Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов

Федоров, Сергей Николаевич

Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Федоров, Сергей Николаевич АВТОР

доктора химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов»

Автореферат диссертации на тему "Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов"

На правах рукописи

Федоров Сергей Николаевич

Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 5 НОЯ 2012

Владивосток - 2012

005054730

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН (Владивосток, Россия) и в Институте Хормела при университете Миннесоты (Миннеаполис, США).

Научный консультант:

Академик РАН, доктор химических наук

Стоник Валентин Аронович

Официальные оппоненты:

Булгаков Виктор Павлович

Член-корр. РАН, доктор биологических наук, Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, заведующий отделом биотехнологии

Попов Сергей Владимирович

Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, заведующий отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии

Звягинцева Татьяна Николаевна

Доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, заведующая лабораторией химии ферментов

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « 29 » ноября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан « 25~» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальность поиска и последующего изучения химической структуры и биологической активности морских природных соединении подтверждается опытом мировой науки. Установление их структур играет важную роль в развитии биоорганнческой химии, биохимии, биологии и медицины, без этого невозможно исследование биологических функций, путей биосинтеза и метаболизма таких веществ в соответствующих организмах, а также создание новых медицинских препаратов па основе морских природных соединений.

Известно, что морские природные соединения иногда обладают экстремально высокой биологической активностью. Среди них - самые мощные из небелковых токсинов (палитокспн, маитотоксип), противоопухолевые соединения с высочайшей токсичностью в отношении опухолевых клеток (спопгистатин, эктейнасцидины, бриостатипы), вещества с очень высоким обезболивающим (копотоксины) и противовоспалительным эффектами (мопаолид, контигннстерол).

Поиск новых природных противоопухолевых и канцерпревентивиых веществ имеет большое практическое значение, поскольку лечение и профилактика онкологических заболеваний в последнее время становятся одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всех странах, включая Россию. За рубежом исследования профилактической и терапевтической противоопухолевой активности соединений природного происхождения особенно активно проводятся в США, а также во многих ведущих европейских странах. Недавно были разрешены к применению первые высокоэффективные противоопухолевые лекарства, созданные па основе морских природных соединении «джопделис» и «эребулин мезилат». В России систематические работы в области химии, биохимии, биотехнологии природных соединений из морских организмов, включая противоопухолевые вещества, выполняются в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии паук (ТИБОХ).

При создании новых лекарственных и профилактических противоопухолевых средств важную роль играют не только поиск, получение, исследование строения и свойств их активных субстанций, по и выяснение молекулярного механизма действия. Без знания механизма действия препарата невозможно введение его в клиническую практику, поэтому изучение механизма действия, предполагающее использование самых современных методов молекулярной и клеточной биологии, является важной и актуальной частью работ по созданию противоопухолевых средств.

Недавно среди природных соединений из различных биологических объектов наземного происхождения найдена серия веществ, нпгибирующпх канцерогенез. Каицерпревептпвные метаболиты красного вина, зеленого чая, красного перца привлекли большое внимание. Соответствующие работы приобрели самую широкую известность и были опубликованы в ведущих научных журналах мира Science и Nature. Морские организмы, безусловно, также содержат соединения, препятствующие возникновению и развитию опухолей, по в то же время все еще остаются малоизученными в отношении содержания в них биологически активных веществ этого тина действия. Вероятность нахождения новых морских низко- и высокомолекулярных соединений, обладающих капцериревептивными свойствами, высока, а их поиск, выделение, изучение строения и механизма действия с целыо последующего применения таких веществ в медицинской практике являются актуальными.

Цели и задачи исследования. Целыо данной работы являлся поиск, выделение (получение), установление химического строения новых морских природных

соединений и их синтетических аналогов, а также исследование их капцерпревептивной и противоопухолевой активности вплоть до некоторых аспектов молекулярного механизма их действия.

При поиске новых морских биологически активных природных соединений были решены задачи отбора наиболее интересных с биохимической точки зрения образцов морских беспозвоночных путем применения широкого скрининга с использованием хроматографическнх методой и методов тестирования биологической активности.

Для выделения конкретных природных соединений ставились задачи оптимального использования современных хроматографическнх методов, включая тонкослойную, колоночную и высокоэффективную жидкостную хроматографию.

При установлении химической структуры и определении чистоты выделенных соединений решали задачи комплексного применения различных физико-химических и химических методов, включая ЯМР, ИК, УФ, КД, масс-спектрометрию, а также рснтгепоструктурный анализ.

В рамках данной работы ставились также задачи определения особенностей биологической, в частности капцерпревептивной н противоопухолевой активности отобранных веществ, а также изучения молекулярных механизмов их действия. В частности, решали задачи изучения цитотокснчсской активности веществ, их влияния на индукцию апоптоза и клеточный цикл, на транскрипционную активность р53, АР-1 и NF-кB ядерных факторов, па внутриклеточные уровни различных белков, включая фосфорнлированпые и пефосфорплпрованпые формы кнпаз, цпклипов и циклии-зависимых кнпаз и других белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз.

Еще одной задачей работы было изучение связи между строением исследуемых соединений и их биологической активностью и установление соответствующих закономерностей, которые дадут возможность прогнозировать свойства новых природных веществ и препаратов, создаваемых на их основе. Эта задача была решена с помощью широкого набора экспериментальных методов с последующим применением статистических методов анализа.

Основные положения, выносимте па интипу.

1. Из спиртового экстракта морского моллюска Лр1уыа с1аау1итс1а были получены 3 новых тернеиоида. При изучении химических свойств выделенных терпеноидов получены 8 их новых производных. Химическое строение этих веществ установлено рептгеиоструктурным анализом и спектроскопическими методами. Показано, что одни из этих терпеноидов, дактилоп, обладает канцерпревентивными свойствами, которые реализуются путем остановки клеточного цикла трансформированных и опухолевых клеток с последующим аноптозом.

2. Из спиртовых экстрактов 4-х видов офиур и 2-х видов шсстплучевых кораллов были выделены 9 новых полигндроксплнрованных стероидов, а еще 2 стероида были впервые выделены из морских организмов. Их строение установлено физико-химическими методами. Путем химических превращений получены 15 их новых производных. Сульфатированпые полпокснстероиды из офиур и морских звезд проявляют цитотоксическое действие против нескольких линий опухолевых клеток человека, ннгпбируют биосинтез ДНК в клетках каршиюмы Эрлиха и вызывают быстрый вход ионов Са2+ в клетки из внеклеточной среды через кальциевые каналы.

3. Левиускулозид С, стероидный гликозид из морской звезды Неппсш 1е\чи$си1а обладает цитотоксичиостыо в отношении опухолевых клеток и капцерпревептивной активностью. Эти активности связаны с индукцией апоптоза в опухолевых клетках человека и ингибированием трансформации нормальных клеток в опухолевые. Они

опосредованы, по крайней мере отчасти, через индукцшо транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и ингибирование транскрипционной активности, зависимой от опкогенных АР-1 и NF-кВ ядерных факторов, а также через ингибирование EGF-индуцироваппого фосфорнлирования опкогенных протеинкиназ ERKs.

4. Алкалоид полнкарпин из асцидии Polycarpa annua и его синтетический аналог дпметилполикаргшн показывают высокую противоопухолевую и цитотоксическую активности, а также канцерпревептпвпую активность в малотоксичных концентрациях. Эти активности поликариинов, по крайней мере отчасти, обусловлены индукцией нолнкарпинами каспаза-3- и р53-зависпмого апоптоза в трансформированных клетках. Фосфорплпрование и активирование под действием поликарпинов белка-супрессора опухолей р53 в свою очередь опосредовано активированными протеинкиназами JNKs, которые участвуют в фосфорилпровапии белка c-Jun, активировании р53 и последующем аионтозе.

5. Алкалоиды иидольного типа шеринины А-Е из морского гриба Pénicillium jaiithiiwlliiin не проявляют заметной цитотокснческой активности в концентрациях до 200 мкМ. Однако уже в концентрации 13 мкМ шерпппн Е ингпбирует опухолевую трансформацию нормальных мышиных клеток. Кроме того, шеришшы А-Е, также как п морские алкалоиды, 3- и 10-бромофаскаплизипы, вызывают апоптоз опухолевых клеток человека.

6. Новый препплпроваппый 1,4-бепзохиноп (глабрухнноп А) был выделен из асцидии Aplidium glabrum. Определено его химическое строение. Методами органического синтеза получены 9 новых и 3 ранее известных аналога глабрухииона. Полученные полипренилхиноны иидуцируют в клетках независимый от активации сунрессора опухолей р53 апоптоз, обладают in vitro и in viva каниерпревентивпой и противоопухолевой активностью, и являются мощными индукторами АР-1 и NF-kB ядерных транскрипционных факторов. Установлена зависимость между биологическими активностями и структурой в этом ряду соединений.

7. Бнополярный необычный сфинголнпид ризохалпп из губки Rhizoclialina incrústala, его аналоги п производные демонстрируют цптотоксические свойства по отношению к опухолевым клеткам человека и вызывают их р53- и каспаза-8, 9, 3-зависпмый апоптоз. Показано также, что МАРК JNK и ERK сигнальные пути участвуют в ответе JB6 С141 клеток на воздействие рнзохалина и его аналогов.

В. Актинонорин RTX-A из актииии Hcteractis crispa демонстрирует каннерпревентивную и цитотоксическую активности. Проявление RTX-A данных активностей может быть объяснено, по крайней мере частично, индукцией р53-пезависимого апоптоза и иигибпровапием активности опкогенных АР-1 и NF-kB ядерных факторов.

9. Сц цпклопситепоп (дносфеиол) пз асцидии Diplosoma sp. обладает канцернревеитивпой активностью в субцптотоксических концентрациях. Каицсриревептпвпое и цнтотокснчсское против опухолевых клеток действие дпосфенола обусловлены индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках. По всей вероятности, МАРК JNK и р38 сигнальные пути участвуют в ответе клеток па воздействие дпосфенола.

Ю.Трптерпеповые гликозиды из голотурий семейств Cncuinariidae, Stichopodidae, Psolidae, Ilolothuriidae и Synaptidae показывают цптотоксические активности, а в малотоксичных концентрациях - канцерпревептивпое действие. Механизм их действия

связан с индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках и ингпбнроваипем онкогенных АР-1 и NF-кВ ядерных факторов транскрипции.

Научная попита и практическая ценность работы. 44 новых морских вторичных метаболита и их синтетических аналога были выделены из морских организмов или получены в результате химических модификаций. Их строение было установлено физико-химическими и химическими методами. Впервые изучены капцерпревептивная и цнтотоксическая активности (в отношении опухолевых клеток) 62-х морских природных соединении и их синтетических аналогов, большинство из которых являются новыми. Для многих из них исследована зависимость биологической активности от их химической структуры.

Новизна данной работы состоит и в том, что в России до недавнего времени еще не проводился направленный поиск канцерпревентивпых природных соединений, а в других странах такой поиск проводился в основном среди природных соединений наземного, но не морского происхождения. Только в 2004 г. нами была опубликована первая статья, посвященная канцернревентиному действию морских метаболитов, алкалоидов поликарпинов, выполненная совместно с американскими учеными. В настоящее время в ТИБОХ ДВО РАН организована экспериментальная база, обеспечивающая проведение таких работ. Для поиска соединений, обладающих каицерпревентивнымн свойствами, создана коллекция из более чем 80 клеточных линий опухолевых и нормальных клеток человека и мыши. В данной работе применены методы поиска соединений, ингибирующпх EGF- н ТРА-нндуцпруемую трансформацию мышиных JB6 С141 Р+ клеток в мягком агаре, MTS-метод определения цитотоксическон активности, люцнферазный метод определения АР-1, р53 и NF-kB-зависимой транскрипционной активности, а в экспериментах используются генетически измененные клетки мыши, применяемые, в том числе для изучения влияния веществ па МАРК р38, JNK и ERK сигнальные пути. Ряд этих методик впервые поставлены нами в России. С помощью метода мягкого агара изучены канцерпревентивные свойства 27 морских природных соединений и пх синтетических аналогов, найдено несколько соединений перспективных в качестве хемопревентивных средств, тормозящих опухолевое перерождение клеток.

Некоторые изученные вещества индуцировали аноптоз в опухолевых клетках человека, воздействовали на активность внутриклеточных белков, регулирующих клеточный цикл п апоптоз, и активировали ряд ядерных факторов, в том числе белок-cyripeccop опухолей р53. В процессе выполнения работы показано, что некоторые виды морского пищевого сырья, в частности морские водоросли и голотурии, содержат соединения с каицерпревентивнымн свойствами.

Результаты данных исследований могут найти применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии, расширить спектр используемых в России биологически активных добавок к пище и привести к разработке новых медицинских препаратов. По результатам работы получены 2 патента РФ па изобретения, связанные с открытием новых перспективных противоопухолевых и апоптоз-индуцирующих препаратов профилактической и терапевтической направленности.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде постерных сообщений и устных докладов па ряде научных конференций и симпозиумов, в том числе: VI International Symposium on marine natural products (Дакар, Сенегал, 1989), 10-th World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins (Сингапур, 1991). 8-th Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chemistry (Riga, Латвия, 1991), 8-th International Symposium on Marine Natural Products (Santa Cruz de

Tenerife, Canary Islands, 1995), Научная Конференция ТИБОХ ДВО РАН (Владивосток, Россия, 1998), 9th International Symposium on Marine Natural Products (Townsville, Australia, 199S), IX Pacific Science International Congress (Taipei, Taiwan, 1998), Pacific Science Congress (Sydney, Australia, 1999), 95lh AACR Annual Meeting (Orlando, Florida, USA, 2Ü04). International Conference "Dietary Factors and Cancer Prevention: Current Premises and Future Promises" (Rochester, Minnesota, USA, 2004), IV Всероссийская Научная Конференция «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, Россия, 2006), The Commemorative International Symposium for the 60-th Anniversary of Dong-A University "Biotechnological Approaches for Agriculture and Medicine" (Busan, Korea, 2006), International Conference "Joint Russian-Korean Research of Physiological and Therapeutic Activity of Natural Compounds" (Vladivostok, Russia, 2007).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 30 статей в отечественных и международных журналах, 2 главы в монографиях, 2 патента и 15 тезисов докладов региональных, всероссийских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация построена традиционно и состоит из 6 глав. Вслед за «Введением» следует «Литературный обзор», в котором дается представление о современных достижениях в области изучения структуры и противоопухолевой профилактической активности морских природных соединений, а также общие сведения о канцерогенезе, фазах его развития, методах изучения, внутриклеточных мишенях и сигнальных путях его ингибирования. В главе «Обсуждение результатов» приведены и обсуждены результаты выполненного исследования. Эта глава состоит из 8 разделов, в которых материал сгруппирован в соответствии с химическими структурами исследуемых соединений. В «Экспериментальной части» даны сведения об использованных приборах и материалах, клеточных культурах, методиках выполненных экспериментов и сообщены характеристики полученных веществ. Завершают диссертацию «Выводы» и «Список цитированной литературы». Работа изложена на 295 страницах, содержит 34 таблицы, 78 рисунков и 9 схем. Список литературы включает 516 цитируемых работ.

Благодарности. Автор благодарен научному консультанту, академику РАН Стонику В.А., всем сотрудникам лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН, а также u.c. Радченко О.С., к.х.н. Баланевоп H.H., к.х.н. Сметаниной О.Ф., д.х.и. Монастырной М.М., Жидкову М.Е. (ДВФУ), принимавшим участие в данной работе и представившим свои вещества для нашего изучения. Автор благодарен также д.х.и. Калнновскому A.II., к.х.н. Дмитреику П.С., к.х.н. Исакову В.В., к.х.н. Герасименко A.B. (ИХ ДВО РАН), к.х.н. Попову Д.Ю. (ИХ ДВО РАН) - за получение и помощь в обработке спектральных данных или данных рентгеноструктурпого анализа, к.б.и. Амнпппу Д.Л., к.б.h. Агафоновой И.Г., к.б.и. Шастнпой В.В., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Ермаковой С.П., к.б.н. Горшковой H.A., к.б.и. Бердышеву Е.В. (Институт Хормела, США), ироф. Боуд A.M. (Институт Хормела, США), проф. Донг 3. (Институт Хормела, США) и сотрудникам его лаборатории, проф. Квак Д.Й. (Университет ДонгА, Республика Корея) и сотрудникам его лаборатории - за помощь в работе и проведение отдельных экспериментов по изучению биологической активности, а также к.б.н. Смирнову A.B. (ЗИН РАН, г. Санкт-Петербург), u.c. Красохину В.Б. и Гребневу Б.Б. - за определение видовой принадлежности изученных морских организмов.

Используемые сокращения. КД - круговой дихроизм; MTS - 5-(3-карбоксиметоксифеш1л)-2-(4,5-дпметилтиазолил)-3-(4-сульфофенил) тетразолпй,

внутренняя соль; EGF - эпидермальпый фактор роста; IC50 - (Inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение

количества жизнеспособных клеток на 50%; INCCjo - (Inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ннгнбировапие колонеобразовапия клеток в мягком агаре на 50%; JB6 CI41 DNM-p38 или JB6 С141 DNM-JNK1 или JB6 С141 DNM ERK2 - (dominant negative mutant), JB6 С141 клетки, домитшт-негатнвпо-мутантные по р38 или JNK1 или ERK2; FBS - сыворотка бычьих эмбрионов; МАРК - (Mitogen Activated Protein Kinases), митогеи-активируемые протеин кпиазы; р38 - киназы, относящиеся к МАРК; JNKs - киназы, относящиеся к МАРК; ERKs - киназы, регулируемые экстраклеточнымп сигналами, относятся к МАР киназам; JB6 С141 р53 или JB6 С141 АР-1 или JB6 С141 NF-кВ - линии клеток со стабильно экспрессированным геном люциферазы, контролируемым промоторной р53 или АР-1 или NF-кВ нуклеотидпон последовательностью; Rb - ретнпобластома, белок-суирессор опухолей; р53 - белок-супрессор опухолей, ядерный транскрипционный фактор; АР-1 - актнваторнын белок-1, ядерный транскрипционный фактор; NF-кВ -(Nuclear Factor - кВ), ядерный транскрипционный фактор; Cdk4 - циклпп-зависимая киназа; противоопухолевая активность - в данной работе - активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Химические структуры, свойства и биологическая активность терпеноидов из некоторых моллюсков и водорослей

Предполагается, что потребление разнообразной морской пищи приводит к значительному количественному уменьшению случаев заболеваний раком в Японии и других странах, население которых традиционно потребляет в пищу большое количество морепродуктов. Известно, что многие виды морской пищи содержат низкомолекулярные природные продукты, не характерные для наземных организмов. Однако возможная роль большинства таких вторичных метаболитов, за исключением жирных кислот, в профилактике раковых заболеваний остается неизвестной.

Галогепнроваииые хамиграповые сесквитерпепонды представляют собой группу морских природных соединений, которые были найдены только в красных водорослях и моллюсках, питающихся этими растениями. Метаболиты этой серии были выделены из различных видов морских водорослей, принадлежащих к роду Laurencia, включая те виды, которые используются в пищу населением Японии, Гавайских островов и других стран мира. Противоопухолевые свойства этих соединений были изучены явно недостаточно.

Дактилон - галоген ироеаннып хамиграиовый сесквитерпеиоид из моллюска Aplysia dactylomela. Структура и абсолютная конфигурация. Из хлороформенного экстракта морского моллюска Л. dactylomela был получен новый хамиграиовый бромсодсржащпн сесквитерпеиоид дактилон (1). Брутто-формула (1) С15Н21ОВГ

установлена путем изучения его масс-спектра (электронная

ионизация) (М+ 298, 296 m/z), а также 'И и |3С ЯМР спектров. УФ-спектр 1 (Хтах 236 им, е 8470) и ИК-спектр (voo 1667, vc=c 1624 см"') указывают на наличие в его структуре фрагмента а,р-иепределыюго кетона. 'И ЯМР спектр дактилопа близок к спектру ранее известного соединения 2, но отличается сдвигом сигнала одной из метнльных групп от 0.95 до 1.72 м.д. и появлением

мультиплета олефинового протона при 6.5 м.д. В связи с этим для 1 предложена структура 10-бромо-3,11,11-тр11метнл-7-метилпдеп-спнро[5,5]уидец-2-еп-4-опа.

Окончательно структура дактилона (1) и его абсолютная стереохимия установлена как (65,10/?)-10-бромо-3,11,11-трнметнл-7-метилндепсппро[5,5]ундец-2-ен-4-оиа с помощью рептгепоструктуриого анализа. Копформации циклов: А - кресло, В - бр-софа. Как следует из полученных данных, выделенный нами терпеноид (1) относится к производным (+)-|}-хамигрена. Родственные 1 соединения с такой абсолютной стереохимией еппроатома до этого были найдены только в двух видах красных водорослей рода Laurencia: L. elata и L. obtusa.

Некоторые химические свойства дакшилоиа. Семь новых терпепоидпых производных получены нами из дактилона (1) путем химических превращений. Их структуры установлены сравнением ЯМР спектров со спектрами исходного дактилона (1), а также с помощью КД и масс-спектров.

Так, в результате восстановительного дсбромпровапня дактилона (1) действием Zn в AcOII (схема 1) были получены новые хамиграповые сесквнтерпепоиды 3 и 4. Определена их абсолютная стереохимия как (3S,6S)-3,11,11-трнметил-7-метилиден спиро[5,5]упдскап-4-опа (3) и (65)-3,11,11-триметил-7-метилндеп-спиро[5,5]ундец-2-еп-4-опа (4).

АсОН

1 3 4

Схема 1. Восстановительное дебромирование дактилона (1) до производных 3 и 4. Гидрирование дактилона (1) над катализатором Адамса (схема 2) приводит к еще двум новым хампграновым сесквнтерпепоидам 5 и б.

'-0 Н,/Р1 \ 1 ■ ^ .Л-^^О

Схема 2. Реакння гидрирования дактилона (1) над катализатором Адамса.

Для териепопдов 5 и 6 установлена абсолютная стереохимия как (35,65,75,10/?)-10-бромо-3,7,11,11-тетраметилсинро[5,5]-упдекаи-4-опа (5) и (35,65,7/?)-3,7,11,11-тстраметнлсннро[5,5]ундекап-4-опа (6) соответственно.

Обработка дактилона трифторуксуспой кислотой в растворе в метаноле в течение 7 дней при комнатной температуре приводит к миграции экзометилеиовой двойной связи в эндоциклпческое положение (схема 3). Единственный продукт реакции - (65,10/?)-10-бромо-3,7,11,11-тетраметилспиро[5,51у11дека-2,7-дисн-4-о11 (7) - получен с выходом 82%.

Предполагается, что морские хамиграповые сесквнтерпепоиды бноспптезируются в результате циклизации бизаболановых предшественников. Памп установлено, что обратное превращение галогенированных хамнграпов в сесквптерпепонды бнзаболапового типа неожиданно легко и с почти количественным выходом происходит в результате реакции хамнграпов со щелочыо.

.г

КОН

Br"*"

МсОН

8' Т 3

Н+ МсОН

Br4*1"

.ОН

Схема 3. Перегруппировка дактилона (1) и его а-изомера (7) с образованием производных

Так, дактнлои (1) и его а-изомер (7) после обработки КОН в метаноле в течение 24 часов при комнатной температуре претерпевают перегруппировку с размыканием бромсодержащего цикла и образованием производных бизаболанового типа 8 и 9 соответственно (схема 3). Возможно, аналогичные трансформации хамиграновых предшественников имеют место также и в живых организмах. Сесквитерпеноиды с углеродным скелетом, аналогичным таковому для соединений 8 и 9, были выделены ранее из ряда горгопарий и губок.

Пчологическая активность дактилона. Цнтотоксчческое и канцерпресентнвное действие. MTS-методом было показано, что дактнлои мало токсичен в отношении мышиных JB6 С141 Р+ клеток и клеток рака легкого человека, НТ-460, его 1С5п - около 150 и 200 мкМ соответственно. Для определения эффекта дактилона на опухолевую трансформацию нормальных клеток или колонеобразование опухолевых клеток был использован стандартный метод мягкого агара. В качестве промотора злокачественной трансформации мышиных JB6 С141 Р+ клеток, которые при такой трансформации образуют многочисленные колонии при росте в мягком агаре, был использован эпидермальпый фактор роста (EGF) в концентрации 10 иг/мл. Результаты экспериментов показали, что дактнлои проявляет канцерпревентивные свойства в практически нетоксичных дозах. Так, 50% ппгпбнрование числа колоний трансформированных JB6 С141 Р+ клеток (INCC5o) дактилоном наблюдается уже в концентрации 45.4 мкМ. Похожие эффекты зафиксированы в экспериментах по ппгибпровапию дактилоном колонеобразованпя опухолевых клеток человека НТ-460, НСТ-116 и SK-MEL-5, при этом INCC5n равны 92.4; 70.5 и 99.2 мкМ соответственно.

Действие дактилона на ктеточный цикл. С помощью проточной цитометрии показано, что дактнлои индуцирует остановку клеточного цикла в JB6 С141 Р+ и SK-MEL-28 клетках на стадии перехода от Gi к S фазе. Так, уже при концентрации 40 мкМ дактнлои в значительной степени препятствует переходу JB6 С141 Р+ клеток из Gi в S фазу клеточного цикла, а при концентрации 60 мкМ он полностью блокирует прогрессию клеточного цикла на этом этане. Однако при действии на доминант-пегатпвно-мутантные JB6 С141 DNM-ERK2 клетки дактилон в концентрациях 10-60 мкМ не ипгпбирует, а наоборот, интенсифицирует переход клеток из G[ в S фазу. На основании этих данных мы предположили, что эффект дактилона на прогрессию клеточного цикла, по крайней мере частично, может быть опосредован через МАРК

бизаболанового тина (8 и 9).

ERKs.

Индукция дактилоном апоптоза. Данные, полученные путем клеточной цитометрии, показали, что дактилон может индуцировать запрограммированную смерть клеток путем апоптоза. Индукция клеточного апоптоза дактилоном показана с использованием красителей Аннексии У-Р1ТС и пропидиум йодид. Было найдено, что дактилон в малотоксичных дозах индуцирует дозозависимый апоптоз в мышиных ГО6 С141 Р+ клетках (рис. 1 А), а также в опухолевых клетках человека 8К-МЕЬ-28 (рис. 1Б), НЬ-60 и ТНР-1. Таким образом, противоопухолевое действие дактилона можно объяснить его способностью вызывать остановку клеточного цикла с последующим апоптозом.

10 40 80

Концентрация дактилона, мкМ

80 100 200 Концентрация дактилона, мкМ

Рисунок 1

Здесь

. Индукция дактилоном (1) апоптоза в JB6 С141 Р+ (А) и SK-MEL-28 (Б) клетках, и в последующих рисунках * р< 0.05 (достоверное отличие от контроля).

Эффект дактилона на фосфорилирование и внутриклеточные уровни некоторых сигнальных белков и роль ERKs в воздействии дактилона на клетки млекопитающих. Некоторые ранее опубликованные данные показывают, что ERKs-фосфорилирование и активирование может индуцировать остановку клеточного цикла. В нашей работе установлено, что дактилон в концентрациях 50-100 мкМ индуцирует в JB6 С141 Р+ клетках время- и дозозависимое фосфорилирование основных MAP киназ, включая ERKs (рис. 2А), р38 (рис. 2Б), и JNKs (рис. 2В). Основываясь па результатах изучения действия дактилона на клеточный цикл, мы также исследовали эффект различных его доз на экспрессию в клетках циклина D3, Cdk4 и фосфорилированных форм белка-супрессора опухолей ретииобластомы (Rb), которые регулируют прогрессию от Gi к S фазе клеточного цикла. Показано, что обработка дактилоном в концентрации 40-100 мкМ подавляет экспрессию циклина D3 и Cdk4, а также фосфорилирование Rb в JB6 С141 Р+ клетках. Похожее ингибиторное действие дактилона наблюдалось также на SK-MEL-28 и НТ-460 линиях опухолевых клеток.

Данные об активной роли ERK-сигналыюго пути в опосредовании индуцированного дактилоном ингибироваиия Rb фосфорилирования с последующей остановкой клеточного цикла на G,/S переходе были получены при сравнении эффектов дактилона па Rb белок в JB6 С141 Р+, JB6 С141 DNM-ERK2, JB6 С141 DNM-р38 и JB6 С141 DNM-JNK1 клетках.

Было найдено, что до концентрации 100 мкМ дактилон никак не воздействует на Rb фосфорилирование в JB6 С141 DNM-ERK2 клетках. Напротив, Rb фосфорилирование было подавлено после воздействия дактилона в JB6 С141 DNM-p38 и JB6 С141 DNM-JNK1 клетках. Ингибиторный эффект дактилона на Rb фосфорилирование также значительно понижен в RSK2" (синдром Коффии-Лоури) клетках по сравнению с нормальными WT-RSK2 клетками.

А Б

Дактилей, 100 мкМ, JBS CI41 F* клетки Дактилон, 100 мкМ, JB6 CI41 Р+ клетки

Ктрл 15 30 60 90 120 Время, мин Ктрл 15 30 60 Время, мин

Щ ЩЩ, г •» з-фосфо-ERKs —— — — - фосфо-р38

%*»». «и»» ттт - р38

Дактилон, мкМ, JB6 CI41 Р* клетки Ктрл 10 26 SO 75 100 Дактилон, мкМ, JBS CI4I Р~ клетки 1тт «я» цтц, -фосфо-р38

Ктрл 10 25 50 75 100 — & з-фосфо-ERKs

р38

3-ERKs

Дактилон, 100 мкМ, JB5 CI41 Р* клетки Ктрл UVB 15 30 60 SO Время, мии * * •....... TZ.-T- ^ ■ 3" фосфо-JNKs

âfc JNKs

Дактилон, мкМ, JB6 CI41 Р+ клетки Ктрл UVB 5 25 50 100

' w SS ii S "У

SZHNK»

Рисунок 2. Эффект дактилона (1) на фосфорнлирование ERKs (А), р38 (Б), и JNKs (В) в

JB6 С141 клетках.

RSK2 является основным субстратом ERKs в MAPK/ERK сигнальном пути. Кроме того, в пользу предположения об активной роли ERK-сигналыюго пути в механизме действия дактилона на клетки млекопитающих свидетельствует тот факт, что в концентрациях от 40 до 150 мкМ дактилон лишь незначительно влияет на жизнеспособность JB6 С141 DNM-ERK2 или RSK2" клеток, в отличие от JB6 С141 DNM-JNK1, JB6 С141 DNM-p38 и WT-RSK2 клеток, жизнеспособность которых понижается на 30-60%.

