Химическое моделирование участия кислой фосфатазы и пирофосфатазы в транспорте электронов в хлоропластах и регуляции фосфорного обмена растений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГб од

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ "ИНСТИТУТ ЙИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НЕФТЕХИМИИ

САМУСЬ Наталия Валерьевна

УДК 577.152.313

ХИМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ УЧАСТИЯ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ И ПИРОФОСФАТАЗЫ В ТРАНСПОРТЕ ЭЛЕКТРОНОВ В ХЛОРОПЛАСТАХ И РЕГУЛЯЦИИ ФОСФОРНОГО ОБМЕНА РАСТЕНИЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев -1997

Диссертацией является рукопись

Работа выполнена в Институте биоорганической химии и нефтехимии

HAH Украины

Научный руководитель:

чл.-корр. HAH Украины, доктор химических наук, профессор Ясников Александр Алексеевич

Институт биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины зав. отделом химии фотосинтеза

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Кибирев Владимир Константинович

Институт биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины зав. отделом химии белка

кандидат биологических наук Верёвка Сергей Викторович

Институт биохимии им. О.В.Палладина HAH Украины ст. научн. сотр. отдела химии и биохимии ферментов

Ведущая организация:

Институт физиологии растений и генетики HAH Украины, г. Киев

Защита состоится 19 декабря 1997 р. в 10-00 часов на заседании специализированного ученого совета Д 01.80.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины, ул. Мурманская, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины, ул. Мурманская, 1

Автореферат разослан 19 ноября 1997г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Исследования химических моделей и механизмов действия ферментов традиционно занимают одно из центральных мест в биоорганической химии. Также важным является изучение закономерностей регуляторного действия ферментов на разных этапах метаболизма растительной клетки, что дает возможность вести поиск новых технологий выращивания культурных растений в направлении воздействия на ферментные процессы.

В этой работе основное внимание сосредоточено на двух ферментах фосфорного обмена клетки - кислой фосфатазе и неорганической пирофосфатазе. В последние годы встал вопрос о том, что кислая фосфатаза, фермент с широкой субстратной специфичностью, участвует в процессах регуляции метаболизма (Duff 1989, Plaxton 1994). Однако, в большинстве работ, проведенных с кислой фосфатазой, были использованы синтетические субстраты. Поэтому важным заданием является исследование гидролиза кислой фосфатазой природных субстратов, что позволяет установить истинные закономерности действия фермента. На ранних стадиях прорастания семян ключевую роль в обеспечении клетки углеродными соединениями и неорганическим фосфатом играет фосфоенолпируват (ФЕП), в гидролизе которого участвует кислая фосфатаза. Молекулярный механизм распада ФЕП на ферментах привлекает внимание исследователей, однако четкого представления о нем нет. Для решения этого вопроса нами была исследована модель фотохимического гидролиза ФЕП под действием ультрафиолетового облучения.

Другое соединение, которое занимает важное, но недостаточно установленное место в регуляции обмена веществ и транспорте электронов в энергопреобразующих органеллах - неорганический пирофос-фат (PPi). Наряду с АТФ, это соединение участвует как в биосинтетических, так и в окислительно-восстановительных процессах ( Гулая, 1970, Baltcheffsky, 1985, Аваева, 1990). Перенос электронов в электронтран-

спортных цепях хлоропластов и митохондрий происходит через посл( довательность одно- и двухэлектронных переносчиков. Не установле механизм и значение такого чередования, поэтому разработка пробле мы сопряжения одно- и двухэлектронных путей транспорта электроне является актуальной.

Связь работы с научными программами. Понимание механи: мов регуляции фосфорного и углеводного обмена, а также транспорт электронов при фотосинтезе очень важно для рационального использс вания регуляторов роста и средств защиты растений, создание которы является одной из приоритетных задач биоорганической химии. Работ выполнена в рамках общей тематики отдела химии фотосинтеза Инсп тута "Биомиметика процессов фотосинтеза и механизмы взаимоде( ствия биологически активных соединений с модельными системами пе реноса электронов".

