Ферментативное определение цинка и магния на основе их действия на щелочные фосфатазы различного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Жаворонкова Анна Михайловна

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИНКА И МАГНИЯ НА ОСНОВЕ ИХ ДЕЙСТВИЯ НА ЩЕЛОЧНЫЕ ФОСФАТАЗЫ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факу.1ые1а Московского госу таре твенното университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Шеховцова Татьяна Николаевна

кандидат химических наук,

доцент Мугинова Светлана Вален 1Иновна

Официальные оппонен!ы: доктор химических наук,

профессор Чухрай Елена Семёновна

доктор химических наук, старший научный сотрудник Дружинин Андрей Александрович

Ведущая организация:

Казанский государственный университет, химический факультет

Защита состоится 24 марта 2004 года в 16 ч 10 мин в аудитории 344 на заседании диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 20 февраля 2004 i ода.

Отзывы и замечания просьба «отправлять по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра аналишческой химии, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

^lliv^vp I UlAIlUillJ»! W VUUb » UЦ J

кандидат химических каук 'uí* Торочешникова И.И.

Ú

1 216ТЧП

/fО ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Одной из многих медико-биологических проблем, стоящих перед современными методами химического анализа, является контроль содержания в организме человека определенных макро- и микроэлементов, особенно магния и цинка, необходимых для нормального протекания многих биохимических реакций и физиологических процессов. В связи с этим актуальна разработка высокочувствительных и высокоселективных методов определения ионов указанных металлов в биологических объектах, в частности крови и моче.

Для решения этой задачи весьма перспективно использование ферментов, выделенных из различных источников и содержащих в активных центрах одновременно ионы обоих металлов - цинка и магния. Использование различий в доступности металлсвязывающих центров, в аминокислотной последовательности и каталитических свойствах металлоферментов различного происхождения может позволить направленно изменять чувствительность и селективность ферментативных методов определения ионов металлов-кофакторов в различных биологических объектах.

В этом плане особенно интересны гидролазы, в частности щелочные фосфатазы из Ecoli, кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя, как активные, стабильные, коммерческие препараты ферментов, содержащие в каталитических и аллостерических ценграх ионы цинка и магния соответственно. Сравнительное изучение влияния ионов металлов, в особенности цинка и магния, на каталитическую активность этих ферментов с целью разработки ферментативных методик определения ионов металлов-кофакторов до настоящею времени не проводилось. Щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя, в аналитических целях ранее не использовалась.

Систематическое исследование действия ионов металлов на каталитическую активность указанных щелочных фосфатаз может позволить не только выявить ферменты, наиболее перспективные для разработки чувствительных и селективных методик определения цинка и магния в различных объектах особенно биологических, но и использовать подходы, выработнные на примере щелочных фосфатаз различного происхождения, для расширения областей использования в химическом анализе других металлоферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы металлов различной природы.

Все сказанное дает основание считать создание и развитие ферментативных методов определения металлов-кофакторов актуальным и перспективным направлением

Цели настоящей работы:

- установление характера и степени влияния ионов цинка и магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трёх различных источников: кишечной палочки Е coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренлашА^^и ^кгген*?—

выбор препаратов ферментов, наиболее перспективных с аналитической точки зрения;

разработка с их использованием высокочувствительных и селективных методик определения цинка и магния на основе их различного действия на каталитическую активность щелочных фосфатаз и их апоферментов; применение разработанных методик в анализе биологических объектов

Научная новизна заключается в том, что впервые на примере щелочных фосфатаз различного происхождения предложены приемы многопланового использования в химическом анализе ферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы различных металлов (цинка и магния);

впервые в аналитических целях использована щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя; выяснены оптимальные условия получения и реактивирования ее апофермента, с целью выяснения перспектив использования в химическом анализе бактериальной и животных щелочных фосфатаз различного олигомерного состава проведено систематическое сравнительное изучение каталитических свойств этих ферментов; чувствительности к действию эффекторов (ионов металлов и органических соединений разных классов); стабильности в буферных растворах различной природы: неорганической -боратном и карбонатном, и органической - глициновом и трис-НС\, разработаны приемы направленного изменения чувствительности и селективности определения цинка и магния: применение щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников; проведение ферментативно! о гидролиза и-нитрофенилфосфата в буферных растворах различной природы, использование различных эффектов: ингибирования (для определения цинка) и активирования фермента (для определения магния), реактивирования апофермента (для определения цинка в присутствии магния), применение либеративного действия ионов металла на фермент, ингибированный органическим лигандом (для определения магния).

Практическую значимость имеют

селективные методики опредетения цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки грентандского шленя в реакции гидролиза и-нитрофенилфосфата в боратном (с,,= 10 нг'мл) и трис~\\С\ (с,,-1 мю/мл) буферных растворах; селективная и высокочувствительная методика определения магния по ею активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыптенка в реакции гидролиза п-нитрофенитфосфата (сн=0 6 нг/мл);

методика получения апофермента ще точной фосфатазы из юнкой кишки грентандскот о тюленя с использованием ЭДТА;

селективная и высокочувствительная методика определения цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя (сн=10 нг/мл); методика определения цинка в сыворотке крови человека; методика определения магния в моче человека;

даны рекомендации по выбору препарата щелочной фосфатазы для определения ферментативным методом магния в присутствии цинка и цинка в присутствии магния; цинка в присутствии ионов кобальта, меди, кадмия и никеля; магния в присутствии кальция.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты систематического сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз разного происхождения в буферных растворах различной природы (органической и неорганической) в реакции гидролиза «-нитрофенилфосфата в отсутствие и в присутствии ионов металлов: цинка и магния, а также кобальта, никеля, кадмия, меди, железа, свинца, ртути, кальция, бария, натрия, калия, цезия (при индивидуальном и совместном с цинком присутствии)

2. Результаты, полученные в ходе:

♦ исследования влияния широкого круга органических соединений на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с целью выявления ее наиболее эффективных ингибиторов;

♦ выбора подходов к получению апоферментов щелочных фосфатаз из трех источников и выяснения оптимальных условий проведения диализа щелочной фосфатзы из тонкой кишки гренландского тюленя;

♦ изучения возможности реактивирования апофосфатаз животного происхождения, полученных с использованием ЭДТА, ионами цинка и магния, а также кобальта, меди, никеля, кадмия и кальция;

♦ исследования действия магния и кальция на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя в присутствии нитрилтриметиленфосфоновой кислоты.

3. Ферментативные методики определения:

► цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя в различных буферных растворах;

► магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка;

► цинка по е1 о реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.

4 Результаты определения магния в образцах мочи; цинка - в образцах сыворотки крови человека.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Международном симпозиуме «Kinetics in Analytical Chemistry» (Румыния 2001), Международной конференции «Biocatalysis-2002» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002). Международном форуме «Аналитика и ана штики» (Воронеж, 2003)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 4 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 211 стр машинописного текста, включая 26 рисунков, 32 таблицы, 9 схем; состойi ш введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части (главы 410), заключения, выводов, списка литературы, включающего 172 наименования и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Литературный обзор

Сис1сма1изированы и обсуждены литературные данные о структуре, физико-химических характеристиках и механизме действия щелочных фосфатаз различного происхождения, а гакже сведения о влиянии на каталитическую активность фосфатаз и их апоформ ионов металлов, прежде всего цинка и магния. Отдельно рассмотрены роль цинка и магния в жизнедеятельности человека и методы их определения в биологических объектах.

Экспериментальная часть

В работе использованы лиофилизованный препарат щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка («Реанал», Венгрия) с активностью 0 4 уд ед/мг; щелочные фосфатазы из Е с oh («Сигма», США) и тонкой кишки гренландского тюленя Phoca Groenlandica (НПО «Биолар», Латвия) с активностью 33.8 и 13 >д ед /мг соответственно в виде гомогенных растворов в 2.5 М растворе с)льфага аммония, препарат шестиводной динатриевой соли я-нитро-фенитфосфата («Сигма», США) Для приготовления щрис-НС1-буферного раствора (рН 7.2 - 10.2) использовали трис(оксиметил)аминометан чда («Серва», Германия), ИС1 ос.ч , глицинового (рН 8.6 - 10 6) — глицин ос ч («Сигма», США), боратного (рН 9.3 - 10.7) и карбонатного (рН 9.2 - 10 8) — теграборат натрия и карбонат натрия ч.д.а. соответственно («Реахим», Москва), КОН ос.ч Исходные растворы цинка (II) готовили растворением точных навесок спекгрально чистого металла в НС1 ос.ч Для приготовления рабочих растворов магния в качестве исходного использовали стандартный раствор MgCl; с концентрацией магния 200 мг/мл («Сигма», США)

Для отбора малых ко гичеств растворов (< 1 мл) использова ж микро доза горы фирмы «Биохит» (Финляндия) Измеряли рН водных растворов с ючностью ±0 005 <_ помошгло рН-метра-мономера «Эконикс-0ксперт-001» (Россия) Ошичсск>ю п го г нос гь растворов во времени измеряли относитетыго

воды на фотоэлектроколориметре КФК-2 (Россия)

Скорость индикаторной реакции контролировали спектрофотометрически

(индикаторное вещество — w-нитрофенолят-ион) и характеризовали величиной

тангенса угла наклона (tgcx) начальных линейных участков кинетических

кривых, построенных в координатах оптическая плотность (А4Ю) - время (t, с)

Абсолютное значение начальной скорости ферментативной реакции (ио,

АС A4 1 '31 мкМ/мин) рассчитывали по формуле: и0 = = *lc ~ 1е ■> гДе с -

Д t Аt

концентрация я-нитрофенолята нафия (М), е - молярный коэффициент поглощения последнего при 400 нм (1,7 ■ Ш1 М"1 см '), 1 - толщина кюветы (1 см) Скорость неферментативного гидролиза субстрата при использованных концентрациях реагентов была равна нулю. Индикаторную реакцию проводили без термостатирования.

Степени ингибирования (I, %), активирования (А, %) и реактивирования (РеА. %) щелочных фосфатаз и их апоформ ионами металлов и органическими соединениями рассчитывали по формулам: I, % = 100% • (и„ - иi)/u0; А, % = 100% • (и - v0)/u0; РеА, % = (и/о0) • 100%, где и0 и u>i (или и) - начальные скорости индикаторной реакции в отсутствие и в присутствии иона металла (или/и органического соединения) соответственно.

Обоснование выбора фермента и индикаторной реакции, выяснение оптимальных условий ее проведения

Для разработки подходов к ферментативному определению двух различных по природе ионов металлов - цинка и магния, с использованием одного и того же фермента бьпи выбраны щелочные фосфатазы, выделенные из трех различных источников: кишечной палочки Е coli, кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя (в дальнейшем «щелочная фосфатаза из кишки тюленя») Каталитический и аллостерический центры этих щелочных фосфатаз содержат ионы цинка и магния соответственно, а их молекулы обладают различной пространственной конфигурацией: фосфатазы из E.coli и кишечника цыпленка - димеры, а фосфатаза из кишки тюленя - тетрамер. Выбор кишечных щелочных фосфатаз обоснован также их наиболее высокой, согласно литературным данным, каталитической активностью среди фосфатаз, выделенных из разных источников. Высокая активность фосфатаз дает возможность наблюдать как за активирующим, так и ингибирующим действием на них различных эффекторов, а также обеспечивает экономичность их использования.

В качестве индикаторной была выбрана реакция гидролиза я-нитро-фенилфосфата (и-НФФ), катализируемая указанными щелочными фосфатазами и широко использовавшаяся ранее при выявлении эффекторов щелочных фосфатаз различного происхождения Индикаторный процесс протекает в щелочной среде с образованием окрашенного в желтый цвет продукта (>.|га< = 410 нм)- и-нигрофенолят-иона (схема 1):

no2

о

11 . +

-0-P О Na О Na*

Щсючная фосфатача

20Н

Р043" + 2 Na++ Н20

гс-ПФФ я-Нитрофенолят-ион

Схема 1

Для проведения реакции гидролиза я-НФФ в присутствии трех щелочных фосфатаз были выбраны неорганические (боратный, карбонатный) и органические (трис-HCl, i лициновый) буферные растворы.