Влияние дактилона на р53-, АР-1- и NF-кВ-зависимую транскрипционную активность. Эффект дактилона на р53-, АР-1- и NF-кВ-зависимую транскрипционную активность оценивался с помощью JB6 С141 клеток со стабильно экспрессированным репортерным геном лгоциферазы, контролируемым р53, АР-1 или NF-kB промоторными ДНК последовательностями. Белок-супрессор опухолей р53 играет критическую роль в апоптозе, а увеличение уровня р53 в клетке с последующим апоптозом характеризует эффект на клетку многих канцерпревентивных агентов, например резвератрола, экстракта черного чая и других. Однако в наших экспериментах дактилон в нетоксичных концентрациях 50-100 мкМ, напротив, в два раза ингибирует базовую р53-зависимую транскрипционную активность и в 1.2-1.6 раз активирует базовую АР-1- и NF-кВ-зависимую транскрипционную активность в JB6 С141 клетках.

Все полученные нами результаты показывают, что хамиграновые сесквитерпеноиды морского происхождения (представленные здесь дактилоном),

являясь компонентами некоторых экзотических морских блюд, образуют перспективную группу канцерпревептивпых и противоопухолевых природных соединений. Их противоопухолевое действие, вероятно, дополняется некоторыми другими эффектами галогеиироваппых сесквитерпеноидов, сообщенными в литературе, например, их антибактериальной активностью по отношению к штаммам, устойчивым к действию антибиотиков, антивирусной активностью против вируса герпеса, а также антнгельмиптпой активностью. Наличием всех этих эффектов могут быть объяснены полезные свойства, приписываемые общественным мнением такой морской пище.

Сесквитерпепоид с перегруппированным углеродным скелетом из моллюска А. (1ас1у1отс1а. В литературе имеется много сообщений о выделении галогенированиых сесквитерпеноидов хамигранового типа с углеродным скелетом типа А (рис. 3) из красных водорослей и моллюсков, питающихся этими водорослями. Более редкими являются соединения, имеющие углеродный скелет типа В (рис. 3).

Рисунок 3. Обычный (Л) и прегруппированный (В) углеродные скелеты хамнграновых терпенондов. Структура териенонда 10.

Мы выделили новый необычный иегхтогенпрованнын сесквитерпеноид (10) с углеродным скелетом В из этанольного экстракта морского зайца А. с1ас1у1оте1а. Структура кетонсодержащего цикла в 10 идентична структуре аналогичного фрагмента в дактнлоне (1), что подтверждается спектральными данными. Другой цикл в 10, как было доказано методами ЯМР спектроскопии, включая КОЕ эксперименты, имеет конформацню кресла с двумя экзо-метиленовыми группами в а-положениях и одной экваториальной метильиой группой в [З-положенип к спиро-атому. Эти данные в сумме указывают на копформадшо этого цикла в виде7Р,10а-кресла. Ранее рсптгепоструктурпый анализ показал, что дактилон (1) имеет абсолютную конфигурацию 65,10/?. Для того чтобы определить абсолютную конфигурацию в 10, мы получили насыщенный кетон 11 каталитическим гидрированием 10 и использовали еще один насыщенный кетон 3, который был получен ранее путем обработки дактплона (1) цинком в смеси уксусной кислоты и метанола (схема 4). Путем сравнения КД спектров производных 11 п 3, был сделан вывод о 65 конфигурации в соединении 10.

136

146

14а

Схс.ма 4. Получение производных 11 из соединения 10 и 3 из дактплона 1. Таким образом, структура терпеноида 10 была определена как (65,105)-3,10-димстнл-7,11-диметилиден-спиро[5,5]упдец-2-еп-4-он.

Присутствие терненоидов 10 и 1, имеющих одинаковую конфигурацию спнро-атома в экстрактах Л. dactylomela, предполагает, что 10 может быть продуктом метаболизма дактилона (1) в организме моллюска (схема 5).

^^ ...

Вг1-' У^ Т

/\ I i

1 12 13 10

Схема 5. Гипотетическая схема биотрансформации дактилона 1 в терпеноид 10.

Аплидактои, терпеноид с беспрецедентным углеродным скелетом из моллюска A. dactylomela. Из спиртового экстракта A. dactylomela был выделен уникальный сесквитерпеноидный кетоп 14, названный анлидактоном. Для установления его строения и абсолютной конфигурации использовали рентгепоструктуриый анализ. В аплидактоне (14) были обнаружены значительные отклонения в длинах углерод-углеродных связей и значениях двугранных углов по сравпсшпо с обычными, в том числе характерными для цнклобутанов. КД спектр аплидактопа показал положительный эффект Коттона с \в\2ц = +42.8х105. Применение правила октантов подтвердило абсолютную конфигурацию аплидактопа, определенную рептгепоструктуриым анализом.

До выделения аплидактопа трудно было предположить, что такие соединения, содержащие два циклобутановых цикла, «вписанных» в шестичленный цикл, могут быть достаточно устойчивы, н существовать в природе. Возможно, что биосинтетическим предшественником 14 может служить дактилон (1). В этом случае образование четырехчленного цикла в 14 является результатом энзиматической трансформации, включающей [2+2]-циклопрпсоедннение в 1 (схема 6). Известно, что оно может происходить под действием УФ-облучения соответствующих днненасыщепиых соединений. Однако наши попытки получить аплидактои (14) из дактилона (1) путем долговременного УФ-облучения не увенчались успехом. Это свидетельствует в пользу in vivo образования аплидактопа.

1 14

Схема 6. Гипотетическая схема трансформации дактилона 1 в аплидактои 14.

Мы предположили, что аплидактои, имеющий нуклеофильный центр, может быть перегруппирован в более стабильное соединение под действием донора протонов. Действительно, реакция с /j-TsOH дала с почти количественным выходом изомерное соединение 15 (схема 7). Структура и абсолютная конфигурация 15 были установлены тщательным ЯМР анализом, включая 'Н-'Н COSY, HMQC, НМВС и 1D-NOE эксперименты, а также КД спектроскопией. КД спектр показал положительный эффект Коттона с ffbs7 = +36х105, что подтвердило стереохпмическпе особенности 15.

Схема 7. Перегруппировка аплидактопа 14 в производное 15 под действием кислоты.

Биологическая активность аплидактопа и хамиграиового сесквитерпеноида (3R,4S,6S,10R) 10 - бромо -3,11,11- ¡приметил - 7 -метнлиден-спиро[5,5]ундекан-3,4-диола из моллюска А. dactylomela. Было показано, что терпенонд 14 обладает весьма слабой цитотоксической активностью по отношению к JD6 С141 Р+ клеткам, 1С50 = 148 мкМ, более того, в концентрациях 25-75 мкМ, аплпдактон (14) способствует ускорению клеточной пролиферации почти в полтора раза, по сравнению с контрольными клетками, в течение 24 ч.

Кроме того, было показано, что, аплидактоп (14) обладает свойствами увеличивать UVB-нпдуцироваипую транскрипционную активность АР-1 и NF-кВ ядерных факторов. Так, в ненитотоксической концентрации 75 мкМ, аплидактоп в два раза увеличивает транскрипционную активность АР-1 и в три раза активность NF-kB ядерных факторов, не оказывая при этом большого влияния на активность р53 ядерного фактора. Вполне возможно, что именно с увеличением активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов связано ускорение пролиферации клеток под действием пецитотокснческнх концентраций аплидактопа. Таким образом, соединение 14 обладает, вероятно, канцерпромоторпыми свойствами.

Хамиграповый сесквитерпеноид (ЗЛ,45,65,10/?) 10-бромо-3,11,11-трнметил-7-метилпденсииро[5,5]ундекан-3,4-диол (16) был выделен памп из экстрактов Л. dactylomela. Была исследована цитотоксическая активность сесквитерпеиоида 16 в сравнении с цитотоксической активностью дактнлона (1) в отношении клеток лейкемии человека IIL-60 и ТНР-1. Сссквнтерепенопд 16 проявляет цитотоксическую активность по отношению к IIL-60 и ТИР-1 ленкемическим клеткам с 1С50 = 102 мкМ и 152 мкМ соответственно. Таким образом, замена сопряженной с двойной связью карбонильной группы в кольце В в дактилоне (1) на дпольную группировку в терпенопде 16 приводит к некоторому увеличению цитотоксической активности последнего по сравнению с дактплопом.

Цитотоксическая активность против опухолевых клеток терпеноидов из дальневосточной бурой водоросли Dictyota dichotoma. Из экстракта дальневосточной бурой водоросли D. dichotoma были выделены дптерпеноид пахидиктиол А (17) и сесквитерпеноид аксенол (18).

Как пахидиктиол А (17), так и аксенол (18) демонстрируют in vitro слабую цитотоксическую активность против опухолевых клеток человека HeLa, ТНР-1 и SNU-С4. В то же время оба вещества значительно менее цнтотокенчны по отношению к

здоровым мышиным эпидермхчьным клеткам линии Л36 С141. Более того, дитерпеноид нахидпктиол А (17) показывает примерно в два раза более высокую цитотоксическую активность по отношению к вышеперечисленным клеточным линиям, чем сесквитерпепопд аксепол (18) (табл. 1).

Таблица 1.1С50 пахиднктиола А (17) и аксенола (18) по отношению к опухолевым клеткам человека НеЬа, ТНР-1 и 8ХИ-С4 и нормальным эпидермальным клеткам

_мыши Л36С141._

Клеточная линия _Цитотоксическая концентрация (1С;п), мкМ

_Пахидиктиол А (17)_Аксенол (18)

HeLa (цервикальная 98 182

карцинома)

TIIP-1 (лейкемия) 74 155 SNU С-4 (рак кишечника) 99 185 JB6C141 _ПО_237

2. Химическая структура и биологическая активность стерондных производных из иглокожих и шестилучсвых кораллов Моиосульфатироваиный полиоксистсроид (20Я)-холест-5-еи-За,41},21-триол 3-сульфат натрия из офиур ОрМига заЫ, Ор1иига 1ер1ос1еша и $1е£ор1иига Ьгас1иасИ5. Основным компонентом фракции полярных стероидов из офиуры О. хам оказался стероидный сульфат 19.

"" 26

3 22

RiO"

R, = S03Na; R2 = R3 = H R-j = R2 — R3 — H Rt = S03Na; R2 = R3 = Ac R, = H; R2 = R3 = Ac

Структуру 19 установили на основании анализа его ЯМР, ИК и МС данных. После сольволнза 19 нагреванием в смеси диоксан-пиридин получили десульфатировапное производное 20. Ацетилировапие 19 давало моиосульфатироваиный диацетат 21, сольволитическое десульфатированне которого приводило к диацетату 22. Для доказательства нхтичия в стероиде 20 а-диолыюй группировки, было проведено его пернодатное окисление с последующим восстановлением боргидридом натрия и ацетилированием. Окисление 19 реактивом Саррета привело к образованию в 4-м положении карбонильной группы, сопряженной с 5,6-двойпой связью, и подтвердило, таким образом, что сульфатированный гидроксил расположен у С-3, а вторичная гидроксильная группа находится в а-положении к двойной связи. На основании полученных данных мы предложили для выделенного соединения 19 структуру (20/?)-холест-5-ен-За,4р,21-триола 3-сульфата натрия. Этот сульфатированный полиоксистсроид был идентифицирован в этанольных экстрактах еще двух видов дальневосточных офиур: 0.1ер1ос1ета и ЬгасЫасйх.

Ди- и три- сульфатированпые полиоксистероиды из О. Продолжив

исследования экстрактов из офиуры О. зат, мы выделили новые ди- и три-сульфатированные стероидные полполы 23, 24 и 25. Ввиду того, что соединение 24 не удалось очистить до индивидуального состояния, структурно изучался продукт его

десульфатирования 26, что и позволило определить химическое строение стероида 24. Наблюдаемые в ЯМР спектрах 23 но сравнению со спектрами 19 сдвиги сигналов протонов С//1-21 в слабое поле и сигналов углеродных атомов С-20 и С-21 в сильное и слабое поля, соответственно, могут быть объяснены сульфатнрованием С-21 гидроксигруппы в соединении 23. Это было подтверждено получением идентичного продукта сольволнза 20 из стероидов 19 и 23. На основании этих данных для 23 была установлена структура (20/?)-холест-5-ен-За,4р,21-триола 3,21-дисульфата натрия. Этот стероид был выделен нами также из этанольпого экстракта О. аси1еа!а.

После ацетилирования и последующего сольволитнческого десульфатирования стероида 23 был получен полиоксистероид, содержащий ацетоксильную группу при С-4, идентичный по спектральным характеристикам моиоацетату стероидного триола 26, выделенному после десульфатирования иодфракции полпоксистероидов, где преобладал стероид 24.

Кроме того, сравнение спектров триацетатов, полученных из 23 и 24 после сольволитнческого десульфатирования и ацетилирования, показало их идентичность друг другу. Установлено, что они имеют формулу 27. Расположение сульфатных групп в молекуле 24 было определено при сравнении 'Н ЯМР спектра подфракции сульфатироваппых полпоксистероидов, где преобладающим компонентом был стероид 24, со спектром сульфатировапного мопоацетата, полученного при ацетилировапии стероида 23. Эти спектры оказались идентичными. Таким образом, для сульфатировапного полноксистероида 24 было доказано строение (20Л)-4р-ацетокси-холсст-5-ен-За,21-днол 3,21-дисульфата натрия.

23 Я, = Из = 0503№; П2 = ОН 25 И, = П2 = Из = ОЭОзШ

24 И, = = 0503№; П2 = ОАс 28 Я, = = В3 = ОН

26 И, = И3 = ОН; Н2 = ОАс 29 Я, = Р2 = = ОАс 20 И, = Нг = = он

27 И, = В2 = Р?3 = ОАс

Сульфатированпый полиоксистероид 25 при попытке ацетилирования не изменялся, а продукт его сольволнза 28 в масс-спектре имеет пик молекулярного иона с т/г 418. В 13С ЯМР спектре триола 28 присутствуют сигналы трех атомов углерода, связанных с кислородом, и двойной связи. Ацетнлирование соединения 28 приводит к триацетату 29, который отличается от триацетата холест-5-еи-За,4р,21-триола (27). Сравнение спектров "С ЯМР 28 п 20, а также 'II ЯМР спектров их ацетатов 29 и 27 показывает почти полное совпадение сигналов С-12 - С-27 и небольшое отличие сигналов атомов в кольцах А и В. Был сделан вывод об идентичности боковых цепей триолов 28 и 20. На основании спектральных данных мы предположили, что две вторичные гндроксильные группы и двойная связь находятся в полнциклнческой части молекулы и образуют фрагмент А. Данные спин-декаплнпг экспериментов, а также ширина сигналов протонов СЯ-2 и СЯ-3, указывают на их экваториальную конфигурацию н 2р,3а-расиоложение гидрокснльпых групп. Следовательно, сульфатированпый

полиоксистероид 25 имеет строение (20/?)-холест-5-еп-2р,За,21-триол 2,3,21-трпсульфата натрия.

Дисульфатироваиные стероидные триолы из офиуры Ор/иоркоПч аси1еаш. Из

офиуры О. аснк'сиа были получены дисульфатироваиные стероидные триолы 30-32.

30 И, = ОН; И2 = П3 = ОБОзМа 33 П, = ОАс; П2 = П3 = ОН

Н,

П, = а, = ОБОз^; П2 = ОН; Д" И, = Р3 = 0Б03Ыа; 112 = ОН; Д22Е 11, = = ОН; Р2 = ОАс; Д23 11, = Р2 = И3 = ОАс; Д25 И, = П2 = = ОАс; Д22Е

При сравнении 13С ЯМР спектра 30 со спектром 25 можно было убедиться, что разница в хнмсдвигах углеродных атомов стероидного ядра для этих соединений значительна лишь для С-2, что говорит о наличии в 30 свободной гидроксильной группы при С-2 по сравнению с сульфатной группой при С-2 в 25. И наоборот, сигналы С-3 и С-21 в спектре 30 смещены в слабое поле по сравнению с соответствующими сигналами в 13С ЯМР спектре известного трнола 28, что свидетельствует о наличии в 30 сульфатных групп при С-3 и С-21. Два дополнительных (по сравнению со спектрами 25 и 28) сигнала в области двойных связей (128.5 и 138.1 м.д.) указывают на то, что в боковой цепи стероида 30 имеется еще одна двойная связь. Наконец, присутствие в 13С ЯМР спектре 30 только 26 сигналов углеродных атомов показывает, что эта боковая цепь укорочена. Дхчьнейшее доказательство структуры стероида 30 мы проводили, используя 13С и 'II ЯМР, а также масс-спектры моноацетата 33, в результате чего было установлено, что полиоксистероид 30 имеет структуру (20/?,22£>24-пор-холеста-5,22-диеп-2р,За,21-триол 3,21-дисульфата натрия. Из сравнения спектров 13С и 'И ЯМР стероидов 31, 32 н 23 можно было сделать вывод о том, что 23, 31, 32 имеют одну и ту же структуру стероидного ядра, а разница между ними заключается лишь в строении боковых цепей. При сравнении химсдвпгов протонов СН2-2\ в 'Н ЯМР спектре смеси стероидов 31 и 32 с таковыми в спектрах известных сульфатнрованных полиокснстероидов 23, 25, стало очевидно, что в 31 и 32 в 21-положенип боковой цепи находится сульфатная группа. При ацетнлироваиин с последующим десульфатировапнем из 31 был получен моноацетат 34.

"С ЯМР н масс-спектры 34 подтверждают его структуру как моноацетата С2т стероидиого триола с двумя двойными связями. Чтобы окончательно определить строение стероида 31, моноацетат 34 после ацетилироваиия и последующего гидрирования над катализатором Адамса был превращен в известное ранее производное - триацетат 27. Идентификацию проводили с помощью 'Н ЯМР и масс-спектров. Таким образом, строение сульфатнровапиого полиоксистероида 31 установлено как (20Я)-холеста-5,25-диеп-За,4р,21-трнол 3,21-дисульфат натрия. Сульфатированпый полиоксистероид 32 выделить в индивидуальном состоянии не удалось. Его "С ЯМР спектр был получен «вычитанием» из спектра смеси стероидов

31 и 32 спектра 31. Присутствие в спектре стероида 32 сигналов при 130.2 и 133.3 м.д. позволяет предположить наличие в его боковой цеии двойной связи, отличной от 25(2б)-двойной связи стероида 31, а именно: Д"-связи. Смесь стероидов 31 и 32 ацетнлировалн и провели сольволиз полученных ацетатов. Попытки разделить смесь продуктов этих превращений не были успешными. Однако 'Н ЯМР спектр смеси подтвердил наличие в стероиде 32 Д""-двойной связи с отрш/е-расположением олефиповых протонов. Смесь полученных мопоацетатов затем ацетнлировалн, а фракцию стероидных триацетатов 35 и 36 разделили с помощью ВЭЖХ. Масс-спектр 36 подтверждает структуру триацетата С27-стеропдпого триола с двумя двойными связями (одна - в ядре, другая - в боковой цепи). Структура боковой цепи 36 доказана с помощью ЯМР экспериментов. Для окончательного подтверхэдепия структуры стероида 32 его производное 36 было превращено в известный триацетат 27 путем гидрирования над катализатором Адамса. Идентификацию провели сравнением 'Н ЯМР и масс- спектров, они были идентичны. Таким образом, для сульфатироваиного полиоксистероида была 32 определена структура (20Я)-холеста-5,22-диен-За,4р,21-триола 3,21-дисульфата натрия.

Дисульфатир овинные стероидные тетраолы из офиуры О. аси1еа!а. Поскольку смесь дисульфатированных полиоксистероидов 37 и 38, выделенную из О. асикма, разделить не удалось, а спектральный анализ смеси был затруднен ассоциацией в растворах, вызванной наличием сульфатных групп, то структурно изучались продукты их ацетилировапия и последующего десульфатирования, а именно - смесь эпимеров 39 и 40.

2413; Я, = а, = ОН; П2 = Р3 = 0503№ 24Э; Я, = а, = ОН; Р2 = а, = ОБО^а 24И; Р, = И4 = ОАс; П2 = Из = ОН 243; Я, = И4 = ОАс; Я2 = И3 = ОН

При сравнении ,3С и 'Н ЯМР спектров смеси с соответствующими спектрами стероида 33 можно было сделать вывод об идентичном строении стероидного ядра в 33 и 39, 40 и о существенной разнице в структуре их боковых цепей. Сигналы углеродных атомов боковой цепн смеси 39 и 40 (кроме снгиалов С-20 н С-21) имеют вид "дублетов" с разницей в химсдвигах 0.1-0.06 м.д., а для С-24 эта разница составляет 0.08 м.д. Именно такой вид 13С ЯМР спектров характерен для смеси стероидных эпимеров по одному из атомов боковой цеии. Химсдвиги углеродных атомов боковой цепи свидетельствуют о наличии в ее структуре гндроксильпой и ацетоксильпой групп, а также 25(26)-двойной связи. 'Н ЯМР спектр и эксперименты ЯЭО подтверждают наличие 25(26)-двойпой связи, гидроксилыюй группы у С-21 и (20й)-конфигурацию в стероидах 39 и 40, а также наличие в положении С-24 ОАс-группы. Расщепление сигнала этой ОАс-группы на два примерно равных синглета (2.05 и 2.06 м.д.) указывает на то, что смесь состоит из приблизительно эквимолярных количеств 24/? и 245-эпимеров 39 и 40. Основываясь на структурах ацетатов 39 и 40, мы определили для нативиых полиоксистероидов 37 и 38 строение (20Я,24Я)- и (20Я,245)-холеста-5,25-диен-2р,За,21,24-тетраол 3,21-дпсульфатов.

Идентификация 3,21-дисульфатированных стероидных диолов в офиурах О. аси1еа1а, О. хагх1 и 5. ЬгасЫас^х. Продолжив изучение полярных стероидов из офиур, мы получили в индивидуальном состоянии и идентифицировали ранее известные

(20/?)-5а-холсстап-За,21-диол 3,21-дпсульфат натрия (41) и (20Я)-холест-5-ен-За,21-днол 3,21-днсульфат натрия (42) в О. аыйеШа, О. хст! и 5. ЬгасЫасНз. Идентификация стероидов 41 и 42 проводилась сравнением |3С и 'Н ЯМР, а также масс-спектров исходных сульфатов и их производных 43 и 44 с литературными данными.

Вероятные пути биосинтеза сульфатчроваиных полиоксистероидов офиур. Наиболее характерными местами гидроксплпрования и сульфатирования для полиоксистероидов офиур являются положения 2, 3, 4, а в боковой цепи - 21. Возможные пути их биосинтеза изображены на схеме 8. Предшественниками этих соединений являются, очевидно, стерины (45,11=боковая цепь). Образование 2,3- и 3,4-а-окисей (46, 50) может быть следствием энзиматической дегидратации свободных стерппов с последующим окислением образующихся при этом 2(3)- и 3(4)-двойпых связей. Размыкание эпоксициклов при их взаимодействии с протоном н реакция соответствующих карбкатнонов (47, 51) с сульфат-анионом, по-видимому, завершают этот процесс, что приводит к образованию соответствующих сульфатированных полиоксистероидов (48, 49, 52, 53).

Схема 8. Возможные пути биосинтеза сульфатированных полигидроксистероидов в офиурах

Биологическая активность полярных стероидов. Действие па опухолевые и нормальные клетки млекопитающих. В наших экспериментах полпокентероид 19, выделенный из О. пап!, показывает слабую цитотоксическую активность против опухолевых клеток человека ПЬ-60, НеЬа, 51ЧГО-С4, а также против мышиных эпидермальных №6 С141 клеток в концентрациях 50-200 мкг/мл. Причем при концентрации 200 мкг/мл 19 па 100% ингибирует рост всех используемых клеточных

линий. 1С,,> равна 121, 135, 101 и 114 мкг/мл в отношении НЬ-бО, НеЬа, 5М11-С4 и Л36 С141 клеток соответственно. Следовательно, более высокую активность стероид 19 проявляет против 8Ми-С4 опухолевых клеток человека (рак кишечника). Полярные стероиды 23 и 31 из О. асикчПа, отличающиеся друг от друга только наличием в боковой цени стероида 31 25(26)-двойноп связи, в концентрациях до 100 мкг/мл не проявляют пи цитотоксической активности по отношению к клеткам карциномы Эрлиха н к лимфоцитам мыши, ни гемолитической активности но отношению к эритроцитам мыши. Влияние стероидов 23 и 31 па транспорт ионов Са"+ через клеточную мембрану было исследовано при помощи радиоизотопного и спектрофлгоориметрического методов с использованием ионов радиоактивного изотопа 45Са2+ и флуоресцентного кальциевого зонда. Оказалось, что 23 и 31 в концентрациях 1-100 мкг/мл и времени инкубирования с клетками 5 мин стимулируют быстрый вход ионов Са2+ в клетки карциномы Эрлиха (рис. 4). Причем стероид 31 примерно в 8 раз более активен, чем 23.

Q. 1200 -г

2 юоо-

5 800 -Л" 600■

га

¡J 400 | 200

1 0

Стероид 23 —•—Стероид 31

3.13 6.25 12.5 25 50 100

Концентрация стероидов 23,31 (мкг/мл) Рисунок 4. Влияние стероидов 23 и 31 на вход попов Са"+ в клетки карциномы Эрлиха.

Подобный эффект стероидов 23 и 31 на внутриклеточную концентрацию Са2+ зафиксирован также на лимфоцитах и макрофагах мыши.

Противоопухолевая активность и механизм действия левнускулозида G, стероидного гликозида из морской звезды Ilenricia leviuscula. Глнкозилировапные стероиды являются обычными вторичными метаболитами морских звезд. Левиускулозид G (LSG, 54) был выделен из дальневосточной морской звезды Н. leviuscula в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ и показал гемолитическую и нейритогенпую активности. Однако его проапоптотпческне и иротнвоканцерогеииые свойства до наших работ не были изучены.

Проапоптотические свойства левнускулозида G.

Клетки лейкемии человека HL-60 или ТНР-1 были обработаны в течение 24 часов возрастающими концентрациями LSG, что вызвало в данных клетках апоптоз, зависящий от концентрации LSG. IIL-60 клетки были более чувствительными к действию LSG по сравнению с ТНР-1 клетками. Так, LSG в концентрации 40 мкМ вызывал апоптоз в 70% HL 60 клеток и лишь в 30% ТНР-1 клеток.

Канцерпревентиеная и цитотоксическая активности левиускулозида G. Результаты изучения цитотоксической активности показали, что даже концентрация LSG 80 мкМ является нецитотоксической для JB6 Р+ С141 клеток (рис. 5 А).

6 »

* 60

4000 « 3500 1 3000 | 2500

ш 2000

8 1500

I woo

* 500

35 50 65

Концентрация LSG, мкМ

III.

Контроль EGF 20 30 40 50 Контроль Концентрация LSG, мкМ

Рисунок 5. Действие LSG (54) на жизнеспособность JB6 Р+ С141 клеток (А). Мигрирование LSG EGF-индуцированной проканцерогенпой трансформации JB6 С141 Р+ клеток (Б).

LSG дозозависимым образом и в нецитотоксических концентрациях ингибирует трансформацию JB6 С141 Р+ клеток, индуцированную эпидермальиым фактором роста (EGF) (рис. 5 Б).

Действие левиускулозида G на АР-1-, р53- и NF-кВ-зависимую транскрипционную активность. Для того чтобы изучить механизм действия LSG на клеточном уровне, было исследовано его действие на АР-1-, р53- и NF-кВ-зависимую транскрипционную активность в JB6 С141 клетках. Роль АР-1 ядерного транскрипционного фактора в пролиферации, дифференциации и EGF-индуцированной прораковой трансформации JB6 Р+ С141 клеток хорошо известна, а ингибиторы АР-1 активности рассматриваются как потенциальные противооопухолевые и/или канцерпревентивные вещества. Полученные нами результаты показывают, что LSG является новым ингибитором базовой, а также EGF-индуцированной АР-1-зависимой транскрипционной активности. Ядерный транскрипционный фактор NF-кВ также участвует в активации большого числа генов, включая гены, ответственные за воспалительные процессы, подавление апоптоза и клеточный ответ на инфекцию.

. Б

Концентрация LSG, мкМ

Рисунок 6. Ингибирование LSG базовой NF-кВ-завнсимой (А) и активирование базовой р53-зависимой (Б) транскрипционной активности в JB6 С141 клетках. "Относительные единицы.

В противоположность этому, активирование белка-супрессора опухолей р53 ведет к ингибированию клеточного роста путем остановки клеточного цикла или индукции апоптоза. В нашем исследовании LSG, подобно многим другим противоопухолевым веществам, в нецитотоксических концентрациях и дозозависимым образом ингибировал NF-кВ-зависимую (рис. 6 А), но индуцировал р53-зависимую транскрипционную активность (рис. 6 Б) в JB6 С1 41 клетках.

Действие левиускулозида G на EGF-индуцированное фосфорилировапие ERKs. Известно, что ERKs - существенный элемент контроля клеточного деления. ERKs способны активировать онкогенпые факторы транскрипции, такие как АР-1, NF-кВ, и с-Мус. Сами ERKs также фосфорилируются и активируются эпидермальным фактором роста в процессе опухолевой трансформации мышиных эпидермальных JB6 ¿141 Р+ клеток. Ингибиторы ERKs рассматриваются в качестве противоопухолевых веществ. Наши эксперименты показали, что LSG дозозависимым образом иигибирует EGF-индуцированпое ERKs фосфорилировапие и активирование в пецитотоксических концентрациях 20-40 мкМ (рис. 7).

Концентрация LSG, мкМ

EGF

10 20 40

mSm rnSSm mSm Щ-фосфо-ERKs «S 12 335 3-нонфосфо-ERKs

Рисунок 7. Ингибирование LSG EGF-индуцированпого фосфорилирования ERKs в JB6

С141 Р+ клетках.

Таким образом, биологическая активность LSG выражается в индукции апоптоза в опухолевых клетках человека и ингпбироваиии трансформации нормальных клеток в опухолевые. Она реализуется, по крайней мере отчасти, через индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и ингибирование транскрипционной активности, зависимой от онкогенных АР-1 и NF-кВ ядерных факторов, а также через ингибирование EGF-индуцироваппого фосфорилирования и активирования онкогенных ERKs. На примере изучения LSG показано, что некоторые стероидные гликозиды из морских звезд представляют собой группу морских вторичных метаболитов, перспективных в качестве потенциальных противоопухолевых и канцерпревептивных веществ.