Цель и задачи исследования. Целью работы было определени функций кислой фосфатазы, РР1 и пирофосфатазы в регуляции отделI ных участков углеродного и энергетического обмена растительной кпет ки.Исходя из поставленной цели, в работе решались такие задачи:

- исследовать кинетику гидролиза кислой фосфатазой из зародыше пшеницы субстратов, которые содержат макроэргическую фосфс эфирную связь;

- определить влияние неорганического фосфата и РР> на реакции кис л ой фосфатазы;

- разработать химическую модель, поясняющую механизм расщепле ния ФЕП на ферменте;

-исследовать участие РР\ и пирофосфатазы в сопряжении одно-двухэлектронных стадий в хлоропластах;

- изучить влияние физиологически активных соединений, которые взг имодействуют с системами вторичной передачи сигнала в клетке, н модельный транспорт электронов в хлоропластах.

Научная новизна полученных результатов. Результаты иссле дований расширяют взгляд на роль кислой фосфатазы и пирофосфг

газы, а также РР1 в метаболизме растительной клетки. Найдено, что <ислая фосфатаза в гидролизе ФЕП действует в ассоциированной форме как РРнзависимый фермент, небольшие концентрации Р1 стимулиру-от гидролиз субстратов с макроэргической фосфоэфирной связью. Описана фотохимическая модель ФЕП-зависимых ферментов, установлены промежуточные стадии активации фотовозбужденного состояния ФЕП, показано фосфорилирование некоторых ионов при высоких температурах при УФ-распаде ФЕП. Найдено, что пирофосфатаза участвует в сопряжении одно- и двухэлектронних стадий при восстановлении НАДФ+ з хлоропластах при отсутствии ферредоксин-НАДФ-редукгазы. Показано влияние РР1 на реакции Хилла (акцептор Ре(С1^)63~) и Мелера [акцепторы ФМН и метилвиологен). Обоснована новая гипотеза о регу-пяторных механизмах кислой фосфатазы и РР| во время развития растительного организма.

Практическое значение полученных результатов. Результаты исследований фотохимического гидролиза ФЕП могут быть основой для дальнейшего развития систем неферментативного фосфорилирования ;убстратов. Кислая фосфатаза как фермент, участвующий в регуляции углеродного и фосфорного метаболизма, является перспективным объ-эктом для поиска новых регуляторов роста растений, влияющих на активность этого фермента. Определение влияния физиологически активных веществ на транспорт электронов в хлоропластах может быть эазвито в систему тестирования способности биоактивных соединений участвовать в окислительно-восстановительных реакциях клетки.

Личный вклад соискателя. Все основные практические результаты, которые приведены в работе, получены лично автором. Соавторы публикаций принимали участие в определении направления исследований, а также обсуждении результатов.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на VI Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", юсв. 50-й год. основания Института физиологии растений и генетики

HAH Украины (Киев, 1996), на XII Научной конференции по биоорганич еской и нефтехимии (Киев,1997), на III Симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), на III Ев ропейском конгрессе по катализу (Краков, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печат ных работ, из которых 4 статьи и 4 тезисов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 стр печатного текста, состоит из введения, литературного обзора, где со держится анализ работ, посвященных проблемам фотосинтеза, образо вания и утилизации макроэргических фосфатов, роли кислых фосфата; в клетке. В разделе "Материалы и методы" изложены методики экспери ментов, далее в четырех главах приводятся результаты исследований t их обсуждение. Данные опытов представлены в 23 рисунках и 6 табли цах. Список литературы насчитывает 120 наименований.

Методология и методы исследования.

