Ферментативное определение кофактора (ионов цинка) и ингибиторов алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структура и механизм действия алкогольдегидрогеназы.

1.1. Общие сведения об алкогольдегидрогеназе.

1.2. Структура алкогольдегидрогеназы из клеток пекарских дрожжей.

1.3. Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы.

1.4. Специфичность алкогольдегидрогеназы по отношению к коферменту.,,

1.5. Кинетика и механизм действия алкогольдегидрогеназы.

Глава 2. Ингибиторы алкогольдегидрогеназы из клеток пекарских дрожжей.

2.1. Влияние ионов металлов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

2.2. Влияние комплексообразующих реагентов и аналогов никотинамид-адениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

2.3. Влияние пиридиновых производных на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

2.4. Влияние алкилирующих агентов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

2.5. Влияние лекарственных препаратов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента, обработка результатов измерений.

3.1. Исходные вещества.

3.2. Посуда и аппаратура.

3.3. Методика эксперимента.

3.4. Обработка результатов измерений.

Глава 4. Выбор фермента и индикаторной реакции.

Глава 5. Влияние органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

5.1. Влияние серо- и фосфорсодержащих органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

5.1.1. Определение пестицидов по их ингибирующему действию на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

5.2. Влияние азотсодержащих органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

5.2.1. Изучение типа ингибирования алкогольдегидрогеназы 2,2'-дипиридилом.

5.2.2. Возможные причины влияния азотсодержащих гетероциклических органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы

5.2.3. Определение азотсодержащих гетероциклических соединений с использованием алкогольдегидрогеназы.

5.2.4. Определение азотсодержащих гетероциклических соединений в присутствии ртути(П) и серебра(1).

5.2.5. Определение ноотропила и кетотифена с использованием алкогольдегидрогеназы.

5.3. Влияние аминокислот на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

5.3.1. Изучение типа ингибирования алкогольдегидрогеназы триптофаном.

Глава 6. Ферментативный метод определения цинка(П) по реактивации апофермента алкогольдегидрогеназы.

6.1. Влияние ионов металлов на каталитическую активность нативной алкогольдегидрогеназы.

6.2. Выбор условий получения апофермента алкогольдегидрогеназы.

6.3. Влияние Zn(II) на нативную алкогольдегидрогеназу в оптимальных условиях получения псевдоапофермента.

6.4. Влияние Zn(II) на псевдоапоферменты алкогольдегидрогеназы, полученные с использованием 1,2,3-бензотриазола, 1,10-фенантролина, ЭДТА.

6.5. Влияние ионов металлов на псевдоапоферменты алкогольдегидрогеназы.

6.6. Получение истинного апофермента алкогольдегидрогеназы.

6.6.1. Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,2,3-бензотриазола.

6.6.2. Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,10-фенантролина и ЭДТА.

Глава 7. Определение ионов металлов по их ингибирующему влиянию на алкогольдегидрогеназу.

Глава 8. Влияние метилртути на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы.

8.1. Определение метилртути по ее ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу.

8.2. Изучение типа ингибирования алкогольдегидрогеназы ионами ртути(П) и метилртутью.

8.3. Определение метилртути в присутствии Hg(II).

Глава 9. Определение ртути(П), метилртути и цинка(П) в различных объектах.

9.1. Определение ртути(П) в водах.

9.2. Определение метилртути в водах.

9.3. Определение цинка(Н) в крови человека по реактивации апофермента алкогольдегидрогеназы.

9.4. Определение цинка(П) в крови человека по его ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу.

Глава 10. Иммобилизация алкогольдегидрогеназы.

10.1. Выбор индикаторной системы для контроля активности иммобилизованной алкогольдегидрогеназы.

10.2. Выбор носителей для иммобилизация алкогольдегидрогеназы.

10.3. Выбор способа иммобилизация алкогольдегидрогеназы.

10.3.1. Иммобилизация алкогольдегидрогеназы путем адсорбции ее на поверхности силикагеля.

10.3.2. Тест-методика определения метилртути с использованием алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной на силикагеле.

10.3.3. Тест-определение цинка(П) с применением алкогольдегидрогеназы, физически иммобилизованной на силикагеле.

10.4. Ковалентная иммобилизация алкогольдегидрогеназы.

10.4.1. Тест-методика определения метилртути с использованием алкогольдегидрогеназы, ковалентно иммобилизованной в альбумине.

