Равновесные комплексы щелочной фосфотазы в гомогенных и гетерогенных каталитических системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

"•Ж -Л' я ?

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДиЩ ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени К.В.ЛОКОНОСОВА

Химический Факультет

На правах рукописи УДК 577.150.3

Ж5ВИ РШ

РАВНОВЕСНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЩЕЛОЧНОЙ ЗОСОАТАЗЫ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата.химических наук

Москва - 1992

Л//

Работа выполнена в лаборатории кинотики и катализа кафедры _ физической химии химического Факультета Московского госдар -ственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководители: доктор химических наук, профессор О.М.Полторак '

доктор химических наук, профессор Е.С.Чухрай

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

А.В.Левашов

кандидат химических ы.ук, старший

научный сотрудник

Ю.А.Жирхов

Ведущая организация: НПО Биотехнология г.Москва.

Защита состоится "_" 1992года

в 16 часов на заседании специализированного совета К 053.05.58 по химическим наукам при Химическом Факультете МГУ по адресу: 119699, ГСП.Москва, "Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, аудитория СХА.

С диссертацией пожно ознакомиться Факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" 1992 года

, Ученый секретарь совета, кандидат хшичаских наук

библиотеке Химического

И.А.Абраыенкова

———^ f

:■ ОЩЛЯ ШШЖ&ТШ РАБОТЫ

. п Актуальность работы связана с поиском путей стабнлн-¿>ЗафйП?ерглентоз. Нестабильность бхокатаяззатороз является главным фактором, сдернязасщим их промышленное прпмоненпе. Решение этой проблемы нсзоз:,:о~ю без пог.пмслпя молекулярных механизмов потери каталитической активности.

В настоящее время известно, что для ферментов, обладающих четвертичной структурой инактивация в результате температурных и других воздейстьлй протопает по разнообразным механизмам, в которых существенную роль игрс.:эт процессы асссдпации белковых глобул. Поэто:лу изучение ;лс:сс-низмов инактивации, а также выяснение рол:: кгг.бс,г'ой:;х взаимодействий для конкретных ферментных систем представляет собой ваглуи задачу современной биофизической

Разлачв"9 препарат щелочной фосфатазы, получопкые из разных источников, сироко исподьауится как в лаборатории исследованиях, так и для целей гммунобпотехпологин, а потому установление механизма её инактивации п возможности влиять на стабильность как растворимых, так и иммобилизованных образцов по-прежнему остается актуально:; задачей. Нестабильность гетерогенной щелочкой фосфатазы, иммобилизованной на различных твердых носителях танг.о ставит задачу поиска ксвых носителей и приготовлепия на их осново гетерогенных биопатализатс^ов на основе щелочной фосфата-зы.

Цель работа - поиск новых твердых носителей для получения гетерогенного биокатализатора, по всем параметрам нэ обличавшегося от растворенной щелочной фосфатазы, а тагсЕо ¡^учение механизма термоинактивацил дпмерной формы щелочной фосфатазы в" различных условиях рН, температуры, концентраций бяяка, присутствии детергентов-таких как мочевина, с иель;о оптимизации условий очистки, приготовления а храазн^л как растворов щелочной фосфатазы, так и ее имо^ялигеванкых форм.

Научная новизна. Получен новый гетерогенный биоката-

газатор па основе щслочпо": босфатазы, адсорбированной на твердом носителе ЛКК-21 (£1 О^ЗН). содоряацегл на поверхности носителя Ш-груплк, облала^е^ все:.:;: каталитически"! и кинетическими свойствами, характерными для Вермонта с растворе. В отличие от ранее полученных нлмобнлп-зсякшпшс образцов цепочно:: фссфатази на сплпкагелз и с::-лнкагело, мо;г:фпцпрова:шом лппндс:.:::, он усто1л:из при хранении к его удельная активность по зависит от степени заполнения поверхности носителя.

Предложен механизм термодеградации активного дилера щелочной фосфатазы по последовательному механизму, зклэ-чакцему стадии плавления "кокформацпонного замка" (от 2 до 4 стадий без сотерн активности) с возникновением легко диссоцкфувдего лабильного дилера.