Установлено, что каталитическая активность щелочных фосфатаз из трех источников максимальна при pH 9.8-10.0 и зависит от природы и концентрации буферного раствора, в котором проводится ферментативный гидролиз и-НФФ Различные щелочные фосфатазы проявляют наибольшую каталитическую активность в разных буферных растворах: из Е coli - в карбонатном (это, по-видимому, может косвенно указывать на большее число неионогенных аминокислотных остатков, стабилизированных карбонат- и гидрокарбонат-ионами, и (или) более плотную «упаковку» фермента); из кишечника цыпленка - в i лициновом (это, вероятно, объясняется встраиванием глицинат-ионов (CH2(NH2)COO") в молекулу этой фосфатазы и взаимодействием с положительно заряженными остатками аминокислот ее белковой глобулы, что стабилизируе1 фермент), из кишки тюленя - в трис-HCl Все три щелочные фосфатазы наименее активны в боратном буферном растворе. Различаются также оптимальные концентрации буферных растворов, при которых каталитическая активность изученных фосфатаз максимальна (табл. 1).

Таблица 1. Оптимальные концентрации буферных растворов (М) для проведения реакции i идролиза п-нитрофенилфосфаы при pH 9 8

Буферный раствор Источник щелочной с юсфатазы

Е coli Кишечник цыпленка Кишка тюленя

Боратный 0.01 0.005 0.005

Карбонатный 0.10 0.010 0.010

Трис-\1С\ 0.05 0.050 0 050

Глициновый 0.10 0.025 0.100

Следует пояснить выбор одинаковой концентрации (0 05 М) трис-ИС1-буферного раствора оптимальной для всех щелочных фосфатаз В случае щелочной фосфатазы из Е coli более высокие, чем 0 05 М концентрации трис-НО-буферног о раствора не приводили к значительному увеличению каталитической акжвности этого фермента Щелочная фосфатаза из кишечника

б

цыпленка наиболее активна именно при этой концентрации буферного раствора, а для фосфатазы из кишки тюленя выбор 1 М трис-Ш2\-буферного раствора, при которой скорость ферментативного гидролиза максимальна, нецелесообразен в виду способности ТРИС'а к образованию комплексов с ионами цинка

Для проведения дальнейших исследований в присутствии различных щелочных фосфатаз выбрали имеено 0.05 М трис-НС1-буферный раствор, поскольку в нем все ферменты обладают достаточно высокой каталитической активностью, не изменяющейся во времени; при указанной концентрации его буферная емкость достаточно велика; этот буферный раствор наиболее часто используют при работе со щелочными-фосфатазами, что важно для сопоставления полученных нами данных с литературными.

Влияние цинка и магния на каталитическую активность фосфатаз, выделенных из различных источников

Для сопоставления свойств трех щелочных фосфатаз и изучения возможностей их использования для разработки ферментативных методик определения цинка и магния было изучено влияние этих ионов на каталитическую активность ферментов в указанных оптимальных условиях проведения индикаторной реакции.

О 2 4 6 8 10 Q„(ii>, мкг/мл

Установлено, что цинк в диапазоне концентраций 0.01 -10 мкг/мл ингибирует все три щелочные фосфатазы (рис. 1). При этом чувствительность к действию ионов цинка (I, % при Czr!=2.5 мкг/мл) понижается в ряду щелочных фосфатаз, выделенных из кишки тюленя (60%) > кишечника цыпленка (35%) > Ecoh (15%). Это может свидетельствовать об уменьшении в представленном ряду доступности аллостерических центров щелочных фосфатаз и затруднении вытеснения из них ионов магния Кроме того, степень ингибирования трех

80

3

Рис. 1. Зависимости степени ингибирования (I, %) щелочных фосфатаз из Ecoh (1), кишечника цыпленка (2) и кишки тюленя (3) от концентрации цинка (II) (оптимальные условия индикаторной реакции)

ферментов ионами цинка практически не зависит от времени их совместного инкубирования (< 30 мин).

В результате изучения механизма действия ионов цинка на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения установлен обратимый бесконкурентный тип ингибирования всех фосфатаз Рассчиганные константы ингибирования щелочных фосфатаз из Е coli и кишки тюленя составляют 0 1 и 0.06 мМ соответственно.

Установлено, что ионы кобальта, никеля, меди, кадмия, обладающие близкими с ионами цинка ионными радиусами и эффективными зарядами, а также железо (III), присутствующее практически во всех объектах, в том числе биологических, при концентрациях 1 мкг/мл и ниже не влияют на скорость индикаторной реакции, катализируемой щелочными фосфатазами из всех трех источников. Свинец, известный из более ранних работ лаборатории как эффективный ингибитор щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка, при тех же концентрациях не изменяет каталитическую активность фосфатаз из Е coli и кишки тюленя. Таким образом, обнаруженное нами ингибирующее действие ионов цинка на щелочную фосфатазу из кишки тюленя оказалось не только самым эффективным, но и селективным.

Изучение влияния магния (в диапазоне концентраций 2 нг'мл -0 2 мг/мл) на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз показало, что он эффективно активирует щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка (степень активирования А = 600% при см8=0.02 мг/мл), слабо активирует фермент из Eco// (А = 20% при cMg=0 2 мг/мл) и совсем не влияет на ка та^тит и чес кую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя Установлено также, что 5-минутное инкубирование со щелочной фосфатазой из кишечника цыпленка ионов магния при концентрации 2 hi/мл (при которой А без инкубирования минимальна) повышает степень активирования на -50% При более длительном времени выдерживания степень активирования остается неизменной. В дальнейших исследованиях щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка инкубировали с магнием в течение 5 мин.

Ионы других щелочноземельных металлов - кальция и бария при концентрациях 0 01-0.5 mi/мл и < 6 мкг/мл соответственно, не влияют на скорость индикаторной реакции в присутствии щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка. Из всех изученных ионов щелочных мегаллов (натрия, калия, цезия) доватьпо слабое ГА = 16-35%) активирующее действие на указанный фермент оказывают ионы калия (при концентрациях 0 2-7 мг/мл) и цезия (7 - 70 мг/мл) Активирование этой фосфатазы ионами магния и отсутствие влияния ионов других щелочно-земельных металлов, в частности кальция, можно объяснить тем, что ионы магния способны образовывать в молекуле фермента дополнительные места связывания, одновременно облегчая перераспределение цинка по «существенным» позициям Кроме того, присоединяясь к так называемой «лиофильной» части молекулы фермента, ионы магния способствуют лучшему связыванию и-НФФ

Влияние цинка на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах

При изучении влияния ионов цинка на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах (боратном, карбонатном, mpuc-UCl, глициновом) в оптимальных условиях проведения индикаторной реакции (габл. 1) обнаружено, что цинк ингибирует фермент во всех буферных системах (рис. 2), но в различных диапазонах его концентраций (с7п, мкг/мл при 1=50%), возрастающих в ряду: боратный (0.04) < карбонатный (0.25) < трис-НС1 (1.5) < глициновый (2.2) буферные растворы. Очевидно, это связано с тем, что равновесная концентрация ионов цинка в неорганических буферных растворах выше, чем в органических (особенно глициновом), компоненты которых (тетраборат, гидрокарбонат, ТРИС, глицин) способны образовывать устойчивые комплексы с цинком (lg (3: 0.9; 0 85; 7.6, 11.77 соответственно). При концентрации цинка > 5 мкг/мл степень ингибирования фосфатазы во всех буферных растворах не изменяется (рис. 2), что, по-видимому, объясняется насыщением цинк-связывающих центров фермента ионами металла при достаточно высоких его содержаниях в реакционной смеси.

Рис. 2. Зависимость степени ингибирования (I, %) щелочной

фосфатазы из кишки тюленя от концентрации цинка в бораiном (1), карбонат-ном (2), трис-НС1 (3). глициновом (4) буфер-ных растворах (оптимальные условия индикаторной реакции)

2 4 6

Свд, МКГ/'МЛ

8 10

Результаты изучения совместного влияния ионов цинка и других металлов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя (табл. 2) свидетельствуют о том, что в неорганических буферных растворах ионы металлов независимо от последовательности их введения в индикаторную систему не влияют или влияют весьма незначительно на степень ингибирующего действия ионов цинка. Активность фермента, ингибированного цинком, несколько (на «15%) возрастает только при введении ионов калия или цезия в концентрациях, значительно превышающих концентрацию ионов цинка. Вероятно, такое повышение активности щелочной фосфатазы из кишки тюленя связано со значительным возрастанием ионной силы реакционного раствора.

Таблица 2. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя (ЩФ) в различных буферных растворах в присутствии цинка (оптимальные условия, концентрации/п(11). СоП1). №(Н), Си(П). СаШ) - 1 мкг/мл. 0 02

м1/мл. Са(ГГ) 0 04 мг/мл. К(1) - 7 мт/мл, Сь(1) - 70 мг/мл), п=5. Р-0.95. последовательное1Ь написания символов соответствуе I порядку введения компоненте в индикаторную систему, исходная активность ЩФ 100%)

Состав Активность фермента, %

реакционной 5 мМ 001 М 0 05 М 0 1 М

смеси Боратный Карбонатный Трис-НС! 1 лициновый

ЩФ-/п 40+] 20+2 55+1 88+2

ЩФ (/п 1 Со Си 38±2 20+2 50+2 88+1 91+2 87±3 81±2

ШФ+со+гп -Си +\1 тСс! 41 + 1 21 ±2 50± 2 82+3 90±1 85+2

76±3

ЩФ-Са-г7п 45+1 25+1 71 + 1 97±2

ЩФ+гп+Са 42+3 23±1 70±2 98+1

ЩФ^Мё+гп 43x1 24±4 70+1 97+1

41±3 23+4 70±1 94±3

щФ+гп-Св 51 ±3 37+4 77±2 92+2

щФ-сь+гп 54±1 32±2 78+) 94±2

щФ+к+гп 57 ±2 33±4 71+2 99±1

ЩФ-г7п~К 58+1 37+1 72±2 97+2

Введение совместно с цинком ионов кобальта, никеля, меди или кадмия в индикаторную реакцию, проводимую в т/?ис-НС1-буферном растворе, очень незначительно повышает ингибирующее действие цинка В го же время в присутствии ионов щелочно-земельных метал юЬ ингибирующее действие цинка уменьшается, каталитическая активность фермента повышается, очевидно, вследовие конкуренции между этими ионами за центры их связывания в ферменте. Этим можно объяснить и результаты, полученные при проведении реакции в глициновом буферном растворе, однако в этом случае накладывает отпечаток еще и высокая реакционная способное 1ь глицина, как компонента буферного раствора Незначительные флуктуации активности фермента при введении наряду с цинком ионов других металлов свидетельствуют, очевидно, о склонности глицина к образованию с ними комптексоа Установлено также, что в исследованных буферных растворах ионы магния (при концентрациях < 0.02 мкг/мл), кобальта, кадмия, никеля и

меди (С ' мкг/мл) не влияют на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

Таким образом, проведение индикаторной реакции в неорганических буферных растворах обеспечивает не юлько более высокую чувствительность щелочной фосфатазы из кишки тюленя по отношению к ингибирующему действию цинка, но и высокую избирательность эюю действия Наиболее перспекшвно для определения цинка использование боратного буферного раствора, поскольку одна и та же степень ингибирования фермента, например 50%, достигается в этом буферном растворе при концентрациях цинка в 6 раз ниже, чем в карбонатном.

Методики определения цинка и магния с использованием различных

щелочных фосфатаз

Ингибирующее действие цинка на щелочную фосфатазу из кишки тютеня в mpuc-HCl- и боратном буферных растворах и активирующее действие магния (И) на щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка были положены в основу селективных ферментативных методик их определения (табл. 3).

Таблица 3. Метрологические характеристики ферментативных мс годик определения цинка и магния с использованием щелочных фосфатаз различного происхождения (п^5. Р ~0 95: у-у, мкМ/мин; х- 1§{Сго(Н). мкг/мл} или х-СМв(ц). нг/мл)

Определ ион (бу ферный Р-Р) Источник фермента Эффект Диапазон определяемых сотержаний Уравнение градуировоч-ного графика sr при С„

Zn(II)

(0 05 М трис-HCI) Кишка тюленя Ингиби-рование 1-10 мкг/мл (0.015-0 15 мМ) у=5 57-3 02х 0 03

(5 мМ боратный) 0.01-0.1 мкг/мл (0.15-1.5 мкМ) у=1 34-4 58х 0 14

Мя(П)

(0 05 М трис-НС1) Кишечник цып тенка Активирование 0 6-6 нг'мл (0 025 0 2S мкМ) >=-3 30-0 53х 0 04

Полученные результаты свидетельствуют о возможности направленного изменения чувствительности и селективности действия ионов металлов варьированием природы буферного раствора, в котором проводят индикаторную реакцию.

