Равновесные комплексы щелочной фосфатизы в гомогенных и гетерогенных каталитических системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДкМ ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗН/И.ККИ ГОСУДРСТВЙККЬЙ УНИВЕРСИТЕТ УМСни М.В.ЛОМОНОСОВА

ХАМВИ РАМИ -

. РАВНОВЕСНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСОАТАЗЫ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Химический факультет

На правах рукописи

УДК 577.150.3

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории кинетики и катализа кафедры _ физической химии химического факультета Московского государ -ственного университета им. М.В.Ломоносова

Научнш руководители: доктор химических наук, профессор О.М.Полторак

доктор химических наук, профессор Е.С.Чухрай

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

А.В.Левашов

кандидат химических н^ук, старший

научный сотрудник

кЗ.А.Жирков

Ведущая организация: НПО Биотехнология г.Москва.

Защита состоится в 16 часов на заседании специализированного совета К 053.05.58 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119699, ГСП,Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, аудитория СХА.

С диссертацией можно ознакомиться » библиотеке Химического Факультета МГУ. •

Автореферат разослан " " 1992 года • -•

Ученкй секретарь совета, кандидат химических наук И;А.Абраменкова

СШЯ ХЛРАКТЕЕГСетСА РАБОТЫ

Актуальность работы связана с поиском тг/то'Л стабилизации ферментоз. Нестабильность бпокаталпзатороз является главным фактором, сдеретза^^.*. их промышленное црдмопек^о. Решение этой проблемы незоэмогло без понпмг .:::я молекулярных механизмов потери каталитической активности.

В настоящее время известно, что Л" ферментов, обладающих четвертичной структурой 1п:акт:зация в результате температурных и других, воздейстый протекает по разнообразным механизмам, в котор:зс сушественнуа роль играет процессы асссанации белковых глобул. Ноэтог.гу изучение : -егг--низмов инактивации, а также выяснение роля ке^елковтх взаимодействий для конкретных ферментных систем представляет собой ваглуи задачу современной биофизической химч::.

Различн"в препараты щелочной фосфатазы, полученные из разных источников, широко используются как в лабораторных исследованиях, так и для целей иммунобиотехнологди, а потому установление механизма её инактивации к возмоглостз влиять на стабильность как растворимых, так и иммобнлизо-ванных образцов по-прежнему остается актуально:; задачей. Нестабильность гетерогенной щелочной фосфатазы, иммобилизованной на различных твердых носителях такг.е ставит задачу поиска ксвых носителей и приготовления на их основе гетерогенных биокатализатс^ов на основе щелочной фосфата-зы.

Дель работа - поиск ноеых твердых носителей для получения гетерогенного биокатализатора, по всем параметрам нэ обличающегося от растворенной щелочной фосфатазы, а тахке изучение механизма термоинактизация димерной формы щелочной Фосфат-азы в" различных условиях рН, температуры, концентраций белка, присутствии детергентов-таких как мо-ч"евина,с целью оптимизации условий очистки, приготовления з rpi.iOb.ui кг:: растворов щелочной фосфатазы, так и её змо'плпгеванных форм.

Нау.чная новизна. Получен новый гетерогенный биоката-

газатор на основе щелочной фосфатазь-', адсорбированное на твердом носителе ЛЙК-21 (51. О^З^Ю, содергацем ня поверхности носителя ¿Л-груплн, обладающей всеми каталити-ческ:и.:-: к кинетическими свойствами, характерная для фермента в растворе. В отличие от ранее получению: иммобилизованных образцов п.елочной фесфатазы на склнкагеле к сп-лккагеле, модифицированном лпппдама, ок устойчив арл хра-' ненпи и его удельная активность но зависят от степени заполнения поверхности носителя.

Предложен механизм термодоградации активного д;:мера целочной фесфатазп но последовательному механизму, включающему стадии плавлена "конформационного замка" (от 2 до 4 стадий без потери активности) с возникновением легко дпссоцшфувдего лабильного дпмера.