¿изусгадпйгьй нос ледовательный- механизм .диссоциативной термоинактнзац'.л лабильного дилера обнаружен при рН 7,2 при 60°С и рН 9,0 при 55°-6о°С.

. Пт^к^нчпскпя значимость. Предложен метод получения гетерогенного биокатализатора на основе адсорбированной . целочной фосфатазы с заданными каталитическая и физико--химическики свойствами.

Предложен механизм тергл сил активации щелочной фосфата-зи, представляющей собой кедиссоциирувдпй дглер, который представляет интерес для фундаментальной науки и физико-химических свойствах олигомерных белков, структуры которых стабилизированы комплементарными мексубъединичными контактами - "кокформационными замками". Разработан метод кинетического обнаружения подобных структур;:ых .образований в кедиссоцпирувдих олигомерных белках. .

Публикации. По теме диссертации подготовлено *ри статьи, одна из которых вышла из печати и две других приняты к опубликованию.

Структур и об'ьем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, трех глав "Результатов и обсуждения", выводов и списка

г

цитируемой литература. Работа изложена наЦ5 страницах капиноипспого текста, Бнлэча:::~:х 24 рисунков, 16 таблиц з списка цитируемой литературы из 77 наименований.

с о и з ? н л н :: з работы

Материалу и методы.

Щелочная фосфатаза (КЗ 3.1.3.1) ::з inseriría цыдллт производства венгерской фирмы 3 качестве суб-

страта использовал:: п-нйтрофонп.*йосфат натрия и В -глицерофосфат, в качестве активатора - раствор tfef^ в 0.Q5M трис-HCI буфере заданного значения рН. Измерение агтквпо-отя проводили при рН 8,5. Измерение оптической плотности продукта ф^ейатазной реакции-п-нирофеяола регистрировали • фотометрически при длине волны 400 ш. Определение концентрации второго субстрата - неорганического фосфата определяли по реакции образовании молибдепозой сини, концентрацию которой такяе регистрировали фотометрически при длине волны 730 ил.

В качестве носителя для приготовления жмобплизозан-ной щелочной фосфатазы использовали патентованный носитель ЛИК-21 (Sí OgR- S II), содеркаций на поверхности сульф-гидрильные группы с удельной поверхностью 100 м^/г при диаметра пор 300 X. Количество адсорбированного белка определяли по убыла ферментатизной активности в 'контактном раотворэ.

Тврмоинактивацал осуществлял:! з термостатхруекых сосудах в интервале температур 50-60°С при различных рН (7,2; 7,5; 8,5 и 9,0), -отракащих различные положения па" кривой рН-зависЕмости активности фермента, 'и в ка-угом

случае при различных начальных концентрациях..беп<а.

*

Р.ЕЗУЛЬТ.АТЫ И' О Б С У Е 5 S й И Е

I. Сравнительные свойства растворенной цепочной фос-фатазы и иммобилизованной на модифицированном си-лхкагэлэ, содержащем SH-группы.

В ранних работах показано, что щелочная фосфатаза неустойчива на поверхности сплпкагеля к дссорблруетп в раствор при щелочных значениях рН, отвечающих каталитической активности щелочной фосфатази. На поверхности сили-кагсля,кодифицированного лишщамн она прочно удержвается, но гидрофобный носитель вкпо.лшет роль детергента, разрушающего активную днмерную структуру щелочной фоейатазы и фермент на таких носителях инактпвируется достаточно быстро при любпх значениях рН. Бибранний нами носитель ЛИХ-21 хорошо адсорбировал щелочную фосфатпзу из растворов при рН 8,5. * '

Цолочная фосфатаза в растворах представляет собой прочпкй кед-лееоцк:грутхтлй размером 5,5x7,5 нм, имею-

щий большой гидрофобный участок на одно;., из концов дилера, коториы 0:1 связывает с природными мембранами в кативных условиях, а после разрушения мембран он переходит в раствор п мо"ст образовать ассоцпата типа гетрамеров по этим гидрофобным контакта:,:. Зол:: недиссоциарувдпй дамер обозначить через 13, а ого ассоцпат Е2> то механизм ассоциации можно представить в вэде реакции димеризации

