Электронный парамагнитный резонанс в меланопротеиновых волокнах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

БАЙТИМИРОВ Дамир Рафисович ___

ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАрДЙГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС В МЕЛАНОПРОТЕИНОВЫХ ВОЛОКНАХ

Специальность 01 04 07 - физика конденсированного состояния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

□ОЗ17527Э

Екатеринбург 2007

003175279

Работа выполнена на кафедре «Теоретической физики и прикладной математики» ГОУ ВПО «Уральский государственный технический университет-УПИ» и в Институте физики металлов УрО РАН, г Екатеринбург

Научный руководитель - кандидат физико-математических наук,

старший научный сотрудник Швачко Юрий Николаевич

Научный консультант - доктор физико-математических наук,

профессор

Мазуренко Владимир Гаврилович

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук,

профессор

Ляпилин Игорь Иванович доктор физико-математических наук Важенин Владимир Александрович

Ведущая организация - Казанский физико-технический институт

им Е К. Завойского КазНЦ РАН

Защита состоится 13 ноября 2007 г в 15 часов на заседании диссертационного совета К 212 285 01 при ГОУ ВПО «Уральский государственный технический университет - УПИ» в аудитории I главного учебного корпуса по адресу 620002, Екатеринбург, ул Мира, 19

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ГОУ ВПО «УГТУ-УПИ»

Отзыв на автореферат в одном экземпляре, заверенный гербовой печатью, просим направить по адресу 620002, г Екатеринбург, ул Мира, 19, ГОУ ВПО «УГТУ-УПИ», ученому секретарю университета

Автореферат разослан «13» октября 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент, к х н

¿к

Недобух Т А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Диссертация посвящена исследованию парамагнитных свойств меланопротеиновых волокон, входящих в структуру человеческого волоса

Актуальность темы: Человеческий волос представляет собой природное органическое волокно, в состав которого входит белок кератин и биополимер меланин Учитывая, что данные две подсистемы имеют непосредственную связь с процессами, протекающими в организме, волос является важным объектом для научных исследований Сегодня можно с полной уверенностью утверждать, что метод Электронного Парамагнитного Резонанса (ЭПР) позволяет более детально изучить специфику этих процессов, проходящих как при формировании волоса (непосредственно в коже), так и процессов проходящих в организме человека в целом До настоящего времени исследования волос традиционно проводились в двух основных направлениях косметологическом и медицинском Терминальные волосяные волокна, являющиеся с точки зрения биологии мертвым клеточным материалом, не рассматривались как объект для полномасштабных физических исследований Отметим, что волос, представляя собой высокоупорядоченное биоволокно с постоянной скоростью роста, является, по существу, ретроспективным датчиком биохимических процессов в организме за период от недель до нескольких лет Разумно предположить, что современные резонансные методики в состоянии различить более тонкие изменения Несомненным достоинством самого объекта с точки зрения ЭПР является, в отличие от других биологических тканей, отсутствие в его составе воды Мощным стимулом к дальнейшему изучению волоса явилась серия работ австралийских и американских исследователей Ими в рентгеновских дифрактограммах волос пациентов с онкопатологией молочной железы были обнаружены характерные диффузные кольца, свидетельствующие о структурных нарушениях в белках Поздние эксперименты с использованием синхротронного излучения подтвердили наблюдаемую аномалию Возникла задача о выявлении подобной аномалии методом ЭПР Кроме того, в последние десятилетия значительно возрос интерес к использованию природных полимеров, в частности биополимеров Материалы на их основе являются экологически чистыми и легко утилизируются Мепанопротеиновые волокна являются широко распространенными природными полимерами, в которых существуют супрамолекулярные наноструктуры Такие материалы рассматриваются как перспективная база современной нанотехнологии В этой связи человеческий волос представляет особый интерес Химическое модифицирование протеиновых волокон открывает разнообразные возможности для создания новых биосовместимых материалов, которые в настоящее время уже востребованы медициной

Таким образом, изучение магнитных свойств меланопротеиновых волокон является актуальным с научной и практической точки зрения

Целью работы явчялось разработка методологической основы и выявление информативных параметров для применения ЭПР в качестве метода медицинской диагностики онкологических заболеваний по изменениям парамагнитных свойств человеческого волоса Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи

1 Поиск и идентификация всех вкладов в спектр ЭПР пигментной и белковой подсистем при нормальных условиях

2 Исследование эволюции спектральных характеристик при внешних воздействиях (высокие, низкие температуры, механическое растяжение, ультразвуковое воздействие, у-облучение, растворение и д р.)

3 Выявление диагностически перспективных спектральных характеристик, чувствительных к структурным изменениям меланопротеиновой системы, обусловленным онкопатологией

Методы исследования, достоверность и обоснованность результатов. В работе использован известный и хорошо апробированный метод экспериментальных исследований - ЭПР-спектроскопия Достоверность результатов работы определялась хорошим совпадением экспериментальных спектров с некоторыми данными других авторов

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующих оригинальных результатах

1 Впервые показано, что ЭПР сигнал меланопротеинового волокна имеет дополнительные компоненты, обусловленные иерархической структурной организацией филаментов а-кератина Проведено изучение эволюции параметров этих компонент при химическом и механическом воздействии и внешнем -/-облучении

2 Проведена идентификация ЭПР спектров белковой подсистемы волоса Наряду с линией, характеризующейся неразрешенной тонкой структурой (ДВ= 15-70 Гс, §1=2,00, g2=2,03, §3=2,06), обусловленной цистеиновыми радикалами, выделены две дополнительные компоненты спектра узкая - с ДВ(300К)=200-500 Гс, £=2,38 и широкая компонента с ДВ(300К)=400-1000 Гс, g=2 20, которые обусловлены комплексами с переносом заряда на базе аминокислотных остатков

3 Впервые систематически изучена температурная эволюция сигала ЭПР белковой подсистемы волоса (серосодержащие радикалы и КПЗ) Из параметров спектров определены температуры стеклования плавления, дегидратации и обугливания а-кератина

4 Впервые проведено экспериментальное изучение зависимости спиновой концентрации в природном меланине при высокой температуре (300-550 К) Результаты исследования позволили определить энергию активации триплетного состояния Еа~0,15 эВ

5 Предложен метод количественного определения относительной доли эумеланинов и феомеланинов в пигменте человеческого волоса с помощью ЭПР-спектроскопии

6 Впервые представлен сравнительный анализ параметров ЭПР спектров белковой и пигментной подсистем волос здоровых доноров и доноров с

клинически выявленным раком молочной железы Экспериментально обнаружена корреляция между интегральной интенсивностью сигналов ЭПР меланина и кератина

Практическая значимость результатов исследования состоит в

1 Классификации спектральных компонент ЭПР сигнала и формулировании модели для парамагнитных центров на базе аминокислотных остатков

2 Разработка метода подготовки образца человеческого волоса для ЭПР исследований и опредетения биологически информативных спектральных параметров

3 Разработке оригинальной методики извлечения кератинового материала из кортекса человеческого волоса

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Утверждение о том, что белковый и пигментный подсистемы человеческого волоса обладает парамагнетизмом

2 Утверждение о том, что данные подсистемы взаимодействуют и должны рассматриваться как единый меланопротеиновый полиассоциат

3 Утверждение о том, что ЭПР характеристики надежно регистрируют морфологические состояния кератиновой подсистемы температуры стеклования, плавления, дегидратации, карбонизации

3 Утверждение о том, что парамагнитные центры, ответственные за широкий ЭПР сигнал от протеинового волокна, обусловлены иерархической филаментарной структурой а-кератина

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на следующих научных конференциях и школах IX международный семинар «Дислокационная структура и механические свойства металлов и сплавов» (Екатеринбург, 2002 г ), «Modern Development of Magnetic Resonance» (Kazan, 2004), VIII международная школа молодых ученых «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применение» (г Казань, КГУ, 2005 г), III Международная конференция «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики» (Иваново, 2006)

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 11 печатных работах Список публикаций приведен в конце автореферата

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка цитируемой литературы, содержит 131 страницу текста, включая 63 рисунка и 3 таблицы Библиография содержит 70 наименований

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении показана актуальность темы диссертации, дана краткая характеристика глав диссертации, сформулированы цель и задачи работы

Первая глава посвящена литературному обзору проведенных ранее исследований белковых объектов методом ЭПР, строения белков и их структуры Подробно описаны накопленные сведения о природе

возникновения индуцированных ЭПР центров под действием у-излучения и отжиге при высоких температурах Кроме того, включен раздел, в котором подробно рассказывается о сегодняшнем развитии исследований белкового материала, обладающего уникальной а-спиральной структурой

Первый параграф второй главы посвящен основам теории ЭПР и возможностям данного метода Описан принцип работы использовавшейся экспериментальной аппаратуры Все спектры ЭПР регистрировались на спектрометре ЕЯБ-231 с использованием проточной криогенной системы термостатирования (83-553 К) Из полученных спектров извлекались значения ширины линии, интегральной и относительной интенсивностей, фактора, времен релаксации Т[ и Т2

Во втором параграфе дано подробное описание методики подготовки образцов Всего в экспериментах было исследовано порядка 200 образцов паховых и скальповых волос людей в возрасте от 3 до 70 лет обоих полов Предварительно перед помещением в резонатор все образцы промывались в дистиллированной воде и высушивались при комнатной температуре

Для экспериментов по определению влияния химической деструкции на характеристики спектров ЭПР меланопротеинового волокна образцы темных и светлых скальповых волос подвергались обработке в растворе перекиси водорода Н202 Через каждые 10-15 мин исследуемый образец промывался дистиллированной водой и высушивался в течение 15 мин при температуре ~30°С После чего производилась запись спектров