В борашом буферном растворе определению цинка на уровне нижней границы определяемых содержаний, соответствующей его ПДК в водах, мешают только 2.5-10Ч и 7-10^-кратные избыточные количества калия и цезия

соответственно Предложенная методика проста и экспрессна, превосходит по чувствительности методику определения цинка методом атомно-абсорбпионной спектроскопии (с„=0.5 мкг/мл), но уступает по чувствительности методикам определения цинка методами инверсионной вольтам перометрии (с, ,=5 нг/мл) и рентгеновской флуоресценции с сорбционным концентрированием (сн = 4 нг/мл).

Ферментативному определению магния на уровне нижней границы определяемых содержаний мешают лишь 105-кратные количества ионов бария и кальция, а также 103- и 10"-кратные количества ионов кадмия и цинка соответственно. Предложенная нами методика определения магния по его активирующему действию на щелочную фосфатазу и; кишечника цыпленка превосходит по чувствительности атомно-абсорбционные и атомно-эмиссионные методики

Получение апофериентов щелочных фосфатаз различного происхождения

Из литературы известно, что связывание иона металла-кофактора в активном центре фермента более специфично и прочно, чем связывание с ферментом иона металла-ингибитора или активатора. Вследствие этого реактивирование апофермента, образующегося при полном или частичном удалении иона металла-кофактора из активного центра фермента, может обеспечить более высокую селективность и чувствительность определения цинка или магния.

Для получения апофосфатаз нами был выбран ЭДТА, что обосновано не юлько литературными данными о частом его использовании для получения апофосфатаз различного происхождения, но и сведениями о способности этого лиганда образовывать прочные комплексы с ионами не только цинка, но и магния.

Рис. 3. Зависимость степени иягибирова-ния (I. %) щелочной фосфатазы из £ coli (1). кишечника цыпленка (2) и кишки тюленя (3) от концентрации ЭДГА (оптимальные условия индикаторной реакции, время инкубирования фермента с ЭДТА 15 мин)

Установлено, что ЭДТА ишибирует всс указанные ферменты, но в различной степени (I, %). которая при c;,i|A=60 мкМ и t= 15 мин понижается в

Сэдтд, мкМ

ряду щелочных фосфашз, выделенных из тонкой кишки гренландскою тюленя (95%) > кишечника цыпленка (86%) > Е coli (5%) (рис 3) Ингибирующий эффект усиливается при увеличении времени инкубирования ЭДТА со щелочной фосфатазы из Е coli весьма незначительно (1-7% при t=60 мин и С)дга-60 мМ). Наибольшая степень ингибирования (1«90-95%) щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя достигается при одинаковых временах их инкубирования с ЭДТА - 15-30 мин и одной и той же концентрации лиганда (60 мкМ), но при различных концентрационных соотношениях Е:ЭДТА - 1.100 и 1:6000 соответственно. Указанные соотношения Е:ЭДТА выбраны в качестве оптимальных для получения апоферментов двух фосфатаз животного происхождения.

В 60 раз меньший избыток ЭДТА, необходимый для получения апофермента из кишечника цыпленка, может свидетельствовать о большей доступности пинка в активном центре этого фермента действию ЭДТА, связанной, по-видимому, с разной пространственной конфигурацией двух фосфатаз (димер и тетрамер соответственно) Различие в степенях ингибирования фосфатаз при 15 и 30 мин инкубирования с ЭДТА незначимо (< 4%), поэтому в целях экономии времени для получения апоферментов выбрали тШ1К = 15 мин Низкая остаточная каталиiическая активность щелочных фосфатаз после действия ЭДТА (5-10%) может свидетельствовать о том. что ионы цинка и магния не полностью удалены из активных центров ферментов при 15-минутном контакте с ЭДТА, очевидно, вследствие их прочной связи с апоферментом. Кроме того, это можно объяснить наличием заряженных участков в молекулах ферментов, которые способны непосредственно участвовать в превращении субстрата даже в отсутствие ионов металлов активных центров.

В случае малоизученной щелочной фосфатазы из кишки тюленя был значительно расширен крут исследованных органических соединений, которые представляли три группы лигандов, способных в условиях эксперимента при pH 9 8' а) взаимодействовать только с ионами цинка (2,2'-дипиридил, 1,10-фенантролин, диэтилдитиокарбаминат натрия (ДЭДТК), аминокислоты- L-цистеин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-лейцин, глицин); б) взаимодействовать преимущественно с ионами магния - нитрилотриметиленфосфоновая кислота (НТФ), в) образовывать комгиексы одновременно с ионами двух металлов -цинка и магния (диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), 1,2-циктогександиамишефауксусная кислота (ЦГДТА), 8-гидроксихинолин. 8-i идроксихинолин-5-сульфокислота)

Установлено, что ДЭДТК, 2,2'-дипиридил, 1,10-фенантролин даже при довольно высоких (0 1-1 мМ) концентрациях не влияют на каталишческую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя, что обусловлено, вероятно, затруднением в проникновении молекул указанных соединений к ионам цинка, расположенным глубоко в «белковых полостях» тетрамерной структуры фермента Из всех изученных аминокислот лишь цистеин. образующий с

цинком наиболее устойчивый комплекс, ингибирует щелочную фосфатазу из кишки тюленя. Однако использование его для получения апофосфатазы сочли нецелесообразным вследствие необходимости введения большого избыточного (105-кратного) количества цистеина по отношению к ферменту, плохой воспроизводимости результатов и отсутствия четко выраженной зависимости степени ингибирования фермента от времени инкубирования его с цистеином НТФ эффективно ингибирует фермент (табл. 4), что обусловлено, вероятно, тем, что, координируясь по магнию, НТФ участвует также в разрыве водородных связей в молекуле фермента и еще в большей степени дестабилизирует его структуру.

Для получения апофосфатазы из кишки тюленя с использованием НТФ и дальнейшею реактивирования его ионами магния нами были выбраны следующие условия: соотношение Е:1 = 1:6000, тиот = 15 мин, при которых степень ингибирования фермента довольно высока (I « 75%).

8-Гидроксихинолин и 8-гидроксихинолин-5-сульфокислота в условиях эксперимента вызывали опалесценцию реакционного раствора, поэтому, несмотря на эффективное ингибирующее действие на фермент в диапазоне концентраций 0.01-0 2 мкМ, их использование для получения апофосфатазы из кишки тюленя возможно, по-видимому, только с применением диализа.

Таблица 4. Зависимость степени ингибирования щелочной фосфатазы из кишки тюленя НТФ 01 концентрации и времени инкубирования (т) его с ферментом (0 05 М ;ир«оНС1-буферный раствор, рН 9 8; сь = 10 нМ, с„.нфф = 0 55 мМ)

С| (в смеси). чкМ Соотношение Е I I, % при т, мин

5 10 15 30 60

1.5 1:150 0 0 0 8 15

3 1:300 0 0 0 5 20

6 1:600 0 9 19 23 35

15 1:1500 11 22 25 41 43

30 1.3000 16 18 25 34 44

60 1:6000 29 51 75 81 81

120 1 12000 43 70 78 82 82

Использование ДТПА и ЦГТПА для получения апофосфатазы сочли нецелесообразным, поскольку ДТПА склонно к образованию биядерных комплексов с ионами цинка и магния, а для проявления эффективного влияния ЦГДТА фебуется длительное время: реакция образования комплекса с ним протекает в десятки раз медленнее, чем с ЭДТА.

Таким образом, в результате проведенного исследования из широкого крута изученных органических соединений различных классов для получения апофосфатазы из кишки тюленя были выбраны ЭДТА и НТФ, способные в

наибольшей степени ингибировать фермент при минимальном избыточном количестве.

Наличие больших избыточных количеств органических соединений в реакционной системе при получении апоферментов щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя может приводить при реактивировании к преимущественному образованию комплексов введенных извне ионов металлов (цинка или мат ния) не с апоферментом, а с избытком свободного, не связанного с ферментом лиганда Следовательно, для разработки селективных и чувствительных методик определения ионов металлов-кофакторов щелочных фосфатаз целесообразно бы га получить истинный апофермент. лишенный не только ответственных за каталитическую активность и алтостерическую регуляцию в молекуле щелочной фосфатазы ионов цинка и магния соответственно, но и ионов цинка структурных центров ферментов.

Возможность получения истинного апофермента изучили на примере щелочной фосфатазы из к-ишки тюленя Для выбора оптимальных устовий проведения диализа варьировали поочередно природу, состав и рН диализной жидкости, условия проведения диализа- статические и динамические; время, температуру При использовании в качестве диализной жидкости раствора ЭДТА с концентрацией, при которой соблюдалось бы концентрационное соотношение Е'ЭДТА = 1 6000 и 1:3000, и временах диализа 24 и 48 ч, выбранных согласно литературным данным, было обнаружено, что с увеличением времени диализа и уменьшением концентрации ЭДТА в диализной системе его ингибирующее действие на фермент снижается Это, вероятно, можно объяснить тем, что ЭДТА, проникнув в диализный мешок, сначала расходуется на неспецифическое (электростатическое) взаимодействие с ферментом, а лишь затем — на связывание с ионами металлов ею активного цен фа На второй стадии диализа (отмывки) молекулы ЭДТА, образующие своеобразную ('шубу;; вокруг белковой глобулы фермента за счет электростатических взаимодействий, быстро отмываются, в результате чего каталитическая активность щелочной фосфатазы несколько возрастает При повышении времени диализа с 24 до 48 ч процесс отмывки сопровождается дальнейшим разрывом неспецифических связей Е---ЭДТА, а степень ингибирования фермента, обусловленная прочным связыванием Е-/п-ЭДТА, остается невысокой

Изменение температуры (с 4° до 25°С), рН (5.5, а не 9 8) и природы диализата (Н;0) привело к полной потере ферментом каталитической активности, но одновременно значительно (до 8%) понизило по сравнению с исходной активность фосфатазы в контрольном опыте, что свидетельствует, по-видимому, о распаде тетрамерной молекулы фермента на неактивные субъединицы и/или денатурации его при длительном выдерживании в воде, проникающей через поры мембраны диализного мешка.

Было решено модифицировать первую сталию диализа - получать анофосфагазу при непосредственном контакте фермента с ЭДТА (в диатизный мешок помещать фермент, предварительно на 90-95% ингибированный ЭДТА),

а вюрую стадию процесса оставить без изменений. Варьируя поочередно состав диализата (вода или трис-НС1-буферный раствор), время (24 или 48 ч) и температуру (4° или 25°С) диализа, установили, что из всех варьируемых параметров главным фактором, определяющим каталитическую активность фермента (в контрольном опыте) после проведения диализа, является состав диализата и его рН. Наибольшая каталитическая активность фермента сохранялась при следующих условиях: температура - 4°С, промывная жидкость - 0.05 М т/?ис-НС1-буферный раствор (рН 9 8), время диализа - 24 ч. В выбранных оптимальных условиях провели диализ в присутствии ЭДТА (Е:ЭДТА = 1 -6000), увеличив время отмывки до 48, 72 ч, а также 12 суток. Во всех случаях промывной раствор меняли каждые 12 ч.

■ контрольный опыт ■после диализа

■ без диализа

0 100 200 300

Время диализа-отмывки, ч

Рис. 4. Зависимость каталитической активности щелочной фосфатазы из кишки тюленя после проведения одностадийного диализа при 4°С от времени диализа (Е:ЭДТА = 1.6000; отмывка 0.05 М трис-НСI-буферным раствором. рН 9 8) в сопоставлении с контрольным опытом и с опытом без диализа

Данные, представленные на рис. 4 (кривая 1), свидетельствуют о том, что по мере увеличения времени отмывки каталитическая активность фермента в контрольном опыте (в отсутствие ЭДТА) понижается. Этот процесс, несомненно, играет роль и при диализе фермента, особенно при увеличении времени отмывки свыше 24 часов; в первые сутки диализа-отмывки (рис. 4, кривая 2) одновременно протекает и другой процесс - удаления молекул ЭДТА, образовавших за счет неспецифического связывания «шубу» на поверхности биокатализатора, в результате чего активность его повышается. Для проверки влияния только времени контакта фермента с ингибитором при соотношении Е:ЭДТА= 1.6000 их смесь выдерживали в течение 24 и 48 ч при не в

диализном мешке, а в стеклянной пробирке с притертой пробкой. Проведенный эксперимент показал, что активность фермента резко падает (до 5%) в течение первых 15 мин и в дальнейшем не изменяется. Замена ЭДТА на 8-оксихинолин и 8-оксихинолин-5-сульфокислоту не привела к каким-либо изменениям в активности фермента после проведения диализа.

