Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа

Смирнова, Юлия Александровна

Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Смирнова, Юлия Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа»

Автореферат диссертации на тему "Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа"

ф о

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

Смирнова Юлия Александровна ДЕЙСТВИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ВИРИОНЫ ВИРУСА ГРИППА

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Л/У~л

□ □34В

Москва 2009

003481845

Работа выполнена в отделе хроматографии Научно-Исследовательского Института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители: Доктор химических наук

Баратова Людмила Алексеевна

Кандидат биологических наук Кордюкова Лариса Валентиновна

Официальные оппоненты: Доктор химических наук

Руденская Галина Николаевна

Доктор биологических наук Иванова Валерия Тимофеевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится 24 ноября 2009 года в 17.00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 40, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 23 октября 2009 года.

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Вирус гриппа является серьёзным патогеном человека, который на протяжении XX столетия вызвал три пандемии с высоким уровнем смертности. Уникальное свойство вируса гриппа - изменчивость белков на поверхности вириона - является причиной его широкого распространения в мире. Преодолевая иммунитет населения, новые штаммы вызывают эпидемии различной степени интенсивности. Именно высокий пандемический потенциал делает вирус гриппа мишенью для углубленных исследований, поскольку имеется достаточно высокая вероятность появления в ближайшем будущем новых высоко патогенных штаммов.

Молекулярная структура оболочечных вирусов представляет собой яркий пример совершеннейших макромолекулярных комплексов, формирование которых достигается посредством высокой специфичности взаимодействия всех структурных компонентов вириона.

Вирион вируса гриппа имеет липопротеиновую оболочку, окружающую геном, состоящий из восьми фрагментов однонитевой РНК «негативной» полярности, которые в комплексе с вирус-специфическими молекулами нуклеопротеина и белков полимеразного комплекса образуют рибонуклеопротеидные частицы. Как проникновение вирусного генома внутрь клетки, так и морфогенез дочерних вирионов обеспечиваются согласованной работой основных вирусных белков оболочки, главным образом, трансмембранных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) и мембран-ассоциированного матриксного белка Ml, образующего слой непосредственно под липидным бислоем вирусной мембраны. Это делает крайне актуальными работы, направленные на структурные исследования оболочки вириона. До настоящего времени исследование структурно-функциональных особенностей поверхностных гликобелков вируса гриппа остается одной из ключевых задач структурной вирусологии.

Одними из первых протеолитическую обработку вирионов вируса гриппа цистеиновой протеиназой бромелаином провели Бранд и Скеел в 1972 г. [Brand & Skehel (1972) Nat. New Biol. 238:145-147]. Целью этих авторов, а также всех последующих работ была кристаллизация отщепляемых с поверхности вирионов эктодоменов гемагглютинина. В использованных условиях протеолиза «шипы» нейраминидазы полностью разрушались. Субвирусные же частицы, т.е. вирионы, лишённые частично или полностью эктодоменов гликобелков, ранее не изучались.

Принимая во внимание чрезвычайную сложность структурной организации вирионов вируса гриппа, этой макромолекулярной многокомпонентной биологической системы, необходимо было провести более углубленное исследование последействия протеолиза на интактный вирион. Кроме того, субвирусные частицы могли быть использованы как удобная система для выделения и структурного исследования С-концевых сегментов гемагглютинина, остающихся заякоренными в мембрану вириона после удаления эктодоменов гемагглютинина ферментом. Выделение данных сегментов является нетривиальной задачей для структурных исследований в силу своей гидрофобности и наличия пост-трансляционных модификаций.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось определение возможностей протеолиза как инструмента для понимания структурно-функциональных особенностей компонентов оболочки вириона вируса гриппа.

В работе решались следующие задачи:

(1) изучение действия различных протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа с целью подбора оптимального фермента и условий проведения протеолиза;

(2) анализ сохранности вирусной мембраны после проведения протеолитической обработки вирионов;

(3) изучение явления доступности мембран-ассоциированного белка М1 в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликобелков;

(4) анализ первичной структуры С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина и характера его посттрансляционной модификации высшими жирными кислотами.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе впервые подробно изучено действие протеолитических ферментов разных классов на интактные вирионы вируса гриппа. Показана эффективность подобного подхода для изучения особенностей структуры компонентов оболочки вириона. Сложность структурной организации данной макромолекулярной многокомпонентной биологической системы определяет сложность и многофакторность процесса протеолиза. Впервые показано, что протеолиз поверхностных гликобелков вириона приводит к нарушению целостности его мембраны и, как следствие, ограниченному протеолизу мембран-ассоциированного матриксного белка М1. Изучение явления фрагментации белка М1 в составе вириона открывает возможности для изучения топографии его поверхности.

Впервые протеолиз целых вирионов был использован как подход для изучения структурной организации той области гомотримерного «шипа» НА, которая не была закристаллизована и, следовательно, не могла быть изучена методом рентгено-структурного анализа, а именно, области «ножки» шипа. В ходе работы был разработан ряд простых и эффективных методик выделения С-концевых сегментов гемагглютинина вируса гриппа из обработанных ферментом вирионов. На основании данных масс-спектрометрического анализа выделенных сегментов впервые были идентифицированы сайты расщепления гемагглютинина на поверхности вирионов целого ряда штаммов вирусов гриппа А, В и С ферментами разных классов и обнаружено, что локализация сайтов гидролиза определяется, главным образом, стерической доступностью зоны расщепления для молекулы фермента.

Впервые был изучен характер посттрансляционной модификации консервативных остатков цистеина С-концевого фрагмента гемагглютинина высшими жирными кислотами у рекомбинантных штаммов вируса гриппа А, включающих гемагглютинин с одиночными делениями сайтов ацилирования, а также у вирусов гриппа В и С. Таким образом, гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов, была доказана для всех эволюционных типов вируса гриппа.

Результаты, полученные в данной работе, продвигают нас в понимании структурной организации оболочки вириона вируса гриппа, которое, в частности, необходимо для разработки новых эффективных средств защиты от инфекции.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты работы были представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов» (Москва, 2006 и 2008 гг), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007 г), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г), Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (Москва, 2007 г), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007 г.), III Европейском вирусологическом конгрессе (Нюрнберг, Германия, 2007), 20-ом Американском пептидном симпозиуме (Монреаль, Канада, 2007), 29-ом Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, Польша, 2006).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного структурной характеристике гемагглютинина и матриксного белка М1, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (118 ссылок). Работа изложена на 99 страницах и содержит 25 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение протеолиза гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа 1.1. Изучение действия различных протеолитических ферментов на вирион вируса гриппа

На примере вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 был изучен протеолиз эктодоменов поверхностных гликопротеинов гемагглютинина и нейраминидазы в составе интактных вирионов рядом протеолитических ферментов, относящихся к различным классам. Основное внимание было уделено гидролизу гемагглютинина.

Были использованы цистеиновые протеиназы бромелаин и папаин, сериновые протеиназы субтилизин Карлсберг, трипсин и а-химотрипсин, ферментный препарат проназа Е (протеиназа из Streptomyces griseus) и металлопротеиназа термолизин. После проведения реакции гидролиза вирионы отделяли от фермента и эктодоменов поверхностных гликопротеинов высокоскоростным центрифугированием через 20%-ный раствор сахарозы в буферном растворе (0.01 М STE (0.1 М NaCl, 0.01 М Трис-HCl, 0.001М ЭДТА, рН 7.4-7.6) или 0.01 М Трис-HCl, рН 7.4-7.6) и исследовали методом SDS-электрофореза по Лэммли (рис.1.).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MW, кДа

Рис. 1. Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 протеолитическими ферментами (0.25-2 мг/мл). 1 - интактные вирионы; 2-11 - вирионы после 16 ч гидролиза при 37°С: 2 - вирус - бромелаин = 4 : 1,5 мМ |3-меркаптоэтанола; 3 - вирус - бромелаин = 1 : 1, без (3-меркаптоэтанола, без остановки реакции; 4 - вирус - папаин = 2 : 1, 5 мМ |3-меркаптоэтанола; 5 - вирус - проназа = 2 : 1; 6 - вирус - субтилизин Карлсберг = 1 : 2; 7-вирус - трипсин = 1 : 2 в буфере, содержащем ионы кальция, без остановки реакции; 8 -вирус - трипсин = 1 ; 2 в буфере, содержащем EDTA, без остановки реакции; 9 - вирус - а-химотрипсин = 1 : 2; 10 - вирус-термолизин = 1 : 1,без остановки реакции. MW-белковые маркеры для электрофореза.

Было обнаружено, что цистеиновые протеиназы бромелаин и папаин эффективно гидролизовали эктодомены гемагглютинина и нейраминидазы. Ферментный препарат проназа, а также сериновые протеиназы субтилизин Карлсберг и трипсин удаляли поверхностные гликопротеины частично, в то время как а-химотрипсин и металлопротеиназа термолизин их практически не гидролизовали.

При инкубации вирионов с трипсином была обнаружена зависимость результата реакции от наличия в системе хелатирующего агента EDTA: использование трипсина в буфере с хелатором приводило к избирательному отщеплению второго гликопротеина оболочки вириона - нейраминидазы (NA, рис. 1, дорожка 10, а также [Schulze I.T. / Virology, 1970, 42, 890-904]), в то время как НА практически не удалялся; в присутствии ионов кальция наблюдался частичный гидролиз эктодоменов гемагглютинина.

На основании полученных данных для удаления поверхностных гликопротеинов с поверхности вирионов было решено использовать цистеиновую протеиназу бромелаин.

1.2. Изучение протеолиза вирионов вируса гриппа бромелаином. Оптимизация метода получения субвирусных частиц

Для оптимизации условий получения т.н. субвирусных частиц (вирионов, лишенных эктодоменов поверхностных гликопротеинов) процесс протеолиза белков оболочки вирионов был изучен более подробно.

1.2.1. Изучение влияния времени проведения реакции на гидролиз гемагглютинина

Используя в качестве начальных условий постановки ферментативной реакции условия, описанные в работе Бранда и Скеела (вирусные частицы суспендировали в 0,1 M буфере Трис-HCl, pH 7,2, содержащем 50мМ ß-меркаптоэтанола и 0,001 M EDTA, см. [Brand С.М., Skehel J.J. / Nat. New Biol., 1972, 238, 145-147]), был проведен кинетический анализ гидролиза эктодоменов поверхностных гликобелков вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином. Для этого через фиксированные промежутки времени после начала реакции в реакционную смесь добавляли необратимый ингибитор цистеиновых протеиназ Е-64, ультрацентрифугированием выделяли субвирусные частицы из реакционной смеси и проводили электрофоретический анализ (SDS-электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли) полученных образцов.

Полное удаление поверхностных гликопротеинов в данных условиях достигалось уже за Зч после начала гидролиза (рис.2).

1 2 3 4 5 6 МЩкДа

-14,4

Рис. 2. Анализ гидролиза гемагглютинина вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином при концентрации Р-меркаптоэтанола 50 мМ. Электофореграмма отражает белковый состав вирусных частиц, обработанных ферментом в течение различных промежутков времени. Условия проведения реакции: соотношение бромелаин:вирус 1:1, 37°С, остановка реакции 10-5М Е-64. Вирионы инкубировали с ферментом в течение 0.5ч (7), 1.5ч (2), Зч (3), 6ч (4), 18ч (5). б - интактные вирионы; MW - белковые маркеры для электрофореза.

1.2.2. Изучение влияния соотношения фермент:вирус на процесс удаления гемагглютинина

В ряде экспериментов было изучено влияние количества фермента в реакционной смеси на скорость гидролиза поверхностных гликопротеинов.

Для этого была изучена временная зависимость гидролиза гемагглютинина бромелаином в присутствии 50 мМ (З-меркаптоэтанола с поверхности вирионов при различном соотношении фермент:вирусный белок (измеренному по методу Петерсона, см. [Peterson (1977) Anal. Biochem. 83:346-356]). Сравнением интенсивностей полос гемагглютинина на электрофореграммах субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов за одинаковые промежутки времени и различном соотношении вирус:фермент (которое проводили методом денситометрического анализа электрофореграмм), было показано, что снижение количества фермента в 4 раза (вирус:фермент = 4:1) не приводит к существенному увеличению времени, необходимого для полного удаления эктодоменов гемагглютинина.(не представлено).

