая модель цитокенеза с анализом изменений структуры кортикального слоя микрофилаыентов'поверхности бластомеров по ходу клеточного цикла; 5. созданы новые не имеющие аналогов приборы и методические приёмы изотропного растяжения клеточной поверхности.

*

Практическое значение работы. В результате выполненной работы решены теоретические и методологические проблемы постановки и проведения'экспершлетов-на отдельных живых клетках. Разработанные в диссертационной работе научные положения и результаты иссле-

дований используются в Институте биологии Хкных морей АН УССР при выборе рационального режима инкубации икры морских рыб. Созданные -приборы и методики используются э Институте биофизики АН СССР , г. Пущино. Полученные результаты к.научные положения составляют основу нового научного направления биомеханики ялетки.

' Апробация работы. Основные результаты и материала диссертации докладывались на У Всесоюзном семинаре по мягким оболочкам /Владивосток, 1976 г./, на Международной конференции КАСС /Алма-Ата, 1977/, на ХХУШ и XXIX. Конгрессах Международной Астронавти-ческой Федерации /ЧССР, Прага, 1977; СФРЮ, Дубровник, 1978/, на Всесоюзных симпозиумах по математическому моделированию в биофизике /Львов, 1980, Кировск, 1981/, на Всесоюзной конференции "Технические средства изучения и освоения океана" /Севастополь, 1981/, на У Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб /Севастополь, 1982/, на I Всесоюзном симпозиуме "Теоретические основы аквакультуры" /Москва, 1983/, на.III Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики /Рига, 1983/, на Всесоюзной конференции "Разработка и внедрение конструкций из эластичных материалов в народном хозяйстве" /Севастополь, 1984/, на 1У и У Всесоюзных совещаниях "Немышечные формы подвижности" /Чернигов, 1984 и 1988 г./, на I Всесоюзном симпозиуме "Нелинейная теория тонкостенных конструкций и биомеханика" /Кутаиси, 1985/, У1 Всесоюзный съезд по теоретической и прикладной механике /Ташкент, 1986/, на Всесоюзном совещании эмбриологов /Ленинград, 1986/, на Международной конференции "Достижения биомеханики в медицине" /Рига, 1986/, на 8-ой Европейской Фиэарум конференции /ФРГ, Регенсбург, 1988 /, !

Структура- диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, изложения основных результатов, заключения с выводами и приложением. Текст изложен на 325 стр., содержит 6 таблиц, 50 графиков, диаграмм и 48 иллюстраций с материалами млкрокиносьемки. Список цитируемой литературы включает 456 работ.'

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 31 печатных работах, среди которых 5 изобретений.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОЭД

Во введении- показана актуальность проблемы и функциональная значимость количественных данных о.; механических свойствах1 клеточной поверхности при решении вопросов немышечной подвижности, цито-физиолохэди, общей биологии и медицины, а также сформулированы цель и задачи исследования.

В первой главе приведен обзор литературы и постановка, задачи. Согласно литературным данным, в настоящее время оформилось самостоятельное направление в исследовании механических-свойств клеточной поверхности, начало которого было положено в тридцатых годах /K.Ccie, 1932/ экспериментами на яйцеклетках морских ежей. Однако, небольшой экспериментальный материал об изменении механических свойств поверхности бластомеров /J.Mitchisoa, K.Swenû,i953,Hiremoto/ не позволял ответить на многие вопросы. Известно., что процесс клеточного деления /карио- к цитокинез/ отобраяают совокупность, событий происходящих в цитоплазме и клеточной поверхности,"Кроме того,цитокинез - процесс,связанный непосредственно с реорганизацией структуры материала клеточной поверхности.- Несовершенство приборного оснащения и методические трудности получения, зачастую . разрозненных, экспериментальных данных тормозили исследования'биомеханики клеточной поверхности. В нашей стране -/BiC.Маркин, ИКозлов, 1981-1988,ВЛасечник, 1978/ на искусственных бислойных липидных мембранах' получены теоретические .обоснования экспериментов- на мембранах эритроцитов и исследованы их механохимические и электромеханические свойства. Что касается исследования поверхности немышзч-ных клеток, то они стимулировались работами по анализу фаз локомоторного цикла в амебой,цном движении распластавшихся.фиброблас^-тоз: и других клзток/В.Смолкинов и'др., 1931/.' Результаты экспериментов' однозначно свидетельствуют, что клеточная поверхность играет важную роль в регуляции клеточного деления, ках в- цитокинезе, так и в подготовке кариокинеза /В.П.Божвова," !1987/.

Изменения формы яйцеклетки наблюдавшиеся многими авторами /обзор П.Н.Резниченко, 1982/ связывают с активностью протоплазма-тического слоя покрывающего желток. Функциональная значимость движений ранних зародышей определяется необходимостью транспорта кислорода и др.- элементов сквозь толщу жидкости, перивителдинового пространства, равполоиенной под оболочкой оплодотворения, прочность которой меняется в эмбриогеиззе/А.Зотин(> 1953,.'Ю.Зайцев, 1959/

Детальных исследований механических свойств этой оболочки не проводили, полагая, что она выполняет в основном заветную функции. Однако?результаты анализа микроснимков /В.В.Рубцов, . 1979/ топо-' графин поверхности, её разломов, показали не однозначность этих . суждений.

Из совокупности задач биомеханики клеточной поверхности следует выделить два класса: - задачи идентификации; - задачи прогноза физиологического состояния клетки. К первому классу относятся:

- определение роли цитоплазмы и комплекса мембрана-кортекс в ка-? риокинезе и цитокинезе; - анализ пространственной реорганизации структуры цитоскелета; - создание модели материала клеточной поверхности. Ко второму классу прдаадледат задачи связанные с дозированием внешних стимулов, микрохирургией клетки, математическим моделированием цитокинеза, раннего морфогенеза и др. задачи фармакологии, общей биологии и медицины. • ■

Результаты электронной микроскопии, морфологические и биохимические данные показывают, что структура материала клеточной поверхности и цитоскелет сложно организованы. Кроме того,трудности методического плана существенно ограничивали постановку и проведение экспериментов на живых клетках. Во-первых: -•немышечные клетки имеют небольше размеры /бластомеры ранних зародышей морских ежей имеют диаметр 20 -ИЗ мкм/, что выдвигает повышенные требование к созданию инструментария и методических приемов. Во-вторых:

- при обработке- результатов экспериментов возникает необходимость учитывать поведение клеточной поверхности при удлинениях, соизмеримых с характерными размерами клетки /геометрически и физически нелинейная постановка задачи/. В-третьих: - живая клетка' активно реагирует на.внешние стимулы и сама изменяет химический состав эк-спериметальной среды, что требует контроля за большим количеством параметров в эксперименте.