В работе использовался очищенный препарат кислой фосфатазь зародышей пшеницы (Serva). Гидролиз субстратов проводили в 0,002 моль/л MES-буфере рН 5,4 при 25°С. Реакционная смесь объемом 1 мх содержала 2 мкмоль субстрата и 0,003 мкмоль фермента. За ходом ре акции следили по количеству выделившегося Pi методом Фиске Суббароу. Разработан метод определения Pi в биохимических система) с использованием 18-краун-6 эфира. Фотохимический гидролиз ФЕГ проводился при облучении ртутно-кварцевой лампой с длиной УФ-светг 220-240 нм, мощностью 0,009 и 0,018 Вт/см2. Изменение концентрацж ФЕП определяли на спектрофотометре при 240 нм.

В исследованиях транспорта электронов использовались суспен зии хлоропластов из двухнедельных проростков гороха, выделенных п< методике Арнона в буферной системе, содержащей 0,02 моль/л трис HCI (или HEPES) буфер рН 7,8, 0,4 моль/л сахарозы и 0,035 моль/; NaCI. Концентрация хлорофилла определялась спектрофотометричесю по системе уравнений Винтерманса, в опытной смеси она равнялась 0,í

wr/мл. Смесь для проведения реакций Хилла и Мелера состояла из 3 мл эуфера, 1 мл суспензЖхлоропластов, 0,4 - 1 мл 0,006 моль/л раствора акцептора. При использовании РР1-РРазы в смесь вносили 0,4 мл 0,02 иоль/л раствора PPi и 0,05 мл препарата РРазы (Serva), содержащего 30 ед/мл фермента. В реакции восстановления НАДФ вносили 0,1 мл лрепарата ферредоксина - ферредоксин-НАДФ-редуктазы, который выделяли из листьев гороха методом ионообменной хроматографии по Rao et. al 1971. Концентрацию НАДФН определяли на спектрофотометре при 340 нм. О влиянии реагентов на скорость переноса электронов в 4епи хлоропластов судили по изменению концентрации 02 в растворе, соторую измеряли с помощью электрода Кларка. Повторность опытов -десятикратная, значения стандартной погрешности не превышали 10%.

Основные результаты исследований

Особенности гидролиза кислой фосфатазой из зародышей пшеницы ФЕП, АТФ, АДФ и других субстратов.

Метаболические превращения фосфата и его производных зависят эт активности различных групп ферментов, среди которых кислая фос-£атаза занимает важное место. В работе использовался препарат кистой фосфатазы зародышей пшеницы. Этот объект выбран потому, что зо время прорастания его активность увеличивается за счет биосинтеза 5 10-15 раз. В этот период одним из основных источников энергии и уг-1еродных радикалов в растении является ФЕП.

Следует сказать, что механизм распада ФЕП на ферментах четко ie установлен. Поэтому нами были проведены исследования, которые эаскрывают роль активации двойной связи ФЕП во время гидролиза. Зодные растворы ФЕП облучались УФ-светом, моделируя таким обра-юм активацию ФЕП на ферменте. В этих условиях такие фосфат-¡одержащие соединения как АТФ и АДФ не гидролизуются. Из анализа мнетических данных мы определили, что фотовозбужденная молекула ]редставляет собой долгоживущий бирадикал, который при 50° обрати-

мо распадается на енолпируват и метафосфат, далее с участием моле кулы воды превращается в пировиноградную кислоту и Рг.

О - РОзг :о- РОз2 О

| Ьу )\ ШО ||

НгС = С - С02 Н2С~- С - СОг СНз - С - С02" + НРО42

Таким образом, для отщепления фосфатной группы ФЕП необхо димым условием является возбуждение двойной связи.

Исследования распада ФЕП на кислой фосфатазе показали, чт( ФЕП гидролизуется преимущественно ассоциированной формой фер мента. Это вытекает из опытов по изучению зависимости скорости реак ции от концентрации фермента (рис 1). Для ФЕП скорость пропорцио нальна квадрату концентрации фермента, в то время, как для АТФ I АДФ эта зависимость линейна. Была также проведена реакция в боле< концентрированном буфере (рис. 2). При повышении ионной силы рас твора в 10 раз произошла остановка реакции с ФЕП. Эти результать дают возможность предположить, что активация двойной связи ФЕГ идет на одной субъединице, а отщепление фосфата - на другой, соглас но механизму, который был показан в модельных опытах.

