Холиновый и фенольный биосенсоры для высокочувствительного определения ферментов-маркеров патологических состояний тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

005005480

Громова Мария Сергеевна

Холиновый и фенольный биосенсоры для высокочувствительного определения ферментов-маркеров патологических состояний

Специальности: 02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06- биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-.8 ДЕК 2011

Москва, 2011

005005480

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, Курочкин Илья Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор химических паук, профессор, Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук, профессор, Изумрудов Владимир Алексеевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится « 27 » декабря 2011 г. в 15 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 24 » ноября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.59,

кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Определение холина и фенола является важной биологической, клинической и токсикологической задачей. Более того, измерение активностей многих ферментов основано на регистрации продуктов гидролиза производных холина и фенола. К таким ферментам относятся ацетилхолинэстераза (АХЭ), бутирилхолинэстераза (БХЭ), карбоксилэстераза (КЭ), параоксоназа (ПОН1) и Ы-ацетил-|3-0-глюкозаминидаза (НАГаза). В свою очередь, знание активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 является важным моментом как при проведении экспериментальных исследований в токсикологии, нейробиологии, фармакологии, так и в клинической практике - терапии, в т.ч. анестезиологии и клинической токсикологии. НАГаза является одним из биомаркёров мастита коров, и определение её активности может быть использовано для диагностики этого заболевания на ранней стадии.

На сегодняшний день наиболее распространенным методом определения активностей выше перечисленных ферментов-маркёров патологических состояний в биологических жидкостях является спектрофотометрия. Развитие оптических методов достигло высокого уровня и позволяет осуществлять высокопроизводительный анализ ферментативной активности в лабораторных условиях. Однако в настоящее время растет потребность в массовых экспресс-исследованиях активностей этих ферментов непосредственно по месту лечения и в полевых условиях для чего требуются малые объемы пробы. Использование высокочувствительных портативных биосенсоров для определения активностей ферментов-маркёров патологических состояний представляет большой интерес для подобного рода задач медико-биологического мониторинга.

Одним из простых, дешевых и удобных способов формирования биосенсорных покрытий является метод последовательной адсорбции полиэлектролитов и ферментов (ПНП). Он заключается в чередующейся электростатической адсорбции на поверхность сенсора компонентов, несущих противоположный заряд и позволяет включать различные виды материалов в состав пленочных структур полиэлектролитов. Качество сборки полиэлектролитных конструкций зависит от индивидуальных особенностей поверхности для адсорбции, структуры полиэлектролитов, количества слоев и т.д. Толщины слоев и другие физико-химические характеристики этих конструкций оказались чувствительными к таким факторам, как рН, ионная сила, температура, анионно-катионный состав, время адсорбции полиэлектролитов, ионной силы и температуры раствора полиэлектролита. Однако особенности формирования фермент-полиэлектролитных комплексов на твердой поверхности при их нанесении методом ПНП недостаточно изучены.

Таким образом, фундаментальные исследования в области создания сенсорных покрытий с последующим практическим применением разработанных биосенсоров является актуальной научной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка высокочувствительных биосенсоров для определения холина и фенола, а также исследование возможности практического применения разработанных биосенсоров для анализа АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови млекопитающих и НАГазы в молоке коров. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Детальное исследование влияния условий формирования фермент-полиэлектролитных пленок на основе холиноксидазы (ХО) и тирозиназы (Тир) на поверхности электродов

- Изучение аналитических характеристик полученных планарных холиновых и фенольных биосенсоров

- Разработка чувствительного и воспроизводимого способа определения холина и фенола в крови и молоке с использованием планарных биосенсоров

- Разработка формата анализа ферментов-маркёров в крови и молоке с использованием биосенсоров нахолин и фенол.

Научная новизна. Исследовано влияние галогенид анионов (И", СГ, Вг", Г) на адсорбцию ПДДА на поверхность графитового стержня и последующее нанесение отрицательно заряженных частиц (холиноксидазы и золота). Показано, что адсорбция ПДДА из растворов содержащих йодид-анион приводит к многократному увеличению чувствительности биосенсора (ПДДАю/ХО) по холину. Предложена физико-химическая модель, объясняющая процесс формирования фермент-полиэлектролитных пленок в присутствии различных анионов.

Еще одним важным фактором при создании сенсоров является предобработка поверхности для адсорбции фермента. Проведя исследование влияния различных способов подготовки поверхности, было обнаружено, что использование углеродных наностержней приводит к наибольшему увеличению чувствительности сенсора. При нанесении пленки ПДДА/ХО на подслой из УНС происходит более чем семикратное увеличение чувствительности.