При анализе напряженно-деформированного состояния клеточной поверхности следует иметь ввиду, что форма клетки в кадцый момент времени определяется структурой комплекса мембрана-кортекс в совокупности с пространственной структурой цитоплазмы. Толщина материала клеточной поверхности А много меньше характерных; размеров-клетки и для сферической'формы отношение -к/^0,1 радиус

клетки/, поэтому можно использовать соотношения механики тонких оболочек. Поверхность немышечной клетки рассматривалась, как заполненная несжимаемой жидкостью мягкая замкнутая оболочка. Пере-

- б -

мещения клеточной поверхности имеют порадок радиуса клетки. Кроме того, её форла поддерживается внутриклеточным давлением р1{Л, которое превышает давление в окружающей среде р0, а материал поверхности имеет весьма малую изгибну» жёсткость и достаточно податлив, что позволяет считать обоснованным принятие расчётной схемы мягкой оболочки. Основная особенность мягких оболочек .- способность сопротивляться внешним механическим воздействиям только в предварительно натянутом состоянии. Оно обеспечивается давлением газа или жидкости, определённый объём которых ограничен поверхностью обслочки. Величина деформации является критерием, по которому определяют подход к расчёту оболочки. Различают три схемы, мягхдах оболочек:- из нерастяжимых материалов; - из малорастявдыых материалов /удлинения до 20^/;- из высокозластичных материалов /удлинения /»10054 и выше/. Для мягких оболочек характерно высокое сопротивление растяжению, малые сопротивления-сдвигу и столь малые сопротивления сжатию и.изгибу, что в определяющих соотношениях их не учитывают /С.А.Алексеев, 195?, В.Й.Усюкин,' 1972/, В общем случае формы мягкой оболочки и характера нагрузсения, задача определения её напряженно-деформированного состояния с учётом реальных свойств конструкционных материалов относится к. физически и геометрически нелинейной и сводится к решению системы-нелинейных диф-? ференциальных уравнений в частных производных. Однако, особенности оболочек из малорастягашых материалов позволяют успешно использовать приём линеаризации нелинейных уравнений относительно малого параметра, что упрощает общую схему расчёта /В.И,Усюкин, 1972/, •Решение этих уравнений также требует применения численных методов. В диссертации используются конечно-разностные схемы- в сочетании с- методом матричной прогонки. В биомеханика расчётную схему мягкой оболочки используют для анализа напряженно-деформированного состояния стенки желудочного тракта /Р.Н.Мифтахов, 1983/, клеточной поверхности /х. гипе , 1966/, элементов сердечно-сосудистой системы /В.А.Касьянов,- 1987/.

Что касается проблем клеточной биомеханики, то следует отметить серию работ Л.А.Мартынова, в которых решаются задачи морфогенеза на; примере клетки ацетобулярии. ■ Наибольшее число работ по" биомеханике клеточной поверхности откосятся к анализу различных форм эритроцитов. Обсуждаются возможности перехода от сфероцита в дискоцит и др. формы, клеток при различных исходно принятых гипотезах о механических свойствах мембраны эритроцитов /Р.Скейлак,-

И.Ивенс, 1982, Г.Вранков, 1977, В. С. Маркин, М.М.Козлов, 1978 -IS89/. Немногочисленны работа,в которых решаются задачи ранкого морфогенеза /Л.А.Мартынов, 1973, С.А.Регирер, 1983, Б.Н.Еелипцев, 1986/.

Во второй главе рассматриваются материалы и методики исследований механических свойств клеточной поверхности. Объектами исследований были: оболочка zona radiata яиц морских рыб /Чёрное море/; яйцеклеток морских ежей трёх видов Sfc.i.ntermedius, So. nirabilis, st. nudus /Японское море / и четыре типа

сферических клеточных моделей /СКМ/, получаемых обработкой кофеином фрагментов плазмодия миксомицета physorum polyc&phalum . Последние впервые использовались в подобных исследованиях механических свойств клеточной поверхности.

Выбор з качества объекта исследований оболочки zona mediata яиЦ рыб обусловлен возрастающим интересом ихтиологов к исследованиям по сохранению и искусственному воспроизводству ценных и исчезающих пород рыб. Получение и оплодотворение икры проводили в открытом море на месте отлова производителей и в термостате доставляли в лабораторию. Инкубирование осуществляли в специальной установке / Ю.Е.Битюкова и др., 1984 / с контролем и управлением параметрами морской ореды . Для растровой электронной микроскопии икру фиксировали в -ом растворе глутарового альдегида на морской воде. Визуальный контроль и цейтраферную шк-рокиносъёмку развития икры проводили на шкроскопе МБИ-13У.4Л. Обработку результатов вели на ЭШ в предположении, что объём икринки не меняется при сжатии и для её свободной от контакта о сжимающими плоскостями части оболочки оплодотворения выполняется условие постоянства средней кривизны const. Сжатие и раздавливание икры проводили на специально созданной установке под би-нокуляром.

Яйцеклетки морских ежей являются традиционными объектами исследований механических свойств комплекса мембрана-кортекс /K.Cola, 1932,J.Mitchisoii, И. Swana, 1953, У. Hiramoto, I960,M.YonedaI97(y. В диссертации исследовали свойства поверхности бластомеров ранних зародышей морских.ежей трёх видов от одной до 16-ти клеточной стадий. Икру и сперму получали, инициируя самцу и самке морскую воду с 0,5% KCL. Отмытую от KCL икру оплодотворяли и на стадии одного бластомера простым встряхиванием удаляли оболочку оплодотворения /В.П.Божкова,1986/.Последующие манипуляции с зародышами проводили

фильтрованной морской воде при Т=19,5°- 22°С. Использовали специальные щелевые камеры, клеточный эластиметр^ позволяющий измерять разность давлений с точностью 0,1 Па и микропипетки с кончиком цилиндрической и конической формы, /внутренний диаметр 19-22 мкм/. Вели микросъёмку кавдого втягивания части клеточной поверхности в ш;кропипотку и развития зародышей в норме до 8-ми клеточной стадии и зародышей обработанных низкими концентрациями ЗГТА /I ыМ/ при концентрации Ca*"*" 2,8x10"^ Ц до образования микромеров на 16-ти клеточной бтадии.

Сферические фрагменты плазмодия милсомицета physагиш poly-oephalua /сферические клеточные модели/ ранее использовали для исследований пространственной организации и динамики сократительной системы/«1. Kukulles, w.stochern, 1985/ регуляции движения протоплазмы /s.Hatano , 1970/ и электромеханических свойств, плазмоди-альной мембраны /н.Kuroda, н.Kuroda,1981/. Они сохраняют структурные и основные функциональные свойства живого объекта. Важными преимуществами этого модельного объекта для клеточной эластомет-рии являются: - сферическая форма; - возможность варьировать размерами СКМ /диаметр 20*100 мкм/ и получение моделей клетки с различным состоянием протоплазмы.Сферические фрагменты классифицировали гш внешнему виду:-гиалиновые СКМ - прозрачные, без видимых включений внутриклеточных органелл; - гранулярных СЮА - равномерно заполненные клеточными органеллами; - смешанного типа СКМ - с протоплазмой, разделённой на гиалиновую и гранулярную части. В экспериментах использовали клеточный эластиметр с подвидением микроманипуляторами нескольких микропипеток к одной клетке. Микрокиносъёмку проводили цейтрафером /3-10 сек/кадр/ с кинокамерой "Кон-вас" на микроскопе "Opton". Применяли микропипетки с внутренним диаметром 18-20 мкм и различной конфигурацией кончика.

Созданное приборное оснащение включает, также экспериментальную установку для микроманипуляций под микроскопом, которая содержит шесть механических шкроманипулятороз-, модифицированный столик микроскопа с шестью механическими позиционерами головок микроманипуляторов! и камеры для микрохирургии клеток. Установка позволяет одновременно подводить к .отдельной клетке шесть микроинстру-" ментов и осуществлять дистанционно микроманипуляции в ходе эксперимента. Разработанный клеточный эластиметр повышает точность измерений, удобен в Эксплуатации и позволяет автоматизировать процедуру обработки результатов.