ВЫВОДЫ.

СПИСКОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ - алкогольдегидрогеназа,

НАД+- никотинамидадениндинуклеотид (окисленная форма),

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма),

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат,

АМФ- аденозин фосфат,

АДФ - аденозин дифосфат,

АФН - аденозин нуклеотидфосфат

ТФН - тионикотинамидадениндинуклеотидфосфат, п-ФДА - гс-фенилендиамин,

Asp -аспаргиновая кислота,

Arg- аргинин,

Cys- цистеин,

Gly - глицин,

Не -изолейцин,

His- гистидин,

Ser - серин,

Thr - треонин,

Туг - тирозин

Актуальность. Перспективным направлением аналитической химии является создание и применение в практике химического анализа ферментативных методов определения биологически активных соединений неорганической и органической природы. Эти методы отличаются высокой чувствительностью, экспрессностью, простотой методик и аппаратурного оформления. В последнее время ферментативные методы все шире применяют для определения ультрамалых количеств токсикантов в объектах окружающей среды, продуктах питания, лекарственных препаратах, биомассах.

Одними из наименее изученных с точки зрения использования в аналитических целях являются алкогольдегидрогеназы — ферменты класса оксидоредуктаз, катализирующие процессы окисления никотинамидаденин-динуклеотидом первичных алифатических спиртов. Источниками алкогольдегидрогеназы служат ткани животных (например, печень лошади и крысы), растения (томаты, картофель), грибы, дрожжи, бактерии. Наиболее активен, стабилен и доступен фермент, выделенный из клеток пекарских дрожжей.

В литературе имеются сведения об ингибирующем влиянии на каталитическую активность дрожжевой алкогольдегидрогеназы различных неорганических и органических соединений. Однако описанные исследования имели своей целью, главным образом, изучение физико-химических свойств фермента. Систематическое изучение эффекторов алкогольдегидрогеназы до настоящего времени не проводилось, и этот фермент практически не использовали в химическом анализе. В то же время литературные данные об ингибиторах алкогольдегидрогеназы указывают на перспективность расширения круга соединений — потенциальных эффекторов фермента, а также разработки ферментативного метода их определения.

Следует отметить, что ферментативные методы определения многих ингибиторов ферментов, в частности ионов металлов, недостаточно селективны. Один из способов повышения селективности, а также чувствительности ферментативных методов — использование явления реактивации апоферментов (белковой части молекул ферментов) для определения ионов металлов - кофакторов, входящих в активные центры ферментов. Необходимо подчеркнуть, что этому направлению развития ферментативных методов анализа уделяется неоправданно мало внимания.

Цель настоящей работы — получение апофермента алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей и использование его реактивации для разработки селективного и высокочувствительного метода определения цинка(И) — иона металла - кофактора этого фермента; выявление неорганических и органических ингибиторов алкогольдегидрогеназы и разработка методик определения наиболее эффективных из них с использованием нативного и иммобилизованного фермента. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: исследовано действие на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы широкого круга серо-, фосфор-, азотсодержащих органических соединений; выявлены органические ингибиторы фермента; наиболее эффективные из них использованы в качестве лигандов для получения ее апофермента; изучено влияние Zn(II) и других ионов металлов (Co(II), Ni(II), Cd(II), Cu(II), Fe(III), Hg(II), Ag(I), Pb(II), Bi(III)) на нативную алкогольдегидрогеназу и ее апофермент; разработаны способы иммобилизации алкогольдегидрогеназы и ее апофермента на различных носителях.