Разработаны пленарные холиновые и фенольные биосенсоры на основе холиноксидазы и тирозиназы, соответственно. Исследовано влияние условий адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация, время высушивания слоев) и определены параметры, влияющие на активность биосенсоров: гидрофобность, молекулярная масса и заряд поликатиона, анионный состав буферного раствора, природа растворителя и количество циклов нанесения слоев ПДДА/фермент, присутствие многозарядных нанообъектов. Пределы обнаружения холинового и фенольного планарных биосенсоров являются одними из самых низких среди известных на данный момент сенсоров на холин и фенол и составляют 50 и 2,6 нМ, соответственно.

Практическая значимость работы. Разработанные высокочувствительные холиновые и фенольные планарные биосенсоры могут быть использованы как для непосредственного определения холина и фенола в низких концентрациях, так и для измерения ферментативной активности. Разработан новый биосенсорный формат определения активностей ацетил- и бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы в крови и Ы-ацетил-р-Э-глюкозаминидазы в молоке. Высокая чувствительность биосенсоров позволяет определять выбранные ферменты-маркёры в низких концентрациях, пределы обнаружения АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 и НАГазы составили 4,5, 2, 2, 0,2 и 0,2 мЕд/мл, соответственно. Полученные пределы обнаружения значительно меньше нижней границы диапазона активностей этих ферментов в норме,

что позволит использовать для анализа большие разведения и соответственно малые

объемы крови (несколько мкл).

Показана применимость нового биосенсора для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы и ранней диагностики мастита коров.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005, 2010, 2011), Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009, 2011), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», (Белгород, 2008), Международной научной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), конференции «1st Russian-Helenic Symposium «Biomaterials and bionanomaterials: resent advantage and safety-toxicology issues», (Крит, Греция, 2010), конференции «14th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference», (Интерлакен. Швейцария, 2011).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в международном и отечественном журналах, 1 глава из книги, 10 тезисов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения в 4-х главах, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 224 ссылок. Работа содержит 75 рисунков, 16 таблиц.

Список сокращении:

SCC - подсчет количества соматических клеток

АХ - ацетилхолин

АХЭ - ацетилхолинэстераза

БХ - бутирилхолин

БХЭ - бутиририлхолинэстераза

ВОПГ - высокоориентированный пиролитический графит КЭ - карбоксилэстераза

МСУНТ- мультистенные углеродные нанотрубки

НАГаза - N-ацетил-р-О-глюкозаминидаза

ПДДА - полидиметилдиаллиаммоний хлорид

ПНП - метод последовательной адсорбции полиэлектролитов

ПОН1 - параоксоназа

УНС - углеродные наностержни

ФА - фенилацетат

ФНАГ - фенил-Ы-ацетил-Р-О-глюкозаминид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В литературном обзоре рассматривается строение, физиологическая функция и биологическая роль ферментов-маркёров патологических состояний млекопитающих, а именно ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы и М-ацетил-Р-О-глюкозаминидазы. Также подробно описаны и классифицированы способы определения активностей этих ферментов в крови и молоке (НАГаза). Поскольку определение активности выбранных ферментов-маркёров осуществляют путем измерения концентраций продуктов их ферментативного гидролиза - холина и фенола - то часть литературного обзора посвящена систематизации современных методов определения этих аналитов. Подробно описана технология последовательного нанесения полиэлектролитов, как успешный метод создания биосенсоров, в том числе на холин и фенол. Рассмотрены методы управления процессом формирования пленочных структур, созданных по методу ПНП.

Экспериментальная часть

Изготовление холиновых и фенольных биосенсоров. Холиновые биосенсоры на основе графитовых стержней были изготовлены адсорбцией поликатиона и холиноксидазы по технологии ПНП (адсорбция из раствора) на поверхность графитового стержня, модифицированного диоксидом марганца. Холиновые и фенольные биосенсоры на основе планарных электродов были изготовлены путем адсорбции диоксида марганца (для определения холина), полиэлектролита и фермента (холиноксидазы или тирозиназы) на поверхность сенсора по методу ПНП (адсорбция из капли) в условиях контролируемой влажности и температуры.

Физико-химические характеристики. Поверхность графитовых стержней и планарных электродов была охарактеризована методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Характеристику фермент-полиэлектролитных пленок проводили методами АСМ, сканирующей электронной микроскопии и спектрофотометрии. Определение гидродинамических радиусов частиц полиэлектролита проводили методом квазиупругого динамического светорассеяния.

Электрохимические измерения активности биосенсоров проводились в амперометрическом режиме с использованием потенциостата IPC-2000 (Кронас, Россия).

Определение активностей АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 в крови мышей и человека и НАГазы в молоке коров проводилось электрохимическим и спектрофотометрическим способами.