1.2.3. Изучение влияния типа и концентрации восстанавливающих реагентов на гидролиз гемагглютинина бромелаином

Также было изучено действие бромелаина на вирион в присутствии различных количеств восстанавливающих реагентов двух типов - Р-меркаптоэтанола и дитиотреитола.

В отдельном опыте была изучена активность бромелаина по гидролизу высокоспецифичного хромогенного субстрата цистеиновых протеиназ 01р-Р11е-А1а-рКА в присутствии разных концентраций восстанавливающих реагентов (рис.3, а и 4, а).

Наибольшая активность фермента наблюдалась в присутствии 5 мМ р-меркаптоэтанола. Обработка нативных вирионов бромелаином при этой концентрации восстанавливающего реагента дала возможность получить субвирусные частицы, полностью лишенные эктодоменов гемагглютинина (рис. 3, б) .

Проведением кинетического анализа гидролиза вирионов бромелаином в присутствии двух различных концентраций меркапоэтанола (оптимальной (5мМ), при которой достигается наибольшая активность фермента, и более высокой (50 мМ), которая приводит к значительному снижению активности фермента, но была использована в классических методиках по выделению эктодоменов), было показано, что для полного удаления эктодоменов НА высоко- и низко- активным ферментом при одинаковом соотношении бромелаин/вирус требовались одинаковые промежутки времени: 3 ч. По-видимому, скорость реакции в данной системе определяется не только удельной активностью фермента, но, главным образом, стерической доступностью субстрата.

8 9

X О

ш * ¡

л s

<5 s

0,8 - —J É

0,7 - -Ж

0,6 - -Ж

0,5 - -ш

0,4 - 0,3 - В 1

0,2 -

0,1 -("I Цд

и - 0,5

0 0 мМ р-МЕ ■ 1 мМ р-МЕ □ 5 мМ р-МЕ а 50 мМр-МЕ

1 16,5

время инкубации, ч

НА-NP-

М1- '

MW, kDa

851

iff -97 Шт -45

«¡•в» -20,1 Ш -14,4

(я)

(б)

Рис. 3. (я). Зависимость гидролитической активности бромелаина от времени инкубации с низкомолекулярным субстратом Glp-Phe-Ala-pNA при 37°С при концентрации р-меркаптоэтанола (р-МЕ) в реакционной среде, равной 0, 1, 5 и 50 мМ. Концентрация бромелаина в реакционной среде 0,025 мг/мл. (б) Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в присутствии 5 мМ р-МЕ: / - субвирусные частицы (вирус-бромелаин 2:1, Зч, 37°С); 2 - интактные вирионы; MW - белковые маркеры для электрофореза.

Удельная активность бромелаина, активированного дитиотреитолом, по отношению к низкомолекулярному субстрату оказалась максимальной в присутствии 1 мМ концентрации этого восстанавливающего реагента. Однако проведение реакции в аналогичных условиях с нативными вирионами не привело к желаемому удалению гемагглютинина с поверхности вирионов. Вместо этого на электрофореграмме наблюдалось появление полос легкой и тяжелой цепей гемагглютинина, свидетельствовавшее о восстановлении дисульфидной связи между НА1- и НА2-цепями молекулы (рис.4, б.).

0 мМ DTT

1 MMDTT Ш 2.5 мМ DTT 15 mMDTT

время инкубации, ч

НА. NP-

НА1-

НА2

2 MW, kDa

ь—* » -97

тщ

I l»j -66

-45

«а» -30

mm* -20,1

«•# -14,4

(а) (б)

Рис.4, {а). Зависимость гидролитической активности бромелаина от времени инкубации с низкомолекулярным субстратом Glp-Phe-Ala-pNA при 37°С при концентрации дитиотреитола (DTT) в реакционной среде, равной 0, 1, 5 мМ. Концентрация бромелаина в реакционной среде 0,025 мг/мл. (б). Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в присутствии 1 мМ DTT: 1 - субвирусные частицы (вирус-бромелаин 2:1, 37°С, Зч); 2 - интактные вирионы; MW-белковые маркеры для электрофореза.

В отсутствие восстанавливающих реагентов также наблюдался гидролиз низкомолекулярного субстрата бромелаином, при этом активность фермента сохранялась практически неизменной на протяжении длительного времени (см. рис. 3, а и 4, а) и была ниже, чем активность после активации небольшими концентрациями р-меркаптоэтанола.

Таким образом, на данном этапе работы было изучено действие различных протеолитических ферментов на интактные вирионы вируса гриппа. Были подобраны условия для удаления гликопротеинов с поверхности вирионов бромелаином. Полученные частицы в дальнейшем использовались для изучения локализации сайтов расщепления полипептидной цепи гемагглютинина использованными ферментами (см. п. 3). Однако

оказалось, что присутствие в системе р-меркаптоэтанола, используемого для восстановления тиоловых групп в активном центре фермента, приводит также к удалению части остатков жирных кислот, присоединенных тио-эфирной связью к консервативным остаткам цистеина, расположенных во внутривирионном фрагменте гемагглютинина. Таким образом, для изучения пост-трансляционной модификации С-концевых сегментов гемагглютинина остатками высших жирных кислот требовалось проведение реакции гидролиза в отсутствие восстанавливающих реагентов.

1.2.4. Изучение действия бромелаина на вирионы вируса гриппа в отсутствие

восстанавливающих реагентов

Для получения субвирусных частиц вируса гриппа без изменения (по сравнению с интактными вирионами) количества остатков высших жирных кислот, ацилирующих консервативные остатки цистеина внутривирионных сегментов гемагглютинина, было изучено действие бромелаина на интактные вирионы вируса гриппа в отсутствие восстанавливающих реагентов.

Была изучена временная зависимость гидролиза поверхностных гликопротеинов. В отсутствие восстанавливающих реагентов гидролиз эктодоменов поверхностных гликопротеинов происходил медленнее: при соотношении вирус: фермент 1:1 полное удаление гликобелков происходило за 5-6 ч при 37°С (см. рис. 5, а: полоса на электрофореграмме, соответствующая гемагглютинину, полностью отсутствует на дорожке № 4). При этом на электрофореграммах наблюдалось появление серии дополнительных полос в диапазоне молекулярных весов 9-23 кДа, которые по результатам их анализа методом трипсинолиза в геле с последующим анализом элюированных пептидов методом МАЬП1 времяпролетной масс-спектрометрии были определены как фрагменты белка М1 и обозначены й-{6 (см. рис.1, дорожка 3). Электрофоретическая подвижность каждого фрагмента белка М1 и взаимные интенсивности полос сохранялись постоянными.

Электрофоретический анализ вирионов, обработанных бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов за различные промежутки времени, показал, что фрагменты белка М1, появляются на электрофореграмме в первые 0,5 ч реакции, когда весь НА практически сохранен (рис.5). В течение всего последующего времени доля фрагментированного белка М1, число полос фрагментов и их интенсивность остаются одинаковыми. Следует отметить, что фрагментация матриксного белка не наблюдалась при инкубации суспензии интактных вирионов в отсутствие фермента при 37°С в течение времени проведения реакции. Напротив, выделенный из вирионов «свободный» белок М1

при гораздо более «щадящих» условиях гидролиза бромелаином (вирус:бромелаин=10:1, 5 мин, 37°С) расщеплялся до коротких пептидов, которые не детектировались белковым электрофорезом по Лэммли (не представлено).

1 2 3 4 5 MW, кДа

(а) (б)

Рис. 5. Анализ гидролиза молекул матриксного белка Ml и эктодоменов гемагглютинина в составе вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в отсутствие |3-меркаптоэтанола. Электрофореграмма отражает белковый состав вирусных частиц, обработанных ферментом при 37°С при соотношении реагентов (бромелаин:вирус) 1:1 в течение различных промежутков времени.С, остановка реакции Ю"5М Е-64. Вирионы инкубировали с ферментом в течение 0.5ч (7), 1.5ч (2), Зч (3), 6ч (4). 5 - интактные вирионы; MW-низкомолекулярные пептидные маркеры.

Снижение концентрации фермента закономерно уменьшало разрушение белка Ml. В то время как количество фрагментированного белка Ml в составе субвирусных частиц могло достигать 90% при соотношении вирус-бромелаин, равном 1:1 (рис. 1, дорожка 3), оно было значительно ниже при соотношении 4:1 (не представлено).

Таким образом, была показана возможность получения субвирусных частиц, лишенных поверхностных гликопротеинов, используя обработку интактных вирионов вируса гриппа бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов. Также было обнаружено, что в этих условиях матриксный белок Ml подвергается частичному расщеплению ферментом.

2. Изучение явления доступности мембран-ассоциированного белка Ml в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликобелков

2.1. Электронно-микроскопический анализ вирусных препаратов

Чтобы понять, почему белок Ml, расположенный внутри вириона под липидной мембраной, становится доступным действию фермента, был проведен электронно-микроскопический анализ тонких срезов контрольных интактных вирионов и субвирусных частиц вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34, полученных протеолитической обработкой вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов (рис. 6). Было обнаружено, что липидная мембрана на большей части поверхности субвирусных частиц отсутствовует. На рис.6, а представлена электронная микрофотография интактного вириона штамма A/Puerto Rico/8/34, на которой виден слой «шипов» гликопротеинов (белая стрелка), окружающих нативную вирусную частицу. На микрофотографии, представленной на рис. 6, б, показана типичная субвирусная частица из препарата, полученного обработкой вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента. Видно, что слой гликопротеиновых «шипов» отсутствует. Кроме того, рядом с участками сохранившегося липидного бислоя (указаны белой стрелкой) есть области, где бислой нарушен (черная стрелка).

(а) (б)

Рис. 6. Электронные микрофотографии тонких срезов интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (а) и вирионов, обработанных бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов (б).

могло происходить в процессе проведения гидролиза вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента или/и при последующем центрифугировании препарата сувбвирусных частиц на холоду, которое проводили с целью освобождения обработанных ферментом вирионов от избытка фермента после реакции.

2.2. Изучение влияния условий ингибирования на фрагментацию белка М1

Далее было изучено влияние условий ингибирования гидролиза на фрагментацию белка М1 - действие двух типов ингибиторов цистеиновых протеиназ при двух температурах инкубации реакционной смеси после остановки реакции.

При исследовании временной зависимости удаления НА в присутствии Р-меркаптоэтанола реакцию гидролиза стандартно останавливали ингибитором Е-64 (10 мкМ, инкубация при комнатной температуре 15 мин), а затем до центрифугирования серию образцов хранили при 4 °С (16-18 ч). В отсутствие восстанавливающего реагента в этих условиях в составе субвирусных частиц обнаруживали фрагменты белка М1 (рис. 7, а). Однако если образцы выдерживали с ингибитором 16-18 ч при температуре 37 °С, то фрагменты белка М1 практически отсутствовали. В отличие от Е-64, ЩСЬ (100 мкМ) не подавлял фрагментацию белка М1 даже при повышенной температуре (рис. 7, б). При этом оба ингибитора останавливали гидролиз поверхностного НА за короткие промежутки времени при 20 °С.

«О 12 № 1 2 3 4 5

Рис. 7. Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов вируса гриппа бромелаином в отсутствие p-меркаптоэтанола при разных условиях остановки реакции: соотношение вирус : бромелаин = 2:1 (га/т), (а) - 3 ч гидролиза при 37 °С, остановка реакции Е-64 (10 мкМ) в течение: 15 мин при 20 °С, затем 16 ч при 4 °С (1) или 16 ч при 37 °С (2); (б) - после «нулевой» точки (5 мин гидролиза при 20 °С) инкубация в присутствии HgCb (100 мкМ, 1, 2) или - Е-64 (10 мкМ, 3, 4) в течение 16 ч при 37 °С (1, 3) или 15 мин при 20 °С, затем 16 ч при 4 °С (2, 4); 5 - интактные вирионы.

