Структурное исследование межбелковых контактов ряда олигомерных ферментов в связи с их диссоциативной инактивацией тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

' ^ ОД ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

2 4 НОВ 1047

На правах рукописи ТОРШИН Иван Юрьевич

СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖБЕЛКОВЫХ КОНТАКТОВ РЯДА ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ В СВЯЗИ С ИХ ДИССОЦИАТИВНОЙ ИНАКТИВАЦИЕЙ.

02.00.15-химическая кинетика и катализ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва- 1997

Работа выполнена на кафедре физической химии в лаборатории кинетики и катализа Химического факультета МГУ.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор О.М. Полторак, доктор химических наук, профессор Е.С. Чухрай

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор С.Д. Варфоломеев, доктор химических наук, профессор Б.И. Курганов

Ведущее учреждение: Институт химической физики РАН

Защита диссертации состоится "18" декабря 1997 г в 1610 часов на заседании диссертационного совета К 053.05.58 по химическим наукам при химическом факультете МГУ.

Адрес:Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, аудитория 344.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 18 " ноября 1997 г. Ученый секретарь совета, кандидат химических наук у И.А. Абраменкова

Общая характеристика работы.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ, обусловлена необходимостью структурного исследования межбелковых контактов и поверхности белковых молекул, дающего ценную и новую информацию, важную для обсуждения кинетических закономерностей диссоциативной инактивации (в, части осп«, термоанактивацик) ферментов и в проблемах их стабилизации.

В предыдущих работах на основе анализа кинетических данных термоинактявации ряда ферментов-двмеров и тетрамеров была предложена концепция копформационпого замка, предполагающая постадийное изменение соединяющих участков в области межбелкового взаимодействия, последовательное разрушение которых приводит в итоге к потере ферментом активности. Структурные исследования дают независимые данные, существенно дополняющие выводы кинетических исследований.

Так как результатом данной работы явилась разработка ряда программ, применимых для любой белковой молекулы, то круг рассматриваемых проблем может оказаться более широким и затрагивать многие важные вопросы современной молекулярной биологии.

Так, в работах последних лет было также установлено, что димеризация может выступать как способ передачи сигнала внутри клетки я наравне с "аллостерией" может служить механизмом регуляции активности ферментов (см. разделы "Щелочная фосфатаза" а 'Тлнкогея-фосфорилаза"). Регулируемая димеризация белков имеет важное значение в таких клеточных процессах, как передача сигнала и транскрипция.

Кроме того, исследование свойств поверхности белков необходимо при изучении адсорбция белков на различных поверхностях раздела и в связи с проблемами синтеза биокатализаторов.

Многостадийная диссоциативная термоинактивация ферментов, возможные механизмы которой обсуждаются в данной работе на примере нескольних ферментов, происходит в узком температурном антервале и в ограниченных интервалах рН я концентраций ионов металлов, необходимых для работы некоторых ферментов. Вероятно, вследствие этого, диссоциативная инактивация была практически не исследована и, соотвественно, никем не проводилось и структурное обоснование многостадийной инактивации олигомерных ферментов.

С другой стороны, существуют работы, связапных с исследованием межбелкопых контактов, в которых описываются их разные структурные, (точнее, геометрические) характеристики. Как правило, зти работы проводятся при помощи программ и ва большом наборе структур белков (200-300) и, как правило, преследуют задачи нахождения каких-то общих

чисто структурных характеристик белка, а не решения конкретных кинетических проблем, которые обсуждаются в данной работе.

ЦЕЛЬ ДАННОЙ РАБОТЫ состояла в получении отсутствующих к данному времени данных о ряде важных для кинетики свойств межбелковых контактов и поверхности олпгомерных ферментов. Для этого было необходимо:

1. Разработать программно-воплощенные методики структурного анализа межбелковых контактов олигомерню ферментов, пространственное строение которых установлено методом РСА с разрешением не ниже 2.5 А.

2. Разработать программно-воплощенные методики анализа молекулярной поверхности белковой глобулы.

3. Разработать методы для нахождения возможных структурных механизмов разрушения межбелковых контактов димерных ферментов для их применения к обсуждению инактивации соотвествующих ферментов н нахождению соответствия между данными кинетических исследовании и результатами структурного анализа.

4. С помощью разработанных методов изучить межбелковые контакты олигомериых ферментов. Были подбробно изучены структуры четырех ферментов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ обусловлена в значительной мере совместным анализом кинетических к структурных данных, относящихся к свойствам межбелковых контактов п строению поверхности белковых глобул. Такие данные для щелочной щелочной фосфатазы из E.colí, алкогольдегидрогеназы из печени лошади, енолазы из пекарских дрожжей и гликогенфосфорилазы из мышц кролика получены впервые.

1. Написан комплекс программ, позволяющих разносторонне а нализировать любую белковую структуру, в частности, с целью нахождения взаимосвязи между активным "центром" белка и межбелковым контактом.

2. Результаты анализа позволяют выделить наиболее структурно значимые аминокислотные остатки, что может оказаться полезным для белковой инженерия посредством мутагенеза отдельных остатков.

3. Указана возможность того, что различные воздействия на молекулу белка, обусловленные нагревом, образованием межбелкового контакта (олнгомеризациел), связыванием аллостеряческого лиганда я пост-трансляционой регуляцией (фосфорилнрованием) со структурной точки зрения эквивалентны и сводятся к частичному развертыванию (или свертыванию в случае связывания лиганда) находящихся на поверхности петель и топологических мотивов (совокупности петель и других элементов вторичной структуры белка). Данный вывод позволяет использовать результаты различных видов кинетических исследований ферментов (как in vitro, так и in vivo) для нахождения взаимосвязи структуры и активности.

4. Использование трех различных методов структурного анализа поверхности белковой молекулы, и, в частности, поверхности межбелкового контакта позволяет судить о возможных функциях различных участков поверхности белковой молекулы, и, следовательно, может быть важным для многих наук, исследующих биологические объекты (например, в молекулярной биологии, энзимологин, цитологии ).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ данной работы определяется прежде всего важностью кинетического исследования стабильности ферментов в связи с их использованием в различных разделах науки и отраслях промышленности.

АППРОБАЦИЯ РАБОТЫ-доклад на II съезде Биохимического общества РАН 1997 (Москва) и доклад на конференции "Ломоносов-96" (Москва)

ПУБЛИКАЦИИ По результатам данной работы опубликовано 4 статьи.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация представляет собой рукопись на f70 страницах, содержит 23 иллюстрация и 30 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 145 ссылок.

Работа состоит из введения (литературный обзор) и трех глав. В литературном обзоре (глава 1) рассмотрены: концепция "конформационного замка"и кинетическое изучение механизмов инактивации олигомерных ферментов, методы структурного анализа межатомных нековалентых взаимодействии в пределах белковой глобулы и методы расчета площади поверхности и точек поверхности молекулы белка. Приведено качественное описание физической модели инактивации в водном растворе и рассмотрена взаимосвязь кинетических и структурных параметров.