Научная новизна заключается в том, что установлено ингибирующее действие на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из клеток пекарских дрожжей в реакции окисления этанола никотинамидадениндинуклеотидом ряда азотсодержащих гетероциклических соединений, в частности лекарственных препаратов; аминокислот; некоторых серо- и фосфорсодержащих органических соединений, в частности пестицидов; ряда ионов тяжелых металлов и метилртути; впервые получен апофермент алкогольдегидрогеназы с использованием в качестве органических лигандов 1,10-фенантролина и ЭДТА и диализа; разработана селективная и высокочувствительная методика определения кофактора алкогольдегидрогеназы — цинка(П), основанная на его реактивирующем действии на апофермент и превосходящая по чувствительности и селективности большинство известных методик определения Zn(II); показана целесообразность использования алкогольдегидрогеназы в химическом анализе для высокочувствительного определения ее наиболее эффективных ингибиторов: ряда азотсодержащих гетероциклических соединений, в том числе лекарственных препаратов; аминокислот; ионов тяжелых металлов; метилртути; обоснован выбор в качестве оптимальных носителей для получения активных и стабильных препаратов иммобилизованнойо алкогольдегидрогеназы силикагелей на алюминиевой подложке; полученные препараты алкогольдегидрогеназы, физически иммобилизованной на силикагеле и ковалентно — в альбумине, использованы для разработки высокочувствительных, простых и экспрессных визуальных тест-методик определения метилртути; впервые получен апофермент алкогольдегидрогеназы, физически иммобилизованный на силикагеле, и разработана визуальная тест-методика определения цинка(П), основанная на реактивации им этого апофермента.

Практическую значимость имеют методика получения апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,10-фенантролина либо ЭДТА в качестве органических лигандов и диализа; селективная и высокочувствительная методика определения кофактора алкогольдегидрогеназы - цинка(П), основанная на реактивации им апофермента (Сн = 50 пг/мл, sr = 0.03); методики определения по ингибирующему действию на нативную алкогольдегидрогеназу: ряда азотсодержащих гетероциклических соединений, представляющих собой либо конденсированные системы из двух или трех ароматических шестичленных циклов, например 1,10-фенантролина и 8-гидроксихинолина, либо являющихся производными пятичленных гетероциклических соединений, в частности имидазола и 1,2,3-триазола (Сн - 1 нМ - 0.1 мМ, sr = 0.03 -0.06);

- аминокислот: гистидина, триптофана, пролина, а также гистамина (Сн = 10 -100 мкМ, sr = 0.09 -0.12);

- лекарственных препаратов: кетотифена и ноотропила (Си = 0.01 и 0.1 мМ, sr= 0.05 и 0.09, соответственно);

- метилртути (Си = 10 нМ, sr = 0.03); ионов металлов — цинка(П) (Сн = 5 нг/мл; sr = 0.05), ртути(И) (Сн = 0.05 нг/мл; sr = 0.02), серебра(1) (Сн = 0.075 нг/мл; sr = 0.02), меди(П) (Сн = 100 нг/мл, sr = 0.09); визуальные тест-методики определения цинка(Н) по реактивации апофермента, физически иммобилизованного на силикагеле (Сн = 0.1 нг/мл, sr = 0.04), метилртути — по ингибирующему действию на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной физически на силикагеле и ковалентно — в альбумине (Сн - 1 и 10 нМ, соответственно, sr = 0.04); методики определения цинка(П) в плазме крови человека, основанные на реактивации им апофермента алкогольдегидрогеназы и его ингибирующем действии на нативный фермент; методики определения ртути(П) и метилртути в природных водах на уровне пдк.

Автор выносит на защиту: результаты изучения влияния на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в реакции окисления этанола никотинамидадениндинуклеотидом широкого круга азот-, фосфор-, серосодержащих органических соединений, в том числе лекарственных препаратов, пестицидов, аминокислот с целью выявления наиболее эффективных ингибиторов фермента; результаты исследований, проведенных с целью получения апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием органических ингибиторов и диализа, а также обоснование возможности и целесообразности его использования для высокочувствительного и селективного определения иона металла - кофактора — Zn(II) по его реактивирующему действию на апофермент; данные о влиянии на каталитическую активность нативной алкогольдегидрогеназы, а также ее апофермента широкого круга ионов металлов: цинка(П), кобальта(Н), никеля(П), кадмия(И), меди(П), железа(Ш), ртути(П), серебра(1), свинца(П); результаты исследований, проведенных с целью получения препаратов алкогольдегидрогеназы, физически и ковалентно иммобилизованной на различных носителях; обоснование целесообразности использования нативной и иммобилизованной алкогольдегидрогеназы для определения ее эффективных ингибиторов: ряда азотсодержащих гетероциклических соединений, в том числе лекарственных препаратов - кетотифена и ноотропила, аминокислот, пестицида параоксона, цинка(Н), ртути(П), серебра(1), меди(И), метилртути.

