Формирование изотопного состава водородсодержащих фрагментов этанола в реакциях химического и биохимического синтеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

КУЛАГИНА Наталья Владимировна

''¡им

ФОРМИРОВАНИЕ ИЗОТОПНОГО СОСТАВА ВОДОРОДСОДЕРЖАЩИХ ФРАГМЕНТОВ ЭТАНОЛА В РЕАКЦИЯХ ХИМИЧЕСКОГО И БИОХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

02.00.03. - органическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Иркутск

2004

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Иркутского государственного университета

Научный руководитель:

доктор химических наук Сахабутдинов А. Г.

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Калабин Г. А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Медведева С.А.

кандидат химических наук, вед. науч. сотр. Гаврилов Ю. Д.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «15» декабря 2004 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 212.074.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата химических наук при Иркутском государственным университете по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 126, химический факультет ИГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИГУ.

Отзывы на автореферат высылать по адресу: 664003, г. Иркутск-3, ул. К. Маркса 1, учёному секретарю диссертационного совета Эдельштейн О.А.

Автореферат разослан «15» ноября 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

QQjUjUII^^.

Эдельштейн О. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Природное распределение дейтерия в водородсодержащих фрагментах органических соединений существенно отличается от статистически ожидаемого и является достаточно характеристичным, чтобы судить о происхождении молекулы. Это нашло широкое применение в решении вопросов подлинности продукции в самых различных отраслях химии. Однако, сведения о механизме формирования изотопомерного состава органических молекул практически отсутствуют. Знание количественных закономерностей, управляющих процессом распределения природной метки позволит не только развивать теоретические представления о химических реакциях, но и совершенствовать методы аутентификации и дифференциации биохимической продукции.

В настоящее время к решению данной проблемы существует два подхода. В работах с естественным обогащением образцов констатируется факт нестатистического распределения минорного изотопа в молекуле органического вещества. Однако, в этих условиях субстрат и реагент имеют соизмеримое по величине изотопное обогащение, что существенно затрудняет оценку их роли в формировании изотопного состава продукта реакции. С другой стороны, попытки изучить механизм этих реакций с использованием изотопномеченых продуктов дают результаты, применение которых к интерпретации природного распределения затруднено вследствие проявления изотопных эффектов.

Перечисленные выше обстоятельства позволили сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Целью диссертационной работы являлось:

- разработка количественной методики измерений природного содержания дейтерия в органических веществах, водных и водно-органических растворах методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Установление возможностей и ограничений методики в дифференциации органических молекул различного происхождения на примере этанола;

изучение методом меченых атомов (2Н, 13С), механизма формирования природного водородного профиля молекулы этанола в модельных реакциях получения его синтетических и природных аналогов -сернокислотной гидратации этилена и ферментативного сбраживания глюкозы;

разработка подхода к интерпретации изотопного состава молекул, учитывающего различную степень обогащения образцов, и установление на его базе количественных соотношений между дейтеросодержанием субстратов, реагентов и продуктов реакции.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке НТП Министерства образования РФ «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» на 2003-2004 г. г. (гранты № 203.05.07.040 и 204.01.02.014) и в рамках программы «Университеты России».

Научная новизна и практическая значимость.

Разработана методика количественного определения содержания дейтерия в молекулах органических веществ методом спектроскопии ЯМР2Н. Применение методики позволяет проводить идентификацию этанолов различных технологий получения в компаундах широкого диапазона концентраций. Представлены количественные критерии дифференциации пищевых и синтетических этанолов, алгоритм идентификации вин с использованием компонентного и изотопного анализов.

Изучен механизм формирования водородного изотопного профиля этанола, полученного в реакции ферментативного сбраживания обычной и [1-13С]-меченой глюкозы в тяжелой воде. Установлен вклад структурных фрагментов глюкозы в изотопный состав продуктов биоконверсии - этанола и глицерина.

Впервые показано, что распределение дейтерия в молекуле этанола определяется изотопомерным составом воды, в которой проводилась ферментация углевода. Установлено, что НОН и HOD изотопомеры участвуют в формировании изотопного состава метильной и метиленовой групп спирта с определенным изотопным вкладом.

Предложены соотношения, позволяющие прогнозировать изотопный состав этанола, основываясь на знаниях о фрагментном распределении дейтерия в молекуле углевода и его содержанием в воде, как в экспериментах с изотопной меткой, так и на уровне природного обогащения среды. Это открывает путь решения обратной задачи - установление изотопных характеристик исходных веществ на основании изотопных данных для продуктов реакции.

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации докладывались на II научно-практической конференции «Идентификация качества и безопасности алкогольной продукции» (Пущино, 2000); V Всероссийской научно-практической конференции «Метрологическое обеспечение сертификационных испытаний пищевой продукции» (Екатеринбург, 2001); I научно-практической конференции ГТЛ «Экспертно-исследовательская деятельность в таможенных целях» (Москва, 2001); Всероссийских научных чтениях (Улан-Удэ, 2002); VI Международном семинаре по магнитному резонансу (Ростов-на-Дону, 2002); EuroConference «Modem Analytical Methods for Food and Beverage Authentification» (Lednice, Czech Republic, 2002); научно-технической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 11 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и содержит 28 таблиц, 14 рисунков, 4 схемы. Список литературы включает 124 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен вопросам формирования природного изотопного состава органических молекул. Представлены особенности изотопных методов анализа при работе с природной изотопной меткой. Подробно рассмотрен механизм ферментативного сбраживания глюкозы с точки зрения процессов водородного обмена, формирующих изотопный состав молекулы этанола. На примере водно-этанольных композиций обсуждается информативность изотопных характеристик для их идентификации. Показано, что совокупность экспериментальных фактов не удается объяснить с единой позиции.

ГЛАВА II. Количественные аспекты спектроскопии ЯМР 2Н в анализе изотопного состава органических веществ, водных и водно-органических растворов

2.1 Методика количественного определения содержания дейтерия

Разработана методика количественного определения содержания дейтерия в водородсодержащих структурных фрагментах молекул жидких или растворенных индивидуальных веществ и их смесей методом спектроскопии ЯМР 2Н в сильных магнитных полях (>6Т) без использования стабилизации резонансного условия (отношение частота/поле).

Проведена оценка метрологических характеристик методики: в условиях природного обогащения образцов изотопом 2Н (диапазон концентраций 40-200 ррт) относительная погрешность измерений содержания дейтерия не превышает 2 %. В условиях искусственного обогащения погрешность ниже.

Область применения методики - измерение природного фракционирования водорода в органических молекулах, изучение механизмов химических реакций, доказательство или опровержение аутентичности веществ по дифференциальному и интегральному содержанию в них изотопов водорода, мониторинг технологических процессов переработки природного сырья, определение сырьевого и географического происхождения индивидуальных веществ.

Методика аттестована Госстандартом РФ (№ 105-05-99), код МВИ ФР.1.31.1999.00073.

2.2 Содержание изотопа 2Н, как маркер сырьевой природы этанола

Разработанная методика применена для изотопного анализа этанолов различного генезиса (спектрометр ЯМР VXR 500S с рабочей частотой для ядер 2Н 76.7 МГц и термостатированным датчиком для ампул диаметром 10 мм).

Установлено, что в процессе перегонки виноматериалов происходит значительное изменение изотопного состава водорода этильного фрагмента отогнанного спирта. Диапазон вариаций дейтерия во фракциях достигает 12ррт для СНз и 6 ррт для СН2 групп, что в несколько раз превышает

погрешность измерении, т.е. неполная дистилляция этанола может вносить основную ошибку в результаты анализа. Реализована возможность регистрации спектров ЯМР 2Н водно-спиртовых смесеИ (>30% об. этанола) без предварительной дистилляции этанола в отсутствии стабилизации резонансного условия частота / поле.

Проведен анализ представительной серии (более 200 образцов) пищевых, синтетических и гидролизных этанолов (ПЭ, СЭ и ГЭ) и установлен диапазон вариаций природного содержания дейтерия в метильной и метиленовой группах (рис. 1).

си»

CHj

140-

сн3

130-

100-

-НИ

сн2

но

150

Рис. 1. Фрагментное распределение дейтерия в ПЭ, СЭ, ГЭ

Рис. 2. Фрагментное распределение 2Н в ПЭ из зерна и СЭ

Исключение ПЭ из нетипичного для России сырья (кукуруза, сахарный тростник, ячмень) сформировало «нейтральную зону», разделяющую область ПЭ и СЭ (рис.2). Каждая охарактеризована предельными значениями содержаний 2Н:

СЭ: D/H СНз-группы >120 ррш; D/H СН2-группы > 140 ррш.