Таким образом, неполное ингибирование бромелаина в отсутствие в инкубационной среде восстанавливающего реагента при стандарно используемой процедуре остановки реакции (10 мкМ Е-64, инкубация при комнатной температуре 15 мин), является одним из факторов, влияющих на фрагментацию белка Ml в составе вириона.

3. Применение протеолиза вирионов для анализа структуры заякоренного в мембрану вириона С-концевого сегмента гемагглютинина

3.1. Определение сайтов гидролиза гемагглютинина/гемагглютинин-эстеразы в составе вирионов вирусов гриппа А, В, С протеолитическими ферментами

Используя масс-спектрометрический анализ хлороформ-метанольных экстрактов С-концевых фрагментов гемагглютинина, выделенных из субвирусных частиц, были определены сайты расщепления полипептидной цепи гемагглютинина вируса гриппа бромелаином, папаином, субтилизином Карлсберг, трипсином и ферментным препаратом проназой.Обнаружено, что бромелаин разрезает полипептидную цепь малой цепи гемагглютинина (НАг) штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) между Lys 177 и Leul78. Экстрагированный фрагмент при этом представляет собой ацилированный пептид НА2-(178-222) (рис. 8 а, в). Иногда детектировались минорные пики пептида HАг—( 176—222) - сайт гидролиза после остатка Gly 175, который был также определен в одной из ранних работ [Dopheide & Ward (1981) J. Gen. Virol. 52:367-370]. Цистеиновая протеиназа папаин, гидролизовала гемагглютинин вблизи мембраны вириона аналогично бромелаину. Сходные точки гидролиза (после остатка Lysl77) были обнаружены после частичного удаления «шипов» гемагглютинина трипсином, а также ферментным препаратом проназой (см. схему в на рис. 8, масс-спектры не представлены).

Из вирионов с частично удаленными субтилизином Карлсберг шипами были экстрагированы пептиды НА2-(177-222) и НАг-(179-222) (рис. 8, б), соответствующие расщеплению НА2-цепи гемагглютинина после остатков Lys 178 (основной сайт) и Val 176 (минорный сайт) (рис. 8, в).

1 Ihtchcmuhoctu у .е.

HAr( 178-222)+ 3Pal

HAr(17S-222) + 2Pal/lSlr

(f'J

IIA,-( 179-222)+ 3Pal

НА2Ч174-222) + 2Ра1/1 Sir I HA,-(l77-222) + 3Pal

HAr(l77-222) + 2Pal/lStr

£_______________________

62«) m/z

5(KX) 5400

(it) cyf>Tll.niijiiH

^177 '179

NHr... DG VKL ESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI-COCW

браме/шин, иапагш. rpn/icmi, промаха ^

Рис. 8. MALDI-TOF-MC-анализ С-концевых сегментов HAi, экстрагированных из вирионов A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), обработанных: бромелаином (а), субтилизином Карлсберг (б). Массы молекулярных ионов (m/z) соотнесены со структурой ацилированных пептидов - С-концевых сегментов НА2; Pal - пальмитат, Str - стеарат; (в) - схема аминокислотной последовательности С-концевого сегмента НАг-цепи вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34, включающего трансмембранный домен (подчеркнуто), с указанием консервативных сайтов ацилирования и сайтов протеолиза; нумерация остатков по НАг-цепи.

Аминокислотная последовательность гидролизуемого участка цепи НА2 хорошо соответствует специфичности использованных протеиназ: в положении Р2 у гидролизуемой бромелаином связи находится остаток гидрофобной аминокислоты, а в Р1 - остаток лизина. У всех детектированных сайтов гидролиза субтилизином Карлсберг расщепляемая связь содержит гидрофобный остаток в положении Р1 (лейцин как основной сайт и валин как минорный, см. рис. 8, в). На поверхности вириона данный участок входит в состав «ножки» тримерного «шипа» гемагглютинина (~10 аминокислотных остатков над мембраной), 3D-структура которой не была определена методом рентгеноструктурного анализа. По-видимому, эта зона является наиболее стерически доступной для молекулы фермента.

Используя тот же подход, у ряда других штаммов вирусов гриппа А и В были определены сайты гидролиза «шипов» гемагглютинина двумя ферментами, для которых было обнаружено различие в их специфичности по отношению к гемагглютинину вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34, - бромелаином и субтилизином. В отдельном эксперименте было также изучено расщепление бромелаином гомологичного гемагглютинину белка вируса гриппа С - гемагглютинин-эстеразы-«фьюжен» (HEF),

совмещающего функции гемагглютинина и 9-О-ацетил-эстеразы (фермента, разрушающего рецептор вируса гриппа С). Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Сайты расщепления НА/НЕБ в составе вирионов вирусов гриппа А, В и С бромелаином и субтилизином, идентифицированные методом МА1_П1-ТОР масс-спектрометрии.

№ № Штамм вируса гриппа Сайты расщепления белков HA/HEF*

Бромелаин Субтилизин

1 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) DGVKJ.LES GVKLJ.ESM VDGVJ.KLE

2 A/USSR/90/77 (H1N1) DGVKJ.LES GVKLjESM IDGVjKLE

3 A/Duck/Alberta/35/76 (H1N1) DGVKJ.LES GVKLJ.ESM IDGVIKLE

4 A/Pintail/Primorie/695/76 (H2N3) GIKLJ.SNM KG1KJ.LSN GIKLJ.SNM

5 A/Leningrad/134/17/57 ca (H2N2)** GVKLjSSM KGVK1LSS GVKLjSSM

6 NIBRG-14*** SGVKJLES GVKLjESI ISGV1KLE

7 A/Duck/Primorie/2621 /01 (H5N2) SGVKJ.LES GVKLJ.ESI ISGVjKLE

8 A/FPV/Rostock/34 (H7N1) DPVKjLSS PVKLiSSG

9 A/Swine/Hong Kong/9/98 (H9N2) EGIKJ.LES IKLEjSEG GIKLjESE

10 A/Teal/Primorie/3631/02 (H9N2) EGVKJ.LES IKLEJSEG Нет данных

11 A/Duck/England/1/56 (Hl 1N6) EGVKJ.LDS GVKLJ.DSS

12 B/Hong Kong/8/73 ASLNJ.DDG AASLJ.NDD

13 B/Victoria/2/87 ASLNJ.DDG Нет данных

14 C/Johannesburg/1/66 PPLDJ.TKI IDLQISDP Нет данных

*Сайты расщепления указаны в формате Р4РЗР2Р1 |РГР2'РЗ\ Знак <ф> обозначает гидролиз пептидной связи. Первыми указаны сайты, определенные по самым интенсивным пикам на масс-спектрограммах; дополнительные сайты определены по пикам, высота которых больше или равна Уг высоты основного пика.

**Pi-P4 последовательности близкородственного штамма A/Singapore/1/57 (H2N2).

***Реассортантный штамм: НА и NA штамма A/Viet Nam/1194/04 (H5N1); остальные белки штамма A/Puerto Rico/8/34.

Таким образом, расщепление гемагглютинина протеолитическими ферментами у всех изученных штаммов вируса гриппа А также происходит в области «ножки шипа» (рис. 9), преимущественно после остатков лизина в случае гидролиза бромелаином и после остатков лейцина и валина в случае субтилизина Карлсберг. Некоторые вариации (например, гидролиз

бромелаином после лейцина в случае штаммов Н2-подтипа гемагглютинина: А/Ьеп^гасШ 34/17/57 и А/Рш1аП/Рптопе/695/76, или после глутаминовой кислоты в случае штаммов подтипа Н9 А/5шше/Нопз Коп§/9/98 и А/Теа1/Рптопе/3631/02) указывают, вероятно, на специфические особенности структуры молекулы гемагглютинина в этой области. Это открывает перспективы для использования данного подхода («зондирования» различными ферментами) в исследовании тонкой структуры поверхностных гликобелков вирусов разных антигенных подтипов, в том числе тех, для которых отсутствуют данные рентгеноструктурного анализа, а также актуальных вирусных штаммов. Структурные особенности и свойства относительной лабильности «ножки шипа» гемагглютинина у разных штаммов, скорее всего, несут и функциональную нагрузку, т.е. могут влиять на способность вируса эффективно связываться с поверхностью плазматической мембраны клетки-хозяина и/или участвовать в перестройках молекулы гемагглютинина, происходящих при функционально активном кислом рН в клеточной эндосоме и обеспечивающих проникновения вирусного генома в цитоплазму.

Рис. 9. Схема, демонстрирующая расположение тримерного «шипа» НА в липидной мембране вириона (адаптировано из [Harris et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:1912319127]). Обозначены: эктодомен, для которого есть данные РСА и С-концевой фрагмент, заякоренный в липидной мембране вириона. Сайты гидролиза ферментами бромелаином и субтилизином локализованы в «ножке шипа». Также схематически изображены глобулы белка М1, контактирующего с С-концевым фрагментом НА.

У исследованных штаммов вируса гриппа В - В/Ую1опа/2/87 и B/Hong Коп§/8/73 - и у вируса гриппа С (штамм СА1о1тппезЬиг£/1/66) сайты гидролиза бромелаином отличаются от сайтов гидролиза бромелаином у всех исследованных штаммов вируса гриппа А и различаются между собой (см. таблицу 1): расщепление происходит после остатка аспарагина (у вируса гриппа В), либо аспарагиновой кислоты и глутамина (вирус гриппа С).

Тример НА

Расщепление после остатков аспарагина и аспарагиновой кислоты не характерно для цистеиновых протеиназ семейства С1 клана СА. Однако, такая специфичность была обнаружена ранее у выделенных из бактерий цистеиновых протеиназ, относящихся к другому клану CD цистеиновых протеиназ ([Руденская Г.Н., Пупов Д.В. (2008) Биохимия 73(1): 3-17].

Основной сайт гидролиза субтилизином Карлсберг, определенный для гемагглютинина вируса B/Hong Kong/8/73, как и в случае вирусов гриппа А, располагается в непосредственной близости от связи, гидролизуемой бромелаином (см. таблицу 1 и рис. 9).

Полученные данные указывают на то, что определяющим фактором гидролиза молекулы гемагглютинина всех исследованных штаммов вируса гриппа А, а также вирусов гриппа В и белка HEF вируса гриппа С протеолитическими ферментами является стерическая доступность зоны гидролиза (максимальная, по-видимому, в области «ножки шипа»). Последовательность остатков как таковая не имеет принципиального значения, хотя в пределах этого небольшого участка ферменты действуют в целом согласно своей субстратной специфичности, которая согласуется с литературными данными [Choe et al. (2006)/. Biol. Chem. 281:12824-12831; Ruanetal. (2008)Biochemistry 47:6628-6636].

3.2. Изучение гетерогенности ацилирования С-коицевого фрагмента гемагглютинина остатками высших жирных кислот

3.2.1. Ацилирование гемагглютининов с делениями сайтов ацилирования

Согласно данным о первичной структуре, С-концевой сегмент гемагглютинина содержит три консервативных остатка цистеина, два из которых расположены в цитоплазматическом домене и один - на границе цитоплазматического и трансмембранного доменов (см. рис. 10, б). В С-концевом сегменте НА вируса гриппа В таких остатков два, и оба расположены в цитоплазматическом домене. У гомологичного белка HEF вируса гриппа С единственный консервативный остаток цистеина расположен на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов.

Известно, что три консервативных остатка цистеина внутривирионного фрагмента гемагглютинина вируса гриппа А ацилированы остатками высших жирных кислот, главным образом, пальмитиновой (гексадекановой). Ранее в нашей лаборатории было обнаружено методом масс-спектрометрического анализа, что к остаткам цистеина могут быть присоединены также остатки стеариновой (октадекановой) кислоты. Для одного штамма вируса гриппа A/FPV/Weybridge/34 (H7N7), для которого была обнаружена наибольшая доля

стеаратов (33%), удалось доказать преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, расположенному на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов гемагглютинина. Была высказана гипотеза о том, что данное свойство характерно и для других штаммов вируса гриппа типа А.

В настоящей работе при использовании вируса гриппа штамма A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и полученных на его основе рекомбинантных штаммов Acl, Ас2 и АсЗ [Wagner et al. (2005) J. Virol. 79:6449-6458], была проведена окончательная проверка данной гипотезы. Рекомбинанты включали молекулы гемагглютинина с одиночными заменами консервативных остатков цистеина на серии (551, 559 или 562, соответственно, см. рис. 10, б), и таким образом были лишены одного из трех сайтов ацилирования.