• ФЕП □ АДФ а АТФ

Рис.1. Зависимость скорости гидролиза субстратов от концентрации кислой фосфатазы.

[Е], ед/мл

0,085

0,17

0,225

0,34

0,4

Рис.2. Гидролиз субстратов кислой фосфа-тазой в 0,02 моль/л МЕЗ-буфере (НФФ - п-нитрофенилфосфат).

мин

Одна из примечательных черт реакции кислой фосфатазы с ФЕП -зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 3). В отличие от кривых для других субстратов, она имеет промежуточное плато, аналогично кривой для пируваткиназы (Курганов Б.П., 1978). Объяснение это явление можно, если предположить, что в растворе существует две формы фермента, одна из которых следует гиперболи-цеской кинетике, а другая - сигмоидальной. Наложение их и дает плато на кривой. В нашем случае мы полагаем, что кривая суммирует кинетику ассоциированной и диссоциированной форм кислой фосфатазы.

Рис.3. Зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата в реакции кислой фосфатазы.

'[8],тмоль/л

Кислые фосфатазы из различных источников сильно отличаютс? по своей относительной субстратной специфичности. Это касается, е частности, нуклеозид moho-, ди- и трифосфатов (табл. 1). Как видно АМФ в нашем случае слабо гидролизуется. Было также установлено, чтс аденозин тормозит реакцию с АТФ и АДФ. Эти данные могут свидетель ствовать о том, что связывание нуклеозида идет на одном участке, а пе ренос фосфорильного остатка - на другом, который удален от центрг связывания. Мы считаем, что расстояние между участком связывания t активным центром и определяет специфичность той или иной фосфатазы. Для нашего фермента уда ленность активного центра рассчи тана, по-видимому, на расщепление трифосфатов, поэтому АМФ прячется в кармане связывания и недосту пен для активного центра.

Известным регулятором активности кислых фосфатаз является Pi В больших концентрациях он вызывает торможение действия фермента. Нами же было показано, что ма лые концентрации Pi (0,5 - 0,Е тмоль/л) на 30-50% увеличивают скорость реакции по отношению t ФЕП, АТФ, PPi, при этом практиче ски не влияя на реакцию с НФФ.

Мы также обнаружили, что в ходе гидролиза ФЕП образуется некоторое количество PPi, появление которого вызывает ускорение реакции (рис. 4). Предполагаемый механизм образования PPi - это фосфотранс-феразная реакция, перенос фосфорильного остатка от фосфогистидинг активного центра на свободную фосфатную группу. Впервые нами былс показано ускоряющее действие PPi на гидролиз ФЕП кислой фосфата зой (рис. 5).При добавлении PPi (0,001 моль/л) скорость гидролиза ФЕП с первых же минут резко возрастает. Также была проведена реакция со

Таблица 1. Относительная специфичность кислой фосфатазы из зародышей пшеницы.

Субстрат Относительная скорость гидролиза, %

НФФ 100

АТФ 328

АДФ 170

АМФ 32

ФСП 151

PPi 240

зместного гидролиза ФЕП и АТФ в зквимолярных количествах. В присутствии АТФ гидролиз ФЕП ускоряется после некоторого периода индукции. Вероятно, АТФ в случае ФЕП не служит прямым эффектором, а действует через образование РРк

Рис.4. Кинетика гидролиза ФЕП и образования РР1 в реакционной смеси.

[ФЕП], тмоль/

Рис.5. Кинетика изменения концентрации ФЕП в присутствии РР1 и АТФ.

Таким образом, нами показано, что в проростках, когда одним из зсновных субстратов кислой фосфатазы является ФЕП, реакция гидро-чиза этого соединения характеризуется сложной кинетикой и подвержена влиянию таких регуляторов, как Р'| и РР'|. Контроль со стороны РР1 яановится понятен, поскольку гидролиз ФЕП имеет смысл только в том злучае, когда клетка обеспечена высокоэнергетическими соединениями *ля утилизации продукта гидролиза - пировиноградной кислоты.