ПЭ из зерна: D/H СН3-группы <110 ррш; D/H СБЬ-группы <135 ррш.

На модельных смесях ПЭ и СЭ, показано, что при концентрации компонентов в смеси не менее 20 % погрешность определения содержания этанолов различного сырьевого происхождения не превышает 4.5 %.

С учетом граничных значений областей зерновых ПЭ и СЭ возможно решение обратной задачи - установление сырьевого происхождения этанола по изотопным параметрам образца:

1. Этанол, изотопный состав которого соответствует «нейтральной зоне» (110-И20 ррш для СНз и 135-440 ррш для СН2 групп), является продуктом компаундирования ПЭ и СЭ. Зная фрагментное распределение 2Н для одного из компонентов, можно оценить соотношение ПЭ и СЭ в смеси.

2. Этанол с минимальными значениями (D/H) по обеим, или хотя бы по одной из координат (<130 ррш для СНг и/или <105 ррш для СНз группы)

практически всегда является ПЭ, с максимальными (>145 ррт для СН2 и/или >125ррт для СНз группы) - СЭ.

3. Этанол с изотопными параметрами выделенных областей соответствует ПЭ (СЭ), но не исключает примесь СЭ (ПЭ) в количестве, определяемом изотопным составом последней.

Показано, что в силу особенностей изотопного состава ГЭ проблему его идентификации целесообразно решать как независимую, используя совокупность методов ЯМР 'Н, 2Н, С, масс — спектрометрию изотопных отношений и ХМС.

На основе сочетания количественных методов спектроскопии ЯМР для компонентного и изотопного анализа разработан эффективный алгоритм идентификации водно-органических растворов (рис. 3), возможности которого проиллюстрированы на примере натуральных виноградных вин.

-Соотношение вода/глицерин/этанол/кислоты -Идентификация некоторых минорных компонентов

-Выявления региона произростания винограда -Выявление добавления в вино воды

-Содержание различных фосфороргзнических соединений

-Идентификация отдельных компонентов -Соотношение этанол/глицерин

-Характеристика компонентного состава через структуру водных кластеров -Соотношение вода/этанол

Рис. 3. Экспресс-алгоритм анализа подлинности вин

ГЛАВА III Формирование изотопного состава водородсодержащих фрагментов этанола в биохимических и химических реакциях

Для установления факторов, определяющих формирование природного изотопного профиля молекул этанола различного генезиса, методом меченых атомов (2Н, 13С) изучены механизмы ферментативного сбраживания глюкозы и сернокислотной гидратации этилена, как модельных реакций получения этанола из растительного сырья и промышленного технического спирта, соответственно.

3.1 Реакция спиртового брожения глюкозы

Изучено влияние среды на формирование водородной периферии

'н

1

2Н

3 Р

1 i

13 С

1_

,7о

и

молекулы этанола в процессе биоконверсии глюкозы. Методом количественной спектроскопии ЯМР 2Н и 13С изучено фрагментное распределение дейтерия в спиртах, полученных ферментацией глюкозы в среде с различным содержанием

D2O.

Из редактированных спектров ЯМР сигарой С спинового эха (рис. 4) установлен

изотопомерный состав выделенных спиртов (табл. 1). Показано, что характер распределения do, dj, d2 и d3 5 изотопомеров этанола в зависимости от концентрации тяжелой воды в среде либо имеет соответствующий аналог из распределения изотопомерных форм воды - НОН, HOD и DOD, либо представляет собой их суперпозицию (рис. 5). Таким образом, вода, принимающая участие в межмолекулярном обмене с продуктами биоконверсии глюкозы, должна рассматриваться с точки зрения соотношения ее изотопомер-ных форм, а не концентрации дейтерия в среде в целом.

При биоконверсии глюкозы в присутствии Saccharomyces cerevisiae фермент-субстратный комплекс имеет сложную макромолекулярную структуру. Очевидно, при таком строении обмен между водой внутри комплекса и водной фазой вне его будет существенно ограничен. Таким образом, характер распределения дейтерия в молекуле этанола определяется, прежде всего, изотопомерной формой молекулы воды, вошедшей в такой комплекс.

lit 1) I I) i |М 1) > 1' I II I III 9Р»

Рис.4 Подспектр d0 и d2 изотопомеров метальной группы спирта

Таблица 1. Изотопомерный состав этанола в зависимости от содержания дейтерия в воде

Изотопомер Содержание дейтерия в воде, %

100 75 50 25 10 5

СНз-СН2-ОН 1.3 8.5 29.3 58.5 83.6 91.6

CH3-CHD-OH 7.7 21.9 ЗОЛ 23.7 10.4 5.8

chrcd2-oh 11.5 12.8 7.7 2.4 0.4 -

ch2d-ch2-oh 2.6 8.2 11.6 9.3 4.9 2.6

ch2d-chd-oh 15.6 20.2 12.8 4.0 0.7 -

ch2d-cd2-oh 25.3 13.1 3.8 0.6 - -

chd2-ch2-oh 2.0 3.1 1.9 0.7 - _

chd2-chd-oh 11.1 7.4 2.1 0.5 - -

chd2-cd2-oh 17.7 4.8 0.7 0.2 - -

CD3-chd-oh 2.0 - - - - -

рис. 5 Процентное содержание изотопомерных форм воды (а) и этанола ф-е) в зависимости от содержания D2O в среде.

Обнаружено, что относительное распределение дейтерия между CH2 и группами этанола количественно связано не только с концентрационными изменениями D2O, но достаточно очевидно синхронизируется с изменениями в изотопомерном составе воды.

Изучен вклад структурных фрагментов глюкозы в распределение дейтерия в этаноле. Ферментативное сбраживание 1>-[1-1:!с|- и обычной глюкозы в тяжелой воде позволило независимо оценить вклад С1-С3 и С4-С6 структурных фрагментов глюкозы в формирование водородной оболочки двух молекул спирта и глицерина, образующихся из одной молекулы углевода по

где * обозначен дейтерий, попадающий в продукты биоконверсии вследствие межмолекулярного водородного обмена со средой.

Согласно схеме, формирование изотопного состава метальных групп двух молекул спирта атомы глюкозы протекает в ходе двух стадий:

кето-енольной перегруппировки фосфатных производных гексоз и синтеза пировиноградной кислоты (ПВК) из енол-пировиноградной кислоты (ЕПВК). Поскольку один из фрагментов глюкозы подвергается обоим

превращениям, а второй в обмен со средой вступает только на стадии

синтеза ПВК, то в формировании метильной группы молекулы этанола фрагменты участвуют с различным изотопным вкладом. Эти различия закладываются на стадии кето-енольной перегруппировки гексоз, которая осуществляется как по внутри-, так и межмолекулярному механизму. Последний фактор определяет величину расхождения в обогащении метальных групп, образующихся из различных фрагментов глюкозы.

В табл. 2 представлено фрагментное распределение дейтерия (грамм-атомы) в молекулах этанола, образующихся из обычной и меченой глюкозы.

Таблица 2. Распределение дейтерия в молекулах спирта, формирующихся из различных фрагментов молекулы глюкозы (г.-а.)

Фрагмент <3, а4 ¿5 дейтеро-содержание

СгСв 0.08 0.48 1.14 1.01 0.20 2.91

с 1-е, 0.05 0.40 1.18 1.20 0.26 3.09

С4-С6 0.11 0.56 1.10 0.82 0.14 2.73

СН2 С,-Сб 0.33 1.18 - - - 1.51

С,-С3 0.35 1.17 - - - 1.52

С4-С6 0.31 1.19 - - - 1.50

СНз с,-Се 0.41 0.80 0.19 - - 1.40

СгСз 0.37 0.89 0.32 - - 1.58

СгСв 0.45 0.71 0.06 - - 1.22

Содержание дейтерия в этаноле, полученном биоконверсией обычной глюкозы, отражает усредненный вклад всех изотопомеров d; двух молекул спирта, образующихся в ходе превращений как фрагментов

глюкозы. Следовательно, суммарное содержание изотопа в обеих молекулах этанола составляет 2.91x2 = 5.82 г.-а. Эксперименты с меченой 13С глюкозой отражают изотопный состав этанола, полученного только из фрагмента.

Таким образом, разность этих величин 5.82-3.09 = 2.73 г.-а. соответствует дейтеросодержанию спирта, образующегося из фрагмента

Этот же подход был использован для определения дейтеросодсржания метильной и метиленовой групп спирта. Согласно представленным результатам на стадии кето-енольной перегруппировки между ЕПВК и ПВК дейтерирование метильной группы спирта, образующегося из фрагмента глюкозы,

составляет 1.22 г.-а. Следовательно, такое же количество 2Н на этой стадии

-ю-

попадает в метальную группу второй молекулы спирта. Тогда, в ходе кето-енольной перегруппировки между фосфатами глюкозы и фруктозы в метальную группу этанола (СьС3 фрагмент) из воды переходит 1.58-1.22=0.36 г.-а. дейтерия.