£ + Е ^^ Е2 (2)

При анализе зависимости удельной активности щелочной фос-фатазы от начальной концентрации белка установлено, что этой зависимости отвечает ниспадающая кривая, показывающая, что возникающие ассоциагы неактивны. Этот факт отвечает последам данным в литература о щелочной фосфатазе, что возникающие ассоциаты являются неактивными,тетрамера-ма. С помощью уравнения, связывающего в линейной форме удельную активность и активность фермента модно вычислить каталитическую константу кедпесоцштруских дамеров (Е) и константу равновесия ассоциации (2;

Е3>_,1_ . ^-сс у

V *£ат

(3)

Здесь [з]0/^г обратная удельная актизпость, а V -активность фермента. К™ и к° „ - параметра уравнения (3), которые для фермента в растворе оказались равными • З.б-ГО^.Г1 л 2,7.IoV*1 при pH 8,5, а для фермента иммобилизованного, как показано в табл.1,кот зависимости аффективной каталитической константы скорости гидролиза субстрата от степени заполнения (Г)

Таблица 1.

Зависимость эффективной каталитической константы от количества иммобилизованной щелочной фосфатазы на единицу поверхности носителя.

Г,мкг/2Смкг Сразу после адсорбции Через 4 суток после Г'-Зот^п.-т;

. ICT^c-1 i\U А

0,075 3,2 2,9

0,125 2,8 2,9

0,130 3,1 1.9

0,175 2,9 2.S

0,225 2,9 2,3

Цанные табл. I показывают, даноситель пзбирате-льно адсорбирузт только активные дпмерние структуры щелочной фосфатазы, а не«ал_вные олпгомеры либо не адсорбируются, либо разрушаются в процессе адсорбции. Механизм адсорбции на носителе, содержащем5Ь-группы,пока остается неизвестным, однако инактивации фермента при хранении зо вла.яом состоянии не происходит. Константа л&хазлпеа для иммобилизованной щелочной фосфатазы оказалась разной 4.10"^ М, что практически созпадает со значением К, , полученным для того не фермента в растворе --3,3.10 -Таким образом, носитель ЛИК-21 оказался хорошим носителем для иммобилизации щелочной фосфатазы. Он улучпа-ет свойства фермента, разрушая неактивные ассоцпаты, поэтому но наблюдается падение удельной активности с позы-

ыоином г.овортлоотг.оИ концентрации белка, йер..:ент стабилен тг-и хранении и обладает всеми свойствами ::оро^ го б:: оката г.:сатора

2. ^гмоиыактпЕсп;:::: щелочной фосфатазы под мочезпни.

Т'о'^евипу ¡инрохо используют в белковой хи.\г'п для денатурации бейка. При ото:.: "огщентрацяк мочевины составляют 6-с-. Низкие концентрации мочевины используют обычно длл разгулен;:.? т-:ст2орг:г:::ой структуры белка на состазлх-кщпо суцы. Поскольку димеры щелочной фосфатазы не-дпсссц:;'.русми, то в настоящей работе была предпринята по-пытла псдолоссвать :-:::з:с::е концентрации мочевины (0-2.0 для нзучеппл кинетики :; механизма превращения недпссоцлируемо-го дп.;;рй в диссоциируемый.

Прездо псого было установлено, что мочевина по-разному влияет на иа-' " чалыгую скорость

■ реа:<цпи гидролиза -¿г / п-нитрофенилфосфа-

< та щелочной фосфа-

тазой в растворах разных значений з пН. -¡ли показано

на рис. 1л'олысо при рН 8 5 не оказывает влияние на этот параметр: _ при более низких

.с^чаьаиа].« значениях рН мочо-вина ингибирует реакцию по неконкурентному механизму, (К=0,5<! при рН 7,2); при более зысо-

Рис

::2.:ость относительной зности щелочной фосфа-

ко:::

г..0чэ-

:'-""Н" ?.зГГ-'тй БД:

.... — и 4 — рН ь,9.

icix, чо:.: 8,5,значениях рК наблюдается активация гслотаой <5ос£атазы (по-з::дпмсму л результата разрушения иоакт.:в;:;л ассоциатор).