При изучении влияния химической обработки на температурные зависимости ЭПР параметров в интервале 83—505К образцы волос обрабатывались Н202 в течение 30 минут После промывки и просушки помещались в спектрометр

Для экспериментов по определению влияния механической деструкции на параметры ЭПР-спектров меланопротеинового волокна была разработана оригинальная методика, позволившая выделить из массы волоса белок а-кератин в виде мелкодисперсного порошка Результаты метода сопоставимы по эффективности вымывания с более сложными процедурами Предложенная методика качественно отличается от существующих технологий гидролиза

Третий параграф содержит подробное описание аппаратуры и методики измерений, применявшихся в экспериментах по исследованию структурного перехода в меланопротеиновом волокне методом ЭПР

Третья глава посвящена идентификации спектров ЭПР, наблюдаемых в меланопротеиновом волокне Их общая характеристика приводится в первом параграфе На всех образцах помимо сигнала меланина с известными характеристиками зарегистрирован и выделен неразрешенный ЭПР спектр, включающий несколько линий В имеющихся публикациях идентификация спектра отсутствует Узкая симметричная компонента ДВ(ЗООК)=200-500 Гс, §=2,38 присутствует во всех спектрах, но хорошо разрешается лишь в небольшом числе образцов Более широкая компонента ДВ(300К)=400-1000 Гс, ¿-2 20 также присутствует во всех образцах Ее

форма изменяется от одиночной линий анизотропного спектра

слабо искаженной до аксиально-в зависимости от ориентации и фактора заполнения. На рис. 1 представлены характер ные виды неразрешенных спектров человеческого волоса: а — спектр с выраженной узкой компонентой, б - спектр, включающий обе компоненты, в — спектр с широкой компонентой типа аксиальной анизотропии. Интегральная интенсивность

неразрешенного ЭПР сигнала изменяется на два порядка и составляет

оолее чем

1МП=102^10~ спин/г.

\

1Я1Л

Во втором параграфе описаны результаты исследования по облучению

. №

Рис. 1. Характерные виды неразрешенных ЭПР шекгров волоса

волос; у-кваитами (источник излучения 1 Со, Е= 1.3 МэВ). Известно, что в области

энергий 0.5-7-5 МэВ у-кваиты способны селективно разрушать неустойчивые химические связи посредством переноса зарядов от возбужденного

электрона.

Таким образом, парамагнитные центры ответственные за неизвестный ЭПР сигнал могут активироваться либо рекомб и н и ров ат ь. Регистрация таких процессов с помощью ЭПР будет прямо указывать на связь наблюдаемого ЭПР спектра с а-кератином.

Известно, что материал ногтя человека также практически на 100% состоит из кератина, существующего в р-форме. Естествен мо, что наблюдаемая в спектре ногтей слабая линия ЭПР (см. рис. 26) связана с р-кератином. В отличие от волоса жжладовагпгае образцы кератина ногтя дают более слабый ЭПР Сигнал, 10!9 спнн/гр., с менее выраженной структурой. Логично предположить, что радиационное воздейст вие на [^-модификацию кератина ногтя позволит качественно оценить влияние иерархической спиральной структуры филаментов а-кератина на формирование ЭГТР спектра. Кроме того, сравнение спектров белка в различных структурных модификациях - удобный способ выявления особенностей парамагнитных петров ответственных за сигнал ЭПР.

Рис. 3. Микроскопические изображения остатков волос после вымывания: •л - кутикула, б - кератин о вые гранулы, в - трубчатые фрагменты а-кератина

В результате пронесенных экспериментов установлено, что интенсивность ЭГТР сигнала, как в образцах полос, так и ногтей значительно возрастает с увеличением дозы (ряс, 2а и 26). Показано, что гтри увеличении дозы до 10 Гр интенсивность ЭПР сигнала а-кератшщ возрастает более чем в 3-4 раза. Однако при дальнейшем облучении до 15 Гр уменьшается на 50% относительно своего максимального значения. Отметим, что и результате радиационного воздействия форма спектра изменялась таким образом, что выделить узкую и широкую компоненту в спектре становилось невозможным.

Радиационно-индуцированные сигналы ногтя также не позволяют разрешить широкую компоненту. Принимая во внимание биологические аффекты от облучения сверх высокими дозами у-излучения -50 Гр, можно предположить, что молекулярная структура меланопротеиновых волокон, как и [3-кератиновых материалов, подвержена столь глубоким разрушениям, что наблюдаемые ЭПР спектры невозможно связать с определенным доминирующим топом дефектов. Можно пить в целом утверждать о существовании неоднородно уширенного сигнала с ДВ~400 Г'с. Упшрения сигнала с дозой не наблюдалось.

Проведенные эксперименты указывают на то, что в твердых кератинах роблучение вызывает возникновение стабильных парамагнитных центров. Однако рост концентрации с дозой резко ограничен. Поскольку в 6-кератинах но1тя эффект- менее заметен разумно предположить, что основной прирост возникает за счет парамагнитных центров в кортексных а-кератинах. Насыщение рос-га ЭПР интенсивности и даже её убыль разумно связать с конечным числом молекулярных фрагментов существующих в дикий. тетрамерах а-кераткна.

Третий параграф посвящен отработке оригинальной методики извлечения кортексного кератина из волоса и изучению спектров ЭПР полученного белкового материала. Описаны, результаты серим исследований по обработке волос в растворах КОН/вода, КаОН/вода в диапазоне концентраций 0,01 г/1 мл. В ходе экспериментов белок выделялся в виде коллоидной массы белесого цвета, которая в последствие отмывалась от щелочи и высушивалась. Наилучшие результаты были достигнуты для растворов ЫаОН с концентраций 0,1 г./1мл, при температуре 60°С в присутствии ультразвука. В результате была получена сухая смесь белого цвета (рис. 3.), состоящая, из отдельных кератин о вы X филаментов,

Е 1Л\-1 г облучения, л Г-.-ЮГр

л

\ Ш

.;;. И..

юзо ?сах1 <ю:о ю;о г^сн

Магнитное по л г. Гс

Рис, 2. ЭПР-спектры: а - кератина волос, б — кератина ногтя

волос после

вымывания ясно

сконденсировавшихся в микроскопические гранулы диаметром —35 мкм, и отдельных стабильных, образований в виде крупных нитей с характерной длиной —90 мкм. Пигментные гранулы отсутствуют. На микрофотографиях

видны полые трубки, стенки которых представляют собой оболочку волоса -кутикулу. Наличие полости

свидетельствует о вымывании

кортексного кератина из объема волоса. Результаты химических анализов и данные микроскопии показали, что выделившийся осадок - белок. После просушки (48 часов) сигнал ЗПР на полученном порошке не наблюдался. Однако в течение 24 часов сигнал восстанавливался, сохраняя форму сходную со спектром исходного волоса. Как показано на рис. 4, после восстановления параметры и характер спектра ЭПР не менялись.

Четвертый параграф посвящен результатам экспериментов по насыщению ЭГТР сигнала а-кератина. Как видно из рис. 5а., амплитуда сигнала ЭПР не насыщается и возрастает пропорционально мощности СВЧ поля вплоть до максимального значения Р=200 мВт. Отметим, что вклад широкой компоненты не влияет не мощностную характеристику: скорость возрастания узкой и широкой компонент в спектре ЭПР одинакова. Такое поведение не характерно для неоднородно уширенных сложных спектров.

1[> Ü0 Й 1>ё [Til J]r. 1SÍI Í9D 3341 37 К

Время, часы

Рис. 4. Кривая восстановления ЭПР сигнала порошка кератина

[.я „а,1" р'",нВт:а

Рис.. 5, Насыщение сигналов ЭПР кератина (а) и меланина (б) СВЧ полем

В пятом параграфе обсуждаются характеристики ЭПР сигнала пигментной подсистемы меланопротеинового волокна. На спектрах всех исследованных волос он представлен одиночной силшстрм~чной линией с шириной ДВи4-6 Гс, и £=2.004 (рис. 6). Этот сигнал связан с компактными гранулами меланина, равномерно распределенными по волосяному волокну. Опенка величины интегральной интенсивности ЭПР сигнала меланина для хорошо пигментированного черно]'« нормального скальпового волоса при

Т=293К дает значение 1ЭРр~1015 спин/гр Для более светлого волоса эта величина убывает Для паховых волос наблюдается аналогичная зависимость 1эпр от степени пигментации

На рис 56 представлена кривая насыщения сигнала ЭПР меланина для нормального пахового волоса черного окраса Как видно из рисунка, амплитуда сигнала быстро насыщается, достигая максимума при Р1/2=10 мВт При больших мощностях амплитуда убывает, демонстрируя классический пример насыщаемой спин-системы По кривым насыщения рассчитывались значения времен спин-решеточной Ть и спин-спиновой Т2, релаксации Показано, что величина Т2, незначительно изменяется от образца к образцу и для паховых волос в среднем составляет 10~9 с Время спин-решеточной релаксации попадает в интервал от 10"4 до 10'6 с

Отметим, что поскольку ЭПР свойства природных меланинов достаточно широко исследовались ранее, акцент данной работы сделан на кератиновую составляющую Вместе с тем, учитывая тот факт, что меланиновые гранулы «встраиваются» в цитоскелет кератиноцита еще до формирования белкового волокна, изучение корреляции между ЭПР-характеристиками меланина и кератина в индивидуальном волосе приобретает важное значение » ™ 4о бо а» к« в шестом параграфе обсуждаются

