Флуоресцентная метка-якорь в структурном анализе олигосахаридов и изучении углеводсвязывающих белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ПАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.Л. ОВЧИННИКОВА

па правах рукописи

ШЮГОВА Надежда Владимировна

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МЕТКА-ЯКОРЬ В СТРУКТУРНОМ АНАЛИЗЕ ОЛИГОСЛХАРИДОВ И ИЗУЧЕНИИ УГЛЕВОДСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

Специальность: 02.00.10 - Биоорганичсская химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискании ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

003067023

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Бовин Н.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Молотковский Ю.Г.,

доктор химических наук Книрель Ю.А.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии

Защита состоится «_17_» января 2007 г. В 10-00 на заседании специализированного совета Д.002.019.01. при инстиг^е биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117991 Г'СП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « 1:5 » декабря 2006 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

В.А. Несмеянов

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Задачами гликомики являются определение структуры совокупности углеводных цепей на уровне целого организма, клетки или отдельного гликопротеина (прямая гликомика), а также обнаружение и изучение углевод-связывающих белков данного вида организма, органа или клеток («обратная» гликомика). Очевидно, что без миниатюризации методов изучения углевод-связывающих белков, т.е. создания гликочипа, задачи обратной гликомики решить невозможно. Особенно привлекательным является конструирование чипов на основе гликопротеиновых углеводных цепей, полученных непосредственно после разделения аналитической ВЭЖХ- тогда прямая гликомика дает инструмент исследования обратной гликомике. Возможным решением этой задачи является введение в олигосахарид метки, объединяющей в себе функции флуорофора и линкера: флуорофор позволяет легче разделить и идентифицировать олигосахариды с помощью ВЭЖХ, а линкер необходим для иммобилизации (принта) меченых олигосахаридов на чипе. Рутинным уровнем чувствительности аналитической ВЭЖХ в структурном анализе олигосахаридов является 10-100 пмоль. Хотя данного количества достаточно для принта чипов, до сих пор олигосахариды гликопротеинов, выделенные в ходе аналитической ВЭЖХ, для этого не использовались. Создание гликочипов открывает уникальные, недоступные ранее возможности в фундаментальных исследованиях углевод-белкового и углевод-углеводного взаимодействий, а также практического применения: для идентификации патогенов и токсинов, для онкодиагностики, трансплантации, выявления аутоиммунных заболеваний, контроля вакцинации и т.д.

Цель работы. Целью данной работы была разработка методологии, позволяющей использовать олигосахариды - 1Ч-цепи гликопротеинов, полученные в результате аналитической ВЭЖХ - для изучения углевод-связывающих белков. В соответствии с этой целью, были поставлены следующие задачи: 1) синтез флуоресцентной метки-якоря с двумя функциональными группами, одна из которых отвечает за взаимодействие с восстанавливающим концом олигосахарида, а другая - за иммобилизацию на чипе; 2) оптимизация стадий мечения, разделения и иммобилизации олигосахаридов; 3) принт гликопротеиновых >1-цепей, выделенных с помощью аналитической ВЭЖХ, на микрочип и его проверка с помощью лектицов и антител.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на ^^странице машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Заключения, Выводов и списка литературы; содержит-/^ рисунков, /^схем и $ таблиц.

Научная новизна и практическая ценность. Показано, что олигосахариды, меченые йпос-йу или 2-аминопиридином, после ВЭЖХ-разделения могут быть трансформированы в производные, пригодные для иммобилизации на 20- и ЗО-микрочипах. Продемонстрировано, что количество олигосахаридов, выделенных в ходе аналитической ВЭЖХ, является достаточным для практического принта гликочипов. Создан прототип чипа на основе 1<Г-цепей гликопротеинов. Разработаш1ая методология начинает использоваться для измерения уровня углевод-связывающих антител крови человека. Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на VI Школе по углеводам (Дебрецен, Венгрия, 2000 г.), Школе по гликоконъюгатам ФЕБО (Лиль, Франция, 2000 г.), Международной молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002 г.); на 18 Международном симпозиуме по гликоконъюгатам «йусо XVIII» (Флоренция, Италия, 2005 г.), где был получен приз за лучший постер; международной конференции «Glycobiology 2005» (Бостон, США, 2005 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи.

Содержание работы

На первом этапе исследования проводился поиск бифункциональной флуоресцентной метки для олигосахаридов; ее введение должно быть эффективным, меченые производные должны быть стабильны, хорошо разделяться с помощью ВЭЖХ, и нести функциональную группу для последующей иммобилизации на чипе. В качестве таких меток исследовались: 1) несколько гидразидов кислот, 2) Бтос-глицин, и 3) 2-аминопиридин.

1. Гидразиды карбоновых и сульфокислот в качестве бифункциональной метки

На основании литературных данных для синтеза бифункциональной флуоресцентной метки были выбраны гидразиды карбоновых и сульфокислот, поскольку они вводятся в молекулу сахарида по восстанавливающему концу в мягких условиях (рН не ниже 3.0, температура не выше 70°С, относительно небольшой избыток реагента, легкость отделения от продукта мечения). Оказалось, однако, что гидразиды сульфокислот в качестве бифункциональной метки не годятся из-за низкой устойчивости меченых сахаридов, поэтому в дальнейшем исследовались только гидразиды карбоновых кислот. На примере гидразида М-(п-феноксазонфенил)-аминоуксусной кислоты были подобраны оптимальные условия для мечения 01сЫАс; реакция протекает с более чем 70% выходом, меченый сахарид устойчив при хранении в растворе. Чувствительные к присутствию кислоты олнгосахариды (например, Ьеу и НЗОзЬе", которые в кислых условиях теряют фукозу и сульфогруппу) были устойчивы в условиях проведения реакции мечения.

Далее проводился синтез шести дигидразидов карбоновых кислот по следующим схемам:

1)

СН.СООМе

СН-ССЖН,

2 3

2)

(! Л—И(СН,СООН),

^ А—М(СН2СОЧ,Н3)г

хо

Нз^о

хос

СО-Н2Ы2ОС.

СО-Н.М.ОС.

где X = С1 или остаток >1-гидроксисукцинимида

Синтетические схемы 1-3 не дали ожидаемых дигидразидов (при реализации схемы 3, выход дигидразида был около 1%). Дигидразид, полученный по схеме 4, при взаимодействии с ЯсИАс вместо меченого сахарида давал продукт внутримолекулярной циклизации. Дигидразид полученный по схеме 5 быстро окислялся на воздухе, а продукт взаимодействия дигидразида (схема 6) с ИсКАс оказался неустойчив. По этим причинам от флуоресцентных гидразидов кислот в качестве меток-якорей пришлось отказаться.

2. К-(9-флуоренил-метоксикарбонил)глицин

В дальнейшем использовалась принципиально иная химия мечения, основанная на том, что метка вводится не в свободный олигосахарид, а в его производное -гликозиламин. Кроме того, бифункциональная метка основана не на симметричной молекуле (как в случае гидразидов кислот), а на временной защите одной из двух разных функций. Для введения такой метки использовался сукцинимидный эфир Н-(9-флуоренил-метоксикарбонил)глицина (Ртос-Яу-З!), которым ацилировали гликозиламины (схема 7).

1ЧНАс

Схема 7. Ацилирование гликозиламинов сукцинимидным эфиром М-(9-флуоренил-метоксикарбонил)глицина и удаление Ртос-защиты.

Fmoc-Gly был выбран потому, что: 1) Fmoc-защнта является хорошей флуоресцентной меткой, 2) при обработке соответствующего производного в мягких условиях (пиперидином или морфолином) Fmoc-защита удаляется, 3) образующееся глицильное производное (схема 7) с одной стороны, устойчиво, а с другой - удобно для последующей иммобилизации. Таким образом, разделение олигосахаридов происходит в виде Fmoc-Gly-производных с флуориметрической детекцией, а последующее присоединение к поверхности чипа - в виде глицильного производного, которое уже не содержит объемной гидрофобной группы, что имеет несомненные преимущества на стадии применения гликочипа. Условия мечения оптимизировали на примере сиалоолигосахарида 1 IOS (рис. 1).

Neu5Accc2-6Galß 1 -4GlcNAcß 1 -2Man<xl-3

а) N Manß 1 -4GlcNAcß 1 -4GlcNAc Neu5Accc2-6Galß 1 -4GlcNAcß 1 -2Manal -6 /

Galßl -4GlcNAcß 1 -2Manal -3 ч

б) ^Manßl-4GlcNAcßl-4GlcNAc Galß 1 -4GlcNAcß 1 -2Mana 1 -6 X

Рис. 1. Структуры олигосахаридов 1 IOS (а) и 90S (б).

На первой стадии свободный 1 IOS превращали в соответствующий гликозиламин обработкой бикарбонатом аммония, затем вводили метку. Степень превращения 1 IOS в Fmoc-Gly-производное (оценивали с помощью ВЭЖХ) составила 75%. Чувствительность определения Fmoc-Gly-HOS с использованием флуориметрического детектора составляет 0.5 пмоль.

2.1. Выбор метода отщепления олигосахаридов.

Было проверено несколько вариантов проведения этой стадии. В качестве модельного объекта был выбран человеческий ai-кислый гликопротеин (АГП), который имеет 5 сайтов гликозилирования и для которого характерна высокая степень гетерогенности: АГП содержит двух-, трех- и четырехантенные олигосахариды полилактозаминового типа, моно- и дифукозилированные, большинство из которых сиалилировано. Содержание углеводов в АГП составляет около 45% (по массе). В данной работе использовался десиалилированный АГП (аАГП), чтобы упростить олигосахаридный профиль.

В гликозиламины вводили метку с помощью Fmoc-Gly-SI, количество отщепленных от белковой цепи олигосахаридов оценивали на стадии ВЭЖХ-детекции, используя соответствующее производное Galal-6Glcßl-Gly в качестве стандарта. 2.1.1. Гидразинолиз

Пул олигосахаридов аАГП получали методом гидразинолиза, а гликозиламины -обработкой полученной смеси олигосахаридов насыщенным раствором бикарбоната аммония (схема 8).

сн2он

¿г

ЫНАс

Схема 8. Отщепление олигосахаридов от белкового кора (обозначен как Р) щдразинолизом с последующим превращением в гликозиламины.

Гликозиламины далее превращали во Ртос-01у-производные и разделяли с помощью ВЭЖХ (рис. 2а).

а)

б)

в)

Время, мин

Рис. 2. Обращеннофазная хроматография Ртос-Иу-производных олигосахаридов, выделенных из аАГП человека гидразинолизом (а), с помощью карбоната аммония (б), и с помощью РКО-азы И (в). Колонка Ууйас С,8 (4.6 мм*2.5 см). Элюция в градиенте от 10% до 50% ацетоншрила в воде в течение 100 минут, скорость потока 1 мл/мин.

СН2ОН Р -оМНССЬ-Авп (ОН У

ов-о

2)Н+, Н20

ШАс

Ас20 ЫаНСО*

СН2ОН

"О ЫН,НС03 /ОН >-ОН-►

оэ-о

оэ-

1ЧНАс

Суммарный выход меченых олигосахарндов составил 50%. Олигосахариды фракции № 12 дополнительно разделяли на амипо-фазной колонке. 2.1.2. Отщепление о.чигосахаридов карбонатом аммония

В 2001 году был предложен метод отщепления О-цепей олигосахарндов насыщенным раствором карбоната аммония в концентрированном водном аммиаке. В используемых условиях, как сообщают авторы , происходит также и отщепление М-цепей, при этом продуктом реакции являются необходимые нам для мечения гликозиламины, которые, таким образом, нет необходимости получать из свободных олигосахарндов (как в случае гидразинолиза) (схема 9).

Схема 9. Отщеплеиие Ы-цепей от белкового кора с помощью карбоната аммония.

Вторым методически важным преимуществом представлялось удобство удаления летучих реагентов (аммиак и карбонат аммония).

Эффективность отщепления проверяли на примере К-цепей человека, который содержит около 2.5% (по массе) углеводов. Нейтральные олигосахариды составляют 75%, моносиалилированные - 18%, дисиалилированные - 6%. Отщепление проводили в течение 2 сут. при 60°С. После мечения полученные Ртос-СТу-олигосахариды десиалилировали и разделяли с помощью ВЭЖХ (рис. 3).

Рпс. 3. Хроматография Ртос-01у-производных олигосахарндов, выделенных из иммуноглобулина О человека. Колонка Уу(1ас С]8 (4,6 ммх2.5 см). Элюция: 20% ацетонитрил. Скорость потока 1 мл/мин.

Y. Huang, Y. Mechref, M. V. Novotny. Microscale Nonreductive Release of O-Linked Glycans for Subsequent Analysis through MALDI Mass Spectrometry and Capillary Electrophoresis // Anal. Chem. 2001,73, 6063-6069.

8.0-,

io го 30 ад so eo

Время, мин

В приведенных условиях отщеплялось только 13% от общего количества олигосахаридов. Аналогичный результат (выход 14%) наблюдался и в случае аАГП. Повышение температуры и увеличение времени проведения реакции практически не изменяло эффективности отщепления, но приводило к появлению побочных продуктов (рис. 26), по-видимому, пептидов, дающих соответствующие Fmoc-Gly-производные. 2.1.3. Отщепление PNG-азой

Пептид-1<1-гликозидаза F (PNG-аза) расщепляет амидную связь между остатком GlcNAc и аспарагином, при этом олигосахарид освобождается в виде гликозиламина. Привлекательность подхода состоит в том, что полученные при отщеплении гликозиламины можно далее использовать для превращения во Fmoc-Gly-производные сразу же после отщепления, in situ.

Отщепление олигосахаридов от аАГП проводили в отсутствие денатурирующих агентов, используя летучий EtjN-AcOH буферный раствор. Максимальный выход олигосахаридов, 50%, был получен в следующих условиях: 100 мМ Et3N-AcOH (рН 7.3), 5-10 U PNG-азы. Соответствующий хроматографический профиль олигосахаридов в виде Fmoc-GIy-производных представлен на рис. 2в.

Сравнение профилей (рис. 2) позволяет заключить, что наибольшее разнообразие и максимальный выход олигосахаридов дает гидразинолиз, в то время как эффективность отщепления карбонатом аммония заметно ниже, а ферментативное отщепление (методически более удобное) уступает гидразинолизу в отношении разнообразия полученных олигосахаридов (рис. 2), иначе говоря, фермент отщепляет не все углеводные цепи.

2.2. Установление структуры олигосахатшдов

Для идентификации олигосахаридов, вьщеленных из IgG в виде Fmoc-производных, применяли масс-спектрометрию. Идентифицированы четыре типа двухантенных фукозилированных цепей: а именно дигалактозилированные, моногалахтозилированные, агалакто- и агалакто- с бисектным GlcNAc; полученные результаты согласуются с литературными данными.

Для олигосахаридов, полученных в результате гидразинолиза аАГП (рис. 2а), проводили масс-спектрометрический анализ в сочетании с экзогликозидазным отщеплением терминальных моносахаридов. Предполагаемые структуры олигосахаридов (в задачу данного исследования не входило полное установление структуры всех олигосахаридов) приведены в табл. 1:

Таблица 1. Молекулярные ионы Fmoc-Gly-меченых олигосахаридов, полученных гидразиколизом

О - Gal, О - Man, □ - GlcNAc, А -

Сравнение полученных данных с литературными позволяет предположить наличие в АГП не только ранее описанных структур, но и нового трифукозилированного олигосахарида, а именно №11а (табл. 2).

После разделения и идентификации олигосахариды превращали в глшдальные производные (схема 7), которые далее использовали для принта 2П-гликочипа. 2.3. Конструирование 2Р-чипа

В качестве платформы был взят стеклянный чип, покрытый полиэтиленгликолем с активированными (N-гидроксисукцинимидом, NHS) карбоксильными группами («Schott Nexterion», Германия); ранее такие чипы применялись для печати синтетических спейсерированных олигосахаридов^. Олигосахарид с аминогруппой в составе спейсера в буферном растворе наносили с помощью робота на NHS-слайд, в результате чего образовывалась ковалентная связь с полимером (рис. 4). Диаметр одного дота, занятого лигандом, составляет ~ 200 мкм. Количество наносимого материала составляет около 10 фемтомолей на дот.

Рис. 4. Иммобилизация спейсерированных олигосахаридов на NHS-активированной поверхности. Fmoc-Gly-производные олигосахаридов из аАГП (фракции №8-10 и № 12-14, табл. 1) превращали в глицильные производные (см. выше) и печатали на NHS-чип. Факт иммобилизации олигосахаридов подтверждали с помощью растительных пектинов известной специфичности, а именно: из Erythrina cristgalli (связывается с N-ацетиллактозамином), Aleuria aurantia (связывается с терминальными остатками ct-L-фукозы) и из Ricinus communis (связывается с остатками ß-галактозы). В качестве контролей на тот же чип наносили глицильное производное 90S-Gly (рис. 1) и 3-аминопропилгликозид трисахарида Le" (Galßl-4(Fucal-3)GlcNAc). Полученные результаты приведены на рис. 5.

Олигосахарид

f O. Blixt, S. Head, T. Mondala, C. Scanlan, M.E. Huflejt, R.A. Alvarez, M.C. Bryan, N.V. Bovin, et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004,101,17033-17038.

1#Д =5000

гоооо

15000

10000

Рнс. 5. Взаимодействие иммобилизованных па чипе олигосадаридок из аАГП и контролей (90S-Gly и Le") с пиотщилиро ванным и растительными лектинами: го Erylhrina crislgalli ( I I ), из Ateuria aar cania (^И) и из Ricinus communis ( ). Проявление чинов осуществляли с помощью флуоресцентно-меченого стрептавиднна. Фон - сигнал от поверхности, не содержащей лиганд.

Специфичный к фукозе лектин из Aleuria auramia взаимодействует, как и ожидалось, как с Le*, так и с олигосахаридами аАГП — именно теми, которые, по данным масс-спектрометрии, содержат остатки фукозм (№ К, 10, 12.1, 14, табл. 1), Лектнн из Erylhrina cristgalli, узнающий N-ацетиллактозамин, взаимодействовал с контрольным 90S, а также с некоторыми из олигосахаридоп аАГП. Агглютинин из Ricinus communis взаимодействовал со всеми олигосахаридами, что также ожидалось, т.к. все они имеют в своем составе терминальный остаток ß-галактозы. Таким образом, пектиновое проявление подтверждает факт иммобилизации олигосахарлдов из аАГП, и, таким образом, работоспособность полученного чипа.

С помощью того же чипа было изучено взаимодействие олнгосахаридов аАГП с антителами, а именно сыворотками крови здоровых доноров и больных раком молочной железы. Типичный результат такого рода сравнения приведен на рис, 6; следует отметить качественно разные профили связывания.

'с.

30000

25000

гоооо

15000 г

10000

5000

/

Н

i

i'i

i

& & Ф «

Ш ^ $ ф ф

№

J? ДГ №

JH0

jr JT J> Jt J? f- jr J> J>

sfT sf eff

Рис. 6. Взаимодействие иммобилизованных на 20-чипе фракций из аАГП с сывороткой Сольной

раком молочной железы, II стадия (ЕшЗ ) и сывороткой здорового донора, j-1 ), разведение 1:50.

Проявление чипов осуществляли с помощью флуоресцентно-меченых вторичных антител фон -сигнал от поверхности, не содержащей лиганд.

В частности, антитела здорового донора со значительно большей интенсивностью связываются с четырех антенным и олигосахаридами, содержащими дополнительный лактозами новый блок (фракции № 8-10, табл. 1), в то время как антитела он кобол ьного - с трех- и четырехантенные (фракции №12 и 13). Приведенные данные, несмотря на их предварительный характер, демонстрируют перспективность дальнейшего развития гликочипа для онкоди агностик и.

Суммарно, данные по иммобилизации олигосахаридов на 2D-чипе позволяют сделать вывод о том, что количества N-цепей, выделенных после аналитической ВЭЖХ (-100 пмоль), достаточно для получения значимого количества (нескольких cor) чипов, учитывая, что количество повторов каждой точки на чипе равно 6. Необходимо также отметить высокий флуоресцентный сигнал на чипе, превышающий фоновое значение в десятки и сотни раз, то есть предложенный выше подход обеспечивает иммобилизацию необходимого для надежной детекции количества олигосахаридов.

3. 2-Аминопиридиновая метка

2-Аминопиридин (2АР) на сегодняшний день является наиболее популярной и широко используемой в структурном анализе олигосахаридов меткой. В виде 2АР-производных проанализировано огромное количество олигосахаридов, выделенных из гликопротеинов, для них в литературе приведены времена удерживания, что облегчает их идентификацию. Кроме того, большое количество 2АР-меченых олигосахаридов коммерчески доступны, т.е. при наличии метода иммобилизации их можно было бы использовать для принта на чипе. Следует отметить также, что благодаря минимальному размеру и низкой гидрофобности, эта метка особенно привлекательна с точки зрения последующего изучения углевод-связывающих белков.

2АР вводится в молекулу олигосахарида с помощью восстановительного аминирования, схема 10:

Схема 10. Взаимодействие олигосахарида с 2-аминопиридином.

2АР-меченый олигосахарид имеет малоактивную вторичную аминогруппу. Тем не менее, в данной работе была сделана попытка проацилировать эту аминогруппу в жестких условиях, чтобы с помощью ацилирования иммобилизовать 2АР-олигосахариды на №18-чипе. Однако реакция шла только по ОН-группам олигосахарида, то есть приводила к образованию не Ы-, а неустойчивых О-ацильных производных. Очевидно, что такое присоединение не отвечает поставленной цели. Поэтому был проведен поиск других методов иммобилизации 2АР-олигосахаридов.