В главе 2. под названием "Кинетическое изучение стабильности щелочной фосфатазы из различных источников. Материалы и методы. Методика эксперимента" рассмотрены Физико-химические свойства щелочных фосфатаз из различных источников, определение активности щелочной фосфатазы и концентрации белка в растворе, изучение кинетики ассоциации димер-тетрамер и результаты кинетических исследований термоинактивации щелочной фосфатазы.

В главе 3. под названием "Методики изучения межбелковых контактов и свойств поверхности белковых молекул по данным РСА" описаны разработанные методики анализа нековалентных взаимодействий в межбелковом контакте, нахождения взаимодействующих аминокислотных остатков и анализа поверхности белковой глобулы.

В главе 4 под названием "Строение, конформационяый замок, связь свойств поверхности молекулы в активности нескольких олигомерных ферментов." рассмотрены результаты изучения структур щелочной фосфатазы из E.coli, алкоголь-дегидрогеназы из печени лошади, енолазы

из пекарских дрожжей я глпкогеифосфорилазы из мышц кролика и обсуждаются структуры межбелковых контактов димеров, их связь с активным центром и возможные механизмы их инактивации.

Глава I. Литературный обзор

Данная глава разделена на две части. В первой рассмотрении кинетическое изучение диссоциативных механизмов инактивации и концепция "конформационного замка", во второй-мпогочисленпые методы структурного анализа белковых структур, установленных посредством РСА.

Кинетические экспериментальные факты, приведшие к формулировке КОНЦЕПЦИИ КОНФОРМАЦИОННОГО ЗАМКА, состоят в следующем: На кинетических кривых термоппактивацпи димерных белков при постоянных температуре и рН падению активности предшествует участок пеиэменпой активности (индукционный период). При pH=const существует температурный порог начала термоинактивации. Инкубационному периоду соответствуют "скрытые" с точки зрения кинетики структурные изменения. Можно предположить наличие ряда структурно различных промежуточных состояний, в каждом из которых еще полностью сохранена конформация активного центра. Тогда периоду задержки будет соответствовать серия последовательных переходов от одного активного интермедиата к другому.

Кинетические данные позволяют указать на минимальное число стадий, предшествующих диссоциативному распаду белка. В данной работе структурные исследования дают независимую от кинетических исследований информацию о связи межбелкового контакта, разрушение которого соогветсвует "скрытым стадиям", и потери активности молекулой фермента.

Во второй части рассматриваются методы анализа строения олигомерных белков. В литературном обзоре рассмотрены МЕТОДЫ СТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА МЕЖАТОМНЫХ НЕКОВАЛЕНТЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МЕЖДУ ГЛОБУЛАМИ И ВНУТРИ БЕЛКОВОЙ ГЛОБУЛЫ.

При геометрическом подходе, использованном в данной работе, нековалентные связи, или контакты между атомами разделяются на две группы с противоложными физико-химическими свойствами-водородпые связи и гидрофобные взаимодействия. Приведено краткое сравнение этих двух "связей".

В обзоре рассмотрены различные МЕТОДЫ РАСЧЕТА ПЛОЩАДИ ПОВЕРХНОСТИ И ТОЧЕК ПОВЕРХНОСТИ МОЛЕКУЛЫ БЕЛКА, разработанные к настоящему времени,

В данной работе используется численный расчет поверхности. Молекула рассматривается как совокупность слившихся сфер (fused sphere model), представляющих индивидуальные атомы. На каждой сфере берется определенное число раяпомерпо распределенных точек и точки поверхности находятся путем удаления точек, находящихся внутри

пересекающих друг друга сфер. Модифицированный вариант этого алгоритма, эмулирующий 'катание зонда', был использован в данной работе. Его подробное описапне помещено в разделе "Расчет доступности растворителя, нахождение точек поверхности атомов" экспериментальной части.

Вкратце рассмотрена проблема определения позиций молекул воды па поверхности белковой глобулы, которые могут непосредственно влиять на образование межбелкового контакта, и на катализ.

Результаты применения различных групп методов исследования функционально важной особенности поверхности белка-гидратации,как правило, несовместимы. Нами предлагается косвенпый учет возможной гидратации поверхности при нахождении гидрофобных и гидрофильных участков поверхности.

В литературе в основном рассматриваются ГИДРОФОБНЫЕ УЧАСТКИ НА ПОВЕРХНОСТИ БЕЛКА. Одной из фунциональных особенностей поверхности белковой молекулы (помимо общей формы и паличпя плоских участков, углублений, выступов и узких каналов, сайтов регуляц ни и других модификаций) является присутствие электроотрицательных атомов (N,0) и атомов, участвующих в гидрофобпых взаимодействиях (C,S).

Процедуры выделепяя гидрофобпых п гидрофильных участков участков на поверхности белковой молекулы рассмотрены в экспериментальной части. В данном разделе кратко рассмотрены результы статистических исследований гидрофобных участков белковых структур.

В обзоре обсуждается ПРИБЛИЖЕННОЕ ОПИСАНИЕ ФОРМЫ ГЛОБУЛЫ, ВЫДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОВЕРХНОСТИ.

Для исследования комплементарности поверхностей, как геометрической, так я физикоотмяческой. наиболее важным является выделепие характерных элементов поверхности: плоских участков, впадин (cleft) и выступов непредсказуемой формы, углублений (pocket), гидрофильные и гидрофобные участки (patch) и указать их приблизительное расположение в системе координат сферы, описанной вокруг белка.

Для этого существует два прянципнально различпых подхода. Первый заключается в том, что па основании координат атомов молекулы и их Вап-дер-Ваальсовых радиусов вычисляются точки поверхности с определенным количеством точек на атом. На основании полученного массива возможно расчитать доступпость растворителя для каждого из атомов молекулы, и вилуалировагь полученные результаты. Второй метод,предлагаемый в этой работе, заключается в изготовлении приближепных моделей из пластичного материала. При этом на основании файла координат вычисляются размеры каждого элемента вторичной структуры и в соответствии с ними молекула складывается вручную. Помимо получения достаточно точной модели поверхпости, данный метод позволяет установить возможные механизмы фоддипга глобулы.

Для анализ взаимосвязи межбелкового контакта и активности необходимо НАХОЖДЕНИЕ МЕСТ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ. Теоретические методы определения участков связывания, разработанные к настоящему времени, включают в себя, как правило, только лишь анализ формы поверхности (то есть нахождение впадип). Считается, что самые большие из найденных впадин могут участвовать в связывании лигандов. Нами предлагается усовершенствованный метод нахождения возможных участков связывания лигаядов, основанный яа анализе формы и расположения гидрофобных и гидрофильных участков на поверхности.