время действия окислителя, мин результаты экспериментальной

Рис. 7. Процентное содержание демонстрации взаимосвязи узкой линии пигмента в волосе ▲ - детский эпр с полимерной семихинонной сеткой черный волос, ♦ - взрослый меланина На рис 7 представлена черный волос, □ - детскии зависимость интегральной интенсивности светло-русого волос ЭПР сигнала меланина от времени

экспозиции волоса в растворе Н202 Как видно из графика, в образцах скальповых волос с интенсивной черной пигментацией концентрация парамагнитных центров убывает пропорционально времени экспозиции Перекисное окисление светло-русого волоса не выявило заметных изменений в спектрах ЭПР во всем интервале экспозиции Наблюдаемое поведение хорошо согласуется с существованием двух типов меланина - эумеланин и феомеланин - в пигментных гранулах волоса В результате проведенных экспериментов по перекисной деструкции

3320 зззо эха ээбп ззта

Магнитное поте, Гс

Рис 6. Экспериментальные ЭПР-спектры меланина

было показано, что в процессе обесцвечивания' эумелангш разрушало! первым. Его парамагнетизм обусловлен полимерной сеткой 4.5-эндолхшюнов, которая более чувствительна к окислительному воздействию РЬСЬ по сравнению с фео меланином, Особенностью ф с о меланинов является наличие в полимерной сечке аминокислотного остатка цистеинов, которые обуславливают большую резистентность. Представленные результаты позволяют использовать метод ЭПР для тонкого количественного определения относительной доли эумеланштов и феомеланинов в пигменте волоса. Показано, что в пигменте екальпового волоса здорового взрослого человека может присутствовать до 50% феом елани па, тогда как в светлом волосе эумеланин практически отсутствует,

3 первом параграфе четвертой главы обсуждаются результаты экспериментального изучения температурной эволюции интегральной интенсивности ЭПР сигнала кератяновоЙ подсистемы лобкового волоса.

1600

а ¡100 Г г

то | * $

ы нн» '

5 «00 - © и

<

600 • Ат

400 ! ш □Р

101) |

90 ш

ч

т, к

т, К

, Ц §р

Рис- 8, Температурные зависимости обратной интегральной интенсив пост и

^„р (а) и ширины ДВ (б) ЭПР сигнала меланолротеинового волокна

На полученных спектрах широкая компонента представляла собой одиночную ассимстричную линию. В этом случае удалось проинтегрировать весь спектр. В результате была получена зависимость обратной величины интегральной интенсивности 1Г1..(Т)"; в диапазоне температур 103<Т<293 К (рис. 8а). Как видно из графика, при Т<148 К 1,пр(ТУ' резко возрастает. Отметим, что ширина сигнала ДВ ниже 148 К также возрастает до значения ДВ(93КУ=1:300 Гс. Выше перехода, Т>148 К, 1:)„р(ТУ1~2'10"4Т. Такое значение соответствует закону Кюрй-Вейса с 0=-14,5 К. Учитывая температурные свойства полимеров, логично предположить, что Т= 14 8К является для меланопротеинового волокна температурой стеклования. В пользу этого свидетельствует Й зависимость ДВ(Т), рис. 86. Из графика

г, к

Рис. 9, Температурная зависимость интегральной интенсивности ЭПР сигнала меланопротеинового волокна

видно, что ДВ возрастает с увеличением температуры, при этом интенсивность ^„ДТ) падает. Следовательно охлаждение белкового волокна приводит к локализации магнитных моментов на димерах а-кератина.

При нагревании параметры сигнала кератина обнаруживают несколько характерных температур. На рис. 9 представлена температурная эволюция интегральной интенсивности ЭПР сигнала в диапазоне температур 200<Т<550К. Монотонное убывание зависимости 1,яр(Т) является продолжением закона Кюри-Вейса. Особенность в области Т=370 К может быть связана с выходом паров воды из волокна волоса. Данное поведение интегральной интенсивности является дополнительным подтверждением чувствительности сигнала кератина к перестройке филаментов в волокне. Как видно из температурной эволюции ЭПР сигнала, матричная протеиновая подсистема не претерпевает существенной перестройки при этих процессах.

При Т>470К начинается выход летучих химических компонент. Дальнейший нагрев выше 500К приводит к плавлению образца: структура кератиновых ассоциатов разрушается. В соответствии с этой картиной 13]1Р(Т) падает. Отметим, что полного исчезновения сигнала с ростом температуры не происходит, т.е. при этом механизмы формирования сигнала изменяются.

На рис. 10 представлены характерные температурные зависимости 1,ир(Т) и ДВ(Т) для ЭПР сигнала кератина скальпового волоса. Как видно из рисунка, относительная интенсивность не претерпевает изменений во всем диапазоне температур К)3<Т<303К (на рис. 10а обозначена Д). Сам спектр ЭПР кератинов ой подсистемы в случае скальпового волоса можно представить в виде суперпозиции двух компонент: широкой линии с параметрами ДВ(300К)=400-Ш<)0Гс, g~2.2 и узкой линии с параметрами ДВ(ЗООК)=200-500Гс,а=2,38 (рис. 11).

ПО Г 159 :-

-.8.1* -I

Дм

оФ*

Т Т й1 "

09

Т, X т, к

Рис, 10. Температурные зависимости относительной интенсивности (а) и ширины сигнала (б) ЭПР сигнала мелаиопротеинового волокна: Д - полный спектр ЭПР, □ - узкая компонента ЭПР сигнала

В результате проведенной декенволющга экспериментальных спектров была получена температурная зависимость резонансных параметров узкой компоненты ЭПР сигнала кератина (на Рис. 10, обозначена □). Интенсивность данной компоненты возрастает: при охлаждении до Т—200 К,

и может быть описана в этом интервале зависимостью Кюри типа 1<~Т"'. Однако при Т<200К 131,р(Т) монотонно убывает, достигая 50% исходного значен mi при Т=120К. Таким образом, при низких температурах в меланопротеиновых волокнах вновь наблюдаются процессы стеклования.

Температурная эволюция полного спектра не проявляет резких изменений в ширине или интенсивности (рис.10а и 106). Ни на одном из образцов не наблюдается зависимость Кюри-типа. Отсутствие ярко выраженной температурной зависимости интенсивности и аксиально-симметричная форма линии указывают на более сложную природу соответствующих парамагнитных центров.

Второй параграф посвящен обсуждению результатов исследования температурных свойств пигментной подсистемы мелано протеинового волокна, lía Рис. Í2 представлена зависимость 1зпр(Т) и ДВ(Т) сигнала

меланина. Как видно из графика, в интервале 150^350 К интегральная интенсивность слабо зависит от температуры и составляет 0 спин/fe При повышении температуры 1эп|) пропорционально возрастает примерно в 10 раз, достигая максимума при 1=530 К. При Т>470К происходит выход летучих и последующий пиролиз ме л ано протеи ново го волокна. Очевидно, в интервале ДТ=60К ниже 530К процесс пиролиза не затрагивает меланиновые гранулы. Однако при более высоких полимерной семихипошшй сетки и сигнал Э! ГР пропадает. Отметим, что во всем исследованном диапазоне ширина линии не зависит от температуры, Температурно-независимое поведение ДВ при ДТ=400К встречается достаточно редко, и свидетельствует об активных процессах сужения, которые маскируют Действительную величину скорости релаксации, ДВ-1/Т. Действительно, поскольку молекулярные продуктьг окисления тирозина внутри отдельной пигментной гранулы (индолхнноны) образуют двумерные полимерные сетки, то вклад в парамагнитный сигнал будут давать лишь термоактивированные состояния. Спины в этих состояниях, не являются локализованными. Ширина линии в

спектр меланопротеинового волокна скальпового волоса

150 1 зу) :г :> ,

Т,К

Рис. 12. Температурная зависимость интегральной интенсивности (Д) и ширины (□) ЭПР сигнала меланина

температурах происходит разрушение

этом случае будет определяться не временем спин-спиновой релаксации Т2, а механизмами двигательного сужения, менее чувствительными к температуре. Ранее было показано, что параметр Т2 различается незначительно, тогда как время с пин-решеточной релаксации Т[ отличается на несколько порядков, что свидетельствует в пользу существования механизма сужения. При этом спиновая концентрация определяется процессами термоактивации, что и наблюдается на эксперименте в виде роста интенсивности с температурой (рис. 12), Оценка полупроводниковой щели составляет 4Еа-й,15 зВ, что разумно согласуется с аналогичными величинами для молекулярных полупроводников. Таким образом, показано, что ЭГ1Р не только позволяет идентифицировать наличие и особенности пигмента в волокне, но и изучать его электронное строение.