Показано, что изотопный состав спиртов, выделенных после ферментации различных углеводов - глюкозы и фруктозы в условиях одинакового обогащения среды, практически совпадает. Следовательно, фруктоза участвует в тех же обменных процессах, что и молекула глюкозы, накапливая при С\ атоме равное количество дейтерия. Принимая во внимание, что перегруппировка между ними протекает по двум механизмам - внутри- и межмолекулярному, очевидно, что равновесие между гексозами с привлечением механизма внутримолекулярного переноса протона устанавливается значительно быстрее, чем межмолекулярное перемещение, сопровождающееся обменом протона со средой.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при биоконверсии глюкозы из шести атомов водорода метальных групп двух молекул этанола по меньшей мере 2.80 г.-а. имеют водное происхождение.

Изотопомерный состав глицерина рассчитывался из спектра ЯМР 13 С метиленовой группы молекулы, из которого также можно оценить изотопное окружение для соседней метиновой группы молекулы. Состав второго метиленового фрагмента глицерина не определён и обозначен как Я. В табл. 3 представлены результаты ЯМР 13С спектрального анализа глицерина, полученного ферментацией обычной (а) и О-[1-13С]-глюкозы (Ь) в тяжелой воде.

Таблица 3. Изотопомерный состав глицерина, полученного ферментацией обычной и меченой глюкозы в тяжелой воде

Изотопомеры глицерина

Я о СН2- сн2— СУЮ- сно-1 СРз-

2 р сн— со— сн— 1 СН- со—

я- я- я- к- я— к-

а 19.2 45.7 9.5 20.4 2.2 3.0

Ь 12.8 29.7 10.8 17.3 11.0 18.5

При регистрации спектров меченого [ 1 -13С]-глицерина установлен изотопомерный состав только СрСг углеродного фрагмента. Для обычного глицерина он представляет собой суперпозицию всех -СН2-СН< фрагментов, (в табл. 3 представлен их усредненный изотопомерный состав). По результатам таблицы рассчитано фрагментное распределение дейтерия в молекуле глицерина:

0-[1-13С]-глюкоза: с!сн2=0.40 г.-а.; с!сн=0.69г.-а.

Б-глюкоза: ёсн2=0.87 г.-а.; с1сн=0.66г.-а.

- и -

согласно которому дейтеросодержание при Q атоме глицерина составляет 0.40 г.-а. (эксперимент с меченой глюкозой). Эта величина соответствует количеству дейтерия, попадающему в молекулу фруктозы на стадии кето-енольной перегруппировки фосфатов гексоз и хорошо согласуется с результатами, полученными для этанола.

Впервые проведена оценка глубины водородного обмена со средой водородсодержащих фрагментов при углеродных атомах глюкозы на

стадии изомеризационного равновесия между триозами - диоксиацетоном и глицериновым альдегидом. В метиленовых группах глицерина при ферментации обычной глюкозы в тяжелой воде оказывается 0.87 г.-а. дейтерия, из них по (2><0.87-0.4)/2=0.67 г.-а. приходится на группы при углеродных атомах. Таким образом, по меньшей мере, 33 % атомов водорода в этих группах принадлежат водной среде.

Метиновая группа глицерина, изотопный состав которой формируется на стадии восстановления диоксиацетона под действием молекулы НАДН, содержит в среднем 0.68 г.-а. дейтерия. Последняя, не вступая в какие-либо обменные процессы со средой, участвует также в восстановлении ацетальдегида до этанола. Тогда, по аналогии с молекулой глицерина в метиленовую группу спирта поступает на этой стадии 0.68 г.-а. дейтерия. Поскольку суммарное содержание дейтерия в ней составляет 1.51 г.-а. (табл. 2.), остальные 0.83 г.-а. поступают на стадии декарбоксилирования ПВК.

Изучено влияние изотопомерных форм воды на распределение дейтерия в этаноле. В табл. 4 представлен изотопомерный состав этанола и воды, в которой проводилась ферментация. Установлено, что во всем диапазоне концентраций D2O содержание необмененных и дейтерированных форм этанола полностью соответствуют таковому в воде. Для изотопомеров такая согласованность соблюдается только в изотопноразбавленной среде. В концентрированных растворах она нарушается вследствие мультиплетного обмена продуктов биоконверсии со средой с образованием полидейтерированных молекул спирта. Представленная взаимосвязь распределения изотопомеров этанола и воды согласуется с предположением об

55

изолированности молекул воды внутри субстрат-ферментного комплекса от внешней фазы. Полученные результаты свидетельствуют также о том, что внедрение молекул воды в такой комплекс происходит без заметной изотопной дискриминации.

15-------------. . ---»

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Установлено, что при низ-

Рис. 6 Зависимость выхода спирта от концентрации тяжелой воды в среде

ких степенях превращения глюкозы (5 суток после начала ферментации) выход этилового спирта уменьшается с увеличением содержания дейтерия в воде (рис.6).

Таблица 4

Изотопомерный состав воды и этанола при ферментации глюкозы в среде с различным содержанием В2<Э

Со2о, % Вода, %а Этанол, % Её,ь, %

¿0 ¿1 ¿2 ¿0 <11 И« н2о Е ЮН

СНз-СНО СНгЭ-СНг £ СНз-СЭг сногСн2 сн2о-стго 2

5 91.0 8.8 0.2 91.6 5.7 2.6 8.3 - - - - - 9.0 8.3

10 82.3 16.9 0.9 83.6 10.4 4.9 15.3 0.4 - 0.7 1.1 - 17.8 16.3

25 59.0 35.7 5.4 58.5 23.7 9.3 33.0 2.4 0.7 4.0 7.1 1.3 41.1 41.4

50 28.7 49.7 21.5 29.3 30.1 11.6 41.7 7.7 1.9 12.8 22.4 6.6 71.2 70.7

75 9.2 42.2 48.9 8.5 21.9 8.2 ЗОЛ 12.8 3.1 20.2 36.1 25.3 90.8 91.5

100 0.5 13.2 86.3 1.3 7.7 2.6 10.3 11.5 2.0 15.6 29.1 59.3 99.5 98.7

а с учетом эффективной концентрации 020;ь суммарное содержание дейтерированных молекул

Очевидно, это связано с проявлением изотопных эффектов на промежуточных стадиях превращения углевода внутри комплекса. В итоге, если суммарный изотопный состав образующегося спирта отражает состав водной среды, то распределение изотопа между метальной и метиленовой группами определяется величиной изотопных эффектов, сопровождающих их синтез на промежуточных стадиях биоконверсии.

Представленные результаты позволяют предположить, что количество дейтерия, переходящего в результате обменных процессов в молекулу этанола, будет определяться независимым вкладом каждой изотопомерной формы воды, вошедшей в фермент-субстратный комплекс:

D, = Mi/100+ М2/ЮО (1)

где D, - количество дейтерия в водородсодержащем фрагменте молекулы, грамм-атомы;

d1( d2 - содержание HOD и DOD изотопомеров воды, %, соответственно; ки к2 - коэффициенты, отражающие вклад молекул воды данного изотопомерного строения в дейтеросодержание этанола.

Определение коэффициента к\ проводилось на основании результатов, полученных в экспериментах по биоконверсии глюкозы в условиях природного обогащения водной среды, когда дейтерированные молекулы воды представлены исключительно изотопомером. Роль воды в процессе формирования водородной оболочки молекулы спирта в этом случае оценивалась по следующему алгоритму (табл. 5).

Таблица 5. Алгоритм расчета вклада изотопомеров воды в формирование водородной периферии молекулы спирта

dH2o den, dcH2 AdH2o AdcH3 AdcHz AdcH3/AdH,o AdcH2/AdH2o

300.0 331.2 250.6 - - - - -

779.8 455.1 609.6 479.8 123.9 359.0 0.26 0.75

1952.8 776.7 1495.8 1652.8 445.5 1245.2 0.27 0.75

3957.0 1302.0 2972.0 3657.0 970.8 2721.4 0.26 0.74

* d, - количество дейтерия в водородсодержащем фрагменте i

В качестве «нулевой точки» был принят изотопный состав этанола, выделенного из среды с естественным обогащением (300 ррт). Постепенное обогащение воды дейтерием позволяет проследить ее вклад в формирование изотопного состава метальной и метиленовой групп этанола. Разностные значения дейтеросодержания (д) для «контрольного» и рассматриваемого этанола определяют количество дейтерия, сформированное за счет разности обогащения водной среды сравниваемых экспериментов. Нормируя полученные значения на величину Д ёИ2о, установлено, что вклад среды, а именно изотопомера воды, в формирование водородной оболочки обоих фрагментов спирта постоянен и определяется коэффициентами 0.26 и 0.75 для метальной и метиленовой групп, соответственно.