Дзустадийный последовательный механизм .лссоцпатив«-ной сермолнактивац:^ лабильного димера обнаружен при рН 7,2 при 60°С и рН 9,0 при 55°-6о°С.

Практическая значимость. Предложен метод получения гетерогенного йнокатализатора на основе адсорбированной . щелочной фосфатази с заданными каталитическими и физико-химическими свойствами.

Предлохен механизм термоинактивации щелочной фосфата-зи, предстазлящей собой недиссоциирушций дг дар, который представляет интерес для фундаментальной науки и физико-химических свойствах олигомерных белков, структуш кото-р:гх стабилизированы комплементарными меБсубъеданичными контактами - "конформационнымз замками" ♦ Разработан метод кинетического обнаружения подобных структур;шх .образованна в недтссоциирувдих олигомерных белках. .

Дублокации. По теме диссертации подготовлено фа статьи, одна из которых вышла аз печата и две других принята к опубликованию. . •

Стпуктуг-а и обам; работа. Диссертация состоит из введеная, литературного обзора, экспериментальной части, трех глав "Результатов и обсуждения", выводов 2 стека

цитируемой литературы. Работа изложена на П5 страницах касикопислого текста, вхлпча::::::::-: 24 рисунков, 16 таблиц и описка цитируемой литературы из 77 наименован:::';.

содержание РАБОТЫ

"атериали и метод::.

Щелочная фосфатаза (КЗ 3.1.3.1) из гн^ечппна цнлл.:т производства венгерской фкрг.'.и 3 качестве суб-

страта использовал:: п-нктраЗон::л:оссат :: /3 -г

рофосфат, в качестве, активатора - растзор MsGIg в O.Oüú трис-HCI буфере заданного значения plí. Измерение агтизно-сти проводили при рН 8,5. Измерение оптической плотности продукта йиСфатазной реакции-п-нирофенола регистрировали фотометрически при длине волны 400 ш. Определение концентрации второго субстрата - неорганического фосфата определяли по реакции образования молибденовой сини, концентрацию которой также регистрировали фотометрически при длине волны 730 км.

В качестве носителя для приготовления иммобилизованной щелочной фосфатазы использовали патентованна:: носитель ЛИК-21 {Si OgH-SlI), содержащий на поверхности сульф-гидрилыше группы с удельной поверхностью ICO при диаметре пор 300 1. Количество адсорбированного болка определяли по убыли ферментативной активности в контактно:-: растворе.

Термоинактивацив осуществляли в термостатпрусмнх сосудах в интервале температур 50-60°С при различию; рП (7,2; 7,5; 8,5 и 9,0), •отражающих различнне полокения на кривой рН-зависимости активности фермента, 'и з каждом

случае при различных начальных концентрациях .белка. • '

РЕЗУЛЬТАТЫ И* О Б С У Е Я Е К И Е

I. Сравнительные свойства растворенной щелочной ¿ос~ фатазы и иммобилизованной на модифицированном сп-ликагел%, содержащем ЗН-групны.

В раш!их работах показано, что щелочная фосфатаза неустойчива на поверхности силпкагеля и десорбнруето-1 в раствор при щелочных значениях рН, отвечающих каталитической активности щелочной фосфатазы. На поверхности сили-каголя,модифицированного липидами она прочно удерживается, но гидрофобный носитель вкполшет роль детергента, разрушающего активную димерную структуру щелочной фосфатазы и фермент на таких носителях пнактивируется достаточно быстро при лвбых значениях рН. Выбранный нами носитель ЛИК-21 хоросо адсорбировал щелочную фосфатазу из растворов при рН 8,5.