Поскольку пигмент в волосе не устойчив к действию ряда химических соединений и легко удаляется, разумно предположить, что под действием осветлителя характер температурной эволюции сигнала ЭПР меланина изменится. На Рис. 16 приведены зависимости интегральных интенсивностей сигналов ЭПР меланина и кератина от температуры в диапазоне 93-г50Ж. Как видно из рисунка, в результате действия П;03 температурные зависимости 19гр для-обеих подсистем, рассмотренные ранее (Рис. 8а, 12), претерпели кардинальные изменения. Спиновая концентрация сигнала ЭПР кератина уменьшается во всей области температур (рис. 13) и может быть описана законом Кюри. Величина I,™ для сигнала меланина также деградирует с ростом температуры, а характерный скачек ори Т>350К (рис. 12) выродился й линейную зависимость. Учитывая, что спиновые концентрации рассматриваемых подсистем одновременно уменьшаются с температурой, очевидно, что имеет место существенная корреляция между белковым составом полоса и пигметнымя гранулами,

Г4

Г, к т, к

Рис. 13. Температурная зависимость интегральной интенсивности ЭПР сигналов кератина (а) и меланина (б) обработанных Н20з

В третьем пара1рафе обсуждаются механизмы формирования сигнала ЭПР в кератиноной подсистеме волоса. Ранее мы показали [4], что сигнал возникает в процессе ассоциации гетрам ер о в в протофиламенты. В этих условиях гидрофильные аминокислотные остатки, содеражащие аромагруппу

(тирозин), образуют до нор но-акцепторные комплекс ы с переносом: заряда (КПЗ) с аминокислотными остатками соседней протеиновой цепочки. При растворении материала кортекса ассоциаты распадаются и соответственно ЭПР сигнал должен исчезать, что и наблюдается в эксперименте. Вместе с тем, в нативном состоянии каждый единичный димерцый фрагмент способен образовать до 10 подобных комплексов в зависимости от пространственной организации тетрамеров. Отмстим, что для КПЗ ширины линий ЭПР --I0'1 Гс не представляются необычными. Более того, ориентация аминокислотных остатков жестко не привязана к общему направлению полилептидной цепи, поэтому даже в ориентированных образцах спектры должны иметь форму, характерную для анизотропных порошков.

Пятая глава содержит обсуждение экспериментальных данных, подученных в результате исследования .эволюции параметров ЭПР сигнала в процессе механического растяжения кергпи новых волокон.

В современных представлениях, молекулы кератина в нормальном состоянии образуют сложную иерархическую спиральную структуру; включающую в себя д и мерные, тстрамерные спирали и спирали протофиламентов. Механическая нагрузка приводит к постепенному «раскручиванию» филаментарной структуры вплоть до димериых фрагментов. С молекулярной точки зрения этот процесс соответствует превращению а-кератина в ^-кератин, или а-р-переходу. Известно, что образование [3-структуры из кератиновых сс-спиралей в человеческом волосе происходит при относительных удлинениях -30%. Причем растяжение при одновременном увлажнении приводит к более глубокой реорганизации вторичной структуры: u-с: тральные цепи, вытягиваясь, переходят в структуру с одновременным установлением системы межцепьевых водородных связей.

Исходя из изложенной концепции а-[3-перехода, исследование эволюции параметров ЭПР сигнала в процессе механического растяжения кератиновых волокон является актуальной задачей. В данной работе были

____ _______проведены in situ эксперименты с

двумя образцами волос, значительно различающимися по прочности. Наибольший интерес представляют данные, полученные для второго образца, т.к. критическое значение относительного удлинения в этом случае составило больше 30%. Образцы в виде пучков длиной ] 10180 мм. помещались в резонатор. Запись спектров проводилась непосредственно в процессе растяжения с одновременным измерением удлинения. Кроме этого, полная нагрузочная кривая

1'ис. 14. Зависимость напряжения о от относительного удлинения г для одного волоса

измерялась для индивидуального волоса. Соответствующие графики представлены в координатах g(e), где s - относительное удлинение образп.а. о - нагрузка, На рис. 14 изображена кривая растяжения a(s) для одиночного волоса. Как видно из рисунка, зависимость о(е) соответствует характерным нагрузочным кривым большинства полимеров. На графике в диапазоне значений а<178 МПа, с максимальным значенном ¿-=4,1% представлека квазиупругая область (а), характеризующаяся величиной модуля Юнга Е=5,98 ГШ. При а=192 МПа начинается вязкотекучее удлинений волоса {область б), так что в течение 48 часов значение е достигает 23%. При дальнейшем увеличений нагрузки наступает фаза прочности (область в), характеризуемая линейной зависимостью о=к-в, где к-0,29 ГПа, Соответствующие значения сгК1, и ещ составили 234 МГ1а (84 г.) и 38%.

На рис. Í5 представлены зависимости о(е) и 1эг||™г,м(е) (1:!ирНОрм(Е)=1эгтр(е)Лэт, где J3r - интенсивность сигнала эталона) для пучка волос. Как и для одиночного волоса, кривая растяжения для пучка (на рис. изображена ромбами) хорошо согласуется с характерными нагрузочными кривыми большинства полимерны* волокон. На 1рафикс имеется участок упругой деформации при 0<к<9%, Удельное напряжение в этом интервале аппроксимируется линейкой зависимостью: с=1084.7-еч12,04. Т.о. модуль Юнга Е при £<10% .08 J~TJa. Соотв&уствуюишд критические параметры состазили 0^=117 МПа (21250 г.), аьр=35%.

о „ л „

Е, %

МЕ-М

| 7,13Е.+Ш

^ É,{lE-ií3

S.OZ+ÍÚ £ Ptic. 15, Зависимости

-i 4,i>F.+i;5 напряжения v (0) и

' З.ОЕ+03 % нормированной

И КПЗ Г-ГСИБЫ ОСТИ

j 2,0E+Í3 сигнала ЭГГР (•) от

]f0EKI3 отно сителъного

d,OF>OD удлинения £ для

35 пучка волос

Исходя из строения кератиновых филам ентов, наиболее вероятным механизмом, обеспечивающим упругую деформацию, 0<ё<10%, является обратимое разворачивание протофиламент в направлении действия силы. В области напряжений о~100 МПа величина а резко возрастает. Для данной стадий характерны «ступеньки» на зависимости о(е). На рис. 15 наблюдается одна, «ступень» при е=25%. Дня одиночного волоса количество «ступеней» зависит от морфологии. «Ступень» возникает, когда энергия деформации становится соизмеримой с характерными энергиями связей между тетрам ерами. При увеличении нагрузки Лртсхолш вязкие сдвиги протофиламеггтов друг относительно друга. Для пучка они начинаются при

а«! 05 МПа. Область вязкого течения заканчивается при а=30%. Эта величина вполне логично объясняется характером перекрытия димеров внутри тетрамера. Химическая связь (-5-8- мостики, водородные связи) в тетрамере образуется за счет контактов ^¡ск'-Ьу-зцЗе) 1/3 длины единичного кератипового димсра с соседним димером. При растяжении в области е®30% перекрывающиеся области уменьшаются, так что соседние дм меры «зацепляются» только своими концевыми полимерными группами «голова-хвост» либо «голова-голова». Вероятно в этот момент происходит переход от а-структуры к ¡3-листу, когда за счет растяжения распрямляется спиральная структура димера.

Следует отметить, что и процессе эксперимента материал оставался в сухом состоянии. Обработки паром не проводилось, поскольку наличие паров воды неконтролируемо уменьшает

добротность резонатора и делает невозможным корректное

измерение величины 1шр. Принимая во внимание принципиальную важность обработки паром для перестройки водородных связей в структуре кортексных а-кератинов, мы не можем достоверно утверждать о наличии а-р-перехода. Величина !пряП&) и форма линии сигнала ЭПР в интервале 0%<в<35% не испытывают заметных изменений в пределах погрешности эксперимента 15%. Эволюция формы линии представлена на рис, 16. Как видно из рисунка, широкая компонента в спектре ЭПР не наблюдается, а вклад от узкой компоненты (-200 Гс), обусловленный радикалами серы К-8* и не чувствителен к

Процессам растяжения и вязкого сдвига. Т.е. в процессе перестройки химических связей, имеющихся в исходной структуре, радикалы серы являются стабильными, и число их не изменяется вплоть до разрыва волоса. Вклад от широкой компоненты, обусловленный КПЗ на базе аминокислотных остатков, оказывается чувствительным к деформации уже в упругой фазе и исчезает при е~5%. Таким образом, при к в ази статическом растяжении и без обработки водяным паром парамагнитные центры в кортсксном а-кертаине не чувствительны к а-]3-переходу.

В шестой главе обсуждается возможность диагностики онкологических заболеваний по волосам методом ЭПР.

Взаимосвязь структурных особенностей а-кератина человеческого волоса с онкологической патологией, в частности рака молочной железы, была впервые обнаружена в 1999 г. проф, В. Джеймс. Исследования дифрактограмй синхротрон но го излучения показали су г ¡чествование аномальных колец в малоугловых диффузных паттернах, характерных для

26И юм «во мои

Рис. 16. Эволюция формы лийни ЭПР с ростом с для пучка волос

1аблица 1

Резонансные параметры сигналов ЭПР нормальных волос

Образец Интенсив цвета 2 и 2 "5 II о о "о Образец Интенсив цвета чО 21й 1— о о "© Н

I группа IV группа

Н0308 2 5 ЗД2 4,15 Н0408 1 0 1,25 4,87

Н2308 4 5 8,48 5,62 Н0408 2 3 2,02 5,3

Н2408 1 5 5,85 3,55 Н1407 1 3 3,93 5,46

Н2908 2 5 3,06 5,03 Н1707 4 4 3,46 5,51

Н1407 4 5 0,96 2,20 Н0708 1 5 2,86 8,57

Н2308 2 6 6,32 9,54 Н1307 1 5 2,20 4,67

Н2408 2 6 7,62 4,46 Н1307 2 5 3,17 5,19

Н2908 1 6 7,60 4,98 Н1307 4 5 3,66 4,88

Н2408 3 8 5,24 8,91 Н1407 2 5 7,48 1,14

Н1407 5 8 1,14 2,08 Н1407 3 6 4,08 9,46

Н2308 3 10 14,2 8,31 Н1707 3 9 5,14 8,14

нормального волоса Группой В Джеймс было установлено, что аномалии в дифрактограммах волос становятся различимы на самых ранних фазах развития рака молочной железы Известно, что подобные отклонения связаны с особенностями молекулярной структуры кератина Однако определить их локализацию и характер до настоящего времени не удавалось Наиболее вероятной причиной рака молочной железы является участие мутирующих генов группы ВКСА, обуславливающих онкопатологию, в кодировании кератинов Выше бьшо показано, что в иерархической молекулярной структуре нормального волоса а-кератины обладают парамагнитными свойствами и демонстрируют сложные ЭПР сигналы Логично предположить, что структурные аномалии, зарегистрированные в дифракционных спектрах синхротронного излучения, влияют на ЭПР характеристики Выявление такой взаимосвязи, ее качественное и количественное описание является чрезвычайно актуальной задачей В случае ее успешного решения создаются физические основы нового инструментального метода ранней диагностики рака молочной железы