3.1. Использование 2АР-иронзводных олигосахаридов в конструировании ЗР-чппа

Технология создания ЗО-гидрогелевого чипа, разработанного в ИМБ РАН для ковалентной иммобилизации ДНК и бежов, основана на фотоиндуцируемой сополимеризации, в которой объединены в одну стадию полимеризация геля и встраивание в него молекул, имеющих аминогруппы. Содержащийся в смеси бисакриламид (1) присоединяет аминокомпонент (2) по Михаэлю, продукт этой реакции (3), сополимеризуется с метакриламидом (схема 11), описанная степень включения Я-ИНг составляет около 50%. Количество наносимого материала составляет до 1 пикомоль на элемент геля.

R-NH,+ iCH^CHCOMHLCH, — НХ^СНСОМНСН.КНСОСН^Н^МН R-^.Coполимеризация

' ' с метакркланндом

(2) (I) (3)

Схема и. Последовательность реакций, приводящая к иммобилизации лиганда (R-MH;) в полиакриловый гидрогель.

В данной работе изучена возможность включения в ЗО-чип 2АР производного мелибиозы Gala 1-6 Gl с (Mel-ZAP). В качестве реакционно способного контроля использовали Mel-ol-NHj, то есть другое производное мепибиозы, восстанавливающее звено которого также раскрыто, но аминогруппа первичная. Было изучено взаимодействие антител специфичных к «Gal-эпитопу с указанными двумя вариантами сахарила, отличающихся только линкером (рис. 7).

5

Msi-ol-NHj Mel-SAP ФО«

Рис. 7. Взаимодействие антител с Ме1-2АР и Ме]-о]-ЫНь иммобидизобаВКЬШи в ЗО-гелевом митфочитк. Проявление чипов осуществляли е помощью флуоресцентно-меченых вторичных антител. Фон - сигнал от геля, не содержащего лиганд.

2-АминогиридиноВое производное мелибиозы действительно включалось в полимерный гель. Ситная и случае Ме1-2АР был примерно в два раза слабее, чем в случае с (см. рис, 7), по-видимому, реакция включения Ме1-2АР в гель протекает с меньшей эффективностью, чем в случае Ме1-МЬ, однако и этого количества достаточно для получения достоверною сигнала. Таким образом, 2АР-производные сахаридов без какой-либо предварительной модификации могут использоваться в ЗБ-чипе. 3.2. Использование 2АР-протво;ишх олигосахарилов в конструировании 2Рчшш Из литературы известно, что 2 АР-производные3 олигоеахаридов можно превратить в соответствующие аминоальдитолы (схема 10),

11 S. Hase. Conversion of pyridylamino sugar chains to 1-amino-l-dcoxy derivatives, intermediates for tagging with fluorescein and biotin. J. Rioehem, 1992,112. 266-268

Схема 10. Превращение 2-аминопиридинового производного олигосахарида в аминоальдитол. В данной работе 2-аминопиридиновое производное мелибиозы (Ме1-2АР) восстанавливали водородом над палладиевой чернью, а затем обрабатывали гидразином. Факт образования 1-амино-1-дезоксиальдитола был подтвержден масс-спектрометрией. Затем была проведена модификация более сложного соединения, . 908-2АР, в микромасштабе (250 пмоль). В качестве катализатора использовали родиевые наночастицы, одним из преимуществ которых является легкость удаления из реакционной смеси центрифугированием. Согласно данньм ВЭЖХ, степень конверсии 90Э-2АР в аминоальдитол, ЭОЭ-оШНг, составляла 30%. Это соединение было иммобилизовано на 2В-чипе, в качестве стандарта для сравнения использовали 908-йу, степень иммобилизации оценивали с помощью лектина из ЕгуЛгта сг1$1§а1Н. Эти два производных 908 взаимодействовали с лектином примерно одинаково, что подтверждает факт превращения 908-2АР в соединение, содержащее реакционно-способную аминогруппу.

Таким образом, 2АР-меченые олигосахариды можно использовать для иммобилизации на чипе либо в неизменном виде (ЗО-чип), либо после относительно несложного превращения в аминоальдитолы (2В-вариант чипа). Тем не менее, Ешос-Иу представляется более перспективной, так как: 1) обладает более высокой интенсивностью флуоресценции по сравнению с 2АР, 2) реакции мечения и иммобилизации методически проще и надежнее, 3) линкер не содержит ароматической группы. 4. Оптимизация иммуноферментного анализа

Несмотря на интенсивное развитие исследований с использованием чипов, изучение углевод-белкового взаимодействия с помощью классического твердофазного метода анализа (ИФА) в 96-или 384-луночных планшетах по-прежнему остается актуальным. Этот метод прост, хорошо воспроизводим, дает высокое соотношение сигнал/шум, широкий круг неогликоконыогатов, используемых для адсорбции на планшет, доступен коммерчески. Для ИФА требуется рутинное оборудование, в то время как оборудование для чипной технологии пока еще дорого. Недостатком ИФА является довольно большой расход гликоконъюгата, около 0.1 мг (~ 100 нмоль углеводов на планшет, или ~1 нмоль в лунку). Нет сомнений, что снижение расхода олигосахаридов на 1-2 порядка величины могло бы значительно расширить репертуар используемых олигосахаридов, и,

соответственно, круг решаемых задач. С этой целью было проведепо сравнительное исследование двух подходов, первый из которых основан на химической иммобилизации полиакрилового гликоконъюгата па аминированном полистироле, а второй - на физической адсорбции полиакрилового коньюгата, имеющего максимально возможный размер. Были синтезированы гликополимеры двух типов (рис. 8): первый - конъюгаты для ковалентной иммобилизации, в которых X - активная группа, второй - «инертные», в которых X - это МНСНгСЩОН. В качестве углеводной компоненты (Иус) использовали спейсерированный Вщ-, т.е. Са1а1-3(Рисос1-2)Оа1. Оба полимера были синтезированы в виде высоко- (2000 кДа) и низкомолекулярного (30 кДа) конъюгатов. Отметим, что обычно в ИФА используют гликоконъюгаты с относительно низкой молекулярной массой 30 кДа.

где X - остаток п-нитрофенола (для конъюгатов с Мг = 30 кДа) или М-гидроксисукцинимида (для конъюгатов с Мг = 2000 кДа), или ШСН2СН2ОП.

Рис. 8. Структура полиакриловых гликоконъюгатов.

Ковалентную иммобилизацию гликоконъюгатов молекулярной массы 30 и 2000 кДа, содержащих активированные карбоксильные группы, проводили на аминированном полистироле (рис. 9).

3 X С1усКН ° о О

+ 1МН, ЫН2 N4

' ' Н '

Рис. 9. Ковале1гп1ая иммобилизация активированных полиакриловых гликоконъюгатов на аминированном полистироле.

Для «инертных» гликохонъюгатов молекулярной массы 30 кДа и 2000 кДа была проведена оптимизация условий физической адсорбции на не модифицированном полистироле (96-луночные планшеты, объем лунки 200 мкл). Для физической адсорбции 30 кДа конъюгатов оптимальными условиями оказались: 1 ч при 37°С или 16 час при 4°С в концентрации 5-10 мкг/мл. Для 2000 кДа конъюгатов - 24 ч при комнатной температуре и концентрации 0.5 мкг/мл. Далее изучалось взаимодействие ковалентно иммобилизованных и физически адсорбированных гликоконъюгатов с антителами (рис. 10, табл. 2).

(конц. конъюгата, мкг/мл)

Рис. 10. Связывание анти-В,н антител с физически адсорбированными конъюгатами Вт-РАА30 (1), Вт-РАА2000 (2) и ковалентно иммобилизованными конъюгатами Вщ-РАА30 (3), В„~РАА20°0 (4).

Таблица 2. Сравнение различных способов иммобилизации полиакриламидных гликоконъюгатов на полистироле, данные ИФА.____

Способ иммобилизации Количество В^, дающее в ИФА соотношение сигнал/фон ~ 3, пмоль Вт /ячейка Концентрация Вщ, дающая в ИФА величину OD*~1.0, пмоль /ячейка Величина ОЭ в ячейках, не содержащих антигена (фон)

Ковалентная иммобилизация В„-РАА30 8.0 150 0.30-0.50

ВП-РАА2000 2.5 40

Физическая адсорбция Bm—РАА30 24.0 400 0.03-0.05

Вп—РАА2000 1.3 40

*ОВ-оптическая плотность

Ковалентная иммобилизация давала существенный выигрьпц в расходе олигосахарида (рис. 10, табл. 2), однако, из-за высокого фона материала планшета (табл. 2) такая иммобилизация гликоконъюгатов на аминированном полистироле в дальнейшем не использовалась. В случае физической адсорбции использование гликоконъюгатов молекулярной массы 2000 кДа позволило снизить количество антигена на порядок по сравнению со стандартным реагентом молекулярной массы 30 кДа. С помощью радиоактивно-меченых В^-РАА30 и Вт-РАА2000 было показано, что только -2% от внесенного в лунку количества В,п-РАА30 реально адсорбируется на пластик, в то же время для Ви-РАА2000 эта величина достигает -20%. По-видимому, значительно большая молекула массы 2000 кДа связывается с большим количеством активных центров на поверхности полистирола и поэтому более прочно, чем 30 кДа; адсорбция идет

эффективно даже из разбавленных растворов. Кроме того, использование высокомолекулярного гликоконъюгата (>50 нм) гарантирует мультивалептное взаимодействие с антителами.

5. Ковалентная иммобилизация активированных полиакриламидных гликоконъюгатов на N11¡-чипах

Иммобилизация активированных полимерных гликоконъюгатов по приведенной выше схеме (рис. 9) была проведена также в варианте аминированного 20-чипа. Как показал опыт работы с аминированными планшетами, обе стадии - конъюгация олигосахарида с активированным полимером и последующая иммобилизация конъюгата на аминированной поверхности - проходят количественно, что важно как с точки зрения экономии сахарида, так и контроля всего процесса. Взаимодействие иммобилизованных конъюгатов с антителами показало, что на чипе, в отличие от полистироловых планшетов, фон получается низким (рис. 11). Количество наносимого материала составило около 60 фемтомолей углевода на дот.

1фл ! Т -г

4000 \ ^ —I—

|

зооо 1 :

!

2000

|

1000 1

о ,------,--.11---■• .1---,----1-,--•-1--

А.н-РАА30 Йл-РАА30 Аы-РАА2000 Вы-РАА2000 Фон

Рис. 11. Связывание антител сыворотки здорового донора группы крови О с ковалентко иммобилизованными А„-РАА30, В„-РАА30, Ац-РАА2000 и В„-РАА2000. Проявление чипов осуществляли с помощью флуоресцентно-меченых вторичных антител. Фон-сигнал от поверхности, не содержащей лиганд.

На чип наносили сыворотку донора группы крови О, то есть содержащую апти-Ащ и анти-Вт антитела. С гликоконъюгатом молекулярной массы 2000 кДа антитела взаимодействовали интенсивнее, чем с 30 кДа, что объясняется мультивалентным

связыванием. Следует отметить, что предложенный метод иммобилизации позволяет представлять олигосахариды на 20 микрочипе не в моновалентпой форме, как было описано ранее (см. п. 2.З., стр. 12), а в мультивалентной. Т.е. одна молекула активированного гликоконьюгата, присоединившись всего одной точкой к поверхности чипа, закрепляет на ней множество копий углеводных лигандов, что гарантирует мультивалентное связывание с антителами. Дополнительным преимуществом данного подхода является возможность контролировать степень иммобилизации коныогата и морфологию (качество) дотов на чипе, если в состав полимера ввести флуоресцентную метку.

5.1. Сравнение различных способов изучения углеводсвязывающих белков

Данные, полученные с использованием двух вариантов гликочипа, а также традиционного ИФА в 96-луночном варианте, приведены в табл. 3.

Таблица 3. Сравнение двух вариантов чипов (2Т) и 31)) и ИФА.

Параметры тест-системы ИФА в 96-луночном планшете 3D-4Hn 2П-чип

Олигосахариды иммобилизованы в виде OS-PAA OS-sp*-NH2 или OS-2AP OS-sp-NH2

Диаметр рабочей поверхности 5000 мкм 150 мкм 200 мкм

Количество олигосахарида необходимое для иммобилизации ~Ю"10 моль/лунка -10"12 моль/элемент геля ~10"14 моль/дот

Степень иммобилизации 2-20%" -50% -50-100%

Объем анализируемого образца, мл 10 0.1 0.1

* эр - спейсерная группа,

* 2% - выход при иммобилизации гликоконьюгата с молекулярной массой 30 кДа, 20% - выход гликоконьюгата с молекулярной массой 2000 кДа.

Прямое сравнение трех методов позволяет заключить, что каждый из них имеет преимущества перед другими. Из таблицы видно, что ИФА проигрывает чипам по всем параметрам, т.к. Ю- и ЗР-чипы позволяют использовать ультранизкие количества олигосахаридов (10"12 - 10"14 моль). Однако рутинный ИФА на сегодняшний день практичнее и не требует дорогостоящего оборудования для печати и чтения чипов. 30-чип, благодаря особенностям конструирования, позволяет разместить в 100 раз большее количество олигосахарида на той же площади и поэтому дает более интенсивный сигнал (высокую чувствительность) и более надежные количественные результаты. По-видимому, разработать «идеальный» метод, совмещающий в себе достоинства всех трех методологий, невозможно; каждый из них находит свою сферу применения и нишу в «обратной» гликомике.

Заключение

Проведенное исследование открывает возможность использования хорошо известных методов структурной химии углеводов для создания библиотек гликопротеиновых N-, а в последствии и О-цепей, и конструирования гликочипов на их основе. В дальнейшем, предложенная методология будет применятся для конструирования двух типов гликочипа. Первый, - универсальный, многоцелевой, -построенный на основе всех имеющихся на данный момент олигосахаридов. Этот инструмент предназначен для поиска новых углевод-связывающих молекул, исчерпывающей характеристики углеводной специфичности уже известных белков, поиска неизвестных углевод-опосредованных процессов, а также на первом этапе разработки практически важных диагностических систем. Второй тип чипа, который можно назвать гликомным, конструируется только из олигосахаридов данного гликопротеина, что позволит находить, какой именно из олигосахаридов этого гликопротеина опосредует его функцию; гликомный чип объединяет в себе функции инструмента и объекта исследования. Аналогично, можно будет делать чипы на основе более сложных гликомов - из данного типа клеток или органа. Очевидно, что информативность такого чипа тем выше, чем полнее на нем представлен гликом.

Разработанная в данной работе методология подходит для принта обоих типов гликочипов - универсального и гликомного, причем как в 2Б-так и в ЗО-варианте. Однако, по-видимому, только 2П-платформа, позволяющая работать на пикомольном уровне, полностью соответствует идеологии гликомного чипа. С точки зрения выбора метки, Fmoc-Gly представляется более перспективной для гликомного чипа, чем 2АР-метка, так как модифицирование последней методически заметно сложнее. Что касается универсального чипа, то на него можно наносить (после модификации) как Fmoc-Gly-олигосахариды и коммерчески доступные 2АР-гликаны, так и уже имеющиеся спейсерированные синтетические олигосахариды. Наконец, необходимо сделать выбор между двумя предложенными методами иммобилизации, то есть 1) нанесением олигосахарида на NHS-активированный чип и 2) присоединением олигосахарида к активированному полимеру с последующей иммобилизацией на ЫНг-чипе. Второй подход представляется предпочтительным, так как гарантирует мультивалентное представление олигосахарида, на обеих стадиях приводит к количественному выходу, а также позволяет вводить в полимер метку для контроля иммобилизации сахарида на чипе.

Таким образом, из исследованных в работе меток, платформ и методов иммобилизации выбраны наиболее рациональные и перспективные; предварительная, методологическая стадия развития данного направления закончена, и открывается возможность выполнять следующую стадию исследовательской программы - применение гликочипов для решения гликобиологических и медицинских задач.

Выводы:

1. Проведен систематический поиск флуоресцентных меток, позволяющих сначала разделять сложные олигосахариды с помощью аналитической ВЭЖХ, а затем их иммобилизовать. Показано, что олигосахариды, меченые Бтос-глициновой и 2-аминопиридиновой группами, после разделения могут быть трансформированы в производные, удобные для принта как на 20-, так и на ЗБ-микрочипах.

2. Разработаны методы иммобилизации, позволяющие представлять олигосахариды на 2Б-микрочипе в моновалентной и мультивалентной формах. Для представления в моновалентной форме аминопроизводное олигосахарида непосредственно присоединяется к активированным карбоксильным группам чипа, в то время как для представления в .мультиивалентной форме - к активированному полимеру, который затем конъюгируется с аминогруппам чипа.

3. Показано, что выделяемые с помощью аналитической ВЭЖХ пикомольные количества олигосахаридов - >1-цепей гликопротеинов, достаточны для практического конструирования гликочипов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Н.В. Шилова, Н.В. Бовин. Флуоресцентные метки для анализа моно- и олигосахаридов. Биоорг. Химия. 29(4), 339-355 (2003).

2. N.V. Shilova, О.Е. Galanina, T.V. Pochechueva, А.А. Chinarev, V.A. Kadykov, A.B. Tuzikov, N.V. Bovin. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays. Glycoconj. J. 22,43-51 (2005).

3. V.I. Dyukova, N.V. Shilova, O.E. Galanina, A.Y. Rubina, N.V. Bovin. Design of carbohydrate multiarrays. Biochim. Biophys. Acta. 1760, 603-609 (2006).

Принято к исполнению 12/12/2006 Исполнено 13/12/2006

Заказ № 1042 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Принятые сокращения

Введение 4 Обзор литературы

Глава 1. Флуоресцентные метки для анализа моно- и олигосахаридов

Глава 2. Общие представления о микрочипах 41 Экспериментальная часть

Оборудование и реактивы

Методы 47 Результаты и их обсуждение

1. Бифункциональные флуоресцентные метки

2. Выбор метода отщепления олигосахаридов.

3. Установление структуры Fmoc-Gly-олигоеахаридов, выделенных из IgG и АГП 88 4.2АР как бифункциональная флуоресцентная метка

5. Гликочип

6. Оптимизация иммуноферментного анализа

7. Сравнение трех «платформ» для изучения углеводсвязывающих белков 109 Заключение 111 Выводы 113 Список литературы

Принятые сокращения

АГП - (Xi-кислый гликопротеин 2АР - 2-аминопиридин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

4-ДМП - 4-диметиламинопиридин

ИФА - иммуноферментный анализ

КЭ - капиллярный электрофорез

МС - масс-спектрометрия

ОС - олигосахарид

ПАГЭ - полиакриламидный гель-электрофорез

ТГФ - тетрагидрофуран

Темед - М^Ы'^'-тетраметилзтилендиамин

ТСХ - тонкослойная хроматография п-ТСГ - п-толуолсульфогидразид

ТФУ - трифторуксусная кислота п-ФФАГ - гидразид М-(п-феноксазонфенил)-аминоуксусной кислоты

Atri - GalN Аса 1 -3 (Fuca 1 -2)Gal

Btri - Galal-3(Fuccxl-2)Gal

DMSO - диметилсульфоксид

DMF - диметилформамид

Et3N - триэтиламин

Fmoc-Gly-SI - сукцинимидный эфир 9-флуоренилметоксикарбонилглицина

GlcNAc - N-ацетилглюкозамин

Glyc - углеводный лиганд

IgG - иммуноглобулин G iMg - изомальтооктаоза

Lex - Gaip 1 -4(Fuca 1 -3)GlcNAc

Ley - Fucal -2Gaip l-4(Fucal -3)GlcNAc

Mel - Galal-6Glc, мелибиоза

NHS - N-гидроксисукцинимид

OD - оптическая плотность

90S - (Gaipi-4GlcNAcpl-2Manal-3,6)2Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAc

PAA и PAA200 - поли(М-2-гидроксиэтилакриламид), верхний индекс обозначает полимера, кДа

PBS - фосфатный буферный раствор PNG-аза F - пептид-Ы-гликозидаза F pNPA - поли(М-нитрофенил акрилат) pNSA - поли(И-оксисукцинимид акрилат) Ру-пиридин

YDS-(Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal-3,6)2Manpl-4GlcNAcpi-4GlcNAc

Недавно, вслед за геномикой и протеомикой возникла новая область исследования, гликомика [1]. Задачами гликомики являются определение структуры совокупности углеводных цепей на уровне целого организма, клетки или отдельного гликопротеина (прямая гликомика), а также обнаружение и изучение углевод-связывающих белков данного вида организма, органа или клеток («обратная» гликомика). Очевидно, что без миниатюризации методов изучения углевод-связывающих белков, т.е. создания гликочипа, задачи обратной гликомики решить невозможно. Особенно привлекательным является конструирование чипов на основе гликопротеиновых углеводных цепей, полученных непосредственно после разделения аналитической ВЭЖХ- тогда прямая гликомика дает инструмент исследования обратной гликомике. Возможным решением этой задачи является введение в олигосахарид метки, объединяющей в себе функции флуорофора и линкера: флуорофор позволяет легче разделить и идентифицировать олигосахариды с помощью ВЭЖХ, а линкер необходим для иммобилизации (принта) меченых олигосахаридов на чипе. Рутинным уровнем чувствительности аналитической ВЭЖХ в структурном анализе олигосахаридов является 10-100 пмоль. Хотя данного количества достаточно для принта чипов, до сих пор олигосахариды гликопротеинов, выделенные в ходе аналитической ВЭЖХ, для этого не использовались. Создание гликочипов открывает уникальные, недоступные ранее возможности в фундаментальных исследованиях углевод-белкового и углевод-углеводного взаимодействий, а также практического применения: для идентификации патогенов и токсинов, для онкодиагностики, трансплантации, выявления аутоиммунных заболеваний, контроля вакцинации и т.д.