Для исследованных в данной работе белков существует по крайпей мере несколько рентген оструктуриых экспериментов с различными связанными молекулами (кофактор,субстрат,ингибитор). При обощении данных всех имеющихся РСА экспериментов для каждого типа связанной молекулы находятся аминокислотные остатки образующие водородные связи и участвующие в гидрофобных взаимодействиях. На основании полученного для каждого лиганда списка остатков определяются элементы вторичной структуры активного и прочих связывающих центров.

Глава. 2. Кинетическое изучение стабильности щелочной фосфатазы из различных источников.

Щелочная фосфатаза катализирует реакцию типа 3.1.3.1 по КФ номенклатуре (гидролиз сложных моноэфиров ортофосфорной кислоты). Щелочная фосфатаза из E.coli является димером в интервале pH 4-8. При pH <4 фермент диссоциирует на субъединицы. Для протекания катализа необходимо присутсвие ионов Mg2* и Zn2+ в активном центре фермента. При концентрации ионов Za более чем Ю'^М молекулярная масса увеличивается с увеличением pH и достигает максимального значения (172,000), при рН=8.0- практически весь белок находится в тетрамерной форме. Четвертичная структура фермента (мономер, димер, тетрамер) определяется кислотностью среды, концентрацией атомов цинка, температурой и концентрацией низкомолекулярных эффекторов. Тетрамеры фермента E.coli менее активны,чем димеры.

Описаны методы, нспользованые для исследования кинетики щелочной фосфатазы: определение активности фермента, и исследование термоинактивации. Зависимость активности от концентрации дает основания предполагать, что молекулы димера щелочной фосфатазы из E.coli могут ассоциировать.

В представленной работе сравниваются термостабильности щелочных фосфатаз животного и бактериального происхождения. С целью получения кривых с индукционным периодом, для денатурации использовалась не более чем 2.5М мочевина (вместо 8М).

Ферменту E.coli не требуется активация ионами Mg2*, в отличие от фермента из кишечника цыпленка. В этом случае дополнительные участки на поверхности могут связывать поны Mg2+, но существование таких участков на поверхности глобулы остается под вопросом.

Глава 3. Методики изучения межбелковых контактов.

В первой части этой главы описапы программно реализованные алгоритмы, связанные с анализом некопалептных взаимодействий в межбелковом контакте, а во второй части рассмотрены разработанные в данном исследовании методы алалнза поверхности белковых молекул.

Рассмотрены использованные в данной работе модельные представления структуры белков. Молекула белка может быть представлена:

-Как набор коордипат сфер (атомов пли аминокислот), радиус каждой сферы известен.

-Как совокупность свернутых определенным образом участков лепты (то есть совокупность элементов вторичной структуры), каждый из которых имеет определенную ориентацию (задан ориентирующий вектор каждого элемента). Эта модель представляет архитектуру белка.

-Как "модель поверхности "-объект с формой, близкой к эллиптической, имеющий полости и, возможно, ходы,их соединяющие, с неровной, бугорчатой поверхностью, гидрофобными и гидрофильными участками. Очевидно, что дапное представление необходимо при анализе биологической функции и фунциональных возможностей белковой поверхности.

-Как "пластилиновая модель" (clay model). Для качественного рассмотрения денатурации ферментов мы предполагаем, что любой фунциональпо регулируемый белок имеет стабильное ядро, сохраняющееся при постоянном изменении конформации элементов вторичной структуры, находящихся на поверхности, связанном с тепловым движением, взаимодействием с водой, посттрансляционными модификациями и связыванием лигандов. Очевидно, что некоторые такие элементы могут отделяться и частично развертываться и вновь "адсорбироваться" тем или другим участком глобулы. Наилучшим представлением такой модели будет пластилиновая модель, построенная на основании данных РСА о вторичной структуре и архитектуре белка.

-Как трехмерный граф, в котором вершинами являются аминокислоты, а ребрами-нековалеятные и ковалентные взаимодействия. Это представление необходимо для сравнения различных РСА данных одного белка с целью выявления постояппмх, "каркасных", связей.

Анализ нековалентных взаимодействий в межбелковом контакте подразделяется на пять основных стадий: выбор файла РСА данных, объединение результатов нескольких реяггенострукгурных экспериментов,

расчет позиций атомов водорода, нахождение водородных связей и гидрофобных взаимодействии, нахождение аминокислот контакта.

ВЫБОР ФАЙЛА РСА ДАННЫХ. К РСА-файлу применялись следующие требования; -Разрешение РСА эксперимента не хуже чем 2.5 А. -Структуры мутантов исключаются из рассмотрения.

РСА файл должен содержать:

-Координаты всех цепей, существующих в нативном ферменте, желательно без "плохо закристаллизованных" элементов вторичной структуры, координаты атомов которых потеряны, -информацию о вторичной структуре.

-Координаты всех коферментов и металлов, необходимых для функционирования фермента.

-Для нахождения групп активного центра необходимо наличие файла с координатами атомов структуры с неактивным аналогом субстрата или ингибированпым тем или иным образом ферментом.

Для достоверного определения всех аминокислот контакта необходимо ОБЪЕДИНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ НЕСКОЛЬКИХ РЕНТГЕНО-СТРУКТУРНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

Границами между рассмотрением белка как геометрической конструкции и молекулой как набором связей являются критерии нековалентных взаимодействий.

Одной из основных задач исследования межбелковых контактов является установление аминокислотного состава сайтов межбелкового контакта. Присравнении различных экспериментов для одного и того же белка нами было обнаружено, что в некоторых случаях межбелковые взаимодействия могут образовывать аминокислоты, отличающиеся номерами в последовательности, но находящиеся на одном элементе вторичной структуры. Поэтому первым этапом анализа является нахождение элементов вторичпой сгрукгуры, участвующих в образовании межбелкового контакта на основе списка аминокислот. В проведенной рабоге пока реализован первый шаг-нахождение аминокислот для различных типов контактов на основе обобщеных по нескольким экспериментам спискам нековалентных связей.

Для определения водородных связей необходим РАСЧЕТ ПОЗИЦИЙ АТОМОВ ВОДОРОДА.

Позиции атомов водорода не обнаруживаемы в большинстве рептгеноструктурпнх экспериментов и в большинстве файлов структурных данных не приводятся. Поэтому проводится расчет, основанный на известных стереохимических правилах для аминокислот в белках. Нами предложен упрощенный метод расчета позиций атомов водорода.

Использованные обозначения:

О -Атом- донор водорода, координаты (или радиус-вектор) этого атома. Н -Агам Водорода.

А -Акцептор водорода.

ГЮ -Неводородпый атом, ковалентно связанный с донором.