Эксперименты по определению механических свойств поверхности немышечных клеток сводятся к изотропному растяжению материала клеточной поверхноти. В работе использованы два метода: - сжатие сферической клетки меяду двумя плоскими пластинами и втягивание час. ти сферической клетки в микропиг.ет1су отрицательны;.! перепадом дав-, лений. Для измерения локальных неоднородкостей механических свойств клеточной поверхности использовали одну и две микропипетки с одинаковым синхронным изменением давления в них. По ходу эксперимента проводили микрокиносьемку процесса втягивания клетки в микропипетку и последующего её 'выталкивания из неё. Обработку результатов проводили по кадра!,! кинопленки. Режим измерений выбирали в зависимости от состояния протоплазш клетки и формы кончика микропипетки.

3 третьей глава рассматриваются напряжения и деформации материала клеточной поверхности. Согласно современным- представлениям слояная пространственная организация внутриклеточного содержимого считается основой координированного функционирования клетки.. Среди большого количества идентифицированных частей структуры цито-скелета основными считают четыре: - ткрофиламенты; - шнротрубоч-ки; - промежуточные филаменты; - микротрабекулярная сеть. В дис.-сертации принята гипотеза Тейлора /1976/, согласно которой в кор-тексе непрерывно идут процессы полимеризации и деполимеризации актива со сборкой пучков микрофиламентов и его,- распадом :на" мономеры. -Взаимодействуя в виде филаментов с другим- белком - миозином, они образуют актомиозиновые комплексы, которые сокращаются в под-мембранном кортексе клеточной поверхности. В соответствии с этим введены две гипотезы: - изменение давления в цитоплазме клетки при . неизменном её объеме. \Д/ кл= сск^Г является следствием механической активности материала клеточной поверхности; - микрофиламенты кортикального слоя находятся в равнонапряженном состоянии, развевая при сокращении одинаковае силы & =■ ео«л£ . Это означает, что изменение форш немышечной клетки,, её перемещение, является следствием изменения плотности микрофиламентов в кортексе,

т* о*

при ^ сопЬ И ,

Рассматривая напряженно-деформированное состояние, различали начальное и актуальные состояния клеточной поверхности. Начальному состоянию соответствовала форма клеточной поверхности в виде поверхности вращения. Полагали, что при деполимеризации актиновнх

филажнтов и шкротрубсчек материала клеточной поверхности становится изотропным, а клетка стремится принять механически равно-вескую форму. Этому соответствуют равные натяжения материала по всей клеточной поверхности. Показало, что при равнонадр;шенном состоянии изотропного однородного материала, клеточ- '

ная поверхность имеет минимальную шгащадь для данного объёма цитоплазмы. Это следует из принципа взаимности вариационного исчисления. Характерной особенностью таких форм клеточной поверхности является постоянство средней кривизны /первый инвариант тензора кривизны поверхности/.

Определяя напряженное состояние клеточной поверхности следует иметь ввиду, что изменение формы клетют может быть обусловлен-но двумя процессами; - набуханием клетки /иэмеленио объёма цитоплазмы/ и механической активацией клеточной поверхности /измена-ние плотности микрофиламентов в кортексе Уп{г$=1/&г /. Изменение внутриклеточного давления определяется именно, этими двумя процессами. Для различных форм немышечных клеток можно проводить анализ геометрических параметров с целью установления их соответствия ■ условиям равнонапрязкенности материала клеточной поверхности.Соответственно введена третья гипотеза: - отклонение формы немышечной клетки от поверхности равных главных натянений = с постоянной толщиной к = сопз1г материала и средней кривизной означает перераспределение плотности 14 (а/!:) , и ориентации

микрофиламентов в кортикальном слое материала клеточной поверхности. . • ;

Механическая активация кортикального слоя микрофиламентоз в совокупности с изменением объёма цитоплазмы определяет перемещение меточной поверхности, что проявляется в ответах на различные стимулы /хемотаксис, фототаксис, гальванотаксие, барота1ссис и дрУ

В четвертой глазе приведены результаты экспериментов по исследованию структуры и упругих свойств материала оболочки вопа гас11аЬа яйцеклеток рыб. Структура материала оболочки гола гасис-Ъа яиц сазана / В.В. Рубцов, 1977/ сравнивается со структурой многослойной оболочки вопа га41йа икры черноморской камба-лы-калкан, которая является перспективным объектом марикультуры. При толщине Т1. = 3 мкм оболочка состоит из 6 слоёв с многочисленными порами средний-диаметр которых л- 0,4 мкм / плотность пор

2,75хЮ5шт/м1!2/. Икра камбалы-калкан пелагическая с небольшим объёмом перивителлинового пространства / ¿икш= 1260 мкм/.

Наличие общих структурных особенностей и морфологии материала оболочки у пресноводных и морских видов позволяет говорить об одинаковом механизме их функционирования на ранних этапах развития /результаты растровой электронной микроскопии/.

Механические свойства определяли по результатам сжатия яиц между параллельными пластинами. Форму меридиана свободной от контакта части клеточной поверхности находили из условия постоянства

средней кривизны, а из условия неизменности объема 'И/Цпри скатки %_

о

численно находили радиус поверхности в параллельном сечении на экваторе ?3 и по степени сжатия АЗ параметр т

Л = < - я- [ЕЧ1ЗД)-^-т*' • Р -

- эллиптические интегралы I и II рода; - радиус области контакта клетки с снимающими пластинами. Деформации материала оболочки на экваторе вычисляли, как . .

а глав ¡ив натяжения м - ,Л

В эксперименте измеряли силу Е и степень сжатия ДЕ ,, по которым находили дефорлацию и натяжения материала, оболочки. На рис. I приведены результаты численного расчета формы меридиана сжатой икринки / = ео«& /. Измерения проводили на всех этапах эмбрионального развития. Получанные в экспериментах зависимости силы . от степени сжатия можно представить в виде

с переменным показателем степени Вид графиков ^-^С^э) и

Др в ^ (42} на разных этапах эмбриогенеза позволяют судать об изменениях в структуре пористого материала оболочки. Избыточное давление Д ркл имеет порядок Ю3 Па, а модуль упругости вначале возрастает,от £ = 4,13x10^ Па до £" = 11,5x10® Па, а затем снижается до значений Е = 3,87x10® г 1,33x10 Па.

В таблице I приведены измеренные изменения механических пара-

Форш мерщиана сжатой клетки, полученные численно при условии постоянства объёма цитоплазмы 1АГц=сшг1Ь и средней кривизны во всех точнах клеточной поверхности свободной от контакта с сжимающими пластинами.

метров оболочки zona radiata икры камбалы-калкана в эбрисгенезе.

Таблица Р I.

о

^ЧЭтапы раПа- звития. рам. оболоч^ -f_- Дробление, мо-рула, ранняя бластула. Поздняя'блач стула, гаст-руляция. ' Поздняя;гаст-рула, начало нейруляции. Подвижный Г .J эмбрион,вык-лев.

