Блок-синтез олигосахаридов - антигенов системы крови ABH тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

Рыжов Иван Михайлович

Блок-синтез олигосахаридов - антигенов системы крови АВН

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2013

1 2 СЕН 2013

005532909

Работа выполнена в лаборатории углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

Корчагина Елена Юрьевна, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории углеводов ИБХ РАН

Официальные оппоненты:

Формановский Андрей Альфредович, доктор химических наук, заведующий лабораторией органического синтеза ИБХ РАН

Возный Яков Васильевич, доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории растительных полисахаридов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова»

Защита состоится 9 октября 2013 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Автореферат разослан О ¿октября 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В самом начале двадцатого столетия антигены групп крови системы ABO стали первыми аллоантигенами, идентифицированными у человека. Интенсивные структурные исследования 60-70-х годов прошлого века выявили их углеводную природу. Минимальными иммунодоминантными структурами эритроцитарных антигенов А и В являются трисахариды Atri и Blri соответственно (Рисунок 1), а на эритроцитах группы крови 0 присутствуют гликаны с терминальным дисахаридом Fuca-(1—>2)-Gal(3, которые получили название Н-антигенов. (З-Гликозидная связь галактозного остатка Н-дисахарида или А(В)-трисахарида со следующим в углеводной цепи моносахаридом определяет тип группоспецифических антигенов ABO (АВН). На сегодняшний день все АВН-антигены подразделены на шесть типов (Рисунок 1), на эритроцитах человека главным образом представлены гликаны типа 2.

X

GalNAcal-3^ (1—3)-GlcNAcP Тип 1

Fucal-2-' а (1—>4)-GlcNAcp Тип 2

A,ri (1—>3)-GalNAca Тип 3

Gala 1-3^ (1—>3)-GalNAcp Тип 4

Fucal-2^ P (1—>3)-Gaip Тип 5

Btri (1—>4)-Glc(3 Тип 6

Рисунок 1. Типы АВН-антигенов групп крови.

Помимо гемопоэтических клеток (эритроцитов и тромбоцитов), АВН-антигены

экспрессированы на эндотелии и эпителии пищеварительного тракта, сердца,

почек, легкого и дыхательных путей, на эпителиальных клетках

репродуктивного и мочевыводящего трактов, что позволяет называть их

гистоантигенами. Во многих биологических жидкостях (слюне, желудочном

соке и др.) присутствуют АВН-содержащие гликопротеины, а в женском

молоке - свободные АВН-олигосахариды. АВН-гликаны ответственны за

гемолитические реакции при переливании крови и острое отторжение при

трансплантации органов и костного мозга; изменение их экспрессии

сопровождает процессы роста, развития, дифференцировки и апоптоза клеток, а также трансформацию клеток при различных видах онко- и кардиоваскулярных заболеваний.

Олигосахариды, определяющие антигенную специфичность групп крови, не могут быть выделены из природных источников в количествах, достаточных для фундаментальных исследований в области гликобиологии и, тем более, для целей практической медицины. Поэтому актуальна задача разработки эффективных химических путей их синтеза.

Целью работы являлся синтез тетрасахаридов А и В типов 1, 2, 3 и 4 и пентасахаридов ALeb и BLeb в виде аминопропилгликозидов, а также получение их липидных производных и полиакриламидных зондов для изучения углевод-белкового взаимодействия.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые тетрасахариды групп крови А и В типов 1, 2, 3 и 4, а также пентасахариды ALeb и BLeb получены методом блок-синтеза с использованием трихлорацетимидатов трисахаридов А и В в качестве гликозилдоноров; предложен удобный способ получения этих гликозилдоноров. В работе впервые синтезирована серия липофильных производных тетрасахаридов А и В с различной длиной спейсера между углеводной и липидной частями молекулы. Встраивание таких неогликолипидов в клеточную мембрану позволяет моделировать гликоландшафт клетки и выявлять особенности взаимодействия углевод-связывающих белков с гликанами; показано, что модифицированные неогликолипидами эритроциты являются перспективными реагентами для контроля качества моноклональных антител, используемых для такой практически важной области здравоохранения, как определение группы крови системы АВН.

Публикации и апробация работы. По результатам работы

опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах. Отдельные части работы

были представлены на Международных симпозиумах 24th International

Carbohydrate Symposium (Норвегия, Осло, 2008), 15th European Carbohydrate

2

Symposium (Австрия, Вена, 2009), 25th International Carbohydrate Symposium (Япония, Токио, 2010), в докладе на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Россия, Москва, 2009). В полном объеме результаты работы докладывались на международном симпозиуме 17th European Carbohydrate Symposium (Тель-Авив, Израиль, 2013).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на

_страницах и состоит из введения, литературного обзора, посвященного

синтезу АВН-антигенов крови и использованию блок-синтеза для получения сложных олигосахаридов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего_ссылок.

Автор выражает глубокую признательность заведующему лабораторией углеводов ИБХ РАН доктору химических наук, профессору Николаю Владимировичу Бовину за внимание и помощь, оказанные при выполнении работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Стратегия синтеза. Целью данной работы являлся синтез тетрасахаридов А и В (типов 1, 2, 3 и 4) 1-8, а также пентасахаридов ALeb 9 и BLeb 10 (Рисунок 2). Все олигосахариды получали в виде 3-аминопропилгликозидов. Наличие аминопропильного спейсера облегчает дальнейшую функционализацию молекул: введение липофильной, флуоресцентной или биотиновой меток, конъюгацию с полимерными носителями и белками. Структурные особенности олигосахаридов 1-10, а именно наличие общих терминальных фрагментов - трисахаридов А или В (отмечены прямоугольником на Рисунке 2) - позволяет использовать в их синтезе блок-схему «3+1», где «3» - А (В) трисахаридный гликозилдонор, а «1» - соответствующий глюкозаминовый или галактозаминовый гликозилакцептор.

ЫНАс

3 А,е(га(тип2)

1Ш. п . ..Л 1.

ЫНАс О

НО. НО

АсНМ 0(СНг)3ИН2

5 АшгаС™113)

ОН ОН

ЫНАс

7 А,е1га(тип4)

он ОН .он

9^-ОН р МНАс

2 В,е(га (тип 1)

но. но

__■од.^Д—

О-Ъон хп

но. но:

он ОН уп ОН

о-17он о

но. но

Г4НАс

4 В[е1га (тип 2)

ОНОН

АсНМ СКСН2)3ЫН2 6 В1с.га (™п 3)

но, но

Шрнон

9'/,им п МНАс

но он

8 В,е(га (тип 4)

ЫНАс

10 ВЬеь

Рисунок 2. Целевые олигосахариды 1-10. 2. Синтез гликозилдоноров. В качестве гликозилдоноров были выбраны перацетилированные трихлорацетимидаты трисахаридов А 11 и В 12 (Схема 1). Обычно трихлорацетимидаты с высокими выходами получают из 1-ОН-производных олигосахаридов обработкой С13ССК в присутствии БВи. Ацетилированные трихлорацетимидаты стабильны и могут длительное время храниться при температуре ниже — 10°С. И, как показал анализ литературных данных, они успешно используются в синтезе сложных олигосахаридов.

-- И О ОАс АсбО-^ТЧф

/ -^о/оАс 17 °АС

|но

он

13,14 цмл'АсОн/ 15>16

ДМФАу/¡) С13ССН. ови СН.С1,

ОАс„._ .. '

ОС{ЫН)СС1э ОАс

I ОАс ОАс

11,13,15:К = МНАс 11'12 12,16: = ОАс, 14: = ОН

Схема 1. Синтез трихлорацетимидатов 11 и 12.

Исходными соединениями в синтезе гликозилдоноров служили аминопропилгликозиды трисахаридов А 13 и В 14 (Схема 1), получаемые в лаборатории углеводов ИБХ РАН в мультиграммовых количествах. На первом этапе синтеза трихлоацетимидатов 11 и 12 необходимо элиминировать агликон и получить трисахариды А и В в виде полных ацетатов 15 и 16 (Схема 1). Было проверено два метода деспейсерирования.