На основании анализа масс-спектрограмм С-концевых сегментов гемагглютинина, экстрагированных в органическую фазу смесью органических растворителей хлороформ-метанол из субвирусных частиц, полученных в отсутствие восстанавливающего реагента (рис. 10), была рассчитана доля пальмитатов и стеаратов у дикого и рекомбинантных штаммов. У дикого штамма доля стеаратов составляет 30%, т.е. одну треть общего количества жирных кислот, у рекомбинантов АсЗ и Ас2, у которых отсутствует один из «цитоплазматических» цистеинов, она повысилась почти до 50%, а у рекомбинанта Acl, у которого отсутствует «трансмембранный» цистеин, наоборот, упала почти до 0 (таблица 2). Таким образом, для гемагглютинина вируса гриппа А было получено убедительное доказательство приоритетной локализации стеарата на цистеине, расположенном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов.

(б) бромелаин |

♦ 55/ 559 562

И'/ Ш2-...Р\'КУ 1^СУКРУ'ИАУгеГСА$СГЬЬЬА1АМС1.УТ1СУК%С^тСТ1С1-СООН

■V Л' л

I I 1

мутанты: Ас1 Ас2 АсЗ

Рис. 10. Масс-спектрограммы экстрактов С-концевых сегментов гемагглютинина, выделенных из субвирусных частиц вируса А/РРУЛ1оз[оск/34 и его мутантов Ас1, Ас2, АсЗ (а). Указано число остатков жирных кислот, присоединенных к выделенному пептиду. Ра1 -пальмитат, Бй - стеарат; (б) - схема аминокислотной последовательности С-концевой области НА, включающей трансмембранный домен (подчеркнуто), и внутривирионный участок, с указанием места расщепления бромелаином и делеций сайтов ацилирования у мутантов Ас1, Ас2 и АсЗ (остатки Суэ551, Суэ 559 или Суэ 562, соответственно, заменены на серин).

3.2.2. Ацилирование гемагглютинина вируса гриппа В и гемагглютинин-эстеразы вируса гриппа С

Также были выделены и охарактеризованы масс-спектрометрически С-концевые фрагменты гемагглютинина вируса гриппа В и гомологичного белка гемагглютинин-эстеразы вируса гриппа С. Полученные данные о характере ацилирования хорошо коррелируют с общей идеей о локализации стеарата на трансмембранном цистеине: в случае гемагглютинина вируса гриппа В, у которого трансмембранный консервативный цистеин отсутствует, практически отсутствуют стеараты, их всего 2 %. С другой стороны,

единственный консервативный остаток цистеина гемагглютинин-эстеразы вируса гриппа С, который локализован на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов, ацшшрован преимущественно стеаратами (таблица 2).

Таблица 2. Анализ ацилирования гемагглютинина/гемагглютинин-эстеразы у вирусов гриппа А, В и С.

Тип (Подтип) Штамм Аминокислотные остатки (а. к.)* Жирные кислоты (%)**

Ра! 81еаг

А (Н71Ч1) А/РРУ/ЯозЮскШ НА 520-563 69.9±0.4 30.1±0.4

РРУ/АС1 НА 520-563 96.0±1.6 4.0±1.6

РРУ/АС2 НА 520-563 54.0±0.4 46.0±0.4

РРУ/АСЗ НА 520-563 54.0±1.2 46.0±1.2

В ВАЧаопа/2/87 НА 541-585 97.6±0.9 2.4±0.9

С СОоЬаппезЬи^/1 /66 НЕЕ 616-655 12.Ш.З 87.9±1.3

■"Нумерация согласно нумерации а. к. остатков в молекулах НА/НЕР соответствующего штамма.

"""Результаты представлены в виде: среднее значение ± стандартное отклонение (данные получены для 2 выращиваний вируса, для каждого из которых было проведено 2-3 обработки ферментом и проанализировано 4-5 масс-спектров после каждой обработки).

Таким образом, было показано, что у всех типов вируса гриппа остаток стеарата может быть связан исключительно с консервативным остатком цистеина, локализованном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов в С-концевом сегменте гемагглютинина.

выводы

1. Предложено использование протеолиза в качестве нового подхода для изучения структурной организации компонентов оболочки вириона вируса гриппа. Изучено действие ряда сериновых, цистеиновых и металлопротеиназ на вирион вируса гриппа и подобраны оптимальные условия протеолиза поверхностных гликобелков бромелаином.

2. Изучено последействие протеолиза на интактный вирион вируса гриппа. Выявлено нарушение целостности липидного бислоя вирусной мембраны при обработке вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента.

3. Обнаружено явление доступности мембран-ассоциированного матриксного белка М1 ограниченному протеолизу бромелаином в составе вирионов при удалении поверхностных гликобелков. Выяснено, что белок М1 подвергается гидролизу бромелаином из-за нарушения целостности липидной мембраны вириона. Проведен анализ первичной структуры С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина. Впервые идентифицированы сайты расщепления гемагглютинина на поверхности вирионов вирусов гриппа А, В и С протеолитическими ферментами разных классов. Обнаружено, что локализация сайтов гидролиза определяется главным образом стерической доступностью основания «шипа» для молекулы фермента.

5. Изучен характер пост-трансляционной модификации консервативных остатков цистеина С-концевого фрагмента легкой цепи гемагглютинина высшими жирными кислотами у вирусов гриппа А, В и С. Подтверждена гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов, для всех эволюционных типов вируса гриппа.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Смирнова Ю.А., Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Баратова Л.А. Вирион вируса гриппа как субстрат протеолитических ферментов. Биоорганическая химия, 2008, т. 34, № 3, с. 409-415.

2. Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Poiyakov V.Y., Smirnova Yu.A., Fedorova N.V., Baratova L.A. Influenza A virus Ml protein structure probed by proteolysis with bromelain. Protein & Peptide Letters, 2008, v. 15, p. 922-930.

3. Smirnova Ju.A., Kordyukova L.V., Fedorova N.V., Baratova L.A., Serebryakova M.V., Veit M. Influenza virus membrane proteome structural investigation based on enzyme proteolysis and MALDI-TOF mass spectrometry. / Proceedings of the 3-rd Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB), Moscow (Russia), July 27-31, 2007, p. 277-278.Smirnova Yu.A., Fedorova N.V., Ksenofontov A.L., Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Baratova L.A., Vaskovsky B.V. Isolation of the Influenza A HA2 C-terminal Segment by Combination of Nonionic Detergents. / Proceedings of the 20th American Peptide Symposium, Montreal (Canada), June 26-30, 2007/, American Peptide Society (2008).Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Smirnova Y.A., Ovchinnikova T.V., Lysogorskaya E.N., Filippova I.Y., Baratova L.A. Influenza A virus particles as a substrate for bromelain: revealing of the matrix Ml protein accessibility for limited proteolysis. Peptides-2006 /Proceedings of the 29-th European Peptide Symposium, September 3-8,2006, Gdansk, Poland / Kenes International, Tel-Aviv, Israel (2007), Paper 0111.

6. Смирнова Ю.А. Изучение влияния p-меркаптоэтанола и дитиотреитола на активацию бромелаина. / Тезисы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006», серия «Химия», т.2, c.49.L.V. Kordyukova, M.V. Serebryakova, Y.A. Smirnova, T.V. Ovchinnikova, E.N. Lysogorskaya, I.Y. Filippova, L.A. Baratova. Influenza A virus particles as a substrate for bromelain. / Abstracts of the 29-th European Peptide Symposium, September 3-8, 2006 , Gdansk , Poland / J. Peptide Sci. (2006), v. 12 (Issue SI), p.168, Th255 Смирнова Ю.А., Кордюкова Л.В., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Баратова Л.А. Вирион вируса гриппа как субстрат протеолитических ферментов. / Тезисы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов» , г. Москва, 23-25 апреля 2007 г., с. 93.

9. Smirnova Yu.A., Fedorova N.V., Serebryakova M.V., Kordyukova L.V., Ksenofontov A.L., Radyukhin V.A., Vaskovsky B.V., Baratova L.A. Isolation of the Influenza A HA2 C-terminal Segment by Combination of Nonionic Detergents. Abstracts of the 20th American Peptide Symposium, Montreal (Canada), June 26-30, 2007/, Biopolymers (Peptide Science),

2007, v. 88, № 4, p. 589.Larisa Kordyukova, Marina Serebryakova, Yulia Smirnova, Michael Veit. Acylation of Influenza Virus Hemagglutinin analyzed by MALDI-TOF MS. / Abstract of the 3rd European Virology Congress, Nuremberg (Germany), September 1-5, 2007, p. 47, SAS008.Julia Smirnova, Marina Serebryakova, Natalya Fedorova, Victor Radyukhin, Larisa Kordyukova. Influenza virus НА/MI interactions: do acyl chains play role? / Abstract of the 3rd European Virology Congress, Nuremberg (Germany), September 1-5,2007, p. 55, SAS038.

12. Смирнова Ю.А., Федорова H.B., Ксенофонтов А.Л., Серебрякова М.В., Кордюкова Л.В., Баратова Л.А. Выделение С-концевого сегмента гемагглютинина вируса гриппа типа А комбинацией неионных детергентов./ Тезисы III Российского симпозиума «Белки и пептиды», г. Пущино Московской обл. (Россия), 16-21 сентября 2007 г., с. 19.

13. Смирнова Ю.А., Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Баратова Л.А., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н. Изучение протеолиза гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34./ Тезисы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008», серия «Химия», с. 300.

14. Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Veit М., Смирнова Ю.А., Кропоткина Е.А., Баратова Л.А. Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для изучения ацилирования гемагглютинина вируса гриппа. /Тезисы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов./ г. Новосибирск, Россия, 11-15 мая 2008 г./ с. 266, № 459.

Заказ № 105-а/10/09 Подписано в печать 20.10.2009 Тираж 140 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровнчок", тел. (495) 649-83-30 У;, www.cfr.ru ; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Смирнова, Юлия Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Список сокращений

1. Структурная характеристика гемагглютинина и матриксного белка

Ml вируса гриппа (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Классификация вирусов гриппа

1.2. Структурная организация вириона вируса гриппа

1.3. Структура поверхностного гликопротеина гемагглютинина

1.3.1. Первичная структура. Сайт протеолитической активации гемагглютинина

1.3.1.1. Действие трипсин-подобных эндопротеаз

1.3.1.2. Действие субтилизин-подобных эндопротеаз

1.3.2. Кристаллографический анализ эктодоменов гемагглютинина

1.3.2.1. Получение эктодоменов гемагглютинина протеолитической обработкой вирионов

1.3.2.2. Пространственная структура гемагглютинина вируса гриппа А при нейтральном рН

Общая характеристика

Рецептор-связывающий сайт гемагглютинина

Антигенные сайты гемагглютинина

Пространственная структура сайта расщепления предшественника гемагглютинина

Анализ специфичности связывания эктодоменов гемагглютинина вируса гриппа с рецепторами клеток человека и птиц

Классификация антигенных подтипов гемагглютинина

1.3.2.3. Перестройка гемагглютинина вируса гриппа А при функционально-активном рН

1.3.2.4. Пространственные структуры гемагглютинина вируса гриппа В и гемагглютинин-эстеразы вируса гриппа С

Гемагглютинин вируса гриппа В

Гемагглютинин-эстераза вируса гриппа С

1.3.3. Структурная характеристика С-концевого фрагмента гемагглютинина. Ацилирование консервативных остатков цистеина

1.4. Структура матриксного белка Ml

Введение диссертация по химии, на тему "Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа"

Вирус гриппа является серьёзным патогеном человека, который на протяжении XX столетия вызвал три пандемии [1, 2]. Каждая из этих пандемий связана с обширной заболеваемостью, серьезными социальными проблемами, большими экономическими потерями и, в случае пандемии сезона 1918-1919, высокой смертностью [3, 4]. Однако, общее количество случаев заболеваемости и смертности на протяжении периодов между пандемиями на самом деле превосходит эти показатели для пандемий. Различают три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирус гриппа типа А представляет наибольшую угрозу здоровью населения. Пандемии XX века были вызваны штаммами вируса гриппа типа А подтипов H1N1 (1918), H2N2 (1957) и H3N2 (1968) [1].