Участие РР1 и пирофосфатазы в транспорте электронов в хлоро пластах гороха.

рр| - соединение, которое занимает важное место в фосфорном I энергетическом обмене, является продуктом многих анаболических ре акций, а также продуктом сопряжения транспорта электронов и фосфо рилирования в мембранах хлоропластов и митохондрий. На сегодняш ний день результаты исследований регуляторного действия РР'| на ме таболические процессы не исчерпывают все возможности этого соеди нения влиять на взаимосвязь между различными обменными путям! клетки. Нами были изучены функции РР| и пирофосфатазы (РРазы) 1 транспорте электрона к различным акцепторам в хлоропластах гороха.

О роли РРазы в реакции Хилла (акцептор К3Ре(СМ)6) судили гт

дествию метиленбисфосфонс

Таблица 2. Влияние PPi и МБК на выделение 02 в реакции Хилла.

Л [Od, мг/л ' мин

июнь сентябрь

Контроль 0,76 ± 0,04 1,08 + 0,03

+ PPi 1,57 + 0,05 0,81 ±0,02

+МБК 0,51 +0,02 -

вой кислоты (МБК), которая яе ляется ингибитором РРаз! (табл.2). Растения выращу вались в открытом грунте в ик не и сентябре. В июньских хлс ропластах, т.е. выращенны при ярком освещении, PPi ускс ряет транспорт электронов Fe(CN)63~ . МБК полностью сну мает действие PPi. В сентябрк ских растениях PPi практическ не влияет на транспорт электрона от фотосистемы II (ФСИ). Мы связь ваем влияние PPi с системой защиты ФСИ от яркого света, котора включает фосфорилирование белков светособирающего комплекса.

Анализ химических моделей гидролиза PPi, сопряженного с оки< лительно-восстановительными реакциями (Ясников A.A. и др. 1996), дг ет возможность предполагать, что PPi с помощью РРазы непосре; ственно участвует в переносе электронов. При этом PPi выполняет рог клапана, который после распада на ферменте препятствует обратном току электронов.

Таблица 3. Влияние PPi и пирофос-

фатазы на поглощение 02 в реакции Мелера.

Д [02], мг/л " мин '

ФМН метил-

виологен

Контроль 2,87 + 0,24 0,14 + 0,03

+ PPi 0,40 ±0,01 0,03 ± 0,00

+ РРаза 3,20 + 0,06 0,17 ±0,01

+PPi-PPa3a 1,17 + 0,04 -

Мы изучали возможные функции PPi-РРазы в транспорте электронов к ФМН и метилвиологену (МВ). В присутствии PPi наблюдается замедление поглощения 02 (табл.3). Вероятно, в этом случае проявляется участие PPi в циклическом транспорте электронов, когда , как известно, электрон возвращается от акцептора ФС I на цитохром b/f или пластоцианин. Механизм этого обратного тока элек-ронов в энергетически невыгодном процессе изучен недостаточно. Palee было показано участие в нем энергии АТФ (Shahak Y., Avron М., 986). Наши данные свидетельствуют, что PPi также может принимать 'частие в циклическом транспорте электронов вокруг ФС1.

Нами была найдена мо-Таблица 4. Влияние PPi и РРазы на из- дельная система передачи менение концентрации 02 в смеси, со- электрона в растворе через держащей ФМН ( или метилвиологен) и РРазу от восстановленного аскорбат Na. аскорбата Na к ФМН и МВ без

хпоропластов. Если электрон передается к акцептору, происходит его мгновенное окисление 02. Поэтому за ходом реакции можно следить по уменьшению концентрации 02 в реакционной среде. Поскольку стандартный электрохимический потенциал

Д [02], мг/л ' мин Ю3

ФМН метил-

виологен

Контроль 24 ±3 -66 + 4

+ PPi -86 ±7 -99 ±6

l+PPi-РРаза -112 + 11 -147 + 12

для аскорбата равен 0,03 В, а для ФМН и МВ близок к -0,3 В, то самс произвольный переход электронов от аскорбата к акцептору невозмс жен. Добавление РР1-РРазы приводит к резкому уменьшению концен1 рации кислорода в смеси (табл.4). Это может быть объяснено тольк тем, что акцепторы восстанавливаются за счет аскорбата с помощы РР|. Восстановленные ФМН и МВ сразу же окисляются кислородом с о( разованием Н202.