1. Кислотно-катализируемый ацетолиз (Ас20/Ас0Н/Н2804). При проведении кислотного ацетолиза может происходить не только разрыв связи между агликоном и олигосахаридом, но и разрыв гликозидных связей между моносахаридными остатками, причем наиболее лабильны гликозиды дезоксисахаров. В нашем случае наиболее подвержена ацетолизу (1—>2)-гликозидная связь между остатками фукозы (6-дезоксигалактозы) и галактозы. Оптимизировать условия ацетолиза так, чтобы полностью избежать дефукозилирования, не удалось. Реакционная смесь всегда содержала 10-20% дисахарида 17, а общий выход олигосахаридов не превышал 80%. Получаемая смесь олигосахаридов была хроматографически трудноразделимой как в виде полных ацетатов, так и в виде 1-ОН-производных. Все это делает описанный метод неприемлемым для препаративного получения ацетилированных трисахаридов.

2. Получение бензоксазольных производных и ацетолиз в присутствии АсОЪ!а. Этот метод включает дериватизацию аминопропилгликозидов трисахаридов 3,5-ди-тире/и-бутил-о-бензохиноном 18, обработку азометиновых производных щавелевой кислотой, ацетилирование и ацетолиз получающихся бензоксазолов в присутствии №ОАс (Схема 2). Механистическую схему образования бензоксазолов Б можно представить следующим образом: 1ЧН2-группа спейсера атакует один из карбонильных атомов в о-хиноне 18 (Схема 2). Далее в основании Шиффа В под действием кислоты происходит прототропный сдвиг, приводящий к ароматизации хиноидного кольца и образованию азометина С, который замыкается в бензоксазольное кольцо. При этом также возможно элиминирование ароматического амина и образование альдегида Е.

ОАс

19: И = N4Ас 20: И = ОАс

ОАс

15: = N4Ас 16: (Ч = ОАс

Схема 2. Дериватизация аминопропилгликозидов 3,5-ди-т/?ети-бутил-о-бензохиноном. Механизм реакции.

Использование такого подхода к деспейсерированию аминопропилгликозидов 13 и 14 было ранее описано Шиповой и Бовиным*. Однако выходы производных на стадии дериватизации аминогруппы были невысокими: бензоксазольное производное А-трисахарида 19 было получено с выходом 70%, а в случае В-трисахарида основным продуктом реакции был не бензоксазол 20, а альдегид с выходом всего 41%. Проведенная нами оптимизация условий получения бензоксазолов — использование полуторократного избытка бензохинона 18 и увеличение pH реакционной смеси с 2 до 4 при обработке щавелевой кислотой - позволила получить производные 19 и 20 с выходами 92% и 88% соответственно. В этих условиях бензоксазолы 19 и 20 были единственными продуктами реакции, что подтверждалось данными масс-спектрометрии и спектроскопии *Н ЯМР. Полученные соединения 19 и 20 далее подвергали ацетолизу (Ac20/Ac0H/Na0Ac, 100 °С, 10 суток) и выделяли полные ацетаты 15 (96%) и 16 (90%) методом флэш-хроматографии на силикагеле.

Селективное 1-О-дезацетилирование соединений 15 и 16 гидразинацетатом и обработка полученных полуацеталей CI3CCN в присутствии DBU (Схема 1) завершало синтез гликозилдоноров. Трихлорацетимидаты 11 и 12 были получены с выходами 86% и 82% соответственно (выходы приведены на две стадии).

3. Синтез целевых олигосахаридов. Ключевой стадией синтеза целевых олигосахаридов 1-10 является ß-гликозилирование трихлорацетимидатами 11 и 12 соответствующих глюкозаминовых или галактозаминовых гликозилакцепторов. В синтетической химии углеводов стереоспецифичность при получении 1,2-от/?ш/с-гликозидов, как правило, обеспечивается наличием соучаствующей ацильной группы при С-2 гликозилдонора. В нашем случае позицию при С-2 в гликозилдонорах 11 и 12 занимает несоучаствующий моносахаридный остаток — ацетилированная фукоза. Мы надеялись, что

* Е. V. Shipova, N. V. Bovin. Mendeleev Commun. - 2000 - стр. 63-64.

7

большой размер заместителя при С-2 и общая конформационная жесткость молекулы, обусловленная наличием двух моносахаридных остатков в соседних положениях (ацетилированной фукозы при С-2 и ацетилированной галактозы или N-ацетилгалактозамина при С-3), затруднит нуклеофильную атаку с а-стороны, что приведет к образованию преимущественно Р-гликозидов.

В качестве растворителя для реакций гликозилирования трихлорацетимидатами 11 и 12 был выбран CH3CN. Известно, что при протекании конденсации по мономолекулярному механизму CH3CN способен координироваться с оксокарбениевым ионом, образуя в основном кинетически более выгодные а-интермедиаты, что способствует получению Р-гликозидов. Такое соучастие CH3CN в реакциях гликозилирования в литературе называют нитрилиевым эффектом. В тех случаях, когда гликозилакцептор плохо растворялся в ацетонитриле, конденсацию вели в смеси CH3CN-CH2CI2, 1:1. Гликозилирование в хлористом метилене (проверено при получении тетрасахарида А типа 4) давало преимущественно а-гликозид. Все реакции гликозилирования проводили при двукратном избытке гликозилакцептора, который легко отделялся от образующихся тетрасахаридов методом гель-фильтрации; в качестве промотора использовали TMSOTf.

Структуру полученных соединений подтверждали данными спектроскопии 'Н и 13С ЯМР и масс-спектрометрии. Полное отнесение сигналов в спектрах 'Н и 13С ЯМР синтезированных производных проводили при помощи экспериментов 'н,'н 2D COSY и 'Н,13С 2D HSQC.

3.1. Синтез тетрасахаридов А (тип 1) и В (тип 1). Для синтеза А и В

тетрасахаридов типа 1 использовали гликозилакцептор 21.

Трифторацетамидопропилгликозид ацетилированного глюкозамина 22

получали по Схеме 3. Свободный N-ацетилглюкозамин 23 обрабатывали АсС1,

избыток АсС1 удаляли и реакционную смесь без очистки использовали для

гликозилирования 3-трифторацетамидопропанола. После флэш-хроматографии

на силикагеле и перекристаллизации выделяли ацетилированный гликозид 22 с

выходом 40-45% на исходный глюкозамин 23. Такая схема, разработанная в

8

нашей лаборатории, позволяет избежать дериватизации аминогруппы глюкозамина (получения ЫТгос, МРЬЛ и других производных, традиционно использующихся для получения Р-гликозидов 2-амино-2-дезоксиглюкозамина) и значительно упростить синтез 2-амино-2-дезокси-(3-глюкозидов. Для получения гликозилакцептора 21 производное 22 дезацетилировали и 4,6-0-бензилиденировали (Схема 3).

ноно.

С0Н AcCI HO(CHa)aNHC(Q)CF3 Ас0-Х^0

^¿^ОН ¡^ СЛСг,50-С -

NHAc

(1) MeONa/MeOH

(2) PhCH(OMe)2 TsOH/CHjCN

sp NHAc

23

Ph-^o

AcCKV^V

sp NHAc

21

11 (12)

OAc

OAc OAc О I °Ac

24 і

R0

TMSOTf

ch2ci2-ch,cn

sp NHAc

NaBH3CN MsOH/THF

MeONa MeOH

UB П

NHAc

С25: R1=AC, R2=H 26: R1,R2=H

(1) 80% AcOH, 80 *C

(2) ACjO/Py

С

OAc

27, 28: R\ R2 = >CHPh 29, 30: R1 = R2 = Ac

(1) MeONa/MeOH

(2) Na0H/H20

Atetra (ТИП !) B.em(™n U sp=0(CH2)3NHC(0)CF3

27, 29: R=NHAc

28, 30: R=OAc

1 или 2

Схема 3. Синтез аминопропилгликозидов тетрасахаридов А (тип 1) 1 и В (тип 1) 2.