-и-

Содержание дейтерия в метильной и метиленовой группах этанола, полученного ферментацией глюкозы в тяжелой воде, составляет 1.21 и 1.52г.-а., соответственно (рассчитано по результатам табл. 1). С учетом изотопного разбавления среды за счет обмена с атомами водорода гидроксильных групп глюкозы изотопомерный состав воды включает формы в количестве 13.2

и 86.3 %, соответственно (табл. 4). Тогда, уравнение 1 может быть представлено следующим образом:

дляСНз группы 1.21 =0.26-13.2/100 + £'2-86.3/100 для СН2 группы 1.52 = 0.75-13.2/100 + £"2-86.3/100

Решение уравнений относительно коэффициентов позволяет установить их значения для метильной и метиленовой групп этанола - 1.36 и 1.65, соответственно. Следовательно, уравнение зависимости количества дейтерия, переходящего в молекулу этанола, от концентрации изотопа в среде принимает следующий вид:

для СНз группы Осн3 = 0.26-<3,/100 + 1.36-с12/100 (2) для СН2 группы Бен, = 0.75-с1,/100 + 1.65-<УЮ0 (3)

Апробация уравнений на спиртах, полученных биоконверсией глюкозы в среде с различным содержанием D2O, показывает что изотопный состав и метильной, и метиленовой групп этанола удовлетворительно воспроизводится на основании предложенных уравнений (табл. 6).

Таблица 6. Вклад изотопомеров воды в формирование метиленовой и метильной групп спирта

СргО, % изотопоме оы воды, % Бен,, г.-а. Бен,, г.-а.

а, ¿2 у-ние (2) ЯМР "с у-ние (3) ЯМР "С

5 8.8 0.21 0.07 0.06 0.03 0.03

10 16.9 0.86 0.14 0.12 0.06 0.06

25 35.6 5.4 0.36 0.35 0.17 0.17

50 49.7 21.5 0.73 0.69 0.42 0.38

75 42.2 48.6 1.12 1.11 0.77 0.72

Согласно представленным уравнениям при проведении ферментации в 100%-ной D2O, количество дейтерия в водородсодержащих фрагментах спирта соответствует величине А2. В таком случае обогащение метиленовой группы этанола должно составлять 1.65 г.-а. Экспериментально установлено, что содержание дейтерия в метиленовой группе составляет 1.51 г.-а. Однако, вследствие обмена воды с атомами водорода гидроксильных групп глюкозы происходит изотопное разбавление среды до концентрации 93%. Следовательно, в пересчете на 100% D2O количество дейтерия в метиленовой группе спирта составит 1.62 г.-а. Это означает, что величина представленных коэффициентов имеет механистическое обоснование.

При проведении ферментации в условиях природного обогащения субстрата и среды, необходимо учитывать вклад атомов водорода самой молекулы глюкозы в изотопный состав этанола. В связи с этим предпринята попытка оценить коэффициенты чувствительности водородсодержащих фрагментов спирта к изотопному составу исходного углевода.

В табл. 7 в соответствии с предложенным ранее алгоритмом расчета, проведена оценка вклада структурных фрагментов глюкозы в изотопный состав молекулы этанола.

Таблица 7. Распределение дейтерия в этаноле в зависимости от положения метки в молекуле глюкозы

глюкоза этанол к

Положение метки Дгл, ррт СНз ДСНз ДСНУДгл

- природное обогащение 331.2 - _ -

с, 585 562.8 231.6 0.40 0.80

С2 341 420.6 89.4 0.26 0.52

Сб 752 637.0 305.8 0.41 0.82

* количество дейтерия в С| фрагменте глюкозы за вычетом естественного обогащения

Чтобы исключить вклад естественного содержания дейтерия молекулы глюкозы в изотопный состав молекулы спирта, также в качестве «нулевой точки» был принят этанол, полученный ферментацией немеченой глюкозы. Селективное обогащение дейтерием отдельных положений исходной глюкозы позволяет оценить их вклад в формирование изотопного состава этанола. Разностные значения дейтеросодержания для исходного и обогащенного таким образом этанола определяют количество дейтерия, формирующего метальную группу спирта за счет изотопного обогащения дейтерием С, фрагмента глюкозы. Нормируя полученные значения на величину изотопной метки углевода установлено, что вклад фрагментов глюкозы в

изотопный состав метальной группы характеризуется коэффициентами 0.40, 0.26 и 0.41, соответственно. Принимая во внимание, что метка передается лишь одной из двух образующихся молекул спирта фрагменты

глюкозы), что приводит к ее разбавлению, представленные коэффициенты должны быть удвоены (табл. 7). Тогда с учетом вклада изотопного состава глюкозы и водной среды в формирование водородной оболочки метальной группы спирта величина дейтеросодержания последней может быть рассчитана на основании следующего уравнения:

Пен, = 0.8(ШС| + 0.52-Бс2 + 0.82-0(с^с„) + 0.52-Ш2о + Ь (5)

Вклад молекул воды удваивается (0.26 х 2), поскольку представленное уравнение учитывает количество образующихся молекул спирта. Параметр,

дополнительно введенный в уравнение, связан с вкладом атомов дейтерия гидроксильных групп глюкозы в изотопный состав водной среды.

Апробация уравнения на результатах работы с известным фрагментным распределением дейтерия в молекуле глюкозы (табл. 8) свидетельствует о том, что изотопный состав метильной группы спирта удовлетворительно воспроизводится на основании предложенного уравнения.

Таблица 8. Расчет изотопного состава метильной группы этанола

Сахар Глюкоза (Б/Н)ь ррш (0/Н)сн3, ррш

с, с2 с6 С6' эксперимент уравнение (5)

сахарная свекла 123.3 126.1 112.6 111.8 90-94 92.4

виноград 145.3 144.4 135.3 131.4 98-106 102.7

сахарный тростник 1 159.8 137.8 148.0 130.5 108-113 105.6

сахарный тростник 2 165.4 138.7 156.2 141.3 108.5 107.9

кукуруза 173.8 156.7 151.7 142.7 111.1 111.3

ананас 151.5 157.6 134.7 148.5 100-106 106.9

" содержание дейтерия в воде 150 ррш

3.2 Реакция сернокислотной гидратации этилена

Синтетические этанолы характеризуются более высоким содержанием дейтерия по сравнению с этанолами растительного происхождения. Для них также свойственно фракционирование изотопов водорода, отличное от статистически ожидаемого: дейтеросодержание метильной группы этанола в 1.1 - 1.3 раза больше, чем метиленовой. Реакция сернокислотной гидратации этилена использована как модельная для изучения факторов, определяющих природное распределение дейтерия в синтетических спиртах.

В отличие от многостадийного процесса получения этанола ферментативным сбраживанием растительного сырья, при сернокислотной гидратации этилена изотопное строение молекулы спирта формируется в результате одной стадии — присоединения протона к двойной связи, при этом на уровне природного обогащения образцов вероятность одновременного взаимодействия дейтерированных молекул субстрата и реагента близка к нулю.

Для изучения возможности ориентирующего действия дейтерия этилена на направление присоединения протона кислоты проведена сернокислотная гидратация [1,1-2Щ - этилена. Спектр ЯМР Н выделенного спирта свидетельствует о том, что присоединение протона протекает равновероятно по обоим углеродным атомам. Таким образом, в результате реакции дейтерий этилена оказывается полностью распределенным между метильной и метиленовой группами спирта и не оказывает влияние на соотношение их изотопомеров.

Для определения направления миграции дейтерия реагента изучено распределение изотопа в этиловом спирте в зависимости от его содержания в серной кислоте. Дейтерозамещение последней варьировалось от 5 до 100 %.

Результаты количественного ЯМР С анализа выделенных спиртов представлены в табл. 9.