На рис.2 приведена кинетика тсрмоиксктипацин вилочной фэсйатазы в присутствии I!.'. ?.:отхев:::::: пр.: рази:.\с начальных концентрация 0",:.:с:;та. кпнотпчсеко~ кривой по зависит от начально;"' концентрации белка. Кинетика термоилакти-вации щелочкой £ос-фатазы в присутствии ЕЛ мочевины имеет индукционный период

= 50 млн,), в течение которого активность фермента не изменяется, по затеи падает. Константа скорости инактивации первого порядка равна I,4.I0~5o~'l для начальной концентрации белка 0,83 л 2,5. 10""® от/мл. Наличие индукционного периода на кинетической кривой хемоинактивзцпи

Рис.2. Кинетика тетглонпактт^г.-цпи целочпе:': фсс: .атагл: при 45°С з T'îno-rIGI бу-йо^е т>Н 8,5 в присутствии И'. мочезппы! Хок-цепттзация бот-моита с.» зз С х. ) -и 2.5ЛС— мг/.-.-.л (о).

(рис.2) позволяет говорить о скрытых стадиях терме:: тлвацил белка без потери каталитической активности схеме (4) ■

г:о

й2

стаблл.

т. хх

п(х) п<х)

лабильный

(4)'

В результате математического модеггрозания, допуска-х;эгэ различные соотношения констант,и обратимость стадий з соотношении (4) в литературе была предложена эмпприче-

екая формула расчета числа стадий (5) и показано, что индукционный пориод максимален при необратимости ста нй (4) и приблизительном равенстве констант. Это эмпирическое соотношение представлено ниг.е (5)

.. = 0.13 + о (5)

0,13 - 0,05§"

Здесь г-- число стадий, а £ - безразмерная величина относительной индукции, равная сГ = И- Г, где ордината, отсекаемая касательной к точке перегиба кинетической кривой, построенной в координатах относительная актпв-ность—время, как показано на рис.2. В таблице 2 приведены данные анализа кинетических кризис термоннактизацли щелочной фосфатазы в присутствии различных ко::центраций

Таблица 2.

Параметры кинетики термоинакт;1вацпп целочной фосфатазы в 0,С5М трис-КС1 буфере рК 3,5 при 45°С з присутствии различных концентраций мочевины.

Концентрация мочевины, I.'. ¡Индукционный период,'?'(мин) ТХг IV Ю5^1

0 цепочная фосфатаза стабильна

0,6 50 2 1,4

".0 50 2 2.0

2,0 43 2 4,9

3,0 0 - 5.8

4.0 0 - 6.5

Данные табл.2 показывает, что индукционный период

на кинетических кривых термоинактивации цепочной фосфатазы под влиянием мочевины сохраняе^вилз^'Ь до концентрации мочевины IV., а с дальнейшим повышением концентрация мочевины превращение стабильного недиссоциирущего динара щелочной фосфатазы протекает с большей скоростьв, чем денатурация возникайте: субьединиц. Независимость эффективной константы скорости денатурации от начальной концентра-

ции белка говорит об отсутствии обратимости стадии диссоциации лаелльг.ого дгглара на неактивные мономеры. Калг:чие этих данных и литературные данные с неактпвности мономеров щелочкой фосфатазы позволяют предложить следующий механизм хсмонкактизацни щелочной фосфатазы под дсйстзи-ем мочепикы (S)

Актиг-кы IlfiaKTKBH.

2/ Jil^ Eg ** а,**2 ^ 22д (6) Стаб. "абилън.

Зтот механизм включает три стадии, содержит 2 промежуточных активных формы белка 2 Первые две стадии связаны с плавлением "конформацлопного замка" - мо-субь-еддничной структуры, стабилизирующей педисссциируемутэ форму стабильного димера.