Гаким образом, варьирование условий проведения диализа, а также модификация второй его стадии - отмывки не позволили нам получить истинный апофермент щелочной фосфатазы из кишки тюленя, и даже снизить активность фермента до такого остаточного уровня (5%), который достигается

при непосредственном выдерживании его с ЭД1А без проведения диализа (рис 4, кривая 3).

Реактивирование ионами металлов апофосфатаз из кишечника цыпленка и кишки гюленя, полученных с использованием ЭДТА

Изучение возможности реактивирования апофосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя, полученных с использованием ЭДТА, без проведения диализа, показало, что при добавленные извне ионы цинка, а также никеля, кобальта, меди и кадмия, имеющие близкие к цинку ионные радиусы и константы усюйчивости их комплексов с ЭДТА, реактивируют апофосфатазу и 5 кишечника цыпленка (табл. 5) Реактивирование апофосфатазы из кишки тюленя вызывает только цинк.

Таблица 5 Корреляция сгепени реактивирования апофосфатаз из кишечника цыпленка (I] и кишки тюленя (II) ионами металлов (Ме) (смс=1 мкг/мл) с ве шчинами и\ радиусов. конс!антами устойчивосш ич пилендиаминтефаацетатов

Ме(П) Ионный радиус, А РцМеЭДТЛ]2 РеА, %

I II

Zя (II) 0.83 16.50 86 25

Со (И) 0 82 16.21 86 0

N 1 (II) 0.78 18.62 69 0

Си (II) 0.70 18.80 68 0

са (II) 1 03 16.59 60 0

Такое существенное различие в селективности реактивирующего действия цинка на две апофосфатазы можно объяснить, вероятно, различным характером взаимодействия ионов цинка ферментов с ЭДТА.

Гак, по-видимому, при получении апофосфатазы из кишки тюленя ионы цинка удаляклся из кататитических центров фермента в резу тьтате образования комтекса с ЭДТА Каталитическая активность этого фермента восстанавливается блаюдаря тому, что введенные извне ионы цинка занимают места в каталитических центрах, ставших вакантными после действия ЭДТА Реактивирование апофосфатазы из кишечника цыпленка протекает, очевидно, по другому механизму Вследствие, видимо, более высокой по сравнению с фосфата ¡ой из кишки тюленя прочности связи [7п-апофермент] в структуре щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка ЭДТА не удаляет ионы цинка из акшвною цешра этого фермент, а лишь координируется вблизи этих ионов Добавленные затем извне ионы цинка (или подобные им ионы других металлов, табл 5) конкурируют с ионами цинка активного центра фермента за связывание с ЭДТА. чем и объясняется низкая сетективность такого реактивирования

Наряду с ионами цинка апофосфатазу из кишечника цыпленка весьма эффективно реактивируют те ионы металлов, которые, как и цинк, обладают характеристическим координационным числом 6 и склонны образовывать октаэдрические комплексы с ЭДТА Однако степень реактивирования этими ионами указанного апофермента уменьшается при переходе от цинка к кадмию (габл. 5) Такая же, как в случае цинка, степень реактивирования апофермента достигается только при введении ионов кобальта, наиболее близких к ионам цинка по ряду характеристик, приведенных в табл. 5.

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что для разработки селективной методики определения цинка по его реактивирующему действию на апофермент перспективно использовать только щелочную фосфатазу из кишки тюленя. При этом целесообразно получать апофермент обработкой раствора нативного фермента ЭДТА, не прибегая к диализу.

Реактивирование апофосфатазы из кишки тюленя, полученной с использованием нитрилтриметиленфосфоновой кислоты

Установлено, что при концентрационном соотношении НТФ и магния 1:1 последний незначительно реактивирует апофосфатазу из кишки тюленя (РеА=Т0%); увеличение концентрации ионов магния до 200 мкг/мл (8 мМ) приводит лишь к незначительному (на 15%) повышению ее каталитической активности.

Происходящие в системе процессы можно представить схемой 2, основанной на предположении, что НТФ может (так же, как и ЭДТА) взаимодействовать с ионами магния аллостерического центра фосфатазы, а также связываться с белковой глобулой, образуя некую «гидрофобную сферу».

Варьирование порядка введения компонентов индикаторного процесса позволило установить, что ионы магния, добавленные в систему до НТФ, уменьшают интибирующее действие хелатирующего агента, восстанавливая тем самым каталитическую активность щелочной фосфатазы. Такое действие магния по отношению к ферменту в присутствии НТФ называется либеративным.

При соотношении НТФ - 1:1 ингибирующее действие НТФ нивелируется практически полностью. По мере увеличения концентрации магния в реакционной смеси ингибирующее действие фосфорсодержащего комплексона на щелочную фосфатазу из кишки тюленя ослабевает, то есть магний в присутствии НТФ выступает в роли либератора каталитической активности щелочной фосфатазы из кишки тюленя. Малое различие (7%) в степенях либеративного действия магния при соотношении его с НТФ 1:1 и 2:1 можно объяснить образованием в последнем случае биядерных комплексов с НГФ

Схема (2) взаимодействия магния со НТФ"" щелочными фосфатазами из кишки

НТФ... тюленя и кишечника цыпленка в

шф* Н1Ф" присутствии НТФ (на примере одной

т • ' I '' А/^ 7 Н1ф. субъединицы фермента)

" Усчоеные обозначения

_ >3, / £ нтф'*' Е субъединина фермента; НТФ* и

ШФ "" /¿нтф- НТФ** - молекулы НТФ, свяинные с

шф- '7 (М? белковой глобулой фермента.

нтф" нтф— образующие «гидрофобную сферу» и взаимодействующие с ионами магния аллостеричсского центра фермента НТФ соответс1венно, НТФ*** - убыточное

„..,. количество ¡ПФ в системе

нтф'

НТФ'1' •■• ЬМ»-Н1Ф** - НТФ*

А Б

А. М§ НТФ"** Б. МеНТФ**"

+ НТФ** + НТФ* ■■ Е-Мв + Г^НГФ** + МвНТФ* - Н"1Ф* ■ ■ Е-М§

Таблица 6. Зависимость степени либеративного действия ионов магния и кальция на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в присутствии НГФ от концентрации ионов металлов и их концентрационного соотношения с комплексоном (концентрация НТФ - 60 мкМ, время инкубирования - 15 мин)

Концентрация МсШ.) мкМ Соотношение(М) МсШ) ШФ 1м.- % Д1мЛ %

Мё(П) Са(П) МВ(П) Са(Н)

120 2 : 1 6 6 69 69

60 1 : 1 13 13 62 и

30 1 : 2 24 27 51 48

6 1 : 10 45 44 30 31

1.2 1 • 50 61 60 14 15

0.6 1 ■ 100 68 69 7 6

* \ I, % = 1|,гф - 1м<. ь ф. где 1Н ф и 1у,„ !гф - степени ингибирования щелочной фосфат азы и? кишки тюленя НТФ в отсутс1вие и в присутствии матния ити ка нщия соответственно, 1шф - 75 %

Аналогичные исследования, проведенные в присутствии кальция, который, как и магний, обра)ует устойчивый комптекс с ШФ, показали

полную идентичность действия ионов двух щелочно-земельных металлов (табл. 6).

При одновременном введении в индикаторный процесс ионов магния и кальция при их концентрационном соотношении Н в присутствии ¡0-ти кратных избыточных количеств НТФ каталитическая активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя возрастает лишь на 15% по сравнению с таковой в случае добавления ионов металлов по отдельности, то есть синергетическое либеративное действие на фермент не наблюдается.

Обнаруженное либеративное действие на щелочную фосфатазу из кишки тюленя в присутствии НТФ ионов магния свидетельствует о принципиальной возможное!и их определения в интервале концентраций 0.6-60 мкМ.

Методики определения цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из кишки тюленя

Для усиления реакшвирующею действия цинка на апофосфатазу из кишки тюленя, полученную с использованием ЭДТА, в реакционную сиситему добавляли ионы магния или кальция в концентрациях 2 и 4 мкг/мл соответственно, при которых их реактивирующее действие на эту апофосфатазу заметно и хорошо воспроизводимо.

При выяснении последовательности введения ионов металлов в индикаторную реакцию обнаружено, что цинк наиболее эффективно реактивирует апофермент (РеА=90%) в том случае, когда он добавлен к апоферменту после магния. Реактивирующее действие цинка в присутствии кальция несколько (на 14%) ниже, чем в присутствии магния. В этом случае, вероятно, ионы щелочно-земельных металлов конкурируют за связывание их как в аллосгерическом, так и в каталитическом центрах фермента.

Изучение влияния на степень реактивирующею действия цинка ионов кобальта, никеля, меди и кадмия при концентрациях 0.01-1 мю/мл показало, что в указанных условиях только цинк реактивирует апофосфатазу из кишки тюленя.

Обнаруженная нами прямо пропорциональная зависимость степени реактивирующего действия иона-кофактора в присутствии магния от концентрации пинка позволила разработать ферментативную методику его определения в диапазоне концентраций 0.01 - 0.1 мкг/мл.

Уравнение градуировочного графика имеет вид: у = 3.62 + 52.89 х, где у = v, мкМ/мин, х = с7п(п), мкг/мл; зг = 0.04 при с„ (п=5, Р=0.95).

Предел обнаружения цинка составляет 8 нг/мл.

Разработанная методика определения цинка отличается не только высокой селективностью, но и высокой чувствительностью, сопоставимой с чувствительностью разработанной нами ранее методики, основанной на ингибирующем действии цинка на тот же фермент в боратном буферном растворе. При этом методика превосходит по чувствительности атомно-абсорбционную методику определения цинка (с„ = 0.5 мкг/мл), но уступает по

чувствительности методике определения цинка по его реактивирующему тействию на апоалкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей (с„ -0 05 нг/мл)

Определение цинка и магния в биологических объектах

Разработанную нами высокоселекшвную и чувствительную меюдику 9 определения цинка по их реактивирующему действию в присутствии магния на

апофосфатазу из кишки тюленя, полученную с использованием ЭДТА, применили для анализа сыворотки крови человека », Для устранения влияния на активность фермента трихлоруксусной кислоты

(рН ~ 1 ), с помощью которой получали сыворогку, увеличили буферную емкоегь трг/оНС1-буферного раствора (рП 9,8), повысив ею концентрацию в 20 раз (до 1 N1).

Найденное содержание цинка в двух образцах сыворотки крови составило (8 04±0 02) и (9.20±0.0!) mki/мл (п=5, Р=0 95), что соответствует нижней границе нормального содержания лого элемента в крови здоровых людей Полученные нами данные хорошо согласуются с результатами определения цинка в iex же образцах сыворотки атомно-абсорбционным методом: (8 05 ± 0 01) и (9 19 ± 0.01) мкг/мл (п=5, Р=0.95) (горючая смесь: пропан-воздух, Л^213 9 нм, ширина щели пламенного атомизатора - 1 см).

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения разработанной нами ферментативной методики для определения цинка в сыворотке крови. Методика отличается высокой селективностью и простотой получения апофосфатазы из кишки тюленя, а также ее высокой стабильностью, что является несомненным достоинством.

Разработанная высокочувствительная и селективная методика определения магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка была применена для анализа мочи человека.

Для полного извлечения ионов магния из его комплексов с органическими и неорганическими компонентами мочи и устранения возможного мешающего влияния белков, углеводов и других биологически активных компонентов, а также продукюв их метаболизма, пробы мочи готовили к анализу, испочьзуя растворы соляной или уксусной кислот. Для устранения мешающего влияния на фермент этих кислот, а также фосфат-ионов, которые присутствуют в моче и являются ингибиторами щелочной фосфатазы, была увеличена буферная емкость трис-НС1-буферного раствора (рН 9.8) в 10 раз (до 0.5 М).

После проведения обширного и детального исследования возможности и способов испо шзования указанных кислот для разложения проб мочи (была изучена зависимость скорости индикаторной реакции от порядка смешения компонентов ферментативной системы и времени их совместного выдерживания при подготовке проб мочи и стандартных растворов магния различными способами) предложен следующий способ разложения проб мочи для понижения ее цвет нос ш и мутности: табораторную пробу подогревают на

пламени горелки до первых паров, огбирают 6 мл и добавляют к ним 0 1 мл 1 М соляной кислоты; в дальнейшем пробу разбавляют в определенное число раз водой с pH 5.5.

