Ферментативный синтез полианилина, катализируемый оксидоредуктазами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

КАРАМЫШЕВ Алексей Владимирович

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПОЛИАНИЛИНА, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ОКСИДОРЕДУКТАЗАМИ

02 00 15 - катализ 03 00 23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003071291

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич

Официальные оппоненты

доктор химических паук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук Сергеев Владимир Глебович

Ведущая организация

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Защита состоится « 29 » мая 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1 стр 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан 27 апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И К Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В 2000-м году Нобелевская премия по химии была присуждена исследователям Хидеки Сиракава (Hideki Shirakawa, Япония), Алану МакДиамиду (Alan G McDiarmid, США) и Алану Хигеру (Alan J Heeger, США) за "открытие и развитие области электроиопроводимых полимеров' Электропроводящие полимеры образовали новый класс "синтетических металлов", обладая исключительными свойствами в сравнении с низкомолекулярными полупроводниками На настоящий момент они нашли широкое применение в различных областях науки и техники от микроэлектроники (батареи, оптические мониторы) до аналитической практики (сенсоры) Полианилин привлекает наибольшее внимание благодаря своей высокой стабильности и хорошим проводящим характеристикам Более того, в присутствии хирального индуктора (например, энантиомеров камфорсульфоновой кислоты) он способен образовывать оптически активные вторичные структуры, что может позволить существенно расширить область применения этого полимера, в частности в качестве селектора для разделения оптически активных соединений К сожалению, основные способы получения (химический и электрохимический) полианилина обладают определенными недостатками, что вызывает необходимость в разработке альтернативных подходов

В последние годы появляется все больше работ, посвященных ферментативной полимеризации, как альтернативному способу получения полимеров Ранее была показана принципиальная возможность проведения ферментативной полимеризации анилина с образованием электропроводящих полиэлектролитных комплексов на основе полианилииа при использовании пероксидазы хрена как биокатализатора Однако, как оказалось, в условиях, необходимых для синтеза (кислая среда), этот ферментный препарат быстро теряет свою активность Таким образом, становятся понятным актуальность диссертационной работы, посвященной ферментативному синтезу полианилина, катализируемого кислотос обильными оксидоредуктазами

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явился поиск высокоактивных и кислотостабильных оксидоредуктаз, способных в экологически чистых условиях эффективного катализировать полимеризацию анилина с образованием электропроводящего и оптически активного полианилина

Основными задачами настоящей работы являлись ■S Исследование возможности использования лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской пальмы в качестве биокатализаторов для проведения ферментативного синтеза полианилина

S Оптимизация методик ферментативного синтеза проводящих полиэлектролитных комплексов полианилина с сульфополистиролом и поли(2-акриламидо-2 -метил-1 -лропан)сульфокислота

S Изучение ферментативного синтеза хирального полианилина, катализируемого пероксидазой пальмы, на мицеллах

додецилбензолсульфоновой кислоты

S Определение физико-химических свойств и структуры полианилина, полученного ферментативным путем

Научная новизна работы и практическая значимость работы.

Впервые проведен ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина с использованием двух кислотостабильных оксидоредукгаз - лакказы Conolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской Показано, что в процессе реакции образуется проводящим полианилин с улучшенными характеристиками в экологически чистых условиях. Впервые проведен ферментативный синтез хирального полианилина на мицеллах додецалбензолсульфоновой кислоты, катализируемый пероксидазой пальмы Показано, что хиральный полианилин может образовываться в отсутствие хирального индуктора (энантиомера камфорсульфонсвой кислоты) при ферментативной полимеризации анилина Изучена морфология ферментативно синтезированного хирального полианилина, представляющего из себя пористые рисоподобные частицы длиной порядка 180нм.

Апробация работы.

Основные результаты работы представлены на международных конференциях "Биокатализ-2002" (Москва, Россия, 2002), Конференция молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им И В Березина "Инженерная энзимология" (Москва, Россия, 2002-2003), "Биотехнология состояние и перспективы развития", (Москва, Россия, 2002, 2003 и 2007), "1 European Chemistry Congress, Polymer architecture - from structure to functional control" (Будапешт, Венгрия, 2006) и EUROBIC8 (Авейро, Португалия, 2006)

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 5 тезисов докладов на м ежду народных конференциях

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 95 ссылок Работа изложена на страницах 105 и включает в себя 38 рисунков и 6 таблиц

Сокращения, принятые в тексте.

ПАНИ - полианилин, ПП - пероксидаза из листьев Королевской пальмы, СПС - сульфополистирол, ПАМПС - поли(2-акриламидо-2-мегил-1-пропан)сульфокислота, ДБСК - додецилбензолсульфо-кислота, КСК -камфорсульфоновая кислота

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Ферментативный метод синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего нолианилина, используя грибную лакказу и пероксидазу пальмы в качестве биокатализаторов.

Так как для образования полиэлектролитного комплекса ПАНИ с анионной полимерной матрицей синтез ПАНИ необходимо проводить при рН ниже рКа аминогруппы анилина (4 6), стабильность фермента в кислых условиях являлась обязательной На рис 1 представлены рН зависимости стабильности пяти различных пероксидаз растений Видно, что при кислых рН наиболее стабильной является пероксидаза, выделеная из листьев Королевской пальмы Поэтому в качестве одного из используемых биокатализаторов ферментативной полимеризации анилина нами был выбран этот фермент Другим ферментом, исользованным нами в синтезе ПАНИ, была кислотостабильная лакказа Сопо1ш /гг/-.?//;«.

В качестве полимерных матриц для синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего ПАНИ использовались СПС и ПАМПС Преимущество использования СПС и ПАМПС заключается прежде в том, что ситезитующийся полианилин, взаимодействуя с такими полимерами, образует стабильные дисперсные растворы полиэлектролитных комплексов, тем самым препятствуя агрегации полианилиновых молекул и выпадению их в осадок Кроме того, сульфосодержащие матрицы способствуют ориентации молекул анилина таким образом, чтобы полимеризация анилина проходила по

механизму «голова - хвост» с образованием линейных молекул полианилина Более того,

сульфогруппы, содержащиеся в СПС и ПАМПС, допируют образующийся полианилин, делая его

электропроводящим

Для оптимизации условий ферментативного синтеза полианилина были проварьированны кислотность Рис 2 рНммсячвстьреакиняфсжеитатнв™™ синтез СрвДЫ И КОНЦМПраЦИИ реаПфуЮЩИХ

полиэлектроиггного комплекса ПАНИ/ПАМПС, катализи- ВбЩеСТВ руемого ПП

На рис 2 представлена рН-зависимость реакции ферментативной полимеризации анилина, катализируемая ПП рН-зависимость имеет колоколообразный вид, а оптимальное значение рН

рН

Рис 1 рН-стабильность раститечьных пероксядчз

2 5 3,0 3,5 4Л 4,5

рН

в этом случае равно 3,5 Аналогичный характер носила и рН-зависимость ферментативной полимеризации

анилина, катализируемой лакказой, только в этом случае рН-оптимум лежал при рН 3,5 - 3,7

Зависимости концентрации анилина на скорость ферментативного синтеза ПАНИ для двух оксидоредуктаз несколько отличались (рис 3) Так, при повышении концентрации анилина до 75 мМ в реакции, катализируемой лакказой, наблюдается повышение скорости реакции Дальнейшее же увеличение концентрации падению скорости реакции:

[анялии], мМ

Рис 3 Влияние концентрации анилина на ферментативный синтез ПАНИ, катализируемый лакказой (черные кружки) и ПИ (белые кружки)