Таким образом, целью данной работы была разработка методологии, позволяющей использовать олигосахариды - N-цепи гликопротеинов, полученные в результате аналитической ВЭЖХ - для изучения углевод-связывающих белков. В соответствии с этой целью, были поставлены следующие задачи: 1) синтез флуоресцентной метки-якоря с двумя функциональными группами, одна из которых отвечает за взаимодействие с восстанавливающим концом олигосахарида, а другая - за иммобилизацию на чипе; 2) оптимизация стадий мечения, разделения и иммобилизации олигосахаридов; 3) принт гликопротеиновых N-цепей, выделенных с помощью аналитической ВЭЖХ, на микрочипе и проверка чипа с помощью лектинов и антител.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.

Флуоресцентные метки для анализа моно- и олигосахаридов

Введение

Углеводные цепи гликопротеинов и гликолипидов выполняют множество разнообразных функций на поверхности клетки - от регулировки гидрофильности белка до высоко специфических рецепторных взаимодействий [2]. Поскольку многие из функционально значимых олигосахаридов углеводных цепей гликопротеинов и гликолипидов встречаются в исчезающе малых количествах, а их гетерогенность, особенно в гликопротеинах, очень велика, требуются все более совершенные методы их разделения и анализа, превосходящие нынешние как по чувствительности, так и по селективности. Одним из наиболее действенных путей повышения чувствительности и, одновременно, улучшения селективности разделения сахаридов, является введение в них флуоресцентных заместителей по восстанавливающему концу, то есть по С-1. Флуоресцентное мечение хорошо сочетается с такими методами разделения сахаридов, как ТСХ, ВЭЖХ, ионообменная жидкостная хроматография, а также различными вариантами электрофореза, включая капиллярный; кроме того, метка, как правило, облегчает разделение. В литературе последних лет прослеживается тенденция увеличения разнообразия и сложности используемых флуоресцентных меток. Очевидно, что каждый метод разделения ставит определенные требования к метке: так, для электрофоретических подходов нужна заряженная метка, а для ВЭЖХ - гидрофобная. Целью данного обзора является систематизация флуоресцентных меток, используемых для модификации восстанавливающих сахаридов, с учетом особенностей методов разделения и поставленной общей задачи исследования.

1. Метки, вводимые реакцией восстановительного аминирования

В настоящее время наиболее распространенным способом введения флуорофора в молекулы восстанавливающих углеводов является двухстадийный метод восстановительного аминирования (схема 1),

Схема 1. Реакция восстановительного аминирования сахаридов который основан на восстановлении основания Шиффа, образующегося при взаимодействии альдегидной группы сахарида с амином. В качестве восстанавливающего агента чаще всего используют цианоборгидрид натрия, поскольку с его помощью можно избирательно восстановить основание Шиффа в присутствии альдегида [3].

В качестве флуоресцентных заместителей при электрофоретическом разделении удобно использовать отрицательно заряженные метки. Как правило, это ароматические аминосульфокислоты (табл. 1, № 1-3). При использовании такого типа меток, достигается хорошая степень разделения особенно при использовании двумерного картирования, метка ANTSX [4-6], и высокая (пикомоли) чувствительность. Восстановительное аминирование сахаридов аминосульфокислотами характеризуется высокими выходами (до 95% [7]), однако отмечено, что остатки N-ацетилгалактозамина и N-ацетилглюкозамина модифицируются существенно хуже остальных моносахаридов (выходы не более 40% [7]). к Полные названия меток и реагентов см. в таблицах

R - остаток сахарида, X - флуоресцентная метка

В работе [9] был предложен микрометод анализа N-гликопротеиновых гликанов, основанный на дегликозилировании гликопротеинов с последующим флуоресцентным мечением образующихся сахаридов APTS (табл. 1, № 2); объем реакционной смеси на стадии мечения составлял 1 мкл; при этом степень очистки от непрореагировавшего APTS составляла более 95%, а выходы продуктов - более 70%. Анализ меченых олигосахаридов проводился методом высокоэффективного электрофореза с использованием ДНК-секвенатора, который позволяет проводить анализ в пикомолярном диапазоне.

Для изучения активности гликозилтрансфераз методом ПАГЭ авторы работ [10, 11] использовали AGA-производные сахаридов (табл. 1, № 3). Этот реагент интересен тем, что его конденсацию с углеводами проводят не в кислых (рН 4.0-5.0), а в почти нейтральных (рН 6.2) условиях, что обусловлено увеличением растворимости AGA с повышением рН.

В качестве флуоресцентных меток используются также и нейтральные молекулы. Заметим, что для высокочувствительного разделения олигосахаридов методами ПАГЭ или КЭ сахарид либо должен иметь собственный заряд, либо электрофоретическая буферная система должна содержать борат-ионы [12]. Например, применяют конъюгацию сиалилированных сахаридов, нейраминовой кислоты и нейтральных моно- и олигосахаридов с 2-аминоакридоном с последующим разделением полученных производных методом ПАГЭ [12-14]. В описанных условиях реакции мечения (табл. 1, № 4) не происходит значительного десиалилирования сахаридов [14].

Авторы работы [15] использовали 5-аминофлуоресцеин и дансилэтилендиамин (табл. 1, №5,6) для анализа углеводных цепей гликопротеинов. Применяли их и для анализа сиаловых кислот, в которых предварительно генерировали альдегидную группу по реакции периодатного окисления а-диольной группировки. Углеводные производные дансилэтилендиамина (алифатического амина) более стабильны по сравнению с производными 5-аминофлуоресцеина (ароматического амина), а степень мечения выше, из-за того, что для ароматических аминов, требуется большее время реакции, чем для алифатических [15].

Для разделения и анализа нейтральных олигосахаридов с различной степенью полимеризации методом КЭ иногда применяют 2-аминопиридин [16,17].

Следует отметить, что ПАГЭ и КЭ чаще всего используют как методы разделения/детекции при изучении активности гликозидаз с использованием флуоресцентно-меченых моно-, ди-, три- и тетрасахаридов, а также для разделения смесей олигосахаридов, выделенных из природных объектов. Однако есть работы, в которых разработаны чувствительные методики и для установления моносахаридного состава олигосахаридов указанными методами [8, 17]. Так, для анализа моносахаридного состава методом высокоэффективного КЭ авторы [18] сравнили 22 гетероциклических ароматических амина пиримидинового и пиразинового ряда, а также 2-аминопиридин. Сравнение проходило по нескольким параметрам: интенсивность флуоресценции, зависимость ее от рН, устойчивость образующихся производных, и т.д. В результате авторы выбрали 2-амино-З-фенилпиразин (табл. 1, № 7). С помощью этой метки был определен моносахаридный состав бычьего сывороточного фетуина.

Большое количество работ посвящено разделению и анализу 2-аминопиридиновых производных сахаридов с использованием метода ВЭЖХ (табл. 1, № 8). Условия введения 2АР в молекулу олигосахарида значительно разнятся от работы к работе: меняется восстановитель, продолжительность и температура реакции, соотношение реагентов [16, 17, 19-23]. Почти во всех работах рекомендуется очистка продукта от избытка исходных реагентов, что не всегда удобно, особенно при анализе микроколичеств вещества. Тем не менее, в виде 2АР-производных проанализировано огромное количество олигосахаридов, в первую очередь, N-цепей гликопротеинов [21]. Было охарактеризовано много новых нейтральных и сиалоолигосахаридов; разработаны методы не только двумерного [22, 24], но и трех-мерного картирования аминопиридиновых производных олигосахаридов [25].

При двумерном картировании в работе [23] в качестве методов сравнения использовали высокоэффективный КЭ и ВЭЖХ. В работе [24] разделение осуществляли методом ВЭЖХ на двух колонках- с фазой Cig и аминофазой. Двумерное картирование позволяет разделить нейтральные сахариды, а также определить их размер. Трехмерное картирование проводят на трех колонках: Cis, NH2 и DEAE [24]; колонка с DEAE-фазой позволяет легко отделить сиалосодержащие олигосахариды и определить степень сиалилирования каждого из них.

В работе [26] представлены попытки использования АМС (табл. 1, № 9) для флуоресцентного мечения углеводов. Авторы показали, что по чувствительности эта метка сравнима с радиоактивным мечением, а также, что квантовый выход флуоресценции соответствующих углеводных производных существенно выше, чем у 2АР-производных [26]. Однако методика мечения не была оптимизирована, и выходы меченых сахаридов не превышали 60%. В продолжение этой работы в [27] были оптимизированы условия мечения, в результате чего были достигнуты высокие выходы меченых производных. Это позволило использовать АМС-метку не только для высокочувствительного определения моносахаридного состава углеводных цепей гликопротеинов методом ВЭЖХ [27], но и для выделения и характеристики новых олигосахаридов [28].

В работах [29-34] проведено систематическое исследование ряда меток на основе аминобензойной кислоты. Наиболее перспективными из них признаны 2-АА, 3-АА, 4-АА, 2-АВ, 3-АВ (табл. № 9-14) как по параметрам флуоресценции (в том числе по слабой зависимости интенсивности флуоресценции от рН), так и по параметрам разделения. При этом методики мечения не сильно варьируются, за исключением [30, 32]. Выбранные метки применяют в электрофорезе и в ряде вариантов ВЭЖХ (нормальнофазная, обращеннофазная, анионообменая).

Авторы работы [35] провели сравнение свойств 2-аминопиридина и 7-амино-1-нафтола в качестве метки (табл. 1, № 15). Показано, что восстановительное аминирование маннозных олигомеров 7-амино-1-нафтолом проходит существенно лучше, т.к. образующееся основание Шиффа полностью восстанавливается цианоборгидридом натрия, в то время как в случае 2АР - не полностью [19]. Кроме того, интенсивность флуоресценции аминонафтольных производных в 8 раз выше, чем аминопиридиновых, что дает производным 7-амино-1-нафтола преимущества при ВЭЖХ-анализе микроколичеств олигосахаридов [35].

Предложенная в работе [36] метка АА-Ас, по мнению авторов, является хорошей альтернативой изученной ранее метке АМАС. АА-Ас реагирует с олигосахаридами в мягких условиях (табл. 1, № 16), образуя устойчивые производные; обладает удвоенным, по сравнению с АМАС, квантовым выходом флуоресценции [36]. Кроме того, АА-Ас подходит как для ВЭЖХ, так и для электрофореза, а также для масс-спектрометрического способа идентификации.

Несомненный интерес представляет вопрос: какая же из используемых меток является наиболее удачпой для целей структурного анализа олигосахаридов? Систематическое сравнение сразу нескольких меток в литературе практически отсутствует - как правило, сравнивают только два типа производных. Мы попытаемся на основании разрозненных данных сделать некоторое обобщение, рассматривая следующие критерии: флуоресцентные свойства, способность к разделению сложных смесей соответствующих производных олигосахаридов методом ВЭЖХ, выходы при мечении, а также легкость отделения избытка реагента и стабильность меченого продукта.

Наиболее популярная метка 2АР, как ни парадоксально, далека от идеальной метки. Так, ее молярное поглощение в 5 раз ниже, чем у АМС и в 20 раз - чем у 5-аминофлуоресцеина [37]; кроме того, незначительная гидрофобность 2АР-метки не лучшим образом способствует разделению сложных смесей олигосахаридов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Популярность 2АР-метки можно объяснить тем, что она была применена одной из первых и далее использовалась традиционно, а многие производные сейчас коммерчески доступны как хроматографические стандарты. Производные 5-аминофлуоресцеина, рекордные по интенсивности флуоресценции и удачные в смысле разделения сложных олигосахаридов, оказались нестабильными. Наиболее гидрофобные метки, такие, как АМАС, приходится вводить в DMSO, что методически неудобно. Общим недостатком всех реагентов, вводимых восстановительным аминированием, является низкий выход при мечении 2-амино-2-дезоксисахаридов. По-видимому, оптимальной из описанных меток является АМС, хотя и она далека от идеальной.

2. Метки, вводимые с помощью гидразидов сульфо- и карбоновых кислот

Взаимодействие углеводов с гидразидами сульфо- и карбоновых кислот катализируется кислотами и протекает по следующей схеме (схема 2):

R - остаток сахарида, X - остаток флуоресцентной карбоновой или сульфокислоты

Схема 2. Реакция взаимодействия углеводов с гидразидами сульфо- и карбоновых кислот.

В ходе реакции образуется относительно устойчивый циклический N-гликозид, не требующий дополнительного восстановления.

В работах [38-42] использовали D11S-NHNH2 (дансилгидразин) (табл. 2, № 1). Введение дансилгидразина в молекулу углевода осуществляется в одну стадию. Условия реакции от работы к работе варьируются незначительно: несколько изменяется соотношение углевод : Dns-NHNH2, меняется растворитель. В то же время температура, время проведения реакции и рН реакционной смеси практически постоянны и, что существенно, почти во всех работах не требуется дополнительного выделения углеводных производных после проведения реакции, т.к. при разделении методом ВЭЖХ они легко отделимы от исходного реагента. Выходы меченых производных достигают 80% [41]. Авторы [43] показали, что дансилгидразиновое производное сахарида существует в нескольких равновесных формах (рис. 1): в ациклической форме основания Шиффа (а) и двух аномерных циклических формах, с преобладанием P-N-пиранозида (Ь).

N(CH3)2 N(CH3)2 а) Ь)

Рис. 1. Равновесные формы углеводных производных дансилгидразина

Нужно отметить, что дансилпроизводные могут храниться в виде разбавленных растворов при -20°С в течение 2-3 недель. Условия синтеза производных DABS-NHNH2 (УФ-метка, не флуоресцирует) [43,44] сходны с условиями введения D11S-NHNH2, за исключением того, что время проведения реакции увеличивается, а рН реакционной смеси несколько ниже (табл. 2, № 2). Для D11S-NHNH2 также отмечается устойчивость получаемых производных (неделя при 4°С [42]). Следует отметить, что квантовые выходы флуоресценции дансильных производных углеводов в водных растворах существенно ниже, чем в органических растворителях [44], а квантовый выход флуоресценции производного N-ацетилглюкозамина на 72% ниже, чем для глюкозы [43]. Но, несмотря на это, чувствительность флуоресцентного детектирования дансильных производных при использовании ВЭЖХ, достигает пикомолыюго уровня.

Ряд работ посвящен Fmoc-гидразиновым производным (табл. 2, № 3) [45-47]. Отмечаются высокие выходы образующихся производных (свыше 90% [46]) и стабильность (по крайней мере, 1 мес. при 5°С в темноте [46]). Следует отметить, что исследование проводилось исключительно на нейтральных моно- и дисахаридах. Данные по мечению GlcNAc и GalNAc отсутствуют.

3. Другие метки

В работе [48] для мечения разнообразных углеводов по восстанавливающему концу использовали 2-аминотиофенол (табл. 3, № 1). Разработанный подход, применяли как качественную реакцию на углеводы в образце. Видимо поэтому авторы остановились на стадии основания Шиффа, не проводя его восстановления.

Для флуоресцентного мечения аминопроизводных сахаридов, также без проведения реакции восстановления, использовали о-формилбензойную кислоту [49, 50]. Реакция протекает быстро, поэтому ее применяют в ВЭЖХ для постколоночного мечения разделенных углеводов (Табл. 3, № 2).

В работе [51] авторы предлагают новую флуоресцентную метку - Glu-EDANS (табл. 3, № 3). Glu-EDANS вводится по восстанавливающему концу олигосахарида с образованием циклического производного пироглутаминовой кислоты. Реакция проводится в две стадии, требует дополнительных реагентов на стадии циклизации и характеризуется невысоким (44%) выходом. Кроме того, образующиеся продукты представляют собой смесь аномеров. Работа [51] также интересна тем, что помимо Glu-EDANS в эту же молекулу сахарида по аминогруппе невосстанавливающего аминосахаридного остатка вводят дополнительную группу в качестве тушителя флуоресценции, такая структура субстрата предложена для изучения активности эндогликозидгидролазы методом ВЭЖХ. Степень гидролиза субстрата определяют по увеличению флуоресценции реакционной смеси вследствие уменьшения степени тушения.

Следует отметить, что введение флуорофора по аминогруппе аминосахаридов также достаточно распространено. Так, в работе [52] гексозамины метили при помощи дансилхлорида (табл. 3, № 4).

Для избирательного мечения аминосахаридов использовали также PDFAc [53] и флуорескамин [53-55]. Реакция флуоресцентного мечения проходит быстро, условия ее протекания простые (табл. 3, № 5, 6), поэтому она рекомендуется для постколоночной модификации сахаридов разделенных ВЭЖХ. Помимо аминосахаридов с помощью флуорескамина можно метить и гликозилгидразины [55] (табл. 3, № 7). Следует отметить, что PDFAc и флуорескамин удобны тем, что флуоресценцией обладает только конечный продукт взаимодействия с аминосоединением. Помимо этого, авторы работы [53] провели сравнение свойств этих двух флуорофоров. Оказалось, что производные PDFAc имеют большую устойчивость к тушению флуоресценции по сравнению с флуорескаминовыми как в кислых, так и в основных условиях (PDFAc-производные в кислой среде теряют 80% интенсивности флуоресценции только через 24 ч, в то время как флуорескаминовые уже через 2 ч).

Помимо аминосахаридов для мечения используют аминоальдитолы, которые получают обработкой олигосахаридов ацетатом аммония в присутствии цианборгидрида натрия. Наиболее часто используемой в этих случаях меткой является CBQCA [56,57]. Реакция протекает количественно в присутствии цианид-иона (табл. 3, № 7). Следует отметить очень высокую чувствительность обнаружения меченого сахарида при использовании КЭ - 75x10" моль [57]. Такая высокая чувствительность объясняется авторами [57] во-первых, высокой интенситвностью флуоресценции CBQCA, а во-вторых, использованием метода КЭ. Однако к такому низкому пределу обнаружения следует относиться с осторожностью, поскольку эти результаты получены в идеальных условиях модельного эксперимента, которые, как правило, далеки от реальных.

Работа авторов [58] посвящена флуоресцентному мечению l-N-метил-аминоальдитолов с использованием NBD-F. Реакция мечения этим реагентом проходит быстро, в мягких условиях и с хорошими выходами (табл. 3, № 8), но предыдущая стадия - восстановительное N-метиламинирование - требует инертной атмосферы и сухих растворителей, что не очень удобно. Однако, как отмечают авторы, N-метилированные производные лучше взаимодействуют с NBD-F [58], чем неметилированные аминоальдитолы.

Для флуоресцентного мечения р-гликозиламинов, получаемых при обработке сахаридов насыщенным раствором гидрокарбоната аммония, была предложена 7-гидроксикумарин-З-карбоновая кислота (табл. 3, № 9). В ходе реакции мечения образуется соответствующий амид с выходом около 90%. Авторы [59] отмечают, что интенсивность флуоресценции полученного производного кумариновой кислоты при нейтральных рН примерно в 10 раз выше, чем у 2-аминопиридинового производного (ср. табл. 1, № 7) и практически не зависит от растворителя, что выгодно отличает ее от 2АР-производных. Однако для количественного образования меченого продукта требуется существенное количество дополнительных реагентов (ВОР, HBTU), способствующих образованию амида, очистка от которых обязательна. р-Гликозиламины, полученные ферментативным отщеплением гликоамидазой F, метили непосредственно в реакционной смеси при помощи Fmoc-Cl (табл. 3, №10). Авторы отмечают, что предложенный ими способ в 5 раз чувствительнее, чем использование в качестве метки 2-АА [60]. Кроме того, Fmoc-меченые олигосахариды можно обработать морфолином и получить свободные сахариды с выходом около 75%, что несомненно представляет большую практическую ценность. Подобный подход предложен и авторами [61]. Р-Гликозиламины, полученные обработкой сахаридов бикарбонатом амония, метили Fmoc-Gly (табл. 3, №11). После обработки полученных производных пиперидином получали l-N-глицил-р-сахариды с выходом около 55%. Благодаря такому подходу восстанавливающие сахариды превращаются в более удобную спейсерированую форму. Этот метод был продемонстрирован на примере модельных соединений, и не опробован на природных образцах.

Для изучения гликозилтранфераз методом КЭ в качестве субстрата часто используют спейсерированные углеводы с терминальной аминогруппой, флуоресцентно меченые SI-TMR [62-64]. SI-TMR применяется в виде активированного сукцинимидного эфира. Реакция протекает с хорошими выходами (до 70%), однако требуется дополнительная очистка образующегося продукта (табл. 3, № 12). Сочетание КЭ с лазерной детекцией флуоресценции приводит к очень высокой чувствительности определения SI-TMR-меченых сахаридов- вплоть до 50-100 молекул [62,64]. Объем пробы составлял 10-20 пл. Очевидно, что к таким результатам модельного эксперимента, далекого от реальных условий практического определения активности гликозилтрансфераз, следует относиться с осторожностью, как это было отмечено выше в случае с CBQCA.

4. Бимодальные метки

Стандартные флуоресцентные производные не удобны для функциональных исследований углеводсвязывающих белков, поэтому для таких целей был предложен ряд флуоресцентных меток, имеющих два функциональных фрагмента, т.е. бимодальных меток. Это, во-первых, химически реакционноспособная группа (амины, гидразиды, активированные эфиры и т.д.), и во-вторых, биотип или фотореактивная группа. Ряд работ посвящен бимодальной метке ВАР (табл. 4, № 1), имеющей в своем составе реакционноспособную аминогруппу и остаток биотина [65,66]. Биотиновый фрагмент дает возможность использовать индивидуальные меченые олигосахариды для изучения специфичности лектинов [65,66]. В то же время, ВАР можно использовать и для установления моносахаридного состава олигосахаридов методом ВЭЖХ [65].