3. Биологическая активность морских алкалоидов и их аналогов.

Биологическая активность и механизм действия поликарпина и его синтетического аналога диметилноликарнина. Противоопухолевый алкалоид поликарпин (55) из асцидии Polyccirpa aurata. высоко токсичен в отношении опухолевых клеток человека. Это соединение и его производное диметилполикарпин (56) были получены путем полного химического синтеза в лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ с хорошими выходами.

*2нс1

nh2

кап церпревент йеной активностей

П2 55 ,,„2

Исследование цитотоксической и поликарпина и диметилноликарнина. Методом МТЗ было показано, что поликарпин (55) и диметилполикарпин (56) ингибируют жизнеспособность .1В6 С141 Р+ клеток с 1С5о=7.2 и 7.7 мкМ соответственно. Канцерпревентивную активность поликарпина и

его производного 56 исследовали с помощью метода мягкого агара. В качестве активаторов процесса опухолевой трансформации Ш6 С141 Р" клеток в мягком агаре были использованы ГОИ (10 нг/мл) и форболовый эфир (ТРА, 20 иг/мл). Полученные результаты показывают, что алкалоиды 55 и 56 обладают канцерпревентивной активностью в малоцитотоксических концентрациях, при этом ШСС50 равны для 55 1.2-1.5 мкМ, а для 56 - 2.5-4.3 мкМ. Таким образом, оба вещества демонстрируют способность тормозить трансформацию нормальных клеток, причем поликарпин (55) -в 2 раза более активный ингибитор злокачественного перерождения клеток, чем диметилполикарпип (56).

Индукция апоптоза в ]В6 С141 Р* клетках, а также в опухолевых клетках человека. Методом проточной цитометрии показано, что поликарпипы 55 и 56 индуцируют апоптоз в Ш6 клетках дозозависимым образом (рис. 8). В этом случае 55 также более активен, чем 56. Однако такие активности обоих веществ по отношению к одним и тем же лейкемическим клеткам человека примерно одинаковы.

К 80

§ о. 70

£ 60

ж 50

ге 40

т 30

о 20

о 10

< 0

5.0 7.5 10.0 12.5 Концсжрация поликарпина, мкМ

0 5.0 7.5 10.0 12.5 Концентрация диметилполикарпина, мкМ

Рисунок 8. Индукция поликарпином (55) (А) и диметилполикарпином (56) (Б) апоптоза в

ЗВ6 С141 Р+клетках.

Поликарпин в концентрации 5 мкМ вызывает ранний апоптоз в 17.3% и поздний в 81.8% НЬ-60 клеток, соответствующие цифры для диметилполикарпина - 18.7% и 76.0%. Оба вещества оказались более активными индукторами апоптоза по отношению к НЬ-60 клеткам по сравнению с ТНР-1 клетками. Действительно, при концентрации 1 мкМ 55 вызывает общий апоптоз в 56.7% НЬ-60 клеток, но лишь в 22.5% ТНР-1 клеток. Аналогичный результат получен и для 56. Вестерп-блоттипгом с использованием первичных антител к прокаспазе-3 и к активной, расщепленной форме каспазы-3 установлено, что 55 и 56 активируют каспазу-3 в 1В6 С141 Р+ клетках в зависимости от времени и концентрации веществ (рис. 9).

Ктр иУВ

Поликарпин, мкМ

7.5 10 12.5

ктр иув

^У&Й»' ч

кармин, мкМ

12.5

* 40)0 -прокаспаза-3

( - •• ФШI

* -0Щ. . -прокаспаза-3

¡¿Ш»: -расщепленная а-Э

Рисунок 9. Активирование поликарпином (55) (А) и диметилполикарпином (56) (Б) каспазы-3 в Л36 С141 Р+ клетках.

Эти результаты показывают, что капцерпревеитивные и противоопухолевые свойства поликарпинов могут быть обусловлены индукцией каспаза-3-зависимого апоптоза в трансформированных или раковых клетках.

Фосфорилирование МАР-киназ, активированное поликарпином и диметилполикарпином. С применением метода ветерн-блоттиига мы показали, что поликарпин и диметилполикариин индуцируют дозозависимое фосфорилирование МАРК р38, 1ЫК.ч и ЕЯКб (рис. 10 А-В) в :Вб С141 Р+ клетках. Так, поликарпин и диметилполикариин начинают стимулировать фосфорилирование р38 киназы и JNKs уже при концентрации 2.5 мкМ, но фосфорилирование ЕШСч они иидуциругот только при концентрации 10 мкМ и выше.

Концентрация, мкМ 1ктр 2.5 5 7.5 10 15 ¡

Поликарпин

Диметип-поникарпин

-фосфо-р38 -р38

-фосфо-р38 : -р38

_ .. Диметилполи-

Поликарпин, мкМ ..

г кармин. мкМ

^ Концентрация, мкМ i Ктр 2.5 5 7.5 10 15

,,,if, Ш:« »

Поликарпин м

Ш >JNKs

^-фосфо-иЫКэ

* т ш шт т.

Диметил-поликарпин

Ктр 2.5 5 10 15112.5 5 10 15

w v

гж т . Ш mm

~|-0OC0O-JNKs 3-JNKs

|j фосфо-ERKs

Рисунок 10. Иидукция поликарпином и диметилполикарпином фосфорилирования МАРК р38 (A), JNKs (Б), ERKs (В) в JB6 С141 Р+ клетках.

Иидукция поликарпином и диметилполикарпином фосфорилирования белка с-Jun по Ser 73 в Ink*'*, но не в ]пкГ'~и Juk2~'~ мышиных эмбриональных фибр о б л а с тих (МЭФ). c-Jun является известным субстратом для JNKs. Наши результаты показывают, что и поликарпин, и диметилполикарпин в концентрациях 7.512.5 мкМ индуцируют c-Jun фосфорилирование rio Ser 73 в Jnk* * мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) дозозависисмым образом (рис. 11).

Поликарпин, мкМ

Ктр 7.5 10 12.5 JNK+'+

Ктр 7.5 10

jnkW-

12.5

Ктр 7.5 10 12.5 JNK+'+

Ктр 7.5 10 12.5 JNK2-'"

щт%рр -фосфо-с-Jun

— — — -нонфосфо-с-Jun

Диметилполикариин, мкМ

Кгр 7.5 10 12.5 JNK+/+

Ктр 7.5 10

jnkW-

12.5

Диметилполикариин, мкМ Ктр 7.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.5 JNK+'+ JNK2"'-

-фосфо-с-Jun -нонфосфо-с-Jun

-Г" ^ -фосфо-с-Jun

-нонфосфо-с-Jun

-фосфо-с-Jun -нонфосфо-с-Jun

Рисунок 11. Воздействие поликаршша и диметилполикарпина на фосфорилирование c-Jun

по Ser 73 в Jnk и Juki

МЭФ (А), а также в Jnk*'* и Jnk2 ' МЭФ (Б).

В то же время никакого активирования e-Jun фосфорилирования не наблюдается в Jnkr'~и МЭФ. Этот результат ясно показывает, что полпкарпины индуцируют

активность JNKs.

Роль MAP кииаз в индукции поликарпииом или диметилполикарпииом проапоптотического сигнала в JB6 С141 клетках. MTS методом была оценена роль MAP кииаз в эффектах поликарпина или диметилполикарипна на жизнеспособность клеток. Экспрессия доминант-пегативной формы JNK1 приводит к резкому увеличению числа JB6C1 41 JNK1 DNM клеток, выживших после воздействия токсичных концентраций поликарпинов по сравнению с контрольными JB6 С141 Р+ клетками. С другой стороны, экспрессия доминапт-негативпых форм р38 или ERK2, напротив, приводит к уменьшению числа выживших JB6 С141 р38 DNM или JB6 С141 ERK2 DNM клеток по сравнению с контрольными JB6 С141 Р+ клетками.

Далее, для подтверждения активной роли JNK кииаз в опосредовании действия поликарпинов на клеточном уровне, мы изучили поликарпии- и диметилполикарпип-индуцпроваппый апоптоз в клетках с экспрессированными доминант-негативно-мутантными (DNM) формами MAP киназ или в Jnkl~'~и Jnk2~'~ МЭФ. Результаты этих экспериментов соответствуют результатам MTS экспериментов и указывают на то, что количество апоптотических JB6 С141 JNK1 DNM клеток после воздействия токсических доз поликарпинов значительно, на 20-70% меньше, чем в контрольных JB6 С141 клетках. Напротив, JB6 С141 р38 DNM клетки в тех же условиях дают значительно большее, на 20-50% количество апоптотических клеток по сравнению с контрольными JB6 С141 Р+ клетками. Экспрессия DNM ERK2 не приводит к большой разнице в апоптозе, индуцированном поликарпинами 55 и 56 в JB6 С141 ERK2 DNM и JB6 С141 Р+клетках.

Для того чтобы еще раз подтвердить роль JNK кпназ в полпкарпин-индуцированном апоптозе, мы использовали специфические ингибиторы JNKs: SP600125 и ингибитор пептидной природы #420116. Результаты этих экспериментов показывают, что полпкарпип-ипдуцированный апоптоз на 20-50% иигибируется этими JNK ингибиторами в JB6 С141 Р+ клетках. С другой стороны, 30-минутное преипкубированне JB6 С141 клеток со специфическим ингибитором р38 киназы, SB202190, имеет результатом значительное, на 20-30%, увеличение числа апоптотических клеток при концентрации поликарпинов 12.5 мкМ, в сравнении с контрольными клетками. Эти результаты подтверждают решающее значение МАРК JNK сигнального пути в индукции апоптоза поликарпииом (55) и днметилиолнкариипом (56).

Роль белка-супрессора опухолей р53 в эффектах, индуцированных поликарпииом и диметилполикарпииом на клеточном уровне. Для того чтобы исследовать роль р53 в индукции аноптоза поликарпииом и диметилполикарпииом, мы изучили апоптоз в р53+/+ и р53-дефицитпых (р53"/_) МЭФ. Для каждого из веществ, при концентрациях 1012.5 мкМ, количество апоптотических клеток в р53+/+ МЭФ в 2-4 раза выше, чем в р53~'~ МЭФ. Этот результат показывает, что р53 вовлечен в апоптоз, индуцированный поликарпииом или диметилполикарпииом. Для того чтобы показать, что оба соединения стимулируют активность р53, мы затем изучили индукцию поликарпинами р53-зависимой транскрипционной активности и р53-фосфорилирования в JB6 С141 клетках. Нами показано, что после обработки JB6 С141 клеток со стабильно экспрессировапным р53-люциферазным репортериым геном (PG-13 клетки) поликарпинами при концентрациях от 2.5 до 12.5 мкМ, в клетках происходит

значительное, на 25-50%, увеличение р53-зависимой транскрипционной активности (рис. 12).

Это увеличение хорошо согласуется с ростом внутриклеточных уровней фосфорилированной и нефосфорилированной форм ядерного фактора р53, наблюдаемым в Л36 С141 Р+ клетках, обработанных поликарпином или диметилполикарпииом в концентрациях 7.5 мкМ и более (рис. 13).

2.5 5 7.5 10 12.5 15 Поликарпин, мкМ

1.25 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 Димстиллоликарпин, мкМ

Рисунок 12. Индукция поликарпином (А) и диметилполикарпииом (Б) р53-зависимой транскрипционной активности в JB6 С141 р53 клетках.

0 0 - - - 7.5 10 12.5 Димегилполикарпин, мкМ о о 7.5 10 12.5 - - - Поликарпин, мкм

* uvb

«™ — —. тт .„„ mm тт -фоСфо-р53 (Set 15| ■ т* чшт тш ... цт um -р53

Рисунок 13. Влияние поликарпина и диметилполикарпина на внутриклеточные уровни белка-супрессора опухолей р53 в JB6 С141 Р+ клетках.

Роль JNKs в фосфорилировапии белка-супрессора опухолей р53, индуцированном поликарпином и диметилполикарпииом. Для того чтобы определить роль JNKs в фосфорилировапии р53, индуцированном поликарпииами, мы изучили фосфорилирование р53 по Ser 15, индуцированное 55 и 56 в Jnkl~'~, Jnk2~'~ или Jnk*'+ МЭФ. Полученные результаты показывают, что фосфорилирование р53 было ингибироваио в Jnkr'~и Jnk2~'~ МЭФ по сравнению с Jnk+,+ МЭФ (рис, 14). Это указывает на востребованность JNK киназ в процессе поликарпин- или диметилполикарпин-индуцированного фосфорилирования р53 по Ser 15 и последующего апоптоза.

А Поликарпин, мкМ Б Диметилполикарпин, мкМ

Ктр 7.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.5 Ктр Г.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.5

JNK1 '- JNK**'+

¡ w» тж. тт -фосфо-р53 (Ser 15) — «ж

£ШНК ----mm* мм -р53 тт

JNK4'* J N К ? ''' JNK

штшзж «я» -фосфо-р53 (Ser 15) fe -, щ-ф -шт

4К.«. •м» шт м» ят -р53 ия — —

Рисунок 14. Влияние поликарпина и диметилполикарпина на внутриклеточные уровни белка-супрессора опухолей р53 в Jnk+I+, Juki'и Jnk2~/~ МЭФ.

Таким образом, наши результаты показывают, что цитотоксическая и канцерпревеитпвпая активности поликарппнов, по крайней мере отчасти, обусловлены индукцией каспаза-3-завнсимого апоптоза. Кроме того, полпкарпины активируют фосфорилированне р38, JNKs н ERKs в JB6 Cl 41 клетках и, следовательно, все три основных МЛРК-сигнальных пути вовлечены в ответ JB6 клеток на действие поликарппнов. Мы также показали, что иоликарпшышдуцпрованный апоптоз в значительной степени подавлен в клетках с экспрессированпой доминант-негативно-мутантпои формой JNK1 киназы. Поликарппны стимулируют р53-завнсимую транскрипционную активность п р53 фосфорилированне в JB6 Cl 41 клетках. Фосфорилированне р53 по Ser-15 подавлено в JNK1 и JNK2 нокаут клетках. Более того, ноликарипны не способны индуцировать апоптоз в р53-дефнцптных (р53"'") мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) в противоположность с сильной индукцией апоптоза в МЭФ с экспрессированпой формой р53 (р53+/+ МЭФ). Этот факт предполагает участие р53 в апотозе, индуцированном поликарпинами. Фосфорилированне и активирование р53 было в свою очередь опосредовано активированными JNK кипазамн. Все это ясно указывает па проапоптотическую роль JNK-спгналыюго пути и показывает, что JNK киназы востребованы в фосфорплнроваиин c-Jun, активировании р53 и последующем апоптозе, индуцированном поликарпинами.

Изучение биологической активности индольпых алкалоидов шеринииов А, Е и D из морского гриба Pénicillium janthinellum Biourge. Морские алкалоиды индолыюго

типа шер...... A (ShA, 57), шерннин Е (ShE, 58) и шеринип D (ShD, 59) были выделены

из заселяющего морские донные осадки гриба Pénicillium janthinellum в лаборатории микробного биосинтеза ТИБОХ. Ранее было показано, что некоторые шернннны обладают инсектицидным действием, а также обладают свойством блокировать натриевые каналы. Мы исследовали ShA, ShE и ShD на цнтотоксическую, канцерпревентивную и проапоптотическую активности и установили, что эти алкалоиды не токсичны в отношении мышиных JB6 С141 Р+ и опухолевых HeLa клеток в дозах до 200 мкМ. Было установлено, что шеринип Е (58) в иецитотоксическпх концентрациях нпгибпрует неопластическую трансформацию JB6 С141 Р+ клеток, стимулированную EGF, и тем самым проявляет канцерпревептивпые свойства. Так, 50% ипгибпроваиие числа колоний в обработанных ShE JB6 С141 Р+ клетках наблюдалось уже при концентрации 13 мкМ, а практически полное ипгибпроваиие роста колоний трансформированных клеток было достигнуто при концентрации ShE 25 мкМ.

шершшн D (59): Н-22, Н-23 - trans Для исследования нроапоптотических свойств шернппиов A, D, Е были использованы клетки лейкемии человека IIL-60 и метод проточной цитометрин. Полученные данные показали, что эти алкалоиды дозозависимым образом индуцируют запрограммированную смерть клеток путем апоптоза. При концентрации 100 мкМ и инкубировании с клетками в течение 24 часов шершшн А вызывает апоптоз в 19%, шерннин Е - в 44%, а шершшн D - в 49% HL-60 клеток, по сравнению с 10% апоптоза в

контрольных клетках. Таким образом, капцерпревентпвную активность шерининов, по крайней мере частично, можно объяснить индукцией аиоптоза в трансформированных пли опухолевых клетках.

Изучение проапоптотической активности 3-оромо- и 10-бромо- фаскаплнзннов. З-Бромо- п 10-бромо- фаскаилнзииы (60 н 61) были недавно выделены из морской губки Fascaplysinopsis reticulata и аецпдин рода Didemmun и затем синтезированы в лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ и на кафедре органической химии ДВФУ. Ранее для этих алкалоидов была известна только цитотоксичсская активность против нескольких линий опухолевых клеток человека и мыши. Нами с помощью проточной цитометрин изучена их проапоптотическая активность па HL-60 клетках.

Было показано, что алкалоиды 60 и 61 могут индуцировать запрограммированную смерть клеток. Найдено, что они индуцируют аноптоз в ПЬ-60 клетках дозозависимым образом. Уже в концентрациях около 500 нМ 3-бромо- и 10-бромофасканлизииы вызывают апоптоз более 50% НЬ-60 клеток.

4. Глабрухннон Л (демстнлубнхнонон (^2) из асциднн АрМшт glabrum и его синтстпчсскне аналоги. Структура, противоопухолевая активность и механизм действия. Из этапольного экстракта дальневосточной аецндии ЛрШИит аЬгит нами выделены два новых дипренилбензохинона, глабрухипоны А (62) и В (63). Структуры выделенных соединений установлены физико-химическими методами. *Н ЯМР спектр глабрухппоиа А похож па спектр вераплихипопа А, выделенного ранее из ЛрИсНшп ер., с тем лишь отличием, что содержит дополнительно типичный для метоксилыюй группы синглст при 4.02 м.д. Квартеты при 61.2 н 61.3 м.д. в 13С ЯМР спектре указывают на присутствие двух метоксильиых групп в структуре 62. Присоединение тернепоидпого фрагмента к С-5, а метоксильиых групп к С-2 и С-3 бензохинопового остатка установлено после детального изучения ЯМР спектров, включая 'Н-'Н-СОБУ, ГТОЕЗУ п ПМВС эксперименты. Сигналы двух трехзамещепных двойных связей, трех метпльпых групп, присоединенных к этим двойным связям, а также трех метнленовых групп в '''С ЯМР спектре ясно указывают на присутствие в структурах 62 и 63 дипреипльпой боковой цени.

Фактически, как было определено на основании химических сдвигов С-10' в "С ЯМР спектрах 62 н 63, эти соединения отличаются друг от друга конфигурацией 2',3' -двойной связи. В £-изомере 62 сигнал метнлыюй группы (С-10', 16.2 м.д.) наблюдается в более сильном поле по сравнению с аналогичным сигналом в 2-изомере 63 (22.76

Вг

ociij

.осн.,

м.д.), что согласуется с литературными данными. Сравнение 'Н ЯМР спектров 62 и 63 показывает, что эти соединения содержат соответственно геранпльный и перильный типы боковой цепи. Можно отметить, что боковые цепи второго типа встречаются в природе редко, а большинство пренилированных бензохиионов, выделенных из морских объектов, имеют гераннльную боковую цепь. Строение 62 и 63 было подтверждено их синтезом из 2,3,4-триметоксибензальдегида.

Очень интересным представляется факт, что глабрухинон А структурно более близко родственен к убихинопам, чем другие линейные полипренилхиноны, выделенные ранее из асцидий н губок. Поскольку глабрухинон А, в отличие от убихинонов, не содержит метальной группы в хиноидном остатке, он может быть назван деметилубихипоном (22.

Цитотоксическая активность глабрухииоиа Л и его синтетических аналогов. Производные глабрухинона А (62), полипрепилированные бензохиноны и гидрохипоны 64-75, были синтезированы так же, как и глабрухинон А.

Исследуемые вещества были разделены на три группы: структурная группа 1 включает в себя вещества, имеющие в своей структуре изопреноидную часть, состоящую из двух изопреновых единиц (глабрухинон А (62) и его синтетические аналоги 64-67), структурная группа 2 - соединения с тремя нзопреповыми единицами (вещества 68-72), структурная группа 3 - с 4-6 нзопреповыми единицами (вещества 7375).

Для оценки цитотоксической активности глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 использовали мышиные 1В6 С141 Р+ клетки и их стабильные трансфектанты Ш6 С141 ОТ-кВ, 1В6 С141 АР-1 и 1В6 С141 р53 клетки, а также опухолевые клетки человека ПТ-460. Полученные значения 1С50 для каждого из исследованных хинопов показаны в табл. 2. В результате исследования всех трех структурных групп хинонов было показано, что вещества 62, 64-75 дозозависимым образом воздействуют на жизнеспособность клеток в широком диапазоне концентраций от нескольких мкМ до нескольких сотен мкМ. Большинство веществ,

входящих в структурную группу 2 обладают более сильной цнтотоксической активностью, чем вещества из структурных групп 1 и 3 (табл. 2).

Таблица 2.1С5п и ИЧСОю глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 по отношению к нормальным мышиным Л36 С141 и опухолевым клеткам человека НТ-

460, НСТ-116 и 5К-МЕЬ-28.

Вещество 1С5Л , мкМ 1КСС,0, мкМ

Л36 Л36С141 ЛВ6С141 НТ- .1В6 С141 Р НТ-460 НСТ-116 5К-МЕЬ-

С141 Р+ ЫИ-кВ АР-1 460 28

Группа 1

1.62 11.4 11.0 20.9 25.8 7.3 50.5 12.7 17.5

2. 64 45.1 29.2 20.3 81.8 15.1 124.1 83.4 46.2

3. 65 8.3 12.3 4.6 30.6 6.6 26.2 38.1 10.5

4. 66 11.8 23.9 20.2 29.1 3.1 30.4 15.9 12.7

5. 67 23.4 25.7 12.7 47.8 14.7 43.2 21.4 20.5

Группа 2

6. 68 5.1 5.4 5.2 18.7 19.4 70.9 26.5 36.1

7.69 4.7 8.0 5.9 27.6 16.7 58.9 22.7 24.6

8.70 8.6 15.9 13.2 22.1 7.4 61.1 17.7 21.2

9.71 25.5 29.0 17.2 72.0 24.6 н/и* 98.6 н/и*

10.72 4.6 4.3 3.6 12.1 51.7 15.2 15.3 8.3

Группа 3

11. 73 >140 >220 >220 >220 29.2 58.7 28.3 40.4

12.74 >15 ц/и* и/и* >100 54.7 198.7 н/и* и/и*

13.75 99.6 85.8 54.7 350 95.3 180.5 112.8 91.2

п.и* - не исследовали

Канцернревентивная активность глабрухинона Л и его синтетических аншюгов. Капцерпревентивпый эффект глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 исследовали методом мягкого агара. Полученные значения 1МСС50 для каждого из изученных хинонов отражены в табл. 2. Было показано, что все исследованные хиноны дозозависимым образом ипгибпруют трансформацию здоровых клеток в опухолевые или рост колоний опухолевых клеток в мягком агаре, причем вещества из группы 1 предотвращают ЕСЕ-ипдуцпрованную опухолевую трансформацию Л36 С141 Р+ клеток в нецнтотоксических концентрациях (табл. 2).

Проапопнюшическая активность глабрухинона А и его синтетических аналогов. Способность глабрухинона А и его аналогов индуцировать в клетках апоптоз исследовали методом проточной цитометрии.

Полученные результаты, показывают, что полипренилхпноны 62, 64-75 дозозависимым образом вызывают апоптоз в Л36 С141 Р* клетках. Кроме того, глабрухипон А индуцирует апоптоз в лимфобластах и опухолевых клетках человека 8К-МЕЕ-28, ПТ-460, НСТ-116 (рис. 15), а также в лейкемических НЬ-60 клетках человека. Тем же методом было показано, что обработка НЬ-60 или ТНР-1 клеток глабрухипоном А в концентрации 30 мкМ приводит к значительному увеличению доли соответствующих суб-0| клеток, что тоже является доказательством индукции апоптоза. Кроме того, индукция глабрухинопом А апоптоза в Л36 С141 Р+ клетках была подтверждена методом «ДНК лестницы». Эти результаты демонстрируют, что глабрухипон А более эффективно действует против клеток мелапомы 8К-МЕЬ-28 и рака кишечника ПСТ-116, чем против клеток рака легких НТ-460.

О 1.25 2.5 5 10 Концентрация глабрухинона А, мкМ

Л36 С141 Р+

-.0111 ¡1 ■ в Й ЙIII

О 7.5 10 12.5 15 20 Концентрация глабрухинона А, мкМ

СЫ 7.5 10 12.5 15 Концентрация глабрух!

Концентрация глабрухинона А, мкМ

Рисунок 15. Индукция глабрухиноном А апоптоза в .1В6 С141 Р+ и .[У клетках, а также в опухолевых клетках человека ЗК-МЕЬ-28, ЫТ-460 и НСТ-116.

Влияние глабрухинона А и его синтетических аналогов на р53-, АР-1- и N1'- кИ-зависимую транскрипционную активность. Известно, что некоторые ядерные транскрипционные факторы, включая белок-супрессор опухолей р53, АР-1 или ОТ-кВ участвуют в индукции или ингибировании апоптоза под действием различных стимулов, в том числе при действии на клетку хемопревентивных или лекарственных препаратов. Мы изучили действие полипренилхинонов 62, 64-75 на эти три транскрипционных фактора.

Таблица 3. Наибольшее активирование или иигибирование АР-1-, ОТ-кВ- или р53-зависимой транскрипционной активности в 1В6 С141 клетках глабрухиноном А (62) и его синтетическими аналогами 64-75.

Вещество Транскрипционная Вещество Транскрипционная

активность, в % от контроля активность, в % от контроля

АР-1 ОТ-кВ р53 АР-1 ОТ-кВ р53

Группа 1 Группа 2

62 190.3 216.9 71.7 68 125.0 99.2 24.6

69 97.2 138.8 57.9

64 159.8 194.8 55.8 70 252.2 223.0 26.9

71 107.7 179.3 31.5

65 293.3 197.9 36.3 72 84.0 403.5 22.8

Группа 3

66 721.7 201.2 31.8 73 139.5 225.7 н/и*

74 и/и* н/и* н/и*

67 880.7 421.7 47.0 75 198.5 549.7 36.5

Результаты, представленные в табл. 3, отражают наибольшие значения активирования или ннгибнрования транскрипционной активности ядерных факторов хипонами 62, 64-75. Эти результаты свидетельствуют о том, что полипреиилхинопы 62, 64-75 вызывают значительное (до 8-ми раз) увеличение базовой АР-1- или NF-kB-завпснмой и ингибирование (до 4-х раз) р53- зависимой транскрипционной активности. Таким образом, паше исследование предполагает, что апоптоз, индуцируемый полинреиилхинопами 62, 64-75, происходит независимо от активирования белка-супрессора опухолей р53, но может быть связанным с активированием ядерных транскрипционных факторов АР-1 и NF-kB.

Зависимость биологической активности глибрухиноиа А и его синтетических аналогов от их химической структуры. Полученные результаты показывают, что биологическая активность полппрепилхиионов 62, 64-75 зависит от длины терпепоидпых боковых цепей. Статистический анализ данных из табл. 2 показывает, что при увеличении длины полннреиилыюй части молекул полппрепилхиионов от 2 до 3 нзопреповых единиц, цитотоксическая активность соединений увеличивается, но при дальнейшем увеличении до 4-6 единиц - резко уменьшается.

При статистическом анализе результатов ннгибнрования полипрепилхипонами 62, 64-75 опухолевой трансформации JB6 С141 Р+ клеток (см. табл. 2) было найдено, что хипопы пз группы 1 обладают наиболее сильной капцерпревентивной активностью по сравнению с хипонами из групп 2 или 3, а хиионы из группы 3 наименее активны среди всех трех групп хпнонов. Затем, мы сравнили данные по цнтотокснческой активности (1С5о, JB6 С141 Р+ клетки) изученных нолнпрепилхппопов 62, 64-75 (табл. 2) с данными по их капцерпревентивной активности (INCC5n, JB6 С141 Р+ клетки). Было найдено, что хиионы из группы 1 пнгибпруют трансформацию JB6 С141 Р+ клеток в нецптотокспческих концентрациях и потенциально могут быть использованы в качестве канцерпревентивных препаратов, в отличие от хинопов из группы 2.

Памп также было показано, что канпериревептивпая активность полппрепилхнпопов зависит от положения метоксплыюп группы по отношению к терпеноидноп боковой цепи в молекуле. Мы выбрали несколько пар структурно похожих хпнонов, которые имеют метоксильные группы в одинаковых положениях. Такими нарами были: орто-аналоги, хиионы 64 и 71; л/стая-апалогп, хиионы 65 и 69 и /;яря-апалоги, хпноиы 66 и 70. Основываясь на данных из табл. 2 и 3 , можно сделать вывод, что капнерпрсвентнвная и АР-1-завпсимая транскрипционная активности хппопов возрастают в ряду орто-мета-пара-йпалогов. В свою очередь среди пара-аналогов 66 и 70 наиболее активным является 66, имеющий в боковой цепи две изопреповые единицы.

Ингибирование глабрухнноном А роста солидной карциномы Эрлиха íh vivo. Ингибирование глабрухнноном А роста солидной карциномы Эрлиха изучали ш viva методом магнптио-резопансноп томографии с использованием белых нелинейных мышей с привитой карциномой Эрлиха. Глабрухинон А растворяли в смесях растворителей DMS0-II20, 1:1 или EtOH-HiO, 1:1. Обработку мышей веществом начинали за день до (канцсриревентивпый эффект) пли через сутки после таисилаптацпп опухоли (терапевтический противоопухолевый эффект).

Результаты изучения показаны на рис. 16 как процент ннгибнрования роста опухоли в зависимости от времени воздействия глабрухииона А. Показано, что рост солидной карциномы Эрлиха в мышах ннгибируется па 50% после превентивной инъекции глабрухииона А в концентрации 30 мг/кг (LD5(I = 35 мг/кг), растворенным в 50% DMSO или 50% ЕЮН (рис. 16 А или 16 Б соответственно). Когда глабрухинон А используют в

той же концентрации в качестве терапевтического препарата, через сутки после инокуляции опухоли, ингибированне роста опухоли составляет 20-25% (рис. 16 В).