анилина приводило к что, по-видимому, было вызвано субстратным ингибированием лакказы Если же в качестве биокатализатора использовалась ПП, то эффекта ингибирования фермента анилином не наблюдалосъся во всем интервале исследуемых концентраций, и скорость реакции ферментативного синтеза ПАНИ увеличивается с увеличением концентрации анилина, что позволяет использовать 1111 с максимальной эффективностью

С увеличением концентрации полимерной матрицы происходило снижение скорости ферментативной полимеризации, катализируемой как ПП, так и лакказой (рис 4) Это, вероятно, объясняется связыванием анилина с СПС и уменьшением концентрации свободного анилина в реакционной среде, который может участвовать в каталитическом цикле ферментов Необходимо также отметить, что существенным является не просто концентрация матрицы в растворе, а соотношение концентраций

[СПС], мМ

Рис 4 В'шяние концентрации полимерной матрицы на реакцию ферментативного синтеза полиэлсктро-литного комплекса ПАНИ, катализируемую лакказой

анилина и мономерного звена полимергой матрицы Так, если это соотношение было меньше 1 1, то образывались стабильные дисперсионные растворы полиэлектролитных комплексов ПАНИ, тогда как при соотношении выше 1.1 наблюдалось выпадение ПАНИ в осадок

Когда в качестве биокатализатора используется 1111, то в роли окислителя выступает пероксид водорода, который, как известно, при высоких концентрациях ингибир> ет пероксидазу На рис 5 (А) представлена зависимость скорости реакции ферментативного синтеза ПАНИ, катализируемого ПП, от концентрации Н2О2. При концентрации Н2О2 ниже 0,5 мМ скорость реакции растет с увеличением концентрации Н202 При более высоких концентрациях окислителя скорость реакции начинает падать Если же

0,25

18 15

[Н202], мМ

для той же реакции рассматривать зависимость выхода продукта реакции от концентрации Н202 (рис 5 (Б)), то выход продукта увеличивается с увеличением концентрации

окислителя вплоть до 5-15 мМ и лишь при более высоких концентрациях реакция резко

Обнаруженная объясниться тем, концентрации НгОг реакция идет по «пинг-понг» пероксидазного

снижается зависимость что при ниже 0,5 мМ традиционному механизму катализа, где

!Н202], ММ

Рис 5 Влияние концентрации пероксида водорода на скорость реакции (А) и выход продукта (Б) при ферментативном синтезе полиэлектролитного комплекса ПАНИ/СПС, катализируемом ПП

(5)) и реакция прекращается

промежуточными продуктами

пероксидазы (Е) являются активные соединения Е1 и Е2 (сх 1, уравнения (1) - (3)) Затем в интервале концентраций окислитзля 0,5 - 15 мМ, когда скорость реакции начинает уже падает, а выход продукта еще увеличивается, происходит

образование соединения Е3 (сх 1, уравнение (4)), которое хотя и менее активно, чем Е[ и Ег, но все же окисляет анилин И наконец при концентрациях пероксида водорода выше 15 мМ происходит образование неактивной формы пероксидазы -бердопротеина-670 (сх 1, уравнение

Е + Н202 -> Е, + Н20 (1)

Е1 + в -> Е2 + Р (2)

Е2 + Б Е + Р (3)

Е2 + н202 -> Е3 + Н20 (4)

Е, + 11202 (Е, Н202) -> Р-670 (5)

Схема 1 Каталитический цикл пероксидазы и реакции ее инактивации

На рис 6 (А) представлена кинетика реакции полимеризации анилина, катализируемой лакказой Как видно, реакция продолжалась в течение б суток, и практически все это время фермент оставался в активном состоянии Вместе с тем, несмотря на высокую концентрацию в системе фермента, скорость реакции оставалась невысокой, что связано с низкой концентрацией

60

50

40

о

о

•Ч- 30

20

10

6 9

1, ДНИ

растворенного в реакционной среде молекулярного кислорода (0,2 мМ), играющего роль окислителя при полимеризации анилина В то же время, при ферментативном синтезе полианилина, катализируемом ГТП, мы можем использовать более высокие концентрации окислителя (псроксида водорода) и, как видно из кинетической кривой этой реакции (рис 6 (Б)), скорость процесса при этом значительно возрастает Более того, после однократного добавления Н202 реакция заканчивалась спустя 10 мин, и при добавлении новой порции окислителя вновь продолжается, что говорит о сохранении ферментом своей активности и о возможности проведения максимально эффективною окисления анилина

Таким образом, нам удалось оптимизировать условия

ферментативного синтеза

полиэлектролитных комплексов

ПАНИ, с использованием в качестве биокатализаторов лакказы и ПП

Рис. 6 Кинетика ферментативного синтеза тлнэлектро-

Результаты оптимизации представлены ттют коматсксГгш вд'спс, юпа-пшфуемого лаки

ЗОЙ (А) и ПП (Б)

Ь, мин

втабл 1

Таблица 1 Оптимальные условия синтеза полиэлектролитных комплексов полианилина

Фермент рн Анилин, чМ СПС, мМ ПАМПС, мМ н202, мМ

лакказа 3 7 50 50 - -

ПП 3 5 100 100 - 5

ПП 2 8 50 - 50 0 25

II. Физико-химические характеристики полиэлектролитных комплексов на основе полнанилина, синтезированных с помощью

оксндоред)ктаз.

X, нм

1*00 X, им

После оптимизации условий ферментативного синтеза

полиэлектролитных комплексов ПАНИ с помощью оксидорсдуктаз нами были приготовлены образцы комплексов ПАНИ/СПС, полученные с помощью лакказы и ПП, и комплекс ПАНИ/ПАМПС, полученный в присутствии ПП

Часто основной характеристикой ПАНИ является его электронный спектр На рис 7 (А) представлен типичный электронный спектр в УФ- и видимой областях для растворов фермснтативно синтезированных

полиэлектролитных комплексов на основе ПАНИ Этот спектр имеет три характерных пика поглощения Первый пик в районе длин волн 320-360 нм соответствует п-л* электронному переходу в бензоидиом фрагменте ПАНИ Второй (400-420 нм) и третий (760-800 нм) пики характеризуют степень допирования и формирование полярона с компактной конформации цепей электропроводящего ПАНИ соответственно Следует заметить, что первые два пика накладываются друг на друга и образуют один широкий пик, образование которого многократно было описано в литературе Единственное различие электронных спектров поииэлектролитных комплексов ПАНИ, синтезированных разными оксидо-редуктазами, заключается в том, что длинноволновый пик в случае лакказы для ПАНИ лежал при 760 нм, в то время в случае ПГ1 этот пик смещается к 800 нм Это говорит о том, что при катализе | ПП синтезируется более допированный | ПАНИ §

При титровании полиэлектролитного комплекса ПАНИ соляной ______ ____

кислотой и гидроксидом натрия мо 5,0 ,0° ш

у } НМ

наблюдалось изменение формы спектра

_________ /„ о\ . Рис 8 Изменение спектров политтектпепитного ком-

поглощения (рис 8) Так, при КИСЛЫХ ПЛСкса ПАНИ/СНС, синтезированного с помощью лак-рН изменений электронного спектра ка1ы'в зависимости от Рп

Рис 7 Электронные спектры рзствора (А) н тенки (Б) полиэлектрочитнего комплекса ПАНИ/ПАМПС, синтезированного с помощью ПП