В ( Р^-лг") 0,78хЮ~2 -I,2xI0~2 Н. 0,2хЮ-2 -0,28хЮ"2 Н. 0,7хЮ"2 -0,9хЮ~2 Н. 2,8хЮ"2

км«* ДРкл давление ЗхЮ3 Па 3,4хЮ3 Па I,lxf03 Па 2,2х103 Па 0,8хЮ3 Па 0,5хЮ3 Па

£ 12,4 н/м 34,6 н/м 40 н/ы . — —

£ модуль упругости. 4,13x10$ Па, 7,87x10® Па, 11,5x10® Па. 3,0x10® Па, 1,3x10® Па. — -

< начальное натяжение 0,2*0,3 н/м. I * 0,8 н/м. 0,6*0,4 н/м. 0,157 н/м

Нагрузка ^эазруш. 5.76XI0-4 Н, 7,5xI0~4 Н. . 6,24xI0"4 Н, 5,56х10-4 Н. 4,32xI0"4 Н. 1,92хЮ"4 К

Эксперименты на икре камбалы-калкана позволили установить, что обьем и состав жидкости перивителлинового пространства, а также состояние структуры пористого материала оболочки zona radiata /его защитная и транспортная функции/ определяют выживаемость и чувствительность икры к величине и длительности изменения параметров среды инкубации. От оплодотворения до выклева механические свойства и состояние многослойной пористой структуры материала обо" лочки претерпевают существенные изменения. На ранних этапах до завершения гаструляции состояние структуры материала указывает на возможную регуляцию обмена с внешней средой.

В пятой главе рассмотрена поверхность яйцеклеток морских ежей и преведены результаты экспериментов по изотропному её растяжению. Изменение механических свойств клеточной поверхности - одно из многих периодически изменяющихся биохимических, биофизических и физиологических параметров, сопровозвдающих процессы в клетке по ходу клеточного цикла/Я.Н.Ротт. Г987/. Преобразования форш клеточ-

ной поверхности в процессе делений дробления связывают с изменением механических свойств материала клеточной поверхности, с синтезов материала в борозде деления и с адгезией поверхности в контак-. тпых зонах/Г.А.Бузников и.др1975/. Обработкой,,нарушающей отдельные компоненты клеточной поверхности, выявлены ультраструктурные изменения,, влияющие на механические свойства бластомеров. Согласно наблюдениям^ растровом электронном микроскопе материал клеточной поверхности представляет собой елейный многослойный композиционный материал,состоящий из оболочки гиалинового слоя, изнутри к которой прикреплены микроворсинки, составляющие гиалиновый слой зародыша.', цитоплазматической мембраны и подаембранный кортикальный слой мик-рофиламентов. Известно, что инкубация зародышей морских ежей. Se. mirabilis, st. intermedius в искусственной морской воде без добавления и в присутствии I мМ ЭГТА /концентрация Са*н" 2,8x10"'' . M/ приводит к дезагрегации бластомеров. без подавления клеточного деления/В.Шэожхова, 1984/,при этом поверхности бластомеров лишаются оболочки гиалинового слоя, а шкроворсинки укорачиваются /результаты РЭУ/. Полезно было сравнить изменения механических свойств поверхности и преобразования формы- бластомеров. в интактном зародыше и у изолированных бластомеров.

Первые эксперименты по определению механических свойств клеточной поверхности интактных зародышей морского ека относятся к 50-м годам /J.Mitchison, M.Swann, J953/, впоследствии 'были проведены более обстоятельные исследования ка тех Ее объектах /F.Hirerfotq, 1974,w.'ïoasda, 1978/. При обработке результатов экспериментов '._;. исходно полагали, что клеточная поверхность состоит из однородного, изотропного, линейно-упругого материала.- В наших эксперимент, тах ' использовались микропипетки с внутренним диаметром в 4-6 раз меньше диаметра бластомера /диаметр шкроПипетки 16-20 з¿км/, что позволило -оценивать локальные неоднородности.механических свойств клеточной поверхности.

Изменение податливости''" 'поверхности интактных зародышей /гиалиновый слой + комплекс мембрана-кортекс/ прослеживали по втягиванию части поверздарс.ти бластомеров в шкропипетку перепадом. давления -30 и 45 Па в течении-первого,'второй? и начала третьего клеточных циклов. Для этого давления в микропипетке изотропное натяжение материала клеточной поверхности внутри микропипетки.составило 9,03x10"® Па>м для-двух и 9,27x10"^ Па-м для четырех бластомеров. На рис, 2 приведены результаты этих экспериментов. Коэффи-

а. Первое деление. = 89,7 им, с1= 19 мкм.

Рис. 2

Изменение длины 2 части клетки втянутой в микропипетку. Морской ёж ёс. и!гаЫ11з . Среда - морская вода. Интервал времени меВДУ •опытами Д^=2 * 10 .мин.

циент линейного растяжения ГС. клеточной поверхности для ранних зародышей морских ежей Se. mirabilis менялся в широком диапазоне в зависимости от фазы, клеточного цикла

1,38хЮ"5Па.м ^ К ^ 7,1бхЮ~5Па«м

Минимум податливости поверхности /максимум 'К / приходился на митоз, а максимум /минимум Vv. /- на цитотомию и интерфазу клеточного цикла. Длительное удержание части бластомера в микропипетке при постоянном давлении в ней, позволило установить пара-метры ползучести материала клеточной поверхности, которая зависела от фазы клеточного цикла. На стадии двух бластомеров средняя скорость установившейся ползучести составила~ 0,65 шш/с. Для делящихся бластомеров характерно вязко-упругое восстановление формы, после их выталкивания из микропипетки.

Изучение структурной основы изменений механических, свойств, поверхности ранних зародышей морских екей в'клеточном цикле позволили установить, что экстраклеточный матрикс поверхности яйца /гиалиновая оболочка/ вносит существенный вклад в жесткостные'па-раметры клеточной поверхности, образуя вместе с микроворсинками структурный комплекс- - гиалиновый слой, увеличивающий изгибкую, жесткость. По ходу клеточного цикла толщина гиалинового слоя меняется, изменяя изгибную жесткость клеточной поверхности, -что отражается на морфогенезе как зародыша в целом, так- и отдельных бластомеров. С другой стороны, периодические изменения жесткости, характерные для дробления, сохраняются и при удалении гиалинового слоя. В эксперименте прослеживали изменение механических свойств, изолированных бластомеров /гиалиноЕЫй слой отсутствует/. В при- -сутйтвии I мil ЭГТА /Са1-1" 2,8x10М/ поверхность бластомеров ли- ■ шалась гиалинового слоя. В структуре материала клеточной поверхности оставалась цитоплазматическая мембрана и подмембранный слой кортикальных микрофиламентов. В отсутствии оболочки гиалинового слоя бластомеры оказывались изолированными и их деление наблвдали до 16-и клеточной стадии'/образование микромеров/. Поверхность бластомеров оказалась значительно более податливой /рис. 3/ и разности давлений в микропипетке л . 10-15. Па'было достаточно, -чтобы проследить за изменением коэффициента жнейного растякения К. клеточной поверхности

' 0^,407х10"5Па.м 2,55х10"5Па-м, что на поредок ниле, чем у поверхности бластомеров интактных заро-

l-t

Рио. 3 ■

Изменение длины Z части клетки втянутой в шкропипетку по ходу клеточного цикла. Изолированные бластомеры. dn= 19 ккм, Л Рд= 7,5 Па. Морской ёк So. mirsbilia.

дышей. В этом случае за изменение податливости ответственны тольг ко процессы реорганизации подмембранного слоя микрофиламентов, полимеризация и деполимеризация которых выявляется ультраструктурными методами /Н.и-зи!., М.Уопес1а,' 1982/.