Дни после инокуляции опухоли

Рисунок 16. Ингибированне глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха ш vivo.

Кроме измерений опухоли, проводили также наблюдение этим же методом за состоянием печени, селезенки и тимуса при жизни мышей, и не было обнаружено никаких значительных отклонений в размерах, виде, общем состоянии этих иммунокомпетентных органов у мышей, обработанных глабрухиноном А по сравнению с контрольными необработанными мышами. Эти результаты свидетельствуют, что даже относительно высокие дозы глабрухинона А не имеют отрицательного эффекта на иммунную систему мышей.

Таким образом, изученные полипренилированные 1,4-бензохиноны и гидрохиноны обладают некоторым потенциалом в качестве канцерпревентивных веществ, а также демонстрируют противоопухолевые свойства ш vivo. Эти вещества вызывают р53-независимый апопотоз опухолевых клеток и являются эффективными активаторами ядерных транскрипционных факторов АР-1 и NF-кВ. Наиболее активные из них. по нашему мнению, могут быть применены в этом качестве при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии. Принимая во внимание, что изученные полипренилхиноны предупреждают злокачественное перерождение эпидермальных JB6 клеток и проявляют наибольшую активность против клеток рака кожи человека SK-MEL-28 (меланома), мы предполагаем, что некоторые из изученных хинонов могут быть использованы непосредственно или в качестве моделей для синтеза на их основе канцерпревентивных веществ, активных в отношении рака кожи человека.

5. Противоопухолевые свойства и механизм действия морского двухголового сфннголипида ризохалина, его производных и аналогов

Сфипголипиды привлекают внимание как противоопухолевые вещества из-за их способности регулировать процессы клеточного роста, дифференциации и апоптоза.

Эти вещества находятся в клеточных мембранах эукарнотпчсских организмов, в том числе морских беспозвоночных, которые являются богатым источником сфнпголипидов и сфинголппид-подобных соединении, различающихся структурами и биологической активностью.

Со времени выделения в пашей лаборатории в 1989 году необычного двухголового (биполярного) сфпнголнпнда ризохалипа (76) было обнаружено несколько его природных аналогов. До настоящего времени эти редкие природные соединения были найдены только в морских губках. Двухголовые сфппголипнды отличаются от классических сфипголипидов а,со-положением фрагментов, сходных по строению с полярными концевыми группами сфипгондпых оснований. Часто они содержат терминальные метильные группы вместо гидроксиметильпых. Известно, что ризохалин и его аих'юги обладают противомпкробиой и противогрибковой активностями, а также являются ДНК-повреждающими агентами и могут ингибировать протеин киназу С и блокировать биосинтез фитосфипголиппдов.

Мы изучили капцерпревеитивную, апоптоз-индуцпрующую и цитотоксическуго активности ризохалипа (76) и его аналогов и производных (77-82), а также некоторые детали молекулярного механизма действия этих веществ.

76 Ризохалин

77 Псрацотат ризохалипа

И, = а, = Из = Нл = Я5 = Н

ОН ^

о Ас о Ас

ОЛс у

78 Лгликон ризохалина (ризохалинин) И, = ОН

79 Псрацстат агликона ризохалина И, = ОАс

0, = Н3 = Н4 = Ас Р5 = Н

80 Ризохалинин А

Р, =ОН

В2= Х^С

^сн.

рз = П4 = В5=Н

ОМе

82 ОцоаналинА

Канцерпревситивиые и цитотоксичсские свойства ризохалина, его производных и аналогов. Полученные памп результаты показывают, что ризохалин демонстрирует потенциальные капцерпревептивпые свойства уже при концентрациях 5-10 мкМ. Так, 50%-иое шшгибировапне ЕСР-ппдуцироваппого колонеобразовапня Л36 С141 Р+

клеток достигается при концентрации ризохалнна 1КТСС50 = 8.6 мкМ. Похожие эффекты наблюдались в экспериментах, в которых ризохалнн или его агликои ингибировали колонеобразоваиие нескольких линий опухолевых клеток в мягком агаре. К примеру,' ШСС50 для ингнбирования ризохалипом колопеобразования НеЬа или ТНР-1 клеток, составили 12.6 или 5.4 мкМ соответственно. Агликои ризохалнна (78) ингибировал колонеобразоваиие 8МЫ-С4 клеток при значительно меньших концентрациях, его 1КСС50 = 1.7 мкМ. Напротив, один из аналогов ризохалипа, оцеапалин А (82), будучи протестирован в экспериментах с мягким агаром, не ингибировал ни злокачественную трансформацию Л36 С141 Р+ клеток, ни колоиеобразовапие раковых НеЬа или ТНР-1 клеток вплоть до концентрации 20 мкМ.

Агликои ризохалнна (78) имеет свободные гидроксильные группы на а- и (й- концах молекулы, в то время как исходный ризохалнн (76) - только па со-конце. В случае же оцеаналпна А, со-конец молекулы имеет тетрагпдроизохиполиновое строение, в отличие от внципалыюго аминоспирта в ризохалнпе. По-видимому, этим и обусловлен тот факт, что по своей канцериревентивной активности эти три вещества могут быть записаны в виде ряда: агликон ризохалнна (78) > ризохалнн (76) >оцеаналин А (82).

Была изучена цнтотоксическая активность рнзохалппа, а также его производных и аналогов по отношению к 1В6 С141 Р+, НеЬа, НЬ-60 или ТНР-1 клеткам. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 4. После сравнения полученных данных с результатами экспериментов па капцерпревентпвпую активность был сделан вывод о том, что ризохалнн демонстрирует каннерпревеитивные свойства против НеЬа или ТНР-1 клеток в малоцитотоксических концентрациях. В случае 1В6 С141 Р+ клеток активные концентрации ризохалнна приблизительно одинаковы в экспериментах на капцсрпревептивную и цитотоксическую активности.

Также как и в экспериментах по капцернервентивной активности, наибольшую цитотоксическую активность проявил агликон ризохалнна (78), а также его аналоги, рнзохалипнпы А и С (80 и 81), являющиеся агликоиами рнзохалинов А и С. Наименьшую же активность показали перацетат ризохалнна (77), оцеаналин А (82) и перацетат агликопа ризохалнна (79), расположенные здесь в порядке убывания цитотоксической активности.

Таблица 4. Цнтотоксическая активность (1С5о, мкМ) соединений 76-82.

Соединение 1В6Р* С141 НеЬа НЬ-60 ТНР-1

Ризохалнн (76) 8.8 22.1 14.4 13.6

Перацетат ризохалнна (77) н/и* н/и * 29.2 26.8

Агликои ризохалнна (78) 2.8 8.5 3.8 3.2

Перацетат аглнкона ризохалнна (79) >30 >30 >30 63.3

Рнзохалинин А (80) и/и* н/и* н/и* 7.5

Ризохалиипи С (81) н/и* н/и* н/и* 6.7

Оцеаналин А (82) 27.9 и/и* н/и* 44.9

и.и* - цнтотоксическая активность не изучалась

В наименее активных соединениях (77, 79, 82), по сравнению с наиболее активными агликоиами (78, 80, 81), гидроксильные группы па а,(»-концах молекул либо гликозилироваиы, либо ацетилироваиы, либо, как в оцеаиалппе А, со-коиец молекулы не содержит вицнналыюго аминоспирта. Вероятно, гидроксильные группы на а- и а> коицах молекул играют важную роль в ингнбированпи клоиогенного эффекта опухолевых промоторов ризохалипом, его производными и аналогами.

МТ8 метод и доминаит-иегатнвпо-мутаитные (ЭКМ) 1Вб С141 клетки были использованы для изучения влияния ризохалппа и его аналогов па основные МАР-киназпые (ЕЯКв, ЖКя, и р38) сигнальные пути в .1В6 С141 клетках. Показано, что ризохалии (рис. 17 А) и оцеаналин А (рис. 17 Б) проявили значительно большую цнтотоксическую активность по отношению к ЛВ6 С141 БМ-Е11К2 или 1В6 С141 1МК1 клеткам, чем к 1В6 С141 Б1Ч-р38 или к исходным, иемутаптпым 1В6 С141 клеткам. Кроме того, ГО6 С141 БМ-р38 и 1В6 С141 Р+ клетки показали примерно одинаковую чувствительность к действию ризохалина (рис. 17 А); эти же выводы можно сделать и по отношению к оцеаналину А (рис. 17 Б).

120 п

иВ6Р+С141 —С141 ОЫ-р38 -А— ивб С1 41 ОМ-ЕЯ!« ■ - ивб С141 0М-,МК1

3.75 7.5 15 Концентрация ризохалина, мкМ

18.75 37.5 Концентрация оцеаналина А, мкМ

Рисунок 17. Цитотоксическая активность ризохалина (А) и оцеаналина А (Б) по отношению к различным Л36 С141 ОЫМ клеткам, а также исходным 1В6 С141 Р+ клеткам.

Полученные результаты показывают, что по всей вероятности, ЖК и ЕЯК сигнальные пути участвуют в ответе №6 С141 клеток на воздействие ризохалина или оцеапалипа.

Индукция ризохалином, его производными и аналогами апоптоза опухолевых клеток человека. Методом проточной цнтометрпи было установлено, что ризохалин вызывает дозозависимый апонтоз НЬ-бО или ТНР-1 клеток с 1АС50 (концентрация, вызывающая апонтоз 50% экспериментальных клеток) 19.4 или 6.5 мкМ соответственно. Таким образом, ризохалин проявляет избирательность по отношению к некоторым опухолевым клеткам и является в три раза более сильным индуктором апоптоза в клетках моноцитариой лейкемии человека ТНР-1, чем в клетках промиелоцптарпой лейкемии НЬ-60. Аглнкон ризохалина (82) является наиболее активным среди исследованных соединений (1АС50 = 6.0 мкМ), а перацетат агликопа ризохалина (83) - наименее активным (1АС50 = 62.0 мкМ). Перацетат ризохалина (81) в этих экспериментах показал примерно такую же активность (1АС50 = 19.2 мкМ), как и ризохалии (1АС50= 19.4 мкМ).

С помощью метода проточной цнтометрпи мы оцепили количество НЬ-60 клеток, находящихся в фазе суб-в) после воздействия на них агликонов ризохалина (82) и ризохалина А (84) в концентрации 10 мкМ. Появление суб-диплоидного ДНК пика (суб-С[ пик) является специфическим маркером апоптоза; некроз, индуцируемый цитотокепчеекпми веществами или лизис клеток, производимый комплементом, не приводят к появлению суб-С| пика на ДНК гистограмме. Было показано, что количество суб в, клеток, по сравнению с контрольными, необработанными клетками, возросло после воздействия агликопа ризохалина в 24 раза, а после действия агликопа

ризохалина А - в 26 раз, что является дополнительным подтверждением индукции апоптоза агликонами ризохалина (82) и ризохалина А (84) в НЬ-60 клетках лейкемии человека.

Методом вестерн блоттиига было показано, что ризохалин (80), а также агликопы ризохалина (82) и ризохалина А (84) в концентрации 10 мкМ вызывают активирование каспаз-8, 9, 3 и про-апоптотических белков РАКР и В1с1 (рис. 18). Следовательно, ризохалин, его производные и аналоги вызывают апоптоз опухолевых клеток человека, в котором участвуют оба каспаза-зависимых пути: митохоидриальиый путь (через каспазу-8) и путь через рецепторы смерти (участвует каспаза-9).

(КДа) д Б В Г Д Е

58 56

18 | 46 '

32 ! 34 I

19 17

116

89 22

Прокаспаза- 8

Каспаза- 8 Прокаспаза- 9 Каспаза- 9 Прокаспаза- 3

Каспаза- 3

РАГ=Р

В1с1

(5- Актин

Рисунок 18. Влияние ризохалина (Б), агликона ризохалина (В), перацетата ризохалина (Г), перацетата агликона ризохалина (Д) и агликона ризохалина А (Е) па внутриклеточные уровни каспаз-8, 9, 3 и проапоптотических белков РАЯР и В1с1 в лейкемических НЬ-60 клетках человека. (А) - контрольные, необработанные клетки.

Индукция ризохалином и его агликоиом базовой р53-зависимой транскрипционной активности в ]В6 С141 клетках. Для того чтобы выяснить возможный механизм канцерпревентивнго действия ризохалина и его аналогов, был исследован эффект ризохалина (80) и его агликона (82) на р53-зависимую транскрипционную активность в 1В6 С141 р53 клетках (рис. 19А, В). Кроме р53-зависимой транскрипционной активности, было также изучено действие ризохалина (80) и его агликона (82) на жизнеспособность №6 С141 р53 клеток (рис. 19Б, Г). В результате экспериментов было показано, что ризохалин (рис. 19А) или агликон ризохалина (рис. 19В) в концентрациях 5-10 или 1.25-2.5 мкМ, соответственно, дозо- и время-зависимым образом индуцируют р53-зависимую транскрипционную активность в №6 С141 клетках. Таким образом, наши результаты показывают, что ризохалин (80) и его аналоги (81-86) представляют собой новую группу морских вторичных метаболитов, перспективных в качестве противоопухолевых и канцерпревентивных веществ. Капцерпревеитивпые эффекты ризохалина, его производных и аналогов могут объясняться, по крайней мере отчасти, индукцией в раковых клетках р53-зависимого апоптоза. Показано также, что по всей вероятности, ДОК и ЕГ1К сигнальные пути участвуют в ответе №6 С141 клеток на воздействие ризохалина и его аналогов.

О 1.25 2.5 5 10 Концентрация агликона ризохалина, мкМ

Рисунок 19. Индукция ризохалпмом (Л) или аглнконом ризохалина (В) базовой р53-зависимон транскрипционной активности в JB6 С141 р53 клетках. Воздействие ризохалина (Б) или агликона ризохалина (Г) на жизнеспособность JB6 С141 р53 клеток после 6 или 24 часов

инкубирования с веществами.

6. Противоопухолевая активность и механизм действия актннопорнна RTX-A из актшпш Ileteractis crispa (=Radianthus macrodactylus)

В 2002 году из тропической актинии Ileteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) сотрудниками лаборатории химии пептидов ТПБОХ были выделены три изоформы пептидных токсинов актнпопорипов, RTX-A, RTX-S, и RTX-G. Были установлены их мощная гемолитическая активность и иигибирование этой активности сфппгомиелином.

Мы установили, что RTX-A в экстремально низких концентрациях защищает клетки от действия опухолевых промоторов, продемонстрировали его апоптоз-ипдуцнрующнй и цнтотокепчекий эффекты по отношению к нескольким линиям опухолевых клеток человека, а также изучили некоторые детали молекулярного механизма противоопухолевого действия этого полппептпда.

Капцерпревептивчая и цшнотоксическая активности актиопорина RTX-A. Исследование канцерпревентивных свойств RTX-A было проведено с использованием мышиных эппдермальных JB6 С141 Р+ клеток, опухолевых клеток человека HeLa и метода мягкого агара при их обработке EGF. Наши эксперименты показали, что RTX-A предотвращает EGF-нндуцпроваппую опухолевую трансформацию JB6 С141 Р+ клеток и ингнбирует колопсобразовапие раковых клеток HeLa в мягком агаре с INCC50 = 0.03 4 пМ н 0.057 иМ соответственно. Эти концентрации, соответственно, в 17 и 50 раз меньше цитотокснческих (табл. 5).

Таблица 5.1С5(> и 1МСС5() ЯТХ-А по отношению к нормальным мышиным Л36 С141 Р+ клеткам, а также НеЬа, ТНР-1, БЖМХ МОА-МВ-231 и НЬ-60 опухолевым клеткам

человека.

Клеточная линия ICjo, нМ INCQm.hM

HeLa 2.26 0.057

ТНР-1 1.11

SNU-C4 4.66

MDA-MB-231 4.64

HL-60 1.06

JB6 С141 Р+ 0.57 0.034

RTX-A демонстрирует мощную цитотоксическую активность (1С50 = 1-5 нМ) по отношению к опухолевым HeLa, ТНР-1, SNU-C4, MDA-MB-231n HL-60 клеткам человека (табл. 5).

Проапоптотическая активность актинопорина RTX-A. Эксперименты с использованием проточной цитометрии показали, что RTX-A индуцирует апоптоз в JB6 С141 Р+ клетках. Так, после обработки клеток этим актинопорином в концентрациях от 0.125 до 1 нМ в течение 24 часов, был зафиксирован апоптоз клеток, зависимый от концентрации RTX-A. Результаты отражены на рис. 24 в виде процентного содержания клеток, находящихся в раннем (нижний правый квадрант) и позднем (верхний правый квадрант) апоптозе (рис. 20).

Контроль 0.125нМ 0.25 нМ 0.5 нМ 1.0 нМ

Аннексии У-Р1ТС

Рисунок 20. Индукция ИТХ-А апоптоза в }В6 С141 Р+ клетках. Здесь и в последующих рисунках этого типа ранний апоптоз показан в нижних правых квадрантах; поздний - в

верхних правых.

Влияние актинопорина КТХ-А на АР-1-, NF-кB- и р53-зависимую транскрипционную активность в ]В6 С141 клетках. Для того чтобы изучить возможный механизм противоопухолевого действия актинопорина, были исследованы эффекты RTX-A па базовую АР-1-, ОТ-кВ- и р53-зависимую транскрипционную активность, а также на жизнеспособность в соответствующих .Ш6 С141 клетках через 6 и 24 часа инкубирования клеток с RTX-A. Наши результаты демонстрируют, что RTX-А в концентрациях 0.1-1.6 нМ время- и дозозависимым образом ипгибирует базовую АР-1, ОТ-кВ, и р53-зависимые транскрипционные активности в .ГВ6 С141 клетках, указывая на то, что апоптоз, индуцируемый RTX-A в Ш6 С141 клетках, может не зависеть от р53 ядерного фактора. Этим можно объяснить тот факт, что RTX-A в таких малых концентрациях (1нМ) демонстрирует цитотоксическую активность по отношению к р53-дефицитным лейкемическим ТНР-1 и НЬ-60 клеткам человека.

На основании полученных экспериментальных данных можно сделать заключение, что каицерпревептивная и противоопухолевая активности RTX-A могут быть объяснены, по крайней мере частично, индукцией р53-независимого апоптоза и

ипгибнровапием активности онкогенных АР-1 н ОТ-кВ ядерных факторов транскрипции.

7. Противоопухолевая активность н механизм действии 5-гндроксн-7-проп-2-ен-(Е)-нл11ден-7,7а-днгндро-211-цпк-лопента[Ь1ннран-6-она (дносфснола) из аснилнн О1р1о5ота ер.

5-Гидроксп-7-нро11-2-ен-(Е)-нлндеп-7,7а-дигндро-2Н-циклопепта[Ь1пирап-6-он (диосфенол, 87), выделенный в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ, относится к классу Си циклопептепопов и известен как природное соединение, обладающее антимикробными и цитотокснческимп свойствами.

НО

Однако его каицериревентивное действие не было ранее исследовано. Нами были изучены канцериревептивпые и проапонтотические свойства диосфенола (87), а также его воздействие на основные МАРК-сигпальпые пути в 1В6 С141 клетках.

Каицерпревеитивная и цитотоксическая активности диосфенола. Результаты исследования канцерпрсвептпвной активности приведены па рис. 21 А (снимки колонии трансформированных 1В6 С141 Р+ клеток) и Б (зависимость количества колонии трансформированных ]Вб С141 Р+ клеток от концентрации диосфенола (87)). Наши эксперименты показали, что 87 на 50% ипгпбпрует ЕвЕ-индуцироваиную опухолевую трансформацию 1В6 С141 Р+ клеток в мягком агаре уже при ПЧСС50 = 6.8 мкМ (рис. 21 А, Б). Эта концентрация в 3 раза меньше цитотоксической, ГС50 = 21.5 мкМ (рис. 21 В).

Индукция анонтоза диосфеполом в опухолевых клетках человека. Мы показали, что диосфенол в пределах концентраций 5-50 мкМ индуцирует дозозависимый апоптоз в клетках лейкемии человека ПЬ-60 и ТНР-1. Уже при концентрации диосфенола 10 мкМ и времени его инкубирования с клетками равном 24 час около 40% НЬ-60 клеток находились в состоянии анонтоза, из них только около 10% клеток показывали ранний апоптоз. Как показали дальнейшие эксперименты, для достижения примерно такого же, в количественном отношении, апоптоза в ТПР-1 клетках, их необходимо было обработать 30 мкМ диосфенола, при этом большинство клеток находились в состоянии раннего апоптоза. Таким образом, диосфенол является гораздо более сильным индуктором апоптоза по отношению к НЬ-60, чем к ТНР-1 клеткам лейкемии человека. Для того, чтобы подтвердить индукцию апоптоза диосфеполом (87), было изучено его влияние на количество ТНР-1 клеток, находящихся в фазе суб-С|. Появление суб-днилоидпого ДНК пика (суб-С| пик) на ДНК гистограмме является характерным признаком апоптоза и дает возможность отличить его от некроза. В наших экспериментах было показано, что обработка диосфеполом в концентрациях 25 или 50 мкМ приводит к увеличению количества ТНР-1 клеток в фазе 5иЬ-С| в 2 или в 5 раз, соответственно, по сравнению с контрольными, ничем не обработанными клетками (рис. 22). В качестве положительного контроля были использованы ТНР-1 клетки, обработанные ДМСО в концентрации 50 мкл на 1 мл среды.

А Щ Ш1 * ■ щррр • • * ш Ъ . - Л:/ « « . » ' ^ . в ♦ » в * t : • iliжшшж • - ' * . ...» <

EGF Диосфенол 0 0 Е 10 нМ 0 10 нМ 1 мкМ к 10 нМ 5 мкМ В

эщ» я*

10 нМ 10 мкМ

120 -100 -

111.

EGF, нМ 0.0 Диосфснол, мкМ

21.

ю.о 0.0

10.0 10.0

Рисунок

диосфенолом

Ингибирование

трансформации JB6 С141 Р+ клеток в мягком агаре (А, Б), жизнеспособности JB6 С141 Р+ клеток (В)

Концентрация диосфенола, мкМ

EGF-ипдуцированной опухолевой Ингибирование диосфенолом

Контроль

ДМСО Контроль

Диосфснол, мкМ

Рисунок 22. Индукция диосфенолом популяции cy6-G| ТНР-1 клеток.

Роль МАРК сигнальных путей в цитотоксическом действии, индуцированном диосфенолом. Для изучения роли основных MAP кипаз в опосредовании цитотоксического действия диосфенола были использованы домипант-негативно-мутантные (DNM) JB6 С141 клетки и MTS метод. Клетки обработали диосфенолом в пределах концентраций от 3 до 30 мкМ. Полученные результаты показали, что в концентрациях от 7.5 до 15 мкМ диосфенол проявляет значительно более сильную цитотоксическую активность по отношению к JB6 С141 DNM-p38 или JB6 С141 DNM-JNK1 клеткам, чем к JB6 С141 DNM-ERK2 или к исходным, немутантным JB6 С141 клеткам, показавшим примерно одинаковую чувствительность к действию диосфенола.

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что: 1) диосфенол обладает каицерпревентивной активностью в субцитотоксических концентрациях; 2) канцерпревеитнвное и противоопухолевое действие диосфенола обусловлено индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках; 3) по всей вероятности, МАРК JNK и р38 сигнальные пути участвуют в ответе клеток на воздействие диосфенола.

8. Канцсрнрсвснтнвная п противоопухолевая активности н механизм действия некоторых тритерпеновых гликозидов из голотурий

Голотурии пли морские огурцы традиционно используются в качестве пищи в юго-восточной Азии, а в последние годы в США, России н других странах. Эти беспозвоночные содержат в больших количествах трнтерпеновые гликознды, обладающие широким спектром биологических активностей, в том числе противоопухолевой активностью. Активность этих веществ, взятых в дозах от десятых долей микрограмма до нескольких микрограммов в миллилитре, направленная против различных видов раковых клеток, описана в большом числе научных статей, однако канцернревептивная активность гликозидов нз голотурий до сих пор не была изучена. Мы изучили капцерпревентивную и противоопухолевую активности in vitro, а также механизм действия некоторых тритерпеновых гликозидов, выделенных в лаборатории химии морских природных соединений из голотурий семейств Cucumariidae, Stichopodidac, Psolidae, Holothuriidae 11 Synaptidae.

Канцерпревснтивная и цшпотокснческая активности некоторых тритерпеновых гликозидов, Капцериревентнвный эффект фрондозида A (FrA, 88) из

Cucumaria frondosa, кукумариозида А2-2 (89) из Cucumaria japónica, стихопозпдов С и D (STC и STD, 90 н 91) из Stichopus chloronotus, а также псолюсознда A (PSA, 92) из Psoitis fabricii исследовали методом мягкого агара с использованием JB6 CI41 Р+ клеток, активированных с помощью EGF (10 нг/мл) или 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетата (ТРА, 20 иг/мл). Было показано, что все исследуемые гликознды в субмикромолярных дозах обладают капцерпревептнвпой активностью in vitro, которая зависит как от концентрации гликозида, так и от его химической структуры. Если сравнивать структуры FrA н А2-2, выделенных из голотурий семейства Cucumariidae, то более активный FrA (INCC50 = 591.9 нМ) отличается от менее активного А2-2 (INCCM, = 861.1 нМ) как по агликону, так и по углеводной части. При сравнении двух других исследуемых гликозидов, STC и STD, выделенных из Stichopus chloronotus, видно, что более активный STC (INCC50 = 73.6 нМ) отличается от менее активного STD (INCC50 = 300.3 11M) лишь наличием в углеводной части остатка хиповозы вместо одного из остатков глюкозы. Пятый из исследованных гликозидов, псолюсозид А, выделенный из голотурии семейства Psolidae, показал INCC50 = 358.6 нМ.

Сравнение капцерпревептнвпой активности гликозидов с их цитотоксической активностью (табл. 5) по отношению к JB6 CI41 Р+ клеткам показывает, что капцерпревептивиую активность все 5 упомянутых гликозидов проявляют в концентрациях, в которых цитотоксический эффект не значителен. Особенно можно выделить FrA и А2-2, для них действующие канцернревентивпые концентрации (INCCjo) в 7 11 в 4 раза, соответственно, меньше цнтотокснческнх (1С50)- Два из пяти гликозидов, а именно FrA и STD, были исследованы также на ингибирование трансформации JB6 С141 Р+ клеток, индуцированной действием форболового эфира ТРА. В этих экспериментах FrA и STD на 100% ингибировали ТРА-индуцированную трансформацию JB6 CI41 Р+ клеток уже при концентрации INCCioo = 300 нМ. Таким образом, капцерпревеитивная активность трнтерпеповых гликозидов зависит не только от их структуры и концентрации, но и от природы промотора канцерогенеза.

Цитотокснческая активность по отношению к JB6 С141 Р+ и к опухолевым клеткам HeLa была исследована для гликозидов 88-105, выделенных из голотурий семейств Cucumariidae, Stichopodidae, Psolidae, Holothuriidae и Synaptidae (табл. 5).

Общими выводами в части установления закономерностей в соотношении структура - активность исследуемых гликозидов, которые можно сделать из рассмотрения полученных данных, являются следующие: 1) каицерпревентнвная и цитотокснческая активности гликозидов увеличивается при замене одного из остатков глюкозы на остаток ксилозы, например, активность STC (90) > STD (91); 2) чем больше сульфатных групп содержится в углеводной части молекулы гликозида, тем большую цптотоксичсскую активность он проявляет, например, активность уменьшается в ряду A7-I (97) > А6-2 (96) > А2-2 (89) > A2-2DS (93); а также OkhB2 (99) или OkhB, (100) > OkliB, (98); 3) аглнкопы гликозидов па несколько порядков менее цитотоксичны, чем сами гликознды (см. AglA2-2 (94) и А2-2 (89)); 4) гидроксилироваиие по 12-му положению в тритерпеновой части молекулы приводит к уменьшению цитотоксической активности гликозида, например активность BohB (105) > BohA (104); и 5) введение в положение 7 аглнкониой части молекулы карбонильной группы, сопряженной с 8(9)-двойной связью, вместо 7(8)-двойиой связи, приводит к уменьшению цитотоксической активности гликозида, например активность SynA (101) > SynA, (102).

Таблица 5. IC5n тритерпеиовых гликозпдов mm их производных 88-105 по отношению к нормальным мышиным JB6 С141 Р* и опухолевым клеткам человека

HeLa н HL-60.

Вещество № 1С™. MKM

JB6C141 P" HeLa HL-60

FrA (88) 4.16 1.53 0.45

А2-2 (89) 3.53 1.44

Ar2DS (93) 7.60 - -

AglAr2 (94) 232.64 - -

А4-2 (95) - - 1.46

Afi-2 (96) 1.90 - -

Ayl (97) 1.27 - -

STC (90) 0.11 - 0.07

STD (91) 0.67 - 0.66

PSA (92) 0.57 - -

OkhB, (98) - ■ 24.20 -

OkhB2 (99) - 9.28 -

OkhB, (100) - 12.67 -

SynA (101) - 6.12 -

SynA, (102) - > 10 -

HtxAl (103) 0.82 - -

BohA (104) 0.14 - -

BohB (105) 0.06 - -

* - не исследовали

Проапонтотическая активность некоторых гликозпдов из голотурий семейств Cucumariidae и Sticliopodidae. Мы исследовали индукцию аноптоза гликозидами А2-2 (89), Aj-2 (95), STC (90) и STD (91) в HL-60 опухолевых клетках человека методом проточной цптометрнн. Клетки были обработаны соответствующими гликозидами в пределах концентрации от 100 до 1000 пМ. Паши эксперименты показали, что все 4 глпкозида после инкубирования с HL-60 клетками в течение 24 часов индуцируют в клетках дозозависимый апоптоз. Кукумарнозиды А2-2, А4-2, а также стихопозид STD в концентрациях 500-1000 пМ вызывают апоптоз от 30 до 80% процентов клеток, в то время как более активный стихопозид STC уже при концентрации 100 пМ индуцирует запрограммированную гибель более 60% HL-60 клеток. Менее активный STD индуцирует апоптоз около 65% HL-60 клеток лишь в концентрации 1000 нМ.

ГГ8-.Г 3.9%

..-•г*.-

82.3%

12.0%

1 j 3.9%

82.3%

12.0%

100

Ti.7%; 5.6"/i

200

500

1000

f 37 4°

'2.3% I

i Л

|28 3%

JT3-^8.3°,

54 9-

-J

! 35 8"

80 7%

Il.8% f 3.I l

73 3"«

} .W

l0 74

421.5'

. Г

'J —

jf.r1 427%

(hM)

STC

STD

Аннексии V-FITC

Рисунок 23. Индукция апоптоза гликозидами STC (90) и STD (91) в ТНР-1 клетках лейкемии человека.