- Неводородпый атом, ковалентно связанный с ОБ. АА - Блнжайгаий к акцептору атом, связанный с ним копалентно. (КН-А) - расстояние между атомами Н и А.

Все аминокислотные атомы-доноры атомов водорода в белках могут быть разбиты па две осноппые группы: эр^-допоры и зр3-доноры. Рассмотрим 5р--доноры. Положения атомов Н относительно Б , 00, ООО (или 002) фиксированы, поэтому задача о нахождении координат атома водорода имеет.в отличие от зр3-донора, только одно решение.

Возможные расположения атомов вблизи доноров сводятся к двум, в соотвествии с чимом соседей у атома донора, (рис. 16)

Из рисунка 1в видно, что две эти конфигурации точек различаются лишь нумерацией, поэтому расчет позиций водорода для любого из приведенных выше зр2-доиоров сводится к одной геометрической задаче, легко решаемой с использованием векторов.

Очевидно, что невозможно рассчитать координаты "вращающихся" атомов водорода (водороды зр3-доноров). Однако можно проверить, может ли данный атом участвовать в образовании конкретной водородной связи с данными соседними группами.

КРИТЕРИИ ВОДОРОДНОЙ СВЯЗИ. Из трех видов взаимодействия ковалентно несвязанных атомов в белках ( гидрофобные взаимодействия, водородные связи, взаимодействия ионов) водородпые связи вносят существенный вклад в сохрапепие пространственной структуры белковых молекул.

Для описания геометрии водородных связей в белках в данной работе предлагается ограничиться двумя параметрами (расстоянием Н-А и углом О-Н-А) (рис. 1), непосредственно влияющих па энергию водородной связи. Нами показано существование в белках водородной связи с двумя акцепторами.

Водородная связь связь определяется как разновидность ионного взаимодействия. Следовательно, даже при одинаковых атомах, участвующих в образовании связи, она будет характеризоваться не какими-то постоянными значениями параметров,ее описывающих, а интервалом значений геометрических параметров. Для определения этого и птервала проводилось определение этих параметров па ряде белков с известной пространственной структурой. Первоначально нами были использованы результаты таких статистических критериев.

В то же время подавляющее большинство белковых структур имеет альфа-спирали как элемент вторичной структуры. Поэтому за исходный постулат при определении водородных связей принято, что каждое из взаимодействий между М-атомом гл. цепн ¡-го остатка в спирали и О-атомом гл. цепи и+3)-остатка следует учитывать как водородную связь. Если белок имеет бета-структуры, для них применяется та же процедура.

и

с! Н А;

с! [на]

\

А.

АА

Н

р 05

2 Н,

роэ

в

АА

ЕР 2

5

Рис. I Пространственная модель водородной связи в белках.Изображены как атомы, участвующие в образовании водородной связи, так и их ближайшее окружение.Принятые обозначения приведены в тексте статьи, а) Доноры с геометрией эр2 1Н 200 к ер2 1Н ЮЭ ( 'звездообразные' ). б) Доноры с геометрией зр2 2Н ЮБ ( 'червеобразные'), в) Геометрическое представление задачи о координатах атома водорода.

В результате проведенных расчетов водородных связей в ряде белков нами было обнаружено, что использование ограничений на значения углов АА-А-О и АА-А-Н приводит к отсеиванию около 1.5% от общего количества связей. Представляло интерес установить, как ие же контакты между аминокислотами "отсеиваются" этими условиями.

Оказалось, что осповная масса этих контактов представляет собой взаимодействия между зр3-донорным атомом и карбоксильной группой с двумя акцепторами (например, между боковыми цепями серина и аспартат-иона) (рис. 2). Такой фрагмент структуры мы назвали "вилкой".

Так как водород ярЗ-донора вращается вокруг оси ОБ-О, то равновесной конфигурации такой системы зарядов будет соответствовать расположение водорода между обоями акцепторами, и, следовательно "вилку" можно рассматривать как особый случай водородной связи с двумя акцепторами.

НАХОЖДЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ, ОБРАЗУЮЩИХ ВНУТРИ И МЕЖБЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, проводилось следующим образом.

С геометрической точки зрения аминокислоту можно представить как совокупность двух сфер. Внутри одной из них (сфера В) находятся атомы пептидной связи (М,СА,С,0) , а в другой (сфера Б)- атомы боковой цепи (если она имеется).

Проще всего определить координаты цсптра сферы В (и S) как центр масс атомов, в ней находящихся, а радиус - как расстояние до самого удаленного атома плюс Ван-дер-Ваальсов радиус этого атома. Так как радиусы сферы В изменяются в пределах (3.19-2.77 =0.42 А), а для некоторых "мягких" боковых цепей (LYS,ARG) разброс радиусов

Рис. 2 а)'Вилка'- водородная связь с двумя акцепторами. 6),в),г) Вилки во внутри- и межглобульных взаимодействиях щелочной фосфагазы E.coli 6)1-

Glu 411.-Л, 2-Thr 381:В; s)l-Asp 320, 2-Thr 374; r)l-Lys 114, 2-Asp 434.

достигает 1 А, то для проверки выполнимости необходимого условия контакта двух аминокислот предпочтительней использовать предложенный выше метод, а не какие- либо фиксированные значения радиусов аминокислот.

Соприкосновение сфер двух амипокяслог- необходимое условие связывания- позволяет выделить аминокислоты, находящиеся вблизи поверхности межбелкового контакта. Очевидно, что выражения "находиться вблизи контакта" н "участвовать в контакте" имеют разный смысл. Под участием в контакте можно понимать существование взаимодействий между атомами двух контактирующих аминокислот. Такими, взаимодействиями, на сегодняшний день признаны гидрофобные взаимодействия, водородные связи и 5$-связи.

г

Общая схема действия алгоритма такова. Пусть имеются две глобулы, каждая представляется как свернутая цепочка пэ сфер. Последовательно перебираются все остатки одной глобулы, п длл каждого взятого в данный момент остатка проверяется пересечение его сфер В(аскЬопе) и БО^есЬа^п) со всеми остатками соседней глобулы. Если две сферы пересекаются или соприкасаются, производится проверка критериев водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Иначе берется следующая сфера.

Во второй части главы 3 рассмотрены разработанные в данном исследовании методы АНАЛИЗА ПОВЕРХНОСТИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ. К ним относятся: расчет доступности растворителя, нахождение точек поверхности атомов, нахождение атомов поверхности, опре деление гндрофпльных участков поверхности, определение гидрофобных участков поверхности, изготовление свертываемых моделей белков.

РАСЧЕТ ПЛОЩАДИ, ДОСТУПНОЙ РАСТВОРИТЕЛЮ (илн "площадь молекулярной поверхности"), выполняется для нахождения атомов поверхности и затем аминокислот, находящихся на поверхности глобулы. Для уменьшения времени расчета необходимо, прежде всего, быстро определять соседние атомы для любого заданного атома. Наиболее простой способ состоит в использовании разбиения пространства, в воображаемой "части" которого находится молекула ("большой куб") па более мелкие "клетки"-кубы или параллелепипеды. Каждая клетка содержит список атомов, каждый из которых представлен сферой, поверхность которой полностью или частично располагается в объеме куба.