Бимодальные метки, имеющие гидразидную группу представлены в табл. 4, 2,3,4. Фотореактивную метку AzNS-NHNH2 [67] авторы использовали для изучения активного центра лектинов (табл. 4, №2). После фотолиза, в ходе которого метка начинает флуоресцировать, и последующего ферментативного расщепления лектина фотомеченые пептиды можно детектировать по флуоресценции.

Для изучения лектинов предложены также биотинилированые метки - BNAH (табл. 4, № 3, [66]) и ВРН (табл., №4, [68]). Авторы отмечают легкость, с которой проходит мечение сахаридов, а также то, что N-гликозид образуется строго в р-конфигурации. В работе [66] было проведено сравнение свойств ВАР- и BNAH-меченых сахаридов в связывании с лектинами: в то время как гидразидные производные были активны, некоторые из ВАР-производных вообще не проявили биологической активности, что еще раз подчеркивает выгодность использования гидразидных производных углеводов. Кроме того, отмечается хорошая устойчивость образующихся P-N-гликозидов в нейтральной [68] и даже в слабокислой среде [66]. Однако в кислой среде вероятность перехода в ациклическую форму существенно выше, и поэтому рекомендуется нейтрализовать кислоту, служащую катализатором, при длительном хранении (очищенные BNAH-производные стабильны в течение года при -20°С [66]).

В работе [69] использовали бимодальную метку PFBAB. Взаимодействие сахаридов с PFBAB осуществляли без стадии восстановления (табл. 4, № 5), при этом с высокими выходами образовывалось циклическое производное (N-пиранозид). Кроме флуоресценции, эта метка обладает свойствами электронной ловушки, что является дополнительным преимуществом при анализе сахаридов методом ВЭЖХ с использованием масс-спектрометрической детекции (с химической ионизацией отрицательно заряженными ионами) и позволяет достичь фемтомолярного уровня определения [69].

Для введения фотореактивной флуоресцентной метки в молекулу 2-амино-2-дезоксигалактозы использовали AzNS-Cl [70]. Реакция мечения проходит в мягких условиях и характеризуется хорошими выходами (табл. 4, № 6). AzNS-производное 2-амино-2-дезоксигалактозы имело такую же аффинность при изучении лектинов, что и сама 2-амино-2-дезоксигалактоза. Кроме того, следует отметить, что AzNS-производное начинает флуоресцировать только после проведения фотолиза. Наличие фотореактивной азидной группы позволило авторам идентифицировать пептиды активного центра лектина.

Авторы [71] метили различные ОС (ОС молока, N-гликаны и др.) 2,6-диаминопиридином (DAP), который несет две химически и стереохимически эквивалентные аминогруппы (табл. 4, № 7). Одна из них взаимодействует с олигосахаридами (выходы - от 70 до 95%, в зависимости от размера ОС). С помощью другой аминогруппы разделенные на ВЭЖХ и охарактеризованные MALDI-TOF олигосахариды ковалентно иммобилизовали на NHS-активированном стекле, карбоксилированных микросферах и др. поверхностях, а также превращали в биотинилированные производные. Важно, что все иммобилизованные DAP успешно взаимодействовали с углевод-связывающими белками. Недостатком этого подхода является низкая нуклеофилыюсть аминогруппы из-за чего выходы на стадии иммобилизации низкие [71].

Выводы

Молярные коэффициенты поглощения обсуждаемых меток лежат в интервале З.9х103 - 92х103 M'W, а длины волн возбуждения и эмиссии практически перекрывают весь диапазон - от УФ- до видимой области (кех- от 240 до 543 нм, от 320 до 580 нм). Т.е. имеется возможность выбрать метку как с заданной длиной волны возбуждения, так и с необходимой интенсивностью флуоресценции.

Кроме того, на основании приведенных данных можно заключить, что гидразиды карбоновых и сульфокислот с химической точки зрения имеют два преимущества перед другими метками: во-первых, условия проведения реакции более практичны, а результаты более воспроизводимы (в частности, выходы одинаковы как для нейтральных, так и для 2-амино-2-дезоксисахаридов); во-вторых, в меченых производных сохраняется пиранозный цикл восстанавливающего звена и p-конфигурация гликозидной связи, что принципиально для последующего использования этих веществ в исследовании углевод-белкового взаимодействия. В то же время, такие производные продемонстрировали стабильность, достаточную не только для их разделения и детекции, но и последующего изучения специфичности углеводсвязывающих белков. Химия присоединения гидразидов к углеводам, т.е. условия реакции, выходы и т.п., практически не зависит от природы реагента, и это позволяет выбрать флуоресцирующий фрагмент X в составе X-NHNH2 в соответствии с особенностями данной конкретной задачи - от структурного анализа олигосахаридов до фотореактивного мечения белков.

Таблица 1. Метки, вводимые реакцией восстановительного аминирования*.

Реагент для мечения Продукт мечения нм ^emj нм (е*10~3, М'см"1) Метод разделения Методика введения метки, выходы меченых производных (если указано) Литература

1 8-Аминонафталин-1,3,6-трисульфонат (ANTS) /—он 353 535 7.2 ПАГЭ+ ВЭЖХ (двумерное картирование) 5—10 нмоль сахарида +1 мкмоль метки в 5 мкл смеси АсОН-вода (3:17) +5 мкмоль NaBH3CN в 5 мкл DMSO. 37°С, 15 ч [4-6] t Величины молярного поглощения - согласно [37]

ОН R— Т ^so3H

9-Аминопирен-1,4,6-

2 трисульфоновая кислота (APTS) п ho3S^ V ■^SO3H 488

10 нмоль сахар ида + 200 нмоль метки в 5 мкл 4.2 МАсОН + 4 мкмоль NaBH3CN в 4 мкл THF. 75°С,1 ч. В случае сиалилированных сахаридов - 2 мкмоль NaBH3CN. 37°С, 15 ч. Гель-фильтрация на биогеле G-10. Выход: >95% [7]

520 19 КЭ 50 пмоль сахар ида + 200 нмоль метки в 2 мкл 0.9 М растворе лимонной кислоты в DMSO +1 мкмоль NaBH3CN 1 мкл THF. 55°С, 2 ч. Выход: количественный [8]

1 нмоль углеводов + 1 мкл смеси, содержащей 10 нмоль APTS и 0.5 мкмоль NaBH3CN в 1.2 М лимонной кислоте в DMSO. 37°С, 18 ч. Гель-фильтрация на биогеле G-10. Выход: >70% [9]

3.5 мкмоль углеводов 750 мкл 50% раствора метки в воде, рН 6.2 (8.3 в случае сиалодисахаридов). 80°С, 1 ч. Затем + 16 мкмоль NaBH3CN. [10,11]

3 7-Амино-1,3-нафталиндисульфоновая у—он so3H R^VTS 250 420 4.2 ПАГЭ 65°С, 12 ч. Диализ. Выход: 50-80% кислота (AGA) 3.5 мкмоль сахарида + 750 мкл 50% раствора метки в воде, рН 6.2. 80°С, 2 ч. Затем [12] 16 мкмоль NaBH3CN. 70°С, 12 ч. После этого еще 16 мкмоль NaBH3CN и 70°С, 12 ч. Гель-фильтрация на биогеле Р2.

ПАГЭ 5 нмоль — 50 нмоль сахарида + 0.5 мкмоль метки в 5 мкл смеси АсОН - DMSO (3:17) + 5 мкмоль NaBH3CN в 5 мкл [12, 13]

2-Аминоакридон (АМАС) r-он 9 R H 488 525 5.2 воды. 37°С, 15 ч.

4 1-5 нмоль сахарида в воде

КЭ + 5 мкмоль АМАС в 5 мкл смеси АсОН — DMSO (3:17) [14] 40 мкмоль NaBH3CN в 10 мкл воды. 90 мин, 90°С.

5 5-Аминофлуоресцеин J^coo- у-ОН ^f^ 495 520 80 КЭ 0.5-2.5 мкмоль олигосахаридов + 20 мкмоль метки в этаноле + 200 мкмоль NaBH3CN в этаноле. 20°С, 15-30 мин. [15]

6 Дансил-этилендиамин SQjNHO^CHJNH-^^ ^ HO—' NfCH^ 340 500 4.6 После этого + 200 мкмоль NaBR, в 0.1М NaOH. 20°С, 15-30 мин, потом АсОН до рН 5.0 и диализ.

7 2-Амино-З-фенилпиразин (3-АРР) Ry—он w-yS N^sJ 340 440 КЭ, ВЭЖХ 100 нмоль сахаридов + 5 мкмоль 3-АРР в 10 мкл АсОН 90°С, 30 мин, + 7 мкмоль боран-диметиламинового комплекса в 10 мкл АсОН 90°С, 15 мин [18]

2-Аминопиридин (2-АР) а n nh

НО—'

320

400 4.2 кэ 1-10 мкмоль сахар ида в воде + 0.2 ммоль 2-АР в 80 мкл метанола, 0.1 ммоль NaBH3CN и АсОН до 30%. 75°С, 3-7 ч. Очистка на Dowex 50x2. Выход: 80-90%. [16,17]

ВЭЖХ 2—25 мкмоль сахарида + 0.9 ммоль метки в 500 мкл метанола + 40 мкл АсОН. 100°С, 20 мин. Затем + 0.3 ммоль NaBH3CN в 500 мкл метанола. 100°С, 3 ч. Очистка на Dowex 50x2. 19

10 нмоль олигосахаридов + 2.3 мкмоль метки в АсОН. 60 мин, 90°С. Затем + 10 мкл 20%-ого боран-пиридинового комплекса и 80°С, 80 мин. Удаление восстановителя упариванием с метанолом; pe-N-ацетилирование [20]

0.05—50 нмоль сахарида + 12 мкмоль метки в 10 мкл смеси АсОН:вода 1:10 (рН 6.8) 90°С, 1 ч. После этого + 70 мкл 1.5%-ого диметиламинобораново-го комплекса в смеси вода-АсОН 5:8 и 80°С, 35 мин. Гель-фильтрация на TSK- геле. [21,22]

10 нмоль олигосахаридов + 140 мкмоль 2-АР в смеси конц. НС1-вода 1:2, рН 6.2 (для сиалилированный ОС 1:3, рН 8.3) 100°С, 13 мин +150 мкмоль NaBH3CN, 70 мкмоль 2-АР в смеси конц. НС1- вода 1:6 90°С, 15 ч Очистка на G-15, доочистка на Dowex 50X2-200 и бумажным электрофорезом [23]

9 7-Амиио-4-метилкумарин (АМС) сн3 r^nhxx!X 365 440 18 тех 1 нмоль сахаридов + 3 мкмоль метки в метаноле, с 4% АсОН 2 ч, 40°С. + 5 нмоль NaBH3CN в 50 мкл метанола. 40°С, 18 ч. Очистка на AG501. Выходы: >20%; в препаративном синтезе - 5060%. [26]

ВЭЖХ 10 пмоль сахаридов + 0.7 нмоль метки в 50 мкл смеси DMF-вода, рН 6.2 (АсОН), 1:1. 40°С, 4 ч, затем +1 мкмоль NaBH3CN в 2 мкл метанола и 40°С, 1 сут. Выход: -95% [27, 28]

10 2-Аминоантраниловая кислота (2-АА) О г—он у^соон С /— NH 330 420 - Гель-фильтрация, ПАГЭ 25-500 пмоль сахарида + 0.75 мкмоль метки в 5 мкл смеси DMSO-AcOH 30:1 + 5 мкмоль NaBHjCN в 5 мкл того же растворителя. 60°С, 2 ч. Очистка на целлюлозном диске. Выходы: до 81.5% [29]

2 нмоль олигосахаридов в 30 мкл воды + 18 мкмоль 2-АА, + 57 мкмоль NaBH3CN в 80 мкл 4% метанольном растворе ацетата натрия, содержащим 2% борной кислоты 80°С, 45-60 мин. Очистка на колонке DPA-6S [30]

11 3 - Аминоантраниловая кислота (3-АА) соон 325 450 КЭ 100 нмоль сахарида + 3.5 мкмоль метки в 5 мкл смеси DMSO—АсОН 30:1 + 10 мкмоль NaBH3CN в 5 мкл того же растворителя. 50°С, 30 мин. Очистка экстракцией и на Sephadex G-10 [31]

12 4-Аминоантраниловая кислота (4-АА) —!IN—О—соон 264 340 ВЭЖХ —30 нмоль сахарида + 10 мкмоль метки в 10 мкл смеси DMSO-AcOH 7:3 + 1.5 мкмоль цианбор-гидрида тетрабутил-аммония в 15 мкл того же растворителя. 60°С, 4 ч. Очистка экстракцией этилацетатом Выход: количественный [32]

13 2-Аминобензамид (2-АВ) о С /— NH 11 - 356 450 - ВЭЖХ 25 пмоль — 50 нмоль сахарида + 1.75 мкмоль метки в смеси DMSO-AcOH 30:1 + 5 мкмоль NaBH3CN в том же растворителе. 60-65°С, 2 ч. Очистка на целлюлозном диске. Выходы: до 89% [29, 33, 34]

14 2-Аминобензамид (3-АВ) CONIIj 325 450 КЭ 100 нмоль сахарида + 3.5 мкмоль метки в 5 мкл смеси DMSO-AcOH 30:1 + 10 мкмоль NaBH3CN в 5 мкл того же растворителя. 50°С, 30 мин. Очистка экстракцией и на Sephadex G-10 [31]

15 7-Амино-1 -нафтол ?Н | Т Т но—/ 240 >320 5.9 ВЭЖХ 2.5 мкмоль углеводов, + 12.5 мкмоль метки в 50 мкл DMSO. 105°С, 30 мин. Затем + 77 мкмоль NaBH3CN в 50 мкл метанола, содержащего 10% АсОН. 105°С, 2.5 ч. Выходы: более 90% 35

16 3-(Ацетиламино)-6-аминоакридин (АА-Ас) R -' 1 442 525 - ВЭЖХ, вэжх-мс 10 нмоль сахарида + 500 нмоль метки в 20 мкл смеси DMSO-AcOH (17:3) и + 0.1 мкмоль NaBH3CN в 10 мкл того же растворителя. 80°С, 30 мин или 70°С, 2 ч. [36]

Реагент для мечения Продукт мечения ^exj НМ НМ (ad О"3, М"'см"') Метод разделения Методика введения метки, выходы меченых производных (если указано) Литература

КЭ 18 нмоль сахарида в 18 мкл 25 мМ раствора Na2B407 + TFA (2% в реакции) + 180 нмоль метки в 80 мкл этанола 68°С, 15-18 мин. [38]

1 Дансилгидразин, (Dns-NHNH2) so2nhnh~( сЛ N(CH3)2 350 540 4.4 тех, ВЭЖХ 10-300 нмоль углеводов, +6 мкмоль метки в 100 мкл этанола, + ТС А в этаноле до 1%. 80°С, 10 мин, либо 65°С, 20 мин, очистка пропусканием через Ci8-картридж. Выходы: до 79% [39-41]

0.7 мкмоль сахаридов в 100 мкл 1% водного раствора ТСА + 7 мкмоль метки в 50 мкл ацетонитрила 65°С, 20 мин [42]

2 4-N,N'-Диметиламино-4' -азобензолсульфонил гидразид (DABS-NHNH2) УФ-метка, Ашах=425нм 33.0 ВЭЖХ 1-50 нмоль сахарида в 1 мл этанола, содержащем 0.1% АсОН + 3 мкмоль метки в 1 мл этанола 50°С, 120 мин [35], либо 60°С, 60 мин [38]. [44, 45]

3 N-(9-Флуоренилметокси карбонил)гидразин (Fmoc-гидразид) ^^CHp^^HNH - r^f1* 270 320 5.8 вэжх 5 пмоль - 50 нмоль сахаридов в 10 мкл этанола + 1 мкмоль метки в 100 мкл ацетонитрила, + 110 мкл этанола, содержащего 0.5% АсОН. 65°С, 3 ч. Выходы: до 82% [45, 46]

2 нмоль сахарида в 10 мкл воды + 2 мкмоль метки в 200 мкл ацетонитрила, рН 4.6 (NaOH и НСООН). 65°С, 3-16 ч Выходы: > 90%. [47]

Таблица 3. Другие флуоресцентные метки, используемые в анализе углеводов.

Реагент для мечения Форма модифици руемого сахарида Продукт мечения нм ^етэ НМ (£, М 'см"1) х10"3 Метод разделения Методика введения метки, выходы меченых производных (если указано) Литература

1 2-Аминотиофенол && 340 470 - Без разделения 0.1-5 нмоль сахарида в 0.5 мл воды + ~16 мкмоль метки в 0.2 мл воды + 0.5 мл 30% H2S04 150°С, 15 мин. [48]

2 о-Формилбензойная кислота к-О-0" NH, Г°>~ои ( соон и 340 455 - ВЭЖХ (постколоночная модификация) 85—650 пмоль аминосахаридов после разделения пропускали через реакторную петлю (30 см), нагретую до 50°С. Элюент: боратный буферный раствор, содержащий 0.08% метки. [49, 50]

3 а-Ь-Глутамил-5-(2-аминоэтил)амино-1 -нафталинсульфонат (Glu-EDANS) «О-™ о sOjH у— N-^4----'NH Н 340 490 5.9 вэжх-мс 0.05 ммоль сахарида + 0.1 ммоль метки + 0.2 ммоль имидазола в 0.9 мл DMSO. 60°С, 20 ч. Затем + 0.2 ммоль имидазола и + 0.11 ммоль ВОР*. 60°С, 30 мин. Осаждали СН2С12 Выход: 44% (смесь аномеров). [51]

4 5-Диметиламино нафталин-1-сульфонилхлорид (дансилхлорид, Dns-Cl) „-О-™ NHj х>н N(CH3)2 340 500 3.9 тех, ПАГЭ 100 нмоль аминосахарида в 200 мкл 0.5 MNaHCOj + 10 мкмоль метки в 1 мл ацетона. 20°С, 4 ч. Выходы: 33 - 92% [52]

5 2,2-Ацетилоксиметил-З-оксо-4-фенил-2,3-дигидрофуран-2-ил ацетат (PDFAc) NH, 352 >470 - ВЭЖХ, КЭ 10 пмоль аминосахарида в фосфатном буферном растворе рН 8-9 + 1 нмоль метки в DMSO [53]

NH, [T^i 20°С, 1 ч (или 50°С,

6 Флуорескамин 400 490 7.8 5 мин). y-OH 1 4=0 R-' p-OH J\.COOH ВЭЖХ, КЭ [53, 54]

ОН С /=nhnh2

Без разделения 10 нмоль гликозилгидразинов + 1 мл 100 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7.4 и 200 мкл 40 мМ боратного буферного раствора, рН 9.4 + 3.6 мкмоль метки в 1 мл диоксана. [55]

3-(4-Карбоксибензоил)-2-формилхинолин (CBQCA) /—он соон 1 - 1000 пмоль аминоальдитолов + 200-400 нмоль цианида калия в 1020 мкл воды + 50-100 нмоль метки в 5-10 мкл метанола. 20°С, 1 ч. [56]

7 ir 1 1 I N ^^ CN 457 552 КЭ 0.01 - 100 нмоль аминоальдитолов + 6.2 ммоль метки и цианида калия в 100 мМ фосфатном буферном растворе, рН 8.0. 20°С, 5 ч в темном месте. Выходы: 26 -100% [57]

8 7-Нитро-4-фтор-2,1,3-бензоксадиазол (NBD-F) ,—он r-W"nhch> /—ОН V /—N <Ж> NOj 488 520 8.0 КЭ 1 пмоль-1 мкмоль N-метиламиноальдитолов, в 5 мкл 200 мМ боратного буферного раствора, рН 8.0 + 1.5 мкмоль метки в этаноле. 70°С, 5 мин. [58]

9 7-Гидроксикумарин-З-карбоновая кислота 330 450 29.0 ВЭЖХ 22.8 мкмоль Р-гликозипамина в 50 мкл DMFA + 22.8 мкмоль метки в 50 мкл DMFA + 22.8 мкмоль 1-гидроксибензотриазола в 50 мкл DMFA + 22.8 мкмоль HBTU& в 200 мкл DMFA и + 68.4 мкмоль iPr2EtN 20°С, 2 ч. Очистка на TSK-геле. Выходы: 80-90%. [59]

10 М-(9-флуренилметил) хлорформиат (Fmoc-Cl) 1 2 О /—О NH^O 266 310 5.8 ВЭЖХ -10 нмоль гликознламина в 400 мкл 20 мМ фосфатного буферного раствора, рН 8.5 после ферментативного отщепления + 4 мкмоль метки в 200 мкл ацетона 37°С, 1 ч Очистка экстракцией [60]

11 N-(9-флуренилметокси-карбонил)глицин (Fmoc-Gly) >=° HN 266 ВЭЖХ 11 мкмоль гликозиламина в 150 мкл смеси DMF-DMSO 1:2 + 11 мкмоль метки в 50 мкл DMF + 11 мкмоль этилдиизопропил амина, 11 мкмоль HBTU, 11 мкмоль 1-гидроксибензтриазола в 50 мкл DMF 24°С, 2 ч Выход: 83%. [61]

12 Сукцинимидат-5-карбокси-NjN-тетраметил родамина (SI-TMR) NH ^(сну. + "Л О / \ JD^J Ч 543 580 92.0 КЭ 1—5 мкмоль амина в 0.185 мМ NaHC03,pH 8.5 + 10 мкмоль метки в 0.25 мл DMF. 20°С, 4 ч. Очистка на DEAE-A25, затем на С 18-картридже. Выход: 70%. [62-64] ВОР — (бензотриазол-1-илокси)-трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфонат. & HBTU - гексафторфосфат О-бензотриазол-1 -ил-М,К,Н',Ы'-тетраметилурония

Таблица 4. Бимодальные метки.