3.3. диссоциативная тсрмоинактивация щелочной фосфатазы.

В ряде ранних работ, проводимых з нагой группе,было показало; что при рН 9,6 щелочная фосфатаза претерпевает • термо?нактиьацка при 55°С по последовательному диссоциативному механизму. Кинетические кризые, предо таз лонные з по"7ЛОгар:.фмпческих координата,имеют точку излома, положение которой зависит от начальной концентрации белка. При рН 63°С при различных значениях рН от 5 до 9,6 кинетика терь:опкакт:зацил подчиняется уравнение перзого порядка а вычисляемая эффективная константа скорости инактивации зависит от рН, причем оптимум рН-стабпльности ( 7,5) активности (pil 8,5) не совпадают. Наличие мики-иукг рН-зависимости стабильности предполагает существование по крайней мере трех ионизированных форм стабильного активного димера (обозначим его престо 2) +Ы* -Г

(7)

El*

Задачей настоящего исследования было установить зли-янпе высоких значений рН на дпссоцнатиз:;ый механизм тер-моинахтивацил лабильного димера согласно схеме

ЙЕз-ХгЕд (8)

Активп. ~ Неактивные Мерой активного белка служила начальная скорость реакции, измеренная при насыщающих концентрациях субстрата (ц-нитрофенилфосфата) - 2.10""%. Кинетические кривые строили в координатах относительная активность СЙц,т ( Се30=^&' от времени. Концентрации активной формы фермента определяли по калибровочной кривой зависимости активности от степени разведения белка. В табл.3 приведены начальные концентрации бежа для различных опытов при различных рЕ и температурах.

Таблица 3.

Значения [Е] в юг/мл в опытах по термоинактивацин при различных температурах и различных значениях рН

рН 50°С ' 52°С 55°С 53°С 60°С

7,2 3,10 4,00 3,50 3,80 4,16

7,5 4,00 4,50 3,00 3,40 3,50

8,5 3,16 3,08 2,75 3,08 2,50

9,0 1,29 0,91 1,45 2.00 1,66

Все концентрации белка, приведенные в табл. 3,для каждо-

го случая рН и температуры брага в разведениях 1:0,66: 0,33, чтобы получить карту данных кинетики термоинактивацин щелочной фосфатазы в зависимости от рН, температуры п концентрации белка. Итого было проанализировано 60 случаев, отличающихся указанными параметрами. Как показано в табл.3,были выбраны достаточно низкие концентрации белка, значительно меньше констант равнозесия ассоциации дилеров в гетрамеры.

На рис.3 приведены кинетические кривые термоинактивации щелочной фосфатазы при различных температурах при концентрациях, соответствующих данным та1и.З в разведении х1. Как показано на ркс.З фермент стабилен при 50° п 52°-' в течение пяти часов. Аналогичные данные получены и при разведении белка х0,66 и 0,33. При 55° и 58°С кинети-

чоо"по кр"оыа имеют' ¿олькой индукционный период. С помощью С, опрсделэп-;;ой графически ,и соотношения (4) вычислено тс:сло стадий, соответствующих плазленип кон-формационяого замка и образованно лабильного диссоциирующего дилера. При 55°С п =2,4; 1,84 п 1,84 при использования разведений белка 1:0,66 и 0,33, соответственно, а при 58°С эта ко величина

Рис.3. Кинетика терлопналтивоции щелочной фоссЬатазы при

60е

в такой из последовательности равна 2,1; 1,5; 1,7. Это позволяет сделать ви-. вод, что минимальное • число стадий равно 2, как и при хемоипак-тивации мочевиной (6) и вычисляемая величина не зависит от начальной концентрации белка и температуры.

При 60°С как показано на рис.4 индухциэшшй период исчезает, а кинетические кривые, представленные з поду-

Рио.4. Кинетические кривые термо-инактнвации мелочной фос-

Шазы птзи рН 7,2. 0- 1,37 II), 2,75(2) я

4.16 (3)

ккг ил

С

логарифмических координатах имепт точку эдиггз, положение которой, как показано на рис.4.зависит ©т йзззяьной концентрации белка. Это соответствует схеме

ранние рис. 4 и табл.4 говорят о бкс-трс:; зозпикнозе-н::и лабильного дилера л установлении кзазиразнозеспого состояния, отвечащего схсгле (8)

Таблица 4.