Если в качестве акцептора ФС I в хлоропластах использоват НАДФ, то в присутствии фередоксин -НАДФ-редуктазы (ФНР) наблк дается выделение 02. При этом от ФС передается два электрона н НАДФ\ происходит его полное восстановление до НАДФН, который н окисляется кислородом. Поскольку ФС I состоит только из одноэле! тронных переносчиков, а для восстановления НАДФ необходимы дв электрона, то на ферменте происходит сопряжение одно- и двухэле! тронных стадий. Во время приготовления суспензии хлороластов ФН вымывается. В ее отсутствие на НАДФ может передаваться только оди электрон. Образуется радикал, который окисляется кислородол вследствие чего наблюдается поглощение 02 хлоропластами (рис. 6). присутствии РРьРРазы происходит выделение кислорода.

-о,з

1 • контроль I П+РР1 | а +РР1-РРаза

I, мин

Рис.6. Влияние РР1 и РРазы на восстановление НАДФ хлоропластами.

Таким образом, РРаза участвует в сопряжении одно- и двухэлек-юнных путей. Если к хлоропластам добавить выделенный препарат НР, то РРаза не оказывает влияния на ее работу. Физиологическое начение РР| в этом случае можно понять, если обратить внимание на эт факт, что в некоторых микроорганизмах, в которых отсутствует ФНР, восстановлении НАДФ принимает участие АТФ. Считается, что РРаз-ая система аналогична АТФазной, но более примитивна. Вероятно, в четке она может выполнять те же функции.

В свою работу мы также включили эксперименты по изучению воз-ействия некоторых физиологически активных соединений на перенос пектронов в хлоропластах, имея в виду поиск агентов, которые оказы-ают влияние на регуляторные механизмы. Использовались вещества, эторые действуют на системы вторичной передачи сигнала в рецепто-ах. Оказалось, что соединения, которые относятся к классу агонистов ли антагонистов адренорецепторов действуют на разные переносчики, ак, адреномиметики (клонидин и мезатон) участвуют в переносе лектронов к феррицианиду калия, который в какой-то мере моделирует итохромы и также содержит в реакционном центре железо с временной валентностью. Было установлено, что адреноблокаторы ( охимбин, аминазин, обзидан) яваляются донорами ФС I.

Элекгронтранспортная цепь хлоропластов растительной клетки в начительной мере гомологична митохондриальной и состоит из родственных компонентов. Такими являются железосодержащие белки цитохромы и белки, содержащие негемовое железо, медьсодержащие елки - пластоцианин и цитохромоксидаза, а таже флавиновые белки и иноны. Наблюдается сходство общих черт последовательности азмещения металлсодержащих белков в ЭТЦ фотосинтеза и дыхания. I связи с этим, мы считаем перспективной разработку на основе лоропластов системы тестирования действия биологически активных оединений на энергетические механизмы клетки. Преимуществом лоропластной модели может являться то, что перенос электронов в ней ачинается от фотохимических реакций, в то время как в митохондриях -

от ферментативного цикла, на который исследуемые вещества мои оказывать влияние.

Выводы

1. Разработана химическая модель ФЕП-зависимых ферментов новая реакция фотохимического гидролиза фосфорного эфира енолп! ровиноградной кислоты. Определены кинетические параметры распад ФЕП в ультрафиолетовом свете (220-240нм). При 20°С распад ФЕП к; тализируют ионы СГ, Н+, НР042 , в то время как Н2Р04" и НС03~ ускор! ют реакцию при 50°С. При 50°С наблюдается фосфорилирование ионе Н2РО.Г, НС03~ и Н2Р2О72". Выдвинута гипотеза активации ФЕП на фе| ментах.