Таблица 9. Влияние концентрации дейтерия кислоты на распределение изотопомеров в этаноле при сернокислотной гидратации этилена

Изотопомер (ьзэол %

100 75 30 15 5

сн3-сн2-он 6.5 33.3 74.6 89.3 98.0

сн2б-сн2-он 85.9 63.6 25.4 10.7 2.0

снз-сно-он 4.0 1.2 - - -

с2н3о2он 3.6 1.9 - - -

аЛчоом^о, 85.9 84.8 84.7 71.3 40.0

* содержание ВгЭО* в кислоте

Показано, что в результате реакции дейтерий практически полностью оказывается в метильной группе этанола. В изотопноразбавленной кислоте изотопомер является единственным продуктом присоединения

дейтерона к двойной связи этилена. В 75 и 100 %-ной Б2804 в этаноле, кроме того, присутствуют изотопомеры СНз-СНО-ОН и СгНзОгОН, однако, их суммарное содержание составляет всего 3.1 и 7.6 %, соответственно. Поскольку уже в 30 %-ной кислоте образование изомерных изотопомеров не обнаружено, то реакция обратной депротонизации не может оказывать существенного влияния на соотношение изотопомеров в условиях природного обогащения.

При проведении гидратации в изотопно-концентрированных кислотах (100, 75 и 30% ОгБО^ степень перехода дейтерия кислоты в изотопомер спирта СНгБ-СНг-ОН практически неизменна и составляет «85%. По мере разбавления выход дейтерированных молекул уменьшается, и в 5 %-ной кислоте составляет всего 40% от дейтерозамещенности кислоты. Очевидно, экстраполирование в сторону большего изотопного разбавления может привести к дальнейшему уменьшению степени дейтерирования молекул спирта относительно концентрации дейтерия в кислоте. Следовательно, в синтетических спиртах, полученных в условиях природного обогащения образцов, нестатистическое распределение изотопа между метильной и метиленовой группами (СН2Б/СНБ=1.1.3) связано, очевидно, с вышеуказанной динамикой.

Таким образом, в условиях природного обогащения изотопное строение молекулы синтетического этанола складывается из двух слагаемых - дейтерия субстрата (этилена) и реагента (кислоты). Полученные результаты показывают, что содержание молекул спирта с атомом дейтерия в метиленовой группе определяется только дейтеросодержанием этилена. В образовании молекул, дейтерированных по метильной группе, участвуют и этилен, и кислота, однако, вклад последней значительно меньше и не соответствует количеству дейтерия, содержащегося в ней. Следовательно, обогащение метиленовой группы может служить критерием для изотопной характеристики исходного соединения, тогда

как использование метильной группы для этих целей требует дополнительных исследований в каждом конкретном случае.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана методика количественного определения содержания дейтерия во фрагментах молекул органических веществ методом спектроскопии ЯМР 2Н в сильных магнитных полях без стабилизации резонансного условия (отношение частота/ поле).

2. Комплексное использование спектров ЯМР на ядрах 'Н, 2Н и |3С с обработкой совокупности количественных параметров позволяет проводить надежные определения как абсолютного содержания изотопов водорода в каждом фрагменте молекулы, так и изотопомерных форм в молекулярной смеси. Эффективность разработанного подхода показана на примерах изучения механизмов органических реакции и идентификации сырьевой природы органических объектов.

3. Методом количественной спектроскопии ЯМР 13С и 2Н изучен изотопомерный состав этанола в зависимости от содержания дейтерия в воде. Впервые показано, что при биоконверсии глюкозы в изотопнообогащенной среде распределение дейтерия в образующемся этаноле определяется изотопомерным составом воды, в которой проводилась ферментация.

4. Методом меченых атомов изучен механизм формирования изотопного профиля этанола и глицерина, полученных ферментативным сбраживанием обычной и [1-13С]- меченой глюкозы в тяжелой воде. Установлен вклад структурных фрагментов глюкозы и роль промежуточных стадий биоконверсии.

5. Впервые предложены уравнения, позволяющие прогнозировать изотопный состав метильной и метиленовой групп спирта, основываясь на знаниях о дейтерозамещеннсти водной среды и водородсодержащих фрагментов глюкозы.

6. На примере сернокислотной гидратации этилена установлено, что для синтетического спирта различия в дейтеросодержании метильной и метиленовой групп определяется количеством изотопа, переходящего из реагента в субстрат.

7. Установлены количественные критерии дифференциации этанолов и водно-этанольных композиций различного сырьевого происхождения методом ЯМР 2Н. Предложен оригинальный алгоритм идентификации водно-органических растворов по их компонентному и изотопному составу из спектров ЯМР.

Публикации по теме диссертации:

1. Калабин ГА, Кушнарев Д.Ф., Кулагина Н.В., Козлов Ю.П., Количественная спектроскопия ЯМР Н. Применение для идентификации алкогольной продукции. // Материалы II научно-практической

конференции «Идентификация качества и безопасности алкогольной продукции». - Пущино, 2000. - С.94.

2. Калабин ГА, Дроздовская Е.В., Козлов Ю.П., Кулагина Н.В., Кушнарев Д.Ф., Рохин А. В. Спектроскопия ЯМР в сертификации пищевой продукции. // Материалы V всероссийской научно-практической конференции «Метрологическое обеспечение сертификационных испытаний пищевой продукции». - Екатеринбург, 2001. - С.26-29.

3. Калабин ГА, Кушнарев Д.Ф., Володина Е.Г., Кулагина Н.В., Козлов Ю.П. Спектроскопия ЯМР Н — новый метод количественного изотопного анализа водных и водно-органических объектов. // Материалы I научно-практической конференции ГТЛ «Экспертно-исследовательская деятельность в таможенных целях». - Москва, 2001. - С.26-29.

4. Рохин А.В., Кушнарев Д.Ф., Кулагина Н.В., Трунов СВ., Сапожников Ю.М., Калабин Г.А. Определение содержания минорных изотопов методом спектроскопии ЯМР в молекулах спиртосодержащих жидкостей. // Материалы I научно-практической конференции ГТЛ ГТК РФ «Экспертно-исследовательская деятельность в таможенных целях». — Москва, 2001.-С.33-34.

5. Рохин А.В., Кушнарев Д.Ф., Сапожников Ю.М, Кулагина Н.В., Калабин Г.А. Определение содержания минорных изотопов методом спектроскопии ЯМР в молекулах спиртосодержащих жидкостей. // Сб. трудов «Проблемы идентификации алкогольсодержащей продукции». Гост - стандарт РФ - Москва, 2001. - С.58-92.

6. Калабин Г.А., Кушнарев Д.Ф., Кулагина Н.В., Рохин А.В., Рыков Р.С. Количественная спектроскопия ЯМР - новый метод идентификации сырьевой, региональной и технологической природы веществ и материалов по содержанию в них стабильных изотопов основных элементов. // Материалы всероссийских научных чтений. - Улан-Удэ, 2002.-С.133-134.

7. Kalabin G.A., Belovezhets K.I., Kozlov Y.P., Rykov R.S., Kushnarev D.F., Rohin A.V., Kulagina N.V., Apostolova I.S. Some Aspects of Applying Quantitative NMR for Russian Customs Laboratory Issues. // Abstracts of EuroConference «Modern Analytical Methods for Food and Beverage Authentication». - Lednice, Czech Republic, 2002. - p.24.

8. Калабин Г.А., Рыков Р.С, Дроздовская Е.В., Козлов Ю.П., Кушнарев Д.Ф., Кулагина Н.В., Рохин А.В. Количественная мультиядерная спектроскопия ЯМР в идентификации сырьевой, региональной и технологической природы технической и пищевой продукции. // Материалы VI Международного семинара по магнитному резонансу. -Ростов-на-Дону, 2002. - С.274-275.

9. Калабин Г.А., Козлов Ю.П., Кулагина Н.В., Кушнарев Д.Ф. Установление регионального соответствия натуральных вин количественными методами ЯМР. // Материалы научно-технической конференции «Технологии живых систем». - Москва, 2003. - С.59-61.

Ю.Калабин ГА, Козлов Ю.П., Кушнарев Д.Ф., Кулагина Н.В., Рохин А.В., Пуляева В.Н., Дроздовская Е.В., Рыков Р.С. Идентификация и контроль качества продуктов биотехнологических процессов методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса. // Материалы научно-прикладной конференции «Химия и химические продукты». - Москва, 2003.-С.166-167.

П.Кулагина Н.В., Сахабутдинов А.Г., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В., Пройдаков А.Г., Калабин Г.А. Механизм природного распределения дейтерия в синтетическом этиловом спирте. // Материалы XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Казань, 2003. -С.477.

12.Калабин Г.А., Кулагина Н.В., Рыков Р.С, Козлов Ю.П., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Идентификация сырьевой природы этанола методом спектроскопии ЯМР 2Н. // Вестник РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2003. - №7. - С.87-99.

13.Калабин Г.А., Козлов Ю.П., Рыков Р.С, Кулагина Н.В., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Новый алгоритм идентификации натуральных вин Грузии методом спектроскопии ЯМР. // Вестник РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2003. - №9. - С.77-82.