После нахождения списка ближайших соседей производится "численный" расчет поверхности "методом удаления точек". Свободная поверхность представлена точками, оставшимися после удаления всех точек в контакте с соседними атомами. Поскольку каждой точке соотвествуег фиксированное значение площади (точка является "узлом" решетки, покрывающей сферу атома), число найденных точек позволяет сосчитать значение свободной поверхности.

Кроме /ого. в работе использован метод "эмуляции катания зонда", который позволяет определять педоступые растворителю атомы более простым способом, не использующим осложняющих геометрических проверок метода "катания зонда".

Мы использовали комбинированный способ ОБНАРУЖЕНИЯ АТОМОВ. СОСТАВЛЯЮЩИХ ПОВЕРХНОСТЬ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. К атому, находящемуся на поверхности глобулы, можно "прикоснуться" н л и "ощупать зондом". Сначала выбираются "кубы", лежащие снаружи глобулы, причем берутся два первых непустых идущих в одном направлении куба, затем проводится проверка атомов этого куба "сферическими зондами", имитирующими молекулы воды. После нахождения списка атомов производится проверка значений доступности растворителя.

Если белковая структура имеет бета-структуры, стрэнды которых обычно располагаются внутри глобулы, образуя ядро, то среднее значение доступностей аминокислот в стрэндах может соотвествует аминокислотам, "находящимся в ядре", то есть "удаленным от поверхности".

АНАЛИЗ ГИДРОФИЛЬНЫХ И ГИДРОФОБНЫХ "ПЯТЕН" НА ПОВЕРХНОСТИ, основапнмй па полученном списке аминокислот поверхности, был использован для рассмотрения олигомеризацпи димера щелочной фосфатаэы.

Тела, носящие заряды одного знака, не имеют тенденции скапливаться в одном и том же участке пространства. Очевидно, что в общем случае положительные и отрицательные заряды на поверхности молекулы белка в среднем будут распределены равномерно. Поэтому помимо чисто положительно или отрицательно заряжепных участков поверхности, наличие которых будет способствовать дестабилизации глобулы можно предположить возможпость обнаружения пространственно разделенных участков содержащих и положительно и отрицательно заряженные атомы. Такие участки назовем просто "гидрофильными" илп "заряжеппыми".

Поскольку заряд любой аминоксилоты, частичный или полный, зависит от условий, в которых находится молекула белка, то в общем случае следует различать не "заряженные" и "незаряженные" атомы (ионы), а "полярпые" илп "неполярпые" участки. В определенных условиях "полярный" может стать "заряженным". В работе в качестве "полярных" атомов рассматривались атомы-доноры или акцепторы протонов, то есть некоторые атомы азота и кислорода определенных аминокислот.

На первом этапе поиска гидрофильных участков находятся все пары атомов, способные адсорбировать молекулу воды. Далее, па основании спискамежатомнмх контактов производится поиск путей вдоль ветвей дерева (термины теории графов). Вершппами этого дерена являются атомы белка, а ребрами "связи", то есть молекулы воды, помещенные между атомами белка.

Для ПОИСКА ГИДРОФОБНЫХ УЧАСТКОВ сначала также составляется список атомов поверхности. Далее, нами был использовал метод, эквивалентный по конечным результатам методу с использованием повторного расчета зпачепий доступностей, который приводят к значительным вычислительным затратам на большинстве персональных компьютеров. Из списка всех гпдрофобпых атомов поверхности исключаются атомы, имеющие гидрофильные соседние атомы, лежащие на расстояпин менее К1+К2^0.-1 А. При имеющемся "скорректированном" списке гидрофобных атомов (атомы С и 5) для обнаружения гидрофобн ых участков используется та же стратегия, что я для гидрофильных, но размер зонда берется небольшим (0.4-1 А).

Изготовление свертываемых МОДЕЛЕЙ БЕЛКОВ. Изображ сние последовательности атомов Са1рЬа (Са1рЬа-иасе) или изображение типа проволочной модели, получаемое посредством распространенных программ визуализации молекулярных структур в лучшем случае дает лишь

ориентировочную информацию о поверхности белка. С другой стороны, даже при использовании более сложных вычислительных методов расчета точек молекулярной поверхности . дает изображение, испещеренное множеством цветных пятен, символизирующих найденные алгоритмами углубления и не позволяет вынести обоснованные предположения о возможной функции данной "вмятины" (invagination) (если нет РСА данных о связывании какого-либо лнгаида).

Нами предложен следующий подход, названный "лепкой молекул" (clay modelling). Использование метода позволяет рассмотреть возможные модификации структуры при различных воздействиях на глобулу (в частности, химической или тепловой денатурации). Основная задачей является изготовление вручную пластилиновой модели, используя минимум графической информации с экрана. Модель должна отображать взаимное расположение элементов вторичной структуры глобулы-архитектуру белка и служить верным качественным приближением поверхности (то есть должны быть обнаруживаемы характерные элементы формы поверхности:выступы, впадлпы и плоские участки).

Глава 4. Строение, конформационный замок, связь свойств поверхности молекулы и активности для нескольких олигомерных ферментов.

В данной главе обсуждена форма макромолекул ферментов, структуры межбелковых контактов димеров, их связь с активным центром и проанализированы возможные механизмы инактивации щелочной фосфатазы из E.coli, алкоголь-дегидрогенаэы из печени лошади, енолазы из пекарских дрожжей и глнкогенфосфорилазы из мышц кролика.

В работе использованы следующие обозначения для элементов вторичной структуры: L(Loop) -петля, Н(НсПх)-альфа-спираль и S(Strand)-6eTa-стрэнд.

Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) катализирует гидролиз сложпых моноэфиров ортофосфорной кислоты. Из всех щелочных фосфатаз фермент из E.coli обладает наименьшей субстратной специфичностью. В бактериях фермент находится в периплазматическом пространтстве н отвечает за поставку неорганического фосфата для поддержания к леточного метаболизма.

На рис. 3 приведены проекции димера ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ из E.coli на плоскости, параллельные XY, YZ и XZ (использована система координат кристалла). Показаны обе глобулы, области межбелкового контакта и активного центра. Связывающие атомы аминокислот одной глобулы сгруппированы в участки, лежащие в грех различных плоскостях, названных нами "контактными участками".