Реагент для мечения Форма модифици руемого сахарида Продукт мечения ^-ехэ НМ НМ (б, М-'см"') хЮ'3 Метод разделения Методика введения метки, выходы меченых производных (если указано) Литература

1 2-Амино-6-биотиниламидо-пиридин (ВАР) ну5 /-он XXX R 345 400 - ВЭЖХ, тех 100 нмоль олигосахаридов + 3 мкмоль метки в 10 мкл смеси пиридин-АсОН, 2:1. 80°С, 1 ч. Затем + 21 мкмоль диметиламиноборана в 10 мкл того же растворителя. 80°С, 1 ч. [65]

100 нмоль олигосахаридов + 1.5 мкмоль В АР в 10 мкл смеси пиридин-АсОН,2:1. 80°С, 1 ч. Затем + 2 мкмоль диметиламиноборана в 10 мкл того же растворителя. 80°С, 1 ч. [66]

2 1 - Азидо-5 -нафталин сульфонил гидразид (AzNS-NHNH2) so2nhnh~ n3 360 480 - ВЭЖХ 2 ммоль углеводов в 5 мл воды + I ммоль метки в смеси диоксан-этанол-10% ТСА* (25:70:5). 50°С, 3 ч. Очистка на Cig-силикагеле. [67]

3 ]М-Биотинил-3-(1 -нафтил)-Ь-аланил гидразид (BNAH) С°) - hnhn-T r — y о УФ-метка, Хмах=275нм - ВЭЖХ, тех 100 нмоль олигосахаридов + 500 нмоль метки в 25 мкл смеси метанол-вода-АсОН, 74:8:8. 60°С, 5 ч. [66]

4 4- (Биотинамидо)фенил-ацетил гидразид (врн) С vhnhn NH I N^—N H УФ-метка, Х.мах=252нм - ВЭЖХ 1 нмоль олигосахарида в 10 мкл воды + 3 нмоль метки в 10 мкл 30% ацетонитрила. 90°С, 1 ч. Выходы: более 70% [68]

5 4-Амино-пентафторбензил-бензоат (PFBAB) F F COOCH:—К VF . 0 ^ /—О / и 296 350 - ВЭЖХ-МС 80 нмоль олигосахаридов в смеси метанол-АсОН 1:1 + 0.9 мкмоль метки в том же растворителе, 65°С, 20 мин. Выходы: 65-90% [69]

6 1 -Азидо-5-нафталинсульфонил-хлорид (AzNS-Cl) iTV <Г°>-он S02NH R^C—г 360 480 - Электрофорез, ВЭЖХ 2.78 ммоль сахарида в 20 мл 50% ацетона в 0.2 М карбонате натрия (рН 9.5) + 1.87 ммоль метки в 10 мл ацетона. 20°С, 2 ч. Выход: до 74%. [70]

7 2,6-диаминопиридин (DAP) /-<* XI С r-NH N N^ 340 400 11.4 ВЭЖХ 0.1 -10 нмоль сахарида + 17,5 мкмоль метки и 50 мкмоль NaBH3CN в 50 мкл смеси DMSO.AcOH 7:3. 65°С, 2-12 ч. Очистка на фильтре Watman ЗММ. Выход: 70-95%. [71]

Г ~ 1 ■ 11 11

ТСА — трихлоруксусная кислота

L , ^PvcHohaH.J

I ОС'Д.Н

Глава2. I—™;,r-irrn:A' •")

Общие представления о микрочипах

Микрочип - это устройство, на котором размещено множество веществ (лигандов), с помощью которых анализируются различные биологические жидкости. На небольшой площади чипа размещяют сотни и более нуклеотидов, антител и т.п. Например, существует технология, которая позволяет расположить на 1 см подложки более 6000 нуклеотидов (технология GenPak, Дания). Высокая плотность размещения лигандов на поверхности позволяет проводить одновременный анализ множества биологических аналитов в небольшом объеме образца. Информация о взаимодействиях обычно считывается с помощью флуоресцентного ридера.

Большинство предлагаемых чипов являются двумерными (2D), элементы которых представляют собой лиганды, химически или сорбционно закрепленные на специально обработанной стеклянной или другой поверхности. Существуют микрочипы на основе трехмерных гидрогелей (3D), в которых лиганды равномерно распределены по всему объему капли геля, и в тоже время находятся на удаленном расстоянии друг от друга [72]. Первыми были разработаны ДНК-микрочипы, лигандами здесь являются молекулы ДНК или олигонуклеотидов [73]. ДНК-чипы используют для решения таких задач, как идентификации генов, изучения профиля генной экспрессии (для классификации раковых клеток при лейкемии, раке молочной железы, меланоме), изучения функций генов, при создании новых лекарств и т.д. [74]. Белковые чипы появились почти сразу за ДНК-чипами. В качестве лигандов здесь используются как целые белковые молекулы, так и пептиды. Область применения белковых микрочипов на сегодняшний день очень широка. Это изучение белок-белковых, белок-лигандных, пептид-лигандных и др. взаимодействий, изучение активности ферментов, поиск новых субстратов и многое другое [75].

Гликочипы (т.е. микрочипы с иммобилизованными олиго- и полисахаридами, гликоконъюгатами) появились относительно недавно, уже после начала выполнения данной диссертационной работы. Технология изготовления гликочипов активно развивается [76, 77], в том числе лабораторией углеводов, ИБХ РАН. На сегодняшний день предложено несколько способов нанесения лигандов, как основанных на ранее известных ДНК и белковых технологиях, так и совершенно новых. Спектр углеводных лигандов и области использования углеводных микрочипов неуклонно расширяется [78].

Углеводные лиганды могут быть иммобилизованы на чипе в самом виде спейсерированных синтетических и природных олигосахаридов, полисахаридов, протеогликанов, неогликопротеинов и неогликолипидов. В зависимости от свойств используемого лиганда используют и различные типы иммобилизации. Для крупных молекул, таких как протеогликаны, неогликопротеины и полисахариды можно использовать физическую адсорбцию [79], либо иммобилизацию на подложке, содержащей фотореактивные группы (арил-трифторметил-диазирин) [80]. Неогликолипиды иммобилизуют также физической сорбцией [81]. Для иммобилизации низкомолекулярных лигандов применяют химические способы, в частности, спейсерированные олигосахариды, содержащие амино- и тиольную группы, иммобилизуют на поверхностях, активированных N-гидроксисукцинимидом или малеимидом [76, 82]. Если на поверхности чипа сначала иммобилизовать стрептавидин, то в качестве лигандов можно использовать биотинилированные олигосахариды или гликоконъюгаты [83].

Изучение углевод-белковых взаимодействий — одно из самых распространенных применений гликочипов. Результатом такого изучения является определение специфичности лектинов, антител, поиск специфических ингибиторов гликозидаз, определение углеводов, участвующих в процессах адгезии клеток. При помощи гликочипов уже начинают изучаются клеточные рецепторы непосредственно на поверхности клетки [1,84].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оборудование и реактивы 1.1. Растворители и реактивы

В работе использовали следующие растворители и реагенты: ЫаНСОз, Ыа2СОз, NaOAc, NaH2P04, Na2HP04, цитрат натрия, Na2S04, СаСЬ, NaOH, концентрированный аммиак, «Диа-М», Россия; NH4HCO3, №ВНзС1Ч, ВНз-пиридиновый комплекс, Pd-чернь, о-фенилендиамин, 4-ДМП, п-нитрофениловый эфир биотинилкапроновой кислоты, пиперидин, этаноламин, метакриламид, М,1\1-метиленбисакриламид, Темед, БСА, нейраминидаза из Vibrio cholerae, «Sigma», США; Rh-наночастицы любезно предоставлены А. Россо (Национальная химическая школа, Репе, Франция); PNG-аза F «Bio Labs», США; 2,5-дигидроксибензойная кислота, N-гидроксисукцинимид, Et3N, N-(9-флуоренилметиоксикарбонил)глицин, К-(2-пиридил)-аминоуксусная кислота, гидразин гидрат, диэтиловый эфир 2,6-дигирокситерефталевой кислоты, п-толуолсульфохлорид, тримезиновая кислота, трихлорангидрид тримезиновой кислоты, Tween-20, «Fluka», Швейцария; п-феноксазонфениламин, п-феноксазонфенилметилбромид любезно предоставлены А.А. Формановским (ИБХ РАН)' трифторуксусный ангидрид, уксусный ангидрид, трифторуксусная кислота, уксусная кислота, ацетилхлорид, бензальдегид, л

Acros», США; [ Н]-лейцин, «ПСН», США; гидразид 7-диэтиламинокумарин-З-карбоновой кислоты, «Molecular Probes», США; Bind Silane, «Amersham Pharmacia Biosciences», США; пиридин, толуол, этилацетат, тетрагидрофуран, хлороформ ацетонитрил, метанол, этанол, «Реахим», Россия; DMF, DMSO, «Мегск», Германия; 110S, IIOS-NHCOCH2NH2 Btri-OCH2CH2NH2, Atn-OCH2CH2NH2, 90S, 90S-NHC0CH2NH2, Galal -6Glcpl-NHCOCH2NH2, изомальтооктаоза, pNPA, pNSA, Btri-PAA30, содержащий 20% mol Вй, «Lectinity», Россия; 110S-2AP, «Glyence», Япония; АГП, НПЦ «Биоген», Россия; IgG человека, «LFB», Франция; человеческие антитела, узнающие Galal-6Glc любезно предоставлены П. Обуховой, ИБХ РАН, Россия; мышиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека, «Southern Biotech», США; антитела против иммуноглобулинов мышей и человека, меченые пероксидазой, Су5 и биотином, стрептавидин, меченый пероксидазой, галактозидаза Bovine testes, «Boehringer-Manheim», Германия; антитела против иммуноглобулинов человека, меченые стрептавидином и Texas Red, стрептавидин, меченый А1еха555, «Pierce», США; сыворотки крови от здорового донора (группа крови О) и от больного раком молочной железы (группа крови А) любезно предоставлены Маргарет Хуфлейт (Гликомедицинский исследовательский институт, Да Хойя, США); биотинилированные лектины из Aleuria aurantia, Erythrina cristgalli и Ricinus communis, «Vector Laboratories», США; сцинцилляторная жидкость "Universal coctail", «ISN Radiochemicals», Швеция.

1.2. Сорбенты, ТСХ-пластинки

Для гель-фильтрации использовали Sephadex G-10, G-15, LH-20, «Pharmacia Biotech», Австрия. Ионообменную хроматографию осуществляли на Dowex 50Wx2-200, «Acros», США; ТСХ проводили на пластинках с силикагелем или с оксидом алюминия, «Мегск», Германия; Разделение реакционных смесей проводили на Cig-патронах, «Диа-Пак», Россия и бумаге ЗММ, «Whatman», Англия.

1.3. Модули для иммуноферментного анализа, стекла

Для конструирования чипов использовали N-гидроксисукцинимид-активированные стекла, «Schott Nexterion», Германия; стекла Coming 2947, обработанные BindSilane; аминированные стекла, «Corning», США. Для иммуноферментного анализа использовали 96-луночные планшеты MaxiSorp, «Nunc», Дания; 8-луночные аминированные модули, «Costar», США.

1.4. Оборудование

Использовали хроматографы, снабженные УФ-детектором, «Beckman System Gold», США, «Gilson», США и флуориметром «Varian», США. Принт чипов осуществляли с помощью принт-робота «Qarray Genetix», Англия; принт-робота Microarray technology, «Array IT» (США); визуализацию флуоресцентных сигналов на чипах проводили с помощью флуоресцентного микроскопа ImaGel (ИМБ РАН, Россия) и сканера для слайдов ScanArray 5000, «PerkinElmer», США. Контроль разделения олигосахаридов при гель-фильтрации осуществляли на рефрактометре «Waters», США; радиоактивность измеряли на счетчике «Beckman LS6000SC», США. Масс-спектры снимали на времяпролетном масс-спектрометре «Ultraflex П Bruker», Германия, оснащенном УФ лазером (Nd). 'Н-ЯМР спектры записывали на спектрометре «Bruker» 500 Гц. Образцы упаривали на вакуумной центрифуге «Savant», США Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiscan МСС 340, «Labsystems», Финляндия.

Методы

1. Синтез гидразида М-(п-феноксазонфепил)-аминоуксусной кислоты (п-ФФАГ)

В колбу помещали 5 г (24 ммоль) п-феноксазонфениламина, 3.0 г (36 ммоль) метилового эфира хлоруксусной кислоты и 1.4 г (36 ммоль) гидроксида натрия, прибавляли 30 мл воды, перемешивали 3 ч, поддерживая значение рН не ниже 7 добавлением щелочи. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол 100:1. По окончании процесса реакционную смесь отфильтровывали через стеклянный фильтр, подкисляли соляной кислотой до рН 2.0, выдерживали 0.5 ч при комнатной температуре и отфильтровывали получившийся осадок. Высушивали на масляном насосе в течение ночи. Затем растворяли в 50 мл метанола, прибавляли 2 мл (37 ммоль) гидразингидрата и выдерживали 2.5 суток. Контроль реакции осуществляли методом ТСХ в метаноле. Пластинки проявляли под УФ-светом. По окончании реакционную смесь упаривали досуха на роторном испарителе, соупаривали с толуолом, 3x20 мл, и перекристаллизовывали из метанола. Выход моногидразида - 65%, Тпл 228°С. Характеристические сигналы 'Н-ЯМР-спектра (DMSO-D6), ppm: 3.75 (2Н, дублет, -СН2-), 7.8 (1Н, триплет, ароматический -NH-), 9.16 (1Н, синглет, гидразидный -NH-), сигналы: 6.73 и 8.22 (дублеты), 7.4 и 7.9 (мультиплет и дублет) отнесены к ароматическим протонам (8Н).

2. Синтез бимодальных флуоресцентных меток 2.1. Дигидразид N-пиридилиминодиуксусной кислоты

1 г (6 ммоль) метилового эфира N-пиридиламиноуксусной кислоты растворяли в 5 мл дихлорэтана и прибавляли по каплям 0.4 мл BF3'Et20, охлаждали реакционную смесь до 0°С. Затем при перемешивании по каплям прибавляли раствор 0.76 г (7 ммоль) диазоуксусного эфира в дихлорэтане, перемешивали при 0°С в течение 10 мин до окончания выделения газа, затем еще 1 ч при комнатной температуре. Через 1 ч к реакционной смеси прибавляли 5 мл насыщенного раствора гидрокарбоната аммония, после чего отделяли органическую фазу и высушивали ее над сульфатом натрия. Согласно данным ТСХ (на силикагеле в этилацетате) в смеси присутствовали только исходные соединения.

2.2. Дигидразид М-(п-феноксазонФенил")-иминодиуксусной кислоты

В колбу помещали 5 г (24 ммоль) п-феноксазонфениламина, 5.7 г (60 ммоль) метилового эфира хлоруксусной кислоты и 2.4 г (60 ммоль) гидроксида натрия, прибавляли 30 мл воды перемешивали в течение 3 ч, поддерживая значение рН не ниже 7 добавлением щелочи. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол 100:1. По окончании процесса реакционную смесь отфильтровывали через стеклянный фильтр, подкисляли соляной кислотой до рН 2.0 и выдерживали 0.5 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывали. Высушивали в вакууме в течение ночи. Затем растворяли в 50 мл метанола, прибавляли 2 мл (37 ммоль) гидразингидрата и выдерживали 2.5 суток. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на AI2O3 в метаноле. По окончании процесса реакционную смесь упаривали досуха на роторном испарителе, соупаривали 3x20 мл толуола, и перекристаллизовывали из метанола. Согласно данным 'Н-ЯМР, в ходе синтеза был получен ранее охарактеризованный моногидразид (см. выше) с выходом 65%.

2.3. Дигидразид М-("п-феноксазон-п-фенилметил)-иминодиуксусной кислоты

В колбу с обратным холодильником помещали 2.88 г (10 ммоль) п-феноксазонфенилметилбромида, прибавляли 3.95 г (20 ммоль) диметилового эфира иминодиуксусной кислоты, 4.14 г (30 ммоль) карбоната калия и растворяли в 50 мл DMF. Нагревали и кипятили в течение 3 ч, контроль реакции осуществляли по ТСХ на оксиде алюминия в хлороформе. По окончании реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, вливали в нее 300 мл воды и экстрагировали 3x50 мл хлороформа. Экстракты объединяли, промывали 3x100 мл воды и насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над сульфатом натрия. Упаривали на роторном испарителе и наносили на колонку, заполненную силикагелем (3x25 см). Элюировали смесью хлороформ-метанол, 100:1. Фракции, содержащие продукт (контроль по ТСХ на силикагеле в той же системе растворителей), объединяли и упаривали. Перерастворяли в 100 мл метанола, прибавляли 2 мл гидразингидрата (37 ммоль) и выдерживали 2.5 суток при комнатной температуре. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в смеси хлороформ-метанол, 100:1. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе, соупаривали с толуолом, 3x20 мл, и перекристаллизовывали из метанола. Выход дигидразида - 82%, Тпл 200°С. Характеристические сигналы 'Н-ЯМР-спектра (D6-DMSO), ppm: 3.73 (2Н, синглет, -СН2-), 3.12 (2Н, синглет, -NCH2CO), область 7.23-8.27 (мультиплеты) - ароматические протоны (8Н), 9.24 (1Н, синглет, -NH-), 4.18 (2Н, дублет, NH2).

2.4. Дигидразид (7-диэтиламинокумарин-3-карбонил)гидразида тримезиновой кислоты

К 330 мг (2.9 ммоль) N-гидроксисукцинимида прибавляли 1 мл трифторуксусного ангидрида и перемешивали при комнатной температуре 3 ч. Упаривали в вакууме и высушивали в течение 1.5 ч. В эту же колбу прибавляли 100 мг (0.48 ммоль) тримезиновой кислоты в 2 мл абсолютного пиридина и перемешивали в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Контроль протекания реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в сиситеме хлороформ:изопропанол 20:1. По окончании реакции приливали 15 мл охлажденной 2 М соляной кислоты, полученный трис-сукцинимидный эфир тримезиновой кислоты отфильтровывали, промывали водой, сушили в вакууме и использовали далее. Выход - 74% (Rf = 0.38, хлороформ:изопропанол 20:1). Характеристические сигналы 'Н-ЯМР-спектра (CDCI3), ppm: 2.94 (4Н, синглет, -СО-СН2-СН2-СО-), 9.14 (ЗН, синглет, ароматические протоны).

К раствору 10 мг (36 мкмоль) гидразида 7-диэтиламинокумарин-З-карбоновой кислоты в 1 мл DMF приливали при перемешивании раствор 54 мг (110 мкмоль) три-сукцинимидного эфира тримезиновой кислоты (см. выше) в 0.75 мл DMF и перемешивали 15 мин при комнатной температуре. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в смеси хлороформ-изопропанол 20:1. ТСХ показала наличие исходных веществ и ряда побочных продуктов их разложения.

2.5. Синтез дигидразида 2.5-дигидрокситерефталевой кислоты

500 мг (2 ммоль) диэтилового эфира 2,5-дигидрокситерефталевой кислоты растворяли в 30 мл метанола при 100°С при кипячении с обратным холодильником, затем прикапывали при перемешивании 0.6 мл (12 ммоль) гидразингидрата и выдерживали сутки при 100°С с обратным холодильником. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в смеси толуол:этилацетат 100:1. По окончании реакции (судили по исчезновению исходного эфира) оставляли реакционную смесь при 4°С на ночь для кристаллизации, образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали последовательно водой и этанолом, высушивали. Выход - 95% (Rf = 0.60 (изопропанол:этилацетат:вода 2:3:1)). Тпл 134°С. Характеристические сигналы 'Н-ЯМР-спектра (D6-DMSO), ppm: 7.47 (2Н, синглет, ароматические протоны), 9.85 (1Н, синглет, -NH-).

2.6. Синтез дигидразида 2.5-диметокситерефталевой кислоты

400 мг (1.6 ммоль) диэтилового эфира 2,5-дигидрокситерефталевой кислоты растворяли в хлороформе, приливали по каплям 670 мг (16 ммоль) раствора диазометана в диэтиловом эфире и перемешивали 10 мин. Прибавляли по каплям 100 мкл безводной уксусной кислоты до прекращения выделения азота и упаривали в вакууме.

300 мг (1 ммоль) полученного вещества растворяли в 30 мл метанола при 100°С при кипячении с обратным холодильником, затем прикапывали при перемешивании 0.29 мл (6 ммоль) гидразингидрата и выдерживали 3 суток при 60°С. Охлаждали до 4°С и оставляли реакционную смесь для кристаллизации, осадок отфильтровывали, промывали последовательно водой и метанолом, высушивали. Выход - 80%. Тпл 135°С. Характеристические сигналы 'Н-ЯМР-спектра (D6-DMSO), ррш: 3.88 (6Н, синглет, протоны метоксигрупп), 7.48 (2Н, синглет, ароматические протоны), 9.56 (1Н, синглет, -NH-).