2. Исследована кинетика гидролиза кислой фосфатазой зародь шей пшеницы ФЕП, АТФ, АДФ, АМФ, неорганического пирофосфат (РРО и л-нитрофенилфосфата в 0,02 моль/л и 0,2 моль/л МЕЭ-буфер рН 5,4, 1=25°С. Определена относительная специфичность фермент! предложено объяснение различного сродства фермента по отношени! к моно-, ди- и трифосфатам. Найдено, что на реакцию кислой фосфг тазы с ФЕП, АТФ, РР1 ускоряющее действие оказывает Р! в небольши концентрациях (0,1 -1 "103 моль/л).

3. Определены особенности гидролиза ФЕП кислой фосфатазой, котором участвует ассоциированная форма фермента, в отличие с других субстратов. Установлено, что зависимость \//[ФЕП] не следуе кинетике Михаелис-Ментен. Показано, что в гидролизе ФЕП кисла фосфатаза действует как РРнзависимый фермент.

4. Показано участие РР1 и неорганической пирофосфатазы (РРазь в фотовосстановлении Ре(СИ)63" в хлоропластах гороха, выращенног при сильном освещении. РРьРРаза замедляет транспорт электронов ФМН и метилвиологену (МВ) в реакции Мелера, вероятно за счет во: вращения электрона в электрон-транспортную цепь по циклическом механизму с использованием энергии РРК

5. Впервые показано участие системы РРиРРазы в транспорте лектронов от аскорбата Na к ФМН и MB против градиента электрохими-еского потенциала за счет расщепления макроэргической пирофос-эатной связи .

6. Установлено, что PPi может участвовать в сопряжении одно- и .вухэпектронных путей при фотовосстановлении НАДФ в отсутствие эередоксин-НАДФ-редукгазы в хлоропластах.

7. Исследовано специфическое взаимодействие физиологически ктивных соединений с электрон-транспортной цепью хлоропластов. дреномиметики (клонидин и мезатон) ускоряют перенос электрона к >еррицианиду К. Йохимбин и другие адреноблокаторы ( аминазин и об-идан ) являются донорами электрона для фотосистемы I, а также, воз-южно, системы цитохромов и медь-содержащих белков. Клонидин, еофилин, индометацин тормозят окисления катион-радикалов, тем са-

ым, препятствуя образованию токсичных супероксидрадикалов.

8. Обоснована новая гипотеза о регуляторном действии PPi на

¡ерментативные и окислительно-восстановительные реакции расти-зльного организма.

Основные публикации по теме диссертации

. Ясников A.A., Ясникова H.A., Самусь Н.В. Кинетика и механизм биомиметических реакций макроэргических фосфатов // Теорет. та экспе-рим. химия. -1996. - т. 32, N4. - С. 200-210.

. Ясников A.A., Канивец Н.П., Самусь Н.В., Лозинская О.М., Марковский A.J1. Кинетика и механизм фотохимического гидролиза фосфорного эфира енолпировиноградной кислоты // Теорет. та эксперим. химия. -1996. - т.32, № 5. - С. 287-290.

Самусь Н.В., Лозинская О.М., Ясников A.A. Специфичность гидролиза макроэргических фосфатов кислой фосфатазой из проростков пшеницы //Доклады HAH Украины. -1997. - №2. - С. 150-153.

4. Самусь Н.В., Марковский A.JI., Ясников A.A. Роль пирофосфа-тазы в переносе электронов в хлоропластах при фотовосстановлении феррицианида К // Доклады HAH Украины. - 1997. - №3. -С.187-189.

5. Самусь Н.В. Регуляторное действие неорганического пирофосфа-та при гидролизе кислой фосфатазой фосфоенолпирувата в проростках пшеницы // VI Конф. мол. ученых, поев. 50-й год. основания Инст. физиологии раст. и генетики НАНУ ( К., октябрь 199i г.): Тез. докл. - Киев, 1996. - С.17-18.