Цояочная фосфатаза в растворах представляет собой прочий недяссоциирувдий дилер размером 5,5x7,5 нм, имеющий болькой гидрофобный участок на одно;., из концов дилера, котором он связывает с лрпроднкгли мембранами в нативных условиях, а после разруезния ме-.-.бран он переходит в раствор н мо™ет образовать ассоциаты типа тетрамеров по этим гидрофобным контактам. Если кеднссоцплрувдий димер обозначить через Е, а его ассоциат то механизм ассоциации можно представить в виде реакции димеризации

Е + Б ¿ВВ* Е2 • (2)

При анализе зависимости удельной активности ¡цепочной фосфатазы от начальной концентрации белка установлено, что этой зависимости отвечает ниспадающая кривая, показывающая, что возникайте ассоциаты неактивны. Этот факт отвечает последним данным в литературе о щелочной фосфатазе, что возникаете ассоциаты являются неактивны;.®, тетраыера-ми. С помощью уравнения, связывающего в линейной форме удельную активность и активность фермента мохно вычислить каталитическую константу недпесоцаиру емше димеров (Е) г константу равновесия ассоциации (2;

= + ^.сс у

Здесь обратная удельная активность, а 2/ -актив-

ность (пэтмента. и :■:?.„„ - параметры уравнения (3), которые для фермента в_Д)астзэро оказались равными З.в-10-:.ГХ и 2,7.102С~- при рН 8,5, а для фермента демобилизованного, га." показало в табл.1,пет зависимости эффективно;: каталитичосхо* константы скорости гадро»т:за субстрата от степени заполнения (Г)

Таблица ±. •

Зависимость эффективной каталитической константы от количества икмо6илизо2£ено2 щелочкой фосфатазы на единицу поверхности носителя.

Г,мкг/20мкг Сразу после адсорбции Через Л суток после

_' ____рт-д ОВб'ТУП_

„ссоф Т0-И -1 кат *1и «с . ИГ* с"1

0,075 3,9 2,9

0,125 2,8 2,9

0,130 зд 1,9

0,175 . 2,9 2,5

0,225 2,9 2,3

Данные табл. I показывает, данг.ы_: носитель нсбпрате-льно адсорбирует только активные дпмерные структуры щелочной фосфатазы, а не<гл_вкые олигомеры либо но адсорбируются, либо разрушаются в процесса адсорбции. Механизм адсорбции на носителе, содерглщем5ь-г?уппы,пока остается неизвестным, однако инактивации фермента при храпении во влажном состоянии не происходит. Константа ¿Михаэлиса для иммобилизованной щелочной фосфатазы оказалась разной 4.10~4 М, что практически созпадаот со значением К., полученным для того яе фермента в растворе --3,3.10 • Таким образом, носитель ЛИК-21 оказался хорошим носителем для иммобилизации щелочной фосфатасы. Он улучка-ет свойства фермента, разрушая неактивные ассоцпаты, поэтому но наблюдается падение удельной активности с повы-

ионием поверхностной концентрации белка, йер.'ент стабилен гг-и гр.-гпс;::::: :: обладает зссми свойства:." хороп. го биокаталнзг.тора

2. 1'£':.:эннактпвс.ц::.с щелочной фосфатазы под

з.1'..-.::::см мочозины. '-о'^сииггу :х:рско иснользувт в белковой хдм"Н для денатурации белка. Ир:: это:.: концентрация г.:очев:н;н сое таз-илот 6—3'.!. концентрации мочезины используют обычко

дгл разрушения- четзорт:гчно2 структуры белка на составлявши© с;, Поскольку димеры мелочно:': фосфатазы не-дпсссцп то в настоящей работе была предпринята попытка пополневать низкие кощентрацзш мочевины (0-2Г.О для изучения к::нет:::::: :: механизма превращения недиссоциируемо-го з дпесецпируемий.