В данной работе проведен скрининг образцов лобковых волос более сотни доноров женского пола различных возрастных групп Экстракция, характеризация и подготовка образцов производились на базе момологического центра г Екатеринбурга под руководством проф дмн С М Демидова Образцы были распределены по основным четырем группам I - отсутствие патологии, II - онкопатология по родственной линии, III -выявленные доброкачественные нарушения, IV - выраженная клинически подтвержденная онкопатология В качестве основных параметров ЭПР сигнала кератина регистрировались ширина линии главной компоненты и интегральная интенсивность полного спектра Также исследовались

аналогичные параметры сигнала меланина. Кроме того, для каждого образца проводились эксперименты по насыщению. Из кривых насыщения извлекались параметры спин-спиновой Т: и спин-решеточной Т] релаксации.

В таблице 1 приведены наиболее характерные экспериментальные данные, свойственные подсистеме меланина. Первая и пятая колонки содержат шифры образцов волос здоровых доноров (Табл. 1, 1 группа) и доноров с выявленной клинической формой рака молочной железы (Табл. 1, IV группа), В колонках 2 и 6 приведены значения интенсивности Л окраски волос доноров определенные визуальными методами с помощью оптической микроскопии. В колонках 3,7 и 4,8 указаны значения спиновой концентрации 1,Пр и времни спин-решеточной релаксации соответственно. Качественно хорошо различимо, что для светлых волос разброс значений Т] существенно выше, чем для ярко выраженного черного волоса с 1=10.

Учитывая, что величину 1-11|р можно рассматривать как количественную характеристику содержания эумеланина, сравним значения спиновой концентрации 131,р и интенсивности окраски. Из таблицы видно, что наиболее интенсивно пигментированному черному волосу соответствует максимальная величина Тзкр=1 ?4-1017 спин/г. С другой стороны, для светлых волос визуально определяемых в одну цветовую группу 1-шР изменяется на порядок в интервале 9,6-10'5^8,4-1016 спин/г. Это неудивительно, поскольку в ходе экспериментов но обесцвечиванию человеческого волоса мы показали, что визуально менее заметное подмешивание фсумеланина приводит к

существенным изменениям в спиновых характеристиках.

Сопоставляя значения Т] и 1-,лр видно, что в диапазоне величии ],4-Ю|(Ч,4-1017, параметр Т, изменялся от 2, М 0"5-^9.4' 1С"5 с, Соответствующие значения 1*2> как было показано ранее, оставались неизменными в пределах 10%,

Приведем аналогичные

исследования для группы доноров с выявленной клинической формой рака молочной железы (IV группа). Как видно из таблицы 1, зависимость 1:)1ф от интенсивности окраски волоса I в целом хорошо укладывается в тенденцию, отмеченную выше для здоровых волос. Так, самому светлому волосу соответствует минимальное значение 1апр=1,2-10 спин/г. Вместе с тем, отмечаются и аномальные образцы, когда для среднепигментированного волоса, например (Н1407_2)1 наблюдается значение 1э[1р=7,5-1016 спин/г. типичное для хорошо окрашенных черных волос. Диапазон значений Т] для доноров IV группы качественно не изменился и составил 4,9-10"~-9;5'10"5 с. Отметим, что для образца Н1407_2

1,1ЬЧ'4 (-

1,0£Н>4 5,01-05

з.ак-пк

СДЕ-ЮЭ

ф IV г^уи[1л| Л1 группа

д I

а о

и. ■ ;||; ■ 1г1

Рис. 17. Зависимость времени спин-решеточноЙ релаксации ЭПР сигнала меланина от возраста доноров

величина также оказалось аномально низкой Т;~1 ■10"'.

Предполагая, что, по крайней мере, частично ЭПР параметры сигнала меланина, могут отражать морфологические изменения в волосе, приведем данные о взаимосвязи Т1 и 1эир от возраста доноров, принадлежащих обоим группам Г. IV. На рис. 17 представлены времена спин-решеточной релаксации Т]. Из рисунка видно, что для нормально пигментированных волос (отсутствие седых) не отмечается зависимости Т, от возраста донора как для первой, Так и дтя четвертой группы.

Важным фактором, влияющим на морфологию волоса, может быть этническая принадлежность донора. Его корректный учет возможен при более масштабном исследовании.

Таким образом, было показано, что основные вариабельные параметры сигнала меланина, такие как интегральная интенсивность и ирешг йшт-решеточной релаксации, не обнаруживают качественных различий в случаях наличия или отсутствия у доноров клинически выявленных форм рака молочной железы. Отметим, что количественные характеристики 1Э1!р и Т; позволяют проводить более тонкую идентификацию меланиновой подсистемы человеческого волоса. Вместе с тем наибольший интерес в диагностическом аспекте представляет исследование кератиновой подсистемы. Особое внимание в данной главе было уделено основной характеристике ЭТТР - интегральной интенсивности полного спектра 1.1П?,

На рис. 18 представлена зависимость величины ;:11!? от возраста доноров 1 и .IV группы. Дчя возрастного интервала 20-50 лет, характеризующегося основными рисками развития рака молочной железы, не наблюдается существенных изменений для спектров

нормальных волос. Из рисунка видно, что величина 1,™ лежит в интервале 5-10м-5-10 спин/г. Аналогичные величины мы зарегистрировали и для большинства скальповых волос. В йредположении, что аномальные дифрактограммы, обнаруженные В. Джеймс и коллегами, связаны с

м агн итоактив ним и фрагм е нтами

молекулярных иерархических структур а-кератинов, оыли детально исследованы интегральные характеристики соответствующих ЭГТР спектров. ..Как и для нормальных волос, образцы IV группы также не обнаруживают заметных возрастных изменений интегральных характеристик ЭПР спектра кератина. Полученные значения лежат в интервале 0,ЗТ02|-Н,3-1021 спин/г.

I Группа ц О IV Гцуяпа

I <>

Ид <>

И ^

1 о

о

-1.

10 та 85 уи 141)

Г.. т лет

Рис, 18. Зависимость спиновой концентрации ЭПР сигнала кератин от возраста доноров

lía рис. J 9 представлены результаты (елеиого теста) образцов лобковых волос доноров I и IV групп. В эксперименте совместно анализировались интегральные интенсивности сигналов меланина и кератина. Интенсивность сигнала меланина определялась с учетом массовой доли пигмента в массе образца волоса 0,1%. Перед экспериментом образцы были пронумерованы без указания группы. После проведения теста принадлежность к группе была идентифицирована. На рисунке образцы IV группы выделены затененной областью. Результаты эксперимента хорошо согласуются с ранее приведенными данными (табл, 1, рис, 17,18). Вместе с тем, обнаруживается необычная взаимная корреляция ЭПР характеристик как кератиновой, так и мелаишопой подсистем. Причем эта корреляция более ярко выражена для образцов группы I (рис. 19). Природа данного факта в настоящий момент не ясна. Возможно, белковая подсистема кератина и мелалиновые ¡ранулы в кортексе волоса связаны молекулярным взаимодействием, так что в окрестностях индивидуальной меланиповой гранулы присутствует некоторая доля парамагнитных центров кератшкдамх филаментов,

!:!l¡,'¡:il;í!l!l"- i.

И

G XrpaTHHj I

'"¡iíiiSÍÜii

I. а

У ^

1 • Л -

i?T

er

:üaagLi -J-

Í G

a &

Рис, 19. Зависимости | относительной е интенсивности ЭПР

о

|д сигналов кератина и | I меланина волос

| I здоровых доноров и | I доноров с выявленной = онко патологе ей: точки § в затемненной области соответствую а1 IV

группе

В результате сравнительного изучения параметров ЭПР спектров меланиновой и кератиновой подсистем образцов лобковых волос доноров с клинически выявленным раком молочной железы и отсутствием онкоггатологии было установлено, что интегральные характеристики качественно не отражают изменений молекулярных свойств вызванных наличием патологии. Мы допускаем, что количественно эти эффекты могут присутствовать в слабой степени на уровне чувствительно с ги метода.

Как было показано выше, в ЭПР спектрах екальповых волос проявляются парциальные вклады от линий с различным температурным поведением. Можно допустить, что изменения вы званные наличием патологии могут быть связаны с одним из них. В этом случае на фоке интегральной характеристики всего спепра изменения этого вклада может быть несу [цестве иными. Дальнейшие исследования в данном направлении предполагают деконволицию исходных спектров.