практически не наблюдалось вплоть до рН 6-8, что говорит о том, что ПАНИ находился в протонированном допированном состоянии Как только рН среды превышает этот интервал, пики при 420 и 760 нм исчезают, и появляется новый пик поглощения при 560 нм, что заметно даже визуально, т к раствор становится голубого и даже фиолетового цвета вместо зеленого Такие изменения связаны с переходом полианилина в дедопированное состояние (сх 2)

э мерял ьдиновая соль

эмерапьдиновое основание Схема 2 Кислотное допирование ПАНИ

Спектральные свойства полиэлектролитных комплексов ПАНИ были изучены не только в виде дисперсионных растворов, но и в виде пленок Электронные спектры комплексов в растворах и в высушенном состоянии не имели принципиальных различий (рис 7) Анализируя спектры пленок в ближней ИК-области (рис 7 (Б)) важно отметить наличие, хотя и невысокого, поглощения при длинах волн, выше 1300 нм, что в литературе трактуется как наличие делокализованных неспаренных электронов, ответственных за проводимость

Наличие неспаренных электронов в образцах синтезированных комплексов ПАНИ было подтверждено методом ЭПР На рис. 9 представлен типичный спектр ЭПР растворов полиэлектролитных комплексов ПАНИ независимо от используемой полимерной матрицы и используемого фермента Значение g-фaктopa для комплексов полианилина составило 2 002, которое характерно для свободных электронов

Электропроводимость комплексов

Рис. 9- ЭПР-снектр полиэлектролитного комплекса ПАНИ / СПС , синтезированного с помощью ПП

полианилина различается в зависимости от способа их получения Так для комплексов ПАНИ, синтезированных с помощью лакказы, проводимость составила 0,2 мС/см Для образцов комплексов ПАНИ, синтезированных с помощью ПП, проводимость достигала 11,2 мС/см

Совместно с д х н И Н Курочкиным и его сотрудниками, была изучена морфология полиэлектролитных комплексов ПАНИ/ПАМПС с помощью атомной силовой микроскопии Как показано на рис 10 (А), «чистый» ПАМПС (контроль) абсорбируется на графитовой подложке, образуя тонкую пленку Для полиэлектролитных комплексов ПАНИ/ПАМПС также наблюдалось образование тонких пленок ПАМПС с агрегированными молекулами полианилина (рис 10 (Б)) Эти агрегаты полианилина локализованы на поверхности ПАМПС, не организуя при этом единую полианилиновую цепь, так как агрегаты наночастиц ПАНИ достаточно удалены друг от друга Размер наночастиц ПАНИ зависит от исходной концентрации ПАМПС При высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС к анилину -11) размер частиц ПАНИ составил порядка 10-15 нм, а при низком содержании

ПАМПС (1 10)--25 нм Таким образом, повышение концен фации ПАМПС

приводило к увеличению количества сайтов инициации образования полианилина, что приводило к образованию более мелких частиц ПАНИ, те изменяя концентрацию ПАМПС, можно варьировать размер образующихся частиц ПАНИ

Наиболее яркие отличия между полиэлектролитными комплексами с различным содержанием ПАМПС были обнаружены при изучении влияния полимерной матрицы на проводимость пленок полианилина Как видно из данных рис. 11, с увеличением содержания ПАМПС происходит электропроводимости электропроводимости ПАМПС/ПАНИ согласовывалось с полученными по изучению их морфологии

снижение Изменение комплексов хорошо данными,

15 2 5 3Í

1ПАМНС]/[апи шм)

Рис 11 Зависимость проводимости полголсктрочитных комптексов ПАНИ, синтезированных с помощью ПП, от содержания в ни* полимерной матрицы

Рис 10: Морфология комплекса полианнлин/ПАМПС, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии (А) - ПАМПС (контороль); (Б) - комплекс полианилин/ПАМПС, полученный ферментативно с помощью ПП при молярном соо! ношении концентраций мономерного звена ПАМПС к анилину 1.5.

Влияние концентрации ПАМПС в реакционной среде на проводимость синтезированных комплексов ПАНИ можно объяснить тем, чго в ходе реакции, когда содержание полимерной матрицы велико, молекулы мономерного анилина равномерно распределяются на них и, тем самым, на одной молекуле ПАМПС количество сорбированных молекул анилина невысоко Это должно приводит к тому, что при большом количестве центров инициации полимерных цепей должны формироваться короткие цепи полианилина В случае же низкой концентрации ПАМПС в реакционной среде гго тем же причинам должны формироваться более длинные цепи ПАНИ, и, следовательно, должна наблюдаться и более высокая проводимость.

III. Синтез хиралыюго полианилина на мицеллах ДБСК, катализируемый ПП

Для проведения ферментативного синтеза хорального полианилина в качестве матрицы были выбраны мицеллы ДБСК, способные не только ориентировать анилин с получением линейных молекул полианилина, но и допировать его Следует отметить, что ДБСК, как и другие детергенты, может разрушать третичную нативную структуру фермента и приводить к его инактивации Поэтому перед началом работы с ферментативным синтезом хирального полианилина было определено влияние ДБСК на активность пероксидаз Для этого были определены константы скорости реакции второго порядка (к) для реакции окисления о-дианизидин пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой хрена (ПХ) и ПП, в присутствии ДБСК (17мМ) (табл 2)

Табл 2 Влияние ДБСК на каталитическую активность ПХ и ПП

фермент Оптимальные условия для каташза ПП и ПХ к, М"'с"' *

[ДБСК], мМ [Н202], мМ [о-дианизидин], мМ

ПХ - 1.43 0.12 2,9 х 106

ПП - 4 20 0.12 8,9 х 10*

ПХ 17 0 72 04 1,6 х 10®

ПП 17 1.3 0.4 2,7 х 106

Как видно из табл. 2, в отсутствие ДБСК ПП - более активный биокатализатор по сравнению с ПХ Введение в реакционную смесь ДБСК частично инактивирует обе пероксидазы, приводя к 2-3-х кратному снижению

¡"А: 4 »ИМ®-

''Ч1, а■■ V «V» л ' ' -Л < 5» - •

> к, •

- — - /¿./„л-. ... _

чГ г

, .

¿1 "'.тл';'

Рис. пая

12 Предположитель-вторичная структура

хирального полианилина

каталитической активности обоих ферментов Эти результаты также показывают, что в присутствии ДБСК ГШ проявляет такую же активность, как ПХ в отсутствие ДБСК. Полученные результаты открывают возможность использования ПП в качестве биокатализатора при синтезе хирального полианилина на мицеллах ДБСК

В соответствии с литературными данными для образования хиральных структур ПАНИ в реакционную смесь вводились энантиомеры камфорсульфоновой кислоты (КСК) как индукторы хиральности

Поскольку концентрации анилина, КСК и ДБСК могут существенно влиять на эффективность мицеллярного ферментативного синтеза ПАНИ, была проведена оптимизация условий синтеза Для оптимизации использовали подход многофакторного планирования эксперимента с тремя независимыми компонентами (анилин, КСК и ДБСК), позволяющий оценить не только влияние каждого отдельного компонента, но и их взаимное влияние Область варьирования концентраций каждого компонента представлена в табл 3. Таким образом, согласно теории построения многофакторного эксперимента были получены 14 образцов полианилина (табл 4)

Сравнение спектров кругового дихроизма (КД-спектры любезно были сняты к ф -м н Лобачевым В М (Институт молекулярной биологии им Энгельгарда РАН)) полученных образцов ПАНИ показало, что хиралыгосгь полианилина в

значительной степени зависит о г условий синтеза Некоторые из полученных образцов имели КД спектр в видимой области, характерный для хирального полианилина (рис 12) В литературе предполагается, что оптическая активность полианилина обусловлена образованием спиралевидной конформации полианилиновых цепей (рис 13) Важно подчеркнуть, что КД-спектры образцов полианилина, синтезированных в присутствии (Я)-КСК и (Б)-КСК, были идентичны Это говорит о том, что в ходе ферментативной реакции образуется спиралевидный ПАНИ, закрученный в одну и ту же сторону Подобный эффект уже был ранее описан в литературе при ферментативном синтезе полиэлектролитных комплексов хирального полианилина с СПС.