Дня линейной зависимости между натяжением и деформаци-

ей £ клеточной поверхности ^^ ч- С»,- £ коэффициент <Я< изменяется н интервале значений

0;2хЮ"%а-м 0< ^ 6,3?х10"4Па-м ■

При тестировании механических свойств; клеточной поверхности методом клеточной эластометрии реорганизация кортикального слоя поверхности изолированных бластомеров выявлялась также по изменению характера деформирования и" разрыва участка- поверхности внутр! микропипетки. При наибольшей податливости наблюдали разрушение: клеточной поверхности в форме отрыва капель внутрь микропипетки. Митоз с-:.'роаовдается снижением податливости и изменением формы мениска внутри микропипетки от сферической-до форш о изломами и локальными выпячиваниями. В установившемся состоянии средней подат-лизости накануне цитотомии форма меридиана мениска внутри микропипетки возвращалась к дуге окружности и при наименьшей податливости с увеличением Л рп происходило разрушешЕ.кшточной поверхности внутри микропипетки не в виде отрыва капель, а в виде взрывного разрушения поверхности и затекания цитоплазмы в. микропшетку..

На интактных зародышах и изолированных бластомерах по. .кадрам микросьемки прослежен процесс деланий-дроблений, который идет со сдвигом по фазе и несимметрично, отобразая особенности изменений структуры и механических свойств поверхности бластомеров, к которым относятся: - толщина гиалинового слоя; - плотность и ориентация микрофиламентов кортекса; - внутриклеточное давление /0,2 Па * 5,26 Па/. Все эти параметры изменяются по ходу'клеточного цикла, и выявляются по изменению характера деформирования и разрушения участка клеточной поверхности,втянутой в микропипетку.

Зависимость натяжение-деформация для материата клеточной поверхности в виде

= + «/*)•£]

хорошо ■ аппроксимирует экспериментальные данные для всех случаев состояния клеточной поверхности. Данные,полученные Хирамото /1972/ и Ёнеда /1978/ на интактных зародышах морских ежей,находятся в

установленной нами области значений механических параметров клеточной поверхности. '

В шестой главе' приведены результаты экспериментов, на сферических фрагментах плазмодия мтасомйцета. - модельном обьекте для исследований биомеханики поверхности немышечных клеток. Плазмодий рйувагит ро1уоерЬаХит-. многоядерная эукариотическая клетка, любой фрагмент которой способен восстанавливать целостность мембраны и двигательную активность. Амебоидное движение сопровождается разделением протоплазмы на гранулярную и гиалиновую части. В диссертации методом ¡щеточной эластометрии исследовали процесс разделения и роль .каддой из компонент протоплазмы в состоянии.клеточной поверхности. Использовали четыре типа.сферических клеточных моделей /СКМ/, что позволило исследовать механические свойства материала клеточной поверхности, контактирующей с гиалоплазмой или гра-нулопладмой, при' этом интерес к процессам разделения и смешивания частей протоплазмы- связан, как с их сходством с событиями, происходящими в локомоторном цикле амебоидных клеток, так и с волновыми явлениями,обнаруженными нами при исследовании этих феноменов. Идентифицированы состояния материала клеточной поверхности аналогичные тем, которые имеют место у изолированных бластомеров ранних зародышей морских ежей. Для всех типов СКЙ наблюдается состояние , материала; х-слеточной поверхности, при котором втягивание в мик-•ропипетку сопровождается сохранением .'формы мениска близкой к части сферы, что указывает на изотропность свойств клеточной поверхности /рис. 4/. У СКМ, протоплазма которых разделилась на гиалиновую и гранулярную'части, наблюдаются спонтанные изменения длины" .втянутого в микропипетку участка и образование несимметричных, сложной форкы* менисков,• что-' Отображает процесс -формирования кор-текса. По характеру разрушения клето .лой поверхности установлены ■ два предельных состояния её. материала. При Дрп= 11-2 Па на фазе расслабления кортекса разрушение клеточной поверхности происходит ■ в виде отрыза капель внутрь микропипетки. Этому состоянию соответствует наименьшая плотность шкрофиламентов кортекса и оно наблюдается только у СКМ содержащих цитоплазматические гранулы. Второе предельное состояние характерно только для гранулярных СКМ^раз рушение которых происходит прорывом поверхности и вытеканием цито-плазмы-внутрь мякропипетки, чему соответствует наибольшая плотность шкрофиламентов кортекса 40 Па/.

Для кадцого типа клеточных моделей определяли совокупность

1.Л. 'ли-. ......

а. Лрд» 2 Па

>'7^

-

• б,. Дрп= 20 Па

_ г. Ъ Па

40 Па

я. Д рп= 20 Па е. Л рп = 20 Па

Рио. 4

Различные состояния материала поверхности СКЫ: а. -разрушение поверхности типа капельного отрава; б. -золь-состояние кортекса; в. - устойчивый кортекс; г. - взрывное разрушение кортекса /только у гранулярных СНМ/} д. - неоднородность механических свойств в пределах втянутого участка; е. - отделение гиалоплаз-ш. с!п= 20 мнм.

людали. На гранулярных СКМ наблюдали, как прямой, так и обратный переходы, что было связано либо с изменением состояния СКМ во времени, либо с внешней стимуляцией. ,

Установлено, что после механического воздействия у гранулярной СКМ происходит локальное желатинирование гранулоплазмы. Форма клетки может не соответствовать сфере, а на клеточной поверхности появляются волны деформации. В экспериментах с двумя одинаковыми микропипетками при синхронном втягивании одинаковым давлением Л рп разных участков поверхности СКМ смешанного типа выявлены локальные неоднородности механических свойств, материала поверхности, которые коррелируют с положением и фазовым состоянием гранулоплазми. Различия в деформировании и разрушении материала клеточной поверхности также зависят от фазового состояния и положения гранулопла-змы относительно поверхности СКМ.

Механическая фиксация гранулярной СКМ на' микропипетке со 'специально оплавленным кончиком позволила получить хорошую модель амебоидной локомоции. Выяснилось, что прикрепленные модели имеют более регулярный двигательный цикл по сравнению со свободно лежащими. Перераспределение натяжений клеточной поверхности важны не .,,только для собственно перемещения, но и для регуляции локомоторного цикла. Улучшение условий наблюдения при фиксации обеспечило возможность более детального анализа изменений, структурного состояния в каждом из трех фаз, имитирующих локомоторный цикл. На рис.6 показаны типы двигательной активности у частично втянутой в микропипетку СКМ и циклические изменения состояния протоплазмы, имити-рующи§ псевдоподиальную активность пресноводных амеб.

Все внутриклеточные движения в активированных СКМ с разде-■ ленной протоплазмой связаны с событиями, происходящими на границе раздела мембрана-гиалин-гранулоплазма. Физиологически важные изменения состояния клеточной поверхности требуют контакта мембраны с гранулоплазмой. Изменения, возможные в поверхности чисто гиалиновых Ш1, ограничиваются снижением податливости /увеличение плотности микрофиламентов в кортексе/, тогда как гранулярные обладают способностью менять характер деформационного поведения материала клеточной поверхности. Смешивание гиалиновой и грануляр-" ной компонент протоплазмы приводит к увеличению податливости поверхности СКМ. Использование нового модельного обьекта и усовершенствованной методики клеточной эластометрии позволили получить новые данные о динамических процессах в материале клеточной поверхности и сформулировать важный для цитофизиологии вывод о наличии

Рас. 5

Зависимости б-^С^) для трех различных гиалиновых СИМ.

Три фазы двигательной активности гранулярной СКМ, частично втянутой в микропипетку: I - однородное, изотропное состояние кортекса перед началом двигательной активности; 2 -(первая фаза) волны деформации перед началом формирования гиалинового "колпака", период появления волн 1-3 сек; 3 -(вторая фаза) изменение положения гиалинового "колпака" (слева-направо) в течение I мин; 4 - (третья фаза) сиеш-' вание гранулярное и гиалиновой частей протоплазмы. Дрп=«120 Па.