В заключении сформулированы основные результаты и краткие

выводы настоящей диссертации

1 Проведены систематические ЭПР исследования более 200 образцов человеческого волоса Показано, что на всех образцах помимо сигнала меланина (ДВ«4-6 Гс, g=2,004), сигналов от ферросодержащих примесей Ре(Ш) (ДВ«70-500 Гс, §=4,3) и серосодержащих радикалов на основе цистеина (ДВ=15-70 Гс, gl=2,00 §2=2,03 gз=2,06) зарегистрирован и выделен неразрешенный ЭПР спектр, включающий несколько линий узкую симметричную компоненту (ДВ(300К)=200-500 Гс, §=2,38) и более широкую компоненту (ДВ(300К)=400-1000 Гс, g~2 2) В результате экспериментов установлено, что ЭПР-центры, ответственные за неидентифицированный сигнал, локализованы в кератиновых ассоциатах и не связаны с парамагнитными примесями

2 Для ЭПР сигнала меланина проведены расчеты времен спин-решеточной Ть и спин-спиновой Т2, релаксации Показано, что значение Т2, незначительно изменяется от образца к образцу и для паховых волос в среднем составляет 10'9с Время Т] попадает в интервал от 104 до 10"6 с

3 Предложен метод количественного определения относительной доли эумеланинов и феомеланинов в пигменте человеческого волоса с помощью ЭПР-спектроскопии Показано, что в пигменте скальпового волоса здорового взрослого человека может присутствовать до 50% феомеланина, в светлом волосе эумеланин практически отсутствует

4 Проведены детальные измерения температурных зависимостей основных характеристик ЭПР спектров волос в интервале 100-550 К Установлено, что для сигнала кератина лобкового волоса спиновая восприимчивость при низких температурах, с характерной температурой стеклования Т=148 К, соответствует закону Кюри Методом деконволюции показано, что температурная зависимость 1эпр и ДВ узкой компоненты ЭПР сигнала кератина скальпового волоса в интервале Т>200 К также может быть описана зависимостью Кюри-типа Установлена взаимосвязь широкого ЭПР сигнала (~103 Гс) с аминокислотными донорно-акцепторными комплексами (КПЗ) В результате исследования температурной эволюции параметров ЭПР сигнала меланина показано, что для пигмента в диапазоне ЮЗК<Т<ЗЗЗК наблюдается характерная частичная делокализация спинов, а при температурах 343К<Т<523К магнитные моменты переходят в активированное триплетное состояние Установлено, что материал пигментных гранул соответствует низкоразмерному органическому полупроводнику с Еа~0,15 эВ

5 Проведены эксперименты по исследованию эволюции параметров ЭПР сигнала человеческого волоса в процессе механического растяжения кератиновых волокон Показано, что величина нормированной интенсивности 1эпр"орм(£) полного ЭПР спектра устойчива к квазистатическому растяжению в интервале 0<£<30% Обнаружено, что вклад широкой компоненты, обусловленный КПЗ, чувствителен к деформации, так что при относительных удлинениях е>10% становится неразрешим

6 Проведен сравнительный анализ параметров ЭПР спектров белковой и

пигментной подсистем лобковых волос доноров с клинически выявленным раком молочной железы и отсутствием онкопатологии. Установлено, наличие корреляции между интегральной интенсивностью сигналов ЭПР меланина и кератина. Проведенные исследования указывают на необходимость поиска взаимосвязи ЭПР-свойств и наличия онкопотологии среди парциальных вкладов в спектры ЭПР, обусловленных КПЗ

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1 Д Р. Байтимиров, Т А Правишкина, Д В Стариченко, С Ф Конев, Ю Н Швачко Парамагнетизм меланопротеиновых волокон // - Химические волокна 2006 №6

2 D R Baitimirov, D V Stanchenko, Т A Pravlshkma, S F Konev, Yu. N Shvachko Paramagnetism of melanoprotein fibres // - Fibre Chemistry 2006 No38 P 49-54

3 Д P Байтимиров, Д В Стариченко, Ю Н Швачко, С Ф Конев Парамегнетизм а-кератинов в меланопротеиновых волокнах// - Сборник тезисов III Международной конференции «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики» Иваново 2006 С 45

4 Д Р Байтимиров, Д В Стариченко, Ю Н Швачко Влияние криомеханического разрушения на ЭПР свойства меланопротеиновых волокон // - Сб тез IX Международной молодежной школы «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» Казань 2005 г С 32-35

5 Yu N Shvachko, D R Baytimirov, D V Stanchenko // Actual problems of magnetic resonance and its application Kazan 2005 P 35-32

6 DR Baytimirov, D V Starichenko, Yu N Shvachko// - Proc Mod Development Magn Res Kazan 2004 P 328-329

7 Д P Байтимиров, Д В Стариченко, С Ф Конев, Ю Н. Швачко, В Г Мазуренко Наноструктуры в природных меланопротеиновых волокнах ЭПР исследование//-Вестник УГТУ-УПИ №5(35)2 Екатеринбург 2004

8 Д Р Байтимиров, Д В Стариченко, Ю Н Швачко, С Ф Конев Наноструктуры в природных меланиновых волокнах ЭПР исследование // -Материалы IV Молодежного семинара по проблемам физики конденсированного состояния вещества Екатеринбург 2003 С 52

9 ЮН Швачко, Д.В. Стариченко, ДР Байтимиров, СФ Конев, СМ Демидов ЭПР в биомолекулярных волокнах // - Сб тез докл IX международного семинара «Дислокационная структура и механические свойства металлов и сплавов», Екатеринбург 2002 С 186-187

10 Байтимиров ДР Конев СФ// - Сб тези студенческой научной конференции УГТУ-УПИ, Екатеринбург 2002 г С 152

11 Yu N Shvachko, DV Stanchenko, DV. Sirazhiev, DR Baytimirov, R R Nigmatullin, S.I Osokin Paramagnetism of Keratin in Human Hair// - EPR Lmeshape Analysis, in Abstracts of International Workshop «Modern Development of Magnetic Resonance Imagmg and Spectroscopy Basic Physics and Applications in Medicine and Biology» Kazan 2001 P 78

Отпгча1ано б типографии ООО ^Издательство УМЦ УПИ» 620078, Екатеринбург, ул Гагарина, 35а, оф 2 Заказ ЛО£8 Тираж ¿00 экз

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Строение человеческого волоса

1.1.1. Структурно-пространственная организация белков

1.1.2. Строение а-кератина

1.1.3. Строение меланина

1.2. Электронный парамагнитный резонанс в белковых объектах

1.2.1. Радикалы, возникающие под действием излучения высокой энергии

1.2.2. Радикалы, образующиеся при высоких температурах

1.2.3. Радикалы, образующиеся при комнатной температуре

1.2.4. Радикалы, образующиеся при низких температурах

1.3. Современные аспекты изучения биологических структур 37 Постановка задачи 42 >

Глава 2. Методика проведения эксперимента

2.1. Электронный Парамагнитный Резонанс (ЭПР)

2.1.1. Основы теории ЭПР

2.1.2. Низкотемпературные измерения 49 2.1.3. Параметры спектров ЭПР и извлекаемая из них информация

2.1.3.1. Ширина линии

2.1.3.2. Интенсивность

2.1.3.3. g-фактор

2.1.3.4. Форма линии

2.2. Приготовление образцов

2.3.1. Экспериментальная аппаратура для снятия нагрузочных характеристик волоса.

2.3.2. Экспериментальная аппаратура для снятия нагрузочных характеристик с использование метода ЭПР.

Актуальность. Человеческий волос представляет собой природное органическое волокно, в состав которого входит белок кератин и биополимер меланин. Учитывая, что данные подсистемы имеют непосредственную связь с процессами, протекающими в организме, волос является важным объектом для научных исследований. Сегодня можно с полной уверенностью утверждать, что методика ЭПР-спектроскопии позволяет более детально изучить специфику этих процессов, проходящих как при формировании волоса (непосредственно в коже), так и процессов проходящих в организме человека в целом. До настоящего времени исследования волос традиционно проводились в двух основных направлениях: косметологическом и медицинском. Медицинское акцентируется не на самом волосе, а, как правило, на биохимических и цитобиологических явлениях, протекающих в волосяной луковице. Терминальные волосяные волокна, являющиеся с точки зрения биологии мертвым клеточным материалом, не рассматривались как объект для полномасштабных физических исследований. Несмотря на то, что волос обладает целым рядом уникальных свойств не отмечено систематического интереса к ним и со стороны специалистов по магнитному резонансу. В качестве исключения можно рассматривать серию работ по ЭПР при фотовозбуждении пигмента и по связи естественной пигментации волос со спектрами различных синтетических меланинов [1,2,3]. Отметим, что волос, представляя собой высокоупорядоченное биоволокно с постоянной скоростью роста, является, по существу, ретроспективным датчиком биохимических процессов в организме за период от недель до нескольких лет. Наглядный пример биоиндикации - седина, когда изменение цвета волос свидетельствует о прекращении синтеза меланинов. Разумно предположить, что современные резонансные методики в состоянии различить более тонкие изменения. Несомненным достоинством самого объекта с точки зрения ЭПР является, в отличие от других биологических тканей, отсутствие в его составе воды.

Мощным стимулом к дальнейшему изучению волоса явилась серия работ австралийских и американских исследователей [4, 5, 6]. Ими, в рентгеновских дифрактограммах волос пациентов с онкопатологией молочной железы, были обнаружены характерные диффузные кольца, свидетельствующие о структурных нарушениях в белках. Поздние эксперименты с использованием синхротронного излучения подтвердили наблюдаемую аномалию. Возникла задача о выявлении подобной аномалии методом ЭПР-спектроскопии.