выводы

1. Установлено, что ингибиторами алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей являются азотсодержащие гетероциклические соединения (в том числе лекарственные препараты ноотропил и кетотифен), представляющие собой либо конденсированные системы из двух или трех ароматических шестичленных циклов, либо являющиеся производными пятичленных гетероциклических соединений - имидазола и 1,2,3-триазола; а также аминокислоты, содержащие атом азота в цикле. Наиболее эффективные ингибиторы — 1,10-фенантролин, 8-гидроксихинолин, 1,2,3-бензотриа-зол, 2,2'-дипиридил, ЭДТА.

2. Показано, что без удаления избытка органических лигандов — ингибиторов алкогольдегидрогеназы (1,10-фенантролина, ЭДТА, 1,2,3-бензотриазола), получается не истинный апофермент, а фермент, ингибированный не более, чем на 40%, то есть "псевдоапофермент".

3. Предложена методика получения истинного апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,10-фенантролина или ЭДТА в качестве органических лигандов и диализа для удаления их избыточного количества.

4. Установлено, что из большого числа изученных ионов металлов, имеющих либо близкий к цинку ионный радиус, либо сродство к сульфгидрильным группам белка, ингибирующее действие на каталитическую активность нативной алкогольдегидрогеназы оказывают цинк(П), кадмий(П), медь(П), ртуть(П), серебро(1), свинец(П); псевдоапофермент АДГ реактивируют — цинк(П), кобальт(П), никель(Н), кадмий(И), медь(П), железо(Ш), а истинные апоферменты АДГ, полученные с использованием 1,10-фенантролина и ЭДТА, реактивирует только Zn(II).

5. Разработана селективная, высокочувствительная (Сн = 50 пг/мл) и воспроизводимая (sr = 0.03) методика определения кофактора алкогольдегидрогеназы - цинка(П) по его реактивирующему действию на апофермент.

6. В результате оптимизации условий проведения сопряженных ферментативной и неферментативной индикаторной реакций на разных носителях — МКЦ. силикагелях, ППУ. и изучения на них каталитической активности фермента, получены высокочувствительные и стабильные препараты алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной физически на силикагеле и ковалентно — в альбумине.

7. Впервые получен иммобилизованный апофермент алкогольдегидрогеназы.

8. По реактивации апо-АДГ, физически иммобилизованной на силикагеле, разработана визуальная тест-методика определения цинка(П) (Си = 0.1 нг/мл, sr = 0.04).

9. Разработанные методики определения наиболее эффективных ингибиторов нативной алкогольдегидрогеназы: ряда азотсодержащих гетероциклических соединений, в том числе лекарственных препаратов, аминокислот, пестицида параоксона, цинка(П), ртути(П), серебра(П), меди(П), метилртути (Сн = 1 нМ -0.1 мМ, sr = 0.01 - 0.12), а также тест-методики определения метилртути по ее ингибирующему действию на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной физически на силикагеле и ковалентно - в альбумине (Си 1 нМ и 10 нМ, sr=0.04) обосновывают целесообразность использования этого фермента в химическом анализе.

1. Ленинджер А. Биохимия. М.: Наука. 1974. 446 с.

2. Krebs Н.А., Perkins I.B. The physiological role of alcohol dehydrogenases. // Biochem. J. 1970. V. 118. P. 635-644.

3. Boyer P., Lardy H., Myrback K. Alcohol dehydrogenase.— in The Enzymes. New-York—London: Academic Press. 1963. V. 7. P. 25-100.

4. Mtiller D. Alcoholdehydrogenase aus Hefe iosgelost. // Biochem. Z. 1933. Bd. 262. S.239-247.

5. Lechman J. Aktiviering von Hefe Alkoholdehydrogenase durch Co-enzyme. // Biochem. Z. 1934. Bd. 272. S. 95-103.

6. Negelein E., Wulff H.-J. Kristallisation des Proteins der Acetaldehydreduktase. // Biochem. Z. 1937. Bd. 289. S. 436-437.

7. Negelein E., Wulff H.-J. Dissoziationskonstanten und reaktionsfahigkeit der Acetaldehydreductase. // Biochem. Z. 1937. Bd. 290. S. 445-446.

8. Negelein E., Wulff H.-J. Diphosphopyridinproteid, Alcohol, Acetaldehyde. // Biochem. Z. 1937. Bd. 293. S. 351-389.

9. Bonnichsen R.K., Wassen A.M. Crystalline alcohol dehydrogenases from horse liver and yeast. // Arch. Biochem. Biophis. 1948. V. 18. P. 361-363.