Н.Сахабутдинов А.Г., Кулагина Н.В., Кушнарев Д.Ф., Пройдаков А.Г., Калабин Г.А. Механизм распределения дейтерия в этиловых спиртах. // Журнал прикладной химии. - 2003. - Т.76. - Вып.З. - С.520.

15.Кулагина Н.В., Сахабутдинов А.Г., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В., Пройдаков А.Г., Калабин Г.А. Об участии воды в формировании молекулы спирта при биоконверсии глюкозы. // Вестник ИрГТУ. - 2004. -Х2.4-С.150.

»24062

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Спектроскопия ЯМР 2Н в изотопном анализе органических ^ веществ.

1.1 Формирование изотопного состава органических молекул.

1.2 Фрагментное распределение изотопов в молекулах органических веществ.

1.3 Спектроскопия ЯМР на ядрах дейтерия.

1.4 Схема спиртового брожения глюкозы.

1.5 Биоконверсия глюкозы с точки зрения водородного обмена.

1.6 Процесс ферментации в условиях природного обогащения образцов изотопом 2Н.

1.7 Проблема подлинности алкогольной продукции.

ГЛАВА II Количественные аспекты спектроскопии ЯМР 2Н в анализе изотопного состава органических веществ, водных и водно-органических растворов.

2.1 Методика количественного определения содержания дейтерия.

2.2 Содержание изотопа 2Н, как маркер сырьевой природы этанола.

2.2.1 Закономерности изменения содержания дейтерия в структурных фрагментах этилового спирта.

2.2.2 Идентификация сырьевой природы индивидуальных спиртов и их смесей.

ГЛАВА III Формирование изотопного состава этанола в биохимических и химических реакциях.

3.1 Реакция спиртового брожения глюкозы.

3.1.1 Влияние дейтерозамещенности среды на формирование водородной периферии молекулы этанола в процессе биоконверсии глюкозы.

3.1.2 Вклад структурных фрагментов глюкозы в распределение дейтерия в этаноле.

3.1.3 Влияние изотопомерных форм воды на распределение дейтерия в этаноле.

3.2 Реакция сернокислотной гидратации этилена.

ГЛАВА IV ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

Важные для реакций органической химии элементы (водород, углерод, азот, кислород) представлены в природе несколькими стабильными изотопными разновидностями. Содержание минорного изотопа, а это, как правило, более тяжелый изотоп элемента, не превышает 1.1%. Установлено, что его распределение во фрагментах молекул органических веществ существенно отклоняется от статистически ожидаемого [1, 2] и несет специфическую изотопную информацию, отражающую происхождение молекулы (сырьевой, географический, технологический, возрастной и другие факторы).

Наибольших успехов в изучении изотопии органических веществ достигли масс-спектрометрия изотопных отношений и спектроскопия ядерного магнитного резонанса - методы измерения суммарного и селективного содержания изотопа в органической молекуле, соответственно. Однако, большей информативностью обладает именно фрагментная изотопная характеристика молекулы, получаемая из количественных спектров ЯМР.

Сочетание таких факторов, как естественная распространенность, магнитная активность минорных изотопов, возможность количественной оценки их фрагментного распределения, информативность изотопного профиля молекулы обеспечило широкое применение спектроскопии ЯМР в решении вопросов подлинности продукции в самых различных отраслях химической промышленности. Сущность подхода заключается в том, что измеряемый изотопный состав образца сопоставляется с соответствующими величинами из банка данных. Однако, в большинстве случаев, механизм формирования характеристичного изотопного состава молекулы, позволяющего различать органические соединения синтетического и природного происхождения, не рассматривается. Между тем, знание количественных закономерностей, управляющих процессом распределения природной метки позволит не только развивать теоретические представления о химических реакциях, но и совершенствовать методы аутентификации и дифференциации биохимической продукции.

На сегодняшний день состояние этой проблемы рассматривается с двух позиций: с одной стороны в работах с естественным обогащением образцов констатируется факт нестатистического распределения минорного изотопа в молекуле органического вещества; с другой - в работах с изотопной меткой среды или субстрата изучен механизм формирования этой молекулы. В последнем случае проявление изотопных эффектов не позволяет применить знания о механизме реакции к интерпретации природного распределения изотопа. В свою очередь попытки изучить механизм той или иной реакции на природном обогащении реагентов дают неоднозначные результаты вследствие статистически неконтролируемого наложения соизмеримых по величине изотопных составов, принадлежащих разным молекулам.

Цель диссертационной работы включала решение следующих задач:

- разработка количественной методики измерений природного содержания дейтерия в органических веществах, водных и водно-органических растворах методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Установление возможностей и ограничений методики в дифференциации органических молекул различного происхождения на примере этанола;

2 13 изучение методом меченых атомов (Н, С), механизма формирования природного водородного профиля молекулы этанола в модельных реакциях получения его синтетических и природных аналогов -сернокислотной гидратации этилена и ферментативного сбраживания глюкозы;

- разработка подхода к интерпретации изотопного состава молекул, учитывающего различную степень обогащения образцов, и установление на его базе количественных соотношений между дейтеросодержанием субстратов, реагентов и продуктов реакции.

1. Разработана методика количественного определения содержания дейтерия во фрагментах молекул органических веществ методом спектроскопии ЯМР'Н в сильных магнитных полях (> 6Т) без стабилизации резонансного условия (отношение частота / поле).2. Комплексное использование спектров ЯМР на ядрах Н, Н и С с обработкой совокупности количественных параметров позволяет проводить надежные определения как абсолютного содержания изотопов водорода в каждом фрагменте молекулы, так и изотопомерных форм в молекулярной смеси. Эффективность разработанного подхода показана на примерах изучения механизмов органических реакции и идентификации сырьевой природы органических объектов.3. Методом количественной спектроскопии ЯМР '^ С и ^Н изучен изотопомерный состав этанола в зависимости от содержания дейтерия в воде.Впервые показано, что при биоконверсии глюкозы в изотопнообогащенной среде распределение дейтерия в образующемся этаноле определяется изотопомерным составом воды, в которой проводилась ферментация.4. Методом меченых атомов изучен механизм формирования изотопного профиля этанола и глицерина, полученных ферментативным сбраживанием обычной и [1- С]- меченой глюкозы в тяжелой воде.Установлен вклад структурных фрагментов глюкозы и роль промежуточных стадий биоконверсии.5. Впервые предложены уравнения, позволяющие прогнозировать изотопный состав метильной и метиленовой групп спирта, основываясь на знаниях о дейтерозамещенности водной среды и водородсодержащих фрагментов глюкозы.6. На примере сернокислотной гидратации этилена установлено, что дЯя синтетического спирта различия в дейтеросодержании метильной и метиленовои групп определяются количеством изотопа, переходящего из реагента в субстрат.7. Установлены количественные критерии дифференциации этанолов и водно-этанольных композиций различного сырьевого происхождения методом ЯМР ^Н. Предложен оригинальный алгоритм идентификации водно-органических растворов по их компонентному и изотопному составу из спектров ЯМР.

1. Martin G.J., Martin M.L., Mabon F., Michon M.J. 1.entification of the origin of natural alcohols by natural abundance hydrogen-2 nuclear magnetic resonance // Analytical Chemistry. - 1982. - vol.54 (13). - p.2380-23 82.

2. Martin G.J., Martin M.L. Deuterium labeling at the natural abundance level as studied by high field quantitative 2H-NMR. // Tetrahedron Letters. 1981. -vol.22.-p. 3525-3528.

3. Brazier I.L. Forensic Application of Mass Spectrometry. // Boca Raton, FL. CRC Press Inc., 1995. p. 259-289.

4. Danho D., Naulet N., Martin GJ. Deuterium. Carbon and nitrogen isotopic analysis of natural and synthetic caffeines. Authentication of coffees and coffee extracts. // Analusis. 1992. - vol.20 (3). - p. 179-184.

5. Martin G.J. Recent advances in site-specific natural isotope fractionation studied by nuclear magnetic resonance. // Isotopes in Environmental and Health Studies. 1998. - vol.34 (3). - p. 233-243.

6. Hermann A. Determination of D/H isotope ratio in acetic acid from vinegars and pickled products by 2H-NMR-spectroscopy. // Research and Technology. -vol.212 (6).-p. 683-686.

7. Buddrus S., Zhang B.L., Martin G.J. Study of the origin of triglycerides and glycerols from diverse sources by 2H-SNIF-NMR and 13C-IRMS. // Isotopes in Environmental and Health Studies. 1998 - vol.34 (1-2). - p.53.