Прог^е еоего было установлено, что мочевина по-раз-

коиу влияет на начальную скорость реакции гидролиза п-нитрофенилфосфа-та щелочной фосфа-тазой в растворах разных значений Ш. .Сак'показано на ряс. I иго лысо при рН 8,5 не оказывает влияние на этот параметр: пр;; более низких значениях рН мочевина ингиблрует реакции по неконкурентному механизму, (К=0,&! при рЕ 7,2); при более зысо-

ких, чем 8,5,значениях рН паб.т".аотсл активация гслочно* фос£гтазы (по-видимому з результате; разрупенхя поас/.зал ассоцнатсз).

lia рис.2 гризсдена кинетика тсрмсинсктизацни г^лоч-Hoiî фосфатазы в присутствии Ш к&чеьипи разги:^ начальных концентрация гзрмекта. Вид кинетичсско*. кривой но зависит от начальной концентрации белка. Кинетика термоипакти-вации щелочной фосфатазы в присутствии la мочевины имеет индукционный период

= 50 млн,), в течение которого активность фермента не изменяется, но затем падает. Константа скорости инактивации первего^порядка равна для

начальной концентрации белка 0,83 а 2,5.

мг/мл. Наличие индукционного периода на кинетической кри-зо2 хемопнактивации

(рис.2) позволяет говорить о скрытых стадиях термоинактивации белка без потери каталитической активности "с, схеме (4)

.00

Рис.2. Кинетика тер щз: цс :оч::сй гго:: 45°С з т по ос; х& 8,5 : ~ " кочог

ентоадия с!от.мз;.т'. v., ^3

J И 2, G . j.Î..V/.МЛ,

0).

3

к*

Е,

ХУ.

(4)'

стабил.

лабильный

В результате математического моделирования, допуска::..;-}?! различные соотношения констант,и обрат;с/.ость стадий соотношении (4) в литература била предложена смпириче-

к

екая формула расчета числа стад:::: (5) и показано, что индукционный пор::од максимален пр:: необратимости ста ни (4) и приблизительном равенстве констант. Это эмпирическое соотношение представлено лиге (5)

, (5)

0,13 - 0,05^

Здесь п,- число стадий, а £ - безразмерная величина относительной индукции, разная о = И- I, где П.- ордината, отсекаемая касательной к точке перегиба кинетической кривой, построенной в координатах относительная актив-ность-врсж, как показано на рис.2. В таблице 2 приведены данные анализа кинетических кризых термопнактивацпи щелочной фосфатазы в присутствии различных кощентраций

Таблица 2.

Параметры кинетики термоинактотации щелочной фосфатазы в 0,05?.! трпс-НС1 буфере рК 3,5 при 45°С в присутствии различных концентраций мочевины.

Концентрация мочевины, ¡.' ГЬ-дукцпонный период,Т(мин) ги Кд.Ю^"1

0 щелочная фосфатаза стабильна

0,6 50 2 1,4

л,0 50 2 2,0

2,0 48 2 4,9.

3,0 0 - 5,8

4,0 0 - 6,5

данные табл.2 показывает, что индукционный период

на кинетических кривых теркоинзктивадии щелочной фосфата-зы под влиянием мочевины сохраняе^Еплоть до концентрации мочевины Ь\!, ас дальнейшим повышением концентрации мочевины превращение стабильного недиссоципрупцего диггера щелочной фосфатазы протекает с большей скоростью, чем денатурация возника«хдх субъединиц. Независимость эффективной константы скорости денатурации от начальной концентра«

ции белка говорит об отсутствии обратимости стадии диссоциации ласлльпого димера на неактгзнно мономеры. Наличие эт::х даи литературные данные о неактивное ти мономеров щелочной фосфатазы позгошэт предложить следующий механизм хемолнактквадпи щелочной фосфатазы под действием мочевины (6)

Активны Неактпвн.

x кт 'р xx ко xxx к_ отг

i у _-у у ~ * '

Стаб. .Табильн.

Зтот механизм включает три стадии, содерглт 2 промежуточных активнее фор:и белка и "е?В11е Я36 стадии связаны с плавлением "конформа-иониого замка" - мексубъ-единичной структуры, стабилизирующей не;ц:сссцнируемуа форму стабильного димера.

3,3. ^ассоциативная гормоякггетпвация щелочкой фосфатазы.