Найденное содержание магния в образцах мочи 6 пациентов в возрасте 5, 15, 20, 25, 30, 50 дет составило 14.40; 20.88; 21.00; 27.00; 12.60; 10.80 мг/сут соответственно, что (при норме магния в моче 100-300 мг/суг) указывает на существенный дефицит этого элемента в их организме.

Для обоснования практического значения разработанной нами методики определения ионов магния в моче и возможности внедрения ее в медицинскую практику, был детально изучен с ее помощью фармакологический эффект приема магнийсодержащего препарата «МАГНЕРОТ» одним из пациентов, у которого отсутствовали хронические заболевания, но были несколько ослаблены жизненные функции организма, восстановление которых при интенсивной магниевой терапии возможно за короткий срок - неделю. Полученные нами результаты хорошо согласуются с результатами спектрофотометрического с использованием красителя ксилидилового синего и атомно-абсорбционного анализа тех же проб мочи и указывают на эффективность применения «МАГНЕРОТА» (рис. 5).

-«—ферментативный метод -*— спекгрофотометрический метод о аточно-абсорбционный метод

Рис. 5. Зависимость содержания магния в суточной моче, опре-детенного ферментативным и спектрофото-метрическим методами, от времени приема препарата

Таким образом, показана возможность и целесообразность использования разработанной нами ферментативной методики экспрессного определения магния для анализа весьма сложного биологическот о объекта - мочи, а также эффективность ее применения для фармакокинетических исследований эффективности магнийсодержащих лекарственных препаратов.

выводы

1 Обоснована целесообразность исследования и использования в химическом анализе нативных щелочных фосфатаз, выделенных hs различных источников' F coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренландского тюленя, для определения цинка и магния — металлов-кофакторов этих ферментов.

2 В результате сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз, выделенных из трех источников, в реакции гидролиза п-ншрофенилфосфата в разных буферных растворах (боратном, карбонатном, глициновом и трис-HCl) установлено, что природа буферного раствора значительно влияет на каталитическую активность ферментов и позволяет направленно изменять их чувствительность к действию различных эффекторов в зависимости от решаемой аналитической задачи

3 Изучение влияния на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз ионов ряда щелочных, щелочно-земельных, переходных и тяжелых металлов показало, что'

• обратимым бесконкурентным ингибитором всех трех щелочных фосфатаз является цинк в диапазоне его концентраций 0.01-10 мкг/мл; наибольшей чувствительностью к действию цинка отличается щелочная фосфатаза и i тонкой кишки гренландского тюленя при проведении реакции гидролиза «-нитрофенилфосфата в боратном буферном растворе;

• щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка в значительной степени активирует магний в диапазоне его концентраций 2 нг/мл - 0.02 мг/мл (степень активирования А = 600% при cMg = 0.02 мг/мл); при более высоких концен¡рациях (0 02-0 2 мг/мл) ион магния слабо активирует фермент из Е coli (А = 20% при Сме = 0.2 мг/мл) и не влияет на каталитическую активность фермента из тонкой кишки гренландского тюленя;

• активность всех трех щелочных фосфатаз незначительно активируют ионы калия (при концентрации 0 3-7 mi/мл), а ферментов из Е coli и кишечника цыпленка - и ионы цезия (при концентрации 7-70 мг/мл);

• каталитическая активность всех исследованных фосфатаз не изменяется в присутствии Со(Н), Cu(II), Cd(II), Ni(II), Fe(III), Hg(ll) при их концентрациях 0.01-10 мкг/мл, а также СаП1), Ва(11) при их концентрациях 0 01-0 5 мг/мт и < 0.006 мг/мл соответственно; Pb(II) в диапазоне концентраций 0 1-10 мк(/мл ингибирует только щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка

4 При изучении влияния широкого круга органических соединений раз 1ичных классов (кислород- и фосфорсодержащих комплексонов, 1 идроксихино типов и ил производных, аминокислот и др ) установлено, что наиболее эффективным ингибитором щелочных фосфатаз животного

происхождения является ЭДТА, а щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя - еще и нитрилотриметиленфосфоновая кислота. Щелочная фосфатаза из Еcoli наименее чувствительна к действию органических соединений.

5. Различная степень ингибирующего действия ионов цинка, ЭДТА и активирующего действия ионов магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз из трех источников указывает на существенные различия в пространственном строении

6. Разработаны методики получения апофосфатаз из кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя с использованием ЭДТА в качестве хелатирующего агента.

7 Установлено, что только апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя ионы цинка реактивируют селективно, в то время как апофосфатазу из кишечника цыпленка помимо цинка реактивируют ионы металлов, имеющие близкий к цинку ионный радиус (кобальта, меди, кадмия и никеля)

8. Показана принципиальная возможность использования обнаруженного либеративного действия ионов магния на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя, ингибированную нитрилотриметилен-фосфоновой кислотой, для определения мат ния в диапазоне его концентраций 0.15-15 мкг/мл.

9 С использованием щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя и индикаторной реакции гидролиза и-нитрофенилфосфата разработаны ферментативные методики определения цинка:

• по его ингибирующему действию на каталитическую активность фермента в трис-HCl и боратном буферных растворах (pH 9.8) с с„=1 и 0 01 мкг/мл соответственно (sr=0.03 и 0.04; п=5; Р=0.95);

• по его реактивирующему действию на апофермент с с„=0,01 мкг/мл (sr=0.04; п=5; Р=0.95)

10 Рафабогана методика определения магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в m/wc-HCl-буферном растворе (pH 9.8) с с =0.06 нт/мл (sr=0.04; п=5; Р=0.95).

11 Разработаны чувствительные и высокоселективные ферментативные методики определения цинка в сыворотке крови, магния - в моче.

12. Даны рекомендации по выбору щелочной фосфатазы, выделенной из определенного источника, для решения ряда конкретных аналитических задач- например, для определения магния в присутствии цинка следует использовать щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка; для определения ионов цинка в присутствии ионов кобальта, меди, никеля, магния, кальция, бария - щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.

Публикации

1 Жаворонкова AM, Мугинова С.В., Веселова И А, Шеховцова ТН Определение цинка (II) с использованием нативных и иммобилизованных щелочных фосфатаз различного происхождения // Журн. аналит. химии. 2003. Т 58 №1. С 88-96

2 Жаворонкова A.M., Мугинова С.В, Шеховцова Т Н. Определение микроколичеств цинка (II) по реактивации апоферментов щелочных фосфатаз различного происхождения // Журн. аналит химии. 2003 Т.58 №6. С.658-665.

3 Жаворонкова А М . Мугинова С В , Шеховцова Т Н Влияние природы буферного раствора на каталитическую активность щелочной фосфагазы из тонкой кишки гренландского тюленя и ее чувствительность к действию цинка (II) '/ Вестник МГУ. Сер. 2 Химия. 2003 Т 44 JV" 2. С 123-130

4 Zhavoronkova А М , Muginova S.V., Shekhovtsova Т N Determination of some metal ions using reactivation of the apoenzyme of alkaline phosphatase from chicken intestine. /Book of Abstracts. 7-th Int. Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry Bucharest, Romania. 2001. P 2.

5 Веселова И А., Жаворонкова A M., Мугинова С В , Шеховцова Г Н Тест-методы определения цинка (II) и свинца (II) на основе иммобилизованных щелочных фосфатаз различного происхождения / Материалы Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии». Краснодар 2002 С. 41-42.

6 Bychkov P.V., Zhavoronkova A.M., Zhmaeva E.V., Muginova S.V, Shekhovtsova TN. Determination of zinc (II) using alkaline phosphatases and alcohol dehydrogenases from different origin and their apoenzymes / Book of Abstracts. Int. Conference "Biocatalysis-2002" Moscow. 2002 P.77.

7 Шеховцова T.H , Веселова И А., Мугинова С.В , Жаворонкова А М., Бычков П.В., Григорьева Д.Л Ферментативные методы анализа: пути расширения возможностей. / Международный форум "Аналитика и аналитики". Воронеж. 2003. С.77.

1

„ Отпечатано на ризографе

В ОНТИ ГЕОХИ РАН Подписано в печать 20.02.2004. Тираж 100 экз.

РНБ Русский фонд

2006-4 10447

'i

15 № 2004

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Источники, структура, физико-химические характеристики и механизм действия щелочных фосфатаз бактериального и животного происхождения.

1.1. Источники щелочных фосфатаз.

1.2. Структура и аминокислотный состав щелочных фосфатаз. II

1.3. Роль ионов металлов в структуре и каталитической активности щелочных фосфатаз.

1.4. Механизм действия щелочных фосфатаз.

1.5. Субстратная специфичность щелочных фосфатаз.

Глава 2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения и их апоферментов.

2.1. Влияние ионов металлов на активность бактериальных и животных щелочных фосфатаз.

2.2. Влияние ионов металлов на апоферменты бактериальных и животных щелочных фосфатаз.

Глава 3. Роль цинка и магния в биологических объектах и методы их определения.

3.1. Значение цинка для организма человека, контроль его содержаний.

3.1.1. Биологическая роль цинка.

3.1.2. Методы определения цинка (II) в биологических жидкостях.

3.2. Значение магния для организма человека, контроль его содержаний.

3.2.1. Биологическая роль магния.

3.2.2. Методы определения магния (II) в биологических жидкостях 67 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика 4 эксперимента, обработка результатов измерений. щ 4.1. Исходные вещества.

4.2. Посуда и аппаратура.

4.3. Методика эксперимента.

4.4. Обработка результатов измерений.

Глава 5. Выбор фермента, индикаторной реакции и оптимальных условий ее проведения.

5.1. Выбор фермента.

5.2. Выбор индикаторной системы.

5.3. Выяснение оптимальных условий проведения индикаторной реакции.

Глава 6. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников

6.1. Влияние ионов цинка на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников.

6.1.1. Выяснение типа ингибирования щелочных фосфатаз ионами цинка.

• 6.1.2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочных фосфатаз различного происхождения.

6.2. Влияние ионов цинка на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах.

6.3. Влияние ионов магния на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз.

6.4. Совместное влияние ионов металлов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах.

Глава 7. Выбор оптимальных условий получения апоферментов щелочных фосфатаз.

7.1. Влияние ЭДТА на каталитическую активность щелочных фосфатаз.

7.2. Влияиис органических соединений различных классов на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

7.3. Получение истинного апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя с использованием диализа.

7.3.1. Выбор оптимальных условий получения апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

Глава 8. Реактивирование апоферментов щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя ионами металлов.

8.1. Реактивирование апоферментов, полученных с использованием ЭДТА.

8.1.1. Изучение влияния на апоферменты ионов цинка и ряда других металлов.

8.1.2. Изучение влияния ионов магния и кальция на апофосфатазу из кишки тюленя.

8.1.3. Реактивирование апофосфатазы из кишки тюленя, полученной диализом.

8.2. Реактивирование апоферментов, полученных с использованием нитрилотриметиленфосфоновой кислоты

Глава 9. Разработка методики определения цинка (II) по его • реактивирующему действию на апофосфатазу из кишки тюленя.

Глава 10. Ферментативные методики определения цинка (II) и магния

II) в биологических объектах.

10.1. Определение цинка (II) в сыворотке крови по реактивированию апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя.

10.2. Определение магния (II) в моче по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка.

10.2.1. Подготовка проб мочи к анализу.

10.2.2. Методика определения магния в моче.

Одной из многих медико-биологических проблем, стоящих перед современными методами химического анализа, является контроль содержания в организме человека определенных макро- и микроэлементов, особенно магния и цинка, необходимых для нормального протекания многих биохимических реакций и физиологических процессов. В связи с этим актуальна разработка высокочувствительных и высокоселективных методов определения ионов указанных металлов в биологических объектах, в частности крови и моче.

Для решения этой задачи весьма перспективно использование ферментов, выделенных из различных источников и содержащих в активных центрах одновременно ионы обоих металлов - цинка и магния. Использование различий в доступности металлсвязывающих центров, в аминокислотной последовательности и каталитических свойствах металлоферментов различного происхождения может позволить направленно изменять чувствительность и селективность ферментативных методов определения ионов металлов-кофакторов в различных биологических объектах.

В этом плане особенно интересны гидролазы, в частности щелочные фосфатазы из Е.соН, кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя, как активные, стабильные, коммерческие препараты ферментов, содержащие в каталитических и аллоетерических центрах ионы цинка и магния соответственно. Сравнительное изучение влияния ионов металлов, в особенности цинка и магния, на каталитическую активность этих ферментов с целью разработки ферментативных методик определения ионов металлов-кофакторов до настоящего времени не проводилось. Щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя, в аналитических целях ранее не использовалась.

