Физико-химические аспекты участия ионов металлов в метаболизме бактерии Azospirillum brasilense тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

* ч / ^ 1

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

И МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ЧЕРНЫШЕВ Анатолий Валериевич

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УЧАСТИЯ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В МЕТАБОЛИЗМЕ БАКТЕРИИ МОЬРИШЛЛМ ВНШЬЕтЕ

02.00.04 — физическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: к.х.н. с.н.с. А. А. КАМНЕВ к.б.н. с.н.с. Л. П. АНТОНЮК

Саратов, 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и обозначений....................................................................................................4

Введение...........................................................................-.................................................................5

Глава 1. Литературный обзор..........................................................................................................10

1.1. Роль ионов металлов в жизнедеятельности бактериальной клетки................. ............................10

I.1.1. Пассивная диффузия.............................................................................................................12

II. 2. Облегченная диффузия........................................................................................................25

1.1. 3. Активный транспорт........................................ ......................................................................30

1.1. 4. Адсорбция и образование новой фазы с участием микроорганизмов............. ........................32

1.2. Биологический катализ на биядерных комплексах металлов.................... ..................................48

Глава 2. Объекты и методы исследования.......................................................................................72

2.1. Объект исследования и условия культивирования........................ ............................................72

2. 2. Выделение и очистка глутаминсинтетазы.............................. ............................................72

2.3. Определение активности и степени аденилирования (а) глутаминсинтетазы.........................74

2. 4. Определение концентрации белка................................. ...........................................................74

2.5. Определение активности глутаминсинтетазы АгавртНит Ьгавиепье Бр 245 з присутствии ионов

металлов............................................... .......................................................................................75

2. 6. Световая микроскопия....................................... ......................................................................76

2. 7. Выделение минеральных кристаллов................................ .........................................................76

2. 8. Структурные исследования минеральных кристаллов ...................... ........................................76

2. 8.1. Инфракрасная (ИК) спектроскопия....................................................................................76

2. 8. 2. Рентгенофазовый анализ...................................... ................................................................77

2. 8. 3. Термогравиметрический (ТГА) и дифференциальный термический (ДТА) анализ...........77

2. 8. 4. Ионная хроматография и элементный анализ.......................... ..............................................77

2. 9. Атомно-эмиссионная (АЭС) и атомно-абсорбционная (ААС) спектрометрия.......................77

2.10. Приготовление образцов сухой биомассы АгохртИит ЬгаяИете Бр 245 ...............................77

2.11. Инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием.......................................................78

2.12. Определение концентрации сухого вещества и клеток, а также их размеров з бактериальной суспензии........................................'................................... ...........................................................78

2.13. Определение фосфатазной активности лантаноидов...............................................................78

2. 14. Изучение активности глутаминсинтетазы в присутствий халькогеиотшрилиевых солеи и 1,5'Дикетонов......................—.......—......... ..............................................................................79

2. 15. Электрохимические исследования кинетических свойств глутаминсинтетазы и реакции гидролиза АТФ в присутствии ионов лантаноидов.....................................................................79

Глава 3. Результаты и их обсуждение..............................................................................................80

3.1. Образование кристаллов струвита в процессе культивирования Azospirilhim brasilense —.— 80

3.2. Поглощение и адсорбция ионов металлов клетками Azospirillum brasilense-----------------------------89

3. 3. Взаимодействие глутаминсинтетазы Azospirillum brasilense с ионами s-, р- и d-элементов.....98

3. 4. Поведение глутаминсинтетазы Azospirillum brasilense в трансферазной реакции с ионами

лантаноидов и фосфатазная активность ионов лантаноидов........................................................114

3. 5. Взаимодействие глутаминсинтетазы с элементорганическими ионами...................................128

Заключение.................................................................................................,..................................140

Выводы................................................... .......................................................................................144

Список литературы...................—...................... ...........................................................................146

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ААС — атомно-абсорбционная спектроскопия