2.7. Сукцинимидный эфир К-(9-флуоренилметоксикарбонил)глицина (Fmoc-Gly-SI)

К 150 мг (1.3 ммоль) N-гидроксисукцинимида прибавляли 0.5 мл трифторуксусного ангидрида и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Упаривали досуха в вакууме. Прибавляли 100 мг Fmoc-Gly (0.34 ммоль) и растворяли в 2 мл сухого пиридина, перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе толуол-этилацетат 2:1. Упаривали реакционную смесь на роторном испарителе, соупаривали с 50 мл толуола. Перерастворяли в 0.5 мл ацетонитрила, прибавляли 0.3 мл воды, интенсивно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на ночь. Осадок отфильтровывали, промывали 0.1% уксусной кислотой в воде и высушивали. Выход - 95%. Характеристические сигналы 1 Н-ЯМР-спектра (D6-DMSO), ррш: 2.8 (4Н, синглет, -СО-СН2-СН2-СО-); 4.19 (2Н, дублет, -СН2-остатка глицина); 4.25 (1Н, триплет, -СН-); 4.35 (2Н, дублет, -СН2-0-); 8.0 (1Н, триплет -CONH-); сигналы: 7.70 и 7.90 (дублеты), 7.33 и 7.42 (триплеты) отнесены к ароматическим протонам (8Н).

3. Отщепление олигосахаридов от АГП гидразинолизом

Отщепление проводили согласно [85]. 250 мг десиалилированного АГП помещали в ампулу, размером 1.5x10 см, и тщательно высушивали в течение 4-5 сут. над P2Os в вакууме. К высушенному образцу прибавляли 3 мл безводного гидразина, ампулу запаивали, встряхивали до полного растворения и выдерживали 16 ч при 100°С. Ампулу охлаждали, вскрывали и упаривали в вакууме (в ловушке - концентрированная серная кислота). Затем следы гидразина удаляли соупариванием в вакууме с безводным толуолом (4x1 мл). Высушенный остаток растворяли в 2 мл воды, прибавляли 0.5 мл бензальдегида и 0.2 мл уксусной кислоты. Ампулу запаивали и нагревали при 100°С в течение 15 мин, охлаждали до комнатной температуры. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (5x3 мл), водный слой упаривали в вакууме. Затем проводили pe-N-ацетилирование; для этого сухой остаток растворяли в 3 мл насыщенного раствора NaHCCb, прибавляли Ас20 (3x0.1 мл с интервалом в 10-15 мин) и выдерживали при комнатной температуре. Смесь лиофилизовали, растворяли в 1 мл воды и обессоливали на Sephadex G-15 (1.5x35 см, элюция водой). Контроль разделения осуществляли рефрактометрически. Фракции, содержащие олигосахариды, объединяли и упаривали в вакууме. Выход - 60%.

4. Отщепление олигосахаридов от гликопротеинов карбонатом аммония

Отщепление N-цепей проводили согласно [86] с некоторыми изменениями. 1 мг десиалилированного АГП или IgG растворяли в 500 мкл насыщенного раствора бикарбоната аммония в 25% водном аммиаке. Добавляли дополнительно 100 мг сухого бикарбоната аммония и выдерживали 2-5 сут при 60-65°С, либо 2 сут при 75°С. Разбавляли реакционную смесь водой до 1.5 мл и упаривали досуха на вакуумной центрифуге. Затем остаток перерастворяли в 0.5 мл воды и лиофилизовали. Процесс лиофилизации повторяли до тех пор, пока масса остатка не перестала изменяться (2-4 раза). Растворяли остаток в 500 мкл воды, прибавляли 500 мкл метанола и 50 мкл хлороформа и центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин. Супернатант отбирали и упаривали. Затем перерастворяли в 200 мкл воды и лиофилизовывали.

5. Отщепление олигосахаридов от АГП с помощью PNG-азы F

1 мг десиалилированного АГП растворяли в 0.5 мл 10 мМ бикарбонате аммония (рН 7.9), или в 100 мМ буферном растворе Et3N-AcOH (рН 7.3), или 150 мМ Et3N-AcOH рН7.9). Затем прибавляли 0.5-10 U PNG-азы F и выдерживали 2 ч при 37°С. Реакционные смеси с рН 7.9 упаривали, а с рН 7.3 охлаждали до -20°С и использовали далее без упаривания (см. ниже).

6. Синтез гликозиламжов

Синтез проводили согласно [87, 88]. 50 мкмоль индивидуального олигосахарида или пула олигосахаридов растворяли в 0.5 мл насыщенного раствора бикарбоната аммония с добавлением избытка твердого бикарбоната, и выдерживали в течение 10 суток при 20°С. Ход реакции контролировали методом ТСХ на силикагеле в системе метанол:ацетонитрил:вода 3:3:2. По окончании процесса реакционную смесь разбавляли вдвое водой, замораживали и лиофилизовали. Процедуру лиофилизации повторяли до тех пор, пока масса вещества не переставала меняться.

7. Превращение олигосахаридов в аминоалъдитолы

Превращение мелибиозы в аминоальдитол осуществляли по методу [89]. К раствору 20 мг (55 мкмоль) мелибиозы в 0.5 мл смеси DMF-MeOH (1:1 по объему), прибавляли 30 мг ацетата аммония и раствор 10 мг (110 мкмоль) цианоборгидрида натрия в 0.5 мл МеОН, смесь перемешивали 48 ч при 20°С. Выпавший осадок удаляли фильтрованием, фильтрат упаривали. Остаток перерастворяли в 3 мл воды, прибавляли 1 мл Dowex50Wx2-200(H+) и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего наносили на колонку с 4 мл Dowex 50Wx2-200 (Н+), промывали 40 мл воды, аминоальдитол элюировали 40 мл 0.6 М водного аммиака; элюат упаривали досуха. Выход - 82% (Rf = 0.5, метанол:ацетонитрил:вода:АсОН 6:6:2:1)

8. Синтез флуоресцентно-меченых сахаридов

8.1. Взаимодействие п-ТСГ с GlcNAc

В пробирку помещали 0.5 мл 10 мМ раствора GlcNAc в воде, прибавляли 0.5-2.0 мл 1.4% раствора п-ТСГ в метаноле, содержащем 20% уксусной кислоты (7-30-кратный молярный избыток метки) и выдерживали в течение 1-4 ч при 50°С. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе этилацетат-изопропанол-вода 3:2:1. Пластинки проявляли сначала под УФ-светом, а затем обугливали 8% фосфорной кислотой при 200°С.

8.2. Взаимодействие Dns-N?Hj с GlcNAc

В пробирку помещали 0.25 мл 10 мМ раствора GlcNAc в воде, прибавляли 0.2-2.0 мл 2% раствора дансилгидразида в метаноле, содержащем 20% уксусной кислоты (7-30-кратный молярный избыток метки) и выдерживали в течение 2-10 ч при 50°С. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе этилацетат-изопропанол-вода 3:2:1. Пластинки проявляли сначала под УФ-светом, а затем обугливали 8% фосфорной кислотой при 200°С.

8.3. Взаимодействия п-ФФАГ с GlcNAc

В пробирку помещали 0.1 мл 200 мМ раствора GlcNAc в воде, прибавляли 0.6-5.0 мл 5% раствора п-ФФАГ в метаноле, содержащем 30% уксусной кислоты (5-40-кратный молярный избыток метки) и выдерживали в течение 2-7 ч при 50°С. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе этилацетат-изопропанол-вода 3:2:1. Пластинки проявляли сначала под УФ-светом, а затем обугливали 8% фосфорной кислотой при 200°С. Продукт выделяли на силикагеле (1.5x20 см), элюируя смесью этилацетат-изопропанол-вода 6:4:1. Фракции, содержащие меченый N-ацетилглюкозамин, собирали и упаривали. Выход - 74%. Структура меченого N-ацетилглюкозамина была подтверждена масс-спектрометрией ([М+Н]+, m/z 486.5, расчетное значение 485.7). В спектре 'Н-ЯМР (D6-DMS0:D20, 6:1) наблюдали сигналы двух компонентов. Первый компонент (сигналы в ppm): 1.82 (ЗН, синглет, NAc); 3.00 (1Н, дублет дублетов, НС4 углеводного остатка); 3.06 (1Н, мультиплет, НС5); 3.26 (1Н, дублет дублетов, НС3); 3.34 (1Н, дублет дублетов, НС2); 3.44 (1Н, мультиплет, НС6); 3.66 (1Н, дублет дублетов, НС6); 3.78 (1Н, дублет, НС1, Ju 9.8 Гц); сигналы 3.70 и 3.78 (2Н, два дублета, COCH2N); сигналы: 6.70 и 7.90 (два дублета), 7.32 и 7.64 (два мультиплета) отнесены к ароматическим протонам (8Н). Второй компонент: 1.90 (ЗН, синглет, протоны NAc); 3.04 (1Н, дублет дублетов, НС4); 3.16 (1Н, мультиплет, НС5); 3.33 (1Н, дублет дублетов, НС3); 3.46 (1Н, дублет дублетов, НС2); 3.43 (1Н, мультиплет, НС6); 3.70 (1Н, дублет дублетов, НС6'); 3.92 (1Н, дублет, НС1, Ju 9.6 Гц); сигналы 3.97 и 4.04 (2Н, два дублета, COCH2N); 6.70 и 7.90 (два дублета), 7.32 и 7.64 (два мультиплета) отнесены к ароматическим протонам (8Н). Согласно данным 'Н-ЯМР при 30°С соотношение двух компонентов составило 1:1.1, при 50°С - 1:1.3. 8.4. Взаимодействие олигосахаридов с 2АР

0.5-500 нмоль олигосахарида растворяли в минимальном (10-30 мкл) количестве воды, затем прибавляли 100 мкл 10-300 мг/мл раствора 2АР либо в уксусной кислоте, либо в метаноле, либо в смеси DMSO-AcOH 7:3, а также 0.2-10 мкмоль NaBH3CN в минимальном количестве метанола (10-20 мкл), либо 0.2-10 мкмоль 8 М ВНз в пиридине. Реакционную смесь выдерживали 2-5 ч при 60-80°С, при необходимости прибавляли дополнительные 0.1-10 мкмоль NaBHjCN в метаноле и инкубировали в течение ночи при 40°С. За ходом реакции наблюдали либо по ТСХ на силикагеле в системе метанол-ацетонитрил-вода-уксусная кислота 6:6:2:1 (для 90S - в системе этанол-вода-пиридин-вода-уксусная кислота 10:1:1:1), либо с помощью ВЭЖХ (см п. 12.1), для чего реакционную смесь предварительно обрабатывали следующим образом. Сложенные вместе 3 диска бумаги Whatman ЗММ диаметром 5 см промывали последовательно 2 мл воды, 1 мл 30% уксусной кислоты и 2 мл ацетонитрила, согласно [71]. Затем наносили на диски предварительно упаренную и растворенную в 200 мкл воды реакционную смесь и оставляли на 15 мин. Далее диски промывали 2x1 мл ацетонитрила и 10x1 мл 96% ацетонитрила. Меченые олигосахариды элюировали водой 4x0.3 мл, элюаты объединяли и упаривали досуха на вакуумной центрифуге. Производное мелибиозы выделяли на колонке с Dowex 50Wx2-200 в Н+-форме (0.5x5 см), элюируя продукт 2 М пиридином в воде и наносили на С^-патрон (8x25 мм), элюируя продукт 15% метанолом в воде. 2АР-производные 11 OS и изо-мальтооктаозы выделяли сначала гель-фильтрацией на LH-20 (1.5x20 см), элюируя смесью метанол-вода 1:1. Выход в случае мелибиозы - 60%, в остальных случаях - не больше 30%. Rf = 0.33 для Ме1-2АР (изопропанол : этил ацетат : вода 4:3:2), Rf = 0.1 для iMg-2AP (этанол:вода:пиридин:АсОН 6:6:2:1), Rf = 0.19 для 110S-2AP (этанол:вода:пиридин:АсОН 6:6:3:1). Ме1-2АР и 110S-2AP были охарактеризованы методом 1 Н-ЯМР-спектрометрии. Характеристические сигналы для Mel-2AP (D2O), ррш: 3.74 (1Н, дублет, НС1 остатка а-галактозы, Ji,2=2), сигналы в области от 6.94 до 7.97 отнесены к ароматическим протонам (4Н), сигнал НС1 остатка глюкозы отсутствует. Для 110S-2AP: сигналы в области от 6.83 до 7.92 отнесены к ароматическим протонам; 1.73 (дублет дублетов) и 2.70 (дублет дублетов) отнесены к протонам СН2ОН в Neu5Ac, сигналы в области от 2.02 до 2.12 - (18Н, 6 синглетов) NHAc; 4.93 (синглет) и 5.16 (синглет) - сигналы НС1 а-маннозных остатков: сигналы в области от 4.50 до 4.70 - 6Н, НС1 остатков Gal и GlcNAc. Образец 110S-2AP совпадал (ВЭЖХ) с коммерчески доступным 110S-2AP (см. ниже). Структура iMg-2AP была подтверждена масс-спектрометрией ([М+Н]+, mlz 1393.6, расчетное значение 1397.4) 8.5. Взаимодействие гликозиламинов с Fmoc-Gly-SI

Индивидуальные амины, гликозиламины или их пул (0.2-200 нмоль) растворяли в 100 мкл 50-150 мМ EtjN-AcOH буферного раствора, рН 6.9-7.9 (либо использовали реакционную смесь, полученную после отщепления PNG-азой F, рН 7.3) и прибавляли 150 мкл 4-40мг/мл раствора Fmoc-Gly-SI в ацетонитриле. Реакционную смесь встряхивали, при необходимости центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, и выдерживали 2-15 часов при комнатной температуре. В случае с 11 OS контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе метанол-ацетонитрил-вода 4:4:1, Rf = 0.4 для Fmoc-Gly-llOS. Пластинки проявляли сначала под УФ-светом, а затем обугливали 8% фосфорной кислотой при 200°С. По окончании процесса реакционную смесь разбавляли водой до 1 мл и экстрагировали 3x200 мкл хлороформа. Затем хлороформ ре-экстрагировали 200 мкл воды, водные фазы объединяли и экстрагировали 3x200 мкл диэтиловым эфиром. Полученную эфирную фракцию также ре-экстрагировали 200 мкл воды. Водные фазы объединяли и упаривали на вакуумной центрифуге. Выход в случае 110S составил 75% (оценивали с помощью ВЭЖХ, см. ниже). Структура меченого 110S была подтверждена масс-спектрометрией ([M-H+2Na]+, mlz 2569.2, расчетное значение 2569.8). Выход в случае Fmoc-Gly-производного глицинмелибиозы - 83% (данные масс-спектрометрии ([M+Na]+, mlz 151 А, расчетное значение 757.5)

Реакционные смеси, полученные после отщепления PNG-азой F, сначала центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, супернатанты отбирали, разбавляли водой до 1 мл и экстрагировали как описано выше. После экстракции проводили дополнительную очистку согласно [71]. Для этого сложенные вместе 3 диска бумаги Whatman ЗММ диаметром 5 см промывали последовательно 2 мл воды, 1 мл 30% уксусной кислоты и 2 мл ацетонитрила. Затем наносили на диски меченые олигосахариды в 200 мкл воды и оставляли на 15 мин, промывали 2x1 мл ацетонитрила и 10x1 мл 96% ацетонитрила. Меченые олигосахариды элюировали 4x0.3 мл воды, элюаты объединяли и упаривали досуха на вакуумной центрифуге, хранили при -20°С.

9. Актирование 2АР-меченых олигосахаридов

9.1. Взаимодействие меченой 2-аминопиридином изомальтооктаозы с активированным эфиром полиакриловой кислоты

К 0.5 мг (0.7 мкмоль) iMg-2AP в 177 мкл DMSO прибавляли 34 мкл 10 мг/мл (1.75 мкмоль) раствора pNPA в DMSO, либо 30 мкл 10 мг/мл (1.75 мкмоль) раствора pNSA в DMSO, 85 мкл 1 мг/мл (0.7 мкмоль) раствора 4-ДМП в DMSO, 2 мкл Et3N и выдерживали 2 сут. при 37°С, отбирая сразу, через 4 ч, 24 ч и 48 ч по 50 мкл. Контроль за протеканием реакции осуществляли на жидкостном хроматографе Beckman с УФ-детектором той же фирмы, на колонке Beckman Cjg (4x250 мм). Элюент: 0.75% ацетонитрила в воде, скорость потока - 1 мл/мин. Полноту протекания реакции контролировали по исчезновению пика, соответствующего iMg-2AP (X, = 320 нм). 9.2. Взаимодействие меченой 2-аминопиридином мелибиозы с нитрофениловым эфиром 5-биотиниламидокапроновой кислоты

К раствору 3 мг (7 мкмоль) Ме1-2АР в 0.6 мл DMSO прибавляли раствор 7-70 мг (14-140 мкмоль) нитрофенилового эфира 5-биотиниламидокапроновой кислоты, содержащий 3.5 мг (28 мкмоль) 4-ДМП и 12 мкл EtjN в 0.6 мл DMSO. Перемешивали до полного растворения и выдерживали в течение 2 сут при 65°С. Контроль за протеканием реакции осуществляли по ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол-вода 7:5:1. Пластинки проявляли сначала под УФ-светом, а затем обугливали 8% фосфорной кислотой при 200°С. По окончании реакции прибавляли 300 мкл концентрированного водного аммиака и оставляли на ночь при комнатной температуре. Продукт ацилирования выделяли гель-фильтрацией на Sephadex LH-20 (1.5x20 см), элюируя смесью ацетонитрил-вода 1:1. Контроль разделения осуществляли с помощью ТСХ в тех же условиях. Фракции, содержащие углевод, объединяли и упаривали в вакууме до появления мути. Раствор оставляли при 4°С на ночь для кристаллизации. Образовавшийся осадок отфильтровывали через вату и промывали водой. Фильтрат упаривали, растворяли в 0.3 мл воды, центрифугировали полученную взвесь в течение 5 мин при 10000 об/мин, супернатант наносили на Cig-патрон, предварительно промытый 2 мл ацетонитрила, а затем 5 мл воды. Промывали последовательно 15 мл воды и 30 мл 50% метанола в воде.

Метанольную фракцию упаривали, перерастворяли в 0.4 мл воды, центрифугировали полученную взвесь в течение 5 мин при10000 об/мин, супернатант наносили на Dowex 50Wx2-200 в Н+-форме (0.5x3 см) в смеси метанол-вода 1:1, элюировали сначала смесью метанол:вода 1:1, а затем 1 М пиридином в той же смеси. Пиридиновую фракцию упаривали, перерастворяли в 100 мкл 0.1 М NaOH и выдерживали 2 ч при комнатной температуре. ТСХ показала наличие только исходных веществ.

10. Десиалилирование

Десиалилирование проводили с помощью нейраминидазы из Vibrio cholerae. Для этого растворяли олигосахариды (0.1-100 нмоль) или АГП (1 мг) в 250 мкл 0.01 М ацетатного буферного раствора, содержащего 1 шМ хлорид кальция, рН 5.1, и прибавляли 0.5-3 мкл нейраминидазы (4.5-36 mU). Перемешивали, выдерживали 2 часа при 37°С. По окончании реакции раствор замораживали и лиофилизовали.

11. Обработка Fmoc-Gly-олигосахаридов галактозидазой

50 - 100 пмоль Fmoe-Gly-олигосахарида растворяли в 100 мкл 50 мМ ацетатного буферного раствора, рН 4.5, прибавляли 20 mU р-галактозидазы из Bovine testes и выдерживали 2 ч при 37°С. Реакцию останавливали замораживанием.

12. Разделение флуоресцентно-меченых олигосахаридов

Для разделения Fmoe-GIy-олигосахаридов использовали колонку Vydac Си small роге (4.6x250 мм). Олигосахариды из IgG предварительно десиалилировали. При разделении олигосахаридов варьировали условия элюирования (продолжительность градиента и концентрацию ацетонитрила в воде) для достижения максимального разрешения пиков. Скорость потока 1 мл/мин. При флуоресцентной детекции ^ех/еш=265/310 нм; при УФ-детекции при 265 нм. Фракции упаривали на вакуумной центрифуге. Для разделения десиалилированных олигосахаридов из аАГП оптимальными условиями были: градиент от 10 до 50% ацетонитрила в воде за 100 мин; олигосахариды из IgG разделяли в 20% водном ацетонитриле.

Для разделения 2АР-меченых олигосахаридов также использовали колонку Vydac Ci8 small pore (4.6x250 мм) в градиентном режиме, варьируя концентрацию ацетонитрила в воде, содержащей 0.05% ТФУ, и продолжительность градиента. Оптимальными условиями оказались градиент от 0% до 0.2% ацетонитрила в воде, содержащей 0.05% ТФУ, в течение 40 минут; скорость потока -1 мл/мин (/Wem=320/410 нм).

Для разделения Fmoc-Gly-производных олигосахаридов использовали также колонку Tosoh NH2-6O (4.6x250 мм). Оптимальными условиями разделения были: ацетонитрил, содержащий 2% АсОН (элюент А); вода, содержащая 5% АсОН и 3% Et3N (элюент Б); 10 мин - 80% элюент А в элюенте Б, а затем градиент от 80% до 10% элюента А в элюенте Б в течение 100 минут. Скорость потока 1 мл/мин, ^ех/еш=265/310 нм или УФ-детекция при 265 нм.

Для оценки полноты мечения олигосахаридов, отщепленных от гликопротеинов и превращенных во Fmoc-Gly-производные, в качестве стандарта использовали Fmoc-Gly-производное глицинмелибиозы (Galal-6Glcpi-NH-COCH2NH-COCH2NH-Gly-Fmoc). Для этого производное глицинмелибиозы с известной концентрацией, полученное в подобранных для 11 OS оптимальных условиях, и Fmoc-Gly-меченые олигосахариды хроматографировали в одинаковых условиях и сравнивали площадь Fmoc-Gly-llOS или сумму площадей (в случае пула меченых олигосахаридов) с площадью пика Fmoc-Gly-производного глицинмелибиозы.

Количество 2АР-производных оценивали с помощью ВЭЖХ, используя в качестве стандарта 110S-2AP известной концентрации.