Рис 13 КД-спнсгр хирального ПАНИ, синтезированного на мицеллах ДБСК с помощью ПП

Таблица 3: Уровни варьирования концентраций компонентов при оптимизации условии ферментативного синтеза хирального полианилина в мицеллах ДБСК в

Компоненты Уровни

Ннжннй (-1) Центр (0) Верхний (+1)

аннлнн, мМ ( X.) 75 1125 150

КСК, мМ (Х2) 0 75 150

ДБСК, мМ ( Хз) 12 17 22

Таблица 4: План многофакторного эксперимента по оптимизации условий ферментативного синтеза хирального полианилпна в мицеллах ДБСК в присутствии иероксидазы пальмы. _

Помер Уровни факторов

эксперимента X, х2 1 Хз .

Основной эксперимент

1 -1 -1 -1

2 +1 -1 -1

3 -1 +1 -1

4 +1 +1 -1

5 -1 -1 и

6 +1 -1 +1

7 -1 +1 +1

8 1-1 +1 +1

Дополнительный эксперимент

9 -1 0 0

10 н 0 0

11 0 -1 0

12 0 +1 0

13 0 0 -1

14 0 0 +1

Обработка результатов эксперимента с многофакторным планированием позволила получить следующую зависимость молярной эллиптичности ([0]) ПАНИ от варьируемых параметров (с погрешностью до 15%)

[0] = -0 1 [анилин]2 - 0 01 [анилин] [КСК] - 0 02[КСК]2 + 0 003[КСК][ДБСК] + 5 8[ДБСК]2 +0 005[анилин][ДБСК]+ 23[анилин]+ 2 8[КСК] +193[ДБСК] - 2583

Из полученного уравнения видно, что каждый из компонентов оказывает разное влияние на формирование хиральности полианилина Дифференцирование полученной функции по каждому из параметров и приравнивание полученных производных к нулю позволили вычислить оптимальные условия ферментативного синтеза хирального полианилина, которые оказались следующими 125 мМ анилина, 17 мМ ДБСК и 47 мМ КСК

Наибольшей хиральностыо

обладали образцы полианилина 2, 6, 10, И, 13 (рис 14) В соответствии с разчитанпым уравнением все высокохиральные образцы ПАНИ были синтезированы либо в отсутствие, либо в присутствии низких концентрациях КСК Из этого следует, что введение КСК в реакцию ферментативной почимеризации

анилина приводит не к увеличению хиральности, как описано для

Рис 14 Зависимость молярной эллиптичности (чер- химичеСКОГО И ЭЛеКТрОХИМИЧеСКОГО

ныс стозбпы) и площади ЭПР-спектра (серые столб- 1

цы) от условий ферментативного синтеза ПАНИ СИНТеЗОВ ОПТИЧеСКИ ЭКТИВНОГО

(согласно табл 4) полианилина, а к ухудшению

оптических характеристик образующегося ПАНИ Возможно, в качестве индуктора хиральности образующегося полианилина выступали либо хиральные молекулы ПП, либо мицеллы ДБСК, структурируя на своей поверхности определенным образом полимерные цепи полианилина Ранее образование хиральной третичной структуры на мицеллах ДБСК было описано и детально изучено на примере другого электропроводящего полимера (политиофена)

Сравнение значений площади ЭГГР-спектров и молярной эллиптичности полученных образцов полианилина (рис 14) не позволило выявить никакого соответствия между этими параметрами Отсюда следует, что оптимальные условия для синтеза электропроводящего полианилина и хирального полианилина различны, что необходимо учитывать при синтезе полианилинов с желаемыми свойствами

На рис 15 представлены два вида спектров в области УФ, видимого и ближнего ИК света, которые регистрировались для полианилина, ферментативно синтезированного при варьировании концентраций компонентов реакционной смеси Как хорошо видно, эти спектры являются

Л

J

)0 И 12 13 14

номер образца потнаншина

типичными для дотированной формы полианилина Все спектры имеют пик поглощения в области 400-415 нм, свидетельствующий об уровне допирования и образовании полярона полианилина Основные различия в электронных спектрах наблюдались в длинноволновой области Так электронные спектры для всех образцов,

синтезированных при самой низкой концентрации анилина (75 мМ),

ИМеЛИ ПИК ПОГЛОЩенИЯ В районе Рис ,5 электронные спектры образцов ПАНИ, еннте-800 нм И небольшое поглощение В зированкых на мицелла* ДБСК с помощью ПП области ближнего ИК света, что

свидетельствует о формировании компактной конформации цепей ПАНИ В противоположность этому, электронные спектры всех остальных образцов демонстрировали невысокое поглощение в районе 800 нм и значительным поглощение в области ближнего ИК. Этот факт свидетельствует о существенной делокализации электронов и формировании развернутой конформации полианилиновых цепей. Следует обратить внимание, что формирование развернутой конформации полианилина не наблюдалось при ферментативном синтезе полианилина на полимерных матрицах СПС и ПАМПС

Морфология полученных образцов полианилина была изучена методами трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) совместно с проф В Ю Поляковым (ИФХБ им Белозерского, МГУ им Ломоносова) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) совместно с А Н Катасовой (Институт геохимии и аналитической химии им Вернадского РАН) (рис 16) Было установлено, что все полученные образцы имели одинаковую морфологию вне зависимости от условий синтеза На рис 16 (А) видно, что агрегаты полианилина представляют из себя отдельные 'рисоподобные' частицы, размеры которых были равны 140 - 180 нм в длину и 70-100 нм в ширину Подобные структуры уже были описаны ранее для полианилиновых агрегатов Более того, СЭМ позволила показать, что поверхность наночастиц полианилина пористая (рис 16 (Б))

I \ I \ I \ \

А

400 600 800 1000 1200

X, Нм

Щв""""' I

Г......

I - .

Л!

> ^ "I ' 7 » ' 1чк! * •

- ¿¿¿г*

' Гй г ь*?-. -ч ■

'11

I I

»Л'1 ^ 7 я

Рис 16 Морфология образцов ПАНИ, полученных на мицеллах ДБСК с помощью ПП (А) - ТЭМ, (Б) - СЭМ

выводы

1 Разработан ферментативный экологически чистый метод полимеризации анилина в присутствии водорастворимого полимера (СПС и ПАМПС) для получения полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина В качестве биокатализаторов применены кислотостабильные препараты грибной лакказы (Coriolus hirsitus) и пероксидазы из листьев Королевской пальмы Варьируя концентрации реагирующих веществ и кислотность реакционной среды, оптимизированы условия ферментативного синтеза комплексов полианилина Исследована кинетика синтеза полианилина, катализируемого обоими ферментами

2 Используя спектральные методы, охарактеризованы препараты ферментативно синтезированного полианилина Показано, что электронные спектры в УФ-, видимой и ближнем ИК- областях и спектры ЭПР химически и ферментативного синтезированных комплексов полианилина практически идентичны Найдено, что степень допированности зарегистрирована выше для препаратов полианилина, полученного при синтезе, катализируемом пероксидазой пальмы, чем при катализе лакказой