АДФ — аденозиндифосфат

Й-АМФ — уикло-аденозинмонофосфат

АО — атомная орбиталь

АТФ — аденозинтрифосфат

АЭС — атомно-эмиссионная спектроскопия

БАМ — бислойная липидная мембрана

БСА — бычий сывороточный альбумин

ВВЛ —взаимное влияние лигандов

ВЗМО — верхняя занятая МО

у-ГГК — у-глутамилгидроксамовая кислота

ГДГ — глутаматдегидрогеназа

ГДФ — гуанозиндифосфат

ГИНК — гидразид изоникотиновой кислоты

ГС — глутаминсинтетаза

ГСТ — глутаматсинтаза

ДПА — дипиридиламин

ДТА — дифференциальный термический анализ

,¿mCNa — додецилсульфат натрия

ДЭС — двойной электрический слой

КЧ — координационное число

КФ — классификация ферментов

МО — молекулярная орбиталь

МЭС — 4-морфолинэтансульфоновая кислота

НАДФ — никотинамиддинуклеотидфосфат

НСМО — нижняя свободная МО

ПААГ — полиакриламидньш гель

ППЭ — поверхность потенциальной энергии

РЗЭ — редкоземельные элементы

РСА — рештеноструктурньш анализ

ТГА — термогравиметрический анализ

ТРИС — трис - гидроксиметиламинометан

ФМН — флавинмононуклеотид

ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид

ЭДТА — этилендиаминтетраацетат (натрия)

Ala — аланин

Arg — аргинин

Asa — аспарагин

Asp — аспарагиновая кислота

Cys — цистеин

Gin — глутамин

Glu — глутаминовая кислота

Gly — глицин

His — гистидин

lie — изолейцин

Lea — лейцин

Lys — лизин

Met — метионин

PDB — Protein Data Bank, банк белковых структур (http;¡¡www.pdb.bnl.gov) Phe — фенилаланин Pro — пролин

Ser — серин Thr — треонин Тгр — триптофан Туг — тирозин Val — валин

а — термодинамическая активность вещества А.к — оптическая плотность при длине волны X с — концентрация вещества d — размерность евклидова пространства D — коэффициент диффузии Ер — энергия Ферми

F — мощность источника вещества, постоянная Фарадея

g — условная обменная емкость ионообменной смолы

/ — ионная сила раствора } — диффузионный поток k — константа скорости реакции К — константа Михаэлиса

т

Меш+ — ион металла п — степень аденилирования ГС

р — вероятность Р — огибающая вероятности

— коэффициент вибронного усиления Р — неорганические фосфаты, включая прото-нированные формы

q — коэффициент поглощения, заряд электрона Q — теплота адсорбции

г — коэффициент корреляции, обобщенная координата

5 — энтропия, площадь поверхности t — время

Т — температура

w — скорость образования зародышей новой фазы z. — заряд i-ro иона а — степень диссоциации электролита AV. — изменение объема белковой глобулы / — коэффициент активности Г — гамма-функция

8 — фрактальная размерность, размерность кластера (по [64]) ц — химический потенциал Ф — потенциал электрического поля р — плотность вещества а — свободная поверхностная энергия

6 — доля занятых адсорбционных мест на поверхности раздела фаз

Y7 д 3 д

v=—+-+...+-

дг; дп.

¿+i

52

дк

дг Зг,

ы

дг:

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Функции ионов металлов и элементоорганических ионов в жизнедеятельности клетки чрезвычайно разнообразны и затрагивают как взаимодействие клеток друг с другом, клетками других организмов и компонентами окружающей среды, так и собственно метаболизм клетки. В последнем случае наблюдается участие ионов металлов практически во всех биохимических реакциях, проходящих внутри клетки.

В настоящее время получены данные [1], позволяющие считать, что основная роль микрофлоры связана с превращениями именно неорганических соединений металлов. Специально выделяют следующие направления трансформации: превращение неорганических соединений в органические компоненты микробной клетки, редокс-процессы, разрушение пород и минералов с сопутствующим выщелачиванием элементов, формирование геологических отложений, синтез комплексообразующих, в том числе хелатирующих, соединений (компоненты почв и илов, гуминовые и фульвокислоты, слизи), адсорбция и отложение ионов металлов на поверхности клеток бактерий, фракционирование изотопов [1—5].

Взаимодействие микроорганизмов с ионами металлов играет важную роль при биологическом осаждении их соединений из окружающей среды наряду с чисто физико-химическими процессами осаждения [6].