В настоящее время, начиная с июня-июля 2009 г. началась пандемия нового штамма антигенно родственного вирусу гриппа свиньи (подтип H1N1). Пандемический штамм вируса возникает намного реже эпидемических штаммов, в результате комбинирования генетического материала вируса гриппа типа А человека с генами вирусов гриппа птиц и/или млекопитающих, в результате чего образуется новый штамм, против которого у человека нет естественного иммунитета. Это приводит к началу пандемии — эпидемии в мировом масштабе. При этом имеется достаточно высокая вероятность появления в ближайшем будущем новых высоко патогенных штаммов вируса. Именно высокий пандемический потенциал сделал вирус гриппа объектом углубленных исследований.

Молекулярная структура оболочечных вирусов, к которым относится вирус гриппа, представляет собой яркий пример совершеннейших макромолекулярных комплексов, формирование которых достигается посредством высокой специфичности взаимодействия всех структурных компонентов вириона. Как проникновение вирусного генома внутрь клетки, так и морфогенез дочерних вирионов обеспечиваются согласованной работой основных вирусных белков оболочки вириона, главным образом, трансмембранных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) и мембран-ассоциированного матриксного белка Ml, образующего слой непосредственно под липидным бислоем вирусной мембраны. Это делает крайне актуальными работы, направленные на структурные исследования оболочки вириона. До настоящего времени исследование структурно-функциональных особенностей поверхностных гликобелков вируса гриппа остается одной из ключевых задач структурной вирусологии.

Впервые использование вирионов вируса гриппа А как субстрата для действия протеолитического фермента бромелаина датировано 1970 годом в работе Компанса [5]. Позже этот прием был использован Брандом и Скеелом [6]. Целью этих авторов была последующая кристаллизация отщепляемых с поверхности вириона эктодоменов гемагглютинина. В использованных условиях протеолиза «шипы» нейраминидазы, по-видимому, полностью разрушались. Субвирусные же частицы, т.е. вирионы, лишённые частично или полностью эктодоменов гликобелков, ранее детально не изучались.

Принимая во внимание чрезвычайную сложность структурной организации вирионов вируса гриппа, необходимо было провести более углубленное исследование последействия протеолиза на интактный вирион. Кроме того, субвирусные частицы могли быть использованы как удобная система для выделения и структурного исследования С-концевых сегментов гемагглютинина, остающихся заякоренными в мембрану вириона после удаления эктодоменов гемагглютинина ферментом. Эти сегменты являются нетривиальной задачей для структурных исследований в силу своей гидрофобности и наличия пост-трансляционных модификаций.

Основной целью данной работы являлось определение возможностей протеолиза как инструмента для понимания структурно-функциональных особенностей компонентов оболочки вириона вируса гриппа.

В работе решались следующие задачи:

• изучение действия различных протеолитических ферментов на вирион вируса гриппа с целью подбора оптимального фермента и условий проведения протеолиза;

• анализ сохранности вирусной мембраны после проведения протеолитической обработки вирионов ;

• изучение явления доступности мембран-ассоциированного белка Ml в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликобелков;

• анализ первичной структуры С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина и характера его посттрансляционной модификации высшими жирными кислотами.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе впервые подробно изучено действие протеолитических ферментов разных классов на интактные вирионы вируса гриппа. Показана эффективность подобного подхода для изучения особенностей структуры компонентов оболочки вириона. Сложность структурной организации данной макромолекулярной многокомпонентной биологической системы определяет сложность и многофакторность процесса протеолиза. Впервые показано, что протеолиз поверхностных гликобелков вириона приводит к нарушению целостности его мембраны и, как следствие, ограниченному протеолизу мембран-ассоциированного матриксного белка Ml. Изучение явления фрагментации белка Ml в составе вириона открывает возможности для изучения топографии его поверхности.

Впервые был изучен характер посттрансляционной модификации консервативных остатков цистеина С-концевого фрагмента гемагглютинина высшими жирными кислотами у рекомбинантных штаммов вируса гриппа А, включающих гемагглютинин с одиночными делециями сайтов ацилирования, а также у вирусов гриппа В и С. Таким образом, гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов, была доказана для всех эволюционных типов вируса гриппа.

Список сокращений

БСА — бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

3D- трехмерный (в ряде случаев использовано для сокращенного обозначения простанственной структуры)

ЗМЕ - Р-меркаптоэтанол DMF - диметилформамид DTT - дитиотреитол Glp - пироглутамил

НА - гемагглютинин вирусов гриппа А и В

HEF-гемагглютинин-этераза вируса гриипа С

NA - нейраминидаза вирусов гриппа А и В

PMSF - фенилметилсульфонилхлорид

PSA - персульфат аммония pNA - и-нитроанилид

SDS - додецилсульфат натрия

STE - буферный раствор Трис-HCl, содержащий ЭДТА и NaCl ТЕ - буферный раствор Трис-HCl, содержащий ЭДТА. TEMED - N, N, Ы',Ы'-тетраметилэтилендиамин Ингибиторы:

Е-64 - Ь-А«ранс-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино)бутан PMSF - фенилметилсульфонилфторид

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

3. Обнаружено явление доступности мембран-ассоциированного матриксного белка Ml ограниченному протеолизу бромелаином в составе вирионов при удалении поверхностных гликобелков. Выяснено, что белок Ml подвергается гидролизу бромелаином из-за нарушения целостности липидной мембраны вириона.

4. Проведен анализ первичной структуры С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина. Впервые идентифицированы сайты расщепления гемагглютинина на поверхности вирионов вирусов гриппа А, В и С протеолитическими ферментами разных классов. Обнаружено, что локализация сайтов гидролиза определяется главным образом стерической доступностью основания «шипа» для молекулы фермента.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям, сотрудникам НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ доктору хим. наук Баратовой JT.A. и канд. биол. наук Кордюковой Л.В. за неоценимую помощь и руководство на протяжении всего времени выполнения и написания диссертационной работы.

Автор благодарит д.б.н. Маркушина С.Г. (ГУ ИВС имени И.И. Мечникова РАМН), академика РАМН, доктора мед. наук, проф. Каверина Н.В. (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН), Кропоткину Е.А. и д.б.н. Гамбарян А.С. (ГУ ИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН), а также докт. М. Файта (Berlin Free University) за предоставление препаратов вируса, зав. отделом электронной микроскопии НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского, д.б.н., проф. Полякова В.Ю. за неоценимую помощь в проведении электронно-микроскопических исследований, к.х.н. Серебрякову М.В. (ФГУ НИИ ФХМ Росздрава) за проведение масс-спектрометрического анализа образцов и сотрудников лаборатории белков растений отдела функциональной биохимии биополимеров (д.б.н. Дунаевского Я.Е., д.б.н. Белозерского М.А., к.б.н. Элпидину Е.Н.) за предоставление оборудования для проведения денситометрического анализа электрофореграмм.

Автор очень признателен сотрудникам лаборатории химии белка кафедры Химии природных соединений Химического факультета МГУ д.х.н. Филипповой И.Ю., к.х.н. Лысогорской Е.Н., к.х.н. Баландиной Г.Н., к.х.н Бачевой А.В., Семашко Т.А. за постоянную поддержку и полезные методические советы в ходе выполнения работы, к.х.н. Оксенойт Е. С. за синтез субстрата для тестирования гидролитической активности бромелаина.

Автор также очень благодарен всем сотрудникам отдела хроматографии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского за обучение и полезные советы в ходе выполнения экспериментальной работы, к.х.н. Гоптарь И.А., Аникиной О.М. и к.х.н. Семёновой С.А., и всем, оказавшим поддержку и помощь в процессе выполнения диссертационной работы.

1.5. Заключение

Из обзора литературы следует, что к настоящему времени имеются кристаллографические данные о структуре водорастворимых фрагментов гликопротеина гемагглютинина многих штаммов вирусов гриппа типов А и В, а также белка гемагглютинин-эстеразы вируса гриппа С. Также имеются данные рентгеноструктурного анализа для фрагмента (две трети молекулы) матриксного белка Ml.

С другой стороны, гораздо меньше ясности и возможных подходов к изучению заякоренного в мембрану вириона С-концевого сегмента гемагглютинина, а также для определения роли гибкой «ножки шипа» гемагглютинина в выполнении его функции. Для верной оценки значимости ацилирования остатков цистеина в биологии вируса гриппа необходимыми являются данные о характере и степени ацилирования С-концевого сегмента гемагглютинина, а также о распределении модифицирующих остатков (т.е. о характере ацилирования каждого из остатков цистеина). Адекватного подхода для структурного исследования ацилированния гемагглютинина на молекулярном уровне до недавнего времени в мировой науке не было. Первые появившиеся работы, которые происходят из нашей лаборатории, наметили возможность таких исследований с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.

К настоящему времени получение структурной информации для каждого из мембранных и мембран-ассоциированных белков в составе оболочки вириона представляет интерес для понимания их функций на различных этапах жизненного цикла вируса.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Изучение протеолиза гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа

2.1.1. Действие различных протеолитических ферментов на вирион вируса гриппа

На первом этапе работы были изучены возможность и условия получения субвирусных частиц обработкой вирионов вируса гриппа рядом протеолитических ферментов.

На примере вируса гриппа штамма штамма A/Puerto Rico/8/34 был изучен протеолиз эктодоменов поверхностных гликопротеинов гемагглютинина и нейраминидазы в составе интактных вирионов протеиназами, относящимися к различным классам и различной специфичностю. Основное внимание было уделено гидролизу гемагглютинина.

Были использованы цистеиновые протеиназы бромелаин и папаин, сериновые протеиназы субтилизин Карлсберг, трипсин и а-химотрипсин, ферментный препарат проназа Е (протеиназа из Streptomyces griseus) и металлопротеиназа термолизин. После проведения реакции гидролиза вирионы отделяли от фермента и эктодоменов поверхностных гликопротеинов высокоскоростным центрифугированием через 20 %-ный раствор сахарозы в буферном растворе (0.01 М STE(0.1 MNaCl, 0.01 М Трис-HCl, 0.001М ЭДТА, рН 7.4-7.6) или 0.01 М Трис-HCl, рН 7.4-7.6) и исследовали методом SDS-электрофореза по Лэммли (рис.16.).

Рис. 16. Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 протеолитическими ферментами (0.25-2 мг/мл). 1 - интактные вирионы; 2-11 - вирионы после 16 ч гидролиза при 37 °С: 2 - вирус : бромелаин = 4 : 1,5 мМ Р-меркаптоэтанола; 3 - вирус : бромелаин = I : 1, без p-меркаптоэтанола, без остановки реакции; 4 - вирус : папаин = 2:1,5 мМ р-меркаптоэтанола; 5 - вирус : проназа = 2 : 1; 6 - вирус : субтилизин Карлсберг =1 : 2; 7 -вирус : трипсин = 1 : 2 в буфере, содержащем ионы кальция, без остановки реакции; 8 -вирус : трипсин = 1 : 2 в буфере, содержащем ЭДТА, без остановки реакции; 9 - вирус : а-химотрипсин = 1 : 2; 10 - вирус : термолизин =1:1, без остановки реакции. MW -белковые маркеры для электрофореза

При инкубации вирионов с трипсином была обнаружена зависимость результата реакции от наличия в системе хелатирующего агента ЭДТА: использование трипсина в буфере с хелатором приводило к избирательному отщеплению второго гликопротеина оболочки вириона - нейраминидазы (NA, рис. 16, дорожка 10, а также [104]), в то время как НА практически не удалялся; в присутствии ионов кальция наблюдался частичный гидролиз эктодоменов гемагглютинина.

На основании полученных данных для удаления поверхностных гл и коп роте и нов с поверхности вирионов было решено использовать цистеиновую протеиназу бромелаин.