13. Превращение Fmoc-Gly-олигосахаридов в глицильные производные

Реакцию проводили согласно [60] с некоторыми изменениями. К раствору 1 -100 нмоль Fmoc-Gly-олигосахарида в 25 мкл воды прибавляли 35 мкл DMF и 10 мкл пипердидина. Выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Разбавляли реакционную смесь водой до 0.2 мл и экстрагировали хлороформом (3x0.2 мл), затем диэтиловым эфиром (3x0.2 мл). Органическую фазу ре-экстрагировали 0.2 мл воды. Водные фракции объединяли и упаривали на вакуумной центрифуге. Хранили при -20°С. В случае 11 OS образование глицильного производного показано с помощью ТСХ (сравнивали с заведомым стандартом llOS-Gly), метанол:ацетонитрил:вода 3:3:2.

14. Превращение 2АР-производных олигосахаридов в аминоальдитолы Превращение проводили в двух вариантах: 1) с помощью Pd-черни согласно [90] и 2) с использованием родиевых наночастиц.

1 вариант. К 2 мг (5 мкмоль) Ме1-2АР прибавляли 4 мг Pd-черни в виде суспензии в воде и разбавляли водой, подкисленной АсОН (рН 3.0), до 1 мл. Гидрирование проводили при перемешивании при атмосферном давлении и комнатной температуре в течение 16 ч. Контроль реакции осуществляли по ТСХ на силикагеле в системе изопропанол-этилацетат-вода 4:3:2. Пластинки проявляли сначала под УФ-светом, а затем 8% фосфорной кислотой при 200°С. По окончании реакции удаляли Pd-чернь фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали, прибавляли 0.2 мл безводного гидразина и выдерживали 3 мин при 70°С, после чего реакционную смесь упаривали на вакуумной центрифуге, соупаривали с толуолом (3x0.2 мл). Полученный аминоальдитол выделяли на Dowex 50Wx2-200 в Н+-форме (0.5x5 см), элюируя продукт 0.5 М водным аммиаком. Выход около 50%. Структура 1-амино-1-дезоксимельтитола была подтверждена масс-спектрометрией ([М+Н]+, mlz 344.1, расчетное значение 344.2)

2 вариант. К 250 пмоль 90S-2AP, полученного десиалилированием 110S-2AP (Glyence, Япония) в 225 мкл воды прибавляли при перемешивании 0.3 мкл (1 нмоль) 3.8 М раствора наноНЬ-частиц. Гидрирование проводили при перемешивании при комнатной температуре и атмосферном давлении в течение ночи. Контроль за протеканием реакции осуществляли с помощью ВЭЖХ. Реакционную смесь центрифугировали в течение 15 мин при 13400 об/мин, супернатант отбирали и наносили на 0.1 мл С^-силикагеля, предварительно промытого 2 мл ацетонитрила, затем 3 мл воды, и элюировали 0.3 мл воды. Водную фазу собирали и упаривали. Затем прибавляли 0.2 мл безводного гидразина и выдерживали 3 мин при 70°С. Реакционную смесь упаривали на вакуумной центрифуге и соупаривали с толуолом (3x0.2 мл). Хранили при -20°С. Выход аминоальдитола 9OS-0I-NH2 около 30% (оценивали с помощью ВЭЖХ, предварительно превратив его во Fmoc-Gly-производное, как описано выше).

15. Масс-спектрометрический анализ олигосахаридов

Образцы растворяли в 10 мкл 40% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ. Затем на стальной мишени смешивали по 0.5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10 мг/мл в 20% водном ацетонитриле, содержащим 0.5% ТФУ), полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры получали в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона.

16. Иммобилизация олигосахаридов в гидрогелевом 3D-4une

К раствору, содержащему 4.75%» (w/v) метакриламида, 0.25% (w/v) >Щ-метилен бисакриламида, 50% (v/v) глицерина в 10 мкл 0.1 М PBS и Темед до рН 10.5 [91], прибавляли 10 - 100 нмоль олигосахарида, содержащего аминогруппу. Полученные растворы олигосахаридов помещали в лунки 384-луночного планшета и с помощью робота QArray («Genetix», Англия) наносили на стекла, обработанные Bind-silane [72], в виде капель объемом 1 пл. Стекла облучали УФ-светом (А. = 312 нм, интенсивность 0.06 W/см2) в течение 50 мин при комнатной температуре. Полученные микрочипы промывали 0.1 М PBS, содержащим 0.1% Tween 20, рН 7.5. Размер полученных элементов геля - 25 мкм в высоту и 150 мкм в диаметре. Микрочипы хранили в водном 50% глицерине при температуре 20°С в течение 6 месяцев.

17. Изучениеуглеводсвязывающих белков с помощью ЗЭ-гликочипа

Микрочипы, содержащие иммобилизованные олигосахариды в концентрации от 1 до 10 пмоль/элемент геля, помещали в камеру, снабженную перистальтическим насосом, прибавляли 80 мкл человеческих антител, узнающих Galal-3Gal (разбавление от 1:10 до 1:1000 в 0.1 М PBS, рН 7.5) и перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем промывали 0.1 М PBS, содержащим 0.1% Tween 20, рН 7.5, в течение 10 мин. После этого прибавляли 80 мкл мышиных антител против иммуноглобулинов человека (разведение 1:40 в 0.1 М PBS, рН 7.5), перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре и промывали 0.1 М PBS, содержащим 0.1% Tween 20, рН 7.5, в течение 10 мин. Затем прибавляли 80 мкл Су5-меченых мышиных антител, против иммуноглобулинов мыши (1 мкг/мл в 0.1 М PBS, рН 7.5) и перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После промывания 0.1 М PBS, содержащим 0.1% Tween 20, рН 7.5, микрочипы промывали водой и высушивали на воздухе. Измерение флуоресценции индивидуальных элементов геля осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа [92], Аех/ет=650/670 нм. Значение флуоресценции для каждой концентрации рассчитывали как среднее арифметическое из значений в 4 параллельных элементах геля.

18. Иммобилизация олигосахаридов на 2D-4une

18.1. Иммобилизация аминопроизводных ОС на NHS-активированных слайдах

Олигосахариды, содержащие аминогруппу (список олигосахаридов и их концентрации в растворе для печати приведены в таблице 5), растворяли в 300 мМ PBS, содержащем 0.005% Tween 20, рН 8.5 и 100 мкг/мл БСА, до концентрации 10-100 мкМ и наносили на NHS-активированные стекла («Schott Nexterion», Германия) при помощи принт-робота Microarray Technology, «Array It» (США), объем капли - около 0.6 нл [76].

Таблица 5. Лиганды и их концентрации в растворе для печати на NHS-активированных слайдах. фракции или название ос 8 9 10 12.1 12.2 12.3 12.4

С, мкМ 80 50 20 40 40 80 20 фракции или название ос 13 14 90S-ol-NH2 90S-Gly Le"-sp* Ley-sp

С, мкМ 100 80 15 50 50 50 sp - аминопропильный спейсер

Полученные слайды выдерживали при относительной влажности 80% при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего помещали в эксикатор и выдерживали в вакууме в течение ночи. Затем слайды помещали в 50 мМ боратный буферный раствор, содержащий 50 мМ этаноламин, рН 9.2 и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего промывали водой и хранили в эксикаторе при комнатной температуре.

18.2. Иммобилизация активированных полиакриламидных гликоконъюгатов на NH?-чипах

К 41 мкл 20 мг/мл раствора pNPA (4.25 мкмоль) или 37 мкл 20 мг/мл раствора pNSA (4.25 мкмоль) в DMSO прибавляли 13 мкл 3% раствора (0.04 мкмоль) флуоресцеина в DMSO и 0.5 мкл триэтиламина и выдерживали в течение ночи при 37°С. После этого прибавляли 0.85 мкмоль А(п или Bin в виде 3-аминопропилгликозида в 55 мкл DMSO, дополнительные 0.5 мкл триэтиламина и вццерживали сутки при 37°С. Все конъюгаты хранили при -20°С.

Полученные реакционные смеси разбавляли DMSO, содержащем 1% (v/v) триэтиламина, до концентрации 100 мкМ по углеводу и наносили на слайды с помощью робота Microarray Technology (Arraylt, США), объем капли - 0.6 нл. Полученные слайды выдерживали при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем выдерживали в DMSO, содержащем 10% (по объему) 2-этаноламина в течение 30 мин, промывали последовательно DMSO, водой и 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 0.05% Tween 20, после чего помещали в эксикатор над драйеритом.

Оценку степени иммобилизации активированных гликоконъюгатов на аминослайдах проводили следующим образом. Брали два слайда, полученные после печати, один из которых оставляли без изменения, а второй промывали сначала 0.1 М PBS, содержащим 0.1 % Tween, а затем водой. После этого измеряли интенсивность флуоресценции дотов на обоих слайдах по флуоресцеину (Хсх/Ст 490/520 нм) и сравнивали полученные сигналы.

19. Изучениеуглеводсвязывающих белков с помощью 20-гликочипа 19.1. Чипы на основе NHS-активированных слайдов

К гликочипам прибавляли либо 1-10 мкг/мл раствор биотинилированных лектинов, либо сыворотку крови человека (разведение 1:25-1:100) в 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащем 0.05-1% Tween 20. Чипы выдерживали при относительной влажности 80% в течение 30-60 мин. Слайды промывали 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащем 0.05% Tween 20 и прибавляли раствор антител, узнающих человеческие Ig, меченых либо биотином, либо Texas Red (Яех/ет=596/630 нм), разведение 1:200. После инкубации при относительной влажности 80% в течение 30-60 мин меченые биотином антитела проявляли стрептавидином, меченым Alexa 555 (разведение 1:100), в 0.1 М PBS, рН 7.4. После инкубации с флуоресцентно-мечеными антителами или стрептавидином, слайды промывали сначала 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 0.05% Tween 20, затем водой и сразу же измеряли интенсивность флуоресценции (kexjcm 555/565 нм (Alexa 555) или 595/620 нм (Texas Red)). Значение флуоресценции для каждой концентрации рассчитывали как среднее арифметическое из значений в 6 параллельных дотах. 19.2. Чипы на основе шинированных слайдов

К чипам прибавляли 0.2 мл сыворотки группы крови О, разведенные 1:50 или 1:100 в 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 1% Tween 20 и выдерживали при относительной влажности 80% в течение 60 мин при 37°С на шейкере. Слайды промывали 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 0.05% Tween 20, и прибавляли раствор меченых Texas Red антител, узнающих Ig человека в 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 0.1% Tween 20 (разведение 1:200). После инкубации при относительной влажности 80% в течение 60 мин при 37°С на шейкере, слайды промывали сначала 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 0.05% Tween 20, затем водой и сразу же измеряли интенсивность флуоресценции (А,ех/еш 595/620 нм). Значение флуоресценции для каждой концентрации рассчитывали как среднее арифметическое из значений в 6 параллельных дотах.

20. Синтез гликоконьюгатов для ИФА

20.1. Синтез гликоконьюгатов Glyc-PAA30 и Glyc-PAA2000

Смешивали раствор олигосахарида в виде аминоспейсерированного производного в DMSO (или в DMF), концентрация 5-10 мг/мл, и раствор pNPA или pNSA в DMSO (или DMF), обычно 20 мг/мл, прибавляли 5% (v/v) триэтиламина и оставляли при 37°С в течение 16-48 ч. Полноту конденсации контролировали с помощью ТСХ по исчезновению исходного олигосахарида, проявляя нингидрином. Наиболее часто используемая система для ТСХ: н-бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота-этанол 10:10:10:2:100. По завершении конденсации к реакционной смеси прибавляли 10% (у/у) 2-этаноламина (или равный объем концентрированного раствора аммиака) и выдерживали 16-48 ч при комнатной температуре. Для выделения Glyc-PAA использовали колонку с Sephadex LH-20 (элюция смесью ацетонитрил-вода 1:1). Содержащие конъюгат фракции упаривали. Выходы около 95%. 20.2. Синтез конъюгата Btn-PAA-f3HlLeu

К раствору 1.93 мг (10 мкмоль) pNPA, либо 1.7 мг (10 мкмоль) pNSA в 0.1 мл DMSO прибавляли раствор 5 мкг (0.038 мкмоль) Н-меченого лейцина, (40 Ки/ммоль) в 0.1 мл смеси метанол-уксусная кислота (500:1), 2 мкл триэтиламина и выдерживали сутки при 37°С. После этого к реакционной смеси прибавляли 1.4 мг (2 мкмоль) Btri в виде 3-аминопропилгликозида в 0.2 мл DMSO и 2 мкл триэтиламина, и выдерживали сутки при 37°С. По окончании реакции (контроль по ТСХ в системе н-бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота-этанол 10:10:10:2:100) прибавляли 50 мкл 2-этаноламина (или равный объем концентрированного раствора аммиака) и выдерживали 16 ч при комнатной температуре. Затем конъюгат выделяли гель-хроматографией (Sephadex LH-20, элюция смесью ацетонитрил-вода 1:1), содержащие конъюгат фракции упаривали. Выход около 95%. Активность Btri-PAA30-[3H]Leu составила 0.13 мКи/мкмоль Btri, Bt„-PAA2000-[3H]Leu -0.23 мКи/мкмоль Btri.

21. Иммобилизация гликокопъюгатов на аминированном полистироле 21.1. Гликоконъюгат В(Г,-РАА30

К раствору 1.4 мг (2 мкмоль) спейсерированного В^ в виде 3-аминопропилгликозида в 500 мкл DMSO прибавляли раствор 1.9 мг (10 мкмоль) pNPA в

500 мкл DMSO и 10 мкл триэтиламина, смесь выдерживали при 37°С в течение 48 ч, раствор хранили при температуре -10°С. Для иммобилизации раствор неогликоконъюгата (2 мкг/мл, 200 нг в лунку) вносили в первую лунку ЫНг-модуля (аминированного

4 Ч л полистирола, содержащего 2x10 аминогрупп/см ) и затем последовательно разбавляли вдвое DMSO и инкубировали при комнатной температуре в течение 24 ч, после чего прибавляли 10 мкл водного 3 М NH3 или 10% (по объему) 2-этаноламина и выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре и промывали несколько раз водой. Затем в каждую лунку прибавляли 0.1 мл насыщенного бикарбоната натрия и 5 мкл уксусного ангидрида. Выдерживали в течение 0.5 ч при комнатной температуре и промывали несколько раз водой. Затем модули использовали для ИФА (см. ниже). 21.2. Гликоконъюгат B,ri-PAA2000

К раствору 1.4 мг (2 мкмоль) спейсерированного Btri в виде 3-аминопропилгликозида в 500 мкл DMSO прибавляли раствор 1.7 мг pNAS (10 мкмоль) в 500 мкл DMSO и 10 мкл триэтиламина, смесь выдерживали при 37°С в течение 48 ч. Дальнейшие операции были аналогичны описанным выше.

22. Оценка степени физической адсорбции гликоконьюгатов

В полистироловые модули вносили раствор В^-РАА30 в 0.05 М карбонатном буферном растворе, рН 9.6, последовательно разбавляли вдвое и выдерживали в течение 15 ч при 4°С, начальная концентрация конъюгата была 20 мкг/мл, конечная - 2.5 мкг/мл. После инкубации растворы переносили во флаконы, содержащие 5 мл сцинцилляторной жидкости «Universal cocktail» («ISN Radiochemicals», Швеция). Модули промывали 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащим 0.05% Tween 20, и каждую порцию буферного раствора помещали во флакон со сцинцилляторной жидкостью. После промывки модули разрезали и каждую «лунку» помещали во флакон с сцинцилляторной жидкостью. Далее проводились измерения радиоактивности растворов, смывов и «лунок».

В случае В^-РАА2000 использовали последовательное разбавление от 10 мкг/мл до 0.2 мкг/мл, время инкубации составило 24 ч при комнатной температуре.

23. Иммупофермептный анализ лл

В полистироловые планшеты вносили 100 мкл раствора Btrj-PAA в 0.05 М карбонатном буферном растворе, рН 9.6, последовательно разбавляли вдвое (диапазон концентраций 10 мкг/мл — 150 нг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч (или в течение ночи при 4°С). В случае В^-РАА2000 диапазон используемых концентраций конъюгата составлял 0.5 мкг/мл - 7.5 нг/мл, время инкубации 16-24 ч при комнатной температуре. После промывки в 0.1 М PBS, рН 7.4, содержащем 0.05% Tween 20, лунки блокировали 3% БСА в 0.1 М PBS, рН 7.4, в течение 1 ч при 37°С. Затем планшеты промывали и инкубировали с мышиными антителами, узнающими трисахарид В (1:2500), в 0.1 М PBS, содержащем 0.3% БСА в течение 1 ч при 37°С. После промывки, связавшиеся мышиные антитела проявляли с помощью пероксидазного конъюгата антител против иммуноглобулинов мыши (1:1000) в 0.1 М PBS, содержащем 0.3% БСА, инкубируя планшеты при 37°С в течение 60 мин. Планшеты промывали и вносили 100 мкл субстрата для пероксидазы (0.03% пероксида водорода и 0.04% о-фенилендиамина в 0.1 М фосфатно-цитратном буферном растворе, рН 5.1). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М H2SO4, и измеряли поглощение при 492 нм.

При использовании модулей с химически иммобилизованными конъюгатами операции были аналогичны описанным выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из целей данной работы является создание такой бифункциональной флуоресцентной метки, чтобы меченые ей сахариды после аналитической хроматографии можно было использовать для конструирования чипов. Такой реагент должен состоять из флуоресцирующей молекулы, содержащей две химически и стереохимически эквивалентные группы, чтобы одна из них отвечала за реакцию с восстанавливающим концом сахарида, а другая - за связывание с твердой фазой. Такие требования к реакционным группам необходимы для того, чтобы при взаимодействии с олигосахаридами образовывались только однотипные производные. Возможен также другой вариант, когда одна из функциональных групп является скрытой, т.е. становится реакционноспособной после деблокирования.

На основании анализа литературных данных в качестве такой бифункциональной флуоресцентной метки были выбраны гидразиды карбоновых или сульфокислот, поскольку они вводятся в сахариды по восстанавлявающему концу в мягких условиях (рН не ниже 3.0, температура не выше 70°С, относительно небольшой избыток метки, легкость отделения реагента от продукта мечения), с высокими выходами, высокой р-стереоселективностью, с сохранением пиранозного цикла.

На начальном этапе было решено проверить, действительно ли гидразиды количественно и в мягких условиях взаимодействуют с олигосахаридами, и, если это так, то найти оптимальные условия проведения этих реакций.

Выводы:

1. Проведен систематический поиск флуоресцентных меток, позволяющих сначала разделять сложные олигосахариды с помощью аналитической ВЭЖХ, а затем их иммобилизовать. Показано, что олигосахариды, меченые Fmoc-глициновой и 2-аминопиридиновой группами, после разделения могут быть трансформированы в производные, удобные для принта как на 2D-, так и на ЗБ-микрочипах.

2. Разработаны методы иммобилизации, позволяющие представлять олигосахариды на 20-микрочипе в моновалентной и мультивалентной формах. Для представления в моновалентной форме аминопроизводное олигосахарида непосредственно присоединяется к активированным карбоксильным группам чипа, в то время как для представления в мультивалютной форме - к активированному полимеру, который затем конъюгируется с аминогруппам чипа.

3. Показано, что выделяемые с помощью аналитической ВЭЖХ пикомольные количества олигосахаридов - N-цепей гликопротеинов, достаточны для практического конструирования гликочипов.

Заключение

Проведенное исследование открывает возможность использования хорошо известных методов структурной химии углеводов для создания библиотек гликопротеиновых N-, а в последствии и О-цепей, и конструирования гликочипов на их основе. В дальнейшем, предложенная методология будет применятся для конструирования двух типов гликочипа. Первый, - универсальный, многоцелевой -конструируется на основе всех имеющихся на данный момент олигосахаридов. Технически вполне реально наносить на 2D- или ЗБ-чип 12000 дотов - при шести повторах это соответствует 2000 разных олигосахаридов. Общее число известных надежно идентифицированных углеводных цепей гликопротеинов и гликолипидов млекопитающих лежит в этих же пределах. Стратегической целью лаборатории химии углеводов ИБХ является создание универсального чипа с представленностью олигосахаридов (синтетических и выделенных), постепенно стремящейся к этому числу -чипа, который предназначен для поиска новых углевод-связывающих молекул, исчерпывающей характеристики углеводной специфичности уже известных белков, поиска неизвестных углевод-опосредованных процессов, а также на первом этапе разработки практически важных диагностических систем. Второй тип чипа, который можно назвать гликомным, конструируется только из олигосахаридов данного гликопротеина, что позволит находить, какой именно из олигосахаридов этого гликопротеина опосредует его функцию. Аналогично, можно будет делать чипы на основе более сложных гликомов - из данного типа клеток или органа. Очевидно, что информативность такого чипа тем выше, чем полнее на нем представлен гликом.

Разработанная в данной работе методология подходит для принта обоих типов гликочипов - универсального и гликомного, причем как в 2D- так и в ЗО-варианте. Однако, по-видимому, только 20-платформа, позволяющая работать на пикомольном уровне, полностью соответствует «идеологии» гликомного чипа. С точки зрения выбора метки, Fmoc-Gly представляется более перспективной для гликомного чипа, чем 2АР-метка, так как модифицирование последней методически заметно сложнее. Что касается универсального чипа, то на него можно наносить как Fmoc-Gly-олигоеахариды и коммерчески доступные 2АР-гликаны (после модификации), так и уже имеющиеся спейсерированные синтетические олигосахариды. Наконец, необходимо сделать выбор между двумя предложенными методами иммобилизации, то есть 1) нанесением олигосахарида на NHS-активированный чип и 2) присоединением олигосахарида к активированному полимеру с последующей иммобилизацией на NHi-чипе. Второй подход представляется предпочтительным, так как гарантирует мультивалентное представление олигосахарида, на обеих стадиях приводит к количественному выходу, а также позволяет вводить в полимер метку для контроля иммобилизации сахарида на чипе.