Форма отдельной субъедипнцы может быть приближенно описана как "клиновидная". На одной из наклонных плоскостей клина располагаются три контактных межбелковых участка и части активного центра. Глобулы димера развернуты на 180 градусов. Два

пространственно разделеняих контактных участка (I и II) образованы петлями 1-29 обеих глобул, петле 1-29 одной глобулы комплементарны элементы вторичной структуры L 85-101 и LSH 422-447 второй глобулы. Петли 402-417 обеих глобул образуют участок Ш и содержат группы активного центра. Расстояние между С и N концами полипептидпой цепи приблизительно 30 А, С-конец расположен со стороны межбелкового контакта. Трехмерная модель димера, построенного из клинообразных субъединиц, приведена на рис. 4.

Рис. 3 Проекции димера щелочной фосфатазы из E.coli па плоскости, параллельные плоскостям а) XY; б) XZ. Приведены основные элементы вторичной структуры, находящиеся в межбелковом контакте.

Вычисления доступности растворителя показывают, что в активпом центре, или, точнее, "кармане", может помещаться только ион фосфата а остальная часть молекулы субстрата располагается снаружи глобулы.

Контактные участки I-II и IM идентичны я расположены со стороны оснований клинообразных субъединиц. Контакт III-III находится внутри днмерл вблизи активных центров обеих глобул. При анализе СТРОЕНИЯ КОНФОРМАЦИОННОГО ЗАМКА ДИМЕРЛ И АНАЛИЗЕ ВОЗМОЖНЫХ МЕХАНИЗМОВ ИНАКТИВАЦИИ предполагается, что два отрезка полнпетидной цепи (в данном случае, активного центра и межбелкопого контакта) могут считаться функционально связанными (то ее ть функция одного зависит от функции другого), если эти отрезки "с.чежны"по аминокислотой оследовательности. В случае щелочной фосфатазы было найдено несколько таких совпадений участков цепи, выполняющими различные фупкшш (как показано в табл. 1).

Табл. I

Элементы вторичной структуры, участвующие в межбелковом контакте и содержащие группы активного центра.

Втор, структура Группы Функция группы

активного центра в механизме фермента

Н 101 - 112 SER 102 OG1 Связывание фосфата

L 367 - 375 ASM 369 ND2 связывание Znl

L 367 - 375 HIS 370 NE2 связывание Znl

L 402 - 416 HIS 412 NE2 связывание Zn2

Рис. 4 Изображение модели молекулы щелочной фосфатазы из Е.coli, а) Вид со стороны активных центров: б)Вид со стороны контактного участка II.

Потеря активности при инактивации обусловлена, вероятно, смешением петли 402-417, содержащей HIS 412 активного центра. Петля 402-417 удерживается как межбелковыми взаимодействиями аминокислот gin 416 и glu 411, так и внутрибелковыми BaaiiMOfleScTBiiflMRgln 410, которые являются "ключевыми остатками" конформацкоиного замка. Наиболее вероятно, что контакт III разрушается последним, так как разрушение этого контактного участка приведет к потере каталитической активности.

Изучение структуры межбелкового контакта щелочной фосфатазы E.coli показало соответствие между минимальным числом стадий в кинетической схеме инактиваппи и числом контактных участков между глобулами димера.равного трем. Предполагаемый механизм инактивации включает в себя три стадии:

1. Развертывание петли 1-29:А (В) (I участок).

2. Развертывание петли 1-29:В (А) (II участок).

3. Развертывание петли 402-417:А и L 402-417:В (III участок), приводящее к распаду комлекса с цинком в активном центре.

Структурный анализ щелочной фосфатазы от E.coli фермента показал что Asp .31. находящийся в координационной сфере Mg расположен вблизи от межглобульного контакта, сформированного альфа-спиралью 54 - 66, взаимодействующей остатками Asp 55, Thr 59 и Arg 62 с остатком Gin 116 соседней субъедпницы. В отсутствии Mg альфа-спираль 54 - 66 сдвигается пол воздействием соседней субъединпцы. что может привести к медленному разрушению Ш-го участка контакта. Таким образом объясняется неактивностъ фермента при отсутствии нона мапшя в активном центре.

Изучение зависимости удельной каталитической активности щелочной фосфатазы от концентрации белка в растворе показало, что тетрамеры щелочной фосфатазы менее активны, чем димеры. Для определения СТРУКТУРНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОБРАЗОВАНИЯ ОЛИГОМЕРОВ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ E.COLI был использован модифицированный метод нахождения гидрофильных гг гидрофобных участков (patch) на поверхности белка и анализ молекулярных контактов в кристаллах.

Гидрофильный участок около SS-связи, образованной Cvs 286-Cys 336 располагается па "межбелковой поверхности" клина, но не участвует во взаимодействии глобул димера. Около этого участка также находится кристаллический межбелковый контакт (269-270). Изменение конформации LHL 259-298 может изменить активность димера из-за взаимодейтсвия S-S связи с Zn-связываюшей спиралью 325-333. Рядом с участок находятся остатки триптофана TRP 220 п TRP 268. Известно, что при образовании тегра.мера фосфатазы E.coli происходит изменение УФ-спектра раствора, что скорее всего связано с экранированием боковой цепи какого-то или каких-то остатков триптофана на поверхности. Это дает основания

предполагать большую вероятность, что тетрамер образуется за счет взаимодействия гидрофильных участков, при котором происходит экранирование ароматического ядра триптофана.

АЛКОГОЛЬДЕГИ ДРОГЕНАЗА ИЗ ПЕЧЕНИ ЛОШАДИ. Алкогольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1) является конечным ферментом гликолиза в одноклеточных и животных. Фермент катализирует взаимопревращение большого количества насыщенных, ненасыщенных и ароматических спиртов и соотвествующих кегонов и альдегидов.

Рис. 5 Изображение модели молекулы алкоголь-дегидрогеназы из печевп лошади. а)Вид со стороны активных центров димера. б) Вид со стороны групп Arg 101.

На рис. 5 приведено изображение модели молекулы. Центральная часть межбелкового контакта является расширенной бета-структурой. Боковые цепи групп Arg 101, находящихся на петлях L 92-129 обеих глобул, соединяют две глобулы по бокам. Гидрофобный карман образован аминокислотными группами, находящимися на трех элементах вторичной структуры, два из которых принадлежат одной глобуле, а один (Hei 30431") другой.

Ни один из элементов вторичной структуры, участвующий в образовании межбелкового контакта алкоголь-дегидрогеназы, не содержит групп активного центра. В то же время, гидрофобный "карман" (рис. 6) образован аминокислотными группами, находящимися на трех элементах вторичной структуры два из которых принадлежат одной глобуле, а один (Hei 304317) другой. Из рисунка видно, что удаление этой альфа-спирали приведет

к разрушению связывающего "кармана", из-за чего связывание субстрата станет невозможным. Так же как я для щелочной фосфатазы, для алкогольдегидрогеназы предлагается трехстадикиый механизм инактивации: 1. Разрушение связей петли Ь 92-129 одной глобулы. 2. Разрушение связей петли Ь 92-129 другой глобулы. 3. Разрушение связывающей гидрофобной впадины.