10. Hayes J., Velick S. Yeast alcohol dehydrogenase. Molecular weight, coenzyme binding and reaction equilibration. // J. Biolog. Chem. 1954. V. 207. P. 225-244.

11. П.Шимон Л.М., Которман M., Бэнэ А., Саяни Б. Иммобилизация дрожжевой алкогольдегидрогеназы с п-бензохиноном на активированном силикатном носителе. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1991. Т. 27. № 1. С. 86-90.

12. Wallenfels К., Arens A. Die Amonosauuren der Alkoholdehydrogenase aus Hefe. // Biochem. Z. 1960. Bd. 332. S. 217-246.

13. Plapp B.V., Ganzhorn A.J., Gould R.M., Green D.W., Jacobi Т., Warth E., Kratzer D.A. Structure of yeast ADH. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 284. P. 241-253.

14. Vallee B.L., Hoch F.L. Zinc: a component of yeast alcohol dehydrogenase. // J. Am. Chem. Soc. 1955. V. 77. P. 1939-1945.

15. Wallenfefs K., Sund H., Faessler A., Burchard W. Uber den Mechanismus der Wasserstoffiibertagung mit Pyridinnucleotiden. II Der minimale und maximale Zinkgehalt kristallisierter Alcoholdehydrogenase aus Hefe. // Biochem. Z. 1957. Bd. 329. S. 31-48.

16. Vallee B.L. The Enzymes. New-York — London: Academic Press. 1960. V. 3. 225 p.

17. Magonet E., Hayen P., Delforge D., Deleive E., Remacle J. Importance of the structural zinc atom for the stability of yeast alcohol dehydrogenase. // Biochem. J. 1992. V. 287. Part 2. P. 361-368.

18. Eklund H. et al. Zinc coordination, function and structure-of zinc enzymes and other proteins. // J. Mol. Biol. 1976. V. 102. N 1. P. 27-73.

19. Grow J.P., Beckman J.S., McCord J.M. Sensitivity of the essential zinc-thiolate moiety of yeast alcohol dehydrogenase to hypochlorite and peroxynitrite. // Biochemistry. 1995. V. 34. N 11. P. 3544-3552.

20. Vallee B.L., Auld D.S. Three-dimensional structure of alcohol dehydrogenase at 2-4 A resolution. // Biochemistry. 1990. V. 29. N 24. P. 5647-5659.

21. Wallenfefs K., Sund H. Zem Wirkungsmechanismus der Alcoholdehydrogenase aus Hefe. // Angew. Chem. 1955. Bd. 67. S. 517-520.

22. Aurichio F., Bruni C. The role of essential -SH groups of yeast alcohol dehydrogenase. // Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 185. P. 461-463.

23. Buchner M., Sund H. Yeast alcohol dehydrogenase : -SH groups, disulfid groups, quaternary structure and reactivation by reductive cleavage of disulfide groups. // Eur. J. Biochem. 1969. V. 11. P. 73-85.

24. J.van Eys, Kaplan N.O. Yeast alcohol dehydrogenase. II. Relation of alcohol structure to activity. // J. Am. Chem. Soc. 1957. V. 79. P. 2782-2786.

25. Dickinson P.M., Monger G.P. A study of the kinetics and mechanism of YADH with a variety substrates. // Biochem. J. 1973. V. 131. P. 261-270.

26. Green D.W., Sun H.-W., Plapp B.V. Substrate specificity of YADH. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N 11. P. 175-189.

27. Sandman R.P., Miller O.N. Studies of the metabolizm of lactaldehyde. III. By alcohol and aldehyde dehydrogenase. // J. Biol. Chem. 1958. V. 230. P. 791-796.

28. Yamada Т., Yamata M. Interaction of yeast alcohol dehydrogenase with various substrates. //J. Biochem. Japan. 1973. V. 74. P. 971-981.

29. Zhang Q„ Yuan J.M., Zhao B.H. // Shegwu Huaxue Zazhi. 1955. V.ll. No.6. P.740. Цит. no Chem. Abstr. 1996. 80336f.30. . Sund H., Theorell H. The Enzymes. New-York — London: Academic Press. 1963 V. 7. P. 25-92.

30. Anderson B.M., Kaplan N.O. Enzymatic studies with analogues of diphosphopyridine nucleotide. //J. Biol. Chem. 1959. V. 234. P. 1226-1232.