Кроме того, была показана индукция апоптоза стихопозидами STC и STD в лейкемических ТНР-1 клетках. И в этих экспериментах STC оказался более сильным индуктором апоптоза, чем STD (рис. 23).

Влияние тритерпеповых гликозидов FrA, STD и PSA па транскрипционную активность онкогенных АР-1 и NF-кВ ядерных факторов. Мы исследовали влияние трех из пяти гликозидов, для которых была показана канцерпревентивная активность (FrA (88), STD (91) и PSA (92)), на EGF и UVB-индуцнрованную транскрипционную активность опкогеиного АР-1 ядерного фактора. Как следует из полученных результатов, два из трех исследованных гликозидов, FrA и STD, в концентрациях, хорошо согласующихся с концентрациями, в которых они проявляют канцерпревеитивпую активность, ингибируют транскрипционную активность АР-1 ядерного фактора. Так, фрондозид FrA в концентрациях 500-800 пМ нпгибирует EGF-ипдуцпрованиую транскрипционную активность АР-1 ядерного фактора на 34-51%, соответственно, а стнхопозид STD в концентрации 300 нМ - па 57%. Точно также оба гликозида ингибируют UVB-индуцированную транскрипционную активность АР-1 ядерного фактора: FrA в концентрации 500 нМ - па 41%, а STD в концентрации 250 нМ - на 45%. В то же время псолюсозид PSA в этих экспериментах не активен вплоть до концентрации 500 нМ.

Было исследовано также влияние FrA, STD и PSA на EGF и UVB-индуцнрованную транскрипционную активность опкогеиного NF-кВ ядерного фактора. Показано, что все 3 исследованных гликозида в концентрациях, в которых они проявили каниерпервептивпую активность, ингибируют EGF-индуцированнуго

транскрипционную активность NF-кВ ядерного фактора: FrA в концентрации 500 нМ -на 37%, STD в концентрации 500 нМ - на 36% и PSA в концентрациях 300-500 нМ - па 22-25%. В то же время, только два из исследованных гликозидов, (STD и PSA), ингибируют UVB-нндуцированную активность ядерного фактора NF-кВ: STD в концентрации 500 нМ - на 46% и PSA в концентрации 600 нМ - на 49%. Таким образом, можно сделать вывод о том, что канцерпревентивная и противоопухолевая активность тритерпеповых гликозидов из голотурии могут быть объяснены, по крайней мере частично, индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках и ингибированием онкогенных АР-1 и NF-кВ ядерных факторов транскрипции. Исследованные глпкозиды могут быть применены в качестве ингибиторов транскрипционной активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии, а также в качестве средств, стимулирующих апоптоз опухолевых клеток человека.

ВЫВОДЫ

1. Из спиртовых экстрактов морских беспозвоночных с использованием различных вариантов колоночной хроматографии, включая ВЭЖХ, выделено или получено в результате химических модификаций 44 новых и 12 ранее известных терпеноидов, сульфатпрованных полпоксистероидов и полипренил-1,4-бепзохннопов. Их строение установлено физико-химическими и химическими методами. Обнаружено действие некоторых полпоксистероидов на клеточный кальциевый транспорт.

2. Исследованы химические превращения ряда новых терпеноидов и сульфатпрованных стероидов из офиур. Показано, что уникальный, имеющий два цнклобутановых фрагмента сесквитерпеноид аплидактои перегруппировывается в кислотной среде в т.н. изоаплидактон, найдены условия превращения бициклического

хамигранового сесквитерпенонда дактнлона в моноциклические бизаболановые производные.

3. Изучены цнтотоксические свойства полученных лично или сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН 62 морских природных соединений п их синтетических аналогов в отношении нескольких линии нормальных и опухолевых клеток. Найдены соединения с высокой цитотоксичностыо в отношении использованных клеток (бромированные фаскаплизипы, некоторые трнтерпеновые гликозпды, радиантотоксин А).

4. Изучена способность большой серии морских природных соединений и их синтетических аналогов тормозить неопластическую трансформацию эпидермальных мышиных JB6 CI41 Р+ клеток, вызванную действием опухолевых промоторов, и/или колопеобразованне в культурах опухолевых клеток. Найдено 27 соединений, в том числе терпепоиды, алкалоиды, биополярные липиды, полипептиды, обладающих канцерпревситпвпой активностью в опытах in vitro па этих клеточных моделях. Многие из них, в особенности дактнлон, шеринипы, радпантотоксины, тритерпеновые гликозпды, демонстрирует эту активность в малотоксичных или пецитотоксичных концентрациях.

5. С помощью проточной цитометрпи, применения различных, в том числе генетически измененных клеточных линий, вестери-блоттпнга для определения внутриклеточных уровней фосфорилированиых и нефосфорилированных форм различных белков п лгоцнферазпого метод определения транскрипционной активности р53, АР-1 или NF-кВ ядерных факторов изучены некоторые особенности молекулярных механизмов действия более 10 из изученных веществ. Показано, что эти механизмы включают подавление экспрессии цпклипа D3 и Cdk4 и блокирование клеточного цикла (дактилон), апоптоз (многие изученные вещества), ингнбирование фосфорилпровання Rb белка (дактнлон), индукцию транскрипционной активности белка-супрсссора опухолей р53 и/или ингнбирование транскрипционной активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов (поликарппппы, радиантотоксин А, ризохалины, левиускулозид G, тритерпеновые гликозпды), или, наоборот, значительное активирование транскрипционной активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов при отсутствии активирования белка-супрессора опухолей р53 (полппреннлхннопы).

6. Показано, что в индуцировании биологических эффектов, вызванных некоторыми изученными веществами, участвует MAP кипазы, в частности JNKs (полпкарпин), ERKs (левиускулозид G), JNKs и ERKs (ризохалины), JNKs и р38 (дносфепол).

7. На основании полученных результатов сделаны обоснованные предположения о возможном применении некоторых из изученных соединений в качестве хемопрсвентнвных противоопухолевых препаратов (иолипрепилхиноны, дактилон, некоторые трнтерпеновые гликозпды) или в качестве биохимических инструментов при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии (тритерпеновые гликозпды, полипренилхипопы, радпантотоксины).

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Левин B.C., Калинин В.Н., Федоров С.И., Смайли С. Структура тритерпеиовых гликозидов и систематическое положение двух видов голотурий семейства Stichopoclidae // Биология моря 1986. С.72-77.

2. Федоров С.И., Стоиик В.А., Еляков Г.Б. Идентификация экднетероидов шестилучевых кораллов //Хим. природ, соедип. 1988. С.603-604.

3. Левина Э.В., Калиновский A.IL, Стопик В.А., Федоров C.II., Исаков В.В. Стероидные соединения из офпур. I. Новый стероидный сульфат из Ophiura sarsi И Хим. природ, соеднн. 1988. С. 375-379.

4. Федоров C.II., Решетняк М.В., Щедрин А.П., Ильин С.Г., Стручков Ю.Т.. Стоник В.А., Еляков Г.Б. Новый галогенировапиып хамиграновый сесквитерпеноид из моллюска Aplysia sp. Структура и абсолютная конфигурация // Докл. АН СССР. 1989. Т. 305. С. 877-879.

5. Левина Э.В., Федоров C.II., Стоник В.А., Андрияшепко П.В., Калиновский А.И., Исаков В.В. Стероидные соединения из офиур. II. Сульфатированпые стероиды из Ophiura sarsi и Ophiura icptocienia II Хим. природ, соеднн. 1990. С.483-487.

6. Fedorov S.N., Levina E.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Sulfated steroids from Pacific brittle stars Ophiopholis aculeata, Ophiura sarsi and Stegophiura brachiaciis/П. Nat. Prod. 1994. V. 57. P.1631-1637.

7. Сова В.В., Левина Э.В., Апдрпящепко П.В., Федоров СЛ., Елякова Л.Н. Действие полиоксистероидов из морских звезд и офиур на активность (5-1,3-глюканаз // Хим. природ, соеднн. 1994. С.647-650.

8. Aminin D.L., Agafonova I.G., Fedorov S.N. Biological activity of disulfated polyhydroxysteroids from the pacific brittle star Ophiopholis aculeata. // Сотр. Biochem. Physiol. 1995. V. 112C. P. 201-204.

9. Agafonova I.G., Aminin D.L., Shubina L.K., Fedorov S.N. Influence of polyhydroxysteroids from pacific brittle star on cytosolic calcium oscillation in cells // In Biodiversity and allelopathy: from organisms to ecosystems in the Pacific. Chou C.H., Waller G.R., Reiniiardt C. (Eds). Taipei, Academia Sinica. 1999. P. 205-214.

10.Fedorov S.N., Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Lyakhova E.G., Stonik V.A. Structure and absolute configuration of a new rearrannged chamigran-type sesquiterpenoid from the sea hare Aplysia sp. // Tetrahedron Lett. 2000. V.~41. P. 1979-1982.

11.Fedorov S.N., Radchenko O.S., Shubina L.K., Kalinovsky A.I., GerasimenkoA.V., Popov D.Y., Stonik V.A. Aplydactone, a new sesquiterpenoid with an unprecedented carbon skeleton from the sea hare Aplysia dactylomela, and its Cargill-like rearrangement // I. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 504-505.

12.Agafonova I.G., Aminin D.L., Shubina L.K., and Fedorov S.N. Influence of polyhydroxysteroids on ГСа2+], II Steroids 2002. V. 67. P. 695-701.

13.Ляхова Е.Г., Федоров C.II., Шубина Л.К., Радчепко О.С., Калиновский А.И., Дмитрспок П.С., Стоник В.А. Химические свойства морских терпеноидов. 1. Некоторые реакции (6S, 10R)-10-бромо-3,11,11-триметил-метилиденсннро[5,5]ундец-2-ен-4-она, сесквитерпеноида из морского зайца Aplysia dactylomela II Изв. АН Сер. Хим. 2003. С. 970-974.

14.Fedorov S.N., Bode A.M., Stonik V.A.. Gorshkova I.A., Schmid P.C., Radchenko O.S., Berdishev E.V., Dong Z. Marine alkaloid polycarpine and its synthetic derivative dimethylpolycarpine induce apoptosis in JB6 cells through p53- and caspase 3- dependent pathways //Pharm. Res. 2004. V. 21. P. 2307- 2319.

15.Shubina L.K., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Balaneva N.N., Kolesnikova S.A., Dmitrenok, P.S., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. Desmethylubiquinone Q2 from the Far-Eastern ascidian Aplidium glabrum: structure and synthesis // Tetrahedron Lett. 2005. V. 46. P. 559-562.

16.Fedorov S.N., Radchenko O.S., Shubina L.K., Balaneva N.N., Bode A.M., Stonik V.A, Dong Z. Evaluation of cancer-preventive activity and structure-activity relationships of

3-demethylubiquinone Q2, isolated from the ascidian Aplidium glabrum. and its synthetic analogs // Pharm. Res. 2006. V. 23. P. 70-81.

17.Kolesnikova S.A., Kalinovsky A.I., Fedorov S.N., Shubina L.K., Stonik V.A. Diterpenes from the Far-Eastern brown alga Dictxota dichotoma II Phytochemistry 2006. V. 67. P. 2115-2119.

18.Fedorov S.N., Shubina L.K., Bode A.M., Stonik V.A, Dong Z. Dactylone inhibits epidermal growth factor-induced transformation and phenotype expression of human cancer cells and induces GrS arrest and apoptosis // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 5914-5920.

19.Шубина JI.К., Федоров C.II., Калпиовский А.II., Дмнтренок А.С., Джин Д.О., Сопг М.Г., Квак Д.И., Стоинк В.А.. Четыре новых хаммграновых сесквитерпеноида из заднежаберного моллюска Aplysia dactylomela II Изв. АН Сер. Хим. 2007. С. 2037-2042.

20.Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Khudyakova Y.V., Pivkin M.V., Dmitrenok P.S., Fedorov S.N., Ji H., Kwak J.Y., Kuznetsova T.A. Indole alkaloids produced by a marine fungus isolate of Penicillium janthinellwn Biourge // J. Nat. Prod. 2007 V. 70. P. 906-909.

21.Zhidkov M.E., Baranova O.V., Balaneva N.N., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Dubovitskii S.V. The first syntheses of 3-bromofascaplysin, 10-bromofascaplysin and 3,10-dibromofascaplysin - marine alkaloids from Fascaplysiuupsis reticulata and Didemnum sp. by application of a simple and effective approach to the pyridof l,2-a:3,4-b'"]diindole system // Tetrahedron Lett. 2007. V. 48. P. 7998-8000.

22.Макарьева Т.Н., Захарепко A.M., Денисенко В.А., Дмнтренок П.С., Гузнй А.Г., Шубина Л.К., Капустина И.И., Федоров C.II. Ризохалиппн А, новый аптнлсйкемический двухголовый сфинголиппд из губки Rhizochalina incrustata II Хим. природ, соедпн. 2007. С. 385-386.

23.Fedorov S.N., Shubina L.K., Kicha А.А., Ivanclnna N.V., Kwak J.Y., Jin J.O., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. Proapoptotic and anticarcinogenic activities of leviusculoside G from the starfish Henricia leviuscula and probable molecular mechanism // Nat. Prod. Commun. 2008. V. 3. P. 1575-1580.

24.Fedorov S.N., Radchenko O.S., Shubina L.K., Balaneva N.N., Agafonova I.G., Bode A.M., Jin J.O., Kwak, J.Y., Dong Z., Stonik V.A. Anticancer activity of 3-demethylubiquinonc Q2. In vivo experiments and probable mechanism of action // Anticancer Res. 2008. V. 28. P. 927-932.

25.Avilov S.A., Silchenko A.S., Antonov A.S., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Smirnov A.V., Dmitrenok P.S., Evtushenko E.V., Fedorov S.N., Savina A.S., Shubina L.K., Stonik V.A. Synaptosides A and A(l), triterpene glycosides from the sea cucumber Synapta maculata containing 3-O-methylglucuronic acid and their cytotoxic activity against tumor cells Hi. Nat. Prod. 2008. V. 71. P. 525-531.

26.Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Fedorov S.N., Stepanov V.G., Dong Z., Stonik V.A. Constituents of the sea cucumber Cucumaria okhotensis. Structures of okhotosides BpB, and cytotoxic activities of some glycosides from this species //J. Nat. Prod. 2008. V. 71. P. 351-356.

27. Jin J.-O., Shastina V., Park J.-I., Han J.-Y., Makarieva Т., Fedorov S„ Rasskazov V., Stonik V., Kwak J.-Y. Differential induction of apoptosis of leukemic cells by rhizochalin, two headed sphingolipid from sponge and its derivatives // Biol. Pharm. Bull. 2009. V. 32. P. 955-962.

28.Jin J.-O., Shastina V.V., Shin S.-W., Xu Q„ Park J.-I., Rasskazov V.A., Avilov SA., Fedorov S.N., Stonik V.A., Kwak J.-Y. Differential effects of triterpene glycosides, frondoside A and cucumarioside A2-2 isolated from sea cucumbers on caspase activation and apoptosis of human leukemia cells // FEBS Lett. 2009. V. 583. P. 697-702.

29.Федоров С.Н., Шубина JI.K., Капустина И. И., Авилов С.А., Стоник В.А., Шастппа В.В., Квак Я.Й., Парк Д.И., Квоп Я.Х. Средство, стимулирующее апоптоз клеток лейкемии человека // Патент на изобретение № 2360692. Зарегистрировано 10 июля 2009г. Заявка №2007148013. Приоритет изобретения 21 декабря 2007 г.

30.Fcdorov S.N., Makarieva T.N., Guzii A.G., Shubina L.K., Kwak J.-Y., Stonik V.A. Marine two-headed sphingolipid—like compound rhizochalin inhibits EGF-induced transformation of JB6 P+ CI 41 cells // Lipids. 2009. V. 44. P. 777-785.

31.Fcdorov S.N., Dyshlovoy S.A., Monastyrnaya M.M., Shubina L.K., Leychenko E.V., Kozlovskaya E.P., Jin J.-O., Kwak J.-Y., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. The anticancer effects of actinoporin RTX-A from the sea anemone Heteractis crispa (=Radianthus inacrodactylus) II Toxicon. 2010. V. 55. P. 811-817.

32.Stonik V.A., Fcdorov S.N. Cancer preventive marine natural products // In Cellular and Genetic Practices for Translational Medicine. J.-Y. Kwak and J.-Y. Han (Eds). Kerala, India. 2011. P. 133-168.

33.Федоров C.II., Боуд A.M., Донг 3„ Радченко О.С., Шубина JI.K., Стоник В.А. Терапевтические хиноны // Патент на изобретение № 2411229. Зарегистрировано 10 февраля 2011г. Заявка №2007110478. Приоритет изобретения 23 сентября 2004 г.

34.Fedorov S.N., Dyshlovoy S.A., Shubina L.K., Guzii A.G., Kuzmich A.S., Makarieva T.N. Си cyclopentenone from the ascidian Diplosoma sp. prevents epidermal growth factor-induced transformation of JB6 cells // Drugs and Therapy Studies. 2012. V. 2. P. e4.

Соискатель

Федоров C.H.

Сергей Николаевич ФЕДОРОВ

ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ МОРСКИХ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Подписано к печати 16.10.2012 г. Печать офсетная. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Усл. п. л. 3,13. Уч.-изд. л. 2,41. Тираж 120 экз. Заказ 109

Отпечатано в типографии ФГУП Издательство «Дальнаука» ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио,7

Содержание диссертации автор исследовательской работы: доктора химических наук, Федоров, Сергей Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ПРИРОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА МОРСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИЕ КАНЦЕРПРЕВЕНТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ.

2.1. Общие сведения о канцерогенезе и профилактике раковых заболеваний.

2.1.1. Канцерогенез и фазы его развития.

2.1.2. Профилактика канцерогенеза и ее классификация.

2.1.3. Потенциальные молекулярные мишени, сигнальные пути и процессы, на которые могут действовать канцерпревентивные вещества на внутриклеточном уровне и в организме в целом.

2.2. Морские канцерпревентивные вещества: структуры, источники выделения и механизмы действия.

2.2.1. Липиды.

2.2.2. Каротиноиды.

2.2.3. Витамины.

2.2.4. Полисахариды.

2.2.5. Гликозиды.

2.2.6. Терпеноиды.

2.2.7. Алкалоиды.

2.2.8. Другие низкомолекулярные вещества.

Введение диссертация по химии, на тему "Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов"

Актуальность проблемы

Актуальность поиска и последующего изучения химической структуры -и биологической активности морских природных соединений подтверждается опытом мировой науки. Установление структур новых морских вторичных метаболитов до сих пор продолжает играть важную роль для развития биоорганической химии, биохимии, биологии и медицины, так как без этого невозможно исследование биологических функций, путей биосинтеза и метаболизма таких веществ в организме животных, а также создание новых медицинских препаратов на основе морских природных соединений. Известно, что морские природные соединения иногда обладают экстремально высокой биологической активностью. Среди них найдены самые мощные из небелковых токсинов (палитоксин, маитотоксин), противоопухолевые соединения с высочайшей токсичностью в отношении опухолевых клеток (спонгистатин, эктеинасцидины, бриостатины), вещества с очень высоким обезболивающим (конотоксины) и противовоспалительным (монаолид, контигнистерол) эффектами. Большое значение имеет поиск новых природных канцерпревентивных веществ, поскольку профилактика онкологических заболеваний становится одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всех странах, включая Россию. Рак (злокачественные опухолевые заболевания) является одной из основных причин смертности в мире. За последние 25 лет заболеваемость раком выросла в 1.5-2 раза, в том числе в развитых странах. Существует много разновидностей раковых заболеваний, но для них характерна одна общая черта - эти болезни чрезвычайно трудно излечить.

За рубежом исследования в области противоопухолевой профилактической и терапевтической активности природных соединений особенно активно проводятся в США, а также во многих ведущих европейских странах, таких как Англия и Германия. Недавно были разрешены к применению первые высокоэффективные противоопухолевые лекарства, созданные на основе морских природных соединений «джонделис» и «эребулин мезилат». В России систематические работы в области химии, биохимии, биотехнологии и молекулярной клеточной биологии природных соединений из морских организмов ведутся в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук. Природные противоканцерогены являются хорошими моделями для создания на их основе противоопухолевых лекарств. Важную роль в характеристике будущего лекарственного препарата имеет механизм его действия. Без знания механизма действия препарата невозможно внедрение его в клиническую практику, поэтому изучение механизма действия, предполагающее использование самых современных методов молекулярной биологии, является важной и актуальной частью поиска и изучения структуры и активности противоопухолевых веществ. В последние годы среди природных соединений из различных биологических объектов наземного происхождения найдена серия веществ, ингибирующих канцерогенез. Канцерпревентивные метаболиты красного вина, зеленого чая, красного перца привлекли большое внимание. Соответствующие работы приобрели самую широкую известность и были опубликованы в ведущих научных журналах мира, таких как Science и Nature. Морские организмы, безусловно, также содержат соединения, препятствующие возникновению и развитию опухолей, но в то же время все еще остаются относительно малоизученными в отношении содержания в них биологически активных веществ этого типа действия. Вероятность нахождения новых морских низко- и высокомолекулярных соединений, обладающих канцерпревентивными свойствами, остается высокой, а их поиск, выделение и изучение химической структуры и механизма действия с целью последующего внедрения таких веществ в практику являются весьма актуальными.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являются поиск, выделение (получение), установление химического строения серии новых морских природных соединений и их синтетических аналогов, а также исследование их биологической, в том числе канцерпревентивной и противоопухолевой активности вплоть до молекулярного механизма действия.

При поиске новых морских биологически активных природных соединений были решены задачи отбора наиболее интересных с биохимической точки зрения образцов морских беспозвоночных путем применения широкого скрининга с использованием хроматографических методов и методов тестирования биологической активности.

Для выделения природных соединений ставились задачи оптимального использования современных хроматографических методов, включая тонкослойную, колоночную, высокоэффективную жидкостную хроматографию на различных сорбентах, а также применения химических методов их модификации (ацетилирование, десульфатирование и т.д.).

При установлении химической структуры и определении чистоты выделенных соединений решали задачи широкого и комплексного применения спектрометрических и других методов, включая ЯМР, ИК, УФ, КД, масс-спектрометрию, а также рентгеноструктурный анализ.

В рамках данной работы ставились также задачи изучения особенностей биологической, в частности канцерпревентивной и противоопухолевой активности веществ, а также установления молекулярных механизмов их действия. Вещества могут проявлять противоопухолевый хемопревентивный или терапевтический эффект различными путями: прямым повреждающим действием на опухолевую клетку; замедлением скорости генерации опухолевых клеток настолько, что они практически перестают делиться; повреждением ДНК клеток и потерей ими основных свойств метастазирования и инвазивности; арестом клеточного цикла; индукцией апоптоза опухолевых клеток. Апоптоз является тем механизмом, который приводит к удалению из организма нежелательных клеток, и играет, таким образом, зашитную, антиканцерогенную роль. Один из наиболее плодотворных подходов при терапии раковых заболеваний основан на поиске и применении природных ингибиторов важнейших внутриклеточных мишеней опухолевых клеток. Ведется активный поиск индукторов апоптоза опухолевых клеток, ингибиторов ангиогенеза, ингибиторов протеин киназ различного типа, а также белков, регулирующих клеточный цикл. Соответственно, в данной работе ставили задачи изучения цитотоксической активности веществ, их влияния на индукцию апоптоза и клеточный цикл, на транскрипционную активность р53, АР-1 и ОТ-кВ ядерных факторов, на внутриклеточные уровни различных белков, включая фосфорилированные и нефосфорилированные формы киназ, циклинов и циклин-зависимых киназ и других белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз. Для решения задачи оценки жизнеспособности различных опухолевых клеток при цитотоксическом действии веществ использовали метод, основанный на способности живых клеток перерабатывать реагент МТБ в окрашенное вещество, формазан. Канцерпревентивные свойства веществ изучали с использованием метода ЕОР- или ТРА- индуцированной трансформации мышиных Ш6 С1 41 Р+ клеток в мягком агаре. Задачу изучения апоптоза, индуцируемого исследуемыми веществами в раковых клетках человека, решали с использованием проточной цитометрии и метода ДНК-лестницы. Для выявления влияния исследуемых веществ на внутриклеточные уровни различных белков использовали метод вестерн-блоттинга. Для изучения влияния веществ на различные ядерные факторы транскрипции в клетке применяли люциферазный метод с использованием 1В6 С141 клеточных линий со стабильно экспрессированным люциферазным репортерным геном. В качестве экспериментальных моделей использовали культуры опухолевых клеток человека и мышиные эпидермальные 1В6 С141 Р+ клетки и их стабильные трансфектанты.

Еще одной задачей данной работы было изучение связи структуры исследуемых соединений с их биологической активностью и установление соответствующих закономерностей, которые дадут возможность использовать эти вещества как модельные соединения и заранее прогнозировать свойства новых природных веществ и препаратов, создаваемых на их основе. Эта задача была решена путем применения широкого набора методов биотестирования с последующим применением статистических методов анализа.

Научная новизна и практическая ценность работы.

44 новых морских вторичных метаболита и их синтетических аналога было выделено из морских организмов или получено в результате химических модификаций и синтеза в рамках данной работы. Их строение было установлено физико-химическими методами.

Впервые изучена биологическая активность, в том числе канцерпревентивная и цитотоксическая против опухолевых клеток, 62 морских природных соединений и их синтетических аналогов, большинство из которых также являются новыми, а их активность ранее не изучалась. Для многих из этих соединений исследована зависимость активности от их химической структуры. Новизна данной работы состоит и в том, что в России до недавнего времени еще не проводился направленный поиск антиканцерогенных соединений, а в других странах такой поиск проводился среди природных соединений в основном наземного, но не морского происхождения. Только в последние годы началось интенсивное изучение морских антиканцерогенных соединений. В 2004 году нами была опубликована первая статья, посвященная антиканцерогенному действию морских метаболитов, алкалоидов поликарпинов, выполненная совместно с американскими учеными. В настоящее время в ТИБОХ ДВО РАН организована экспериментальная база, обеспечивающая проведение таких работ. Для поиска соединений, обладающих канцерпревентивными свойствами, нами создана коллекция из более, чем 80 клеточных линий опухолевых и нормальных клеток человека и мыши. В данной работе используются методы поиска соединений, ингибирующих ЕОР- и ТРА-индуцируемую трансформацию мышиных 1В6 С141 Р+ клеток в мягком агаре, МТБ-метод определения цитотоксической активности веществ, люциферазный метод определения АР-1, р53 и ЫР-кВ-зависимой транскрипционной активности, а в экспериментах используются генетически измененнме клетки мыши. Ряд этих методик впервые поставлены нами в России. С помощью метода мягкого агара изучены канцерпревентивные свойства 27 морских природных соединений и их синтетических аналогов, найдено несколько соединений перспективных в качестве хемопревентивных средств, тормозящих опухолевое перерождение клеток. Новизна данной работы состоит и в широте охвата морских источников выделения природных веществ, которая обеспечивается ежегодными экспедициями специализированного научно-исследовательского судна «Академик Опарин». Результатом этого обстоятельства стал широкий круг морских природных веществ, исследованных в данной работе, это стероиды и терпеноиды, алкалоиды, хиноидные соединения, полипептиды, липиды, Си циклопентеноны и тритерпеновые гликозиды.

Принципиально новые сведения были получены в результате данной работы при изучении механизмов физиологического действия веществ морского происхождения и их аналогов, в том числе была показана их способность препятствовать перерождению здоровых клеток в опухолевые, индуцировать апоптоз в опухолевых клетках человека, воздействовать на активность внутриклеточных белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз и активировать транскрипционную активность ряда ядерных факторов, в том числе белка-супрессора опухолей р53. В процессе выполнения данной работы впервые было показано, что некоторые виды морского пищевого сырья, в частности морские водоросли и голотурии, содержат соединения с канцерпревентивными свойствами.

Результаты данных исследований могут найти применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии, расширить спектр используемых в России биологически активных добавок к пище и создать условия для разработки новых медицинских препаратов. По результатам данной работы получены 2 патента РФ на изобретения, связанные с открытием новых перспективных противоопухолевых и апоптоз-индуцирующих препаратов профилактической и терапевтической направленности.

Публикация результатов исследования.

Основные результаты данной работы опубликованы в международных и отечественных научных журналах: Journal of the American Chemical Society, Cancer Research, Tetrahedron Letters, Pharmaceutical Research, Journal of Natural Products, Comparative Biochemistry and Physiology, Steroids, Phytochemistry, Natural Product Communications, Biological and Pharmaceutical Bulletin, FEBS Letters, Lipids, Toxicon, Drugs and Therapy Studies, Биология Моря, Химия Природных Соединений, Доклады Академии Наук, Известия Академии Наук. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в патентах, главах в научных сборниках и материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов. По теме диссертации опубликованы 49 работ, в том числе 30 научных статей, 2 главы в монографиях и 2 патента.

Структура и объем диссертации.

Диссертация построена традиционно и состоит из шести глав. Вслед за «Введением» следует «Литературный обзор», в котором дается представление о современных достижениях биоорганической химии в области изучения структуры и противоопухолевой профилактической активности морских природных соединений, а также общие сведения о канцерогенезе, фазах его развития, методах и внутриклеточных мишенях и сигнальных путях его ингибирования. В главе «Обсуждение результатов» даны описание и обсуждение результатов выполненного исследования. Эта глава состоит из восьми разделов, в которых материал сгруппирован в соответствии с химическими структурами исследованных соединений. В «Экспериментальной части» приведены приборы и материалы, клеточные культуры, методики выполненных экспериментов и характеристики полученных веществ. Завершают диссертацию «Выводы» и «Список цитированной литературы». Работа изложена на 295 страницах, содержит 34 таблицы, 78 рисунков и 9 схем. Список литературы включает 516 цитируемых работ.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

250 5. ВЫВОДЫ

1. Из спиртовых экстрактов морских беспозвоночных с использованием различных вариантов колоночной хроматографии, включая ВЭЖХ, выделено или получено в результате химических модификаций 44 новых и 12 ранее известных терпеноидов, сульфатированных полиоксистероидов и полипренил-1,4-бензохинонов. Их строение установлено физико-химическими и химическими методами. Обнаружено действие некоторых полиоксистероидов на клеточный кальциевый транспорт.