6. Ясников A.A., Марковский АЛ., Луйк А.И., Самусь Н.В., Могиле-вич С.Е., Канивец Н.П., Лозинская О.М. Влияние ряда фармацевтических препаратов на реакции Хилла и Мелера в хлоропласта? гороха. // 3-й Ежегод. симпозиум "Физ.-хим. основы физиол растений и биотехнология" ( М., июнь 1997 г.): Тез. докл. - М. 1997. - С.ЗЗ.

7. Самусь Н.В., Ясников A.A. Роль пирофосфата и пирофосфатазы i фотозависимом транспорте электронов в хлоропластах гороха h Там же. - С. 16.

8. Samus N., Yasnikov A. Special features of phosphoenolpyruvat« hydrolysis by acid phosphatase and biomimetic reactions // 3 Europear Congress on Catalysis. - (Krakow, Poland, sept. 1997): Abstracts -Krakow,1997. - P. 621.

Самусь H.B. Химическое моделирование участия кисло! фосфатазы и пирофосфатазы в транспорте электронов в хлоропласта? и регуляции фосфорного обмена растений. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидат« биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическа? химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии HAK Украины, Киев, 1997.

Проведены исследования реакций кислой фосфатазь зародышей пшеницы с макроэргическими субстратами и участш пирофосфатазы (РРазы) в транспорте электронов в хлоропласта? гороха. Показано, что кислая фосфатаза гидролизует ФЕП i ассоциированной форме, согласно механизму, который был раскрьп в модельных реакциях фотохимического гидролиза ФЕП Установлено, что в реакции с ФЕП кислая фосфатаза работает Kat PPi-зависимый фермент. Показано участие PPi и РРазы в перенос«

электронов в реакциях Хилла и Мелера, а также в сопряжении одно-it двухэлектронных путей при фотовосстановлении _ НАДФ _ в хлоропластах. Найдено, что PPi-PPa3a может переносить электроны против градиента электрохимического потенциала в системе аскорбат - ФМН (или метилвиологен). Предложена модель изучения действия физиологически активных веществ на транспорт электронов с помощью хлоропластов. Обоснована гипотеза о роли кислой фосфатазы, PPi и РРазы в регуляции фосфорного и энергетического обмена в растительной клетке.

Ключевые слова: кислая фосфатаза, пирофосфатаза, фосфоенол-пируват, хлоропласты, регуляция, фотохимический гидролиз, моделирование.

Samus* N.V. Chemical modelling of the acid phosphatase and pyrophosphatase participation in chloroplasts electron transport and plant phosphorus metabolism regulation. - Manuscript.

Thesis for a candidate of sciences degree by speciality 02.00.10 -

bioorganic chemistry. - The Institute of bioorganic chemistry and petrochemistry Ukrainian National Academy of Sciences, Kyiv, 1997.

Investigations of wheat germ acid phosphatase (AP) reactions with macroergic bond containing phosphates were conducted and the role of inorganic pyrophosphatase (PPase) in electron transfer in pea chloroplasts was studied. It was shown that AP hydrolyse phosphoenolpyruvate (PEP) in associative form according to the mechanism, which have been established in model reactions of photochemical PEP hydrolysis. It was found that in PEP reactions AP acts as PPi-dependent enzyme. PPi and PPase participate in electron transfer in Hill and Mehler reactions, and in coupling of one- and two electron stages during NADP photoreduction in chloroplasts. It was found that PPi-PPase could transfer electrons in the ascorbate - FMN (or paraquat) system against gradient of electrochemical potential. Chloroplasts model was proposed to study bioactive compounds effect on the electron transport. The hypothesis was substantiated about the role of AP, PPi, and PPase in plant phosphorus and energetic metabolism.

Key words: acid phosphatase, pyrophosphatase, phosphoenolpyruvate, chloroplasts, regulation, photochemical hydrolysis, models.