31. Kaplan N.О., Ciotti M.M. Chemistry and properties of the 3-acetylpyridine analogue of diphosphopyridine nucleotide. //J. Biol. Chem. 1956. V. 221. P. 823-832.

32. Klinman J. Acid-base catalysis in the yeast alcohol dehydrogenase reaction. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 2569-2582.

33. Theorell H. The Harvey lectures. Series 61. New York. 1967. P. 17-41.

34. Гладышев П.П., Шаповалов Ю.А., Квасова В.П. Реконструированные оксидоредуктазные системы. Алма-Ата: Наука. 1987. 189 с.

35. Silverstein E., Boyer P.D. Liver and yeast alcohol dehydrogenase. // J. Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 3908-3914.

36. Dickenson C.J., Dickinson F.M. A study of the pH- and temperature-dependence of the reactions of yeast alcohol dehydrogenase with ethanol, acetaldehyde and butyraldehyde as substrates. // Biochem. J. 1975. V. 147. P. 303-31 1.

37. Leskovac V., Trivic S., Anderson B. Use of competitive dead-end inhibitors to determine the chemical mechanism of action of yeast alcohol dehydrogenase. // Mol. Cell. Biochem. 1998. V. 178. P. 219-227.

38. Fisher H.F., Conn E.E. The enzymatic transfer of hydrogen. The reaction catalyzed by alcohol dehydrogenase. // J. Biol. Chem. V. 202. 1953. P. 687-697.

39. Townshend A., Vaughan A. Application of enzyme-catalysed reactions in trace analysis-VI. Determination of mercury and silvery by their inhibition of yeast alcohol dehydrogenase. // Talanta. 1970. V. 17. N 4. P. 299-233.

40. Hoch F.L., Valee B.L. Kinetics studies on the rate of zinc and diphosphopyridine nucleotide in the activity of yeast alcohol dehydrogenase. // J. Biol. Chem. 1956. V. 221. P. 491-500.

41. Hoch. F.L., Williams R.J.P. The role of zinc in alcohol dehydrogenases. The kinetics of the inhibition of yeast alcohol dehydrogenase by 1,10-phenantroline. // J. Biol. Chem. 1958. V. 232. P. 453-464.

42. Anderson B.M., Reynolds M.L., Anderson C.D. Nitogen base inhibition of yeast alcohol dehydrogenase. // Biocim. Biophis. Acta. 1966. V. 113. P. 235-243.

43. Vallee B.L. Zinc and .metalloenzymes. Yeast alcohol dehydrogenase. // Adv. Protein Chem. 1955. V. 10. P. 353-384.

44. Benech R. Sulfur in Proteins. New-York—London: Academic Press. 1959. P. 215-290.

45. Wallenfels K., Sund H., Diekman H. Hemmstoffe fur DPN-alhangige zinkenzyme. // Biochem. Z. 1957. Bd. 329. S. 48-58.

46. H. von. Euler. Alkivierungen und hemmungen an Apodehydrasen. // Biochem. Z. 1936. Bd. 286. S. 72-76.

47. J. van Eys, Ciotti M.M., Kaplan N.O. Yeast alcohol dehydrogenase. Coenzyme binding sites. //J. Biol. Chem. 1958. V. 231. P. 571-582.

48. J. van Eys, Kaplan N. Yeast alcohol dehydrogenase. The effect of pyridine derivatives on the reaction. // Biochim. Biophis. Acta. 1957. V. 23. P. 574-587.

49. Rasherd N., Rabin B. Inhibition of yeast alcohol dehydrogenase by alkylating agents. // Eur. J. Biochem. 1968. V. 5. P. 147-150.

50. Fiddich R., Heath H. Inhibition of yeast alcohol dehydrogenase by chloroquine. // Nature. 1967. V. 213. P. 628-629.

51. Baillie A., Caiman K., Hart D. Histichemical distribution of alcohol dehydrogenase in endocrine tissue. // Nature. 1966. V. 210. P. 1277-1286.

52. Pfleiderer G., Jeckel D., Wicland T. Uber die Einwirkung von Sulfit auf einige DPN hydrierende enzyme. // Biochem. Z. 1956. Bd. 328. S. 187-194.

53. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. М.: Химия. 1967. 200 с.