В ряде ранних работ, проводимых з наще" группе, было показано; что при рН 9,6 щелочная фосфатаза претерпевает термоинактиьадка при 55°С по последовательному диссоциативному механизму. йнетнческие кризые, предотгв доаныэ в по"7логар:.7г.:пческнх координат.—'. ,име:;т точку излома, положение которой зависит от начальной ко::цептрацп2 белка. При рН 63°С при различных значениях рН от 5 до 9,6 кинетика термоинакт:зацпп подчиняется уравнение первого порядка а вычисляемая эффективная константа скорости инактивации зависит от рН, причем оптимум рН-стабильности ( 7,5) и активности (рП £.5; не совпадай?. Наличие

на рН-зависимости стабильности предполагает существование по крайней мере трех ионизированных форм стабильного активного димепа (обозначь.: его просто 2) +Н+ -Н*

Еа1, Б у—^ 2Г

Задачей настоящего исследования било установить влияние высоких значений рН на диссоциативный мгханизм тор-иоинахтпзацнз лабильного димера согласно сие."о

2Е1_Х2Ед (8)

Активн. Неактивные

Мерой активного белка служила начальная скорость реакции, измеренная при насыщающих концентрациях субстрата (н-ни тр офени л|юсфата) - 2.10"*%!. Кинетические кривые строили в координатах относительная активность / [е30=Ф' от времени. Концентрации активной формы фермента определяли по калибровочной кривой зависимости активности от степени разведения белка. В табл.3 приведены начальные концентрации белка для различных опытов при различных рЕ и температурах.

Таблица 3.

Значения (Е"]пв мкг/мл в опытах по термоинактивации при различных температурах и различных значениях рН

рн ' 50°С ' 52°С 55°С 53°С 60°С

7.2 3,10 4,00 3,50 3,80 4,16

7.5 4,00 4,50 3,00 3,40 3,50

8,5 3,16 3,08 2,75 3,08 2,50

9,0 1,29 0,91 1,45 2,00 1,66

Все концентрации белка, приведенные в табл. 3,для каждого случая рН и температуры брали в разведениях 1:0,66: 0,33, чтобы получить карту данных кинетики термоинактивации щелочной фосфатазы в зависимости от рН, температуры и концентрации белка. Итого было проанализировано 60 случаев, отличающихся указанными параметрами. Как показано в табл.3,были выбраны достаточно низкие концентрации белка, значительно меньше констант равновесия ассоциации динаров в тетрамеры.

На рис.3 приведены кинетические кривые термоинактивации щелочной фосфатазы при различных температурах при концентрациях, соответствующих данным та^л.З в разведении х1. Как показано на рис.З фермент стабилен при 50° и 52°в течение пяти часов. Аналогичные данные получены и при разведении белка х0,66 и 0,33. Црн 55° и 58°0 кинети-

Рис.3. Кинетика термопнактивацил щелочной фосйатазк при

чеокие кр"выс имеют' ¿ОЛЬГОЙ индукционный период. С помощью 8, определенной графически ,и соотношения (4) вычислено число стадий, соответствующих плаз ленив кон-формационного замка и образовании лабильного диссопдируицего дилера. При 55°С п =2,4; 1,84 и 1,84 при использовании разведений белка 1:0,66 и 0,33, соответственно ^ а при

58°С эта же величина 60°С(5).

з такой г.-э последовательности равна 2,1; 1,5; 1,7. Это позволяет сделать ви- . вод, что минимальное число стадий равно 2, как и при хемоннак-тивации мочевиной (6) и вычисляемая величина не зависит от начальной концентрации белка и температуры.

При 60°С как показало на рис.4 индукционный период исчезает, а кинетические кривые, представленные в поду-

Рио. 4. Кинетические кривые термоинактивации щелочной фос-

Шазы отзи рН 7,2. О- 1,57 XV. 2,75(2) я

4.16 (3)§Е

логарифмических координатах имеют точку излома, положение которой, как показано на рис.4,зависит от й85ая>но2 концентрации белка. Это соответствует схеме £35*

Данные рис.4 и табл.4 гозорят о бкотрам зозпикнозе-нии лабильного дилера и установлении кзазиразнозесного состояния, отвеча:ощего схеме (8)

Таблица 4.