Систематическое исследование действия ионов металлов на каталитическую активность указанных щелочных фосфатаз может позволить не только выявить ферменты, наиболее перспективные для разработки чувствительных и селективных методик определения цинка и магния в различных объектах, особенно биологических, но и использовать подходы, выработанные на примере щелочных фосфатаз различного происхождения, для расширения областей использования в химическом анализе других металлоферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы металлов различной природы.

Все сказанное дает основание считать создание и развитие ферментативных методов определения металлов-кофакторов актуальным и перспективным направлением.

Цели настоящей работы:

- установление характера и степени влияния ионов цинка и магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз, выделенных из трёх различных источников: кишечной палочки Е. coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренландского тюленя;

- выбор препаратов ферментов, наиболее перспективных с аналитической точки зрения;

- разработка с их использованием высокочувствительных и селективных методик определения цинка и магния на основе их различного действия на каталитическую активность щелочных фосфатаз и их апоферментов;

- применение разработанных методик в анализе биологических объектов.

Научная новизна заключается в том, что впервые на примере щелочных фосфатаз различного происхождения предложены приемы многопланового использования в химическом анализе ферментов, содержащих в каталитическом и аллостерическом центрах ионы различных металлов (цинка и магния); впервые в аналитических целях использована щелочная фосфатаза, выделенная из тонкой кишки гренландского тюленя; выяснены оптимальные условия получения и реактивирования ее апофермента; с целью выяснения перспектив использования в химическом анализе бактериальной и животных щелочных фосфатаз различного олигомерного состава проведено систематическое сравнительное изучение каталитических свойств этих ферментов: чувствительности к действию эффекторов (ионов металлов и органических соединений разных классов); стабильности в буферных растворах различной природы: неорганической - боратном и карбонатном, и органической - глициновом и трис-HCl; разработаны приемы направленного изменения чувствительности и селективности определения цинка и магния: применение щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников; проведение ферментативного гидролиза л-нитрофенилфосфата в буферных растворах различной природы; использование различных эффектов: ингибирования (для определения цинка) и активирования фермента (для определения магния), реактивирования апофермента (для определения цинка в присутствии магния); применение либератавного действия ионов металла на фермент, ингибированный органическим лигандом (для определения магния).

Практическую значимость имеют

• селективные методики определения цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя в реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата в боратном (с„=10 нг/мл) и трис-НС1 (с„=1 мкг/мл) буферных растворах;

• селективная и высокочувствительная методика определения магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в реакции гидролиза п-нитрофенилфосфата (с„=0.6 нг/мл);

• методика получения апофермента щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с использованием ЭДТА;

• селективная и высокочувствительная методика определения цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя (сн= 10 нг/мл);

• методика определения цинка в сыворотке крови человека;

• методика определения магния в моче человека;

• рекомендации по выбору препарата щелочной фосфатазы для определения ферментативным методом магния в присутствии цинка и цинка в присутствии магния; цинка в присутствии ионов кобальта, меди, кадмия и никеля; магния в присутствии кальция.

Автор выносит на защиту:

1. Результаты систематического сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз разного происхождения в буферных растворах различной природы (органической и неорганической) в реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата в отсутствие и в присутствии ионов металлов: цинка и магния, а также кобальта, никеля, кадмия, меди, железа, свинца, ртути, кальция, бария, натрия, калия, цезия (при индивидуальном и совместном с цинком присутствии).

2. Результаты, полученные в ходе: исследования влияния широкого круга органических соединений на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя с целыо выявления ее наиболее эффективных ингибиторов; выбора подходов к получению апоферментов щелочных фосфатаз из трех источников и выяснения оптимальных условий проведения диализа щелочной фосфатазы из топкой кишки гренландского тюленя; изучения возможности реактивирования апофосфатаз животного происхождения, полученных с использованием ЭДТА, ионами цинка и магния, а также кобальта, меди, никеля', кадмия и кальция; исследования действия магния и кальция на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя в присутствии нитрилтриметиленфосфоновой кислоты.

3. Ферментативные методики определения: цинка по его ингибирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя в различных буферных растворах; магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка; цинка по его реактивирующему действию на апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.

4. Результаты определения магния в образцах мочи; цинка - в образцах сыворотки крови человека.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VII Международном симпозиуме «Kinetics in Analytical Chemistry» (Румыния, 2001), Международной конференции «Biocatalysis-2002» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 4 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 211 стр. машинописного текста, включая 26 рисунков, 32 таблицы, 9 схем; состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части (главы 410), заключения, выводов, списка литературы, включающего 172 наименования, и приложения.

выводы

1. Обоснована целесообразность исследования и использования в химическом анализе нативных щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников: Е. coli, кишечника цыпленка, тонкой кишки гренландского тюленя, для определения цинка и магния — металлов-кофакторов этих ферментов.

2. В результате сравнительного изучения каталитических свойств щелочных фосфатаз, выделенных из трех источников, в реакции гидролиза п-нитрофенилфосфата в разных буферных растворах (боратном, карбонатном, глициновом и трис-IIC1) установлено, что природа буферного раствора значительно влияет на каталитическую активность ферментов и позволяет направленно изменять их чувствительность к действию различных эффекторов в зависимости от решаемой аналитической задачи.

3. Изучение влияния на каталитическую активность трех щелочных фосфатаз ионов ряда щелочных, щелочно-земельных, переходных и тяжелых металлов показало, что: ; .*

• обратимым бесконкурентным ингибитором всех трех щелочных фосфатаз является цинк в диапазоне его концентраций 0.01-10 мкг/мл; наибольшей чувствительностью к действию .цинка отличается щелочная фосфатаза из тонкой кишки гренландского тюленя при проведении реакции гидролиза п-нитрофепилфосфата в боратном буферном растворе;

• щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка в значительной степени активирует магний в диапазоне его концентраций 2 нг/мл - 0.02 мг/мл (степень активирования А = 600% при c.Mg = 0.02 мг/мл); при более высоких концентрациях (0.02-0.2 мг/мл) ион магния слабо активирует фермент из т

E.coli (А = 20% при cMg = 0.2 мг/мл) "и не влияет на каталитическую активность фермента из тонкой кишки гренландского тюленя;

• активность всех трех щелочных фосфатаз незначительно активируют ионы калия (при концентрации 0.3-7 мг/мл), а ферментов из E.coli и кишечника цыпленка - и ионы цезия (при концентрации 7-70 мг/мл); каталитическая активность всех исследованных фосфатаз не изменяется в присутствии Со(П), Си(П), Сс!(П), N¡(11), Ре(Ш), Н§(П) при их концентрациях 0.01-10 мкг/мл, а также Са(П), Ва(П) при их концентрациях 0.01-0.5 мг/мл и < 0.006 мг/мл соответственно; РЬ(П) в диапазоне концентраций 0.1-10 мкг/мл ингибирует только щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка.

4. При изучении влияния широкого круга органических соединений различных классов (кислород- и фосфорсодержащих комплексонов, гидроксихинолинов и их производных, аминокислот и др.) установлено, что наиболее эффективным ингибитором щелочных фосфатаз животного происхождения является ЭДТА, й щелочной фосфатазы из тонкой кишки 9 гренландского тюленя - еще и нитрилотриметилепфосфоповая кислота. Щелочная фосфатаза из Е.соИ наименее чувствительна к действию органических соединений.

5. Различная степень ингибирующего действия ионов цинка, ЭДТА и активирующего действия ионов магния на каталитическую активность щелочных фосфатаз из трех источников указывает на существенные различия в пространственном строении их молекул.

6. Разработаны методики получения апофосфатаз из кишечника цыпленка и топкой кишки гренландского тюленя с использованием ЭДТА в качестве хелатирующего агента.

7. Установлено, что только апофосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя ионы цинка реактивируют селективно, в то время как апофосфатазу из кишечника цыпленка помимо цинка реактивируют ионы металлов, имеющие близкий к цинку ионный радиус (кобальта, меди, кадмия и никеля).

8. Показана принципиальная возможность использования обнаруженного либеративного действия ионов магния на щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя,, ингибированную нитрилотриметилен-фосфоиовой кислотой, для определения магния в диапазоне его концентраций 0.15-15 мкг/мл.

9. С использованием щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя и индикаторной реакции гидролиза л-нитрофенилфосфата разработаны ферментативные методики определения цинка:

• по его ингибирующему действию' на каталитическую аетивность фермента в трис-НС1 и боратном буферных растворах (рН 9.8) с с„=1 и 0.01 мкг/мл соответственно (8Г=0.03 и 0.04; п=5; Р=0.95);

• по его реактивирующему действию на апофермент с с„=0.01 мкг/мл (^=0.04; п=5; РЮ.95).

10. Разработана методика определения . магния по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в ш/?мс-НС1-буферном растворе (рН 9.8) с с„=0.06 нг/мл (бг=0.04; п=5; Р=0.95).

11. Разработаны чувствительные и высокоселективные ферментативные методики определения цинка в сыворотке крови, магния - в моче.

12. Даны рекомендации по выбору щелочной фосфатазы, выделенной из определенного источника, для решения ряда конкретных аналитических задач: например, для определения магния в присутствии цинка следует использовать щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка; для определения ионов цинка в присутствии ионов кобальта, меди, никеля, магния, кальция, бария - щелочную фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное нами впервые систематическое сравнительное .изучение каталитических свойств щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников: кишечной палочки (Е. coli), кишечника цыпленка, топкой кишки гренландского тюленя, — металлоферментов, содержащих в своей структуре ионы цинка и магния в каталитическом и аллостерическом центрах соответственно, позволило получить ряд важных результатов, представляющих ценность, как с теоретической, так и практической точек зрения.

При изучении влияния ряда ионов металлов на каталитическую активность в реакции гидролиза я-нитрофенилфосфата щелочных фосфатаз разного происхождения выявлены . различия в их чувствительности к воздействию одних и тех же неорганических эффекторов; в частности" получены данные, свидетельствующие о разной доступности аллостерических центров щелочных фосфатаз. Так, установлено, что из широкого круга изученных ионов переходных и тяжелых металлов только ионы цинка эффективно ингибируют каталитическую активность трех щелочных фосфатаз, причем чувствительность к действию этих ионов понижается в ряду ферментов, выделенных из тонкой кишки гренландского тюленя > кишечника цыпленка > E.coli (табл. 29).

Обнаруженный нами факт, что ионы магния эффективно активируют только щелочную фосфатазу из кишечника цыпленка; бактериальный фермент менее чувствителен к действию этих Ионов даже при высоких их концентрациях, а каталитическая активность щелочной фосфатазы из тонкой кишки гренландского тюленя вообще не меняется в присутствии ионов магния (табл. 29), свидетельствует, очевидно, о том, что структура щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка в наибольшей степени способствует образованию ионами магния в молекуле этого фермента дополнительных мест связывания субстрата, что облегчает перераспределение ионов цинка по «существенным» позициям. Кроме того, эта фосфатаза отличается, по-видимому, повышенным содержанием лиофильной части, присоединяясь к которой, ионы магния способствуют лучшему связыванию субстрата.

Выявление ингибирующего действия цинка (II) на щелочнун? фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя и активирующего эффекта магния (II) на

1. Фредер Дж. Фосфатазы. / В кн.: Фосфор в окружающей среде. М.: Мир, 1978. С. 516-551.

2. Кретович B.JI. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1967. 350 с.

3. Neumann Н. Phosphoryl Transfer from s-substituted monoesters of phosphorothiolic acid to various acceptors catalyzed by alkaline phosphatase from Escherichia coli. И Eur. J. Biochem. 1969. V. 8. P. 164-173.

4. Wilson LB., Dayan J., Cyr K. Some properties of alkaline phosphatase from Escherichia coli. И J. Biol. Chem. 1964. V. 239. № 12. P. 4182-4185.

5. Snyder S.L., Wilson L.B. Investigations on the alkaline phosphatase catalyzed hydrolysis of phosphoramidates. Substituent effects and transphosphorylation. // Biochem. 1972. V. 11. № 17. P. 3220-3223.

6. Reynolds J.A., Schlesinger M.J. Formation and properties of a tetrameric form of Escherichia coli alkaline phosphatase. // Biochem. 1969. V. 8. № 11. P. 4278-4282.

7. Reynolds J.A., Schlesinger M.J. Alterations in the structure and function of Escherichia coli alkaline phosphatase due to Zn binding. // Biochem. 1969. V. 8.№ 11. P. 588-593.