8. Hermann A. Determination of site specific D/H isotope ratios in glycerol of different origins by NMR-spectroscopy. // Isotopes in Environmental and Health Studies. 1998. - vol.34 (1-2). - p. 227.

9. Martin G., remaud G., Martin G.J. Authentication of natural flavors using SNIF NMR new developments on mustard oil and saffron. // Developments in Food Science. - 1995.-vol. 37A.-p. 355-378.

10. Fronza G., Fuganti C., Guillou C., Renero F., Joulain D. Natural abundance 2H nuclear magnetic resonance study of the origin of raspberry ketone. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998. - vol.46 (1). - p. 248-254.

11. Fuganti C., Fronza G., Joulain D., Breas O., Fauhl C., Guillou C. SNIF NMR and IRMS study of raspberry ketone. // Isotopes in Environmental and Health Studies. - 1998. - vol.34 (1-2). - p. 54.

12. Martin G.J., Janvier P., Mabon F. Deuterium NMR characterization of anetholes. Factorial analysis of specific isotope ratios. // Analusis. 1985.-vol.13 (6). - p.267-274.

13. Martin G.J., Martin M.L., Mabon F., Michon M.J. Natural selective deuterium labeling; labeling without enrichment. // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 1982. - vol.11. - p.616-617

14. Hays P., Remaud G.S., Jamin E., Martin Y.L. Geographic origin determination of heroin and cocain using site specific isotopic ratio deuterium NMR. // J. Forensic Sci. - 2000. - vol.45 (3). - p. 552-562.

15. Masud Z., Vallet C., Martin G.J. Stable Isotope Characterization of Milk Components and Whey Ethanol. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1999. - vol.47. - p.404-421.

16. Zhang B.L., Vallet C., Blanchard F., Martin G.J. Characterization of galactose from carrageenans by natural abundance site srecific isotope parameters. // Photochemical Analysis. - 1994. - vol.5 (6). - p. 291-296.

17. Deiana M., Corongiu F.P., Dessi M.A., Scano P., Casu M., Lai A. NMR determination of site specific deuterium distribution (SNIF - NMR) in squalen from different sources. // Magnetic Resonance in Chemistry. - 2001. - vol.39 (l).-p. 29-32.

18. Lajtha K., Michener R.H. Stable isotopes in ecology and environmental science. London etc.: Blackwell sci. Pbul., 1994. 316p.23.0'Leary M.N. // Phytochem. 1981. - vol.20. - p.553-567.

19. Zhang B.L., Quemerais B., Martin M.L., Martin G.J., Williams J.M. Determination of the natural deuterium distribution in glucose from plants having different photosynthetic pathways. // Phytochemical Analysis. 1994. -vol.5 (3). - p.105-110.

20. Martin G.J., Martin M.L., Zhang B.L. Site-specific natural isotope fractionation of hydrogen in plant products studied by nuclear magnetic resonance. // Plant, Cell and Environment. 1992. - vol.15 (9). - p. 1037-1050.

21. Zhang B.L., Billault I., Li X., Mabon F. Hydrogen Isotopic Profile in the Characterization of sugars. Influence of the Metabolic Pathway. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002. - vol.50 (6). - p.1574-1580.

22. Schleucher J. Intramolecular deuterium distributions link biochemistry, physiology and climate research. // Isotopes in Environmental and Health Studies. 1999. - vol.35 (4). - p.281-282.

23. Dansgaard W. // Geochem. Cosmohim. Acta. 1954. - vol.6. - p.241.

24. Никаноров A.M., Федоров Ю.А. Стабильные изотопы в гидрохимии. // JL: Гидрометеоиздат. 1988. - 435с.

25. Shwarz G., Kowski P., Kaneto S., Gernandt H. Meridional distribution of deuterium in atmospheric water vapor between tropical and southern polar latitudes. // Met. Natl. Inst. Polar. Res. Spec. Issue. 1998. - vol.52. - p. 102110.

26. Martin G.J., GuillouC., Martin M.L., Cabanis M. Natural factors of isotope fractionation and the characterization of wines. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1988. - vol.36 (2). - p. 316-322.

27. Reniero F., Versini G., Simoni M., Ziller L. Characterization of grappas regional scale by stable isotope indicators. // Rivista di Sciienza dell' Alimentazione. 1995. - vol.24 (3). - p. 407-415.

28. Jamin E., Naulet N.,Martin G.J. Multi-element and multi-site isotopic analysis of nicotine from tobacco leaves. // Plant, Cell and Environment. 1997. - vol.20 (15).-p.589-599.

29. Weber D., Kexel H., Schidt H. L. 13C-Pattern of Natural Glycerol: Origin and Practical Importance. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. — 1997. -vol.45 p. 2042-2046.

30. Hanneguelle S., Thibault J. N., Naulet N., Martin G. J. Authentification of essential oils containing Iinalool and linalyl acetate by isotopic method. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1992. - vol.40 (1) - p.81-7.

31. Williams M., Jegou H., Langlois V., Zhang B.L., Martin M.L. The search for D-glucose derivatives suitable for the study of natural hydrogen isotope fractionation. // Carbohydrate Research. 1993. - vol.245 (1). - p.57-64.

32. Martin G.J., Zhang B.L., Naulet N., Martin M.L. Deuterium Transfer in the Bioconversion of Glucose to the Natural Abundance Level. // Journal of the American Chemical Society. 1986. - vol.108, -p.5116-5122.

33. Martin M.L., Martin G.J., Guillou C. A site-specific and multielement isotopic approach to origin interference of sugars in food and beverages. // Mikrochimica Acta. 1991. - vol.2 (1-6). - p.81-91.

34. Zhang B.L., Emeriau L., Martin G.J. Comparison of the isotopic characteristics of legume constituents characterization of lentils. // Sciences des Aliments. -1991.-vol.11 (2).-p.291-304.

35. Zhang B.L., Buddrus S., Martin M.L. Site-Specific Hydrogen Isotope Fractionation in the Biosynthesis of Glicerol. // Bioorganic Chemistry. 2000. -vol.28.-p.1-15.

36. Quemerais B., Mabon F., Naulet N., Martin G.J. Site-specific isotope fractionation of hydrogen in the biosynthesis of plant fatty acids. // Plant, Cell and Environment. 1995. - vol.18 (9). - p.989-98.

37. Zhang B.L., Yunianta, Martin M.L. Site-specific Isotope Fractionation in the Characterization of Biochemical Mechanisms // Journal of Biological Chemistry. 1995. - vol.270 (27). - p. 16023-16029.

38. Pascal R.A., Baum M.W., Wagner C.K., Rodgers L.R. Measurement of Deuterium Kinetic Isotope Effects in Organic Reactions by Natural-Abundance Deuterium NMR Spectroscopy // Journal of the American Chemical Society. -1984.-vol.106.-p.5377-5378.

39. Leopold M.F., Epstein W.W., Grant D.M. Natural Abundance Deuterium NMR as a Novel Probe of Monoterpene Biosynthesis: Limonene. // Journal of the American Chemical Society. 1988. - vol.110-p.616-617.

40. Kang G., Zhang B.L., Gao Z. Measurement of primary kinetic deuterium isotope effect of the reaction of enamine formation using natural abundance deuterium NMR. // Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebaao. 1987. - vol.8(5). -p.444-446.

41. Zhang B.L. Application of natural abundance deuteron NMR. Simultaneous measurement of primary and secondary kinetic isotope effects. // Magnetic Resonance in Chemistry. 1988. - vol.26(l 1). - p.955-959.

42. Li G. Measurement of kinetic deuterium isotope effect by natural abundance deuterium NMR. // Huaxue Tongbao. 1988. - vol.8. - p.25-30.

43. Juchelka D., Hilker A.W., Schluter H.J. Irm-GC/MS: new applications through on-line 2H/1H and 180/160 analysis. // Isotopes in Environmental and Health Studies. 1999. - vol.35 (4). - p. 272-273.

44. Midwood A.J. Recent developments in the analysis of light isotopes by continuous flow isotope ratio mass spectrometry. // Analytical Communications. 1999. - vol.36 (8). - p.291-294.66.0'Leary M.H. //Bioscience. 1998. - vol.38. - p.328-336.t

45. Brenna J.T., Tobias H.J., Corso T.N. High-precision deuterium and 13C measurement by continuous flow-IRMS: organic and position-specific isotope anallysis. // Stably Isotope Simposium. Cornell University, USA, July, 1996. — p. 1-12.

46. Mantsch H.H., Saito H., Smith C.P. Deuterium magnetic resonance, applications in chemistry, physics and biology. // Progress in NMR Spectroscopy. 1977. - vol.11. - p.211-271.