Кинетические параметры двустадийной дпссог.иатизной термоянактквацил щелочной фосфатазы (8) по данным рис.4

4lK K-£.I04,c_i Кдзс-^.104,С, J кд.Ю4с"х

4,16 0,79 ' 1,3 0,43 3,7

2,75 0,70 1,3 0,71 4,0

1,37 0,48 1,3 0,98 2,9

Здесь ГЕ]0 - начальная концентрация бедка, ^ - ордината точки излома, кт - константа скорости диссоциации лабильного дилера, к_ тангенс угла наклона кинетичсскои кривой при ъ г <ъ , Кд - истинная константа скорости денатурации.

Аналогичные исследования прг: рН 7,5 показал:!, что индугзциопеый период сохраняется вплоть до 60°С к в табл.5 представлены соответствующие данные.

Таблица 5

Зййективное число сквытых стадий в индукционном периоде ка~кр:1зых термоинактивацип щелочной фосфатазы при pli 7,5

Разведение 50°С 52°С 55°С 53°С 60°С

xï,0ûQ с таб. стаб. 3,70 2,47 1,84

х0,66 с таб. с таб. 3,70 2,50 1,58

х0,33 с таб. стаб. 2,30 1,84 1,50

Данные табл.5 пог-^двают, что'нри рН 7,5, как и при-рП 7,2 фермент стабилен при 50 и 52°С, щи более высоких температурах наблюдается инактивация белка после достаточно продолжительного индукционного периода, величина которого не зависит от начальной концентрации белка, но уменьшается с повышением температуры. Эти данные гово-

рят о том, что при плавлении конформационного замка в стабильном дилере щелочной фосфатазы на пути к возникновению лабильного дилера, способного-к диссоциации возможно существование двух и более активных промежуточных форм дилера.

Данные показывают, что при рН 8,5 индукционный период появляется уге при 50° эффективное число стадий, протекающих без потери активности на пути превращения стабильного димера в лабильный, легко диссоциирующий, равно 2,52; 2,42; 2,52 при разведениях белка 1:0,66:0,33 при 50°С и 2,52; 2,42: и 1,84 при 52° соответственно. Эффективное число стадий не зависит ни от температуры, ни от концентрации белка. Индукционный период исчезает уже при 55°С и кинетические кривые' спрямляйся в координатах уравнения первого порядка, вычисляешь таким образом константа скорости инактивации первого порядка не зависит от начальной концентрации белка и равна 2,1(55°С); 5,7(53°С) и 9,5. ХО^с-^ (60°). Вычисленная по этил данным эффективная энергия активации оказалась равной 59 ккал/моль, что характеризует процесс денатурации белка.

Аналогичная картина наблюдается и при рЯ 9,0, когда индукционные периода появляются на кинетических кривых

т п го зо

40 50

Рис.5. Кинетика термокнактивацип щелочной фосбатазы в трио-ПС! б*д. -ое рН 8,5 при 55°(I), 580(2), 60°(3).

тормоинактивацни белка ута при 50°,, а эффективное чиоло стадий равно 2,56; 2,56 и 2,50 для разведений белка I: 0,66:0,33, а для 52°С 1,93; 1,84 к соответственно,

т.е. в этих условиях превращение стабильного дилера в лабильный протекает минимум через 2-3 стадии без потери каталитической активности. Тахае,как показано на рис.5, при рН 9 индукционный период исчезает при 55°С, по в отличие от предыдущего случая здесь спова, как и при рК 7,2 (60°С),удается обнаружить последовательный диссоциативный механизм термоинактивацин активного лабильного дилера, обратило диссоциирующего на неактивные мономеры согласно схеме (8).

Таблица 6.