Таким образом, из исследованных в работе меток, платформ и методов иммобилизации выбраны наиболее рациональные и перспективные; предварительная, методологическая стадия развития данного направления закончена, и открывается возможность выполнять следующую стадию исследовательской программы - применение гликочипов для решения гликобиологических и медицинских задач.

1. www.functiona1glvcomics.org

2. A. Varki. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct // Glycobiology. 1993. V. 3. P. 97-130.

3. R.F. Borch, M.D. Bernstein, H.D. Durst. Reductive animation // J. Am. Chem. 1971. V. 93. P. 2897-2904

4. O. Quintero, R. Montesino, J. A. Cremata. Two-dimensional mapping of 8-amine-l,3,6-naphthalene trisulfonic acid derivatives of N-linked neutral and sialyloligosaccharides // Anal. Biochem. 1998. V. 256. P. 23-32.

5. F-T.A. Chen, R.A. Evangelista. Analysis of mono- and oligosaccharide isomers derivatized with 9-aminopyrene-l,4,6-trisulfonate by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence // Anal. Biochem. 1995. V. 230. P. 273-280.

6. F-T: A. Chen, T.S. Dobashi, R.A. Evangelista. Quantitative analysis of sugar constituents of glycoproteins by capillary electrophoresis//Glycobiology. 1998. V. 8. P. 1045-1052.

7. N. Callewaert, S. Geysens, F. Molemans, R. Contreras. Ultrasensitive profiling and sequencing of N-linked oligosaccharides using standard DNA-sequencing equipment // Glycobiology. 2001. V. 11. P. 275-281.

8. K.B. Lee, U.R. Desai, MM. Palcic, O. Hindsgaul, R.J. Linhardt. An electrophoresis-based assay for glycosyltransferase activity // Anal. Biochem. 1992. V. 205. P. 108-114.

9. K.B. Lee, A. AI-Hakim, D. Loganathan, R.J. Linhardt. A new method for sequencing linearoligosaccharides on gels using charged, fluorescent conjugates // Carbohyd. Res. 1991. V. 214. P.55-168.

10. P. Jackson. High-resolution polyacrylamide gel electrophoresis of fluorophore-labeled reducing saccharides // Meth. Enzymol. 1994. V. 230. P. 250-253.

11. P. Jackson. Polyacrylamide gel electrophoresis of reducing saccharides labeled with the fluorophore 2-aminoacridone: subpicomolar detection using an imaging system based on a cooled charge-coupled device // Anal.Biochem. 1991. V. 196. P. 238-244.

12. P. Camilleri, G.B. Harland, G. Okafo. High resolution and rapid analysis of branched oligosaccharides by capillary electrophoresis // Anal. Biochem. 1995. V. 230. P. 115-122.

13. K.C. Ingham, S.A. Brew. Fluorescent labelling of the carbohydrate moieties of human chorionic gonadotropin and alpha 1-acid glycoprotein // Biochem. Biophys. Acta. 1981. V. 670. P. 181-189.

14. S. Hase, S. Hara, Y. Matsushima. Tagging of sugars with a fluorescent compound, 2-aminopyridine // J. Biochem. 1979. V. 85. P. 217-220.

15. W. Nishabeh, Z.E. Rassi. Capillary zone electrophoresis of linear and branched oligosaccharides // J. Chromatogr. 1992. V. 600. P. 279.

16. K. Yamamoto, K. Hamazi, K. Zaitsu. 2-Amino-3-phenylpyrazine, a sensitive fluorescent prelabelling reagent for the chromatographic or electrophoretic determination of saccharides. // J. Chromatogr. 2003. V. 1004. P. 99-106.

17. V.N. Reinhold, E. Coles, S.A. Carr. Fluorescent labelling of carbohydrates and analysis by liquid chromatography. Comparison of derivatives using mannosidosis oligosaccharides // J. Carbohydr. Chem. 1983. V. 2. P. 1-18.

18. H. Iwase. I. Ishii-Karakasa. T Urata, T Saito, K. Hoffa. Extraction method for preparing pyridylaminosugar derivatives and application to porcine gastric mucus glycoprotein analysis // Anal. Biochem. 1990. V. 188. P. 200-202.

19. S. Hase. Analysis of sugar chains by pyridylamination // Methods. Mol. Biol. 1993. V. 14. P. 69- 80.

20. S. Hase, T. Ibuki, T. lkenaka. Reexamination of the pyridylamination used for fluorescence labelling of oligosaccharides and its application to glycoprotein. // J. Biochem. 1984. V. 95. P. 197-203.

21. N. Takahashi, Y. Wada, J. Awaya, M. Kurono, N. Tomiya. Two-dimensional elution map of GalNAc-containing N-linked oligosaccharides // Anal. Biochem. 1993. V. 208. P. 96-109.

22. N. Takahashi. Three-dimensional mapping of N-linked oligosaccharides using anion-exchange, hydrophobic and hydrophilic interaction modes of high-performance liquid chromatography // J. Chromatography, A. 1996. V. 720. P. 217-225.

23. C. Prakhash, I.K. Vijay. A new fluorescent tag for labelling of saccharides // Anal. Biochem. 1983. V. 128. P. 41-46.

24. С.Д. Шиян, В.В. Насонов, Н.В. Бовин, Л.И. Новикова, В.А. Алешкин. Молекулярные формы ai-кислого гликопротеина сыворотки крови человека. Различия в содержании ди-, три- и тетраантенных N-углеводных цепей // Биоорг. Химия. 1991. Т. 17. С. 663-670.

25. J.C. Bigge, LP. Patel, J.A. Bruce, P.N. Goulding, S.M. Charles, R. Parekh. Nonselective and efficient fluorescent labelling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid // Anal. Biochem. 1995. V. 230. P. 229-238.

26. K. Kakehi, T. Funakubo, S. Suzuki, Y. Oda, Y. Kitada. 3-Aminobenzamide and 3-aminobenzoic acid, tags for capillary electrophoresis of complex carbohydrates with laser-induced fluorescent detection. //J. Chromatogr. A. 1999. V. 863. P. 205-218.

27. C.-T. Yuen, C.K. Gee, C. Jones. High-performance liquid chromatographic profiling of fluorescent labeled N-glycans on glycoproteins. // Biomed. Chromatogr. 2002. V. 16. P. 247254.

28. Y-J. Chen, D.R. Wing, G.R. Guile, R.A. Dwek, D.J. Harvey, S. Zamze. Neutral N-glycans in adult rat brain tissue-complete characterisation reveals fucosylated hybrid and complex structures // Eur. J. Biochem. 1998. V. 251. P. 691-703.

29. R.R. Townsend, P.H. Lipniunas, C. Bigge, A. Ventom, R. Parekh. Multimode high-performance liquid chromatography of fluorescently labeled oligosaccharides from glycoproteins//Anal. Biochem. 1996. V. 239. P. 200-207.

30. E. Coles, V.N. Reinhold, S.A. Carr. Fluorescent labelling of carbohydrates and analysis by liquid chromatography. Comparison of derivatives using mannosidosis oligosaccharides // Carbohydr. Res. 1985. V. 139. P. 1-11.

31. J. Charlwood, H. Birrell, A. Grible, V. Burdes, D. Tolson, P. Camilleri. A probe for the versatile analysis and characterization of N-linked oligosaccharides // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 1453-1461.

32. Molecular Probe. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. R.P. Haugland. 6th Edition. 1995.680 p.

33. S.A. Perez, L.A. Colon. Determination of carbohydrates as their dansylhydrazine derivativesby capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection // Electrophoresis. 1996. V. 17. P. 352-358.

34. G. Avigad. Dansyl hydrazine as a fluorimetric reagent for thin-layer chromatographic analysis of reducing sugars// J. Chromatogr. 1977. V. 139. P. 343-347.

35. P.M. Eggert, M. Jones. Measurement of neutral sugars in glycoproteins as dansyl derivatives by automated high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1985. V. 333. P. 123131.

36. K. Muramoto, R. Goto, H. Kamiya. Analysis of reducing sugars as their chromophoric hydrazones by high-performance liquid chromatography // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 435442.

37. K. Mopper, L. Johnson. Reversed-phase liquid chromatographic analysis of Dns-sugars. Optimization of derivatization and chromatographic procedures and applications to natural samples //J. Chromatogr. 1983. V. 256. P. 27-38.

38. S.R. Hull, S.J. Turco. Separation of dansyl hydrazine-derivatized oligosaccharides by liquid chromatography//Anal. Biochem. 1985. V. 146. P. 143-149.

39. J-K. Lin, S-S. Wu. Synthesis of dabsylhydrazine and its use in the chromatographic determination of monosaccharides by thin-layer and high-performance liquid chromatography // Anal Chem. 1987. V. 59. P. 1320-1326.

40. Y-S. Yuh, J-L. Chen, C-H. Chiang. Determination of blood sugars by high pressure liquid chromatography with fluorescent detection // J. Pharm. Boimed. Anal. 1998. V. 16. P. 10591066.

41. D.R. Rooyakkers, H.M.H. van Eijk, N.E.P. Deutz. Simple and sensitive multi-sugar-probe gut permeability test by high-performance liquid chromatography with fluorescence labelling // J. Chromatography, A. 1996. V. 730. P. 99-105.

42. J-K. Zhu, E.A. Nothnage. Fluorometric determination of carbohydrate with 2-aminothiophenol // Anal. Biochem. 1991. V.195. P. 101-104.

43. F. Perini, J.B. Sadow, C.V. Hixson. Fluorometric analysis of polyamines, histamine, and 1-methylhistamine // Anal. Biochem. 1979. V. 94. P. 431-439.

44. F. Perini, B.P. Peters. Fluorometric analysis of amino sugars and derivatized neutral sugars // Anal. Biochem. 1982. V. 123. P.357-363.

45. S. Cottaz, B. Brasme, H. Driguez. A fluorescence-quenched chitopentaose for the study of endo-chitinases and chitobiosidases // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 5593-5600.

46. J-D. Schulzke, R. Tauber, W. Reutter. Incorporation of non-acetylated hexosamines into plasma membrane glycoproteins of liver cells after galactosamine injection // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1988. V. 369. P. 957-964.

47. P. Chen, M.V. Novotny. 2-Methyl-3-oxo-4-phenyl-2,3-dihydrofuran-2-yl acetate: a fluorogenic reagent for detection and analysis of primary amines // Anal.Chem. 1997. V. 69. P.2806-2811.

48. W.F. Oswald; R.E. McDonald, R.P. Neidz, J.P. Shapiro, R.T.F. Mayer. Quantitative fluorometric analysis of plant and microbial chitosanases // Anal. Biochem. 1992. V. 204. P. 4046.

49. F. Chen, Y. Liu, J. Lu, K. J. Hwang, V.H. L. Lee. A sensitive fluorometric assay for reducing sugars // Life Sci. 1992. V. 50. P. 651-659.

50. Y. Zhang, A. Arriaga, P. Diedrich, O. Hindsgaul, N.J. Dovichi. Nanomolar deterination of aminated sugars by capillary electrophoresis // J. Chromatography, A. 1995. V. 716. P. 221-229.

51. J. Liu, 0. Shirota, D. Weisler, M. Novotny. Ultrasensitive fluorometric detection of carbohydrates as derivatives in mixtures separated by capillary electrophoresis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 2302-2306.

52. G. Arsequell, R.A. Dwek, S.Y.C. Wong. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-glycine coupling of saccharide P-glycosylamines for the fractionation of oligosaccharides and the formation of neoglyconjugates. // Anal. Biochem. 1994. V. 216. P. 165-170.

53. X.C. Lee, W. Tan, C.H. Seaman, A. Szpacenko, E. Arriaga, Y: Zhang, N.J. Dovichi, O. Hindsgaul, M.M. Palcic. Single cell studies of enzymatic hydrolysis of a tetramethylrhodamine labeled triglucoside in yeast // Glycobiology. 1999. V. 9. P. 219-225.

54. D.K. Toomre, A. Varki. Advances in the use of biotinylated diaminopyridine (BAP) as a versatile fluorescent tag for oligosaccharides // Glycobiology. 1994. V. 4. P. 653-663.

55. C. Leteux, R.A. Childs, W. Chai, M.S. Stoll, H. Kogelberg, T. Feizi. Biotinyl-L-3-(2-naphthyl)-alanine hydrazide derivatives of N-glycans: versatile solid-phase probes for carbohydrate-recognition studies // Glycobiology. 1998. V. 8. P. 227-236.

56. K. Muramoto, F. Yamauchi. H. Kamiya. Preparation of a photoactivatable fluorescent derivative of lactose and its application to photoaffinity labelling of a congereel lectin // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V. 58. P. 1013-1017.

57. Y. Shinohara, H. Sota, M. Gotoh, M. Hasebe, M. Tosu, J. Nakao, Y. Hasegava, M. Shiga. Bifunctional labelling reagent for oligosaccharides to incorporate both chromophore and biotin groups //Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 2573-2579.

58. J.P. Caesar, J.D.B. Sheeley, V.N. Reinhold. Femtomole oligosaccharide detection using a reducing-end derivative and chemical ionization mass spectrometry // Anal. Biochem. 1990. V. 191. P. 247-252.

59. K. Muramoto, H. Kamiya. Photoaffinity labelling of an acorn barnacle lectin with a photoactivatable fluorescent reagent derivative of D-galactosamine // Dev. Сотр. Immunol. 1992. V. 16. P. 1-8.

60. B. Xia, Z.S. Kawar, T. Ju, R.A. Alvarez, G.P. Sachdev, R.D. Cummings. Versatile fluorescent derivatization of glycans for glycomic analysis // Nat. Meth. 2005. V. 2. P. 845-850.

61. V.I. Dyukova, E.I. Dementieva, D.A. Zubtsov, O.E. Galanina, N.V. Bovin, A.Y. Rubina. Hydrogel glycan micro arrays // Anal Biochem. 2005. V. 347. P. 94-105.

62. M. Schena, D. Shalon, R.W. Davis, D.O. Brown. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complimetary DNA // Science. 1995. V. 270. P. 467-470.

63. D.J. Crowther. Application of micro arrays in pharmaceutical industry // Curr. Oppin. Pharm. 2002. V.2. P. 551-554.

64. H. Zhu, M. Snyder. Protein arrays and microarrays // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. V. 5. P. 40-45.

65. C. Scanlan, D. Calarese, H.K. Lee, O. Blixt, C.H. Wong, LA. Wilson, D. Burton, R. Dwek, P. Rudd. Antibody recognition of a carbohydrate epitope: a template for HIV vaccine design // Adv. Exp. Med. Biol. 2005. V. 564. P. 7-8.

66. J Hirabayshi. Oligosaccharide microarrays for glycomics // Trends Biotech. 2003. V. 21. P. 141-143.

67. W. G. Willats, S.E. Rasmunssen, T. Kristensen, J.D. Mikkelsen, J. P. Knox. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycan // Proteomics. 2002. V. 2. P. 1666-1671.

68. S. Angeloni, J.L. Ridet, N. Kusy, H. Gao, F. Crevoisier, S. Guinchard; S. Kochhar, H. Sigrist, N. Sprenger. Glycoprofiling with micro-arrays of glycoconjugates and lectins // Glycobiology. 2005. V. 15. P. 31-41

69. M.A. Campanero-Rhodes, R.A. Childs, M. Kiso, S. Komba, C. LeNarvor, J. Warren, D. Otto, P.R. Crocker, T. Feizi. Carbohydrate microarrays reveal sulphation as a modulator of siglec binding // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 344. P. 1141-1146.

70. E.W. Adams, D.M. Ratner, H.R. Bokesch, J.B. McMahon, B.R. O'Keefe, P.H. Seeberger. Oligosaccharide and glycoprotein micro arrays as tools in HIV glycobiology; glycan-dependent gpl20/protein interactions // Chem. Biol. 2004. V. 11. P. 875-81.

71. O.E. Galanina, М. Mecklenburg, N.E. Nifant'ev, G.V. Pazynina, N.V. Bovin. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate-binding proteins // Lab Chip. 2003. V. 3. P. 260-265.

72. Y. Ebe, A. Kuno, N. Uchiyama, S. Koseki-Kuno, M. Yamada, T. Sato, H. Narimatsu, J. Hirabayashi. Application of lectin microarray to crude samples: differential glycan profiling of Iecmutants. //J. Biochem. 2006. V. 139. P. 323-327.

73. Y. Huang, Y. Mechref, М. V. Novotny. Microscale поп reductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis // Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 6063-6069.

74. L.M. Likhosherstov, O.S. Novikova, V.A. Derevitskaya, N.K. Kochetkov. An improved procedure for the synthesis of jV-bromoacetyl-/3-glycopyranosylamines, derivatives of mono- and disaccharides // Carbohydr. Res. 1986. V. 146. P. 1-5.

75. A.B. Tuzikov, A.S. Gambaryan, L.R. Juneja, N.V. Bovin. Conversion of sialooligosacharides into polymeric conjugates and their anti-influenza virus inhibitory potency // J. Carbohydr. Chem. 2000. V. 19. P. 1191-1200.

76. S. Hase. Conversion of pyridylamino sugar chains to 1-amino-l-deoxy derivatives, intermediates for tagging with fluorescein and biotin // J. Biochem. 1992. V. 112. P. 266-268.

77. JI.A. Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981.288 с.

78. V. Barsky, A. Perov, S. Tokalov, A. Chudinov, E. Kreindlin, A. Sharonov, E. Kotova, A. Mirzabekov. Fluorescence data analysis on gel-based biochips // J. Biomol. Screen. 2002. V. 7. P. 247-57.

79. Общая органическая химия. Пер. с англ. А.Я. Черняка. М.: Химия, 1982. Т. 3. С. 268285.

80. D.L. Steer, R.A. Lew, P. Perlmutter, A.I. Smith, M.L. Aguilar. Design and synthesis of inhibitors incorporating beta-amino acids of metalloendopeptidase EC 3.4.24.15 // J. Pept. Sci. 2000. V. 6. P. 470-7.

81. C. Schumann, L. Seyfarth, G. Greiner, L Paegelow, S. Reissmann. Synthesis and biological activities of new side chain and backbone cyclic bradykinin analogues. // J. Pept. Res. 2002. V. 60. P. 128-40.

82. S. Sakakibara, N. Inukai. A new reagent for the p-nitrophenylation of carboxylic acids // Bull. Chem. Soc. Jap. 1964. V. 37. P. 1231.

83. H. Yoshima, A. Matsumoto, T. Mizuochi, T. Kawasaki, A. Kobata. Comparative study of the carbohydrate moieties of rat and human plasma alpha-1-acid glycoproteins // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 8476-84.

84. T. Kremmer, E. Szollosi, M. Boldizsar, B. Vincze, K. Ludanyi, T. Imre, G. Schlosser, K. Vekey. Liquid chromatographic and mass spectrometric analysis of human serum acid alpha-1-glycoprotein // Biomed. Chromatogr. 2004. V. 18. P. 323-329.

85. M.V. Croce, КС. Salice, E. Lacunza, A. Segal-Eiras. Alpha-1-acid glycoprotein (AGP): a possible carrier of sialyllewis X (sLewis X) antigen in colorectal carcinoma // Histol Histopathol. 2005. V. 20 V. 91-97.

86. S.D. Shiyan, N.V. Bovin. Carbohydrate composition and immunomodulatory activity of different glycoforms of alpha-l-acid glycoprotein // Glycoconj. J. 1997. V. 14. P. 631-638.

87. S. Takasaki, T. Mizuochi, A. Kobata. Hydrazinolysis of asparagine-linked sugar chains to produce free oligosaccharides // Meth. Enzymol. 1982. V. 83. P. 263-268.

88. N. Takahashi, I. Ishii, H. Ishihara, M. Mori, S. Tejima, R. Jefferis, S. Endo, Y. Arata. Comparative structural study of the N-linked oligosaccharides of human normal and pathological immunoglobulin G // Biochem. 1987. V. 26. P. 1137-44.

89. A. Kobata. Function and pathology of the sugar chains of human immunoglobulin G. Glycobiology. 1990. V.l.P. 5-8.

90. N. Takahashi, N. Takahashi, T. Muramatsu. Handbook of Endoglycosidases and Glycoamidases. CRC Press. Boca Raton, 1992. P. 183.

91. A.L. Tarentino, C.M. Gomez, Т.Н. Plummer. Deglycosylation of asparagine-linked glycans by peptide:N-glycosidase F. // Biochem. 1985. V. 24. P. 4665-71.

92. С. Takahashi, S, Nakakita, S. Ease. Conversion of pyridylamino sugar chains to corresponding reducing sugar chains // J. Biochem. 2003. V. 134. P. 51-55.

93. V. Mevellec, A. Roucoux. Nanoheterogeneous catalytic hydrogenation of N-, 0- or S-heteroaromatic compounds by re-usable aqueous colloidal suspensions of rhodium(O) // Inorg. Chim. Acta. 2005. V. 357. P. 3099-3103.

94. O.E. Галанила, EM. Дерюгина, MM. Лапенков, A.E. Носырев, Е.Ю. Корчагина, T.B. Землянухина, Н.В. Бовин. Специфичность эпитопа гемагглютинируюгцих моноклональных анти-В антител // Биоорг. Химия. 1991. Т. 17. С. 181-189.

95. P. Esser. Principles in adsorption to polystyrene //Nunc Bulletin. 1997. V. 6. P. 1-5.