Тетрасахарид А (тип 1) получали конденсацией трихлорацетимидата 11с гликозилакцептором 21 (Схема 3). Далее реакционную смесь подвергали гель-фильтрации на Сефадексе LH-20 с последующей колоночной хроматографией на силикагеле, однако, выделить индивидуальное соединение 27 не удалось (по данным 'Н ЯМР в смеси присутствовало около 10% неидентифицированных примесей). Для облегчения выделения требуемого гликозида фракцию, содержащую А-тетрасахарид 27, обрабатывали 80%-ной водной АсОН для удаления бензилиденовой защитной группы и ацетилировали (АсгО/Ру). Перацетилированный гликозид 29 выделяли с выходом 56% на 3 стадии.

Тетрасахарид В (тип 1) получали конденсацией трихлорацетимидата 12 с

9

гликозилакцептором 23 (Схема 3). Целевой гликозид 28 выделяли с выходом 90% методом колоночной хроматографии на силикагеле и далее превращали в полный ацетат 30 так же, как описано выше для производного 29.

Перацетилированные тетрасахариды 29 и 30 дезацетилировали по Земплену, удаляли трифторацетильную защиту действием водной щелочи. После ионобменной хроматографии на DOWEX (Н+) получали аминопропилгликозиды тетрасахаридов 1 и 2 с количественными выходами.

Отметим, что гликозилирование трихлорацетимидатом В-трисахарида проходило стереоспецифично и приводило только к целевому р-гликозиду 28 с выходом 90%. При гликозилировании трихлорацетимидатом А-трисахарида в реакционной смеси детектировались примесные продукты, но ни один из них, включая а-аномер, в индивидуальном виде выделен не был.

3.2. Гликозилирование диола. Получение пентасахаридов АЬеь и ВЬеь. Использование в блок-синтезе глюкозаминового диола 26 в качестве гликозилдонора потенциально дает возможность одновременного получения тетрасахаридов как типа 1, так и типа 2. Кроме того, остающаяся свободной ОН-группа при С-4 или С-3 глюкозамина позволяет исключить стадии перезащит в синтезе фукозилированных пентасахаридов АЬеь (ВЬеь) или АЬеу (ВЬеу) соответственно.

Глюкозаминовый диол 26 получали в три стадии из производного 21 — ацетилированием гидроксила при С-3, региоселективным восстановительным раскрытием бензилиденового ацеталя и дезацетилированием (Схема 3).

Конденсация А-трисахаридного трихлорацетимидата 11 с диолом 26

(Схема 4) приводила к смеси продуктов, из которой методами гель-фильтрации

и колоночной хроматографии на силикагеле выделяли три тетрасахарида: Р-

(1—*3)-гликозид 31 (33%), Р-(1—>4)-гликозид 32 (5%) и а-(1—>3)-гликозид 33

(10%). При гликозилировании диола 26 трихлорацетимидатом В-трисахарида

12 также получали многокомпонентную смесь веществ, из которой с выходом

43% удавалось выделить только Р-(1—>3)-гликозид 34 (Схема 4). Определение

положения образовавшихся гликозидных связей проводили сравнительным

10

анализом спектров *Н ЯМР тетрасахаридов 31-34 и соответствующих ацетилированных производных.

ОВп МНАс

31 32 33 34

31

^г--от-ос<мн>сс|з

т™

ОВп

35

тмзотг Ецо-снга2

ОАс

АсНЫ О

О

^.ОАс

ОАс

(1) нг. Рй/с/меон 37: Р=Вп <2)Асго/Ру 4^-38: Р=Ас

ЫНАс

^(1) МеОЧа/МеОН (2) №0№Н20

34

^Г~07-ОС(МН)СС13 ОАсод

ЦТ

35 АсОО-»"^^ МНДс

ТМвСШ

ОАс

(1) нг, ра/с/меон с 39: 1Ч=Вп

(2) Ас2о/Ру I, 40: Р=Ас

ОАс

(1) МеСЖа/МеОН

(2) №0№Н20

10

зр=0(СН2)3ЫНС(0)СР3

Схема 4. Синтез аминопропилгликозидов пентасахаридов АЬеь 9 и ВЬеь 10.

Выходы тетрасахаридов А (тип 1) 31 и В (тип 1) 34 были ниже, чем при использовании в качестве гликозилакцептора моногидроксильного производного 23. Тетрасахарид А (тип 2) 32 был выделен лишь в минорных

количествах (5%), а тетрасахарид В (тип 2) выделить из реакционной смеси не удалось. Тем не менее, основные продукты гликозилирования диола — тетрасахариды 31 и 34, имеющие свободную 4-ОН-группу в глюкозаминовом звене - были удобными синтонами для получения фукозилированных пентасахаридов АЬеь 9 и ВЬеь 10. Фукозилирование акцепторов 31 и 34 проводили в смеси Е^О-СНгСЬ (3:1) в присутствии ТМБОТГ, используя известный бензилированный трихлорацетимидат фукозы 35 в качестве гликозилдонора. Гликозилирование производного А-тетрасахарида 31 фукозилимидатом 35 давало смесь двух продуктов - целевого пентасахарида 37 (60%) и Р-аномера 36 (13%). При конденсации производного 35 с В-тетрасахаридом 34 с выходом 75% получали только а-фукозилированный пентасахарид 39 (Схема 4). Удаление защитных групп обычными методами (Схема 4) приводило к аминопропилгликозидам АЬе 9 и ВЬеь 10.

3.3. Синтез тетрасахаридов А (тип 2) и В (тип 2). В тетрасахаридах типа 2 трисахаридный фрагмент связан с остатком Ы-ацетилглюкозамина р-(1—>4)-гликозидной связью. Низкая реакционная способность гидроксильной группы при С-4 Ы-ацетилглюкозамина - известный факт в синтетической химии углеводов. Это обусловлено несколькими причинами: стерической заслоненностью 4-ОН-группы заместителями в третьем и шестом положениях глюкозамина, образованием меж- или внутримолекулярных водородных связей гидроксила при С-4 с ЫН-фрагментом амидной группы при С-2, а также возможностью образования супрамолекулярных агрегатов за счет межмолекулярных водородных связей.

Существуют различные способы решения этой проблемы. Во-первых, возможен выбор таких защитных групп для амина при С-2, которые предотвратили бы образование водородных связей (ЪГ-фталимидо-, 14-ацетилоксазолидинон-, Т^Ы-диацил-, 2-азидо-2-дезокси-). Во-вторых, возможно применение 1,6-ангидропроизводных М-ацетилглюкозамина, имеющих закрепленную ^(С'-конформацию (в отличие от 4С]-конформации, характерной для большинства пиранозидов), в которой все заместители пиранозного цикла

12

находятся в аксиальном положении. В таких соединениях уменьшается стерическая заслоненность гидроксильной группы при С-4 глюкозамина.

Была проверена возможность использования трех гликозилакцепторов для синтеза А- и В-тетрасахаридов типа 2: производного М-ацетилглтокозамина 25, 1,6-ангидро-1Ч-ацетилглгокозамипа 41, ранее синтезированного в нашей лаборатории, и ЩчГ-диацетильного производного 42 (Рисунок 3).

МНАс ОН ИНАс ^

25 41 42

5Р=0(СН2)^НС(0)СР3

Рисунок 3. Гликозилакцепторы 25, 41 и 42.

При гликозилировании акцептора 25 трихлорацетимидатом В-трисахарида 12 не удалось получить целевой тетрасахарид. Основной продукт реакции оказался нестабильным при хроматографии и полностью разлагался на гликозилакцептор 25 и гемиацеталь В-трисахарида при обработке 80%-ой водной АсОН. По-видимому, при конденсации прошла конкурирующая реакция по ацетамидной группе с образованием соответствующего имидата.

Конденсация 1,6-ангидропроизводного Ы-ацетилглюкозамина 41 с трихлорацетимидатом 12 приводила к смеси и а-гликозидов, из которой методом колоночной хроматографии на силикагеле были выделены индивидуальные соединения с выходами 23% и 30% соответственно. Низкая эффетивность и отсутствие стереоизбирательности гликозилирования (общий выход терасахаридов был 53%, р/а 0.76) не позволяют использовать производное 41 для препаративного получения тетрасахаридов А и В типа 2. Ы,М-Диацетильное производное 42 получали из соединения 24 последовательным 1Ч-ацетилировапием и восстановительным региоселективным раскрытием бензилиденового цикла (Схема 5).