47. Martin G.J. Quantitative isotopic NMR of quadrupolar and dipolar nuclei. // GIT Labor-Fachzeitschrift. 1998. - vol.42 (5). - p.494-498.

48. Филипович Ю.Б. Основы биохимиию M.: "Высшая школа". - 1993. -C.329-350.

49. Неницеску К.Д. Органическая химия. ИИЛ. - 1963. - т.И. - С.205-258.

50. Topper Y.J. The mechanism of action of phosphoglucose isomerase and phosphomannose isomerase// Journal of Biological Chemistry. 1957 - vol. 225.-p.419-426.

51. Malaisse W.J., Malaisse-Lagae F., Liemans V., Ottinger R. Willem R. // Mol. Cell. Biochem. 1989.

52. Rose I.A., O'Connel E.L. Intramolecular Hydrogen Transfer in the Phosphoglucose Isomerase Reaction // Journal of Biological Chemistry. 1961. -vol.236 (12). -p.3086-3092.

53. Willem R., Malaisse-Lagae F., Ottinger R., Malaisse W.J. Phosphoglucoisomerase-catalysed interconversion of hexose phosphates. // J. Biochem. 1990. - vol.265 (2). -p.519-524.

54. Aguayo J.B., Gamcsik M.P., Dick J.D. High Resolution Deuterium NMR Studies of Bacterial Metabolism. // Journal of Biological Chemistry. 1998. -vol.263 (36). - p. 19552-7.

55. Rose I.A., Rieder S.V. The mechanism of the aldolase reaction. Isotope exchange reactions of muscle and yeast aldolase. // Journal of Biological Chemistry. 1958. - vol.231. - p.315-329.

56. Saur W.K., Crespi H.L., Halevi E.A., Katz J.J. Deuterium Isotope Effects in the Fermentation of Hexoses to Ethanol by Saccharomyces cerevisiae. I. HydrogenExchange in the Glycolytic Pathway // Biochemistry 1968. - vol.7 (10). -p.3529-3536.

57. Vennesland В., Westheimer F.H. The mechanism of Enzyme Action. -McElroy, W. D., and Glass , В., Ed., Baltimore, Md., Johns Hopkins, 1954.

58. Bush K., Shiner V.J., Mahler H.R. Deuterium Isotope Effects on Initial Rates of the Liver Alcohol Dehydrogenase Reaction. // Biochemistry. 1973. - vol.12 (23). -p.4802-4805.

59. Hallander J.A., Brown J.R., Ugurbil K., Shulmun R.G. 13C nuclear magnetic resonance studies of anaerobic glycolysis in suspension of yeast cells // Biochemistry vol. 76 (12). - p.6096-6100.

60. Kerson L.A., Garfmkel D., Mildvan A.S. Computer Simulation Studies of Mammalian Pyruvate Kinase // Journal of Biological Chemistry. 1967 -vol.242.-p.2124-2133.

61. Schellenberger A., Muller V., Winter K., Hubner G. // J. Physiol Chem. 1966 -vol.344.-244.

62. Zhang B.L., Buddrus S., Trierweiler M., Martin G.J. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. in press.

63. Vallet C., Said R., Rabiller C., Martin M.L. Natural abundance isotopic fractionation in the fermentation reaction: influence of the nature of the yeast. // Bioorganic Chemistry. 1996. - vol.24 (4). - p.319-330.

64. Сборник международных методов анализа и оценки вин и сусел. М.: Пищевая технология. - 1993. - С.82-88.

65. Tateo F., Cantele G., Damia B., Russo G., Panza L., .Boussquet E. Analitical research to identify illegal modifications of D/H values in sugar mixtures. // Developments in Food Science. 1995. - vol.37B. - p. 1637-44.

66. Kosir I.J., Ogrinc N., Kidric J. Use of stable isotopes in wine analysis. // Zbornic Referatov s Posvetovanja Slovenski Kemijski Dnevi, Maribor, Slovenia, Sept. 20-21, 2001, Issue Part 2. p.796-801.

67. Monetti A., Reniero F., Versini G. Interregional and interannual variability of ethanol site-specific deuterium content in Italian wines. // Zeitschrift fuer Lebensmittel-Untersuchung und-Foschung. 1994. - vol.199 (4). - p.311-16.

68. Martin G.J., Nicol L., Naulet N., Martin M.L. New isotopic criteria for the short-term dating of brandies and spirits. // Journal of the Science of Food and Agriculture. 1998. - vol.77 (2). - p. 153-160.

69. Martin G.J., Benbernou M., Lantier F. Application of site-specific natural isotope fractionation (SNIF-NMR) of hydrogen to the characterization of European beers. // Journal of the Institute of Brewing. 1985. - vol.91 (4). -p.242-9.

70. Hajek M., Martin G.J. Determination of the relative natural abundance of deuterium by NMR spectroscopy and its application in the analysis of foods. // Chemicke Listy. 1989. - vol.83 (4). - p.404-21.

71. Е.С. Regulation № 2676/90. Official Journal of the European Communities, (1990) № L272, vol. 33, p.64.

72. Martin G.G., Pelissolo F., Martin G.J. ISOLOG: A Diagnostic System for Origin Recognition of Natural Products through Isotope Analysis. // J. Computer Enchanced Spectroscopy. 1986. - vol.3. - p.147-152.

73. Guillou C., Trierweiler M., Martin G.J. Repeatability and reproducibility of site-specific isotope ratios in quantitative deuterium NMR. // Magnetic Resonance in Chemistry. 1988. - vol.26 (6). - p.491-6.

74. Муратшин A.M., Белобрагин В.Я., Карповская С.А., Шмаков B.C., Безопасность и качество алкогольных напитков. // Стандарты и качество. 1998. - №8. - С.27-29.

75. Вязьмина H.A., Савчук С.А. Исследование примесного состава этилового спирта и продуктов его ректификации. // Партнеры и конкуренты. 2002.—№2.— с. 30-40.

76. Арбузов В. Н., Савчук С.А., Алёшкин Б.М., Фролова И.В. Комплексное применение методик для определения подлинности водок. // Партнеры и конкуренты. 2001 .-№8. - с. 22-24.

77. Муратшин A.M., Шмаков B.C., и др. Определение происхождения этилового спирта методом хромато-масс-спектрометрии. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2. - с. 27-34.

78. Проблемы идентификации алкогольсодержащей продукции. Сборник трудов. М.: Госстандарт РФ, 2001. - 199 с.

79. Устынюк Ю.А., Ходеев Ю.С., Нужный В.П. Как распознать, что мы пьём, господа? // Химия и жизнь. 1999. - №11-12. - с. 36-40.

80. Caer V., Trierweiler M., Martin G.J, Martin M.L. Determination of Site-Specific Isotope Ratios at Natural Abundance by Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. // Anal. Chem. 1991. -vol. 63. -p. 2306-2313

81. Смагунова А.Н., Козлов В.А. Примеры применения математической теории эксперимента в рентгенофлуоресцентном анализе. — Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та. 1990. - 232с.

82. Moussa I., Naulet N., Martin M.L., Martin G.J. A site specific and multielement approach to the determination of liquid - vapor isotope fractionation parameters: the case of alcohols. // Journal of Physical Chemistry. - 1990. -vol.94 (21). - p.8303-9.

83. Калабин Г.А., Кулагина H.B., Рыков P.C., Козлов Ю.П., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Идентификация сырьевой природы этанола методом спектроскопии ЯМР Н. // Вестник РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. 2003. - №7. - С.87-99.

84. Martin G.J., Sun X.Y., Guillou C., Martin M.L. NMR determination of absolute site-specific natural isotope ratios of hydrogen in organic molecules. Analytical and mechanistic applications. // Tetrahedron. 1985. - vol.41 (16). -p.3285-96

85. Шатенштейн А.И. Изотопный обмен и замещение водорода в органических соединениях в свете теории кислот и оснований. М.: АН СССР. - 1960.-С.213.

86. Bigeleisen J., Lee M.W., Mandel F. Equilibrium isotope effects. //Annual Rev. Phys. Chem. 1973. - vol.24. - p.407-440.

87. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах. М.: Наука. - 1978. - С.70-71.

88. Батунер Л.М., Позин М.Е. Математические методы в химической технике. Л.: Химия. - 1968. - 585с.

89. Краткая химическая энциклопедия. Т.4. М.: Советская энциклопедия, 1965. - с.817-826.

90. Препаративная органическая химия. 2 изд. М.: Госхимиздат, 1964.-с.867-870.

91. Препаративная органическая химия. 2 изд. М.: Госхимиздат, 1964.-с.581-583.

92. Gluud W., Schneider G. // Chem. Ber. 1924. - N 57. - S. 254-255.