экспериментов из условий предварительных/ оценок' 'механических свойств материала клеточной поверхности.' Использовали два режима измерений для определения зависимости \ (¿'fV) . В первом случае, после установления механического равновесие СКМ выталкивали из микропипетки, а затем повторно втягивали её большей разностью давлений Л р^. Упругое восстановление и малая вязкость клеточной поверхности позволили применить режим измерений, при котором очередная ступень изменения разности давлений Дрп создавалась сразу после установления механического равновесия, без выталкивания СКМ из микропипетки. Это позволяло проводить до 50 измерений на одной клетке. В третьем режиме часть клетки втягивали в минропшетку и при постоянном давлении А рп= ícivit в ней измеряли изменение длиш втянутой части клетки во времени.

Анализ состояния материала, клеточной поверхности проводили по картинам деформирования части различных СКМ, втянутых б ыикро-пипетку. Наиболее интересным является поведение материала в интервале малых и средних деформаций, соответствующих растяжению поверхности по ходу движения клетки. По результатам экспериментов весь спектр состояний комплекса мембрана-кортекс можно представить определяющим -уравнением вида-, /рис. 5./

Как у гиалиновых, так и у гранулярных СКМ зависимость жет быть, как линейной, так и нелинейной. Начальные натяжения -íC и натяжения вызывающие деформацию поверхности СКМ имеют порядок Ю-4 Ца*ы. Следует•выделить два участка зависимости £ = ^ С^^ , которые характеризуют поведение материала клеточной поверхности при различные уровнях натяжений <Я< Для первого участка характерна высокая податливость. Здесь жесткость клеточной, поверхности меняется в интервале 1,57xI0-6na.u é (Ei)t é 6,5х1СГ%1а-м . Для второго участка, характерна низкая податливость материала клеточной поверхности*чему соответствует повышенная жесткооть в интервале значений 1,2х1(Гп1а»м ^ <Е<0г4 5,4хЮ"3Па»м . Диапазон изменения внутриклеточного давления.составил соответственно для всех видов СКМ 0,49 Па^ар^ 4,6 Па.

lía гиалиновых СКМ при внешней стимуляции можно наблюдать переход от линейно-упругого к нелинейно-упругому поведению материала^ сопровождаемое уменьшением объема и увеличением натязешя клеточной поверхности. Обратный переход для этих СКМ никогда не наб-

управления ими со стороны гранулярной части протоплазмы.

В седьмой главе обсувдшотся механические аспекты изменения формы поверхности немышечных клеток.Преобразование формы клетки обусловлено двумя процессами: - изменением объема цитоплазмы и изменением фазового состояния кортекса и цитоплазмы клетки. Изменение объема цитоплазмы /обмен с внешней средой/ связано с составом среды, в которой находится клетка, законом дефэр.шровакия и проницаемостью Материале клеточной поверхности. Изменение, фазового состояния кортикального слоя также изменяет давление в цитоплазме клетки. Переход актина из мономерного состояния в полимеризованное сопровождается сокращением кортекса, а при деполимеризации его на мономеры происходит расслабление материала клеточной поверхности. Результатом перехода кортекса из одного фазового состояния в другое являются периодические изменения давления в цитоплазме Л р^. На фоне основного, механически равновесного состояния поверхности клетки, происходят периодические изменения её формы. Для анализа отклонений поверхности нлетки от формы основного состояния используются подходы линеаризованной теории мягких оболочек/В.И^/сазкин,1972/, которая базируется на методе расчленения напряженного состояния на основное и дополнительное. Физиологически обусловленные деформации материала клеточной поверхности в клеточном цикле не превышают 10^ от деформаций основного состояния клетки. Известно, что форма и функция клетки взаимосвязаныДЛСаплуччинелли, 1982^..Анализ напряженного состояния клеточной поверхности при изменении её формы позволяет получать количественную инфоршщшо о процессах формообразования и структурных перестроениях в материале клеточной поверхности в норме и при клеточной патологии. Необходимо ввделить две противоположности в акте изменения формы немышечной клетки. С одной стороны, клетка при данной совокупности механических параметров стремится принять равновесную форму, отвечающую минимуму потенциальной энергии в материале клеточкой поверхности. С другой стороны, механические свойства материала клеточной погерхности непрерывно меняются, что влечет за собой непрерывность изменения формы клетки. Рассматриваются два состояния меточной поверхности, первое из которых названо основным, а второе актуальным, каздоыу из которых соответствует своя форма клетки. В актуальном состоянии натяжения материала деформированной клеточной поверхности представлено в виде двух слагаемых:

первые из которых соответствуют основному напряженному состоянию, а , , Н.,^.. соответствующие поправки к ним, как результат деформации клеточной поверхности. При построении уравнений равновесия используется принцип возможных перемещений, а такге векторио-матричная символика, которая позволила компактно записать систему нелинейных дифференциальных уравнений в. частных производных и значительно облегчить процедуру программирования. Эта система уравнений имеет вид:

4 л

Уравнения линейной теории тонких оболочек и линеаризованной теории мягких оболочек соответственно могут быть получены из приведенной системы при сохранении слагаемых заданного пордцка малости. Система описывает деформированное состояние клеточной поверхности относительно геометрии основного состояния и'" ей. соответствуют условия на граничном контуре области интегрирования. Для замкнутой поверхности вращения это условия симметрии,, а в случае контакта клетки с подложкой или соседними клетками следует воспользоваться гранич-'ными условиями в дифференциальной форме. Это могут быть силовые, кинематические или вмешанные граничные условия. '

При решении системы нелинейных уравнений организуется итерационный процесс. На каздом шаге итерации-решается линеаризованная система уравнений относительно геометрии основного состояния. Корректируются только натяжениямклеточной поверхности и физические соотношения для нелинейной зависимости натяжений от деформаций. Для одной итерации полная система определяющих дифференциальных уравнений механики клеточной поверх..ости в матричной форме имеет вид:

- уравнения-равновесия

_ *щ -М * -та -

- геометрические соотношения

- физические соотношения

tnj-M^+CeAitW

К ним добавляются граничные условия в дифференциальной форме вдоль координатных линий = ОоиЛ (i -I, 2)

№ + [ег])- { - .или w - ич

Квадратные скобки введены для обозначения прямоугольных матриц, а фигурные .матрицы-столбца. Их размерность (3x3) и (3x1). Здесь приняты обозначения: А.,. Аг - параметры Ламе; К - порядковый номер итерации; {Я'}- натяжения клеточной поверхности основного состояния;

неизвестные поправки натяжений клеточной поверхности; {-pj -внешняя нагрузка; {UJ - перемещения точки.клеточной поверхности; {{•{} - линейные составляющие деформаций;;- матрицы,элементами которых являются линейные составляющие деформаций; С«*] - единичная матрица; [^¡1 - слабозаполненные 0 и 1-ыи квадратные матрицы; 0?>*] - матрицы дифференциальных операторов; С0^- матрицы констант материала клеточной поверхности.

Приведенная запись физических соотношений используется и при нелинейной зависимости натяжений от деформаций для каждой итерации, при этом константы материала находятся линеаризацией экспериментальных данных относительно натяжений основного состояния в каждой точке клеточной поверхности, которое может быть неоднородным.