Кинетические параметры дзустадпйюй диссоциативной тер:.:оинакт:зац:и1 мелочно:: фосфатазы (8) по данным рис.4

^0 мл к 3(Й 104 д ,сЛ Кд.Ю-с"-1

4,16 0,79 1,3 0,43 3,7

2,75 0,70 1,3 0,71 4,0

1,57 0,48 1,3 0,98 2,9

Здесь ГВ}0 - начальная концентрация б с л:: а, ^ - ордината точки излома, к^- константа скорости диссоциации лабильного димера, тангенс угла наклона кинетической кривой при ъ г чГ , Кд - истинная константа скорости денатурации.

Аналогичные исслэдозанпя при рй 7,5 показал::, что кнду:д";:о::ный период сохраняется вплоть до 60°С и в табл.5 преде таз ле.ш соответстьугчие данные.

Таблица 5

Элективное ч::сло ехгоытих стадий в индукциохгном периоде ка'кризых термоинактйзацпц целочной фосфатазы при рН 7,5

Разведение 50°С 52°С 55°С 53°С 60°С

XI,ООО стаб. стаб. 3,70 2,47 1,84

хО.66 стаб. стаб. 3,70 2,50 1,58

х0,33 стаб. стаб. 2,30 1,84 1,50

Данные табл.5 по:-\^шают, что'при рН 7,5, как и при-рП 7,2 фермент стабилен при 50 и 52°С, пр1 более высоких ге:.гпературах набгздается инактивация белка после достаточно продолжительного индукционного периода, величина которого не зависит от начальной концентрации белка, но уменьшается с повывением температуры. Эти данные гово-

рят о том, что при плавления конформацяонного замка в стабильном димерв щелочной фосфатазы на пути к возникновении лабгльпого днмера, способного к диссоциация возможно существование двух и более активных промежуточных форм днмера.

Данные показывают, что при рН 8,5 индукционный период появляется уке при 50° эффективное число стадий, протекающих без потери активности на пути превращения стабильного дкмера в лабильный, легко диссоциирующий, равно 2,52; 2,42; 2,52 при разведениях белка 1:0,66:0,33 при 50°С в 2,52; 2,42: и 1,84 при 52° соответственно. Эффективное число стадий не зависят ни от температуры, ни от концентрации белка. Индукционный период исчезает уже при 55°С и кинетические кривые' спрямляется в координатах уравнения первого порядка, вычисляемап такал образе:.: константа скорости инактивации первого порядка не зависит от начальной концентрации белка и равна 2,1(55°С); 5,7(58°С) и 9,5.Ю~4с"^(60°). Вычисленная по этил данным эффективная энергия активации оказалась равной 59 ккал/моль, что характеризует процесс денатурации белка.

Аналогичная картина наблюдается и при ря 9,0, когда индукционные периода появляются на кинетические кривых

тормоипактивацчи белка уго при 50°,, а -эффективное число стадий равно 2,55; 2,56 и 2,30 раззедений бежа I: 0,66:0,33, а для 52°С 1,93; 1,34 к 1,71, соответственно, т.е. в этих условиях превращение стабильного димэра з лабильный протекает минимум через 2-3 стадии без потери каталитической актизности. Такие,как показано на рис.5, при рН 9 индукционный период исчезает при 55°С, но в отличие от дредьтд;,сого случая здесь спова, как и при рН 7,2 (60°С),удается обнаружить последовательный диссоциативный механизм тормопиактпвецип активного лабильного димера, обратимо диссоциирующего на неактивные мономоры согласно схеме (8).

Таблица 6.