Конденсация акцептора 42 с трихлорацетимидатом В-трисахарида 12 давала аномерные гликозиды 44 (Схема 5), которые выделяли из реакционной смеси гель-фильтрацией на Сефадексе ЬН-20. Затем их дезацетилировали и

разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле. Требуемый (3-гликозид 46 выделяли с выходом 55%, а его а-аномер 48 - с выходом 11% (р/а 5:1). Удаление защитных групп обычными методами (Схема 5) приводило к аминопропилгликозидам 4 (89%) и 54 (84%).

24

АсС1, |-РгЫЕЦ СН2С12 *

МаВН3СЦ МзОН/ТНР

42

11 (12) ТМвОТЯСНзСМ

зр КНАс

^^¿он (но

ОН45,46

1(1) Н2, Ра/С/МеОН (2) Ас20/Ру

Г .иАС ОАС0Дс

о

07. О Ас

зр МНАс

ОАс ОАс

49, 50

(1) Ме(Жа/МеОН

(2) №0ШН20

3,4

То-

МеОЫа/МеОН

43,44

]ОН

Хо

9 о но -он

ивп

®Р ИНАс

ОАс,

47,48

(1) Н2, Рй/С/МеОН

(2) Ас20/Ру

ОАс

ОАс

ер ГІНАс

ОАс

ОН,

51,52

I (1) МеСЖа/МеОН (2) №0Н/Н20

ОН

9о-

„ НО-££он МНАе

но

он ноЗ^^

о*сн2)3мнг

он

53, 54

43 (смесь а и 3), 45,49 (А тип 2), 47, 51, 53 (а-А тип 2): IV = ІЧНАс

44 (смесь а и р), 46, 50 (В тип 2), 48, 52, 54 (а-В тип 2): Р*1 = ОН, (V = ОАс

зр=0(СН2)3МНС(0)СР3

Схема 5. Синтез аминопропилгликозидов тетрасахаридов А (тип 2) 3 и В (тип 2) 4.

Тетрасахарид А (тип 2) получали гликозилированием производного 42

трихлорацетимидатом 11 (Схема 5). Реакция также приводила к смеси аномеров

43, из которой после дезацетилирования выделяли Р-гликозид 45 (35%) и а-гликозид 47 (26%). Стереоспецифичность при этом (р/а 1.3:1) была значительно хуже, чем при гликозилировании трихлорацетимидатом В-трисахарида 12. Мы проверили влияние температуры на стереоизбирательнось гликозилирования. Предполагалось, что понижение температуры может усилить нитрилиевый эффект и, следовательно, повысить долю образующегося Р-гликозида. Однако при температурах в диапазоне от —10 до 0°С конденсация шла очень медленно, что приводило к накоплению побочных продуктов. Соотношение аномеров а/р при этом не изменялось.

Такая разница в стереоспецифичности гликозилирования диацетильного акцептора 42 трихлорацетимидатами А-трисахарида 11 и В-трисахарида 12 была неожиданной. Производные 11 и 12 отличаются только заместителем при С-2 терминального галактозного остатка (ЫНАс в 11, О Ас в 12). Этот заместитель удален от реакционного центра молекулы и механизм его влияния на стереохимию гликозилирования остается невыясненным.

3.4. Синтез тетрасахаридов А (тип 3 и 4) и В (тип 3 и 4). В качестве гликозилакцепторов для синтеза тетрасахаридов А (тип 3 и тип 4) и В (тип 3 и тип 4) использовали известные бензилиденовые производные 2-дезокси-2-азидогалактозы 56 и 57. Гликозилакцепторы 56 и 57 отличаются друг от друга только конфигурацией гликозидной связи (а для 56 и р для 57). Для их получения было использовано нестереоспецифическое гликозилирование 3-трифторацетамидопропанола ацетилированной азидогалактозой 55 в присутствии ТМБОТ^ которое давало смесь аномеров с выходом 65% (Схема 6). Полученную смесь гликозидов дезацетилировали, бензилиденировали и колоночной хроматографией на силикагеле выделяли а-гликозид 56 (39%) и р-гликозид 57 (58%).

Во всех случаях гликозилирования акцепторов 56 и 57 трихлорацетимидатами А-трисахарида 11 и В-трисахарида 12 получали смеси аномерных гликозидов А-тетрасахаридов (58 и 60) и В-тетрасахаридов (59 и 61) (Схема 6).

I ОАс ОАс

58, 59, 60, 61

АсС

(1) 80% АсОН, 80 *С

(2) Ас,0/Ру

ОАС

АсО

62, 63, 64, 65

ОАс

^¿ОАс

. ОАс ОАс

66, 67, 68, 69

Г

(1)МеОМа/МеОН

(2) Н„ РШС, Ас,0/Ме0Н

(3) МаОН/НгО

5, 6, 7, 8

58 (смесь а и р), 62 (А тип 3), 66 (сс-А тип 3): Р!=МНАс, Х=Н, У=эр

59 (смесь а и р), 63 (В тип 3), 67 (а-В тип 3): Р!=ОАс, Х=Н, У=эр

60 (смесь а и р), 64 (А тип 4), 68 (а-А тип 4): [*=МНАс, Х=зр, У=Н

61 (смесь а и р), 65 (В тип 4), 69 (а-В тип 4): R=OAc, Х=эр, У=Н

$р=0(СН2)3ЫНС(0)СР3

Схема 6. Синтез аминопропилгликозидов тетрасахаридов А (типа 3 и 4) и В (тип 3 и 4) 5-7.

Мы изучили влияние температуры на стереоизбирательность гликозилирования. Результаты экспериментов приведены в Таблице 1. На примере получения тетрасахаридов 58 (а/р А тип 3) и 60 (а/р А тип 4) было показано, что оптимальной является температура 4°С (Таблица 1, опыты № 2 и 4). При 0°С реакции шли крайне медленно и происходило накопление продуктов разложения трихлорацетимидатаимидата 11, а при температурах ниже 0°С образования тетрасахаридов не наблюдалось совсем.

16

Таблица 1. Синтез тетрасахаридов А (тип 3 и 4) и В (тип 3 и 4). Влияние температуры на стереоизбирательность гликозилирования.

№ Реагенты Растворитель Температура, °C p/a" Выход, %

1 11+56 CH3CN 20 2.5:1 79

2 11+56 CHjCN 4 3.0:1 70

3 11+57 CH3CN 20 2.1:1 81

4 11+57 CH3CN 4 3.3:1 69

6 12+56 CH3CN 4 5.1:1 66

7 12+57 CH3CN 4 4.7:1 74

8 11+57 CH2C12 20 1:1.6 77

а Для определения соотношения р/а использовали данные спектров *Н ЯМР смесей аномеров.

Гликозилирование трихлорацетимидатом В-трисахарида 12 производных 56 и 57 проводили при 4°С в CH3CN. Выход а/р-гликозидов 59 (тип 3) составил 66%, а соотношение р/а = 5.1:1 было наилучшим (Таблица 1, опыт № 6). Смесь аномеров 61 (тип 4) была получена с выходом 74%, соотношение р/а = 4.7:1 (Таблица 1, опыт 7).

Для упрощения разделения аномерных тетрасахаридов (опыты 1-8, Таблица 1), их подвергали дебензилиденированию и ацетилированию (Схема 6). Перацетилированные тетрасахариды А (тип 3) 62, В (тип 3) 63, А (тип 4) 64 и В (тип 4) 65, а также их а-аномеры 66, 67, 68 и 69 соответственно, выделяли с помощью хроматографии на силикагеле. Далее перацетилированные тетрасахариды 62—65 дезацетилировали и восстанавливали азидную группу каталитическим гидрированием. Полученный амин ацетилировали in situ действием Ас20 и удаляли трифторацетильную защиту водной щелочью (Схема 6). Аминопропилгликозиды 5, 6, 7 и 8 выделяли с выходами 77%, 83%, 64% и 85% соответственно.