2.1.2. Оптимизация протокола получения субвирусных частиц при обработке вирионов бромелаином

Для оптимизации условий получения т.н. субвирусных частиц (вирионов, лишенных эктодоменов поверхностных гликопротеинов) процесс протеолиза белков оболочки вирионов цистеиновой протеиназой бромелаином был изучен более подробно.

2.1.2.1. Влияние времени проведения реакции на гидролиз гемагглютинина

Используя в качестве начальных условий постановки ферментативной реакции условия, описанные в работе Бранда и Скеела (вирусные частицы суспендировали в 0,1 М буфере Трис-HCl, рН 7,2, содержащем 50мМ меркаптоэтанола и 0,001 М ЭДТА, см. [6]), был проведен кинетический анализ гидролиза эктодоменов поверхностных гликобелков вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином. Для этого через фиксированные промежутки времени после начала реакции в реакционную смесь добавляли необратимый ингибитор цистеиновых протеиназ Е-64, ультрацентрифугированием выделяли субвирусные частицы из реакционной смеси и проводили электрофоретический анализ (SDS-электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли) полученных образцов.

Полное удаление поверхностных гликопротеинов в данных условиях достигалось уже за Зч после начала гидролиза (рис.17).

1 2 3 4 5 6 MW, кДа при концентрации (3-меркаптоэтанола 50 мМбромелаин:вируе 1:1, 37 °С, остановка реакции 10" 5 М Е-64. Вирионы инкубировали с ферментом в течение 0.5 ч (I), 1.5 ч (2), 3 ч (3), 6 ч (4), 18 ч (5). 6 - интактные вирионы; MW - белковые маркеры для электрофореза.

2.1.2.2. Влияние соотношения ферментгвирус на процесс удаления гемагглютинина

Для этого была изучена временная зависимость гидролиза гемагглютинина бромелаином в присутствии 50 мМ (3-меркаптоэтанола с поверхности вирионов при различном соотношении фермент:вирусный белок (измеренному по методу Петерсона, см. [113]). Сравнением интенсивностей полос гемагглютинина на электрофореграммах субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов за одинаковые промежутки времени и различном соотношении вирус:фермент (которое проводили методом денситометрического анализа электрофоре грамм), было показано, что снижение количества фермента в 4 раза (вирус:фермент = 4 : 1) не приводит к существенному увеличению времени, необходимого для полного удаления эктодоменов гемагглютинина (не представлено).

2.1.2.3. Влияние типа и концентрации восстанавливающих реагентов на гидролиз гемагглютинина

Также было изучено действие бромелаина на вирион в присутствии различных количеств восстанавливающих реагентов двух типов - р-меркаптоэтанола и дитиотреитола.

В отдельном опыте была изучена активность бромелаина по гидролизу высокоспецифичного хромогенного субстрата цистеиновых протеиназ Glp-Phe-Ala-pNA в присутствии разных концентраций восстанавливающих реагентов (рис.18, а и 19, а).

Наибольшая активность фермента наблюдалась в присутствии 5 мМ (3-меркаптоэтанола. Обработка нативных вирионов бромелаином при этой концентрации восстанавливающего реагента дала возможность получить субвирусные частицы, полностью лишенные эктодоменов гемагглютинина. (рис. 18, б)

Проведением кинетического анализа гидролиза вирионов бромелаином в присутствии двух различных концентраций меркапоэтанола (оптимальной (5мМ), при которой достигается наибольшая активность фермента, и более высокой (50 мМ), которая приводит к значительному снижению активности фермента, но была использована в классических методиках по выделению эктодоменов, было показано, что для полного удаления эктодоменов НА высоко- и низко- активным ферментом при одинаковом соотношении бромелаин/вирус требовались одинаковые промежутки времени: 3 ч (рис. 20). По-видимому, скорость реакции в данной системе определяется не только удельной активностью фермента, но, главным образом, стерической доступностью субстрата.

В данной системе РМЕ действует сразу на несколько мишеней. Во-первых, он восстанавливает SH-группы в активном центре молекулы бромелаина. Высокая концентрация РМЕ, по-видимому, вызывает также и разрушение/перегруппировку S-S-связей между другими SH-содержащими аминокислотными остатками, приводя к инактивации фермента. Во-вторых,

РМЕ воздействует на С-концевые сегменты НА2 в составе вириона. Нами было показано, что из субвирусных частиц, приготовленных в присутствии (ЗМЕ (50 мМ), экстрагируются не только трижды ацилированные, но также ди-, моно- и даже полностью деацилированные пептиды. После отмывки (ЗМЕ частично деацилированные молекулы могут образовать S-S-связи и, таким образом, стабилизировать оболочку вириона. Наконец, проникающий через мембрану (ЗМЕ, вероятно, может изменять пространственную структуру белка Ml, включающего три остатка цистеина.

1 2 MW, kDa

NP-VM« -66

М1

-45 -30

-20,1

Ш -14,4 а) (б)

Рис. 18. (а). Зависимость гидролитической активности бромелаина от времени инкубации с низкомолекулярным субстратом GIp-Phe-AIa-pNA при 37 °С при концентрации Р-меркаптоэтанола (Р-МЕ) в реакционной среде, равной 0, 1, 5 и 50 мМ. Концентрация бромелаина в реакционной среде 0,025 мг/мл. (б) Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в присутствии 5 мМ р-МЕ: 1 - субвирусные частицы (вирус : бромелаин 2:1, 3 ч, 37 °С); 2 - интактные вирионы; MW - белковые маркеры для электрофореза.

0,5 1 1 время инкубации, ч появление полос легкой и тяжелой цепей гемагглютинина, свидетельствовавшее о восстановлении дисульфидной связи между НА1- и НА2-цепями молекулы (рис.19, б.). ш * fe г я ^ л

1| л £

Е г ф ч а) (б)

Рис. 19. (а). Зависимость гидролитической активности бромелаина от времени инкубации с низкомолекулярным субстратом Glp-Phe-Ala-pNA при 37 °С при концентрации дитиотреитола (DTT) в реакционной среде, равной 0, 1, 5 мМ. Концентрация бромелаина в реакционной среде 0,025 мг/мл. (б). Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в присутствии I мМ DTT: 1 — субвирусные частицы (вирус:бромелаин 2:1, 37 °С, 3 ч); 2 - интактные вирионы; MW - белковые маркеры для электрофореза.

В отсутствие восстанавливающих реагентов также наблюдался гидролиз низкомолекулярного субстрата бромелаином, при этом активность фермента сохранялась практически неизменной на протяжении длительного времени (см. рис. 18, а и 19, о) и была ниже, чем активность после активации небольшими концентрациями р-меркаптоэтанола.

1 2 3 время инкубации, ч п.З). Однако оказалось, что присутствие в системе Р-меркаптоэтанола, используемого для восстановления тиоловых групп в активном центре фермента, приводит также к удалению части остатков жирных кислот, присоединенных тио-эфирной связью к консервативным остаткам цистеина, расположенных во внутривирионном фрагменте гемагглютинина. Таким образом, для изучения пост-трансляционной модификации С-концевых сегментов гемагглютинина остатками высших жирных кислот требовалось проведение реакции гидролиза в отсутствие восстанавливающих реагентов.

2.1.2.4. Действие бромелаина на вирионы вируса гриппа в отсутствие восстанавливающих реагентов

Была изучена временная зависимость гидролиза поверхностных гликопротеинов. В отсутствие восстанавливающих реагентов гидролиз эктодоменов поверхностных гликопротеинов происходил медленнее: при соотношении вирус:фермент 1:1 полное удаление гликобелков происходило за 5-6 ч при 37 °С (см. рис. 20, а и 21, а\ полоса на электрофореграмме, соответствующая гемагглютинину, полностью отсутствует на дорожке № 4). При этом на электрофореграммах наблюдалось появление серии дополнительных полос в диапазоне молекулярных весов 9-23 кДа, которые по результатам их анализа методом трипсинолиза в геле с последующим анализом пептидных элюатов методом MALDI времяпролетной масс-спектрометрии были определены как фрагменты белка Ml и обозначены fl-f6 (см. рис. 16, дорожка 3). Электрофоретическая подвижность каждого фрагмента белка Ml и взаимные интенсивности полос сохранялись постоянными.

Электрофоретический анализ вирионов, обработанных бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов за различные промежутки времени, показал, что фрагменты белка Ml, появляются на электрофореграмме в первые 0,5 ч реакции, когда весь НА практически сохранен (рис. 20, 21). В течение всего последующего времени доля фрагментированного белка Ml, число полос фрагментов и их интенсивность остаются одинаковыми. Следует отметить, что фрагментация матриксного белка не наблюдалась при инкубации суспензии интактных вирионов в отсутствие фермента при 37 °С в течение времени проведения реакции. Напротив, выделенный из вирионов «свободный» белок Ml при гораздо более «щадящих» условиях гидролиза бромелаином (вирус:бромелаин = 10:1, 5 мин, 37 °С) расщеплялся до коротких пептидов, которые не детектировались белковым электрофорезом по Лэммли (не представлено).

Негидролизованный белок, отн. ед.

Время инкубации, ч

Рис. 20. Зависимость гидролиза бромелаином поверхностного гликопротеина НА и матриксного белка Ml в составе вирионов от времени инкубации с вирусными частицами при 37 °С при концентрации РМЕ в среде, равной 0 (а), 5 (б) и 50 мМ (в) . Концентрация бромелаина 1 мг/мл. 1 - НА, 2- Ml. Относительное количество негидролизованного бромелаином НА и Ml в составе субвирусных частиц оценивали методом денситометрии полос в геле. В каждой дорожке геля долю НА и Ml нормировали на долю внутреннего белка NP.

Рис. 21. Анализ гидролиза молекул матриксного белка Ml и эктодоменов гемагглютинина в составе вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в отсутствие Р-меркаптоэтанола. Электрофоре грамма отражает белковый состав вирусных частиц, обработанных ферментом при 37 "С при соотношении реагентов (бромелаин:вирус) 1:1 в течение различных промежутков времени. Остановка реакции 105м Е-64. Вирионы инкубировали с ферментом в течение 0.5 ч (1), 1.5 ч (2), 3 ч (3), 6 ч (4). 5 - интактные вирионы; MW - низкомолекулярные пептидные маркеры.

1 2 3 4 5 MW, кДа 40 о®1 л 35 £ с ю 20 X Й о. 10 I О 6 время инкубации, ч М1

Снижение концентрации фермента закономерно уменьшало разрушение белка Ml. В то время как количество фрагментированного белка Ml в составе субвирусных частиц могло достигать 90 % при соотношении вирус:бромелаин, равном I: I (рис. 9, дорожка 3), оно было значительно ниже при соотношении 4:1 (не представлено).

2.2. Изучение явления доступности мембран-ассоциированного белка Ml в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликопротеинов

2.2.1. Электронно-микроскопический анализ вирусных препаратов

Чтобы понять, почему белок Ml, расположенный внутри вириона под лигшдной мембраной, становится доступным действию фермента, был проведен электронно-микроскопический анализ тонких срезов контрольных интактных вирионов и субвирусных частиц вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34, полученных протеолитической обработкой вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов (рис. 22). Было обнаружено, что липидная мембрана на большей части поверхности субвирусных частиц отсутствует. На рис.22, а представлена электронная микрофотография интактного вириона штамма A/Puerto Rico/8/34, на которой виден слой «шипов» гликопротеинов (белая стрелка), окружающих нативную вирусную частицу. На микрофотографии, представленной на рис. 22, б, показана типичная субвирусная частица из препарата, полученного обработкой вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента. Видно, что слой гликопротеиновых «шипов» отсутствует. Кроме того, рядом с участками сохранившегося липидного бислоя (указаны белой стрелкой) есть области, где бислой нарушен (черная стрелка). а) (б)

Рис. 22. Электронные микрофотографии тонких срезов интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (а) и вирионов, обработанных бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов (б).

На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что белок Ml, прилегающий изнутри к липидной оболочке, подвергается ограниченному протеолизу бромелаином в результате нарушения целостности мембраны вирионов. Это нарушение могло происходить в процессе проведения гидролиза вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента или/и при последующем центрифугировании препарата субвирусных частиц на холоду, которое проводили с целью освобождения обработанных ферментом вирионов от избытка фермента после реакции.