2. Исследованы химические превращения ряда новых терпеноидов и сульфатированных стероидов из офиур. Показано, что уникальный, имеющий два циклобутановых фрагмента сесквитерпеноид аплидактон перегруппировывается в кислотной среде в т.н. изоаплидактон, найдены условия превращения бициклического хамигранового сесквитерпеноида дактилона в моноциклические бизаболановые производные.

3. Изучены цитотоксические свойства полученных лично или сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН 62 морских природных соединений и их синтетических аналогов в отношении нескольких линий нормальных и опухолевых клеток. Найдены соединения с высокой цитотоксичностью в отношении использованных клеток (бромированные фаскаплизины, некоторые тритерпеновые гликозиды, радиантотоксин А).

4. Изучена способность большой серии морских природных соединений и их синтетических аналогов тормозить неопластическую трансформацию эпидермальных мышиных JB6 С141 Р+ клеток, вызванную действием опухолевых промоторов, и/или колонеобразование в культурах опухолевых клеток. Найдено 27 соединений, в том числе терпеноиды, алкалоиды, биополярные липиды, полипептиды, обладающих канцерпревентивной активностью в опытах in vitro на этих клеточных моделях. Многие из них, в особенности дактилон, шеринины, радиантотоксины, тритерпеновые гликозиды, демонстрирует эту активность в малотоксичных или нецитотоксичных концентрациях.

5. С помощью проточной цитометрии, применения различных, в том числе генетически измененных клеточных линий, вестерн-блоттинга для определения внутриклеточных уровней фосфорилированных и нефосфорилированных форм различных белков и люциферазного метод определения транскрипционной активности р53, АР-1 или NF-кВ ядерных факторов изучены некоторые особенности молекулярных механизмов действия более 10 из изученных веществ. Показано, что эти механизмы включают подавление экспрессии циклина D3 и Cdk4 и блокирование клеточного цикла (дактилон), апоптоз (многие изученные вещества), ингибирование фосфорилирования

Rb белка (дактилон), индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и/или ингибирование транскрипционной активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов (поликарипины, радиантотоксин А, ризохалины, левиускулозид G, тритерпеновые гликозиды), или, наоборот, значительное активирование транскрипционной активности АР-1 и NF-кВ ядерных факторов при отсутствии активирования белка-супрессора опухолей р53 (полипренилхиноны).

6. Показано, что в индуцировании биологических эффектов, вызванных некоторыми изученными веществами, участвуют MAP киназы, в частности JNKs (поликарпин), ERKs (левиускулозид G), JNKs и ERKs (ризохалины), JNKs и р38 (диосфенол).

7. На основании полученных результатов сделаны обоснованные предположения о возможном применении некоторых из изученных соединений в качестве хемопревентивных противоопухолевых препаратов (полипренилхиноны, дактилон, некоторые тритерпеновые гликозиды) или в качестве биохимических инструментов при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии (тритерпеновые гликозиды, полипренилхиноны, радиантотоксины).

2.2.9. Заключение

Морские организмы являются богатым источником различных природных соединений, обладающих значительным канцерпревентивным потенциалом. Активность этих веществ реализуется через различные биохимические пути, включая апоптоз раковых клеток, воздействие на прогрессию клеточного цикла и дифференциацию, дезактивирующее действие по отношению к свободным радикалам, стимулирование противоопухолевого иммунитета, противовоспалительное действие, модификацию различных ферментов, ингибирование опухолевого ангиогенеза и т.д. Эти вещества во многих случаях могут быть полезны для людей, относящихся к группам риска, в том числе и по той причине, что они потенциально могут действовать в синергизме с другими природными антиканцерогенными веществами, обладающими другими механизмами действия и таким образом дополняющими канцерпревентивное действие первых. Однако их применение в профилактических целях требует доказательств безопасности для пациентов.

Имеются хорошие возможности использовать полусинтетические производные некоторых канцерпревентивных веществ из морских организмов, чтобы улучшить активность и понизить токсичность последних. Многие из известных морских канцерпревентивных веществ, от таких, как высокомолекулярные фукоидан и хитин, и до низкомолекулярных алкалоидов и терпеноидов, имеют многообещающий потенциал для развития исследований на их основе, направленных на поиск более перспективных канцерпревентивных агентов.

Тесное сотрудничество химиков-биооргаников со специалистами в области молекулярных механизмов канцерогенеза было бы ценным вкладом в решение таких проблем, как получение наиболее активных целевых соединений, создание на их основе эффективных канцерпревентивных композиций и дальнейшие исследования антиканцерогенных свойств морских природных соединений.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Химические структуры, свойства и биологическая активность терпеноидов из некоторых моллюсков и водорослей

Предполагается, что потребление разнообразной морской пищи приводит к значительному количественному уменьшению случаев заболеваний раком в Японии и других странах, население которых традиционно потребляет в пищу большое количество морепродуктов. Известно, что многие виды морской пищи содержат низкомолекулярные природные продукты, не характерные для наземных организмов. Однако возможная роль таких вторичных метаболитов, за исключением жирных кислот [259], в профилактике раковых заболеваний остается неизвестной.

Галогенированные хамиграновые сесквитерпеноиды представляют собой группу морских природных соединений, которые были найдены только в красных водорослях и моллюсках, питающихся этими растениями [260-263]. Метаболиты этой серии были выделены из различных видов морских водорослей, принадлежащих к роду Laurencia, включая те виды, которые используются в пищу населением Японии, Гавайских островов и других стран мира. Противоопухолевые свойства этих соединений изучены явно недостаточно.

3.1.1. Дактилон - галогенированный хамиграновый сесквитерпеноид из моллюска Aplysia dactylomela. Структура и абсолютная конфигурация

Из хлороформенного экстракта A. dactylomela, собранного у острова Нуси-Хара (Мадагаскар) во время 3-го рейса НИС «Академик Опарин», мы получили новый хамиграновый бромсодержащий сесквитерпеноид дактилон (1), выход 0.4 % на сырую массу.

Его строение и абсолютную стереохимию установили с помощью физико-химических методов, включая рентгеноструктурный анализ [264]. Брутто-формула С15Н21ОВГ (1) установлена путем изучения его масс-спектра (М+ 298, 296 m/z), а также 'Н и 13С ЯМР спектров (табл. 1). УФ-спектр 1 (А.тах 236 нм, е 8470) и ИК-спектр (vc=o 1667, vc=c 1624 см"1) указывают на наличие в его структуре фрагмента а,(3-непредельного кетона. 'Н ЯМР спектр дактилона близок к спектру ранее известного соединения 2 [265], но отличается сдвигом сигнала одной из метальных групп от 0.95 до 1.72 м.д. и появлением мультиплета олефинового протона при 6.5 м.д. В связи с этим для 1 предложена структура 10-бром-3,11,11-триметил-7-метилиденспиро[5,5]ундец-2-ен-4-она.

Список источников диссертации и автореферата по химии, доктора химических наук, Федоров, Сергей Николаевич, Владивосток

1. Bertram J.S. The molecular biology of cancer // Mol. Aspects Med. 2000. V. 21. P. 167223.

2. Berenblum I., Armuth V. Two independent aspects of tumor promotion // Biochim. Biophys. Acta 1981. V. 651. P. 51-63.

3. Surh Y.-J. Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic compounds // Mutat. Res. 1999. V. 428. P. 305-327.

4. Sporn M.B. Approaches to prevention of epithelial cancer during the preneoplastic period // Cancer Res. 1976. V. 36. P. 2699-2702.

5. Umar A., Viner J.L., Hawk E.T. The future of colon cancer prevention // Ann. NY Acad. Sci. 2001. y. 952. P. 88-108.

6. Krishnan K., Ruffin M.T., Brenner D.E. Chemoprevention for colorectal cancer // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2000. V. 33. P. 199-219.

7. Azmi. A.S., Ahmad A., Banerjee S., Rangnekar V.M., Mohammad R.M., Sarkar F.H. Chemoprevention of pancreatic cancer: characterization of Par-4 and its modulation by 3,3'diindolylmethane (DIM) // Pharm. Res. 2008. V. 25. P. 2117-2124.

8. Hong W.K, Sporn M.B. Recent advances in chemoprevention of cancer // Science 1997. V. 278. P.1073-1077.

9. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell 2000. V. 100. P. 57-70.

10. Denissenko M.F., Pao A., Tang M., Pfeifer G.P. Preferential formation of benzoa.pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in p53 // Science 1996. V. 274. P. 430-432.

11. Bode A.M., Ma W.Y., Surh Y.J., Dong Z. Inhibition of epidermal growth factor-induced cell transformation and activator protein 1 activation by 6.-gingerol // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 850-853.

12. Colburn N.H, Wendel E.J, Abruzzo G. Dissociation of mitogenesis and late-stage promotion of tumor cell phenotype by phorbol esters: mitogen-resistant variants are sensitive to promotion//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981. V. 78. P. 6912-6916.

13. Alt J.R., Cleveland J.L., Hannink M., Diehl J.A. Phosphorylation-dependent regulation of cyclin D1 nuclear export and cyclin D1-dependent cellular transformation // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 3102-3114.

14. Sicinski P., Donaher J.L., Parker S.B., Fazeli A., Gardner H., Haslam S.Z., Bronson R.T., Elledge S.J., Weinberg R.A. Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast // Cell 1995. V. 82. P. 621-630.

15. Adams P.D. Regulation of the retinoblastoma tumor suppressor protein by cyclin/CDKs //Biochim. Biophys. Acta 2001. V. 1471. P. 123-133.

16. Bunn P.A., Soriano A., Johnson G., Heasley L. New therapeutic strategies for lung cancer // Chest 2000. V. 117. P. 163S-168S.

17. Ahmad N., Katiyar S.K., Mukhtar H. Antioxidants in chemoprevention of skin cancer // Curr. Prob. Dermatol. 2001. V. 29. P. 128-139.

18. Young M.R., Li J.J., Rincon M., Flavell R.A., Sathyanarayana B.K., Hunziker R., Colburn N. Transgenic mice demonstrate AP-1 (activator protein-1) transact!vaJon is required for tumor promotion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V.96. P. 9827-9832.

19. Dong Z.G., Birrer M.J., Watts R.G., Matrisian L.M., Colburn N.H. Blocking of tumor promoter-induced AP-1 activity inhibits induced transformation in JB6 mouse epidermal cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. V. 91. P. 609-613.

20. Dong Z., Lavrovsky V., Colburn N.H. Transformation reversion induced in JB6 RT101 cells by AP-1 inhibitors // Carcinogenesis 1995. V. 16. P. 749-756.

21. Karin M. NF-kB as a critical link between inflammation and cancer // Cold. Spring Harb. Perspect. Biol. 2009. V. 1. P. a000141.

22. Nilsson J.A., Cleveland J.L. Myc pathways provoking cell suicide and cancer // Oncogene 2003. V. 22. P. 9007-9021.

23. Leder A., Pattengale P.K., Kuo A., Stewart T.A., Leder P. Consequences of widespread deregulation of the c-myc gene in transgenic mice: multiple neoplasms and normal development // Cell 1986. V. 45. P. 485-495.

24. Malumbres M., Pellicer A. Ras pathways to cell cycle control and cell transformation // Front. Biosci. 1998. V. 3. P. D887-D912.

25. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell 1997. V. 88. P. 323-331.

26. Oren M. Regulation of the p53 tumor suppressor protein // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 36031-36034.

27. Vousden K.H. p53: death star// Cell 2000. V.103. P. 691-694.

28. Classon M., Harlow E. The retinoblastoma tumor suppressor in development and cancer // Nat. Rev. Cancer 2002. V. 2. P. 910-917.

29. Sherr C.J., McCormick F. The Rb and p53 pathways in cancer // Cancer Cell 2002. V. 2. P. 103-112.

30. Madhunapantula S.V., Robertson G.P. The PTEN-AKT3 signaling cascade as a therapeutic target in melanoma // Pigment cell melanoma Res. 2009. V. 22. P. 400-419.

31. Lawrence T. The nuclear factor NF-kB pathway in inflammation // Cold Spring Harb. Perspect Biol. 2009. V. 1. P. a001651.

32. Nareika A., Im Y.B., Game B.A., State E.H., Sanders J.J., London S.D., Lopes-Virella M.F., Huang Y. High glucose enhances lipopolysaccharide-stimulated CD 14 expression in

33. U937 mononuclear cells by increasing nuclear factor kappaB and AP-1 activities // J. Endocrinol. 2008. V. 196. P. 45-55.

34. Tang C.H., Chiu Y.C., Tan T.W., Yang R.S., Fu W.M. Adiponectin enhances IL-6 production in human synovial fibroblast via an AdipoRl receptor, AMPK, p38, and NF-kB pathway // J. Immunol. 2007. V. 179. P. 5483-5492.

35. Liu C.H., Chang S.H., Narko K., Trifan O.C., Wu M.T., Smith E., Haudenschild C., Lane T.F., Hla T. Overexpression of cyclooxygenase-2 is sufficient to induce tumorigenesis in transgenic mice // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 18563-18569.

36. Goossens L., Pommery N., Pierre H.J. COX-2/5-LOX dual acting anti-inflammatory drugs in cancer chemotherapy // Curr. Top. Med. Chem. 2007. V. 7. P. 283-296.

37. Radisavljevic Z. Inactivated tumor suppressor Rb by nitric oxide promotes mitosis in human breast cancer cells // J. Cell. Biochem. 2004. V. 92. P. 1-5.

38. Neufeld G., Kessler O. Pro-angiogenic cytokines and their role in tumor angiogenesis // Cancer Metastasis Rev. 2006. V. 25. P. 373-385.

39. Huang S., Pettaway C.A., Uehara H., Bucana C.D., Fidler I.J. Blocade of NF-кВ activity in human prostate cancer cell is accociated with suppression of angiogenesis, invasion and metastasis // Oncogene 2001. V. 20. P. 4188-4197.

40. Huang C., Ma W.-Y., Young M.R., Colburn N., Dong Z. Shortage of mitogen-activated protein kinase is responsible for resistance to AP-1 transactivation and transformation in mouse JB6 cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. V. 95. P. 156-161.

41. Testa J.R., Bellacosa А. АКТ plays a central role in tumorigenesis // Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2001. V. 98. P. 10983-10985.

42. Daniel P.В., Walker W.H., Habener J.F. Cyclic AMP signaling and gene regulation // Annu. Rev. Nutr. 1998. V. 18. P. 353-383.

43. Taylor S.S., Buechler J.A., Yonemoto W. c-AMP-dependent protein kinase: framework for a diverse family of regulatory enzymes // Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 971-1005.

44. Dhanasekaran N., Heasley L.E., Johnson J.L. G protein-coupled receptor systems involved in cell growth and oncogenesis // Endocr. Rev. 1995. V. 16. P. 259-270.

45. Montminy M. Transcriptional regulation by cyclic AMP // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P.807-822.

46. Greten F.R., Eckman L., Greten T.F., Park J.M., Li Z.W., Egan L.J., Kagnoff M.F., Karin M. IKKp links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer // Cell 2004. V. 118. P. 285-296.

47. Maeda S., Kamata H., Luo J.L., Leffert H., Karin M. IKK(3 couples hepatocyte death to cytokine-driven compensatory proliferation that promotes chemical hepatocarcinogenesis // Cell 2005. V 121. P. 977-990.

48. Fingar D.C., Blenis J. Target of rapamycin (TOR): an integrator of nutrient and growth factor signals and coordinator of cell growth and cell cycle progression // Oncogene 2004. V. 23. P. 3151-3171

49. Rojas J.D., Sanka S.C., Hendrix M.J., Meininger C.J., Wu G., Seftor E.A., Martinez G., Martinez-Zaguilan R. Vacuolar type proton ATPases in angiogenesis and cancer // Proc. Am. Assoc. Cance Res. 2000. V. 41. P. 303.

50. Martinez-Zaguilan R., Martinez G.M., Gomez A., Hendrix M.J.C., Gilles R.J. Distinct regulation of pHin and Ca2+.in in human melanoma cells with different metastatic potential // J. Cell Physiol. 1998. V. 176. P. 196-205.

51. Johnstone R.W. Histone-deacetylase inhibitors: Novel drugs for the treatment of cancer // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. P. 287-299.

52. Vigushin D.M., Coombes R.C. Histone deacetylase inhibitors in cancer treatment // Anticancer Drugs 2002. V. 13. P. 1-13.

53. Sun S.-Y., Hail N., Lotan R. Apoptosis as a novel target for cancer chemoprevention // J. Natl Cancer Inst. 2004. V. 96. P. 662-672.

54. Frenzel A., Grespi F., Chmelewskij W., Villunger A. Bcl2 family proteins in carcinogenesis and treatment of cancer // Apoptosis 2009. V. 14. P. 584-596.

55. Van Antwerp D.J., Martin S.J., Kafri T., Green D.R., Verma I.M. Suppression of TNF-a-induced apoptosis by NF-kB // Science 1996. V. 274. P. 787-789.

56. Blagosklonny M.V. Prospective strategies to enforce selectively cell death in cancer cells // Oncogene 2004. V. 23. P. 2967-2975.

57. Karnauskas R., Niu Q., Talapatra S., Plas D.R., Greene M.E., Crispino J.D., Rudin C.M. Bcl-xL and Akt cooperate to promote leukemogenesis in vivo // Oncogene 2003. V. 22. P. 688-698.

58. Simmons T.L., Andrianasolo E., McPhail K., Flatt P., Gerwick W.H. Marine natural products as anticancer drugs // Mol. Cancer Ther. 2005. V. 4. P. 333-342.

59. Tsuda H., Ohshima Y., Nomoto H., Fujita K., Matsuda E., Iigo M., Takasuka N., Moore M.A. Cancer prevention by natural compounds // Drug Metab. Pharmacok. 2004. V. 19. P. 245-263.

60. Oh K., Willett W.C., Fuchs C.S., Giovannucci E. Dietary marine n-3 fatty acids in relation to risk of distal colorectal adenoma in women // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2005. V. 14. P. 835-841.

61. Augustsson K., Michaud D.S., Rimm E.B., Leitzmann M.F., Stampfer M.J., Willett W.C., Giovannucci E. A prospective study of intake of fish and marine fatty acids and prostate cancer // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2003. V. 12. P. 64-67.

62. Neuhouser M.L., Barnett M.J., Kristal A.R., Ambrosone C.B., King I., Thorquist M., Goodman G. (n-6) PUFA increase and dairy foods decrease prostate cancer risk in heavy smokers//J. Nutr. 2007. V. 137. P. 1821-1827.

63. Somers C.M., Kwiecien J.M., Quinn J.S. A marine fish diet reduces spontaneous lymphoma in outbred Swiss-Webster mice // Leukemia Lymphoma 2005. V. 46. P. 17971800.

64. Wendel M., Heller A.R. Anticancer actions of omega-3 fatty acids Current state and future perspectives // Anti-cancer Agents Med. Chem. 2009. V. 9. P. 457-470.

65. Kang K.S, Wang P., Yamabe N., Fukui M., Jay T., Zhu B.T. Docosaxehaenoic acid induces apoptosis in MCF-7 cells in vitro and in vivo via reactive oxygen species formation and caspase 8 activation // PLOS ONE. 2010. V. 5. P. el0296.

66. Chevalier S., Goupille C., Maheo K., Domingo I., Dussiau C., Renoux B., Bougnoux P., Papot S. Dietary docosahexaenoic acid proposed to sensitize breast tumors to locally delivered drug // Clin. Lipidology 2010. V. 5. P. 233-243.

67. Kawano T., Cui J., Koezuka Y., Toura I., Kaneko Y., Motoki K., Ueno H., Nakagawa R., Sato H., Kondo E., Koseki H., Taniguchi M. CD Id-restricted and TCR-mediated activation of Va14 NKT cells by glycosylceramides // Science 1997. V. 278. P. 1626-1629.

68. Fujii S., Shimizu K., Kronenberg M., Steinman R.M. Prolonged IFN-y-producing NKT response induced with a-galactosylceramide-loaded DCs // Nat. Immunnol. 2002. V. 3. P. 867-874.

69. Shimizu K., Goto A., Fukui M., Taniguchi M., Fujii S. Tumor cells loaded with alpha-galactosylceramide induce innate NKT and NK cell-dependent resistance to tumor implantation in mice//J. Immunol. 2007. V. 178. P. 2853-2861.

70. Nishino H. Cancer prevention by carotenoids // Mutat. Res. 1998. V. 402. P. 159-163.

71. Nishino H. Murakoshi M., Ii T., Takemura M., Kuchide M., Kanazawa M., Mou X.Y., Wada S., MasudaM., Ohsaka Y., Yogosawa S., Satomi Y., Jinno K. Carotenoids in cancer chemoprevention // Cancer Metastasis Rev. 2002. V. 21. P. 257-264.

72. Cantrell A., McGarvey D.J., Truscott T.G., Rancan F., Bohm F. Singlet oxygen quenching by dietary carotenoids in a model membrane environment // Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 412. P. 47-54.

73. Edge R., Land E.J., McGarvey D., Mulroy L., Truscott T.G. Relative one-electron reduction potentials of carotenoid radical cations and the interactions of carotenoids with the vitamin E radical cation // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 4087-4090.

74. Sachindra N.M., Sato E., Maeda H., Hosokawa M., Niwano Y., Kohno M., Miashita K. Radical scavenging and singlet oxygen quenching activity of marine carotenoid fucoxanthin and its metabolites // J. Agric. Food Chem. 2007. V. 55. P. 8516-8522.

75. Miyashita K. Function of marine carotenoids // Food Factors for Health Promotion 2009. V. 61. P. 136-146.

76. Sun S., Gross M.D., Iijima K., Jyonouchi H. Antitumor activity of astaxanthin on Meth-A tumor cells and its mode of action // FASEB J. 1998. V. 12. P. A966.

77. Kim H.W., Park J.S., Chew B.P. P-Carotene and astaxanthin inhibit mammary tumor cells growth and induce apoptosis in mice in vitro II FASEB J. 2001. V. 15. P. A298.

78. Kotake-Nara E., Asai A., Nagao A. Neoxanthin and fucoxanthin induce apoptosis in PC-3 human prostate cancer cells // Cancer Lett. 2005. V. 220. P. 75-84.

79. Chew B.P., Park J.S., Wong M.W., Wong T.S. A comparison of the anticancer activities of dietary P-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo II Anticancer Res. 1999. V. 19. P. 1849-1853.

80. Tanaka T., Morishita Y., Suzui M., Kojimat T., Okumura A., Mori H. Chemoprevention of mouse urinary bladder carcinogenesis by the naturally occurring carotenoid astaxanthin // Carcinogenesis 1994. V. 15. P. 15-19.

81. Tanaka T. Makita H., Ohnishi M., Mori H., Satoh K., Hara A. Chemoprevention of rat oral carcinogenesis by naturally occurring xanthophylls, astaxanthin and canthaxanthin // Cancer Res. 1995. V. 5. P. 4059-4064.

82. Jyonouchi H., Sun S., Iijima K., Gross M.D. Antitumor activity of astaxanthin and its mode of action // Nutr. Cancer 2000. V. 36. P. 59-65.

83. Gradelet S., Astorg P., Leclerc J., Chevalier J., Vernevaut M.F., Siess M.H. Effect of canthaxanthin, astaxanthin, lycopene and lutein on liver xenobiotic-metabolizing enzymes in the rat // Xenobiotica 1996. V. 26. P. 49-63.

84. Heo S.-J., Jeon Y.-J. Protective effect of fucoxanthin isolated from Sargassum siliquastrum on UV-B induced cell damage // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2009. V. 95. P. 101-107.

85. Lipkin M., Newmark H.L. Vitamin D, calcium and prevention of breast cancer: a review //J. Am. College Nutr. 1999. V. 18. P. 392S-397S.

86. Peterlik M., Grant W.B., Cross H.S. Calcium, vitamin D and cancer // Anticancer Res. 2009. V. 29. P. 3687-3698.

87. Newcomb P.A., Kim H., Trentham-Dietz A., Farin F., Hunter D., Egan K.M. Vitamin D receptor polymorphism and breast cancer risk // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2002. V. 11. P. 1503-1504.

88. Beer T.M., Myrthue A. Calcitriol in cancer treatment: from the lab to the clinic // Mol. Cancer Ther. 2004. V. 3. P. 373-381.

89. Bao B.-Y., Yao J., Lee Y.-F. la,25-Dihydroxyvitamin D3 suppresses interleukin-8-mediated prostate cancer cell angiogenesis // Carcinogenesis 2006. V. 27. P. 1883-1893.

90. Koli K., Keski-Oja J. la,25-Dihydroxyvitamin D-3 and its analogues down-regulate cell invasion-associated proteases in cultured malignant cells // Cell Growth Differ. 2000. V. 11. P. 221-229.

91. Ross A.C. Vitamin A and retinoids // In Modern nutrition in health and disease. Shils M.F., Olson J.A., Shike M., Ross A.C. (Eds). 9th Ed. Baltimore. William & Wilkins. 2000. P. 305-327.

92. Satia J.A., Littman A., Slatore C.G. Long-term use of beta-carotene, retinol, lycopene, and lutein supplements and lung cancer risk: results from the VITamins And Lifestyle (VITAL) study // Am. J. Epidemiol. 2009. V. 169. P. 815-828.

93. Yamamoto I., Takahashi M., Tamura E., Maruyama H., Mori H. Antitumor activity of edible marine algae: effect of crude Fucoidan fractions prepared from edible brown seaweeds against L-1210 leukemia // Hydrobiologia 1984. V. 116. P. 145-148.

94. Furusawa E., Furusawa S. Anticancer activity of a natural product, viva-natural, extracted from Undaria pinnantifida on intraperitoneally implanted Lewis lung carcinoma // Oncology 1985. V. 42. P. 364-369.

95. Zhuang C., Itoh H., Mizuno Т., Ito H. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed, umitaranoo (Sargassum thunbergii) II Biosci. Biotecnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 563-567.

96. Запорожец T.C., Беседнова H.H., Лоенко Ю.Н. Антибактериальная и иммуномодулирующая активность фукоидана. // Антибиот. Химиотер. 1995. Т. 40. С. 9-13.

97. Choi E.M., Kim A.J., Kim Y.O., Hwang J.K. Immunomodulating activity of arabinogalactan and fucoidan in vitro //J. Med. Food. 2005. V. 8. P. 446-453.

98. Кузнецова Т.А. Применение фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens длч коррекции нарушений иммунитета и гемостаза на модели эндотоксинемии // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009. Т. 147. С. 71-74.

99. Yang М., Ma С.Н., Sun J.T., Shao Q.Q., Gao W.J., Zhang Y., Li Z.W., Xie Q., Dong Z.G., Qu X. Fucoidan stimulation induces a functional maturation of human monocyte-derived dendritic cells // Int. Immunopharmacol. 2008. V. 8. P. 1754-1760.

100. Hu Y.L., Cheng S.C.S., Chan K.T., Ke Y., Xue B.F., Sin F.W.Y., Zeng C.J., Xie Y. Fucoidan enhances dendritic cell-mediated T-cell cytotoxicity against NY-ESO-1 expressing human cancer cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. V. 392. P. 329-334.

101. Aisa Y., Miyakawa Y., Nakazato Т., Shibata H., Saito K., Ikeda Y., Kizaki M. Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways // Am. J. Hematology 2005. V. 78. P. 7-14.

102. Lee N.Y., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. Inhibitory effects of fucoidan on activation of epidermal growth factor receptor and cell transformation in JB6 C141 cells // Food Chem. Toxicol. 2008. V. 46. P. 1793-1800.

103. Yamasaki-Miyamoto Y., Yamasaki M., Tachibana H., Yamada K. Fucoidan induces apoptosis through activation of caspase-8 on human breast cancer MCF-7 cells // J. Agric. Food Chem. 2009. V. 57. P. 8677-8682.

104. Hyun J.H., Kim S.C., Kang J.I., Kim M.K., Boo H.J., Kwon J.M., Koh Y.S., Hyun J.W., Park D.B., Yoo E.S., Kang H.K. Apoptosis inducing activity of fucoidan in HCT-15 colon carcinoma cells // Biol. Pharm. Bull. 2009. V. 32. P. 1760-1764.

105. Nagamine Т., Hayakawa K., Kusakabe Т., Takada H., Nakazato K., Hisanaga E., Iha M. Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12 // Nutr. Cancer 2009. V. 61. P. 340-347.

106. Irhimeh M.R., Fitton J.H., Lowental R.M. Fucoidan ingestion increases the expression of CXCR4 on human CD34(+) cells // Exp. Hematol. 2007. V. 35. P. 989-994.

107. Moon H.J., Lee S.R., Shim S.N., Jeong S.H., Stonik V.A., Rasskazov V.A., Zvyagintseva Т., Lee Y.H. Fucoidan inhibits UVB-induced MMP-1 expression in human skin fibroblasts // Biol. Pharm. Bull. 2008. V. 31. P. 284-289.

108. Yang С., Chung D., Shina I.S., Lee Н., Kim J., Lee Y., You S. Effects of molecular weight and hydrolysis conditions on anticancer activity of fucoidans from sporophyll of Undariapinnatifida И Int. J. Biol. Macromol. 2008. V. 43. P. 433-437.

109. Kuda Т., Yano Т., Matsuda N., Nishizawa M. Inhibitory effects of laminaran and low molecular alginate against the putrefactive compounds produced by intestinal microflora in vitro and in rats // Food Chem. 2005. V. 91. P. 745-749.

110. Ни X.K., Jiang X.L., Aubree E., Boulenguer P., Critchley A.T. Preparation and in vivo antitumor activity of к-carrageenan oligosaccharides // Pharm. Biol. 2006. V. 44. P. 646-650.

111. Zhou G.F., Sun Y.P., Xin H., Zhang Y.N., Li Z., Xu Z.H. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight л-carrageenans from Chondrus ocellatus // Pharmacol. Res. 2004. V. 50. P. 47-53.

112. Sun Т., Tao H.N., Xie J., Zhang S.O., Xu X. Degradation and antioxidant activity of kappa-carrageenans // J. Appl. Polym. Sci. 2010. V. 117. P. 194-199.

113. Zhou G.F., Xin H., Sheng W.X., Sun Y.P., Li Z., Xu Z.H. In vivo growth-inhibition of SI80 tumor by mixture of 5-Fu and low molecular Л-carrageenan from Chondrus ocellatus II Pharmacol. Res. 2005. V. 51. P. 153-157.

114. Zhou G.F., Sheng W.X., Yao W.H., Wang C.H. Effect of low molecular ^-carrageenan from Chondrus ocellatus on antitumor H-22 activity of 5-Fu // Pharmacol. Res. 2006. V. 53. P. 129-134.