Подводя итоги по блок-синтезу антигенных тетрасахаридов крови

системы АВН разных типов, необходимо отметить, что для всех

гликозилакцепторов Р-стереоспецифичность гликозилирования

17

трихлорацетимидатом В-трисахарида была выше, чем трихлорацетимидатом А-трисахарида. Строение гликозилакцепторов также влияет на стереохимию образующихся гликозидных связей. Наиболее высокие выходы ß-гликозидов получены в синтезе тетрасахаридов типа 1 (акцептор 23, Рисунок 4), наиболее низкие - типа 2 (акцепторы 41 и 42, Рисунок 4).

Ph^ro РИЛГО QBn _0

> НО&^зр . J^ > HOolC^sp >

NHAC N3 N3| NAc2 ¿h NHAc

sp

23 57 56 42 41

sp=0(CH2)3NHC(0)CF3

Рисунок 4. Сравнение ß-стереоспецифичности при гликозилировании различных акцепторов.

4. Синтез липофильных производных тетрасахаридов А и В типов 14 и их использование для тестирования АВН-реагентов. Из тетрасахаридов 1-8 были синтезированы две серии неогликолипидов с различной длиной спейсера между липофильной и углеводной частями молекулы. Производные с адипиновым спейсером 70—74 получали конденсацией аминопропилгликозидов 2, 3, 4, 6 и 8 с активированным эфиром 1,2-0-диолеоил-5и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE-Ad-ONSu) 81 (Схема 7). Синтез неогликолипидов с карбоксиметилглицинсодержащим пептидным (CMG) спейсером 75-80 осуществляли в два этапа: реакцией аминопропилгликозидов 1-4, 5 и 7 с Ad(ONSu)2 82 получали активированные эфиры 83-88, которые затем конденсировали с производным 89 (Схема 7). Соединения 70-80 выделяли из реакционных смесей гель-фильтрацией на Сефадексе LH-20 и хроматографией на силикагеле с выходами 88-96%. Структуру производных 70-80 подтверждали данными спектроскопии 'Н ЯМР и масс-спектрометрии.

Липидный (диолеоильный) фрагмент молекул 70-80 позволяет им встраиваться в клеточную мембрану без нарушения жизнеспособности клеток, а экспонированный во внеклеточное пространство А- или В-гликан придает клеточной поверхности антигенные свойства групп крови системы АВН.

, , , о . Ч о н

70: Sug = Де,га(тип 2), 71: Sug = В,е1га(тип 1), 72: Sug = В,а,га(тип 2) 73: Sug = В1е1га(тип 3), 74: Sug = В,е1га(тип 4)

89 DMSO+PrOH-NaHCO, (aq)

75: Sug = А,е1га(тип 1), 76: Sug = А,Мга(тип 2), 77: Sug = A,etra(™n 3) 78: Sug = А,е„а(тип 4), 79: Sug = В1ага(тип 1), 80: Sug = ВМга(тип 2)

Схема 7. Синтез неогликолипидов с адипиновым (70-74) и CMG2 (75-80) спейсером.

Структурные особенности синтезированных гликолипидов позволили использовать их для модификации эритроцитов группы крови 0 (на которых отсутствуют природные А- и В-гликаны) с целью разработки инструментов для оценки качества моно- и поликлональных антител (АВН-реагентов), применяемых для определения групп крови. Сложность выбора и необходимость тщательного контроля качества АВН-реагентов связана с серологическим полиморфизмом А- и B-эритроцитов, который заключается в

существовании «сильных» (Аь В) и «слабых» (А2, А3, Ах, В2, Вх и других) подгрупп. Эритроциты «слабых» подгрупп хуже агглютинируются моноклональными антителами (МА), что вызывает сложности при АВН-типировании.

SO

3 6 12,5 J 6 25 31 50 63 100 125 200 2SO 500 1000 Al

■ A tetra (тил 2)-Ad-DE OAtetra (тип 2)-Ad-CMG2-Ad-DE ЗА tn-Ad-DE 0 Эритроциты группы крови Al

Рисунок 5. Результаты по агглютинации эритроцитов, модифицированных различными А-гликолипидами, анти-А моноклональными антителами (А 16). По оси X - концентрация модифицирующего раствора (мкМ). По оси Y -разведение антител.

Эритроциты группы крови 0 модифицировали гликолипидами А1е[Га(тип

2)-Ad-DOPE 70, А,е,га(тип 2>Ad-CMG-Ad-DOPE 76, а также ранее

синтезированным Atr¡-Ad-DOPE 90, используя различные концентрации

модифицирующего раствора. Таким образом, в исследование были включены

три параметра: лиганд (детерминантный трисахарид и основной

эритроцитарный тетрасахарид типа 2), концентрация гликолипида и длина

спейсера между углеводной и липидной частями молекулы (эти параметры

отвечают за презентацию антигена на поверхности). Для тестирования

модифицированных эритроцитов (МЭ) использовали анти-А (Al 6) и анти-В

20

(В8) МА, полученные в Российском Гематологическом Центре (Москва). Все МЭ агглютинировались анти-А МА и не давали перекрестной реакции с анти-В МА. Результаты по агглютинации МЭ моноклоналъными антителами А16 представлены на Рисунке 5, в качестве положительного контроля в тесте использовались эритроциты «сильной» группы крови А;. Анализ полученных данных (Рисунок 5) показал, что все исследованные параметры (лиганд, концентрация и длина спейсера) влияют на свойства модифицированных эритроцитов. Все модифицированные эритроциты уступают в агглютинабельности природным эритроцитам «сильной» группы крови А1 и, в той или иной степени, имитируют различные «слабые» эритроцитарные подгруппы. Такие модифицированные эритроциты могут быть инструментами для надежной оценки АВН-реагентов, предназначенных для определения не только сильных, но и слабых эритроцитарных подгрупп.

5. Синтез флуоресцентных полиакриламидных зондов и их использование в изучении лигандной специфичности галектинов. Синтез флуоресцентных полиакриламидных зондов представлен на Схеме 8.

Конденсацию аминопропилгликозидов 1-8 (20 мольн. %) и флуоресцеинкадаверина (1 мольн. %) с поли(4-нитрофенилакрилатом) проводили в ДМСО в присутствии триэтиламина при 40°С. Избыточные сложноэфирные группы превращали в амидные действием этаноламина. Флуоресцентные полимерные гликоконъюгаты (флуоресцентные зонды) выделяли гель-фильтрацией на Сефадексе ЬН-20, выходы составляли 90-95%.

Флуоресцентные зонды использовали для изучения углеводной специфичности галектинов. Было установлено*, что для С-домена галектинов-4, -8 и -9 тетрасахариды А и В (особенно типа 2) являются наиболее аффинными из изученных гликанов.

* Эти данные подробно описаны в наших публикациях [3] и [4].

21

"Ы* *К4-

О о О о о о

ф ф ф

I

N02 N02

ЭидНН; Р1ио-вр-МН2 СМвО, Е^Ь!, 40 -С

ТуТ 0.01 п о.20 п *0.79П

Ф

О^Н О ЫН 0^0

Эйд

| НОСН2СН2МН2

Т^ТТ 0.01-п * о.20п °-79п

° ИИ О МН О мсН2СН2ОН

?Р ¿ид

Н Н

Пио-8р^Н2

Схема 8. Синтез полиакриламидных конъюгатов.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы тетрасахариды и пентасахариды, относящиеся к гистоантигенам системы крови АВН, а именно, тетрасахариды А и В типов 1, 2, 3 и 4, и пентасахариды АЬеь и ВЬсь. Впервые в их синтезе использована блок-схема с участием трисахаридных гликозилдоноров, что позволило значительно сократить общее число синтетических стадий. Разработан эффективный метод получения трисахаридных гликозилдоноров.

2. Показано, что Р-стереоизбирательность гликозилирования трихлорацетимидатом В-трисахарида выше, чем трихлорацетимидатом А-трисахарида, независимо от природы моногидроксильных гликозилакцепторов. Строение гликозилакцепторов влияет на стереохимический результат гликозилирования, наиболее высокая р-селективность достигнута в синтезе

тетрасахаридов типа 1, наиболее низкая наблюдалась в синтезе тетрасахаридов типа 2.