Построенная система нелинейных уравнений в частных производных записана относительно известной геометрии основного состояния клеточной поверхности. В итерационном алгоритме решения задач при известной кинетике внутриклеточных процессов за основное принимается предыдущее актуальное состояние клетки и процедура счета проводится уже относительно этого известного состояния. Особенность линеаризованной, на каждом шаге итераций, системы уравнений состоит в том,.что в ней сохраняются слагаемые, содержащие произведения натяжений основного состояния на деформации клеточной поверхности . которые отражают влияние изменения формы клеточной поверхности на её напряженное состояние. Порядок этих слагаемых тот,

же, что и линейных слагаемых, входящих в эти уравнения и содержащие в качестве множителей неизвестные поправки натяжений основного состояния {11} .В совокупности, эти особенности позволяют использовать эти уравнения при решении широкого круга задач теории тонких оболочек произвольной геометрии в нелинейной постановке.

В диссертации полученную'систему диференциальных уравнений механики клеточной поверхности произвольной формы на каждом шаге итерации решали в перемещениях. Для этого разработан и реализован алгоритм матричных преобразований системы определяющих уравнений на ЭВМ. Решение ищется численно в конечных разностях с использованием метода матричной прогонки. Создан пакет прикладных программ 'для решения задач биомеханики поверхности немышечных клеток.. Особенность программ заключается в том, что решение задач проводится в геометрически и физически нелинейной постановке с учетом неоднородности основного напряженного состояния, изменений механических Свойств материала клеточной поверхности, изменения формы клетки и внутриклеточного давления.

■Представляют интерес процессы, связанные с изменением форды клетки при делении-дроблении и преобразованиями в структуре клеу пточной поверхности при подготовке и завершении деления. В диссертации проведен анализ изменений в структуре материала клеточной поверхности в ходе цитотомии. По кадрам микрокиносьемки процесса деления яйцеклетки морского ежа) з соответствии с принятыш гипотезами, из решения обратной задачи .получена количественная информация об изменениях плотности и ориентации микрофиламентов кортикального слоя клеточной поверхности при образовании борозды деления. С использованием упрощенной системы нелинейных уравнений биомеханики клеточной поверхности показана численная реализация итерационного алгоритма последовательного изменения формы клетки и ■структуры комплекса мембрана-кортекс по ходу клеточного деления в ответ на процессы происходящие в протоплазме. Для делящихся клеток характерно увеличение плотности микрофиламентов вблизи экватора с.областью равномерно высокой плотности с последующим снижением и перераспределением, микрофиламентов; в области борозды деления и резким снижением плотности на экваторе клетки при завершении деления и образования дочерних клеток. Материал клеточной поверхности рассматривается, как композиционный материал, образованный сочетанием армирующих элементов /микрофиламенты кортикалоного слоя/ и изотропного связующего. •

В заключении сформулированы положения основных разделов диссертационной работы и в совокупности перечислены полученные ре-, зультаты теоретических и экспериментальных исследований с. комплектом созданного приборного обеспечения.

основные вывода

1. Построен вариант упрощенной системы нелинейных дифференциальных уравнений в частных производных /в векторно-матргеной форме/ биомеханики клеточной поверхности, позволяющей проводить анализ реорганизации структуры кортикального слоя микрофиламентов. по ходу клеточного и локомоторного циклов. Сформулированы основные задачи биомеханики клеточной поверхности и на примере цитотомии показана их численная реализация на ЭВМ.

2. Разработаны алгоритмы матричных преобразований системы нелинейных уравнений на ЭВМ и программы их.реализующие для анализа преобразований формы клеточной поверхности с учетом неоднородности основного напряженного состояния, анизотропии, и локальной неоднородности изменяющихся свойств материала клеточной поверхности, изменения формы клетки и внутриклеточного давления. Принята модель материала, представляющая совокупность сети пассивных и активных' микрофиламентов кортекса, ячейки которой перекрыты цитоплазмати-ческой мембраной. Введено условие равнонапряженности микрофиламентов, что означает их встраивание в кортекс по схеме оптимального армирования, которое является энергетически выгодным, поскольку обеспечивает минимум потенциальной энергии в материале клеточной поверхности.

3. Установлено, что по ходу деления-дробления бластомера раннего зародыша морского ежа обьем цитоплазмы уменьшаемся на •*- 10%, а площадь клеточной поверхности увеличивается на - 25%, при этом плотность микрофиламентов вначале возрастает на экваторе, а затем резко уменьшается перед завершением деления.

4/ Выявлены ультраструктурные основы изменения податливости поверхности ранних зародышей морских ежей и ее разрушения по ходу клеточного цикла и установлена периодичность этих изменений в нормальной среде и в среде направленно нарушающей отдельные компоненты материала клеточной поверхности.

5. Экспериментально изучены механические свойства и структура оболочки оплодотворения икры морских рыб и их изменения в ом-

бриогенеза, что позволило установить различия в чувствительности и выживаемости зародышей морских видов на различных этапах эмбрионального развития при искусственном их воспроизводстве. Изменения давления в жидкости перивителлинового пространства совпадают по времени с изменениями в движении икры и эмбриона и в состоянии микроструктуры материала оболочки оплодотворения.

6. Предложены легко воспроизводимые в лабораторных условиях клеточные модели /сферические фрагменты плазмодия миксомицета/, которым свойственны основные признаки живого обьекта, проведена их классификация, исследованы механические свойства их поверхности, обнаружены и идентифицированы предельные и промежуточные состояния материала клеточной поверхности, аналогичные тем, которые установлены нами и на бластомерах ранних зародышей морских ежей.

?. Установлено, что физиологически важные изменения состояния клеточной поверхности зависят от положения и состояния гранулоплаз-мы; У клеточных моделей,заполненных гиалоплазмой^возможно только увеличение гсесткости клеточной поверхности, тогда как наличие гра-нулоплазмы обеспечивает изменение жесткости, как в сторону увеличения, так и снижения, вызывая' тем самым перемещение протоплазмы.'

8. Механической1 фиксацией клеточных моделей на микропипетке "с сильно оплавленным кончиком получена хорошая модель амебоидной локомоции, тлеющая более регулярный двигательный-цикл по сравнен.

- нию со свободно лежащими, что позволило детально проанализировать Изменения структурного" состояния'клеточной поверхности в кадцой из трех фаз локомоторного цикла.' Показано, что все внутриклеточные движения связаны с событиями- происходящими на границе раздела мембрййа-гиалоплазма-гранулошгазма, а обнаруженные волны деформации на поверхности представляют интерес для исследований автоволновых процессов.

9. Дтя исследований механических свойств клеточной поверхности разработана установка "клеточный эластиметр", отработана технология изготовления микропипеток с заданной формой кончика.1 Отработаны методические приемы изотропного растяжения клеточной поверхности при различных режимах измерений на клетках^характерные размеры которых от 8 до -100 мкм, с одновременным подведением к клет-.ке нескольких минропипеток.

10. Создана установка для микроманипуляций под микроскопом , выполненная в виде модифицированного столика микроскопа с препа-ратоводителем и шестью позиционерами^ на которых расположены головки шести микроманипулятаров. Позиционеры и головки микроманипуля-

торов выполнены механическими на упругих элементах с дистанционным управлением посредством гибких тросиков, что исключает вибрации ' и дрейф микроинструментов при работе. Конструктивные особенности установки позволяют: - повысить производительность труда за счет снижения утомляемости оператора, уменьшения количества микроманипуляций при работе несколькими микроинструментами на одной клетке; - снизить требования к профессиональны;.! навыкам экспериментатора; - расширить функциональные возможности и диапазон проводимых экспериментов на одной клетке.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Расчет подвижных пневматических соединений из тканевых оболочек И Расчеты на прочность. М. .-Машиностроение, Т. 16. 1975 г. - С.136г144(в соавт. с Усюкиным В. И.)