115. Yuan H., Song J., Li X., Li N., Dai J. Immunomodulation and antitumor activity of k-carrageenan oligosaccharides // Cancer Lett. 2006. V. 243. P. 228-234.

116. Yin H., Du Y.G., Zhang J.Z. Low molecular weight and oligomeric chitosans and their bioactivities // Curr. Top. Med. Chem. 2009. V. 9. P. 1546-1559.

117. Liu C.H., Xi T., Lin Q.X., Xing Y.Y., Ye L., Luo X.G., Wang F.S. Immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Strongylocentrotus nudus eggs // Int. Immunopharm. 2008. V. 8. P. 1835-1841.

118. Sun L.M., Zhu B.W., Li D.M., Wang L.S., Dong X.P., Murata Y., Xing R., Dong Y. Purification and bioactivity of a sulfated polysaccharide conjugate from viscera of abalone Haliotis discus hannai Ino // Food Agric. Immunol. 2010. V. 21. P. 15-26.

119. Ji H.W., Shao H.Y., Zhang C.H., Hong P.Z., Xiong H.P. Separation of the polysaccharides in Caulerpa racemosa and their chemical composition and antitumor activity //J. Appl. Polym. Sci. 2008. V. 110. P. 1435-1440.

120. Sun C., Wang J.W., Fang L., Gao X.D., Tan R.X. Free radical scavenging and antioxidant activities of EPS2, an exopolysaccharide produced by a marine filamentous fungus Keissleriella sp. YS 4108 // Life Sci. 2004. V. 75. P. 1063-1073.

121. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (hoiothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis, and evolution // J. Nat. Toxins 1999. V. 8. P. 235-248.

122. Aminin D.L., Agafonova I.G., Berdyshev E.V., Isachenko E.G., Avilov S.A, Stonik V.A. Immunomodulatory properties of cucumariosides from the edible Far-Eastern holothurian Cucumaria japonica II J. Med. Food. 2001. V. 4. P. 127-135.

123. Aminin D.L., Pinegin B.V., Pichugina L.V., Zaporpzhets T.S., Agafonova I.G., Boguslavski V.M., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of cumaside // Int. Immunopharm. 2006. V. 6. P. 1070-1082.

124. Aminin D.L., Chaykina E.L., Agafonova I.G., Avilov S.A., Kalinin Y.I., Stonik V.A. Antitumor activity of the immunomodulatory lead cumaside // Int. Immunopharm. 2010. V. 10. P. 648-654.

125. Tong Y., Zhang X., Tian F., Yi Y., Xu Q., Li L., Tong L., Lin L., Ding J. Philinopside A, a novel marine-derived compound possessing dual anti-angiogenic and anti-tumor effects // Int. J. Cancer 2005. V. 114. 843-853.

126. Tian F., Zhang X., Tong Y., Yi Y., Zhang S., Li L., Sun P., Lin L., Ding J. PE, a new sulfated saponin from sea cucumber, exhibits anti-angiogenic and anti-tumor activities in vitro and in vivo II Cancer Biol. Ther. 2005. V. 4. P. 874-882.

127. Fujiki H., Suganuma M., Suguri H., Yoshizawa S., Takagi K., Kobayashi M. Sarcophytol-A and sarcophytol-B inhibit tumor promotion by teleocidin in 2-stage carcinogenesis in mouse skin // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1989. V. 115. P. 25-28.

128. Wei H., Frenkel K. Suppression of tumor promoter-induced oxidative events and DNA damage in vivo by sarcophytol A: a possible mechanism of antipromotion // Cancer Res. 1992. V. 52. P. 2298-2303.

129. Fujiki H., Suganuma M., Yatsunami J., Komori A., Okabe S., Nishiwaki-Matsushima R., Ohta T. Significant marine natural products in cancer research // Gazzetta Chim. Ital. 1993. V. 123. P. 309-316.

130. Fujiki H., Suganuma M., Komori A., Yatsunami J., Okabe S., Ohta T., Sueoka E. A new tumor promotion pathway and its inhibitors // Cancer Det. Prev. 1994. V. 18. P. 1-7.

131. Bhimani R.S., Troll W., Grunberger D., Frenkel K. Inhibition of oxidative stress in HeLa cells by chermopreventive agents // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 4528-4533.

132. Yokomatsu H., Satake K., Hiura A., Tsutsumi M., Suganuma M. Sarcophytol-A a new chemotherapeutic and chemopreventive agent for pancreatic-cancer // Pancreas 1994. V. 9. P. 526-530.

133. Yokomatsu H., Hiura A., Tsutsumi M., Satake K. Inhibitory effect of sarcophytol A on pancreatic carcinogenesis after initiation by N-nitrosobis(2-oxypropyl)amine in Syrian Hamsters // Pancreas 1996. V. 13. P. 154-159.

134. Narisawa T., Takahashi M., Niwa M., Fukaura Y., Fujiki H. Inhibition of methylnitrosourea-induced large bowel-cancer development in rats by sarcophytol A, a product from a marine soft coral Sarcophyton glaucum II Cancer Res. 1989. V. 49. P. 32873289.

135. Sawant S.S., Youssef D.T.A., Reiland J., Ferniz M., Marchetti D., El Sayed K.A. Biocatalytic and antimetastatic studies of the marine cembranoids sarcophine and 2-epi-l6-deoxysarcophine // J. Nat. Prod. 2006. V. 69. P. 1010-1013.

136. Katsuyama I., Fahmy H., Zjawiony J.K., Khalifa S.I., Kilada R.W., Konoshima T., Takasaki M., Tokuda H. Semisynthesis of new sarcophine derivatives with chemopreventive activity // J. Nat. Prod. 2002. V. 65. P. 1809-1814.

137. Pec M.K., Hellan M., Moser-Thier K., Fernandez J.J., Souto M.I., Kubista E. Inhibitory effects of a novel marine terpenoid on sensitive and multidrug resistant KB cell lines // Anticancer Res. 1998. V. 18. P. 3027-3032.

138. Pastor P.G., De Rosa S., Giulio A., Paya M., Alcaraz M.J. Modulation of acute and chronic inflammatory processes by cacospongionolide B, a novel inhibitor of human synovial phospholipase A2 // Br. J. Pharmacol. 1999. V. 126. P. 301-311.

139. El Sayed K.A., Mayer A.M.S., Kelly M., Hamann M.T. The biocatalytic transformation of furan to amide in the bioactive marine natural product palinurin // J. Org. Chem. 1999. V.64. P. 9258-9260.

140. Aoki S., Higuchi K., Isozumi N., Matsui K., Miyamoto Y., Itoh N., Tanaka K., Kobayashi M. Differentiation in chronic myelogenous leukemia cell K562 by spongean sesterterpene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 282. P. 426-431.

141. Aoki S., Kong D., Matsui K., Kobayashi M. Smenospongine, a spongean sesquiterpene aminoquinone, induces eritroid differentiation in K562 cells // Anticancer Drugs 2004. V. 15. P. 363-369.

142. Kong D., Aoki S., Sowa Y., Sakai T., Kobayashi M. Smenospongine, a sesquiterpene aminoquinone from a marine sponge, induces G1 arrest or apoptosis in different leukemia cells // Mar. Drugs 2008. V. 6. P. 480-488.

143. Choi H.J., Choi Y.H., Yee S.B., Jung J.H., Kim N.D. Ircinin-1 induces cell cycle arrest and apoptosis in SK-MEL-2 human melanoma cells // Mol. Carcinog. 2005. V. 44. P. 162173.

144. Liu W.K., Cheung F.W., Che C.T. Stellettin A induces oxidative stress and apoptosis in HL-60 human leukemia and LNCaP prostate cancer cell lines // J. Nat. Prod. 2006. V. 69. P. 934-937.

145. Liu W.K., Ho J.C., Che C.T. Apoptotic activity of isomalabaricane triterpenes on human promyelocytic leukemia HL-60 cells // Cancer Lett. 2005. V. 230. P. 102-110.

146. Jiang Y., Ahn E.Y., Ryu S.H., Kim D.K., Park J.S., Kang S.W., You S., Lee B.J., Jung J.H. Mechanism of cell cycle arrest by (8E, 13Z, 20Z)-strobilinin/(7£, 13Z, 20Z)-felixinin from a marine sponge Psammocinia sp. // Oncol Rep. 2005. V. 14. P. 957-962.

147. Copp B.R., Fairchild C.R., Cornell L., Casazza A.M., Robinson S., Ireland C.M. Naamidine A is an antagonist of the epidermal growth factor receptor and an in vivo active antitumor agent // J. Med. Chem. 1998. V. 41. P. 3909-3911.

148. Matsumoto S.S., Haughey H.M., Schmehl D.M., Venables D.A., Ireland C.M., Holden J.A., Barrows L.R. Makaluvamines vary in ability to induce dose-dependent DNA cleavage via topoisomerase II interaction // Anticancer drugs 1999. V. 10. P. 39-45.

149. Wang W., Rayburn E.R., Velu S.E., Nadkarni D.H., Murugesan S., Zhang R. In vitro and in vivo anticancer activity of novel synthetic makaluvamine analogues // Clin. Cancer Res. 2009. V. 15. P. 3511-3518.

150. Hirano K., Kubota T., Tsuda M., Watanabe K., Fromont J., Kobayashi J. Ma'edamines A and B, cytotoxic bromotyrosine alkaloids with a unique 2(lH)pyrazinone ring from sponge Suberea sp. // Tetrahedron 2000. V. 56. P. 8107-8110.

151. Zhou B.N., Slebodnick C., Johnson R.K., Mattern M.R., Kingston D.G.I. New cytotoxic manzamine alkaloids from a palaun sponge // Tetrahedron 2000. V. 56. P. 5781-5784.

152. Kamata K., Okamoto S., Oka S., Kamata H., Yagisawa H., Hirata H. Cycloprodigiosin hydrochloride suppresses tumor necrosis factor (TNF) a-induced transcriptional activation by NF-kB // FEBS Lett. 2001. V. 507. P. 74-80.

153. Roskelley C.D., Williams D.E., McHardy L.M., Leong K.G., Troussard A., Karsan A., Andersen R.J., Dedhar S., Roberge M. Inhibition of tumor cell invasion and angiogenesis by motuporamines // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 6788-6794.

154. Dirsch V.M., Kirschke S.O., Estermeier M., Steffan B., Vollmar A.M. Apoptosis signaling triggered by the marine alkaloid ascididemin is routed via caspase-2 and JNK to mitochondria // Oncogene 2004. V. 23. P. 1586-1593.

155. Aoki S., Kong D., Matsui K., Kobayashi M. Erythroid fifferentiation in K562 chronic myelogenous cells induced by crambescidin 800, a pentacyclic guanidine alkaloid //

156. Anticancer Res. 2004. V. 24. P. 2325-2330.

157. Oku N., Nagai K., Shindoh N., Terada Y., Van Soest R.W.M., Matsunaga S., Fusetani N. Three new cyclostellettamines, which inhibit histone deacetylase, from a marine sponge of the genus Xestospongia// Bioorg Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. P. 2617-2620.

158. Jiang X.X., Zhao B.G., Britton R., Lim L.Y., Leong D., Sanghera J.S., Zhou B.B.S., Piers E., Andersen R.J., Roberge M. Inhibition of Chkl by the G2 DNA damage checkpoint inhibitor isogranulatimide // Mol. Cancer Ther. 2004. V. 3. P. 1221-1227.

159. Kluza J., Gallego M.A., Loyens A., Beauvillain J.C., Sousa-Faro J.M., Cuevas C., Marchetti P., Bailly C. Cancer cell mitochondria are direct proapoptotic targets for the marine antitumor drug lamellarin D // Cancer Res. 2006. V. 66. P. 3177-3187.

160. Aoki S., Kong D., Suna H., Sowa Y., Sakai T., Setiawan A., Kobayashi M. Aaptamine, a spongean alkaloid, activates p21 promoter in a p53-independent manner // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 342. P. 101-106.

161. Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Dyshlovoy S.A., Krasokhin V.B., Stonik V.A. Aaptamine alkaloids from the Vietnamese sponge A aptos sp. //Nat. Prod. Commun. 2009. V. 4. P. 1085-1088.

162. Utkina N.K. Antioxidant activity of aromatic alkaloids from the marine sponges Aaptos aaptos and Hyrtios sp. // Chem. Nat. Comp. 2009. V. 45. P. 849-853.

163. Soni R., Muller L., Furet P., Schoepfer J., Stephan C., Zumstein-Mecker S., Fretz H., Chaudhuri B. Inhibition of cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4) by fascaplysin, a marine natural product // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 275. P. 877-884.

164. Fujiki H., Suganuma M. Naturally-derived tumor promoters and inhibitors of carcinogenesis // J. Toxicol.-Toxin Rev. 1996. V. 15. P. 129-156.

165. Sato K., Horibe K., Amano K., Mitusi-Saito M., Hori M., Matsunaga S., Fusetani N., Ozaki H., Karaki H. Membrane permeabilization induced by discodermin A, a novel marine bioactive peptide// Toxicon 2001. V. 39. P. 259-264.

166. Erba E., Bergamaschi D., Ronzoni S., Faretta M., Taverna S., Bonfanti M., Catapano C.V., Faircloth G., Jimeno J., D'lncalci M. Mode of action of thiocoraline, a natural marine compound with anti-tumor activity // Br. J. Cancer 1999. V. 80. P. 971-980.

167. Aoki S., Higuchi K., Ye Y., Satari R., Kobayashi M. Melophlins A and B, novel tetramic acids reversing the phenotype of ras-transformed cells, from the marine sponge Melophlus sarassinorum II Tetrahedron 2000. V. 56. P. 1833-1836.

168. Hood K.A., West L.M., Northcote P.T., Berridge M.V., Miller J.H. Induction of apoptosis by the marine sponge (Mycale) metabolites, mycalamide A and pateamine <7 Apoptosis 2001. V. 6. P. 207-219.

169. KorneevaN.L. Translational dysregulation by pateamine A // Chem. Biol. 2007. V. 14. P. 5-7.

170. Miyamoto T., Kodama K., Aramaki Y., Higuchi R., Van Soest R.W.M. Orostanal, a novel abeo-sterol inducing apoptosis in leukemia cell from a marine sponge, Stelletta hiwasaensis II Tetrahedron Lett. 2001. V. 42. P. 6349-6351.

171. Esposito G., Aiello A., Carbonelli S., Menna M., Fattorusso E., Iuvone T. Mechanism of cytotoxicity of turbinamide in vitro II Anticancer Res. 2002. V. 22. P. 2827-2831.

172. Rodrigues-Nieto S., Gonzalez-Iriarte M., Carmona R., Munoz-Chapuli R., Medina M.A., Quesada A.R. Antiangiogenic activity of aeroplysinin-1, a brominated compound isolated from a marine sponge // FASEB J. 2002. V. 16. P. 261-263.

173. Gajate C., An F., Mollinedo F. Rapid and selective apoptosis in human leukemic cells induced by aplidine through a Fas/CD95- and mitochondrial-mediated mechanism // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9. P. 1535-1545.

174. Muller I.M., Dirsch V.M., Rudy A., Lopez-Anton N., Pettit G.R., Vollmar A.M. Cephalostatin 1 inactivates Bcl-2 by hyperphosphorylation independent of M-phase arrest and DNA damage // Mol. Pharmacol. 2005. V. 67. P. 1684-1689.

175. Bowman E.J., Gustafson K.R., Bowman B.J., Boyd M.R. Identification of a new chondropsin class of antitumor compound that selectively inhibits V-ATPases // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 44147-44152.

176. Williams D.E., Roberge M., Van Soest R., Andersen R.J. Spirastrellolide A, an antimitotic macrolide isolated from the Caribbean marine sponge Spirastrella coccinea H J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 5296-5297.

177. Choi H.J., Bae S.J., Kim N.D., Jung J.H., Choi Y.H. Induction of apoptosis by dideoxypetrosynol A, a polyacetylene from the sponge Petrosia sp., in human skin melanoma cells // Int. J. Mol. Med. 2004. V. 14. P. 1091-1096.

178. Richardson A.D., Ireland C.M. A profile of the in vitro antitumor activity of lissoclinolide // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004. V. 195. P. 55-61.

179. Shim J.S., Lee H.S., Shin J., Kwon H.J. Psammaplin A, a marine narural product, inhibits aminopeptidase N and suppresses angiogenesis in vitro II Cancer Lett. 2004. V. 203. P. 163169.

180. Schmidt E.W., Raventos-Suarez C., Bifano M., Menendez A.T., Fairchild C.R., Faulkner D.J. Scleritodermin A, a cytotoxic cyclic peptide from the lithistid sponge Scleritoderma nodosum II J. Nat. Prod. 2004. V. 67. P. 475-478.

181. Chiang P.C., Chien C.L., Pan S.L., Chen W.P., Teng C.M., Shen Y.C., Guh J.H. Induction of endoplasmic reticulum stress and apoptosis by a marine prostanoid in human hepatocellular carcinoma // J. Hepatol. 2005. V. 43. P. 679-686.

182. Chiang P.C., Kung F.L., Huang D.M., Li T.K., Fan J.R., Pan S.L., Shen Y.C., Guh J.H. Induction of Fas clustering and apoptosis by coral prostanoid in human hormone-resistant prostate cancer cells // Eur. J. Pharmacol. 2006. V. 542. P. 22-30.

183. Huang Y.C., Guh J.H., Shen Y.C., Teng C.M. Investigation of anticancer mechanism of clavulone II, a coral cyclopentenone prostaglandin analog, in human acute promyelocytic leukemia//J. Biomed Sci. 2005. V. 12. P. 335-345.

184. Aoki S., Watanabe Y., Sanagawa M., Setiawan A., Kotoku N., Kobayashi M. Cortistatins A, B, C, and D, anti-angiogenic steroidal alkaloids, from the marine sponge Corticum simplex Hi. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 3148-3149.

185. Chevallier C., Bugni T.S., Feng X., Harper M.K., Orendt A.M., Ireland C.M. Tedanolide C: A potent new 18-membered-ring cytotoxic macrolide isolated from the Papua New Guinea marine sponge Ircinia sp. // J. Org. Chem. 2006. V. 71. P. 2510-2513.

186. Diyabalanage T., Amsler C.D., McClintock J.B., Baker B.J. Palmerolide A, a cytotoxic macrolide from the Antarctic tunicate Synoicum adareanum II J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 5630-5631.

187. Gamal-Eldeen A.M., Abdel-Lateff A. and Okino T. Modulation of carcinogen metabolizing enzymes by chromanone A, a new chromone derivative from algicolous marine fungus Penicillium sp. // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2009. V. 28. P. 317-322.

188. Folmer F., Harrison W.T.A., Tabudravu J.N., Juspars M., Aalbersberg W., Feussner K., Wright A.D., Dicato M., Diederich M. NF-KB-inhibiting naphthopyrones from the Fijian echinoderm Comanthusparvicirrus II J. Nat. Prod. 2008. V. 71. P. 106-111.

189. Ghaly N.S., Melek F.R., Mabry T.J. Anglular naphthopyrones with DPPH scavenging activity from the crinoid Oligometra serripinna //Rev. Latinoamer. Quim. 2009. V. 37. P. 252-261.

190. Sauer L.A., Dauchy R.T., Blask D.E. Mechanism for the antitumor and anticachectic effects of n-3 fatty acids // Cancer Res. 2000. V. 60. P. 5289-5295.

191. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Терпеноиды морских организмов. М., Наука. 1986. С. 8694.

192. Martin J.D., Darias J. Algal sesquiterpenoids // In Marine natural products, chemical and biological perspectives. Scheuer P. J., Darias J. (Eds). New York. Academic Press. 1978. P. 125-173.

193. Sakai R., Higa Т., Jefford C.W., Bernardinelli G. The absolute configurations and biogenesis of some new halogenated chamigranes from the sea hare Aplysia dactylomela II Helv. Chim. Acta 1986. V. 69. P. 91-105.

194. Fraga B.M. Natural sesquiterpenoids // Nat. Prod. Rep. 2005. V. 22. P. 465-486.

195. Федоров C.H., Решетняк M.B., Щедрин А.П., Ильин С.Г., Стручков Ю.Т., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Новый галогенированный хамиграновый сесквитерпеноид к.; моллюска Aplysia sp. Структура и абсолютная конфигурация // Докл. АН СССР. 1989. Т. 305. С. 877-879.

196. Suzuki M., Kurosawa E., Irie T. Three new sesquiterpenoids containing bromine, minor constituents of Laurencia glandulifera. II Tetrahedron Lett. 1974. V. 15, P. 821-824.

197. Гордон А., Форд H. Спутник химика. M., Мир. 1976. С. 128.

198. Lacoume В. RMN. Un exemple de couplage a longue distance 4 J entre protons axiaux 11 Bull. Soc. Chim. France. 1967. N. 9. P. 3496-3498.

199. Reddy N.S., Goud T.V., Venkateswartu Y. Acid catalysed rearrangement of delta(9,15)-africanene: a cytotoxic sesquiterpene. // J. Chem. Res. S 2000. V. 9. P. 438

200. McEnroe F.J., Fenical W. Structures and synthesis of some new antibacterial sesquiterpenoids from the gorgonian coral Pseudopterogorgia rigida. II Tetrahedron 1978. V. 34. P. 1661-1664.

201. Chen C.Y., Shen Y.C., Chen Y.J., Sheu J.H., Duh C.Y. Bioactive sesquiterpenes from a taiwanese marine sponge Parahigginsia sp. // J. Nat. Prod. 1999. V. 62. P. 573-576.

202. Fedorov S.N., Shubina L.K., Bode A.M., Stonik V.A, Dong Z. Dactylone inhibits epidermal growth factor-induced transformation and phenotype expression of human cancer cells and induces GpS arrest and apoptosis // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 5914-5920.

203. Colburn N.H., Former B.F., Nelson K.A., Yuspa S.H. Tumour promoter induces anchorage independence irreversibly //Nature 1979. V. 281. P. 589-591.

204. Dong Z., Cmarik J.L., Wendel E.J., Colburn N.H. Differential transformation efficiency but not AP-1 induction under anchorage-dependent and -independent conditions // Carcinogenesis. 1994. V. 15. P. 1001-1004.

205. Dong Z., Watts S.G., Sun Y., Colburn N.H. Progressive elevation of AP-1 activity during preneoplastic-to neoplastic progression as modeled in mouse JB6 cell variants // Int. J. Oncol. 1995. V. 7. P. 359-364.

206. Dong Z., Cmarik J.L. Harvesting cells under anchorage-independent cell transformation conditions for biochemical analyses // Sci. STKE. 2002. V. 2002. P. PL7.

207. Lavrovsky V., Dong Z, Ma W.Y., Colburn N. Drug-induced reversion of progression phenotype is accompanied by reversion of AP-1 phenotype in JB6 cells // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 1996. V. 32. P. 234-237.

208. Strickland J., Sun Y., Dong Z., Colburn N.H. Grafting assay distinguishes promotion sensitive from promotion resistant JB6 cells // Carcinogenesis 1997. V. 18. P. 1135-1138.

209. Sun Y., Nakamura K., Hegamyer G., Dong Z., Colburn N. No point mutation of Ha-ras or p53 genes expressed in preneoplastic-to-neoplastic progression as modeled in mouse JB6 cell variants // Mol. Carcinog. 1993. V. 8. P. 49-57.

210. Alblas J., Slager-Davidov R., Steenbergh P.H., Sussenbach J.S., van der Burg B. The role of MAP kinase in TPA-mediated cell cycle arrest of human breast cancer cells // Oncogene 1998. V. 16. P. 131-139.

211. Marshall C.J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signalregulated kinase activation // Cell 1995. V. 80. P. 179-185.

212. Pumiglia K.M., Decker S.J. Cell cycle arrest mediated by the MEK/mitogen-activated protein kinase pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 448-452.

213. Kyriakis J.M., Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation // Physiol. Rev. 2001. V. 81. P. 807-869.

214. Mousa S.S., Mousa S.A. Effect of resveratrol on angiogenesis and platelet/fibrin-accelerated tumor growth in the chick chorioallantoic membrane model // Nutr. Cancer 2005. V. 52. P.59-65.

215. Mayhew C.N., Perkin L.M., Zang X.P., Sage J., Jacks T., Knudsen E.S. Discrete signaling pathways participate in Rb-dependent responses to chemotherapeutic agents // Oncogene 2004. V. 23. P. 4107-4120.

216. Weinberg R.A. The retinoblastoma protein and cell cycle control // Cell 1995. V. 81. P. 323-330.

217. Hatakeyama M., Weinberg R.A. The role of RB in cell cycle control // Prog. Cell Cycle Res. 1995. V. 1. P.9-19.

218. Agarwal C., Dhanalakshmi S., Singh R.P., Agarwal R. Inositol hexaphosphate inhibits growth and induces G1 arrest and apoptotic death of androgen-dependent human prostate carcinoma LNCaP cells // Neoplasia 2004. V. 6. P. 646-659.

219. Chinni S.R., Li Y., Upadhyay S., Koppolu P.K., Sarkar F.H. Indole-3-carbinol (I3C) induced cell growth inhibition, G1 cell cycle arrest and apoptosis in prostate cancer cells // Oncogene 2001. V. 20. P. 2927-2936.

220. Todd D.E., Densham R.M., Molton S.A., Balmanno K., Newson C., Weston C.R., Garner A.P., Scott L., Cook S.J. ERK1/2 and p38 cooperate to induce a p21CIPl-dependent G1 ce.P. cycle arrest // Oncogene 2004. V. 23. P. 3284-3295.

221. Rashid M.A, Gustafson K.B, Cardellina J.H, Boyd M.R. Brominated chamigrane sesquiterpenoids produce a novel profile of differential cytotoxicity in the NCI in vitro screen //Nat. Prod. Lett. 1995. V. 6. P.255-259.

222. Juagdan E.J., Kalidinidi R., Scheuer P.J. Two new chamigranes from an Hawaiian red algae, Laurencia cartilagínea II Tetrahedron 1997. V. 53. P. 521-528.

223. Vairappan C.S., Suzuki M., Abe T., Masuda M. Halogenated metabolites with antibacterial activity from the Okinawan Laurencia species // Phytochemistry 2001. V. 58. P. 517-523.

224. Konig G.M., Wright A.D. Laurencia rigida: chemical investigations of its antifouling dichloromethane extract // J. Nat. Prod. 1997. V. 60. P. 967-970.

225. Konig G.M., Wright A.D., Franzblau S.G. Assessment of antimycobacterial activity of a series of mainly marine derived natural products // Planta Med. 2000. V. 66. P.337-342.

226. Copp B.R. Antimycobacterial natural products // Nat. Prod. Rep. 2003. V. 20. P. 535-557.

227. Suzuki M., Daitoh M., Vairappan C.S., Abe T., Masuda M. Novel halogenated metabolites from the Malaysian Laurenciapannosa II J. Nat. Prod. 2001. V. 64. P. 597-602.

228. Kimura J., Kamada N., Tsujimoto Y. Fourteen chamigrane derivatives from a red alga, Laurencia nidifica II Bull. Chem. Soc. Jpn. 1999. V. 72. P. 289-292.

229. Ojika M., Shizuri Y., Yamada K. A halogenated chamigrane epoxide and 6 related halogen-containing sesquiterpenes from the red alga Laurencia okamuria II Phytochemistry 1982. V. 21. P. 2410-2411.

230. Suzuki T., Kikuchi H., Kurosawa E. Constituents of marine plants. 46.6. New sesquiterpenoids from the red alga Laurencia nipponica Yamada // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1982. V. 55. P. 1561-1563.

231. Furusaki A., Katayama C., Matsumoto T., Suzuki M., Suzuki T., Kikuchi H., Kurosawa E. The crystal and molecular-structure of 7,8-epoxyhalochamigrene // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1982. V. 55. P. 3398-3402.

232. Suzuki M., Segawa M., Suzuki T., Kurosawa E. Constituens of marine plants. 58. Structures of halogenated chamigrene derivatives, minor constituents from the red alga Laurencia nipponica Yamada // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1983. V. 56. V. 3824-3826.

233. Suzuki M., Segawa M., Suzuki T., Kurosawa E. Structures of 2 new halochamigrene derivatives from the red alga Laurencia nipponica Yamada // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1985. V. 58. P. 2435-2436.

234. Brennan M.R., Erickson K.L., Minott D.A., Pascoe K.O. Chamigrane metabolites from a jamaican variety of Laurencia obtusa. II Phytochemistry. 1987. V. 26. P. 1053-1057.

235. Kennedy D.J., Selby I.A., Thomson R.H. Chamigrane metabolites from Laurencia obtusa and Laurencia scoparia II Phytochemistry. 1988. V. 27. P. 1761-1766.

236. Guella G., Oztunc A., Mancini I., Pietra F. Stereochemical features of sesquiterpene metabolites as a distinctive trait of red seaweeds in the genus Laurencia II Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 8261-8264.

237. Francisco M.E.Y., Turnbull M.M., Erickson K.L. Cartilagineol, the fourth lineage of Laurencia-derived polyhalogenated chamigrene // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. P. 52895292.

238. Pitombo L.F., Kaiser C.R., Pinto A.C. Occurrence of chamigrenes in Aplysia dactylomela from Brazilian waters // Bol. Soc. Chil. Quim. 1996. V. 41. P. 433-436.

239. Faulkner D.J. Interesting aspects of marine natural products chemistry // Tetrahedron 1977. V. 33. P. 1421-1443.

240. Bittner M.L., Silva M., Paul V.J., Fenical W. A rearranged chamigrene derivative and its potential biogenetic precursor from a new species of the marine red algal genus Laurencia (Rhodomelaceae)//Phytochemistry 1985. V. 24. P. 987-989.

241. Fedorov S.N., Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Lyakhova E.G., Stonik V.A. Structure and absolute configuration of a new rearrannged chamigran-type sesquiterpenoid from the sea hare Aplysia sp. // Tetrahedron Lett. 2000. V. 41. P. 1979-1982.

242. Fenical W. Topics in the biochemistry of natural products // In Recent Advances in Phytochemistry. Swain Т., Waller G.R. (Eds). New York, Plenum Press. 1979. V. 13. P. 219239.

243. Walker R.P., Faulkner D.J., Van Engen D., Clardy J. Sceptrin, an antimicrobial agent from the sponge Agelas sceptrum II J. Am. Chem. Soc. 1981. V. 103. P. 6772-6773.

244. Kobayashi J., Tsuda M., Ohizumi Y. A potent actomyosin ATPase activator from the Okinawan marine sponge Agelas cf. nemoechinata II Experientia 1991. V. 47. P. 301-304.