3. Гликозилирование производного глюкозамина с двумя экваториальными ОН-группами (при С-3 и С-4) идет в основном по гидроксильной группе при С-3 с образованием преимущественно Р-гликозида. Однако получение трудноразделимых многокомпонентных реакционных смесей делает нерациональным использование диола в синтезе тетрасахаридов.

4. Синтезированы липофильные производные тетрасахаридов А и В типов 1-4 с различной длиной спейсера между углеводной и липидной частями молекулы. Показано, что модифицированные ими эритроциты могут использоваться для контроля качества моно- и поликлональных антител, используемых при определении групп крови системы АВН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи

1. E.Yu. Korchagina, I.M. Ryzhov, K.A. Byrgazov, I.S. Popova, S.N. Pokrovsky, N.V. Bovin. Block synthesis of blood group tetrasaccharides В (types 1, 3 and 4)//Mendeleev Commun., 2009, Vol. 19, pp. 152-154.

2.1.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, I.S. Popova, N.V. Bovin. Block synthesis of A tetrasaccharides (types 1, 3, and 4) related to the human ABO blood group system// Carbohydr. Res., 2012, Vol. 351, pp. 17-25.

3. O.A. Вохмянина, E.M. Рапопорт, И.М. Рыжов, Е.Ю. Корчагина, Г.В. Пазынина, В.В. Северов, Г. Кальтнер, С. Андре, Г.-И. Габиус, Н.В. Бовин. Углеводная специфичность куриного и человеческого галектинов-8 в составе клеток//Биохимия, 2011, Т. 76, стр. 1452-1460.

4. О .A. Vokhmyanina, E.M. Rapoport, S. Andre, V.V. Severov, I.M. Ryzhov, G.V. Pazynina, E.Yu. Korchagina, H.-J. Gabius, N.V. Bovin. Comparative study of the glycan specificities of cell-bound human tandem-repeat-type galectin-4, -8, and -9// Glycobiology, 2012, Vol. 22, pp. 1207-1217.

Тезисы докладов на конференциях

1. I.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, I.S. Popova, N.V. Bovin. Block synthesis of blood group В (type 1, type 2) tetrasaccharides// 10th European Training Course on Carbohydrates, Wageningen, 9-12 June 2008. Book of Abstracts, p. 56.

2. I.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, K.A. Byrgazov, I.S. Popova, N.V. Bovin. Block Synthesis of Blood Group В (type 1, type 3, and type 4) Tetrasaccharides// 24th International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, 27 July - 1 August, 2008. Abstract A-P071.

3. E.Yu. Korchagina, I.M. Ryzhov, I.S. Popova, T.V. Tyrtysh, N.V. Bovin. Block Synthesis of Blood Group A (type 2) and В (type 2) Tetrasaccharides// 24th International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, 27 July - 1 August, 2008. Abstract A-P072.

4. И.М. Рыжов, Е.Ю. Корчагина, И.С. Попова, H.B. Бовин. Блок-синтез тетрасахаридов групп крови А (тип 1 и 2) и В (тип 1 и 2)// Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Секция «Химия». Подсекция «Органическая Химия». Отв. ред. И. А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев. Москва, 2009, стр. 82 [http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2009/28_9.pdf].

5. I.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, I.S. Popova, N.V. Bovin. N,N-Diacetylglucosamine derivatives as glycosyl acceptors in block synthesis of blood group A (type 2) and В (type 2) tetrasaccharides// 15th European Carbohydrate Symposium. Vienna, Austria, 19-24 July, 2009. Book of Abstracts, p. 269.

6.1.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, I.S. Popova, N.V. Bovin. Block Synthesis of Blood Group A and В Tetrasaccharides// 25th International Carbohydrate Symposium. Tokio, 1-6 August, 2010. Book of Abstracts, p. 213.

7. I.M. Ryzhov, E.Yu. Korchagina, I.S. Popova, S. Henry, N.V. Bovin. Block Synthesis of Blood Group A and В Tetrasaccharides (types 1-4) Related to Human ABO Blood Group System and Pentasaccharides ALewis В and BLewis В // 17th European Carbohydrate Symposium. Tel-Aviv, 7-11 July, 2013. Book of Abstracts, p. 165.

Заказ № 14-Р/09/2013 Подписано в печать 04.09.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таіі: info@cfr.ru

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

на правах рукописи

04201361708

Рыжов Иван Михайлович

БЛОК-СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАРИДОВ - АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ КРОВИ АВН

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н. Корчагина Е.Ю.

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3

ЧАСТЬ 1. ВВЕДЕНИЕ 5

ЧАСТЬ 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7

2.1. Синтез олигосахаридов - антигенов групп крови системы АВН 7

2.1.1. Синтез Н-гликанов 7

2.1.2. Синтез антигенов групп крови А и В 21

2.2. Блок-синтез сложных олигосахаридов 37

2.2.1. Блок-синтез олигосахаридов Льюис 37

2.2.2. Метод гликальной сборки 44

2.2.3. Блок-синтез гликанов N-цепей 51

2.2.4. Другие примеры 56

2.3. Заключение 61 ЧАСТЬ 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 62

3.1. Целевые соединения и стратегия синтеза 62

3.2. Синтез гликозилдоноров 63

3.3. Синтез целевых олигосахаридов 66

3.3.1. Синтез тетрасахаридов А (тип 1) и В (тип 1) 67

3.3.2. Гликозилирование диола. Получение пентасахаридов ALe и BLe 69

3.3.3. Синтез тетрасахаридов А (тип 2) и В (тип 2) 72

3.3.4. Синтез тетрасахаридов А (тип 3 и 4) и В (тип 3 и 4) 79

3.4. Синтез липофильных производных тетрасахаридов А и В

типов 1-4 и их использование для тестирования АВН реагентов 83

3.5. Синтез флуоресцентных полиакриламидных зондов и их

использование в изучении лигандной специфичности галектинов 87

ЧАСТЬ 4. ВЫВОДЫ 91

ЧАСТЬ 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 92

5.1 Синтез гликозилдоноров 11 и 12 93

5.2 Синтез тетрасахаридов А (тип 1) и В (тип 1) 97

5.3 Синтез пентасахаридов ALe и BLeb 101

5.4 Синтез тетрасахаридов А (тип 2) и В (тип 2) 112

5.5 Синтез тетрасахаридов А (тип 3 и тип 4) и В (тип 3 и тип 4) 121

5.6 Синтез неогликолипидов 77-81, 91-96 и полиакриламидных конъюгатов 131 ЧАСТЬ 6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 136