Рис. 6 Гидрофобный карман глобулы А димера. 1- Leu 57:А, 2- Leu 307:B,Leu 308:В, Leu 309:В, 3- Phe U0:A, Leu 1!2:A, 4- Leu 116:A.

ЕНОЛАЗА ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ.

Енолаза (КФ 4.2.1.11) из дрожжей Saccharomyces является ферментом спиртового брожения(глнколиза) и находится в цитозоле клеток бактерий и животных. Этот фермент катализирует дегидрирования 2-фосфо-О-глицерата до фосфоенолиирувата.

Молекула фермента-димер, в котором одна субъединица может быть получена из другой вращением на 90 град, и инверсией. Размеры субъединицы составляют 60 X 55 X 45 А. Каждая глобула построена из двух доменов. Меньший М-концевой домен содержит малую бета-

структуру, составленную из трех стрзндов (strand), а большой основой па "бета-бочке" (beta-barrel, бета-структура, замкнутая в кольцо). Активный центр расположен на карбоксильном краю "бочки".Часть малого, N-концевого домена и две длинные пеглидомена бочки образуют широкую щель, содержащую активный центр. В димере малый домен каждой глобулы полностью расположен на большом домене соседней глобулы. Малый и большой домены каждой из глобул соединены спиралью 402-417 соседней глобулы. Угол между осями спиралей 402-417 соседних глобул равен 90. Модель молекулы изображена на рис. 7.

Структурные данные позволяют предложить следующий механизм действия фермента (рис 8):

1.Связывание субстрата His 373, Arg 374, Ser 375 2.Закрытие подвижной петли активного цептра ("задвижки"), заключающееся в одновременном или последовательном движении остатков 36-44 петли и движении малого домена на "подвесках" ARG 14, LYS 102, ARG 119.

3.Ионизация отрываемого атома гидроксила субстрата подвижным и неподвижным атомами магния. 4.Отрыв гидроксила и протона и их

рекомбинация па группе Glu 168. Стадии 3,4 входят в цепь перераспределения связей.

При анализе СВЯЗИ МЕЖБЕЛКОВОГО КОНТАКТА И КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ было установлено, что при связывании субстрата каждой глобулой фермента происходит смещение малого домена относительно большого так, что сторона малого домепа, участвующая в межбелков ом контатке, пе смещается относительно большого домена, а в целом малый домен "качается" при катализе, приоткрывая промежуток между доменами, где находится активный центр. Смещение домена обусловлено связыванием субстрата.

(

Рис. 7 Изображение модели димера еыолазы пекарских дрожжей.

При удалении соседней глобулы, удерживающей два домена, соединенные спиралью 402-417 (рис. 7) со сторопы малой бета-сгруктуры это движение будет нарушено. Это приведет к изменению положения Ser 39, координирующего иоп Zn, нарушению протекании катализа с последующим разделением глобулы на домены. Так как при связывании субстрата образуются дополнительные связи между доменами, то, по все видимости, димер енолазы менее стабилен в своб одном

Glu 168 // С

Q^fO ^His 373 I \ Arg 374^

Участок связывания субстрата

-DPO,

Sec-575

'Asp 320

Glu 168

СН2

,■ -'"M д^

" ! \ ^ Glu 295 ,C<Í4 /?_ ; Y Asp 246

\b___pj i - "неподвижный"

/ H атом магния

''Nz Mg Ч,

Lys 345 H \ -------

Ser 39

пегли L(34,62)

Рис. 8 Предлагаемый механизм каталитического действия енолазы пекарских дрожжей.

состоянии, чем я состоянии со связанным субстратом. Поэтому весьма вероятно, что время жизни фермента in vivo a in vitro будет зависеть от концентрации субстрата.Мономеры в свободном состоянии, по всей видимости неактивны.

Характерной особенностью связи активного центра и межбелкового контакта является отсутствие смежных полипептидных отрезков. Эта функциональная связь осуществляется через более крупные изменения

структуры- через относительное смещение доменов. Так как всякое нарушение связи между доменами одной глобулы приведет к потере активности, в работе предложена не более чем двухсгадпйная схема инактивации:

[.Отсоединение малого домена одной глобулы, при котором большой домен удерживает домены соседа, а активность данной молекулы димера падает в два раза.

2. Аналогичное разрушение соседней глобулы и полная потеря активности.

ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗА ИЗ МЫШЩ КРОЛИКА.

Гликоген-фосфорилаза (КФ 2.4.1.1) является важным ферментом метаболизма Сахаров. Этот фермент находится в начале цепи реакций гликолиза и использует в качестве коферкента пиридоксальфосфат. Активность фосфорилазы регулируется как пост-трансляционными модификациями, так и аллостерически. AMP является активатором, в то время как ATP.ADP и глюкозо-б-фосфаг (G6P) являются лллостеряческимп ингибиторами. В клетке гликоген-фосфорилаза размещается на гранулах гликогена.

МОЛЕКУЛА МОНОМЕРА имеет 842 остатка и состоит из двух доменов приблизительно шарообразной формы. С- и N-конец расположены рядом, на боковой части N-концевого домена (домену соотвествуют остатки 1-500), в центральной части которого находятся несколько бета-структур. Другой домен (С-концевой.ориентировочно 500-842 остатки) имеет только однубега-структуру. С-концевой длинный отрезок цепи спускается с вершины С-концевого домена и располагается на N-копцевом. Общая архитектура напомипает архитектуру молекулы алкоголь-дегидрогеназы. Диаметр N-концевого домепа приблизительно 70 А, С-концевого-50 А. Оба домена немного сплюснуты в направлении их контакта (рис. 9). Два димера тетрамера образованы глобулами А,В и C,D. Запись AB=CD означает, что "коптакты АВ и CD образованы одними и теми же остатками глобулы". Также AC=BD a AD=BC. Таким образом, в тетрамере имеется три типа межглобульных контактов"АВ","АС" и "AD". Каждый из трех межбелковых коитактоп АВ,АС, и AD взаимодействует с таким же контактным участком соответствующей соседней глобулы.

При изготовлении модели димера можно обнаружить, что С-концевые домены двух глобул димера направлены в противоположные стороны. Соответственно, и активные центры глобул димера повернуты в разныестороны. По результатам электронной микроскопии, димер имеет форму вогнутой прямоугольной пластинки. Активные центры расположены на коротких сторонах этой пластинки.

Модель геграмера получается в результате совмещения участков типа "АС" и "AD" двух димеров. В центре тетрамера имеется отверстие между двумя "вогнутыми пластинками" димеров размером около 20 А.