р и и

естественно, что такая значимость ионов и соединении металлов для живои клетки обусловила ранний интерес исследователей к взаимоотношениям между живой материей и неорганической составляющей среды. Так, основоположник современной биогеохимии В. И. Вернадский отмечал необходимость как можно более широкого и систематического охвата элементов при изучении влияния неорганических соединений на живые клетки: «Мы захватили точной методикой (определения концентрации —А. Ч.) сперва 18 химических элементов, сейчас мы можем количественно исследовать более 60, а должны захватить все 92, если не больше. Ибо все яснее становится, что живое вещество охватывает и регулирует в области биосферы все или почти все химические элементы. Они все нужны для жизни и все попадают

в состав организма не случайно. Нет особых, жизни свойственных элементов. Есть господствующие. Взятая же как целое, жизнь охватывает всю систему земных элементов, вероятно, оставляя в стороне лишь немногие, как, например, обычные изотопы тория, но может быть, в разных изотопах захватывая их все. Жизнь есть планетное явление и определяет основным образом химическую миграцию химических элементов верхней земной оболочки — биосферы, миграцию всех химических элементов»[2].

Изучение взаимодействия ионов металлов с клетками и компонентами клеток почвенных азотфиксирующих бактерий заслуживает особого интереса, поскольку почвы представляют собой коллоидную систему, состоящую, в первом приближении, из трех фаз: твердой (механический состав), жидкой (растворы солей и высокомолекулярных соединений) и газообразной. Микроорганизмы почвы, тем самым, вовлечены в активное взаимодействие со всеми тремя фазами.

Почвенная азотфиксирующая бактерия АгозртИит brasilen.se является ассоциативным микроорганизмом, то есть способна образовывать сообщества с высшими небобовыми растениями [7]. Эта особенность делает возможным использование данного микроорганизма в сельскохозяйственных целях в качестве азотного биоудобрения для таких культур, как рис, пшеница, кукуруза и другие злаки. В связи с этим изучение роли ионов металлов — компонентов почв — в физико-химических процессах, сопровождающих метаболизм азос-пириллы, представляет особый интерес.

Поскольку фермент глутаминсинтетаза является ключевым ферментом азотного метаболизма микроорганизмов [8], мы выбрали его среди клеточных компонентов А. Ьга511еп&е для исследования взаимодействия фермента с ионами металлов и элементоорганическими ионами.

Цель настоящего исследования заключалась в физико-химическом исследовании роли ионов металлов в метаболизме АгоьртИитп Ьга.5'йете Бр 245, включая взаимодействие этой бактерии с окружающей средой.

Цель работы определила постановку следующих задач:

♦ Идентификация и комплексное исследование кристаллов минерала, образующегося в результате жизнедеятельности данной бактерии.

♦ Исследование накопления ионов металлов клетками А. brasilen.se.

♦ Исследование активности фермента глутаминсинтетазы А. brasilen.se в присутствии ионов 5-, р-, (1- и /-элементов, а также некоторых элементоорганических катионов.

Научн;

ая новизна

♦ Обнаружено явление образования минеральных кристаллов при культивировании почвенной азотфиксирующей бактерии Аго5рт11ит ЪгаьИете Бр 245, которые охарактеризованы как модификация минерала струвита (ЫН4М§Р04 • 6Н20).

♦ Исследовано накопление ряда ионов металлов клетками бактерии А. ЬгазИете.

♦ Проведено комплексное исследование влияния ионов 5-, р-, й- и /-элементов на каталитическую активность глутаминсинтетазы А. Ьга.5'йеп$е.

♦ Найдена количественная корреляция структура-биологическая активность по воздействию на глутаминсинтетазу в ряду 1,5-дикетонов и солей пирилия, тиопирилия и селенопирилия.

Практическая значимость работы

Обнаруженное явление образования кристаллов струвита в среде культивирования А. brasilen.se совместно с данными по накоплению ионов металлов клетками бактерии позволяет по-новому подойти к рассмотрению механизмов функционирования системы микроорганизм-почва-растение.

Данные по активности ГС А. ЬгавИепве в присутствии ионов металлов и элементоорганических катионов дают дополнительные сведения, необходимые для построения низкомолекулярной модели активного центра ГС, ключевого фермента азотного метаболизма как бактерий, так и более высокоорганизованных видов.