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АН - аллил Ad - адипинил

AIBN - азобисизобутиронитрил Asn - аспарагин

AZMB - 2-(азидометил)-бензоил

BSP - 1-бензосульфонилпиперидин

Cbz - бензилоксикарбонил

CMG - карбоксиметилглицил

Coll - коллидин

Ср - циклопентадиенил

DBU - 1,8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ен

DMAP - 4-диметиламинопиридин

DMDO - 3,3-диметилдиоксиран

DMTSB - диметил(метилтио)сульфонийборат

DMTST - диметил(метилтио)сульфонийтрифлат

DOPE - 1,2-0-диолеоил-5и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин

DTBMP - 2,6-ди-/?г/^т-бутил-4-метил пиридин

Fluo - флуоресцеин

Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил

Fue - фукоза

Gal - галактоза

GalNAc - N-ацетилгалактозамин Glc - глюкоза

GlcNAc - N-ацетилглюкозамин HMDS - бис(триметилсилил)амид Lev - левулиноил

ШСР - иодоний диколлидинперхлорат

Man - манноза

МВп - и-метоксибензил

Ms - метансульфонил

Np - нафтил

NIS - N-йодсукцинимид

РАА - полиакриламид

Piv - пивалоил

Phth - фталоил

Py - пиридин

Rh a - рамноза

SE - (триметилсилил)этил

Ser - серии

Si а - сиалил

Sug - углеводный остаток

TCP - тетрахлорфталоил

Tf - трифторметансульфонил

TBS - трибутилсилил

TBDPS - wpem-бутилдипропилсшшл

TBDMS - да/;еда-бутилдиметилсилил

TDS - диметилтексилсилил

TES - триэтилсилил

TIPS - три-шо-пропилсилил

TMS - триметилсилил

Troc - 2,2,2-трихлорэтилоксикарбонил

Ts - я-толуолсульфонил

ТТВР - 2,4,6-три-/и/?ет-бутилпиримидин

ГМФТА - гексаметилфосфортриамид

ДМФА - диметилформамид

ДМСО - диметилсульфоксид

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия

ТГФ - тетрагидрофуран

ТММ - тетраметилмочевина

Часть 1

ВВЕДЕНИЕ

В 1900 г. К. Landsteiner [1], систематизируя данные по кросс-агглютинации эритроцитов и сывороток разных людей, показал, что только два антигена (агглютиногена) - А и В - и два антитела (агглютинина) - анти-А и анти-В - нужны для объяснения полученных результатов. Было показано, что в сыворотках людей, имеющих на эритроцитах один из этих антигенов, присутствуют природные агглютинирующие антитела ко второму антигену. Если эритроциты людей не содержат ни одного из агглютиногенов, то в их сыворотках присутствуют оба агглютинина. Тогда же, по наличию или отсутствию этих антигенов на эритроцитах, были установлены три группы крови человека, обозначенные как группы А, В и 0. Годом позже Decastello и Sturli [2] описали четвертую группу крови АВ, на эритроцитах которой одновременно присутствуют оба антигена. Таким образом, в самом начале двадцатого столетия антигены групп крови системы ABO стали первыми аллоантигенами, идентифицированными у человека. Интенсивные структурные исследования 50-60-х годов прошлого века выявили углеводную природу этих антигенов (см. обзор [3] и цитируемые работы). Минимальными иммунодоминантными структурами эритроцитарных А и В антигенов являются трисахариды Atri и Btn соответственно (Рисунок 1), а на эритроцитах группы крови 0 присутствуют структуры, содержащие дисахарид Fuccx(l—>2)Galp, которые получили название Н-антигенов. Следующий в углеводной цепи моносахарид определяет тип группоспецифических антигенов ABO (АВН). На сегодняшний день все АВН антигены подразделены на шесть типов (Рисунок 1) [4, 5].

GalNAcal-3.

Fucal-2^ Р

Uri

Galal-3.

Fucal^0^1"*

В

tri

X

►3)-GlcNAcp

>4)-GlcNAcp

>3)-GalNAca

>3)-GalNAcp

>3)-Gaip

>4)-Glcp

Тип 1 Тип 2 Тип 3 Тип 4 Тип 5 Тип 6

Рисунок 1. Типы АВН-антигенов групп крови.1

1 Нумерация соединений дается арабскими цифрами жирным шрифтом, причем соединения, рисунки, схемы и таблицы в частях «Введение», «Литературный обзор» и «Обсуждение результатов» нумеруются независимо.

Помимо гемопоэтических клеток (эритроцитов и тромбоцитов), АВН-антигены экспрессированы на эндотелии и эпителии пищеварительного тракта, сердца, почек, легкого и дыхательных путей, на эпителиальных клетках репродуктивного и мочевыводящего трактов, что позволяет называть их гистоаптигенами [6, 7]. Во многих биологических жидкостях (слюне, желудочном соке и др.) присутствуют АВН-содержащие гликопротеины [8, 9], а в женском молоке - свободные АВН-олигосахариды [10]. АВН-гликаны ответственны за гемолитические реакции при переливании крови и острое отторжение при трансплантации органов и костного мозга [11]; изменение их экспрессии сопровождает процессы роста, развития, дифференцировки и апоптоза клеток, а также трансформацию клеток при различных видах онкологических и кардиоваскулярных заболеваний [12-15].

Олигосахариды, определяющие антигенную специфичность групп крови, не могут быть выделены из природных источников в количествах, достаточных для фундаментальных исследований в области гликобиологии и, тем более, для целей практической медицины. Поэтому актуальна задача разработки эффективных химических путей их синтеза.

Целью работы являлся синтез тетрасахаридов А и В типов 1, 2, 3 и 4 и

ь ь

пентасахаридов АЬе и ВЬе в виде аминопропилгликозидов, а также получение их липидных и полиакриламидных производных для изучения углевод-белкового взаимодействия.

Работа выполнена в Лаборатории углеводов ИБХ РАН и является частью комплексного исследования по синтезу и изучению свойств углеводных антигенов.

Часть 2

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Литературный обзор состоит из двух глав. В первой главе мы постарались обобщить результаты по химическому синтезу антигенов групп крови Н, А и В. Вторая глава посвящена синтезу сложных олигосахаридов с использованием блок-схем. Основное внимание в обзоре уделялось гликозилированию как ключевому моменту синтеза олигосахаридов. Получение гликозилдоноров и гликозилакцепторов, а также удаление защитных групп в целевых олигосахаридах не рассматривались.

2.1 Синтез олигосахаридов - антигенов групп крови системы АВН

2Л.1 Синтез Н-гликанов

Н-антигены системы крови АВН - линейные олигосахариды, содержащие терминальный дисахарид Риса-(1—>2)-Оа1р. Н-гликаны являются предшественниками А и В антигенов и, как уже отмечалось (см Введение), подразделяются на шесть типов:

Обзор синтетических методов получения Н-трисахаридов разделен на две части: галактозилирование (синтез коровых дисахаридов) и фукозилирование 2-ОН-группы терминальной галактозы. Информация о получении защищенных Н-гликанов (гликозилдоноры, гликозилакцепторы, продукты, условия проведения реакций и выходы) представлена в Таблице 1.

Галактозилирование. В первых работах [16-18], посвященных синтезу трисахаридов Н (тип 1 и тип 2), галактозилирование проводили ортоэфирным методом. Конденсаций бензилированного этилортоацетата галактозы 1 с бензилиденовым производным глюкозамина 2 в присутствии НзВг2 получали коровый дисахарид (тип 1) За с выходом 38% (Таблица 1, №1). В синтезе лактозаминовых производных (коровый дисахарида тип 2) в качестве гликозилдонора использовали галактозный трет-бутилортоацетат 6 и два акцептора 7 и 11, отличающиеся заместителем при С-3 - 3-0АН в соединении 7 и З-ОВп в 11. Конденсация ортоэфира 6 с производными 7 и 11 (Таблица 1, № 2 и 3) протекала с образованием не только требуемых Р-гликозидов 8а и 12а (выход

Риса-(1^2)-Оа1р-(1-»3)-ОШАс|3 Риса-(1 —>-2)-Оа1р-(1 —>4)-01сМАср БисоК 1 —>2)-0а1р-( 1 —>3)-ОаШАса Риса-(1—>2)-0а1р-(1—>3)-ОаШАср Риса-( 1 ->2)-Оа1Р-( 1 ^3)-Оа1 р

тип 1 тип 2 тип 3 тип 4 тип 5 тип 6

Биса-( 1 ->2)-Оа1р-( 1 -^4)-01сР

52% и 38% соответственно), но и побочных а-гликозидов. При этом аномерное соотношение зависело от защитной группы при С-3 - для З-О-бензилированного производного 7 стереоспецифичность была лучше ф/а 4.3:1), чем для 3-0-аллилированного производного 11 ф/а 2.4:1). Отметим, что применение ортоэфиров для синтеза антигенов групп крови ограничивается этими тремя работами. Метод не получил развития из-за низкой эффективности ортоэфирных доноров при гликозилировании вторичных гидроксильных групп.