54. Worthington G. Enzyme Manual. New Jersey: Freehold. 1972. P. 1-4.

55. Кольтгофф И.М. Сендел Е.Б. Количественный анализ. М.: Госхимиздат. 1948. 822 с.

56. Сладков А.З. Таблицы буферных растворов. // Заводск. Лаб. 1969. Т. 35. № 9. С. 1146-1148.

57. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. 543 с.

58. Parra M.J.A., Mateos A.A., Candido G.-M., Rozas L.G. Determination of mercury(II) by its inhibitory effect on the enzymatic reaction of ethanol oxidation using flow injection.//Analyst. 1992. V. 117. P. 921-924.

59. Mizgunova U.M., Zolotova G.A., Dolmanova I.F. Enzymic method for determination of ethanol and methanol with spectrophotometric detection of the rate of the process. // Analyst. 1996. V. 121. P. 431-433.

60. Broun G.„ Thomas D., Gelle G., Domurado D., Berjonneau A., Guillon C. New methods for binding enzyme molecules into a water-insoluble matrix: properties after insolubilization. // Biotechnol. Bioengineer. 1973. V. 15. P. 359-375.

61. Ивановский В.И. Химия гетероциклических соединений. М.: Высшая школа. 1978. 560 с.

62. Ким Б.Б. Механизм действия пероксидазы. Биотехнология. М.: Высшая школа.1992. Т. 36. С. 126.

63. Попова И.М. Ферментативные методы определения физиологически активных веществ с применением пероксидазы. Дисс. к. х. н. М. МГУ. 1981. 232 с.

64. Andrews A., Reithel F. The thiol groups of jack bean urease. // Arch. Biochem. Biophys. 1970. V. 141. P. 538-546.

65. Попов В.О., Егоров A.M. Исследование существенных SH-групп бактериальной формиатдегидрогеназы. // Биохимия. 1979. Т. 44. № 2. С. 207-213.

66. Джоуль Дж., Смит Г. Основы химии гетероциклических соединений. М.: Мир. 1975. 398 с.

67. Джилкрист Т. Химия гетероциклических соединений. М.: Мир. 1996. 464 с.

68. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 1990. 234 с.

69. Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Попов К.И. Комплексоны и комплексонаты металлов. М.: Химия. 1998. 544 с.

70. Зигель X., Зигель А. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов. М.: Мир.1993. 368 с.

71. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия. 1971. 454 с.

72. IUPAC-Stability Constants Database. 1994. Version 2.6.3. Academic Software Royal Society Chemistry - IUPAC.

73. Альберт А. Избирательная токсичность. M.: Медицина. Т. 2. 427 с.

74. Perrin D. Organic complexing reagents. New-York: Wiley-Interscience. 1964. 320 p.

75. Никольская Е.Б. Применение ферментов для изучения состава некоторых гидроксокомплексов. //Журн. аналит. хим. 1983. Т. 38. № 1. С. 5-11.

76. Березин И.В., Антонов В.К., Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М.: МГУ. 1976. Т. 1.296 с.

77. Эйхгорн Г. Неорганическая биохимия. М.: Мир. 1978. 765 с.

78. Хванг С.Т., Каммермайер К. Мембранные процессы разделения. М.: Химия. 1981.464 с.

79. Дытнерский Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация. М.: Химия. 1978. 351 с.

80. Gottesman М., Simpson R. Т., Valee В. L. Kinetic properties of cobalt alkaline phosphatase. // Biochemistry. 1969. V. 8. N. 9. P. 3776-3783

81. Wang Z., Benkovic S. J. Purification, characterization and kinetic studies of a soluble bacteroides fragilis metallo-P-lactamase that provides multiple antibiotic resistance. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N 35. P. 22402-22408.

82. Vanni A., Pessione E., Anfossi L., Baggiani C., Cavaletto M., Gulmini M., Giunta C. Properties of a cobalt-reactivated form of yeast alcohol dehydrogenase. V J. of Mol. Catalysis. 2000. V. 9. P. 283-291.

83. Ригин В.И. Хемилюминесцентный метод определения микроколичеств цинка с применением иммобилизованной пируватоксидазы. // Журн. аналит. хим. 1979. Т. 34. № 4. С. 680-686.

84. Mealor D., Townshend A. Applications of enzyme-catalyzed reactions in trace analysis. Determination of silver and thiourea by their combined inhibition of invertase. //Talanta. 1968. V. 15. N 12. P. 1371-1376.