245. Keifer P.A., Schwartz R.E., Koker M.E.S., Hughes R.G., Rittschof D., Rinehart K.L. Bioactive bromopyrrole metabolites from the Carribean sponge Agelas conifera II J. Org. Chem. 1991. V. 56. P. 2965-2975.

246. Brothner-by, A.A. // In Advances in Magnetic Resonance. Waugh, J.S. (Ed). New York, Academic Press. 1965; V. 1. P. 195-316.

247. Cargill R.L., Beckham M.E., Damewood J.R., Pond D.M., Bundy W.A., Bordner J. Acid-catalyzed rearrangements and additions of P,у-unsaturated ketones // J. Org. Chem. 1972. V. 37. P. 78-84.

248. Шубина JI.K., Федоров C.H., Калиновский А.И., Дмитренок А.С., Джин Д.О., Сонг М.Г., Квак Д.Й., Стоник В.А. Четыре новых хамиграновых сесквитерпеноида из заднежаберного моллюска Aplysia dactylomela II Изв. АН Сер. Хим. 2007. С. 2037-2042.

249. Kolesnikova S.A., Kalinovsky A.I., Fedorov S.N., Shubina L.K., Stonik V.A. Diterpenes from the Far-Eastern brown alga Dictyota dichotoma II Phytochemistry 2006. V. 67. P. 21152119.

250. Левина Э.В., Калиновский А.И., Стоник В.А., Федоров С.Н., Исаков В.В. Стероидные соединения из офиур. I. Новый стероидный сульфат из Ophiura sarsi II Хим. природ, соедин. 1988. С. 375-379.

251. Riccio R., D'Auria M.V., Minale L. Two new steroidal glycoside sulfates, longicaudoside A and B, from the Mediterranean ophiuroid Ophioderma logicaudum И J. Org. Chem. 1986. V. 51. P. 533-536.

252. Кича А.А., Калиновский А.И., Левина Э.В., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Полигидроксилирванные стероиды из пищеварительных органов морской звезды Patiriapectinifera II Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 975-977.

253. D'Auria M.V., Riccio R., Minale L., La Barre S., Pusset J. Novel marine steroid sulfates from Pacific ophiuroids // J. Org. Chem. 1987. V. 52. P. 3947-3952.

254. D'Auria M.V., Riccio R., Uriarte E., Minale L., Tanaka J., Higa T. Isolation and structure elucidation of seven new polyhydroxylated sulfated sterols from the ophiuroid Ophiolepis superba II J. Org. Chem. 1989. V. 54. P. 234-239.

255. Левина Э.В., Федоров C.H., Стоник B.A., Андриященко П.В., Калиновский А.И., Исаков В.В. Стероидные соединения из офиур. II. Сульфатированные стероиды из Ophiura sarsi и Ophiura leptoctenia И Хим. природ, соедин. 1990. С.483-487.

256. Riccio R., D'Auria M.V., Minale L. Unusual sulfated marine steroids from the ophiuroid Ophioderma logicaudum II Tetrahedron 1985. V. 41. P. 6041-6046.

257. Fedorov S.N., Levina E.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Sulfated steroids from Pacific brittle stars Ophiopholis aculeata, Ophiura sarsi and Stegophiura brachiactis II J. Nat. Prod. 1994. V. 57. P. 1631-1637.

258. Wight J.L.C., Mc Innes A.G., Shimizu S., Smith D.G., Walter J.A. Identification of C-24 alkyl epimers of marine sterols by C13 nuclear maguctic resonance spectroscopy // Can. J. Chem. 1978. V. 56. P. 1898-1903.

259. Sturaro A., Guerriero A., De Glauser R., Pietra F. A new unexpected marine source of a molting hormone. Isolation of ecdysterone in large amounts from the zoanthid Geraldia savaglia И Experientia 1982. V. 38. P. 1184-1185.

260. Федоров C.H., Стоник B.A., Еляков Г.Б. Идентификация экдистероидов шестилучевых кораллов // Хим. природ, соедин. 1988. С.603-604.

261. Galbraith M.N., Horn D.H.S. Insect molting hormones: crustecdysone (20-hydroxyecdysone) from Podocarpus elatus II Aust. J. Chem. 1969. V. 22. P. 1045-1057.

262. Абубакиров H.K. Экдистероиды цветковых растений (Angiospermae) // Химия природ, соедин. 1981. С. 685-702.

263. Yasumoto Т., Yasumura D., Ohizumi Y., Takahashi M., Alcala A.C., Alcala L.C. Palytoxin in two speacies of xanthid crab from the Philippines // Agric. Biol. Chem. 1986. V. 50. P. 163-167.

264. Elyakov G.B., Stonik V.A., Levina E.V. Marine tetracyclic isoprenoidds: structure and biosynthesis //Pure Appl. Chem. 1990. V. 62. P. 1259-1262.

265. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Стероиды морских организмов. М., Наука. 1988. С. 61.

266. Авилов С. А., Стоник В. А., Калиновский А.И. Строение четырех новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japónica II Хим. природ, соедин. 1990.С. 787-793.

267. Левин B.C., Калинин В.И., Федоров С.Н., Смайли С. Структура тритерпеновых гликозидов и систематическое положение двух видов голотурий семейства Stichopodidae II Биология моря 1986. С.72-77.

268. Стоник В.А. Морские полярные стероиды // Успехи химии 2001. Т. 70. С. 763-808.

269. Stonik V.A., Ivanchina N.V., Kicha A.A. New polar steroids from starfish // Nat. Prod. Comm. 2008. V. 3. P. 1587-1610.

270. Blunt J.W., Copp B.R., Munro M.H.G., Northcote P.T., Prinsep M.R. Marine natural products //Nat. Prod. Rep. 2010. V.27. P. 165-237.

271. Blunt J.W., Copp B.R., Munro M.H.G., Northcote P.T., Prinsep M.R. Marine natural products //Nat. Prod. Rep. 2011. V.28. P. 196-268.

272. D'Auria M.V., Minale L., Riccio R. Polyoxygenated steroids of marine origin // Chem. Rev. 1993. У. 93. P. 1839-1895.

273. Andersson L., Bohlin L., Iorizzi M., Riccio R., Minale L., and Moreno-Lopez W. Biological activity of saponins and saponin-like compounds from starfish and brittle-stars // Toxicon 1989. V. 27. P. 179-188.

274. Aminin D.L., Agafonova I.G., Fedorov S.N. Biological activity of disulfated polyhydroxysteroids from the pacific brittle star Ophiopholis aculeata. II Сотр. Biochem. Physiol. 1995. У. 112C. P. 201-204.

275. Agafonova I.G., Aminin D.L., Shubina L.K., and Fedorov S.N. Influence of polyhydroxysteroids on Ca2+., // Steroids 2002. V. 67. P. 695-701.

276. Mainwaring W.I.P. Steroid receptors // In Cellular receptors for hormones and neurotransmitters. Schulster D., Levitzki A. (Eds). Chichester, New York, Brisbain, Toronto. John Wiley & Sons. 1980. P. 91-125.

277. Mendoza С., Soler A., Tesarik J. Nongenomic steroid action: independent targeting of a plasma membrane calcium channel and a tyrosine kinase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 210. P. 518-523.

278. Wehling M. Specific, nongenomic actions of steroid hormones // Annu. Rev. Physiol. 1997. V. 59. P. 365-393.

279. Doolan C.M., Harvey B.J. Rapid effect of steroid hormones on free intracellular calcium in T84 colonic epithelial cells // Am. J. Physiol. 1996. V. 271. P. С1935-1941.

280. Kobayashi J., Ishibashi M., Nakamura H., Ohizumi Y. Hymenosulphate, a novel sterol sulphate with Ca2+ releasing activity from the cultured marine haptophyte Hymenomonas sp. //J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1989. V. 1. P. 101-103.

281. Сова В.В., Левина Э.В., Андриященко П.В., Федоров С.Н., Елякова Л.Н. Действие полиоксистероидов из морских звезд и офиур на активность Р-1,3-глюканаз // Хим. природ, соедин. 1994. С.647-650.

282. Levina E.V., Andriyaschenko P.V., Stonik V.A., Kalinovsky A.I. Ophiuroid-type steroids in starfish of the genus Pteraster II Сотр. Biochem. Physiol. 1996. V. 114B. P. 49-52.

283. Андриященко П.В., Левина Э.В., Калиновский А.И. Стероидные соединения из дальневосточных морских звезд Luidia quinaria и Distolasterias elegans II Изв. АН Сер. Хим. 1996. С. 473-476.

284. Sova V.V., Elyakova L.A. Some aspects of the specificity and action pattern of 0-1,3-glucan glucanohydrolase from Spisula sachalinensis II Biochem. Biophys. Acta 1972. V. 258. P. 219-227.

285. Han C., Qi J., Ojika M. Structure-activity relationships of novel neuritogenic steroid glycosides from the Okinawan starfish Linckia laevigata II Bioorg. Med. Chem. 2006. 14. P. 4458-4465.

286. Ivanchina N.V., Kicha A.A., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Dmitrenok A.S., Chaikina E.L., Stonik V.A., Gavagnin M., Cimino G. Polar steroidal compounds from the Far Eastern starfish Henricia leviuscula II J. Nat. Prod. 2006. 69. P. 224-228.

287. Bernstein L.R., Colburn N.H. AP-l/Jun function is differentially induced in promotionsensitive and resistant JB6 cells // Science 1989. V. 244. P. 566-569.

288. Amit S., Ben-Neriah Y. NF-kB activation in cancer: a challenge for ubiquitination- and proteasome-based therapeutic approach // Seminars in Cancer Bioogyl. 2003. V. 13. P. 1528.

289. Beg A.A., Baltimore D. An essential role for NF-kB in preventing TNF-a induced cell death // Science 1996. V. 274. P. 782-784.

290. Prives C., Hall P.A. The p53 pathway // J. Pathol. 1999. V. 187. P. 112-126.

291. Johnson G.L., Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases// Science 2002. V. 298. P. 1911-1912.

292. Roux P.P., Blenis J. ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse biological functions // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V. 68. P. 320344.

293. Dubois M.A., Higuchi R., Komori T., Sasaki T. Structures of two new oligoglycoside sulfates, pectinosides E and F, and biological activities of the six new pectinosides // Liebigs Ann. Chem. 1988. P. 845-850.

294. Rinehart K.L., Sakai R., Holt T.G., Fregeua N.L., Thomas J.P., Seigler D.S., Wilson G.R., and Shield L.S. Biologically active natural products // Pure Appl. Chem. 1990. V. 62. P. 1277-1280.

295. Rinehart K.L. Antitumor compounds from tunicates // Med. Res. Rev. 2000. V. 20. P. 127.

296. Haefner B. Drugs from the deep: marine natural products as drug candidates // Drug Discov. Today 2003. V. 8. P. 536-544.

297. Radchenko O.S., Novikov V.L., Willis R.H., Murphy P.T., and Elyakov G.B. Synthesis of polycarpine, a cytotoxic sulfurcontaining alkaloid from the ascidian Polycarpa aurata, and related compounds // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 3581-3584.

298. Hickman J.A. Apoptosis induced by anticancer drugs // Cancer Metastasis Rev. 1992. V. 11. P. 121-139.

299. Budihardjo I., Oliver H., Lutter M., Luo X., and Wang X. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. V. 15. P. 269-290.

300. Liebermann D.A., Hoffman B., and Steinman R.A. Molecular controls of growth arrest and apoptosis: p53-dependent and independent pathways // Oncogene. 1995. V. 11. P. 199210.

301. Huang C., Ma W.Y., Goranson A., Dong Z. Resveratrol suppresses cell transformation and induces apoptosis through a p53-dependent pathway // Carcinogenesis 1999. V. 20. P. 237-242.

302. Nomura M., Kaji A., Ma W., Miyamoto K., Dong Z. Suppression of cell transformation and induction of apoptosis by caffeic acid phenethyl ester // Mol. Carcinog. 2001. V. 31. P. 83-89.

303. Huang C., Ma W.Y., Li J., Hecht S.S., Dong Z. Essential role of p53 in phenethyl isothiocyanate-induced apoptosis // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 4102—4106.

304. He Z., Ma W.Y., Hashimoto T., Bode A.M., Yang C.S., Dong Z. Induction of apoptosis by caffeine is mediated by the p53, Bax, and caspase 3 pathways // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 4396-4401.

305. Gu X.-H., Wang X.-Z., Jiang B. Syntheses and biological activities of bis(3-indolyl)thiazoles, analogues of marine bis(indole)alkaloid nortopsentins // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V. 9. P. 569-572.

306. Schupp P., Steube K., Meyer C., Proksch P. Anti-proliferative effects of new staurosporine derivatives isolated from a marine ascidian and its predatory flatworm // Cancer Lett. 2001. V. 174. P. 165-172.

307. Perry N.B., Ettouati L., Litaudon M., Blunt J.W., Munro M.H.G., Parkin S., Hope H. Alkaloids from the antarctic sponge Kirkpatrickia variolosa. Part 1: variolin B, a newantitumor and antiviral compound // Tetrahedron. 1994. V. 50. P. 3987-3992.

308. Ip Y.T., Davis R.J. Signal transduction by the c-Jun N-terminal kinase (JNK) from inflammation to development // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. V. 10. P. 205-219.

309. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J., Davis R.J., Greenberg M.E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis // Science 1995. V. 270. P. 1326-1331.

310. Seimiya H., Mashima T., Toho M., Tsuruo T. c-Jun NH2-terminal kinase-mediated activation of interleukin-1 beta converting enzyme/CED-3-like protease during anticanccr drug-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 4631^1636.

311. Bursch W., Oberhammer F., Schulte-Hermann R. Cell death by apoptosis and its protective role against disease // Trends Pharmacol. Sci. 1992. V. 13. P 245-251.

312. Martinez E.J., Corey E.J., Owa T. Antitumor activity- and gene expression-based profiling of ecteinascidin Et 743 and phthalascidin Pt 650 // Chem. Biol. 2001. V. 8. P. 1151-1160.

313. Kuan C.Y., Yang D.D., Samanta Roy D.R., Davis R.J., Rakic P., Flavell R.A. The Jnkl and Jnk2 protein kinases are required for regional specific apoptosis during early brain development//Neuron 1999. V. 22. P. 667-676.

314. Adams J.L., Badger A.M., Kumar S., Lee J.C. p38 MAP kinase: molecular target for the inhibition of pro-inflammatory cytokines // Prog. Med. Chem. 2001. V. 38. P. 1-60.

315. Guan Z., Buckman S.Y., Pentland A.P., Templeton D.J., Morrison A.R. Induction of cyclooxygenase-2 by the activated MEKK1 —> SEK1/MKK4 —> p38 mitogen-activated protein kinase pathway // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 12901-12908.

316. Tsujii M., Kawano S., DuBois R.N. Cyclooxygenase-2 expression in human colon cancer cells increases metastatic potential // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 3336-3340.

317. Tsujii M., DuBois R.N. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2 // Cell. 1995. V. 83. P. 493-501.

318. Fujita N., Tsuruo T. Survival-signaling pathway as a promising target for cancer chemotherapy // Cancer Chemother. Pharmacol. 2003. V. 52(Suppl 1). P. S24-S28.

319. Hickmanand E.S., Helin K. The p53 tumour suppressor protein // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2000. V. 17. P. 179-211

320. Unger T., Sionov R.V., Moallem E., Yee C.L., Howley P.M., Oren M., Haupt Y. Mutations in serines 15 and 20 of human p53 impair its apoptotic activity // Oncogene 1999. V. 18. P. 3205-3212.

321. Hollstein M., Rice K., Greenblatt M.S., Soussi T., Fuchs R., Sorlie T., Hovig E., Smith-Sorensen B., Montesano R., Harris C.C. Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell lines //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 3551-3555.

322. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis // Nature 2000. V. 407. P. 770-776.

323. Mischak R. Assessment of caspase activity; synthetic substrates and inhibitors // Bioconcepts 2003. V. 9.2. P. 1-20.

324. Aune G.J., Furuta T., Pommier Y. Ecteinascidin 743: a novel anticancer drug with a unique mechanism of action // Anticancer Drugs 2002. V. 13. P. 545-555.

325. Ding H.F., Lin Y.L., McGill G., Juo P., Zhu H., Blenis J., Yuan J., Fisher D.E. Essential role for caspase-8 in transcription-independent apoptosis triggered by p53 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 38905-3891.

326. Mihara M., Erster S., Zaika A., Petrenko O., Chittenden T., Pancoska P., Moll U.M. p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 577-590.

327. Belofsky G.N., Gloer J.B., Wicklow D.T., Dowd P.F. Antiinsectan alkaloids: shearinines A-C and a new paxilline derivative from the ascostromata of Eupenicillium shearii. II Tetrahedron 1995. V. 51. P. 3959-3968.

328. Pennock J.F. The chemistry of isoprenoid quinones // In Terpenoids in plants. Pridham J. B. (Ed). London, Academic Press. 1967. P. 129-146.

329. De Rosa S., Crispino A., De Giulio A., Iodice C., Milone A. Sulfated polyprenylhydroquinones from the sponge Ircinia spinulosa II J. Nat. Prod. 1995. V. 58. P. 1450-1454.

330. Treveleka L.A., Abitis D., Paulus K., Bauer R., Vagias C., Rousis V. Marine polyprenylquinones, quinones and chromenols with inhibitory effects on leukotriene formation // Chem. Divers. 2005. V. 2. P. 901-909.

331. Baz J.P., Canedo L.M., Tapiolas D. A new tetraprenylhydroquinone derivative with an acetic acid unit from the marine sponge Ircinia muscarum // J. Nat. Prod. 1996. V. 59. P. 960-961.

332. Stonik V.A., Makarieva T.N., Dmitrenok A.S. Sarcochromenol sulfates A-C and sarcohydroquinone sulfates A-C from the sponge Sarcotragus spinulosus // J. Nat. Prod. 1992. V. 55. P. 1256-1260.

333. Ochi M., Kotsuki H., Inoue S., Taniguchi M., Tokoroyama T. Isolation of 2-(3,7,ll-trimethyl-2,6,10-dodecatrienyl) hydroquinone from the brown seawed Dictyopteris unulata !! Chem. Lett. 1979. P. 831-832.

334. Capon R.J., Ghisalberti E.L., Jefferies P.R. Isoprenoid dihydroquinones from a brown alga, Cystophora sp. // Phytochemistry. 1981. V. 20. P. 2598-2600.

335. Gerwick W.H., Fenical W. Ichthyotoxic and cytotoxic metabolites of the tropical brown alga Stypopodium zonale (Lamouroux) Papenfuss 11 J. Org. Chem. 1981. V. 46. P. 22-27.

336. Fenical W. Diterpenoids // In Marine natural products. Chemical and biological perspectives. Scheuer P.J. (Ed). New York, Academic Press. 1978. V. 2. P. 238-245.

337. Minale L. Terpenoids from marine sponges // In Marine natural products. Chemical and biological perspectives. Scheuer P.J. (Ed). New York, Academic Press. 1978. V. l.P. 220240.

338. Bifulco G., Bruno I., Minale L., Riccio R. Bioactive prenylhydroquinone sulfates and a novel, C31 furanoterpene alcohol sulfate from the marine sponge, Ircinia sp. // J. Nat. Prod. 1995. V. 58. P. 1444-1449.

339. Bowden B.F., Coll J.C. Studies of Australian soft corals. XXVI tetraprenylbenzoquinone derivatives from a Nephthea species of soft coral (Octocorallia, Alcyonacea) // Aust. J. Chem. 1981. V. 34. P. 2677-2681.

340. Ravi B.N., Wells R.J. Lipid and terpenoid metabolites of the gorgonian Plexaura flava II Aust. J. Chem. 1982. V. 35. P. 105-112.

341. Howard M., Clarkson K., Bernstein R.L. Simple prenylated hydroquinone derivatives from the marine urochordate Aplidium californicum II Tetrahedron Lett. 1979. V. 20. P.4449-4452.

342. Targett M., Keeran W.S. A terpenehydroquinone from the marine ascidian Aplidium constellatum II J. Nat. Prod. 1984. V. 47. P. 556-557.

343. Guella G., Mancini I., Pietra F. Verapliquinones: novel diprenylquinones from an Aplidium sp. (Ascidiacea) of the Ile-Verte waters, Brittany // Helv. Chim. Acta. 1987. V. 70. P. 621-626.

344. Fu X., Bilayet Hossain ML, van der Helm D., Schmitz F. Longithorone A: unprecedented dimeric prenylated quinone from the tunicate Aplidium longithorax II J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 12125-12126.

345. Fu X., Bilayet Hossain M., Schmitz F., van der Helm D. Longithorones, unique prenylated para and metacyclopropane type quinones from the tunicate Aplidium longithorax //J. Org. Chem. 1997. V.62. P. 3810-3819.

346. De Rosa S., De Giulio A., Iodice C. Biological effects of prenylated hydroquinones: structure-activity relationship studies in antimicrobial, brine shrimp, and fish lethality assays //J. Nat. Prod. 1994. V. 57. P. 1711-1716. ^

347. Guella G., Mancini I., Guerriero A., Pietra F. New furano-sesquiterpenoids from Mediterranean sponges II Helv. Chim. Acta. 1985. V. 68. P. 1276-1282.

348. Misiti D., Moore H.W., Folkers K. Identification of plastoquionone-3 from chloroplasts. II J. Am. Chem. Soc. 1965. V. 87. P. 1402-1403.

349. Sakamoto K., Miyoshi H., Takegami K., Mogi T., Anraku Y., Iwamura H. Probing substrate binding site of the Escherichia coli quinol oxidases using synthetic ubiquinol analogues. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 29897-29902.

350. Ames B.N., McCann J., Yamasaki E: Methods for detecting carcinogens and mutagens with the salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test // Mutation Res. 1975. V. 31. P. 347-364.

351. Chiu R., Angel P., Karin M. Jun-B differs in its biological properties from, and is a negative regulator of, c-Jun // Cell. 1989. V. 59. P. 979-986.

352. Passegue E., Jochum W., Schorpp-Kistner M., Mohle-Steinlein U., Wagner E.F. Chronic myeloid leukemia with increased granulocyte progenitors in mice lacking junB expression in myeloid lineage // Cell 2001. V. 104. P. 21-32.

353. Kasibhatla S., Brunner T., Genestier L., Echeverri F., Mahboubi A., Green D.R. DNA damaging agents induce expression of Fas ligand and subsequent apoptosis in T lymphocytes via the activation ofNF-kappa B and AP-1 // Mol. Cell 1998. V.l. P. 543-551.

354. Manna S.K., Sah N.K., Aggarwal B.B. Protein tyrosine kinase p561ck is required for ceramide-induced but not tumor necrosis factor-induced activation ofNF-kappa B, AP-1, JNK, and apoptosis // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 13297-13306.

355. Leppa S., Eriksson M., Saffrich R., Ansorge W., Bohmann D. Complex functions of AP-1 transcription factors in differentiation and survival of PC12 cells // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 4369-4378.

356. Fan M., Goodwin M.E., Birrer M.J.,- Chambers T.C. The c-Jun NH(2)-terminal protein kinase/AP-1 pathway is required for efficient apoptosis induced by vinblastine // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 4450-4458.

357. Garcia-Bermejo L., Perez C., Vilaboa N.E., Blasde E., Aller P. cAMP increasing agents attenuate the generation of apoptosis by etoposide in promonocytic leukemia cells // J. Cell. Sci. 1998. V. lllPt 5. P. 637-644.

358. Shier W.T., Shier А.С. Sphingosine- and ceramide- analog toxins an update // J. Toxicol. Toxin Rev. 2000. V. 19. P. 189-246.

359. Makarieva T.N., Denisenko V.A., Stonik V.A., Milgrom Y.M., Rashkes Y.V. Rhizochalin, a novel secondary metabolite of mixed biosynthesis from the sponge Rhizochalina incrustata II Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 6581-6584.

360. Kong F., Faulkner D.J. Leucettamols A and B, two antimicrobial lipids from the calcareous sponge Leucetta microraphis И J. Org. Chem. 1993. V. 58. P. 970-971.

361. Willis R.H., De Vries D.J. BRS1, a C30 bis-amino, bis-hydroxy polyunsaturated lipid from an Australian calcareous sponge that inhibits protein kinase С // Toxicon. 1997. V. 35. P. 1125-1129.

362. Nicholas G.M., Hong T.W., Molinski T.F., Lerch M.L., Cancilla M.T., Lebrilla C.B. Oceanapiside, an antifungal bis-a, ¿y-amino alcohol glycoside from the marine sponge Oceanapia phillipensis IIJ .Nat. Prod. 1999. V. 62. P. 1678-1681.

363. Zhou B.N., Mattern M.P., Johnson R.K., Kingston D.G. Structure and stereochemistry of a novel bioactive sphingolipid from a Calyx sp. // Tetrahedron 2001. V. 57. P. 9549-9554.

364. Makarieva T.N., Guzii A.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Santalova E.A., Pokanevich E.V., Molinski T.F., Stonik V.A. Rhizochalin A, a novel two-headed sphingolipid from the sponge Rhizochalina incrustata II J. Nat. Prod. 2005. V. 68. P. 255— 257.

365. Макарьева Т.Н., Гузий А.Г., Денисенко В.А., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Новые двухголовые сфинголипидоподобные соединения из морской губки Oceanapia sp. // Изв. АН Сер. Хим. 2008. С. 656-660.

366. Fedorov S.N., Makarieva T.N., Guzii A.G., Shubina L.K., Kwak J.-Y., Stonik V.A. Marine two-headed sphingolipid-like compound rhizochalin inhibits EGF-induced transformation of JB6 P+ CI 41 cells // Lipids 2009. V. 44. P. 777-785.

367. Delmas D., Lancon A., Colin D., Jannin В., Latruffe N. Resveratrol as a chemopreventive agent: a promising molecule for fighting cancer // Current Drug Targets 2006. V. 7. P. 423-442.

368. Rogozin E.A., Lee K.W., Kang N.J., Yu H., Nomura M., Miyamoto K.-I., Conney A.H., Bode A.M., Dong Z. Inhibitory effects of caffeine analogs on neoplastic transformation: structure-activity relationships // Carcinogenesis 2008. V. 29. P. 1228-1234.

369. Nunez G., Benedict M.A., Hu Y., Inohara N. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway // Oncogene 1998. V. 17. P. 3237-3245.

370. Boatright K.M., Salvesen G.S. Mechanisms of caspase activation // Curr. Opin. Cell Biol. 2003.V. 15. P. 725-731.

371. Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del Bino G., Gorczyca W., Hotz M.A., Lassota P., Traganos F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry // Cytometry 1992. V. 13. P. 795808.

372. Dive C., Gregory C.D., Phipps D.J., Evans D.L., Milner A.E., Wyllie A.H. Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry // Biochem. Biophys. Acta. 1992. V. 1133. P. 275-285.

373. Afanas'ev V.N., Korol' B.A., Mantsygin Y.A., Nelipovich P.A., Pechatnikov V.A., Umansky S.R. Flow cytometry and biochemical analysis of DNA degradation characteristic of two types of cell death // FEBS. 1986. V. 194. P. 347-350.

374. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., Grignani F., Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry //J. Immunol. Meth. 1991. V. 139. P. 271-279.

375. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. V. 40. P. 111-124.

376. Parker M.W., Feil S.C. Pore-forming protein toxins: from structure to function // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. V. 88. P. 91-142.

377. Macek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea anemones (Actinaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. V. 105. P. 121-130.

378. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.W., Shwets T.W., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon 2002. V. 40. P. 1197-1217.

379. Il'ina A., Lipkin A., Barsova E., Issaeva M., Leychenko E., Gusev K., Monastyrnaya M., Lukyanov S., Kozlovskaya E. Amino acid sequence of RTX-A's isoform actinoporin from the sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon 2006. V. 47. P. 517-520.

380. Alvarez C., Mancheno J.M., Martinez D., Tejuca M., Pazos F., Lanio M.E., Sticholysins, two pore-forming toxins produced by the Caribbean Sea anemone Stichodactyla helianthus• Their interaction with membranes // Toxicon 2009. V. 54. P. 1135-1147.

381. Avila A.D., de Acosta M.C., Lage A. A new immunotoxin built by linking a hemolytic toxin to a monoclonal antibody specific for immature T lymphocytes // Int. J. Cancer. 1988. V. 42. P. 568-571.

382. Avila A.D., de Acosta M.C., Lage A. A carcinoembryonic antigendirected immunotoxin built by linking a monoclonal antibody to a hemolytic toxin // Int. J. Cancer. 1989. V. 43. P. 926-929.

383. Park Y.J., Wen J., Bang S., Park S.W., Song S.Y. 6.-Gingerol Induces cell cycle arrest and cell death of mutant p53-expressing pancreatic cancer cells // Yonsei Med. J. 2006. V. 47. P. 688-697.

384. Lian F., Li Y., Bhuiyan M., Sarkar F.H. p53-independent apoptosis induced by genistein in lung cancer cells //Nutrition and Cancer 1999. V. 33. P. 125-131.

385. Wratten S.J., Faulkner D.J. Antimicrobial metabolites from the marine sponge Ulosa sp. // Tetrahedron Lett. 1978. V. 19. P. 961-964.

386. Гузий А.Г., Макарьева Т.Н., Денисенко В.А., Дмитренок П.С., Дмитренок А.С., Гребнев Б.Б., Стоник В.А. Диосфенол из асцидии Diplosoma sp. // Хим. природ, соедин. 2008. С. 298-299.

387. Ogi Т., Taira J., Margiastuti P., Ueda К. Cytotoxic metabolites from the Okinawan ascidian Diplosoma virens //Molecules 2008. V. 13. P. 595-602.

388. Stine K.C., Warren B.A., Saylors R.L., Becton D.L. KRN5500 induces apoptosis (PCD) of myeloid leukemia cell lines and patient blasts // Leukemia Res. 2000. V. 24. P. 741-749.

389. Nigrelli R.F. The effects of holothurin on fish and mice with Sarcoma-180 // Zoologica. 1952. V. 37. P. 89-90.

390. Pettit G.R., Herald C.L., Herald D.L. Antifungal agents. XIV. Cytotoxic saponins from sea cucumber//J. Pharm. Sci. 1976. V. 65. P. 1556-1559.

391. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

392. Fieser L.F., Fieser M. Reagents for Organic Synthesis // John Wiley & Sons. New York. 1967. V. 1.Р. 1276.

393. Organic Synthesis // Ed. Gilman H., Queens College, Flushing, New York, 19^4.

394. Karber G. Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche // Arch. Exp. Pathol. Pharm. 1931. V. 162. P. 480-483.