2. Расчет мягкой тороидальной оболочки при действии внутреннего давления и торцовых усилий нормальных к оси вращения // Расчет тонкостенных элементов конструкций. Труды МВТУ. М.: Вып. I,

Р 206, 1975 г. - С. 103-106 (в соавт. с Наумовым' В.А.)

3. Поперечное армирование цилиндрических оболочек из полимерных пленок // Применение пластмасс- в машно с троении. М. : Труды МВТУ, № 15, 1976 г. - С. 10-14.

4. Исследование'изгибной жесткости подвижных пневматических соединений из тканевых оболочек // Доклады. Пятый семинар ро .мягким оболочкам. ДОЙМУ, Владивосток, 1976 г. - С.46-53. .

5. Мягкие равноналряженные оболочки //. Доклады. Пятый семинар по мягким оболочкам. ДВВИМУ. Владивосток, 1976 г. - С.74-79. (в соавт. с Зиновьевым П.А.)

6. К расчету оболочек пневмоконструкций // Строительная механика и расчет сооружений. М.: Стройиздат. № 2, 1977 г. - C.2I-25 (в соавт. с Усюкиным В.И., Ворсовым Р.Г.)

7. Расчет пневматических строительных конструкций с использованием ЭЦВМ // Доклады, русск., англ. Международная конференция ИАСС. Алма-Ата, М.: Стройиздат. М.: Мир. 1977 г. - C.I46-I5I (в соавт. с Усюкиным В.И., Пановым C.B., Сдобниковым А.Н., Ворсовым Р. Г.")

8. Алгоритм численного 'решения задач статики мягких оболочек // Расчет тонкостенных элементов конструкций. Труды МВТУ. М.: Вып. 2, № 241, 1977 г. - С. 89-100.

9. Статический и динамический анализ тонкостенных элементов конструкций космических радиотелескопов // До клады. (рус с к., англ.), ХХУЩ Конгресс Международной Астронавтической Федерации МАЙ . Прага,. ЧССР. Препринт. 1977 г. - И; с. (в соавт. с Усюкиным В.И.)

10. Влияние способа нагружения на устойчивость резиновой оболочки // Механика полимеров. Ali ЛаССР, Зинатне. Рига.К? 5, 1978 г. -С.922-924 (в соавт. с.Стыцына В.К.)

11. Динамика конструкций больших космических радиотелескопов // Доклады, ¿русск., англ.) XXIX Конгресс Международной Астронавтической Федерации МАФ . Дубровник, Югославия. Препринт. 1978 г.

- 14 с. (в соавт. с Усюкиным В.И., Сдобниковым А.Н., Горбуновым Т.)

12. Разностные методы решения задач статики мягких оболочек // Расчет пространственных конструкций. М.: Стройиздат. Вып.ХУШ, 1979 г. - С.69-84 (в соавт. с Усюкиным В.И., Еорсовш Р.Г.))

13. Решение двумерных задач механики мягких оболочек на ЭВМ // Тезисы Всесоюзной конференции. Технические средства изучения и освоения океана. 0неанотехнина-81. Севастополь, СПИ, 1981 г.

- С,56 (в соавт. с Усюкиным В.И., Накесткиным С.А.)

14. Static-and-dynamic analysis of thin-walled structural member's of spase radio telescope // Acta Aatron&utica. Pergamon Press Ltd., 19в1. 7.8. - p.57-65 ( в соавт. с Усюкиным В.И. ).

15. Температурная адаптация чернрмерской каыбалы-калкана в период эмбрионального развития // 'Тезисы У Всесоюзной конференции

по экологической физиологии и биохимии рыб. ЙнЕШ АН УССР, Севастополь. Ч. III. 1982 г. - С. 14-15 (в соавт.1 с Еитюковой D.E.', Ткаченко Н.К., Чепуриовым A.B.)

16. Об управлении процессом инкубации икры // Тезисы I Всесоюзного симпозиума. Теоретические основы аквакультуры. М1У, Биофак. U., IS83 г. - С.84 .

17. Методы построения моделей отображающих свойства и функции мягких биологических тканей // Тезисы III Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики. Рига. Том I, 1983 Г.-С.П9-121.

18. Об исследовании механических свойств материала поверхности немышечных клеток // Нелинейная теория тонкостенных конструк ций и биомеханика» Труды I Всесоюзного симпозиума. Кутаиси. 1985 г. - С.435-438.

• 19. Клеточный эластиметр // Авт. свид. №1242517 СССР !Ш CI2 М 3/00. - 1986. Еюл. № 25.

20. Микроманипулятор для микрохирургии //Авт. свид.Р1238016 СССР МКИ G 02 В 21/32.-1986. Еюл. 22.

21. Микромшшпулятор // Заявка Р 3755043/25-08 СССР МКИ В 25 j 7/00.- Пол. решение от г*5.04.1985 ,г.

22. Камера для микрохирургических процедур // Заявка №3697307/ 28-14 СССР МКИ CI2 М 1/34. - Пол. решение от 27.12.1985 г.

23. Механический позиционер для ыикроманипуляторов // Заявка № 3824900/24-10 СССР МКИ G 02 В 21/32. - Пол. решение от 18.02. 1986 г.

24. Периодические изменения механических свойств- клеточной поверхности бластомеров в период делений дроблений // Закономерности индивидуального развития живых организмов.' Тезисы У11 Всесоюзного совещания эмбриологов. М.; Наука, 1985. Т. I. -С.71 (в соавторстве с Чайлахяном JI.M., Божковой В.П., Петряевской В.Б.)

25. Механические свойства поверхности сферических клеточных моделей // Медицинская биомеханика.- Тезисы докл. Международной конференции. Достижения биомеханики в медицине. Рига, 1986 г., -Т. 1,7 С.365-370 (в соавт. с Матвеевой Н.Б.)

26.Механическая активность протоплазматических тяжей плазмой дия миксомицета // Тезисы докл. У1 Всесоюзного съезда по теоретической и прикладной механике. Ташкент, 1986 г. - С.87 (в соавт, с Бейлиной С. И., Тепловым В". А.)

27. О напряженном состоянии повериности немышечных клеток // Статика и динамика гибких систем, М.: Наука. 1987 р. - С.121-139.

2Э.Процесс растяжения и возможный механизм функционирования оболочки zona radiata икринок сазана в период эмбрионального развития // Биомеханика мягких тканей. Казань. 1987 г. - C.I53-I6I (в соавт. с Рубцовым В.В.)

29.Активные механические процессы в клеточной поверхности при амебоидном движении // Коллективная динамика возбуждений с структурообразование в биологических тканях. Горький. 1988 г. -G. 63-70 (в соавт. с Матвеевой Н.Б., Бейлиной С.И.)

30. Периодические изменения механических свойств материала поверхности бластомеров ранних зародышей морских ежей // Коллективная динамика возбуждений и структурообразование в биологических тканях. Горький. 1988 г. - С;71-77 (в соавт. с Божковой В.П., Чайлахяном JI.M,)

31. The active mechanical processes in cell surface during araoeboid movement // 8th European Jhysarum Workshop. FRG, Regennburg. 1988 - F.J9. (в соавт. с Матвеевой Н.Б. .Бейлиной С.И.).