Основные положения, выносимые на защиту

♦ Состав и структура кристаллического минерала, образующегося в результате деятельности бактерии А. brasilen.se.

♦ Накопление ионов металлов биомассой А. ЬгазИете.

♦ Взаимодействие глутаминсинтетазы А. ЪгаьИеюе с ионами е-, р-, ¿- и /-элементов.

♦ Взаимодействие глутаминсинтетазы с солями пирилия, тиопирилия, селенопирилия и некоторыми 1,5-дикетонами.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-й конференции Международного союза по биохимии и молекулярной биологии «Молекулярное узнавание» (Сингапур, 1995), XXIX международном спектроскопическом коллоквиуме (Лейпциг, Германия, 1995), 10-м Международном конгрессе по азотфиксации (С.-Петербург, Россия, 1995), VI Всероссийской конференции «Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов» (Саратов, Россия, 1996), 17-м Международном симпозиуме по органической химии серы (Цукуба, Япония, 1996), Международном симпозиуме по субповерхностной микробиологии (Давос, Швейцария, 1996), VII Международном симпозиуме по азотфиксации небобовых растений (Файсалабад, Пакистан, 1996), 26-м Международном симпозиуме по аналитической химии окружающей среды (Вена, Австрия, 1996), XXIII Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Балатонфюред, Венгрия, 1996), 8-м Конгрессе Международного союза микробиологических обществ (Иерусалим, Израиль, 1996), VII Межвузовской конференции «Новые достижения в органической химии» (Саратов, Россия, 1997), 17-м Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Сан-Франциско, США, 1997), 7-й Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Сан-Лоренцо, Испания, 1997), 7-й Европейской конференции по электроанализу (Коимбра, Португалия, 1998), Европейской конференции по взаимодействию бактерий с металлами и радионуклидами (Дрезден, Германия, 1998).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы в отечественных и зарубежных изданиях.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста и включает введение, 3 главы, заключение, выводы и список литературы из 342 наименований, содержит 35 рисунков, 2 фотографии и 9 таблиц.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. 1. Роль ионов металлов в жизнедеятельности бактериальной клетки

В живых клетках, в том числе и в клетках бактерий, низкомолекулярные иошщые соединения представлены чрезвычайно широко, от простейших ионов водорода и гидратиро-ванных электронов до сложных ионных ассоциатов органических соединений. Если применительно к живой материи правомерна вообще какая-либо классификация соединений, ее составляющих, по важности, то первое место, по всей видимости, принадлежит ионам водорода, а следом располагаются ионы металлов.

Содержание элементов в бактериальной клетке варьирует в широких пределах. Принято разделять все элементы, составляющие живую материю, на эссенциальные,— абсолютно необходимые для функционирования клетки, и условно ксенобиотические, не являющиеся в большинстве случаев жизненно важными, а иногда оказывающиеся ядовитыми для организма. Эссенциальные элементы, в свою очередь, делятся на основные, или мажорные, концентрация которых в клетке превышает 10"4 М, и минорные, или микроэлементы, концентрация которых обычно очень мала, но они необходимы для развития и роста клетки.

Готтшалк [11] выделяет 10 мажорных элементов: С, О, Н, N. являющиеся основными составляющими клетки, и Б, Р, К, Са, Ре. Примерами микроэлементов служат Zn, Мп, Мо, Бе, Ыа, Со, Си, N1, V. Ниже приведены данные по среднему содержанию химических элементов в биомассе бактерий (мг/100 г сух. в-ва, [12]):

С 54000 С1 230 Бе 0,05-0,15

о 23000 Б* 18 V 0,022

N 9600 Ре 25 В 0,55-2,4

н 7400 Си 3,7-12 А1 10-21

Са 510 гп 0,1-28 Ва 18-90

м§ 700 Бг 0,27-30 и 20-50

Ыа 460 Мп 3-7,5 п 2,1

К 1000-11500 Со 0,07-0,2 V. А§ 0,1-1,0

Р 3000 N1 0,6 РЬ 0,6-1,5

Б 530 Мо 0,3-2 ть 0,22-64

и 4,7-190

Содержание металлов в микрорганизмах может варьировать в широких пределах, в

зависимости от вида организма и условий роста. В разных час