Применение галактозилбромидов в качестве гликозилдоноров позволило добиться значительно лучших результатов. Использовались два варианта условий гликозилирования бромидами: метод Гельфериха [проведение реакции в СНзЖЬ или смеси СНзМОг с бензолом или толуолом в присутствии цианида и (или) бромида ртути (II)] или конденсация в СНгСЬ в присутствии AgOTf. Применение метода Гельфериха для синтеза коровых дисахаридов Н-антигенов типов 1, 2 и 3 описано в работах [19-25]. В качестве гликозилдонора во всех случаях использовали ацетилированный галактозилбромид 14. Для получения р-(1-*3)-связанного дисахарида 15а [22], из которого затем был получен трисахарид Н (тип 1) [19-21], донор 14 конденсировали с бензилиденовым производным глюкозамина 2 (Таблица 1, № 4, 5). Соединение 15а выделяли из реакционной смеси кристаллизацией с выходом 53%. Коровью дисахариды типа 2 и 3 получали гликозилированием глюкозаминового и галактозаминового бензилгликозидов 7 [23, 24] и 23 [25] бромидом 14 с выходами 73-80% (Таблица 1, № 68). В работе [26] для синтеза лактозаминовых предшественников антигена Н (тип 2) 28а и 32а были использованы галактозилбромиды 26 и 30, имеющие ацильный (бензоильный в 26, я-нитробензоильный в 30) заместитель только при С-2, остальные гидроксилы были бензилированы. Бромид 26 конденсировали с 3-0-А11-акцептором 27 по Гельфериху, при этом был выделен только нужный р-аномер (76%). Гликозилирование 3-0-бензилоксиметилированного акцептора 31 бромидом 30 в присутствии А§0ТГ (Таблица 1, № 9, 10) приводило к образованию смеси а/р-аномеров (2:3) с общим выходом 60%. Более успешное применение А§ОТ£ в качестве катализатора было описано позже Пазыниной с соавторами [27]. Лактозамин 36а получали галактозилированием глюкозаминового производного 35 галактозилбромидом 34 с выходом 68% (Таблица 1, № 11).

Использование в качестве гликозилдоноров тиогликозидов также позволяет достигать хороших результатов в синтезе Н-антигенов типа 1 и 2. Нифантьев с соавторами синтезировали дисахаридный предшественник антигена Н (тип 1) [28]. Гликозилирование 3-ОН-группы глюкозаминового акцептора 39 ацетилированным этилтиогалактозидом 38 в присутствии КОВБ4 [29] проходило стереоизбирательно, выход дисахарида 40а составил

8

76% (Таблица 1, № 12). Галактозилирование тиогликозидами 4-ОН-группы глюкозамина также проходило с высокими выходами. Хатунцева с соавторами получили лактозаминовое производное 45а с выходом 83%, гликозилируя акцептор 44 этилтиогалактозидом 43 в присутствии ШБ/ТГОН (Таблица 1, № 13) [30]. В работе [31] был синтезирован лактозамин 50а с использованием 2-0-ацетил-3,4,6-0-и-хлорбензилированного тиогликозида 48 (Таблица 1, № 14). Стереоспецифичность реакции зависела от условий гликозилирования. Конденсация производного 48 с глюкозамином 49 в СН2СЬ при -10°С с БМТ8Т в качестве промотора проходила р-стереоизбирательно с выходом 91%. Тогда как при проведении реакции в ЕггО с использованием в качестве промотора МеОТГ получали смесь аномерных гликозидов с выходом 88% и соотношением р/а 8.8:1.

БашзЬеГзку с соавторами применяли гликали для синтеза трисахарида Н (тип 1) [32]. Галакталь 54 превращали в 1,2-ангидрид обработкой 3,3-диметилоксираном и и конденсировали с глюкалем 55 в ТГФ при -70 °С в присутствии 2пСЬ. Реакцияф проходила региоселективно по более реакционноспособной 3-ОН-группе, находящейся в р-положении к двойной связи глюкаля. Целевое соединение 56 получали с выходом 68% (Таблица 1, № 15).

Использование дибутилфосфатных гликозилдоноров для синтеза антигена Н (тип 2) было предложено БееЬе^ег с соавторами [33]. Конденсация галактозилфосфата 59 и глюкозаминового акцептора 60 в хлористом метилене при -50-е--20 °С приводила к лактозамину 61а с практически количественным выходом 96% (Таблица 3, № 16).

Цикл из трех работ [34-36], опубликованный Ме1опсеШ и Ьоууагу, является самым современным исследованием по химическому синтезу группоспецифических антигенов (2009-2011 гг.). Антигены А, В и Н всех шести типов получали линейным методом с использованием трихлорацетимидатных гликозилдоноров. На первом этапе были синтезированы коровью дисахариды антигенов Н (тип 1-6). В качестве гликозилакцепторов применяли 7-октенилгликозиды азидоглюкозы (65 и 69 для синтеза антигенов типа 1 и 2), азидогалактозы (72 и 75, тип 3 и 4), галактозы (78, тип 5) и глюкозы (81, тип 6). Гликозилирование вели 2,3-0-ацетил-4,6-0-бензилиденгалактозил-трихлорацетимидатом 64 в присутствии ТМБОТГ или ВРз^гО (Таблица 1, № 17-22). Выходы р-гликозидов составляли 59-91%. О выделении побочных а-аномеров авторы не сообщают.

Подводя итоги по синтезу коровых дисахаридов, отметим, что наиболее перспективными являются тиогликозидный и трихлорацетимидатный методы. Реакции с использованием тиогликозидов и трихлорацетимидатов практически всегда проходили с

9

хорошими выходами и стереоспецифичностью. Методология синтеза с использованием фосфатов и гликалей в качестве гликозилдоноров также давала хорошие результаты, хотя и является более трудоемкой.

Фукозилирование. Для проведения фукозилирования коровые дисахариды дериватизировали таким образом, чтобы в их терминальном Оа1|3-звене была свободная 2-ОН-группа.

В первых работах по фукозилированию (синтез терминального Риса-(1—>-2)-Оа1Р) [37, 38] гликозилирование вели ацетилированным фукозилбромидом 85 в классических условиях Гельфериха (Таблица 1, № 23 и 24). Как общие выходы реакций, так и стереоспецифичность были невысокими, что неудивительно при использовании гликозилдоноров с соучаствующей группой при С-2. Выходы а-гликозидов не превышали 40%. Двадцатью годами позже Нифантьев с соавторами показали, что замена ацетильных защитных групп на бензоильные в фукозилдоноре значительно повышает и выход, и стереоизбирательность гликозилирования [28]. Так, конденсация бензоилированного фукозилбромида 41 с дисахаридным акцептором 406 по Гельфериху давала смесь а- и (3-гликозидов с соотношением а/р 9:1. После удаления бензилиденовой защиты а-фукозилированный продукт был выделен с выходом 71% (Таблица 1, № 12).

В работах [16, 20, 21] в качестве фукозилдонора был предложен бромид 4, имеющий несоучаствующую бензильную защиту при С-2 и я-нитробензоильные заместители при С-3 и С-4. Предполагается, что ацильные заместители при С-3 и С-4 способны образовывать бициклические ацилоксониевые ионы, ^-сторона которых заблокирована для нуклефильной атаки [39], что позволяет увеличить а-стереоспецифичность фукозилирования. Конденсация донора 4 с дисахаридами 36 по Гельфериху в присутствии только Н§(СТ\Г)2 проходила с выходом всего 25% (Таблица 1, № 1). Использование в качестве промотора системы ^(СГ^г/Н^Вгг позволило увеличить выход целевого дисахарида до 65% (Таблица 1, № 5).

Бензилированные производные фукозы, вошедшие в практику гликозидного синтеза в середине 70-х годов прошлого века, позволили значительно повысить выходы а-фукозидов. Предложенный Лемье метод фукозилирования, основанный на использовании бензилированного фукозилбромида 9. в условиях галоид-ионного катализа, и сегодня остается одним из наиболее востребованных. В классическом варианте гликозилирование по Лемье ведут в СН2СЬ (СНгСЬ/ДМФА) в присутствии источника бромид-ионов (ВщКВг или Е14МЗг) и акцептора кислоты (/-Рг2№й). Этот способ использовали авторы работ [1719, 24-27, 31, 40] (Таблица 1, № 2-4, 7-11, 14, 25, 26). Выходы сх-фукозидов составляли

63-94%. Низкий выход был получен лишь в одном случае [24] - фукозилирование

10

лактозамина 196 по Лемье проходило с выходом 50%, а по Гельфериху - с выходом 80% (Таблица 1, № 7). Возможная причина невысокого выхода при использован