3 Методом атомно-силовой микроскопии исследована морфология полиэлектролитных комплексов полианилина/ПАМПС Размер наночастиц полианилина зависит от исходной концентрации полимерной матрицы при высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС/анилин -11) размер частиц составляет порядка 10-15 им, в то время как при низком содержании ПАМПС (1 10) размер наночастиц полианилина был несколько выше (~25 нм) Показано, что с увеличением содержания ПАМПС в комплексах полианилина происходит также снижение его электропроводимости Сравнение значений электропроводимости полиэлектролитных комплексов полианилина, полученных различными методами, показало преимущество разработанного нами пероксидазного метода синтеза

4 Разработан и оптимизирован оригинальный ферментативный метод получения оптически активного полианилина в мицеллах додецилбензолсульфокислоты, где как биокатализатор была использована пероксидаза пальмы В качестве индуктора хиралыюсти на стадии синтеза были применены энантиомеры камфорсульфоновой кислоты С помощью метода кругового дихроизма продемонстрировано, что высокохиральный полианилин может быть получен как в присутствии, так и отсутствие камфорсульфоновой кислоты

5 Методами трансмиссионной и электронной микроскопии определена морфология полианилина, синтезированного в мицеллах додецилбензолсульфокислоты Найдено, что агрегаты полианилина представляют собой пористые рисоподобные наночастицы, длина и ширина которых равны 140 - 180 нм и 70-100 нм соответственно

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 A.V. Karamyshcv, S V Shleev, О V Koroleva, AI Yaropolov, I Yu Sakharov Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyanilme Enzyme Microb. Technol., 2003, v. 33, N 5, 556-564

2 Ю M Мажуго, А. В. Карамышев, С В Шлеев, И Ю Сахаров,А И Ярополов Ферментативный синтез электропроводного комплекса полианилина и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислоты с использованием пероксидазы пальмы и его свойства Прикл. биохим. микробиол., 2005,41, 283-287

3 A.V. Caramyshev, Е G. Evtushenko, V F Ivanov, A Ros Barcelo, М G Roig, V L Shnyrov, R В van Huystee, IN Kurochkin, A Kh Vorobiev, I Yu Sakharov Synthesis of conducting polyelectrolyte complexes of polyanilme and poly(2-acrylamido-2-methyl-l-propane)sulfomc acid catalysed by pH-stable palm tree peroxidase Biomacromoleculcs, 2005, 6, 1360-1366

4 A.V. Caramyshev, Y N Firsova, E A Slastya, A A Tagaev, N V Potapenko, E S Lobakova, О Yu Pletjushkma, I Yu Sakharov Purification and characterization of Windmill Palm Tree peroxidase J.Agric.Food Chem., 2006, 54 (26), 9888-9894.

5 A.V. Karamyshev, A Ch Vorobiev, J J Castillo Leon, I Yu Sakharov Plant peroxidases as catalysts m synthesis of polyanilines Proc. I Intern. Symp. Biotechnology — state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, October 14-18, 2002, С 6 21

6 I Yu Sakharov, A.V. Karamyshev, IV Ouporov, A Kh Vorobiev, AI Yaropolov, MG Roig, J.J Castillo Leon Enzymatic synthesis of polyelectrolyte complexes of conducing polyanilme Proc. II Intern. Symp. Biotechnology — state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, November 10 -14, 2003, v 2, p 190-191

7 A V Caramyshev, I Yu Sakharov Palm tree peroxidase-catalyzed synthesis of chiral and conducting polyanilme Proc. 1 European Chemistry Congress, Polymer architecture — from structure to functional control, Budapest, Hungary, 27-31 August 2006, M-OC-85, p 288

8 A.V. Caramyshev, V M Lobachev, I Yu Sakharov Peroxidase-catalyzed synthesis of chiral polyanilme m presence of achiral surfactant Proc. Conference EUROBIC8, Aveiro, Portugal, 1-6 July 2006, PS 7 15

9 I Yu Sakharov, V M Lobachov, V M Makarov, A.V. Caramyshev Enzymatic synthesis of chiral polyaniline Proc. IV Intern. Symp. Biotechnology - state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, March 12 -16, 2007, v.2, p 246

Формат 60x88 1/16 Объем 1 5 п л Тираж 100 экз Заказ № 664 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Современные представления о структуре и механизме действия лакказ

1.1. Классификация, общая характеристика и биохимические свойства лакказ

1.2. Строение активного центра лакказ

1.3. Каталитические свойства лакказ и механизм катализа

ГЛАВА 2. Современные представления о структуре и механизме действия пероксидаз растений

2.1. Классификация и общая характеристика растительных пероксидаз

2.2. Структура изофермента С пероксидазы хрена

2.3. Каталитический цикл пероксидазной реакции. Промежуточные соединения пероксидазы

2.4. Функциональная важность отдельных компонентов пероксидазы для катализа

2.5 Механизм химической инактивации пероксидазы пероксидом водорода

2.6 Субстратная специфичность пероксидаз

2.7 Применение пероксидаз растений

ГЛАВА 3. Полианилин

3.1 Общие представления о структуре полианилина

3.2 Синтез полианилинов

3.2.1 Химический способ получения полианилина.

3.2.2 Электрохимическая полимеризация анилина

3.3 Механизм полимеризации анилина

3.4 Допирование полианилина

3.5 Хиральность полианилина

3.6 Морфология полианилина

3.7 Ферментативная полимеризация как альтернативный способ получения полианилинов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА 1. Ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, катализируемый лакказой

1.1. Оптимизация условий ферментативной полимеризации анилина в присутствии лакказы

1.2. Характеристики полученных комплексов полианилина

ГЛАВА 2. Ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, катализируемый пероксидазой

2.1 Оптимизация условий ферментативного синтеза полиэлектролитных комплексов на основе полианилина, катализаруемого пероксидазой пальмы

2.2 Характеристики полученных полиэлектролитных комплексов полианилина

ГЛАВА 3. Ферментативный синтез хирального полианилина на мицеллах, катализируемый пероксидазой

3.1. Оптимизация условий ферментативной полимеризации анилина на мицеллах додецилбензолсульфоновой кислоты в присутствии камфорсульфоновой кислоты с помощью пероксидазы пальмы. Характеристики полианилина

ВЫВОДЫ ИЗ

В 2000-м году Нобелевская премия по химии была присуждена исследователям Хидеки Сиракава (Hideki Shirakawa, Япония), Алану МакДиармиду (Alan G. McDiarmid, США) и Алану Хигеру (Alan J. Heeger, США) за "открытие и развитие области электронопроводимых полимеров". Проводящие полимеры образовали новый класс "синтетических металлов", обладая исключительными свойствами в сравнении с низкомолекулярными полупроводниками. На настоящий момент они нашли широкое применение в различных областях науки и техники от микроэлектроники (батареи, оптические мониторы) до биоаналитики (сенсоры). Полианилин привлекает наибольшее внимание исследователей, благодаря своей высокой стабильности и хорошим проводящим характеристикам. Кроме того, обнаружено, что в присутствии хирального индуктора (например, энантиомеров камфорсульфоновой кислоты) он может образовывать оптически активные вторичные структуры [1]. Это свойство в дальнейшем может существенно расширить область применения полианилина. К сожалению, основные способы получения (химический и электрохимический) полианилина обладают определенными недостатками, что вызывает необходимость в разработке альтернативных методов.