Кинетические патзаметш двустадийаой диссоциативной тер-моинактизацки щелочной фосфатазы (8) при рН 9 и Б8°С

ГЕ) ^О мл % КрПЛс-1 К^ЛСЛ-1 кд.Ю4с-1

2,СО 0,54 8,8 2,2 7,2

1,32 0,44 8,8 3,3 8,5

0,66 - 8,8 8,8 8,8

То ко при 60°С

1,66 0,46 9,3 3,5 9.5-

1,10 0,30 9,3 5,5 10,2

0,55 - 9,3 9,3 9,3 . '

Таким образом, при рН 9 соотношения констант скоростей отдельных стадий позволяет" наблюдать на кинетических кривых различные стадии и вычислять отдельные элементарные константы.

Таким образом ¿наиболее стабильным фермент оказывается в растворах рН 7,5.

На основании всего изложенного мокно сделать вывод, что ликерная форма щелочной фосфатазы устойчива к диссоциации в водных растворах и затеплена структурой "кон-форматюнного замка", возникавшего между субъединицами.

"Ковфорлапошшй зо-'/.ок" устойчнз в растворах при рН 7,5 в 0,05?,1 _рис-НС1 буфере в присутствии 0,03?.; хлористого магния. Повышенно температуры и сдвиг рН в область щглоч-кых ил:: кислых значений облегчает этот процесс, в результате которого возникает лабильный дилер, легко диссоци::ру-:сщий на состазл-'лхре субъоднннци, которые :ле;:ео устойчивы, чем джлеры и легко донатур:груют. Схематически это псказа-

Рис. 6. Схема механизма деструкции активного стабильного дилера щелочной фосфатазы.

Раскрытие конформационпого за-,аса протекает без потери активности фермента через несколько стад::;':, число которых определяется условия?.«! эксперимента (от четырех до двух). При этом структура "конформациопного замка" плавится и возникает лабильный димер, легко диссонирующий ь растворах.

ШЕОШ.

1. Получен новый гетерогенный бпокатализато? па сс-нозе щелочной фосфатазы, иммобилизованной па твердом носителе Л5К-21 ($I О^Я $, Н). При этом не изменяется его удельная активность и константа "пхаэлиса. Биокатализатор устойчив при хранении и его удельная активность не зависит от степени заполнения.

2. Показано, что при рН 2,5 мочевина (1У.) из влияет

на активность щелочной фосфатазы, но при 45°С происходит медленная инактивация фермента, Кинетические кривые имеот индукционный период, обусловленный протеканием последовательных стадий разрушения структуры "конформационного заимка" (минимум в две стадии) с последующей необратимой инактивацией лабильного дилера.

3. Проведено детальное изучоние механизма, термоинактивации дшлзрной формы щелочной фосфатазы при рН 7,2; 7,5; 8,5 и 9. В кандом случае исследовался температурный интервал от 52 до 60°С для трех различных концентраций «ферлен-та <1:0,66:0,33). Получены и проанализированы кинетические кривые до степени инактивации белка 0,1-0,2.

4. Показано, что существует по крайней мере три да-мерные форш фермента в растворе, отличающиеся степенью ионизации, из которых одна стабильная Е и две лабильные Ш* и ЕГ. Наиболее стабилен фермент при рН 7,5.

5. Предлоген механизм термодеградации активного ликера щелочной фосфатазы по последовательному механизму, • влзчавдему стадии плавления "конформационного замка" (от 2 до 4 стадий без потери активности промежуточных форм)

с возникновением лабильного дилера. Явустадийшй последовательный днссоциат:таг.й механизм денатурации- лабильного дилера обнаружен при рН 7,2 (60°С) и рН 9,0 при 55-6£°С.

Основное содержание диссертации .изложено в следующих работах:

I. Хаза Р., Чухрай Е.С., Веселова М.Н., Рощана Т.К., Полторак O.U. Каталитические свойства щелочной фосфатазы, иммобилизованной на модифицированном силикагеле, содержащем ¿Н-грудпы // Вести.Моск.ун-та. Сер. 2. Химия-1992 -Т.ЗЗ - с.250-253.