8. Csopak H., Falk K.-E., Szajn H. Effect of EDTA on Escherichia coli alkaline phosphatase. // Biochim. biophys. acta. 1972. V. 258. P. 466-472.

9. Snyder S.L., Wilson I., Bauer W. The subunit composition of Escherichia coli alkaline phosphatase in 1 M TRIS. // Biochim. biophis. acta. 1972. V. 258. P. 178-187.

10. Dong G., Zeikus J.G. Purification and characterization of alkaline phosphatase from Thermotoga neapolitana. II Enz. Microb. Technol. 1997. V. 21. P. 335340.

11. Hauksson J.B., Andresson O.S., Asgeirsson B. Heat-labile bacterial alkaline phosphatase from a marine Vibrio sp. II Enz. Microb. Technol. 2000. V. 27. P. 66-73.

12. Tuleva B„ Vasileva-Tonkova E., Galabova D. A specific alkaline phosphatase from Saccharomyces cerevisiae with protein phosphatase activity. // FEMS Microb. Lett. 1998. V. 161. P. 139-144.

13. Say J.C., Furriel R.P.M., Ciancaglini P., Jorge J.A., Lourdes M., Polizeli T.M., Pizauro J.M., Terenzi H.F., Leone F.A. Conidial alkaline phosphatase from Neurospora crassa. II Phytochem. 1996. V. 41. № 1. P. 71-75.

14. Xiao R., Xie L.-P., Lin J.-Y., Li C.-H., Che Q.-X. Purification and enzymatic characterization of alkaline phosphatase from Pinctada fucata. II J. Mol. Catalysis. Section B: Enzymatic. 2002. V. 17. P. 65-74.

15. Lan W.G., Wong M.K., Chen Ni, Sin Y.M. Effect of combined copper, zinc, chromium and selenium by orthogonal array design on alkaline phosphatase activity in liver of the red sea bream, Chrysophrys major. II Aquaculture. 1995. V. 131. P. 219-230.

16. Zhang R.-Q., Chen Q.-X., Xiao R., Xie L.-P., ZengX.-G., Zhou H.-M. Inhibition kinetics of green crab (Scylla serrata) alkaline phosphatase by zinc ions: a new type of complexing inhibition. // Biochim. biophys. acta. 2001. V. 1545. P. 6-12.

17. Ding S., Li Y., Zhu L. Indentification of histidine residues at the active site of Megalobatrachus japonicus alkaline phosphatase by chemical modification. //

18. Biochim. biophys. acta. 2002. V. 1594. P. 100-108.

19. PetitClerc C., Delisle M., Martel M., Fecteau C., Briere N. Mechanism of action of Mg2+ and Zn2+ on rat placental alkaline phosphatase. I. Studies on the soluble Zn2+ and Mg2+ alkaline phosphatases. // J. Biochem. 1975. V. 53. № 10. P. 89100.

20. Femandes S.S., Furriel R.P.M., Petenuscit S.O., Leone F.A. Streptozotocin-induced diabetes: significant changes in the kinetic properties of the soluble form of rat bone alkaline phosphatase. // Biochem. Pharmacology. 1999. V. 58. P. 841-849.

21. Leone F.A., Rezende L.A., Ciancaglini P., Pizauro J.M. Allosteric modulation of pyrophosphatase activity of rat osseous plate alkaline phosphatase by magnesium ions. // Int. J. Biochem & Cell Biology. 1998. V. 30. P. 89-97.

22. Ciancaglini P., Pizauro J.M., Leone F.A. Dependence of divalent metal ions on phosphotransferase activity of osseous plate alkaline phosphatase. // J. Inorg. Biochem. 1997. V. 66. P. 51-55.

23. Leone F.A., Ciancaglini P., Pizauro J.M. Effect of calcium ions on rat osseous plate alkaline phosphatase activity. // J. Inorg. Biochem. 1997. V. 68. P. 123127.

24. Ciancaglini P., Pizauro J.M., Leone F.A. Mechanism of action of cobalt ions on rat osseous plate alkaline phosphatase. // J. Inorg. Biochem. 1995. V. 60. P. 155-162.

25. Kunitz M. Chicken Intestinal Alkaline Phosphatase. I. The kinetics and thermodynamics of reversible inactivation. II. Reactivation by zinc ions. // J. General Physiol. 1960. V.43. P.l 149-1169.

26. Fernley H.N. Mammalian alkaline phosphatases / In: Boyer P.D., The Enzymes. New-York—London: Academic Press. 3-d ed., 1971. V. 4. P. 417-447.

27. Zhang Y.-X., Zhu Y., XiH.-W., Liu Y.-L., ZhouH.-M. Refolding and reactivationof calf intestinal alkaline phosphatase with excess magnesium ions. // Int. J. Biochem & Cell Biology. 2002. V. 34. P. 1241-1247.

28. Zhang Y.-X., Zhu Y„ Zhou H.-M. Conformational changcs and inactivation of calf intestinal alkaline phosphatase in trifluoroethanol solutions. // Int. J. Biochem & Cell Biology. 2000. V. 32. P. 887-894.

29. Dabich D., Neuhaus O.W. Purification and properties of bovine synovial fluid alkaline phosphatase. //J. Biol. Chem. 1966. V. 241. № 2. P. 415-420.

30. Morton R.K. The Kinetics of Hydrolysis of Phenyl Phosphate by Alkaline Phosphatases. // Biochem. J. 1957. V. 65. P. 674-681.

31. Сахаров И.Ю., Макарова И.Е., Лахтин B.M., Арбатский Н.П. Изоформы, аминокислотный и углеводный состав щелочной фосфатазы из слизистой тонкого кишечника тюленя. // Биохимия. 1989. Т. 54. № 2. С. 250-255.

32. Сахаров И.Ю., Мечетнер Е.Б., Ефремов Е.Е., Степанова И.Е., Шехонин Б.В., Плетюшкина О.Ю. Получение и применение моноклональных антител против щелочной фосфатазы тюленя. // Биохимия. 1991. Т. 56. № 10. С. 1900-1906.

33. Сахаров И.Ю., Макарова И.Е., Ермолин Г.А. Физико-химические свойства щелочной фосфатазы из топкого кишечника тюленя. // Биохимия. 1988. Т. 53. №6. С. 974-978.

34. Sakharov I.Yu. Purification of alkaline phosphatase from the intestinal content of common seal (Phoca vitulina larga) by immunoaffinity chromatography. // Сотр. Biochem. Physiol. 1991. V.99 B. № 3. P. 509-511.

35. Sakharov I.Yu., Mechetner E.B., Stepanova I.E., Shekhonin B.V., Pletyushkina O. Yu. Monoclonal antibody to alkaline phosphatase from the intestinal mucosa of the harp seal, phoca groenlandica. П Сотр. Biochem. Physiol. 1992. V. 101 B. № 4. P. 677-682.

36. Sakharov I.Yu., Makarova I.E., Ermolin G.A. Chemical modification andcomposition of tetrameric isozyme К of alkaline phosphatase from harp seal intestinal mucosa. //Сотр. Biochem. Physiol. 1989. V. 92 B. № 1. P. 119-122.

37. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э„ Хилл Р., Леманн И. Основы биохимии. М.: Мир, 1981. Т. 1.535 с.4S.Schlesinger M.J., Olsen R. A new, simple, rapid procedure for purification of Escherichia coli alkaline phosphatase. // Anal. Biochem. 1970. V. 36. P. 86-90.

38. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. M.: Мир, 1982. В 3-х т.

39. McComb R.B., Posen S. Alkaline Phosphatase. / Plenum Press. 1979. 279 P.

40. Полторак O.M., Атякшева Л.Ф., Чухрай E.C., Торшин И.Ю. Роль конформационного замка в стабилизации димеров щелочной фосфатазы различного происхождения. // Журн. физ. химии. 1998. Т. 72. № 8. С. 14931496.

41. Schlesinger M.J., Barret К. The reversible dissociation of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. I Formation and reactivation of subunits. // J. Biol. Chem. 1965. V. 240. № 11. P. 4284-4292.

42. Fourniere L., Nosjean O., Buchet R., Roux B. Thermal and pH stabilities of alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa: a FTIR study. // Biochim. biophys. acta. 1995. V. 1248. P. 186-192.

43. Атякшева Л.Ф., Чухрай E.C., Полторак O.M. Ассоциация щелочной фосфатазы из E.coli в растворе. // Журн. физ. химии. 1998. Т. 72. № 8. С. 1490-1492.

44. Asgeirsson В., Artdresson O.S. Primary structure of cold-adapted alkaline phosphatase from a Vibrio sp. as deduced from the nucleotide gene sequence. // Biochim. biophys. acta. 2001. V. 1549. P. 99-111.

45. Martin D.C., Pastra-Landis S.C., Kantrowitz E.R. Amino acid substitutions at the subunit interface of dimeric Escherichia coli alkaline phosphatase cause reduced structural stability. // Protein Sci. 1999. V. 8. P. 1152-1159.

46. МакОлифф К. Методы и достижения бионеорганической химии. М.: Мир, 1978.416 с.

47. Неорганическая биохимия. / Под ред. Г. Эйхгорна М.: Мир, 1978. Т. 1.711 с.

48. Gottesman М., Simpson R.T., Vallee B.L. Kinetic properties of cobalt alkaline phosphatase. //Biochem. 1969. V. 8. № 9. P. 3776-3783.

49. Ma L., Kantrowitz E.R. Kinetic and X-Ray structural studies of a mutant Escherichia coli alkaline phosphatase (His-412 —» Gin) at one of the zinc binding sites. //Biochem. J. 1996. V. 35. P. 2394-2402.

50. Plocke D.J., Levintahal C., Vallee B.L. Alkaline phosphatase of Escherichia coli: A zinc metalloenzyme. // Biochem. 1962. V. 1. № 3. P. 373-378.

51. Simpson R.T., Vallee B.L. Two differentiable classes of metal atoms in alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Biochem. 1968. V. 7. № 12. P. 4343-4350.

52. Holtz K.M., Kantrowitz E.R. The mechanism of the alkaline phosphatase reaction: insights from NMR, crystallography and site-specific mutagenesis. // FEBS Lett. 1999. V. 462. P. 7-11.

53. Gettins P., Coleman J. Zn-113Cd and Zn(II)-Mg(II) hybrids of alkaline phosphatase. 31P- and 113Cd NMR. III. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 4991-5003.

54. Sl.Applebury M.L., Coleman J.E. Escherichia coli Alkaline phosphatase. Metalbinding, protein conformation, and quaternary structure. // J. Biol. Chem. 1969. V.244. №2. P.308-318.

55. Zl.Zukin R.S., Hollis D.P. Role of metal ions in Escherichia coli alkaline phosphatase. A study of the metal-water interaction by nuclear relaxation rate measurements on water protons. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. № 3. P. 835842.

56. Petitclerc C., Lazdunski C, Chappelet D., Moulin A., and Lazdunski M. The functional properties of the Zn2+ and Co2+ - alkaline phosphatases of Escherichia coli. И Eur. J. Biochem. 1970. V. 14. № 2. P. 301-308.

57. M.Simpson R.T., Vallee B.L. Two differentiable classes of metal atoms in alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Biochem. 1968. V. 7. № 12. P. 4343-4350.

58. Zl.Heppel L.A., Harkness D.R., Hilmoe R.J. A study of the substrate specificily and other properties of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 1962. V. 237. № 3. P. 841-846.

59. W.Salomon L.L., James J., Weaver P.R. Assay of phosphatase activity by direct spectrophotometric determination of phenolate ion. II Anal. Chem. 1964. V. 36. №6. P. 1162-1164.

60. S9.AumapuH И.П. Молекулярная биология. JI.: ЛГУ, 1974. 367 с.

61. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.544 с.91 .Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989. 447 с.

62. Kreuzer М.Р., O'Sullivan С.К., Guilbault G.G. Alkaline phosphatase as a label for immunoassay using amperometric detection with a variety of substrates and an optimal buffer system. II Anal. chim. acta. 1999. V. 393. P. 95-102.

63. Thiel Т., Liczkowski L., Bissen S.T. New zwitterionic butanesulfonic acids that extend the alkaline range of four families of good buffers: evaluation for use in biological systems. //J. Biochem. Biophys. Methods. 1998. V. 37. P. 117-129.

64. Guilbault G., Sadar M., Zimmer M. Analytical applications of the phosphataseenzyme system. Determination of bismuth, beryllium and pesticides. // Anal, chim. acta. 1969. V. 44. P. 361-367.