В последние годы был опубликован ряд работ, посвященных использованию ферментов как катализаторов окислительной полимеризации, что привело к появлению термина "ферментная полимеризация" [2]. В частности была показана возможность получения проводящего полианилина при полимеризации анилина с помощью пероксидазы хрена [3, 4]. В то же время оказалось, что в условиях, необходимых для синтеза полианилина, а именно при кислых условиях, этот ферментный препарат быстро теряет свою активность. Таким образом, становится понятным интерес к поиску новых ферментов, пригодных для проведения синтеза полианилина.

Задачей настоящей диссертационной работы является:

S Исследование возможности использования лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской пальмы в качестве биокатализаторов для проведения ферментативного синтеза полианилина

S Оптимизация методик ферментативного синтеза проводящих полиэлектролитных комплексов полианилина с сульфополистиролом и поли(2-акриламидо-2-метил-1 -пропан)сульфокислой Изучение ферментативного синтеза хирального полианилина, катализируемого пероксидазой пальмы, на мицеллах додецилбензолсульфоновой кислоты

S Определение физико-химических свойств и структуры полианилина, полученного ферментативным путем.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы

1. Разработан ферментативный экологически чистый метод полимеризации анилина в присутствии водорастворимого полимера (сульфополистирола и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислоты (ПАМПС)) для получения полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина. В качестве биокатализаторов применены кислотостабильные препараты грибной лакказы (Coriolus hirsitus) и пероксидазы пальмы. Варьируя концентрации реагирующих веществ и кислотность реакционной среды, оптимизированы условия ферментативного синтеза комплексов полианилина. Исследована кинетика синтеза полианилина, катализируемого обоими ферментами.

2. Используя спектральные методы, охарактеризованы препараты ферментативно синтезированного полианилина. Показано, что электронные спектры в УФ-, видимой и ближнем ИК- областях и спектры ЭПР химически и ферментативного синтезированных комплексов полианилина практически идентичны. Найдено, что степень допированности зарегистрирована выше для препаратов полианилина, полученного при синтезе, катализируемом пероксидазой пальмы, чем при катализе лакказой.

3. Методом атомно-силовой микроскопии исследована морфология полиэлектролитных комплексов полианилина/ПАМПС. Размер наночастиц полианилина зависит от исходной концентрации полимерной матрицы: при высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС/анилин - 1:1) размер частиц составляет порядка 10-15 нм, в то время как при низком содержании ПАМПС (1:10) размер наночастиц полианилина был несколько выше (-25 нм). Показано, что с увеличением содержания ПАМПС в комплексах полианилина происходит также снижение его электропроводимости. Сравнение значений электропроводимости полиэлектролитных комплексов полианилина, полученных различными методами, показало преимущество разработанного нами пероксидазного метода синтеза.

4. Разработан и оптимизирован оригинальный ферментативный метод получения оптически активного полианилина в мицеллах додецилбензолсульфокислоты, где как биокатализатор была использована пероксидаза пальмы. В качестве индуктора хиральности на стадии синтеза были применены энантиомеры камфорсульфоновой кислоты. С помощью метода кругового дихроизма продемонстрировано, что высокохиральный полианилин может быть получен как в присутствии, так и отсутствие камфорсульфоновой кислоты.

5. Методами трансмиссионной и электронной микроскопии определена морфология полианилина, синтезированного в мицеллах додецилбензолсульфокислоты. Найдено, что агрегаты полианилина представляют из себя пористые рисоподобные наночастицы, длина и ширина которых равны 140 - 180 нм и 70-100 нм соответственно.

1. Majidi,M.R., Kane-Maguire,L.A.P., Wallace,G.G. (1994) Enantioselective Electropolymerisation of Aniline in the Presence of (+) or (-) Camphorsulfonate Ion: A Facile Route to Conducting Polymers with One-Screw-Sense Helicity. Polymer, 35 (14), 3113-3115.

2. Kobayashi,S., Shoda,S., Uyama,H. (1995) Enzymatic Polymerization and Oligomerization. Adv Polym Sci, 121, 1-30.

3. Lui,W., Cholli,A.L., Nagarajan,R., Kumar,J., Tripathy,S., Bruno,F.F. and Samuelson,L. (1999) The role of template in the enzymatic synthesis of conducing polyaniline. J Am Chem Soc, 121, 11345-11355.

4. Lui,W., Kumar,J., Tripathy,S., Senecal,K.J. and Samuelson,L. (1999) Enzymatically synthesized conducting polyaniline. J Am Chem Soc, 121, 71-78.

5. Yaropolov,A.I., Skorobogat'ko,O.V., Vartanov,S.S., Varfolomeev,S.D. (1994) Laccase: properties, catalytic mechanism, and applicability. Appl Biochem Biotechnolm, 49, 257-280.

6. Lee,S.-K., George,S.D., Antholine,W.E., Hedman,B., Hodgson,K.O., Solomon,E.I. (2002) Nature of the intermediate formed in the reduction of 02 to H202 at the trinuclear copper cluster active site in native laccase. J Am Chem Soc, 124 (21), 6180-6193.

7. Baldrian,P. (2006) Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiol Rev, 30 (2), 215-242.

8. Колобова,A.B., Аскадский,А.А., КондращенкоДИ., Рабинович,M.JI. (2002) Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. II: Ферменты, модели, процессы М.: Наука, 343с.

9. Mayer,A.M. and Staples,R.C. (2002) Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 60 (6), 551-565.

10. Thurston,C.F. (1994) The structure and function of fungal laccase. Microbiology, 140 (1), 19-26.

11. Ko,E.-M., Leem,Y.-E., Choi,H.T. (2001) Purification and characterization of laccase isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum. Appl Microbiol Biotechnol, 57 (1), 98-102.

12. Yoshitake,A., Katayama,Y., Nakamura,M., Iimura,Y., Kawai,S., Morohoshi,N. (1993) N-Linked carbohydrate chains protect laccase-III from proteolysis in Coriolus versicolor. J Gen Microbiol, 139, 179-185.

13. Malmstrom,B.G. (1982) Enzymology of Oxygen. Annu Rev Biochem, 51, 21-59.

14. Reinhammar,B.R., Vanngard,T.I. (1971) The electron-accepting sites in Rhus vernicifera laccase as studied by anaerobic oxidation-reduction titrations. Eur J Biochem, 18 (4), 463-468.

15. Solomon,E.I., Sundaram,U.M., Machonkin,T.E. (1996) Multicopper Oxidases and Oxygenases. Chem Rev, 96 (7), 2563-2606.

16. Larrabee J.A. and Spiro T.G. (1979) Cobaltll substitution in the type 1 site of the multi-copper oxidase Rhus laccase. Biochem Biophys Res Commun, 88 (3), 753-760.

17. Morie-Bebel,M.M., Morris,M.C., Menzie,J.L., McMillin,D.R. (1984) A mixed-metal derivative of laccase containing mercury (II) in the type 1 binding site. J Am Chem Soc, 106 (12), 3677-3678.

18. Malkin,R., Malmstrom,B.G., Vanngard,T.I. (1969) The reversible removal of one specific copper (II) from fungal laccase, Eur J Biochem, 7 (2), 253-259.

19. Allendorf,M.D., Spira,D.J., Solomon,E.I. (1985) Low-temperature magnetic circular dichroism studies of native laccase: Spectroscopic evidence for exogenous ligand bridging at a trinuclear copper active site. Proc Nat Acad Sci USA, 82 (10), 30633067.

20. Spira-Solomon,D.J., Allendorf,M.D., Solomon,E.I. (1986) Low-temperature magnetic circular dichroism studies of native laccase: confirmation of a trinuclear copper active site. J Am Chem Soc, 108 (17), 5318-5328.