Кроме того, в последние десятилетия значительно возрос интерес к использованию природных полимеров, в частности биополимеров. Материалы на их основе экологически безвредны и легко утилизируются. Меланопротеиновые волокна (шерсть, перо, волосы) являются широко распространенными природными полимерами, в которых существуют супрамолекулярные наноструктуры [7]. Такие материалы рассматриваются как перспективная база современной нанотехнологии [8]. В этом ряду человеческий волос представляет особый интерес. Химическое модифицирование протеиновых волокон открывает разнообразные возможности для создания новых биосовместимых материалов, которые в настоящее время уже востребованы медициной.

Таким образом, изучение магнитных свойств меланопротеиновых волокон является актуальным как с научной, так и с практической точки зрения.

Целью работы являлось разработка методологической основы и выявление информативных параметров для применения ЭПР в качестве метода медицинской диагностики онкологических заболеваний по изменениям парамагнитных свойств человеческого волоса. Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи: 1. Поиск и идентификация всех вкладов в спектр ЭПР пигментной и белковой подсистем при нормальных условиях.

2. Исследование эволюции спектральных характеристик при внешних воздействиях (высокие, низкие температуры, механическое растяжение, ультразвуковое воздействие, у-облучение, растворение и д.р.).

3. Выявление диагностически перспективных спектральных характеристик, чувствительных к структурным изменениям меланопротеиновой системы, обусловленным онкопатологией.

Методы исследования, достоверность и обоснованность результатов. В работе использован известный и хорошо апробированный метод экспериментальных исследований - ЭПР-спектроскопия. Достоверность результатов работы определялась хорошим совпадением экспериментальных спектров с некоторыми данными других авторов.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующих оригинальных результатах:

1. Впервые показано, что ЭПР сигнал меланопротеинового волокна имеет дополнительные компоненты, обусловленные иерархической структурной организацией филаментов а-кератина. Проведено изучение эволюции параметров этих компонент при химическом и механическом воздействии и внешнем у-облучении.

2. Проведена идентификация ЭПР спектров белковой подсистемы волоса. Наряду с линией, характеризующейся неразрешенной тонкой структурой (ДВ=15-^70 Гс, gi=2,00, g2=2,03, g3=2,06), обусловленной цистеиновыми радикалами, выделены две дополнительные компоненты спектра: узкая - с ДВ(300К)=200-500 Гс, g=2,38 и широкая компонента с ДВ(300К)=400-1000 Гс, g=2,20, которые обусловлены комплексами с переносом заряда на базе аминокислотных остатков.

3. Впервые систематически изучена температурная эволюция сигала ЭПР белковой подсистемы волоса (серосодержащие радикалы и КПЗ). Из параметров спектров определены температуры стеклования, плавления, дегидратации и обугливания а-кератина.

4. Впервые проведено экспериментальное изучение зависимости спиновой концентрации в природном меланине при высокой температуре (30(Н550 К). Результаты исследования позволили определить энергию активации триплетного состояния Еа~0,15 эВ.

5. Предложен метод количественного определения относительной доли эумеланинов и феомеланинов в пигменте человеческого волоса с помощью ЭПР-спектроскопии.

6. Впервые представлен сравнительный анализ параметров ЭПР спектров белковой и пигментной подсистем волос здоровых доноров и доноров с клинически выявленным раком молочной железы. Экспериментально обнаружена корреляция между интегральной интенсивностью сигналов ЭПР меланина и кератина.

Практическая значимость результатов исследования состоит в:

1. Классификации спектральных компонент ЭПР сигнала и формулировании модели для парамагнитных центров на базе аминокислотных остатков.

2. Разработка метода подготовки образца человеческого волоса для ЭПР исследований и определения биологически информативных спектральных параметров.

3. Разработке оригинальной методики извлечения кератинового материала из кортекса человеческого волоса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Утверждение о том, что белковая и пигментная подсистемы человеческого волоса обладают парамагнетизмом.

2. Утверждение о том, что данные подсистемы взаимодействуют и должны рассматриваться как единый меланопротеиновый полиассоциат.

3. Утверждение о том, что ЭПР характеристики надежно регистрируют морфологические состояния кератиновой подсистемы: температуры стеклования, плавления, дегидратации, карбонизации.

4. Утверждение о том, что парамагнитные центры, ответственные за широкий ЭПР сигнал от протеинового волокна, обусловлены иерархической филаментарной структурой а-кератина.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на следующих научных конференциях и школах: IX международный семинар -«Дислокационная структура и механические свойства металлов и сплавов» (Екатеринбург, 2002 г.), «Modern Development of Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. Basic Physics and Applications in Medicine and ВюЬГр» (Kazan, 2001), Modern Development of Magnetic Resonance (Kazan, 2004), VIII международная школа молодых ученых «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применение» (г. Казань, КГУ, 2005 г.). Кроме этого, результаты данной работы докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях УГТУ-УПИ.

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 11 печатных работах, включая: 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 5 статей в материалах международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка цитируемой литературы; содержит 131 страницу текста, включая 63 рисунка и 3 таблицы. Библиография содержит 60 наименований.

выводы

1. Проведены систематические ЭПР исследования более 200 образцов человеческого волоса. Показано, что на всех образцах помимо сигнала меланина (ДВ«4+6 Гс, g=2,004), сигналов от ферросодержащих примесей Fe(III) (ДВ«70+500 Гс, g=4,3) и серосодержащих радикалов на основе цистеина

ДВ=15ч-70 Гс, gi=2,00 g2=2,03 g3=2,06) зарегистрирован и выделен неразрешенный ЭПР спектр, включающий несколько линий: узкую симметричную компоненту (ДВ(300К)=200-500 Гс, g=2,38) и более широкую компоненту (ДВ(300К)=400-1000 Гс, g~2.2). В результате экспериментов установлено, что ЭПР-центры, ответственные за неидентифицированный сигнал, локализованы в кератиновых ассоциатах и не связаны с парамагнитными примесями.

2. Для ЭПР сигнала меланина проведены расчеты времён спин-решеточной Ть и спин-спиновой Т2, релаксации. Показано, что значение Т2, незначительно изменяется от образца к образцу и для паховых волос в среднем составляет 10"9с. Время Tj попадает в интервал от 10"4 до 10"6 с.

3. Предложен метод количественного определения относительной доли эумеланинов и феомеланинов в пигменте человеческого волоса с помощью ЭПР-спектроскопии. Показано, что в пигменте скальпового волоса здорового взрослого человека может присутствовать до 50% феомеланина, в светлом волосе эумеланин практически отсутствует.

4. Проведены детальные измерения температурных зависимостей основных характеристик ЭПР спектров волос в интервале 100-^550 К. Установлено, что для сигнала кератина лобкового волоса спиновая восприимчивость при низких температурах, с характерной температурой стеклования Т=148 К, соответствует закону Кюри. Методом деконволюции показано, что температурная зависимость 1эпр и ДВ узкой компоненты ЭПР сигнала кератина скальпового волоса в интервале Т>200 К также может быть описана зависимостью Кюри-типа. Установлена взаимосвязь широкого ЭПР

125 сигнала (~10 Гс) с аминокислотными донорно-акцепторными комплексами (КПЗ). В результате исследования температурной эволюции параметров ЭПР сигнала меланина показано, что для пигмента в диапазоне ЮЗК<Т<ЗЗЗК наблюдается характерная частичная делокализация спинов, а при температурах 343К<Т<523К магнитные моменты переходят в активированное триплетное состояние. Установлено, что материал пигментных гранул соответствует низкоразмерному органическому полупроводнику с Еа~0,15 эВ.

5. Проведены эксперименты по исследованию эволюции параметров ЭПР сигнала человеческого волоса в процессе механического растяжения кератиновых волокон. Показано, что величина нормированной интенсивности 1эпрНорм(е) полного ЭПР спектра устойчива к квазистатическому растяжению в интервале 0<е<30%. Обнаружено, что вклад широкой компоненты, обусловленный КПЗ, чувствителен к деформации, так что при относительных удлинениях £>10% становится неразрешим.

6. Проведен сравнительный анализ параметров ЭПР спектров белковой и пигментной подсистем лобковых волос доноров с клинически выявленным раком молочной железы и отсутствием онкопатологии. Установлено, наличие корреляции между интегральной интенсивностью сигналов ЭПР меланина и кератина. Проведенные исследования указывают на необходимость поиска взаимосвязи ЭПР-свойств и наличия онкопотологии среди парциальных вкладов в спектры ЭПР, обусловленных КПЗ.

1. Ф. Ф. Литвин, О. Б. Беляева, Н. В. Игнатов. Биосинтез хлорофилла и формирование реакционных центров фотохимических систем фотосинтеза // Успехи биологической химии. -2000. -т. 40. -С. 3-432.

2. M.S. Blois, А.В. Zahlan, J.E Maling // Biophys. J. -1964. -4, -P. 471

3. В.П. Курченко, T.A. Кукулянская, ИИ. Азарко, О.Ю. Зуева, Р.Г. Хисматуллин, В.П. Варламов. Физико-химические свойства хитинмеланинового и меланопротеинового комплексов из подмора пчел // Прикладная биохимия и микробиология. -2006. -Т. 3. 42. -С. 374-378.

4. V.J. James et al.// Int. J. Biol. Macromol. -1995. -17. P. 99.

5. V. James, J. Kearsley, T. Irving et al. Using hair to screen for breast cancer // Nature. -1999. -4. -P. 33.

6. V.J. James. A place for fiber diffraction in the detection of breast cancer? // Cancer detec. prev. -2006. -vol. 30. №3. -P. 233-238.

7. А. И. Котельников // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева), -2002. -Т. XLVI. №5. -С. 42-49.

8. М. С. Роко, В.С.Уильямс, П. Аливисатос. Нанотехнология в ближайшем десятилетии. Прогноз направления исследований. Пер. с англ. Под ред. Р. А. Андриевского/ -М.: Мир. -2002. -С. 156.