На основе данных ряда известных РСА-структур гликогенфосфорилазы из мышц кролика, проведен подробный АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ

МЕХАНИЗМОВ активирования и пнгибированяя различными лигапдами, а также влияния гтосг-грансляционпых модификаций и связывания лиганлов

на протекапие инактивации фермента и равновесие димер-тетрамер. Обсужден вопрос взаимосвязи активного центра и межбелкового контакта.

Связь межбелкового контакта дпмсра и активного центра

гликогенфосфорилазы осуществляется следующим образом. Отрезок полипептидной цепи (282,286) сайта актиппого цептра находится относительно близко от отрезка (265,275) контакта АВ. Контакт отделен от сайта связывания бета-стрзндом 5(276,279), находящимся на краю бета-структуры и могущем легко отделял,ся при достаточной силе воздействия.

Рис. 9 Изображение модели глобулы мономера гликогенфосфорилазы с указанными участками межбелковых контактов в димере и тетрамере: а) нид со стороны межбелкового контакта АВ; б) вид со стороны межбелкового коитакта АС.

Рядом с каждым из отрезков межбелкового контакта имеются сайты М-гликозилирования, расположенные рядом с сайтами активации РКС-кпнаэы. Межбелковый контакт димера связывает различные отрезки цепи глобулы -отрезок (10,40) и отрезок (265,275).

Результаты сайт-анализа показывают, что при малых изменениях конформации, подобным происходящим при фосфорилировавип удаление

Бета — структура малого домена

а)

<5-3

одной из глобул димера может приводить к увеличению активности фермента. При наличии присоединенных к сайтам N-гликозилирования цепей олигосахарндов, обр азующих множество водородных связей с растворителем, конформационные изменения будут намного более значительны, что может привести к разрушению некоторых бета-структур К-концевого домена, то есть сильному изменению конформации всей глобулы и, следовательно, падению активности. Падение активности при денатурации будет связано с частичным разрушением бета-структуры, содержащей стрэнд S(276,279).

Вследствие N-гликозялирования межбелковых сайтов активность мономера и получаемые кривые термоинактивации должны в сильной степени зависеть от меры "очистки" фермента, то есть его деглнкоэплировання, и, в меньшей мере, дефосфорилнрования. При полном удалении всех олигосахарндов есть некоторая вероятность того, что мономеры будуттакже активны, и, следовательно, термоннактивациоиная кнвегическаясхема, предполагающая неакгивность моно меров, в этом случае не может быть применима к описанию процесса термоинактивации димера гликоген-фосфорилазы.

ВЫВОДЫ.

I. Разработан комплекс программ для анализа белковых структур с целью исследования различных структурных аспектов ферментативного катализа.

2.Рассмотрены структурные аспекты взаимосвязи между активным "центром" белка и межбелковым контактом.

3. Результаты работы позволяют выделить наиболее структурно значимые аминокислотные остатки, что может оказаться полезпым для белковой инженерии посредством мутагенеза отдельных остатков.

4. Показано, что различные воздействия па молекулу белка структурной точки зрения эквивалентны и сводятся к частичному развертыванию или свертыванию находящихся на поверхности петель и топологических мотивов. Это позволяет использовать результаты различных видов кинетических исследований ферментов для нахождения взаимосвязи структуры и активности.

5. Использование трех различных методов структурного анализа поверхности белковой молекулы, и, в частности, поверхности межбелкового контакта, позволяет судить о возможных функциях различных участков поверхности белковой молекулы и рассматривать структурные модели образования олигомеров более сложного состава.

6. Изучение структуры межбелкового контакта щелочной фосфатазы E.coli показало соответствие между минимальным числом стадий в кинетической схеме инактивации и числом контактных участков между глобулами димера, равного трем. Предложен механизм диссоциативной инактивации, включающий в себя три стадии:

1. Развертывание петли 1-29:Л (В) (I участок).

2. Развертывание петли 1-29:В (Л) (II участок).

3. Развертывание петли 402-417:А и L 402-417:В (III участок),

приводящее к распаду комлекса с цинком в активном центре.

7. С помощью использования модифицированного метода нахождения гидрофильных и гидрофобных участков (patch) па поверхности белка и анализа молекулярпых контактов в кристаллах определены возможпьге участки связывания димера в тетрамеры и обсуждена связь структуры тетрамера с активностью.

8. На основе анализа структурных данных для алкогольдегидрогеназы из печепи лошади предложен трехстадийпый механизм инактивации:

1. Разрушение связей петли L 92-129 одной глобулы.

2. Разрушение связей петли L 92-129 другой глобулы.

3. Разрушение связывающей гидрофобной впадины.

9. Рассмотрен структурно и молекулярно-биологически обоснованный механизм действия енолазы из пекарских дрожжей.

10. Для еполазм из пекарских дрожжей предоложея двухстадийный механизм инактивации:

1 .Отсоединение малого домена одной глобулы, при этом большой домен удерживает домены соседа, а активность данной молекулы димера падает в два раза.

2.Разрушение соседней глобулы и полная потеря активности.

11. Для гликоген-фосфорилазы из мышц кролика проведеп разносторонний аяалнз взаимосвязи активности и различных влияний па структуру фермента:связывания аллостерических ингибиторов и активаторов, пост-трансляционных модификаций, инактивирующих воздействий (гермо- и хемоденатурация). Обсужден вопрос взаимосвязи активного центра и межбелкового контакта и установлен механизм уменьшения активности при диссоциативной инактивации фермента.

Публикации.

1. Торшия И.Ю., Полторак О.М., Чухрай Е.С. Структурные аспекты термоинактивации димерных ферментов: Часть I: Концепция конформацпонного заика и исследование структуры межбелковых контактов^Вестн. Моск. Ун-та, сер. 2. Химия. 1996. N 4. с. 329.

2. Торгпин И.Ю., Полторак О.М., Чухрай Е.С. Структурные аспекты термоинактивацяи димерных ферментов: Часть II: Межбелковый контакт щелочной фосфатазы E.coli и механизм термоипактивации димера.// Веста. Моск. Ун-га, сер. 2. Химия. 1996. N 5. с. 431.

3. Торшия И.Ю., Полторак О.М., Чухрай Е.С. Расчет позиций атомов водорода в белках и геометрические критерии существования водородной связи в белках.// Веста. Моск. Ун-та, сер. 2 Химия. 1996. N 4 с. 335.

4. О.M. Полторак, Е.С. Чухрай, И.Ю. Торшин "Конформацнонный замок днмернмх ферментов и его взаимосвязь с активными центрами"// Сб. докладов второго съезда Биохимического Общества РАН, с. 10.

5. О.М. Poltorak, E.S. Chukhray, I.Y. Torshin, L.F. Atyaksheva, M.D. Trevan, M.F. Chaplin. Catalytic properties, stability and the structure of the conformational lock in the alkaline phosphatase from E.coli.// Archives of Biophysics and

Biochemistry,1997,