21. Cole,J.L., Tan,G.O., Yang,E.K., Keith,O., Hodgson,O., Solomon,E.I. (1990) Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: an X-ray absorption edge study. J Am Chem Soc, 112 (6), 2243-2249.

22. Palmer,A.E., Lee,S.K., Solomon,E.I. (2001) Decay of the peroxide intermediate in laccase: reductive cleavage of the 0-0 bond. J Am Chem Soc, 123 (27), 6591-6599.

23. Messerschmidt,A. and Huber,R. (1990) The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationships. Eur J Biochem, 187 (2), 341-352.

24. Kumar,S.V.S., Phale,P.S., Durani,S., Wangikar,P.P. (2003) Combined sequence and structure analysis of the fungal laccase family. Biotechnol Bioeng, 83 (4), 386-394.

25. Reinhammar,D. (1984) Laccase. In: Copper Proteins and CopperEnzymes, (Lontie R., Ed.) CRC Press: Boca Raton, Fla, 3, 1-35

26. Shleev,S., Reimann,C.T., Serezhenkov,V., Burbaev,D., Yaropolov,A.I., Gorton,L., Ruzgas,T. (2006) Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: Possible correlation with a resting form of laccase. Biochimie, 88 (9), 1275-1285.

27. Kumari,H.L. and Sirsi,M. 1972 Purification and properties of laccase from Ganoderma lucidum. Arch Microbiol, 84 (4), 350-357.

28. Xu,F. (1996) Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition. Biochemistry, 35 (23), 7608-7614.

29. Slomczynski,D., Nakas,J.P. and Tanenbaum,S.W. (1995) Production and Characterization of Laccase from Botrytis cinerea. Appl Microbiol Biotechnol, 61 (3), 907-912.

30. Johannes,C., Majcherczyk,A. (2000) Natural mediators in the oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by laccase mediator systems. Appl Environ Microbiol, 66 (2), 524-528.

31. Huddleston,S., Robertson,S., Dobson,C., KwongJF., Chamralambous.B. (1995) Structural and functional stability of horseradish peroxidase. Biochem Soc Trans, 23, 108.

32. Veitch,N., Smith,T. (2001) Horseradish peroxidase. Advances in inorganic chemistry, 51, 107-162.

33. Sontum,S.F., Case,D.A. (1985) Electronic structures of active site models for compounds I and II of peroxidase. J Am Chem Soc, 107, 4013-4015.

34. Dunford,H.B. (1982) Peroxidases, In Advances in Inorganic Biochemistry. Eichhorn, G. L., Marzilli, L. G., eds. Elsevier Biomedical: Amsterdam, 41-68.

35. Dunford,H.B., StilIman,J.S. (1976) On the function and. mechanism of action of peroxidases. Coord Chem Review, 19, 187-251.

36. Du,P., Axe,F.U., Loew,G.H., Canuto, S., Zerner,M.C. (1991) Theoretical study on the electric spectral of model compound II complexes of peroxidases. J Am Chem Soc, 113, 8614-8621.

37. Dunford,H.B. (1992) In Peroxidase in chemistry and biology, J.Everse, K.E.Everse, M.B.Grisham, eds. CRC Press: Boca Raton: Florida, 1-24.

38. Kim,B.B., Pisarev,V.V., Egorov,A.M. (1991) A comparative study of peroxidase from horseradish and Arthromyces ramosus as labels in luminol mediated chemiluminescent assay. Anal Biochem, 199, 1-6.

39. Nagano,S., Tanaka,M., Watanabe,Y. and Morishima,I. (1995) Putative hydrogen bond network in the heme distal site of horseradish peroxidase. Biochem Biophys Res Commun, 207,417-423.

40. Nagano,S., Tanaka,M., Ishimori,K., Watanabe,Y. and Morishima,I. (1996) Catalytic roles of the distal site asparagine-histidine couple in peroxidases. Biochemistry, 35, 14251-14258.

41. Tams,J.W., Welinder,K.G. (1991) In Biochemical, molecular and physiological aspects of plant peroxidases. Lobarzewski,J., ed. Imprimerie Nationale: Geneve, 111114.

42. Arnao,M.B., Acosta,M., delRio,J.A. and arcia-Canovas,F. (1990) Inactivation of peroxidase by hudrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta, 1038, 85-89.

43. Hernandez-ruiz,J., Arnao,M.B., Hiner,A.N.P., Garcia-Canovas,F., Acosta,J.A. (2001) Catalase-like activity of horseradish peroxidase: relationship to enzyme inactivation by H202. Biochem J, 354, 107-114.

44. Arnao,M.B., Acosta,M., del Rio,J.A., Varon,R. and Garcia-Canovas,F. (1990) A kinetic study on the suicide inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide. Biochim Biophys Acta, 1041, 43-47.

45. Frew,J.E., Jones,P.L. (1984) Structure and functional properties of peroxidases, and catalases. Adv Inorg Bioinorg Mech, 3, 176-212.

46. Acosta,J.A., Arnao,M.B., delRio,J.A., Garcia-Canovas,F. (1989) Kinetic characterization of the inactivation process of two peroxidase isoenzymes in the oxidation of indolyl-3-acetic acid. Biochim Biophys Acta, 996, 7-12.

47. Arnao,M.B., Sanchez-Bravo,J., Acosta,J.A. (1993) In Plant peroxidases Biochemistry and Physiology, Welinder,K.G., ed. University of Geneva: Geneva, 181-184.

48. Ator,M.A., DeMentellano,P.R.O. (1990) In The Enzymes, Sigman,D.S., Boyer,P.D., eds. Academic Press: San Diega, 213-282.

49. Uyama,H., Kobayashi,S. (1999) Enzymatic polymerization yields useful polyphenols. ChemTech , 29 (10), 22-28.

50. Akkara,J.A., Ayyagari,M.S.R., Bruno,F.F. (1999) Enzimatic synthesis and modificat ion of polymers in nonaqueous solvents. TIBTech, 17, 67-73.

51. Bruno,F.F., Nagarajan,R., Stenhouse,P., Yang,K., Kumar,J., Tripathy,S.K., Samuelson,L.A. (2001) Polymerization of water-soluble conductive polyphenol using horseradish peroxidase. J Macromol Sci, A38, 1417-1426.

52. Jin,Z., Su,Y., Duan,Y. (2001) A novel method of polyaniline synthesis with the immobilized horseradish peroxidase enzyme. Synth Met, 122, 237-242.

53. Mejias,L., Reihmann,M.H., Sepulveda-Boza,S., Ritter,H. (2002) Horseradish or Soybean Peroxidase. Macromol Biosci, 2,24-32.

54. Sakharov,I.Y,, Vesga,M.K, Galaev,I.Y., Sakharova,I.V., Pletjushkina,O.Y. (2001) Peroxidase from leaves of royal palm tree Roystonea regia: purification and some properties. Plant Sci, 161, 853-860.

55. Alpeeval.S., Niculescu-NistorM., LeonJ.C. (2005) Palm tree peroxidase-based biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide monitoring. Biosensors and Bioelectronics, 21 (5), 742-748/

56. Shirakawa,H., Louis,E.J., McDiarmid,A.G., Chiang,C.K., Heeger,A.J. (1977) Synthesis of electrically conducting organic polymers halogen derivatives of polyacetylene (CH)X. J Chem Soc, Chemical Community, 16, 578-580.