Кинетические патзаметта двустадийиой диссоциативной тер-моинактизацпи щелочной фосфатазы (8) при рН 9 и 53°С

ч £:г.104,с-1 кд3®Л04о-1 кд.Ю4с-1

2,00 0,54 8,8 2,2 7,2

х,32 0,44 8,8 3,3 8,5

0,63 - 8,8 8,8 8,8

То ПС при 60°С

1,65 0,46 9,3 3,5 9,5-

1,10 0,30 9,3 5,5 10,2

0,55 - 9,3 9,3 9,3

Таким образом, при рН 9 соотношения констант скоростей отдельных стадий позволяет наблюдать на кинетических крнвш: различные стадии и вычислять отдельные элементарные константы.

Таким образом наиболее стабильным фермент оказывается в растворах рН 7,5.

На основании всего изложенного можно сделать вывод, что днмерная форма щелочной фосфатазы устойчива к диссоциации в водннх растворах и закреплена структурой "кон-форматонного замка", возникающего между субъединицами.

"Кокформацпонный замок" ус?о:гт.:з в растворах при рН 7,5 в 0,05.1 _р::с-НС1 буфере в присутствии 0,03М хлористого магния. Повышение температуры и сдвиг рН з область щелочных или кислых значений облегчает этот процесс, з результате которого возникает лабильный димер, легко диссоцииру-ецпй на составляющие субъеднницы, которые менее устойчивы, чем ди!.;еры :: легко денатурируют. Схематически это показано на рис. 6-

конформационный замок

ДК.ЕР СТАЕЗЛЬНЬЙ! ■ АКТИВНЫ/;

НЕАКТИВНЫ* 1 КОНСХ.'ЕР.

Г?,7 тор {ЛЕ'^НЫ:-!

2,

г

зенатл^ОВЛШШ

Рис. 6. Схема механизма дествукцпн активного стабильного димера щелочной фосфатазы.

Раскрытие конформационного замка протекает без потерн активности фермента через несколько стадий, число которых определяется условиями эксперимента (от четырех до двух). При этом структура "конформационного замка" плавится и возникает лабильный димер, легко диссоциирующий в растворах.

КШОГЛ.

1. Подучен новый гетерогенный биокатализатор .;а основе щелочной фосфатазы, иммобилизованной на твердом носителе ИК-21 (51 О^К- Ь К). При этом не изменяется ого удельная активность и константа "пхаэдпеа. Бнокаталкзатор устойчив при хранении и его удельная активность не зависи'.-от степени заполнения.

2. Показано, что при рН 3,5 мочевина (ПО не влияет

га активность щелочной фосфатазы, но при 45°С происходит медленная инактивация ферлента. Кинетические кривые имет индукционный период, обусловленный протеканием последовательных стадий разрушения структуры "конформационыого замка" (минимум в две стадам) с последуюцей необратимой инактивацией лабильного дилера.

3. Проведено детальное изучение механизма терлокнгк-тпвацни димерной формы щелочной фосфатазы при' рН 7,2; 7,5; 8,5 и 9. В какдом случае исследовался температурный интервал от 52 до 60°С для трех различных концентраций'фермента (1:0,65:0,33). Получены и проанализированы кинетические кривые до степени инактивации белка 0,1-0,2.

4. Показано, что существует по крайней мере три ди-мерные формы фермента в растворе, отличающиеся степенью ионизации, из которых одна стабильная Е и две лабильные ЕГ1" и 1Г. Наиболее стабилен фермент при рН 7,5.

5. Предложен механизм термодеградации активного ди-кера щелочной фосфатазы по последовательному механизму. Ел:оча;:ще;.у стадию плавления "конформационного замка" (от 2 до 4 стадий без потери актизности промежуточных форм)

с возникновением лабильного дилера. Евустадийкый последс-вательный дпссоциатпаш.й механизм денатурации- доильного днмера обнаружен при рН 7,2 (60°С) и рН 9,0 при 55~6£°С.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

I. Хамви Р., Чухрай Е.С., Веселова Ы.Н., Роцина Т.Н., Полторак О.М. Каталитические свойства щелочкой фосфатазы, иммобилизованной на модифицированном силикагеле, содержащем SП-группы // Вести.Моск.ун-та. Сер. 2. 1имия-1992 -Т. 33 - с.250-253.