2.2.2. Влияние условий ингибирования на фрагментацию белка Ml

Далее было изучено влияние условий ингибирования гидролиза на фрагментацию белка Ml - действие двух типов ингибиторов цистеиновых протеиназ при двух температурах инкубации реакционной смеси после остановки реакции.

При исследовании временной зависимости удаления НА в присутствии Р-меркаптоэтанола реакцию гидролиза стандартно останавливали ингибитором Е-64 (10 мкМ, инкубация при комнатной температуре 15 мин), а затем до центрифугирования серию образцов хранили при 4 °С (16-18 ч). В отсутствие восстанавливающего реагента в этих условиях в составе субвирусных частиц обнаруживали фрагменты белка Ml (рис.23, а). Однако если образцы выдерживали с ингибитором 16—18 ч при температуре 37°С, то фрагменты белка Ml практически отсутствовали. В отличие от Е-64, HgC^ (100 мкМ) не подавлял фрагментацию белка Ml даже при повышенной температуре (рис. 23, б). При этом оба ингибитора останавливали гидролиз поверхностного НА за короткие промежутки времени при 20 °С. б)

1 ^t "T

-у

-(NAb -НА -NP 20.)

14.4 фрагменты Ml

I -Ж" jt ®а? 1 '

Рис. 23. Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов вируса гриппа бромелаином в отсутствие (3-меркаптоэтанола при разных условиях остановки реакции: соотношение вирус - бромелаин = 2:1 (ш/ш). (а) - 3 ч гидролиза при 37 °С, остановка реакции Е-64 (10 мкМ) в течение: 15 мин при 20 °С, затем 16 ч при 4 °С (1) или 16 ч при 37 °С (2); (б) — после «нулевой» точки (5 мин гидролиза при 20 °С) инкубация в присутствии HgCb (100 мкМ, 1, 2) или - Е-64 (10 мкМ, 3, 4) в течение 16 ч при 37 °С (1, 3) или 15 мин при 20 °С, затем 16 ч при 4 °С (2, 4); 5 -интактные вирионы.

2.3. Анализ структуры заякоренного в мембрану вириона С-концевого сегмента гемагглютинина

2.3.1. Отработка способов экстракции С-концевых сегментов гемагглютинина из субвирусных частиц

К настоящему времени данные о структуре С-концевого сегмента НА2-цепи, включающего трансмембранный домен (TMD) и цитоплазматический домен (СТ) и трижды ацилированного по остаткам цистеина жирнокислотными остатками, незначительны, однако представляют значительный интерес в связи с возможным участием их в процессе слияния мембран при проникновении вируса в клетку и/или процессе сборки дочерних вирионов перед их выпочковыванием с плазматической мембраны зараженной клетки.

Ранее в нашей лаборатории совместно с Институтом Биомедицинской Химии имени В.Н. Ореховича и ГУ НИИ Физико-химической медицины Росздрава был предложен протокол исследования тонкой структуры С-концевых сегментов НАг, экстрагированных из обработанных бромелаином вирионов (т.н. субвирусных частиц), с использованием МС-анализа. Предложенный поход наметил путь для изучения характера ацилирования консервативных остатков цистеина, расположенных на внутривирионных фрагментах гемагглютинина у различных эволюционных групп вируса гриппа. Однако, данный метод позволял получать ацилированный пептид с низким выходом, достаточным только для проведения масс-спектрометрического анализа. Низкий выход экстракции не давал уверенности, что остальная (неэкстрагированная) часть пептида обладает теми же химическими свойствами (характером ацилирования), поскольку отсутствие даже одного из трех связанных с пептидом жирно-кислотных остатков серьезно снижает гидрофобность ацилированного пептида.

Для того чтобы разобраться, отражает ли обнаруженный нами характер ацилирования свойства всего пула С-концевых сегментов НА или только его небольшой фракции, мы разработали альтернативный метод выделения С-концевого сегмента НА2 из субвирусных частиц, полученных обработкой нативных вирионов вируса гриппа цистеиновой протеиназой бромелаином. Метод заключается в солюбилизации субвирусных частиц при температуре 30 °С смесью неионных детергентов октилглюкозид/айгепал (NP-40) с последующим разделением солюбилизата (супернатанта) и осадка центрифугированием при 14000xg в течение 40 мин при комнатной температуре на настольной центрифуге Microfuge 18 (Beckman Coulter). Как оказалось, данный метод экстракции позволял выделять количества С-концевых пептидов НА2, достаточные для характеристики его состава методом аминокислотного анализа — стандартного метода для определения аминокислотного состава белкового объекта.

Препараты С-концевого сегмента НА2, выделенного из субвирусных частиц вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 были исследованы параллельно двумя методами: MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом и аминокислотным анализом. Полученные результаты представлены в таблице 1. Данные аминокислотного анализа показали, что состав экстракта хорошо согласуется с данными из базы данных по аминокислотной последовательности С-концевого пептида цепи НА2, включающего трансмембранный и цитоплазматический домены. Кроме того, расчет выхода при экстракции С-концевых сегментов НА2 смесью октилглюкозид/айгепал показал, что при данном способе экстракции происходит практически количественный переход пептида в солюбилизат (супернатант). Масс-спектрограммы солюбилизатов показали, что выделенные таким образом С-концевые сегменты НА2 имеют тот же характер ацилирования, что и пептиды, экстрагированные в органическую фазу (не представлено).

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Смирнова, Юлия Александровна, Москва

1. Сох N .J., Bender С.А. The molecular epidemiology of influenza viruses. / Semin. Virol., 1995, 6: 359-370.

2. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., Chambers T.M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. / Microbiol. Rev., 1992, 56, 152-179.

3. Reid A. H., Taubenberger J. K. The origin of the 1918 pandemic influenza virus: a continuing enigma. I J. Gen. Virol., 2003, 84, 2285-2292.

4. Noble G.R. Epidemiological and clinical aspects of influenza. In: "Basic and Applied Influenza Research" (Beare A.S., Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, 1982, pp. 11-50.

5. Compans R.W., Klenk H.-D., Caliguiri L.A., Choppin P.W. Influenza virus proteins. / Virology, 1970, 42, 880-889.

6. Brand C.M., Skehel J. J. Crystalline antigen from the influenza virus envelope./Nat. New Biol., 1972, 238, 145-147.

7. Lamb, R. A., and R. M. Krug. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, p. 1487-1531.In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), 2001, Fields virology, 4th ed. Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia, Pa.28.

8. Makarova N.V., Kaverin N.V., Krauss S., Senne D. and Webster R.G. Transmission of Eurasian avian H2 influenza virus to shorebirds in North America. / J. Gen. Virol., 1999, 80, 3167-3171.

9. Nicol S.T., Airkawa J., and Kawaoka Y. Emerging viral diseases. / PNAS, 2000, 97, 12411-12412.

10. Russell R.J., Haire L.F., Stevens D.J., Collins P.J., Lin Y.P., Blackburn G.M., Hay A.J., Gamblin S .J., Skehel J.J. The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design. / Nature, 2006,443,45-49.

11. Colman P.M. NA enzyme and antigen. In The influenza viruses (R. M. Krug,ed.). Plenum Publishing Corporation, New York, 1989, 175-218.

12. Osterhaus A.D., Rimmelzwaan G. F., Martina B.E., Bestebroer T.M., Fouchier. R.A. Influenza В virus in seals. / Science, 2000, 288, 1051-1053

13. Stegman Т., Helenius A. In: Viral Fusion Mechanisms (ed. Bentz J). CRC, Boca Raton, FL, 1993, 89-111.

14. Skehel J. Influenza hemagglutinin structure and antogenicity. / Experientia, 1986, 46, 89.

15. Zebedee S.L., Lamb R.A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. / J. Virol., 1988, 62, 2762-2772.

16. Garoff H., Hewson R., Opstelten D.-J. E. Virus maturation by budding. / Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, 62, 1171-1190.

17. Ruigrok R.W., Barge A., Durrer P., Brunner J., Ma K., Whittaker G.R. Membrane interaction of influenza virus Ml protein./Virology, 2000, 267, 289-298.

18. Noda Т., Sagara H., Yen A., Takada A., Kida H., Cheng R. H., Kawaoka Y. Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles. / Nature, 2006, 439, 490-492.

19. Harris A., Cardone G., Winkler D. C., Heymann В., Brecher M., White J. M., Steven A. C. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. / PNAS, 2006, 103, 50, 19123-19127.

20. Nayak D. P., Hui E. K.-W., Barman S. Assembly and budding of influenza virus. / Vir. Res., 2004, 106, 147-165.

21. Iwatsuki-Horimoto K, Horimoto Т., Noda Т., Kiso M., Maeda J., Watanabe S., Muramoto Y.,Fujii K., Kawaoka Y. The cytoplasmic tail of the influenza A virus M2 protein plays a role in viral assembly. / J. Virol., 2006, 80, 5233-5240.

22. Tamm L.K., Han X. Viral fusion peptides: a tool set to disrupt and connect biological membranes. / Biosci. Rep., 2000, 20, 501-518.

23. Han X., Bushweller J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Membrane structure and fusion-triggering conformational change of the fusion domain from influenza hemagglutinin. / Nat Struct. Biol., 2001, 8, 715-720.

24. Cross K.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Wiley D.C., Steinhauer D.A. Studies on influenza haemagglutinin fusion peptide mutants generated by reverse genetics. / EMBO J., 2001, 20, 4432-4442.

25. Barman S, Adhikary L, Chakrabarti AK, Bernas C, Kawaoka Y, Nayak D.P. Role of transmembrane domain and cytoplasmic tail amino acid sequences of influenza a virus neuraminidase in raft association and virus budding. / J. Virol. 2004, 78, 5258-5269.

26. Varghese J.N. and Colman P.M. Three-dimensional structure of the neuraminidase of influenza virus A/Tokyo/3/67 at 2.2 A resolution. / J. Mol. Biol., 1991,221,473-486.

27. Tung C.-S., Goodman J. L., Lu H., Machen C.A. Homology model of the structure of influenza В virus HA1. f J. Gen. Virol, 2004, 85, 3249-3259.

28. Betakova T, Kollerova E. pH modulating activity of ion channels of influenza A, B, and С viruses. I Acta Virol., 2006, 50, 187-193.

29. Veit M., Schmidt M. F. G. Palmitoylation of influenza virus proteins. / Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr., 2006, 119, 112-122.

30. Weissenhorn W., Hinz A., Gaudin Y. Virus membrane fusion. IFEBS Lett., 2007,581,2150-2155.

31. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. I Nature, 1981, 289, 366373.

32. Klenk H.-D. Proteolytic cleavage of the influenzavirus hemagglutinin and other viral glycoproteins. In: Influenza Viruses Facts and Perspectives, Ed. M.F.G. Schmidt. 2006, pp. 80-84.

33. Klenk H.D., Rott R. The molecular biology of influenza virus pathogenicity. / Adv. Vir. Res., 1988, 34,247-281.

34. Pager C.T., Jr. Craft W.W., Patch J., Dutch R.E. A mature and fusogenic form of the Nipah virus fusion protein requires proteolytic processing by cathepsin L. / Virology, 2006, 346, 251-257.

35. Yey M., Orlich M., Adler S., Klenk H.D., Rott R., Garten W. Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R. / Virology, 1992, 188, 408-413.

36. Lazarowitz S.G., Goldberg A.R., Choppin P.W. Proteolytic cleavage by plasmin of the HA polypeptide of influenza virus. Host cell activation of serum plasminogen. / Virology, 1973, 56, 172-180.

37. Gotoh D. Ogasawara Т., Toyoda Т., Inocencio N.M., Hamaguchi M., Nagai Y. An endoprotease homologous to the blood clotting factor X as a determinant of viral tropism in chick embryo. / EMBO J., 1990, 9, 4189-4195.

38. Tashiro M., Ciborowski P., Klenk H. D., Pulverer G., Rott. R. Role of staphylococcal protease on the development of influenza pneumonia. / Nature, 1987, 325, 536-537.