65. Кучеряева B.B. Методы определения соединений эффекторов щелочной и кислой фосфатаз. . дисс. к.х.н. М.: МГУ, 1987. 230 с.

66. Жмаева Е.В. Ферментативное определение кофактора (иона цинка) и ингибиторов алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей. . дисс. к.х.н. М.: МГУ. 2002. 223 с.

67. Hofstee B.H.J. Alkaline phosphatase. I. Mechanism of action of Zn, Mg, glycine, versene and hydrogen ions. // Arch. Biochem. Biophys. 1955. V. 59. P. 352-365.

68. Thowshend A., Vaughan A. Applications of enzyme-catalysed reactions in trace analisis. 4: Determination of berylium and zinc by their inhibition of calcificational alkaline phosphotase // Talanta. 1969. V. 16. №. 7. P. 929-937.

69. Townshend A., Vaughan A. Applications of enzyme-catalysed reactions in trace analysis. V. Determination of zinc and calcium by their activation of the apo-enzyme of calf-intestinal alkaline phosphatase. // Talanta. 1970. V. 17. P. 289298.

70. SanjaiD., Rajiv D. И Mater. Sci. 1995. V. 3. № 2. P. 79.

71. Cho H.-Y, Tanizawa K., Soda K. Role of divalent metal ions on activity and stability of thetmostable dipeptidase from Bacillus stearothermophilus. И Biosci. Biotech. Biochem. 1997. V. 61. № 10. P. 1688-1692.

72. MildvanA. Metalls in Enzyme Catalisis. / In: Boyer P.D. The Enzymes. 1971. New-York—London: Academic Press. 3-d ed., V. 2. P. 448-450.

73. Арене Э.А., Веселова M.H., Чухрай E.C., Полторак О.М. Диссоциативная термоинактивация щелочной фосфатазы в растворе. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 1981. Т. 22. № 6. С. 555-558.

74. Чухрай Е.С., Кучеряева В.В., Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н. Термоинактивация щелочной фосфатазы // Журн. физ. химии. 1989. Т. 63. № 12. С. 3354-3358.

75. Крупянко В.Н. Распределение ингибирующей активности среди катионов двухвалентных металлов. //Биохимия. 1988. Т. 53. № 6. С. 905-911.

76. IUPAC-Stability Constants Database. 1994. Version 2.6.3. Academic Software Royal Society Chemistry - IUPAC.

77. Никольская Е.Б. Применение ферментов для изучения состава некоторых гидроксокомплексов. //Журн. аналит. химии. 1983. Т. 38. № 1. С. 5-11.

78. Csopak Н The specific binding of zinc (II) to alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Eur. J. Biochem. 1969. V. 7. № 2. P. 186-192.

79. Lazdunski C., Lazdunski M. Zn2+ and Co2+-Alkaline phosphatase of E.coli. A comparative kinetic study. // Eur. J. Biochem. 1969. V. 7. № 2. P. 294-300.

80. Lazdunski M„ Petitclerc C., Chappelet D., Lazdunski C. Flip-flop mechanisms in enzymology. A model: the alkaline phosphatase of Escherichia coli. II Eur. J. Biochem. 1971. V. 20. P. 124-139.

81. Trotman C. Greenwood C. Effects of zinc and other metal ions on the stability and activity of Escherichia coli alkaline phosphatase. // Biochem. J. 1971. V. 124.№ i.p.25-30.

82. Jasaitis J.J., Razumas V.J., Kulys J.J. Amperometric determination of zinc with an apoenzyme-treated graphite electrode. //Anal. chim. acta. 1983. V. 152. P. 271-274.

83. Cloetens R. Uber den Aktivierungesmechanismus der alkalischen phosphatase • II durch metallionen. //Biochem. Z. 1941. Bd. 307. S. 352-365.

84. Cloetens R. Reversible abspaltung des zweiten metalles der alkalischen phosphatase II. II Biochem. Z. 1941. Bd. 308. S. 37-39.

85. Sanjai D., Rajiv D. II Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 216.

86. Щеплягина Л.А., Легопькова Т.Н., Моисеева Т.Ю. Клиническое значение дефицита цинка для здоровья детей: новые возможности лечения и профилактики. // Рус. мед. журн. 2002. № 11.

87. Junker М., Rodgers К.К., Coleman J.E. Zinc as a structural and folding element of proteins which interact with DNA. // Inorg. chim. acta. 1998. V. 275276. P. 481-492.

88. AntonucciA., Baldassarre A., Giacomo F. Detection of apoptosis in peripheral blood cells subjects affected by Down syndrome before and after zinc therapy. // Ultrastruct. Pathol. 1997. V. 21. № 5. P. 449- 452.

89. Шейбак М.П., Шейбак JJ.H. Недостаточность цинка у детей. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2000. № 1. С. 48-51.

90. Емельянова Т.П. Витамины и минеральные вещества. СПб.: Весь, 2000. 368 с.

91. Folwaczny С. Zinc and diarrhea in infants. // J. Trace Elem. Med. Biol. 1997. V. 11. №2. P. 116-122.

92. Kirsten G.F., Heese V., Villiers S. Serum zinc and cooper levels in the 1-st year of life. // S. Afr. Med. J. 1985. V. 67. №11. P. 414-418.

93. LansdownABG. Zinc in the healing wound. // Lancet. 1996. V. 347. № 16. P. 706-707.

94. Scholmerich J., Wietholtz H., Buchsel R. Zink und vitamin A magel bei gastroenterologischen erkrankungen. // Leber Magen Darm. 1984. Bd. 14. № 6. S. 288-295.

95. Коршунова H. Вездесущий цинк. // Рус. деловой вестник. 2003. № 9.

96. Карпинский М.В., Вендланд И.О. Профилактика дефицита цинка. // Вопросы охраны матери и детей. 1987. № 10. С. 57-61.

97. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородский И.В. Клиническая биохимия. М.: Триада-Х, 2002.497 с.

98. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. М.: Химия, 1996. 320 с.

99. Школышкова М.А., Чупрова С.Н., Калинин Л.А., Березницкая В.В., Абдулатипова И.В. Метаболизм магния и терапевтическое значение его препаратов. М.: Медпракгика-М, 2002. 28 с.

100. Greensmith L. Magnesium ions reduce motoneuron death following nerve injury or exposure to N-methyl-D-aspartate in the developing rat. // Neuroscience. 1995. V. 68. № 3. P. 807-812.

101. Bruno V. Antidegcnerative effecs of Mg2+-valproate in cultured cerebellar neurons. // Funct. Neurol. 1995. V. 10. № 3. P. 121-130.

102. Коломиец В.В., Боброва Е.В. Физиологические механизмы регуляции метаболизма магния. // Укр. кардюл. журн. 1988. № 4. С. 54-58.

103. Чекман И.С., Горчакова Н.А., Николай C.JT. Магний в медицине. Кишинев. 1992. 101 с.

104. Городецкий В.В., Талибов О.Б. Препараты магния в медицинской практике. М.: Медпрактика, 2003. 44 с.

105. Постникова C.JI. Магний и здоровье человека. // Здоровье. 2000. № 1.

106. Добрынина В.И. Биологическая химия. М.: Медицина, 1976. 504 с.

107. Биохимические методы исследования в клинике. / Под ред. А.А. Покровского М.: Медицина, 1969. 652 с.

108. Немелова Ю.М. Методы лабораторных клинических исследований. М.: Медицина, 1972.424 с.141 .Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь, 1976. С. 200.

109. Mann С.К., Joe J.H. И Anal. Chem. V. 28.

110. Bohuon С. II Clin. Chem. Acta. 1964. V. 7. P. 811-817.

111. Veselova LA., Shekhovtsova T.N. Visual determination of lead (II) by inhibition of alkaline phosphatase immobilized on polyurethane foam. // Anal, chim. acta. 2000. V. 413. P. 95-101.

112. Живописцев В.П., Селезнева E.A. Аналитическая химия цинка. М.: Наука, 1975. 200 с.

113. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1990. 234 с.

114. БейлиДж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989. В 2-х ч.

115. Dolmanova I.F., Shekhovtsova T.N., Kutcheryaeva V.V. Assay of enzyme effectors. //Talanta. 1987. V. 34. № 1. P. 201-205.

116. Miki Y„ Toshima N., Tanaka K. Alkaline phosphatase reaction activators containing cesium salts and solutions for determination of the enzyme. // Jpn. Kohai Tokkyo Koho. 1998. Patent CA Section: 7 (Enzymes). JP 96-203357 11. Aug 1996.

117. Happold F.C., Beeckey R.B. Univalent metals and other loose or non-specific activations. / The 15-th Biochem. society symposium at the university of leeds. 1958. P. 52-63.

118. Armas G., Cladera A., Becerra E., Estela J.M., Cerda V. Fluorimetric sequential injection determination of magnesium using 8-hydroxiquiniline-5-sulfonic acid in a micellar medium. // Talanta. 2000. V. 52. P. 77-82.

119. Шеховцова Т.Н., Чернецкая C.B., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Использование иммобилизованных ферментов для определения ионов металлов. // Жури, аналит. химии. 1994. Т. 49. № 8. С. 789-795.

120. Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Попов К.И. Комплексоны и комплексонаты металлов. М.: Химия, 1998. 544 с.

121. Виноградов A.B., Елинсон C.B. Оксихинолин. М.: Наука, 1979. 328 с.

122. Тихонов В.Н. Аналитическая химия магния. М.: Наука, 1973. 252 с.

123. Хванг С.Т., Каммермайер К. Мембранные процессы разделения. М.: Химия, 1981.464 с.

124. Яцимирский К.Б. Введение в неорганическую биохимию. Киев: Наукова думка, 1976. С. 96-103.

125. Васильев В.П., Шорохова В.И., Катровцева A.B., Гудина Л.Г. Устойчивость соединений Zn (II) с нитрилотриметиленфосфоновой кислотой. //Журн. неорг. химии. 1988. Т. 33. № 12. С. 3076-3079.

126. Морозова С.С., Никитина Л.В., Дятлова Н.М., Серебрякова Т.В. Изучение комплексообразования НТФ с некоторыми переходными металлами. //Журн. неорг. химии. 1975. Т. 20. № 2. С. 413-418.

127. Ригин В.И. Хемилюминесцентный метод определения микроколичеств цинка с применением иммобилизованного фермента. // Журн. фналит. химии. 1979. Т. 34. № 4. С. 680-687.

128. Применение магния и оротовой кислоты в кардиологии. Метод, реком. / Под ред. А.П. Юренева. М.: Типогр. № 9, 1997. 22 с.

129. Шилов A.M., Рабинович Ж.Г., Мельник М.В., Святое И.С., Максимова Л.А., Соколинская И.Ю. Дефицит магния и артериальная гипертония. // Рос. мед. вести. 2000. № 2. С. 62-65.

130. Степура O.E., Мельник О.О., Шехтера А.Б., Пак Л.С., Мартынов А.И.

131. Результаты применения магниевой соли оротовой кислоты «Магнерот» при лечении больных с идиопатическим пролапсом митрального клапана. // Рос. мед. вести. 1999. № 2. С. 64-69.

132. Шилов A.M., Мельник М.В., Кравченко В.В., Святов И.С., Космодемьянский Л.В., Максимова JJ.A. Синдром удлинения интервала Q-Т у больных острым инфарктом миокарда: диагностика и лечение. // Рос. мед. вести. 2000. № 1. С. 45-48.

133. Шилов A.M., Мельник М.В., Санодзе И.Д., Святов И.С., Максимова JJ.A. Врожденный синдром удлинения интервала Q-T. // Рос. мед. вести. 2000. №3. С. 60-63.

134. Black М.М. Zinc deficiency and child development. // Am. J. Clin. Nutr. 1998. V. 68. №2. P. 464-469.

135. Лаврова A.E., Волков A.M. Дефицит цинка у детей с пищевой аллергией и его коррекция препаратом цинктерал. // Нижегород. мед. журн. 1998. № 2. С. 25-29.

136. Quamme G.A., Rabkin S.fV. Cytosolic free magnesium in cardiac myocytes: identification of a Mg2+ influx pathway. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. P. 167.

137. Фримантл M. Химия в действии. M.: Мир, 1991. Ч. 2. С. 119.

138. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. / Под ред. Ю.А. Ершова. М.: Высш. шк., 2000. 560 с.

139. Каупе L.H., Lee D.B. Intestinal magnesium absorption. // Min. Electr. Metab. 1993. P. 210.