85. Guilbault G.G., Kraner D.N., Carron P.L. Electrochemicals determination of xanthine oxidase and inhibitors. // Anal. Chem. 1964. V. 36. N 3. P. 606-610.

86. Долманова И.Ф., Никольская Е.Б., Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В. Способ ферментативного определения микроколичеств ртути. Бюлл. изобр. 1994. № 10. N2013770.

87. Krajewska В., Lezko М., Zaborska W. Urease immobilized on chitosan membrane. Preparation and property. // J. Chem. Technol. Bioteechnol. 1990. V. 48. P. 337-350.

88. Кучеряева В.В. Методы определения соединений эффекторов щелочной и кислой фосфатаз. Дисс. к. х. н. М.: МГУ. 1987. 230 с.

89. Maslowska J., Owczarek A. Wykorzystanie reakcji enzymatycznych w chkomatograficznym wykrywaniu sladowych ilosci jonow niektorych metali. // Chem. Anal. 1987. V. 32. N 5. P. 845-852.

90. Кузубова Л.И., Шуваева О.В., Аношин Г.Н. Метилртуть в окружающей среде. Распространение, образование в природе, методы определения. Новосибирск: СО РАН. 2000. 80 с.

91. Winfrey М., Rudd J. Environmental factors affecting the formation of methylmercury in low pH lakes: a review. // Environ. Contam. Toxicol. 1990. V. 9. P. 853-869.

92. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1997. 303 с.

93. Маки Р. Смит Д. Путеводитель по органическому синтезу. М.: Мир. 1985. 252 с.

94. Чернецкая С.В. Методы определения ртути, кадмия, висмута с использованием пероксидазы хрена. Дисс. к. х. н. М.: МГУ. 1995. 196 с.

95. Семенов Н.В. Биохимические компоненты и константы жидких сред и тканей человека. Справочник. М.: Медицина. 1971. 250 с.

96. Iversen L. The uptake and storage of noradrenaline in sympathetic nerves. Cambridge.: University Press. 1967. 126 p.

97. Мизгунова У.М., Шеховцова Т.Н., Долманова И.Ф. Ферментативные методы определения алифатических спиртов. // Журн. аналит. химии. 1998. Т. 53. № 10. С. 1014-1029.

98. Стрельцова О.Д., Горшкова Т.А., Юсуф Ба., Володина М.А., Долманова И.Ф. Каталитический метод определения микроколичеств альдегидов. // Журн. аналит. хим. 1984. Т. 39. С. 1886-1889.

99. Косырева О.А. Пенополиуретаны в сорбционно-фотометрическом определении металлов. Дисс. к. х. н. М. МГУ. 1993. 201 с.

100. Веселова И.А. Иммобилизованные пероксидаза и щелочная фосфатаза в тест-методах определения биологически активных веществ. Дисс. к. х. н. М. МГУ. 2001. 293 с.

101. Dmitrienko St.G., Sviridova О.A., Pyatkova L.N., Myshak E.N., Shmeleva O.V. Chemical reactions of terminal groups in polyurethane foams. // Mend. Commun 2000. N 6. P. 244-245.

102. Messing R.A. Adsorption and inorganic bridge formations. Methods in enzymology. New-York: Academic. 1976. V. 44. P. 148-169.

103. Woodward J. Immobilized enzymes: adsorption and covalent coupling. Immobilized cells and enzymes. Oxford: IRL. 1985. P. 148-169.

104. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир. 1989. Т. 1. С. 238-249.

105. Никольская Е.Б., Латыпова В.З., Евтюгин Г.А. Экологический мониторинг. Ч. 1. Ферментативные методы контроля. Казань: КГУ. 1992. С. 17.

106. Bickerstaff G.F. Immobilized of enzymes and cells. Totowa. New Jersey: Humana Press. 1997. V. 1. 141 p.

107. Srere P.A., Ueda K. Functional groups on enzyme suitable for binding to matrices. Methods in enzymology. New-York: Academic. 1976. V. 44. P. 11-19.

108. Mazid M.A., Laidler K.J. Flow kinetics yeast alcohol dehydrogenase attached to nylon tubing. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 614. P. 225-236.

109. Johansson A.Ch., Mosbach K. Acrylic copolymers as matrices for the immobilization of enzymes. The effect of a hydrophobic microenvironment on enzyme reactions