39. Garten W., Stieneke A., Shaw E., Wikstrom P., Klenk H. D. Inhibition of proteolytic activation of influenza virus hemagglutinin by specific peptidyl chloroalkyl ketones. / Virology, 1989, 172, 25-31.

40. Kuroda K., Groner A., Frese K., Drenckhahn D., Hauser C., Rott R., Doerfler W., Klenk H. D. Synthesis of biologically active influenza virus hemagglutinin in insect larvae. / J. Virol., 1989, 63, 1677-1685.

41. Fuller R.S., Brake A.J., Thorner J. Intracellular targeting and structural conservation of a prohormone-processing endoprotease. / Science, 1989, 246, 482486.

42. Steiner D.F., Smeekens, S.P., Ohagi, S., Chan, S.J. The new enzymology of precursor processing endoproteases. / J. Biol Chem., 1992, 267, 23435-23438.

43. Stieneke-Grober A., Vey M., Angliker H., Shaw E., Thomas G., Roberts C., Klenk H.D., Garten W. Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease. / EMBO J., 1992, 11, 2407-2414.

44. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. / The EMBO J., 2002, 21, 5, 865 875.

45. Klenk H.-D., Garten,W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity. / Trends Microbiol, 1994, 2, 39-43.

46. Chen J., Lee K.H, Steinhauer D. A., Stevens D. J., Skehel J. J., Wiley D. C. Structure of the hemagglutinin precursor cleavage site, a determinant of influenza pathogenicity and the origin of the labile conformation. / Cell, 1998, 95, 409-17.

47. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. / Nature, 1994, 371, 37 43.

48. Chen J., Skehel J .J., Wiley D.C. N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subunit to form an N cap that terminates the triple-stranded coiled coil J Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 8967-8972.

49. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J J., Wiley D.C. X-ray structure of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs. / PNAS, 2001, 98, 11181-11186.

50. Russell R.G., Gamblin S.J., Haire L.F., Stevens D.J., Xiao В., Ha Y., Skehel JJ. HI and H7 influenza haemagglutinin structures extend a structural classification of haemagglutinin subtypes. / Virology, 2004, 325, 287 296.

51. Russell R.J., Kerry P.S., Stevens D.J., Steinhauer D.A., Martin S.R., Gamblin S.J., Skehel J.J. Structure of influenza hemagglutinin in complex with an inhibitor of membrane fusion. / Proc. Natl. Acad. Sci., 2008, 105, 17736-17741.

52. Dopheide T.A., Ward C.W. The location of bromelain cleavage site in a Hong Kong influenza virus haemagglutinin. /J. Gen. Virol. 1981, 52, 367-370.

53. Wiley D.C., Wilson I.A.,. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. / Nature, 1981, 289, 373-378.

54. Waterfield M., Scrace G., Skehel J. Disulfide bonds of haemagglutinin of Asian influenza virus. / Nature, 1981, 289, 422-424.

55. Weis W., Brown J. H., Cusack S., Paulson J. C., Skehel J. J., Wiley D. C. Structure of the virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. / Nature, 1988,333,426-431.

56. Stevens D. J., Corper A. L., Basler C. F., Taubenberger J. K., Palese P., Wilson I. A. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. / Science, 2004, 303, 1866-1870.

57. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. X-ray structure of the hemagglutinin of a potential H3 avian progenitor of the 1968 Hong Kong pandemic influenza virus. / Virology, 2003, 309, 209 218.

58. Chernomordik L.V., Kozlov M.M. Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes. / Annu. Rev. Biochem., 2003, 72, 175-207.

59. Melikyan G.B., Brener S.A., Ok D.C., Cohen F.S. Inner but not outer membrane leaflets control the transition from glycosylphosphatidylinositol-anchoredinfluenza hemagglutinin-induced hemifusion to full fusion. I J. Cell Biol., 1997, 136, 995-1005.

60. Blumenthal R., Sarkar D.P., Durell S., Howard D.E., Morris S.J. Dilation of the influenza hemagglutinin fusion pore revealed by the kinetics of individual cell-cell fusion events. / J. Cell Biol., 1996, 135, 63-71.

61. Markovic I., Leikina E., Zhukovsky M., Zimmerberg J., Chernomordik L.V. Synchronized activation and refolding of influenza hemagglutinin in multimeric fusion machines. I J. Cell Biol., 2001, 155, 833-844.

62. Schroth-Diez В., Ludwig K., Baljinnyam В., Kozerski C., Huang Q., Herrmann A. The role of the transmembrane and of the intraviral domain of glycoproteins in membrane fusion of enveloped viruses. / Biosci. Rep., 2000, 20, 571595.

63. Armstrong R.T., Kushnir A.S., White J.M. The transmembrane domain of influenza hemagglutinin exhibits a stringent length requirement to support the hemifusion to fusion transition. / J. Cell Biol., 2000, 151, 425-437.

64. Wang Q., Tian X., Chen X., Ma J. Structural basis for receptor specificity of influenza В virus hemagglutinin. / PNAS, 2007, 104, 43, 16874-16879.

65. Q. Wang, F. Cheng, M. Lu, X. Tian, J. Ma. Crystal Structure of Unliganded Influenza В Virus Hemagglutinin. I J. Virol., 2008, 82, 3011-3020.

66. Rosenthal P.B., Zhang X., Formanovski F., Fitz W., Wong C.-H., Meier-Ewert H., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein of influenza С virus./ Nature, 1998, 396, 5, 92-96.

67. Tatulian S.A., Tamm L.K. Secondary structure, orientation, oligomerization, and lipid interactions of the transmembrane domain of influenza hemagglutinin. / Biochemistry, 2000, 39, 496-507.

68. Barman S., Ali A., Hui E.K., Adhikary L., Nayak D.P. Transport of viral proteins to the apical membranes and interaction of matrix protein with glycoproteins in the assembly of influenza viruses. / Virus Res., 2001, 77, 61-69.

69. Jin H., Leser G.P., Zhang J., Lamb R.A. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. / EMBO J., 1997, 16, 12361247.

70. Naeve C.W., Williams D. Fatty acids on the A/Japan/305/57 influenza virus hemagglutinin have a role in membrane fusion. / Embo J., 1990, 9, 3857-3866.

71. Nairn H. Y., Amarneh В., Ktistakis N.T., Roth M.G. Effects of altering palmitoylation sites on biosynthesis and function of the influenza virus hemagglutinin. I J. Virol., 1992, 66, 12, 7585-7588.

72. Steinhauer D.A., Wharton S.A, Wiley D.C., Skehel J.J. Deacylation of the hemagglutinin of influenza A/Aichi/2/68 has no effect on membrane fusion properties. / Virology, 1991, 184, 445-448.

73. Veit M., Kretzschmar E., Kuroda K., Garten W., Schmidt M.F., Klenk H. D., Rott R. Site-specific mutagenesis identifies three cysteine residues in the cytoplasmic tail as acylation sites of influenza virus hemagglutinin. / J. Virol., 1991, 65,2491-2500.

74. Ujike M., Nakajima K., Nobusawa E. Influence of acylation sites of influenza В virus hemagglutinin on fusion pore formation and dilation. / J. Virol. 2004, 78, 11536-11543.

75. Veit M., Reverey H., Schmidt M. F. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. / Biochem. J., 1996, 318, 163-172.

76. Chen B. J., Takeda M., Lamb. R. Influenza virus hemagglutinin (H3 subtype) requires palmitoylation of its cytoplasmic tail for assembly: Ml proteins of two subtypes differ in their ability to support assembly. I J. Virol., 2005,79, 21, 13673 13684.

77. Wagner R., Herwig A., Azzouz, Klenk H.-D. Acylation-mediated membrane anchoring of avian influenza virus hemagglutinin is essential for fusion pore formation and virus infectivity. / J. Virol, 2005, 79, 10, 6449-6458.

78. Zurcher Т., Luo G., Palese. P. Mutations at palmitylation sites of the influenza virus hemagglutinin affect virus formation. I J. Virol., 1994, 68, 5748-5754.

79. Sakai Т., Ohuchi R., Ohuchi M. Fatty acids on the A/USSR/77 influenza virus hemagglutinin facilitate the transition from hemifusion to fusion pore formation. / J. Virol, 2002, 76, 4603-4611.

80. Ujike M., Nakajima К., Nobusawa E. Influence of additional acylation site(s) of influenza В virus hemagglutinin on syncytium formation. / Microbiol. Immunol., 2005, 49, 4, 355-359.

81. Zhirnov O. P. Isolation of matrix protein Ml from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent. / Virology, 1992, 186, 324-30.

82. Ruigrok R.W. Structure of Influenza А, В and С Viruses. / Textbook of Influenza. Ed. A.H.N.C.R.Webster. Blackwell Scientific Publications, 2007, pp.356359.

83. Zhirnov OP. Solubilization of matrix protein Ml/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. / Virology, 1990, 176, 274-279.

84. Roberts P.C., Lamb R.A., Compans R.W. The Ml and M2 proteins of influenza A virus are important determinants in filamentous particle formation. / Virology, 1998, 240, 1, 127-137.

85. Solon J., Gareil O., Bassereau P., Gaudin Y. Membrane deformations induced by the matrix protein of vesicular stomatitis virus in a minimal system. / J. Gen. Virol., 2005, 86, 3357-3363.

86. Antonny B. Membrane deformation by protein coats. / Current Opinion in Cell Biol., 2006, 18,4, 386-394.

87. Kretzschmar E., Bui M., Rose J.K. Membrane association of influenza virus matrix protein does not require specific hydrophobic domains or the viral glycoproteins. / Virology, 1996, 220, 1, 37-45.

88. Ye Z., Baylor N.W., Wagner R.R. Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotypic antibodies and synthetic peptides./ J. Virol. 1989,63, 3586-3594.

89. Ye Z.P., Pal R., Fox J.W., Wagner R.R. Functional and antigenic domains of the matrix (Ml) protein of influenza A virus./ J. Virol., 1987, 61, 239-246.

90. Gregoriades A. Interaction of influenza M protein with viral lipid and phosphatidylcholine vesicles. I J. Virol, 1980, 36, 470-479.

91. Gregoriades A., Frangione B. Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion. IJ Virol., 1981, 40, 323-328.

92. Chong L.D., Rose J.K. Membrane association of functional vesicular stomatitis virus matrix protein in vivo. / J. Virol., 1993, 67, 407-414.

93. Chong L.D., Rose J.K. Interactions of normal and mutant vesicular stomatitis-virus matrix proteins with the plasma-membrane and nucleocapsids. / J. Virol., 1994, 68, 441-447.

94. Schulze I. T. The srtucture of influenza virus. / Virology, 1970, 42, 890904.

95. Sha B.D., Luo M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml./Nat. Struct. Biol., 1997, 4, 239-244.

96. Baudin F., Petit I., Weissenhorn W., Ruigrok R.W. In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus Ml protein. / Virology, 2001,281, 102-108.

97. Harris A., Forouhar F., Qiu S.H., Sha B.D., Luo M. The crystal structure of the influenza matrix protein Ml at neutral pH: Ml-Ml protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of Ml./ Virology, 2001, 289, 34-44.

98. Epand R.M. Proteins and cholesterol-rich domains. / Biochim.Biophys.Acta., 2008, 1778, 1576-1582.

99. Saijo S., Kishishita S., Yokoyama S.// Crystal structure of Matrix protein 1 from influenza A virus A/crow/Kyoto/Tl/2004(H5Nl). RCSB PDB-bank 2009. DOI: 10.2210/pdb2zl6/pdb.

100. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et.al. which is more generally applicable. / Anal.Biochem., 1977, 83, 346-356.

101. Ruan В., London V., Fisher K.E., Gallagher D.T., Bryan P.N Engineering Substrate Preference in Subtilisin: Structural and Kinetic Analysis of a Specificity Mutant. / Biochemistry, 2008, 47, 6628-6636.

102. Руденская Г.Н., Пупов Д.В. / Биохимия, 2008,73,3-17.

103. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly at the head of bacteriophage T4. /Nature, 1970, 227, 680-685.

104. Lebaron F.N., Folch J. The effect of pH and salt concentration on aqueous extraction of brain proteins and lipoproteins./ J. Neurochem., 1959, 4, 1-8.