9. О.Ф. Чернова, Т.Н. Целикова. Атлас волос млекопитающих. Тонкая структура остевых волос и игл в сканирующем электронном микроскопе / -М.: Товарищество научных изданий КМК. -2004.

10. Румянцев Е.В., Антона Е.В., Чистяков Ю.В. Химические основы жизни / -Иваново: Иван. гос. хим-технол. Университет. -2003. -С. 80

11. A.M. Mitu. Damage assesment of human hair by electrophoretical analysis of human protein // Doctor Dissertation. Rheinisch-Westfalischen Technischen Hochschule, Aachen. Germany. 2004.

12. UniProt Knowledgebase // Swiss-Prot Release 31.8., TrEMBL Release. 2006.

13. E.M. Попов, B.B. Демин, Е.Д. Шибанова. Проблема белка. В 5 т. Т. 2. Пространственное строение белка / -М.: Наука. -1996. -С. 12.

14. В.М. Степанов. Молекулярная биология: Структура и функции белков / -М.: Высшая школа. -1996. -С. 91-331.

15. Ю.М. Торчинский. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков / -М.: Наука.-1971.-С. 150.

16. Х-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты, пептиды, белки / -М.: Мир. -1985.-С. 421.

17. М.В. Волькенштейн. Биофизика./ -М.: Наука. -1988. -С. 128.

18. Г. Шульц, Р. Ширмер, Принципы структурной организации белков / -М: Мир. -1982. -С. 98.

19. Krystyna Е. Wilk, Veronica J. James, Yoshiyuki Amemiya The intermediate filament structure of human hair // Biochimica et Biophysica Acta. -1995. -1245. -P. 392-396.

20. S.V. Strelkov, H. Herrmann, U. Aebi // BioEssays. Wiley Periodicals. -2003. №25. -P. 243-251.

21. Г. Бриттон, Биохимия природных пигментов / -М.: Мир. -1986.

22. W. Gordy, W. В. Ard, Н. Shields // Proc. Nat. Acad. Sci. -1955. 41. -P. 983996.

23. Л.П. Каюшин, М.Н.Пулатова, В.Г. Кривенко. Свободные радикалы и их превращения в облученных белках / -М.: Атомиздат. -1976. -С. 300.

24. W. Gordy, Y. Kurita, J. Chem. // Phys. -1960. 33. -P. 1047-1077.

25. JI.A. Блюмендфельд, А.Э. Калмансон // Биофизика. -1958. -Т. 3. №1. -С. 87.

26. JI.A. Блюмендфельд, В.В. Воеводский, А.Г. Семенов. Применение электронного парамагнитного резонанса в химии / -Новосибирск: издательство сибирского отделения АН СССР. -1962. -С. 160.

27. Т. Henricsen, Т. Sanner, A. Pihl // Radiat. Res. -1963.18. -P. 147.

28. J.W. Hunt, J.F. Williams// Radiat. Res. -1964.23. -P. 26.

29. N.B. Jackson. Strand of Hair May Point To Who Has Breast Cancer // The New Hork Times. -1999. March 4.

30. W.T. Astbury, W.A. Sisson // Proc. R. Soc. London Ser. -1935. A 150. P. 533.

31. L. Pauling, R.B. Corey // Nature. -1951. 166. P. 550.

32. J. Cao. Is the a-f3 transition of keratin a transition of a-helices to (3-pleated sheets? Part 1. In situ XRD studies // Journal of molecular structure. -2000. vol. 553. -P. 101-107.

33. L. Kreplak, J. Doucet, P. Dumas, F. Briki. New aspects of the a-helix to 13-sheet transition in stretched hard a-keratin fibers // Biophysical journal. -2004. vol. 87. -P. 640-647.

34. Д. Ингрем. Электронный парамагнитный резонанс в биологии / -М.: Мир. -1972. -С. 296.

35. С. А. Альтшулер, Б. М. Козырев. Электронный парамагнитный резонанс / -М.: Государственное издательство физико-математической литературы. -1961. -С. 368.

36. Ч. Пул. Техника ЭПР-спектроскопии / -М.: Мир. -1970.-С. 310.

37. Д.Р. Байтимиров, С.Ф. Конев // Сборник тезисов студенческой научной конференции УГТУ-УПИ. Екатеринбург. -2002 г. -С. 152.

38. К. М. Львов, О. Ф. Львова. Фотодеструктивные реакции в белках / -М.: Наука. -1988.

39. Герцберг Г. Спектры и строение простых свободных радикалов / -М.: Мир. -1974.

40. Я.И. Ажипа. Медико-биологические аспекты применения метода ЭПР / -М: Наука.-1983.

41. Д.Р. Байтимиров, С.Ф. Конев // Межрегиональная молодежная научно-практическая конференция. Екатеринбург. -2001. -С. 78-79.

42. H. Zahn. Progress report on hair keratin research / International Journal of Cosmetic Science. -2002. 24. -P. 163-169.

43. М.И. Токарева, И.С. Селезнева. Учебное электронное текстовое издание «Биохимия. Часть 2» / -Екатеринбург: ГОУ ВПО УГТУ-УПИ. -2005. -С. 22.

44. Д.Р. Байтимиров, Д.В Стариченко, Ю.Н. Швачко, С.Ф.Конев. Наноструктуры в природных меланиновых волокнах: ЭПР исследование // Материалы IV Молодежного семинара по проблемам физики конденсированного состояния вещества. -Екатеринбург. -2003. с. 52.

45. D.R. Baytimirov, D. V. Starichenko, Yu. N. Shvachko // Proc. Mod. Development Magn. Res. -Kazan. -2004. -P.328-329.

46. N. Nishikawa, Yo. Tanizawa, Sh. Tanaka and others. Structural change of keratin protein in human hair by permanent waving treatment // Polymer. -1998. -39. №16. -P. 3835-3840.

47. A.A. Тагер. Физикохимия полимеров / -M.: Наука. -1978. -С. 350.

48. М.С. Литвиненко. Химические продукты коксования / -Киев: Техника. -1974.

49. А.А. Аскадский, В.И. Кондращенко. Компьютерное материаловедение полимеров. Т.1. Атомно-молекулярный уровень / -М.: Научный мир. -1999. -С. 85.

50. Д.Р. Байтимиров, Д.В Стариченко, С.Ф.Конев, Ю.Н. Швачко, В.Г. Мазуренко. Наноструктуры в природных меланопротеиновых волокнах: ЭПР исследование // Вестник УГТУ-УПИ. -Екатеринбург. -2004. №5. -С. 35.

51. Д.Р. Байтимиров, Д.В. Стариченко, Ю.Н. Швачко, С.Ф Конев. Парамегнетизм а-кератинов в меланопротеиновых волокнах // Сборник тезисов III Международной конференции «Высокоспиновые молекулы и молекулярные магнетики». -Иваново. -2006. -С. 45.

52. Д.Р. Байтимиров, Т.А. Правишкина, Д.В. Стариченко, С.Ф. Конев, Ю.Н. Швачко. Парамагнетизм меланопротеиновых волокон // Химические волокна. -2006. №6.

53. D.R. Bytimirov, D.V. Starichenko, Т.А. Pravlshkina, S.F. Konev, Yu.N. Shvachko. Paramagnetism of melanoprotein fibres // Fibre Chemistry. -2006. No38. -P. 49-54.

54. M.H. Briggs, M. Briggs, A. Wakatama // Experientia. -1972. 28(4). -P. 406.

55. M.A. Eltayeb, R.E. Van Grieken // Sci Total Environ. Jun. -1995. -P. 157-65.

56. N.L. Derise, S.J. Richey // Dent. Res. J. -1974. 53(4). -P. 853-858.

57. J. Buchancova, M. Knizkova, D. Hyllova, M. Vrlik, D. Mesko, G. Klimentova, E. Galikova // Cent Eur J Public Health. -1994. Dec. 2(2). -P. 82.

58. E. Y. Ionashiro; T. S. R. Hewer; F. L. Fertonani; E. T. de Almeida; M. Ionashiro // Eel. Quim. Sao Paulo. -2004. 29(2). -P.53-56.

59. Barry C. Cope, Lyn Hopegood, Roger J. Latham, Roger G. Linford, John D. Reilly, Martyn C. R. Symonsa and Fatai A. Taiwo. Studies of equid hoof horn material by EPR spectroscopy // Journal of Materials Chemistry. -1998. 8(1). -P. 4345.

60. J. Kaluza, M. Jeruszka, A. Brzozowska // Rocz Panstw Zakl Hig. -2001. 52(2). -P. 111.

61. C. Reilly, F. Harrison, J. Zinc // Hum Nutr. -1979. 33(4) -P. 248.

62. J. H. Hadley and W. Gordy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974. 72. -P. 3106.

63. D. J. Nelson, R. L. Petersen, M. C. R. Symons // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. -1977. -P. 225.

64. И.М. Цидильковский. Бесщелевые полупроводники с магнитными примесями, образующими резонансные донороные состояния // Успехи физических наук. -1992. -Т. 162. №2.

65. J. Alan Swift. The mechanics of fracture of human hair // International Journal of Cosmetic Science. -1999. 21. -P. 227-239.

66. И.И. Тугов, Г.И. Кострыкина. Химия и физика полимеров / -М.: Химия. -1989. -С. 282.

67. Yu.N. Shvachko, D.R. Baytimirov, and D.V. Starichenko. EPR in melano-protein fibers: charge-transfer complexes // International Modern Development of Magnetic Resonance. -Kazan. -2007.