57. McDiarmid,A.G., Chiang,C.K., Halpern,M., Huang,W.S., Mu,S.L., Somasiri,N.L.D., Wu,W., Yaniger,S.I. (1985) Polyaniline: Interconversion of Metallic and. Insulating Forms. Mol Cryst Liq Cryst, 121, 173.

58. Anand,J., Sathyanara,D.N., Palaniappan,S. (1998) Conducting polyaniline blends and composites. Prog Polym Sci, 23, 993-1018.

59. Nicolas-Debarnot,D., Poncin-Epaillard,F. (2003) Polyaniline as a new sensitive layer for gas sensors. Anal Chim Acta, 475, 1-15.

60. Tawde,S., Mukesh,D., Yakhmi,J.V. (2002) Redox behavior of polyaniline as influenced by aromatic sulphonate anions: cyclic voltammetry and molecular modeling. Synth Met, 125, 401-413.

61. Malinauskas,A. (2001) Chemical deposition of conducting polymers. Polymer, 42, 3957-3972.

62. Syed,A.A., Dinesan,M.K. (1991) Polyaniline-A novel polymeric material. Talanta, 38,815-837.

63. Abrantes,L.M., Correia,J.P., Savic,M., Jin,G. (2001) Structural modifications during conducting polymer formation: an ellipsometric study. Electrochim Acta, 46, 31813187.

64. Pron,A. and Rannou,P. (2002) Processible conjugated polymers: from organic semiconductors to organic metals and superconductors. Prog Polym Sci, 27, 135-190.

65. Heeger,A.J. (2002) Semiconducting and metallic polymers: the fourth generation of polymeric materials. Synth Met, 125, 23-42.

66. Kim,B.-J., Oh,S.-G., Han,M.-G. and Im,S.-S. (2001) Synthesis and characterization of polyaniline nanoparticles in SDS micellar solutions. Synth Met, 122, 297-304.

67. Yue,J., Wang,J.H., Cromark,K.R., Epstein,J.A. and MacDiamid,A.G. (1991) Effect of sulfonic acid group on polyaniline backbone. J Am Chem Soc, 113, 2665-2671.

68. Haba,Y., Segal,E., Narkis,M., Titelman,G.I. and Siegmann,A. (1999) Polymerization of aniline in the presence of DBSA in a aqueous dispersion. Synth met, 106, 59-66.

69. Hopkins,A.R., Rasmussen,P.G. (1996) Characterization of Solution and Solid State Properties of Undoped and Doped Polyanilines Processed from Hexafluoro-2-propanol. Macromol, 29, 7838-7846.

70. Krinichnyi,V.I., Konkin,A.L., DevasagayamJP., Monkman,A.P. (2001) Multifrequency EPR study of charge transport in doped polyaniline. Synth Met, 119, 281-282.

71. Rao,P.S., Anand,J., Palaniappan,S., Sathyanarayana,D.N. (2000) Effect of sulphuric acid on the properties of polyaniline-HCl salt and its base. Eur Polymer J, 36, 915921.

72. Hatchett,D.V., Josowicz,M., Janata,J. (1999) Acid Doping of Polyaniline: Spectroscopic and Electrochemical Studies. J Phys Chem, 103, 10992-10998.

73. Hu,H., Saniger,J.M., Banuelos,J.G. (1999) Thin films of polyaniline-polyacrylic acid composite by chemical bath deposition. Thin Solid Films, 347, 241-247.

74. Ryu,K.S., Moon,B.W., Joo,J., Chang,S.H. (2001) Characterization of highly conducting lithium salt doped polyaniline films prepared from polymer solution. Polymer, 42, 9355-9360.

75. Han,M.G., Lee,Y.J., Byun,S.W., Im,S.S. (2001) Physical properties and thermal transition of polyaniline film. Synth Met, 124, 337-343.

76. Langeveld-Voss,B.M.W., Janssen,R.A.J., Meijer,E.M. (2000) On the origin of optical activity in polythiophenes. J Mol Struct, 521, 285-301.

77. Stejskal,J., Sapurina,I., Trchova,M., Konyushenko,E.N., Holler,P. (2006) The genesis of polyaniline nanotubes. Polymer, 47, 8253-8262.

78. Li,D., Kaner,R.B. (2006) Shape and Aggregation Control of Nanoparticles: Not Shaken, Not Stirred. J Am Chem Soc, 128, 968-975.

79. Zhou,S., Wu,T., Kan,J. (2007) Effect of methanol on Morphology of Polyaniline. Eur Polym J, 43, 395-402.

80. Xing,Sh., Zhao,Ch., Jing,Sh., Wu,Y., Wang,Z. (2006) Morphology and gas-sensing behaviour of in situ polymerized nanostructered polyaniline films. Eur Polym J, 42, 2730-2735.

81. Thiyagarajan,M., Samuelson,L.A., Kumar,J., Cholli,A.L. (2003) Helical conformational specificity of enzymatically synthesized water-soluble conducting polyaniline nanocomposites. J Am Chem Soc, 125 (38), 11502-11503.

82. Chattopadhyay,K. and Mazumdar,S. (2000) Structural and conformational stability of horseradish peroxidase: effect of temperature and pH. Biochem, 39, 263-270.

83. Nagarajan,R., Tripathy,S., Kumar,J., Bruno,F.F. and Samuelson,L.A. (2000) An enzymatically synthesized conducting molecular complex of polyaniline and polyvinyl phosphonic acid). Macromol, 33, 9542-9547.

84. Feng,F. (1996) Oxidation of phenols, anilines and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition. Biochem, 35, 7608-7614.

85. Rannou,P., Gawlicka,A., Berner,D., Pron,A. and Nechtschein,M. (1998) Spectroscopic, structural and transport properties of conductive polyaniline processed from fluorinated alcohols. Macromol, 31, 3007-3015.

86. Su,S.-S. and Kuramoto,N. (2000) Synthesis of processable polyaniline complexed with anionic surfactant and its conducting blends in aqueous and organic system. Synth Met, 108, 121-126.

87. Chen,S.-A. and Hwang,G.-W. (1996) Structure characterization of self-cid-doped sulfonic acid ring-substituted polyaniline in its aqueous solutions and as solid films. Macromol, 29,3950-3955.

88. Ghosh,P., Siddhanta,S.K. and Chakrabarti,A. (1999) Characterization of polyvinyl pyrrolidone) modified polyaniline prepared in stable aqueous medium. Eur Polym J, 35, 699-710.

89. Mav,I. and Zigon,M. (2001) Chemical copolymerization of aniline derivatives: preparation of fully substituted PANI. Synth Met, 119, 145- 146.

90. Yin,W. and Ruckenstein,E. Water-soluble self-doped conducting polyaniline copolymer. Macromol, 33, 1129-1131.

91. Varela,H., de Albuquerque Maranhao,S.L., Mello,R.M.Q., Ticianelli,E.A. and Toressi,R.M. (2001) Comparisons of compensate process in aqueous media of polyaniline and self-doped polyanilines. Synth Met, 122, 321-327.

92. Koul,S., Dhawan,S.K., Chandra,R. (2001) Compensated sulphonated polyaniline-correlation of processibility and crystalline structure. Synth Met, 124, 295-299.

93. Shreepathi,S., Holze,R. (2006) Spectroelectrochemistry and Preresonance Raman Spectroscopy of Polyaniline-Dodecylbenzenesulfonic Acid Colloidal Dispersions. Langmuir, 22, 5196-5204.

94. Allenmark,S. (2003) Induced circular dichroism by chiral molecular interaction Chirality, 15 (5), 409-422.