Результаты и обсуждение

Принцип работы холинового биосенсора основан на ферментативном окислении добавляемого в систему холина до бетаина и пероксида водорода в присутствии холиноксидазы. Последующее окисление пероксида водорода протекает при положительном потенциале (vs. Ag/AgCl) при участии Мп02 в качестве медиатора. Измеряемый параметр представляет собой ток медиаторного электроокисления пероксида водорода, который пропорционален скорости окисления холина. Данный принцип был

реализован в нашей лаборатории на примере биосенсора, представляющего собой модифицированный оксидом марганца графитовый стержень с нанесенной по методу ПНП холиноксидазой. Однако остались невыясненными факторы, оказывающие значительное влияние на активность биосенсора, такие как характер поверхности; время, концентрация компонентов и катионно-анионный состав буфера, из которого происходит адсорбция; химический состав полиэлектролита; включение в состав биосенсора наноматериалов и т.п.

Факторы, влияющие на адсорбцию холиноксидазы и поликатиона, для создания холинового биосенсора на основе графитовых стержней. Известно, что природа противоиона является значительным фактором, влияющим на свойства многослойных полиэлектролитных слоев сформированных по методу ПНП.

Таким образом, представляется целесообразным исследовать влияние галогенид-анионов (Р\ СГ, Вг\ Г) на стадиях адсорбции ПДДА на активность получающегося биосенсора (ПДДА/ХО). В этом ряду энергия гидратации последовательно уменьшается, а значит и растет способность аниона экранировать заряды поликатиона. Сильное экранирование зарядов приводит к адсорбции поликатиона в агрегированном состоянии. Дальнейшая способность адсорбированного поликатиона взаимодействовать с ферментом будет также меняться в зависимости от типа аниона, в присутствии которого происходила адсорбция. На Рис.1 представлены результаты определения чувствительности биосенсоров, полученных при адсорбции ПДДА из растворов 5 мМ К-фосфата, содержащих Ю% КС1, КВг и К1 в концентрации 0-100 мМ. Видно, что при адсорбции ПДДА из раствора К1 в узком диапазоне концентраций (20-30 мМ) наблюдается увеличение чувствительности биосенсора более чем в 5 раз по сравнению с теми значениями чувствительности, которые получали при использовании других галогенидов (КГ, КС1, КВг) и контролем (чистый буфер).

Концентрация KHal, мМ

Рис. 1. Зависимость чувствительности биосенсора от концентрации галогенида калия в растворе ПДДА. □ - контроль (5 мМ K-фосфат без галогенида), в -KF, - KCl, D - КВг, Я Kl.

Относительные стандартные ошибки для трех измерений составили 30%.

Было показано, что при адсорбции холиноксидазы на ПДДА в присутствии различных галогенидов, значение эффективной константы Михаэлиса фермента в пленке не изменяется по сравнению с ее значением в растворе (Км(раствор) = 0,95±0.19 мМ.

7

КМ(К1) = 1,2±0,3 мМ). Постоянство Км3*''1 означает, что адсорбция холиноксидазы на поверхность электрода не влияет на доступность активного центра для субстрата.

Результаты динамического светорассеяния и турбодиметрического титрования показывают различие в поведении макромолекул ПДДА в растворе, содержащем йодид-анион, по сравнению с другими анионами. Гидродинамический радиус частиц в растворах КС1 составляет около 10 нм и слабо меняется при изменении концентрации от 20 до 500 мМ. В тоже время тенденция к увеличению гидродинамического радиуса ПДДА наблюдается в растворах йодида калия, начиная с 20-30 мМ К1. Более того, согласно данным турбодиметрического титрования, при концентрации К1 более 70 мМ наблюдается высаливание ПДДА, в то время как при изменении концентрации КС1/КВг вплоть до 500 мМ растворы поликатиона остаются прозрачными. Нанесение ПДДА в присутствии более высоких концентраций йодида приводит к получению неактивного биосенсора.

Данные атомно-силовой микроскопии пленок ПДДА/ХО, адсорбированных на высокоориентированный графит (ВОПГ) из растворов, содержащих КС1 и К1, свидетельствуют о различном характере распределения молекул ХО в зависимости от того, в присутствии какого галогенида (К1 или КС1) осуществляли адсорбцию ПДДА (Рис. 2). В случае нанесения ПДДА из растворов КС1 основным структурным элементом пленки ПДДА/ХО является зерно средним латеральным размером 50 нм (с учетом конволюции), которое может быть соотнесено с отдельными молекулами или олигомерами фермента. Однако в случае нанесения ПДДА из растворов К1 фермент в бислойной структуре объединен в крупные домены, структурные детали которых неразличимы при использовании стандартных зондов. Выделение объектов методом секущей плоскости для таких систем дает один связный объект на всей площади изображения.

Рис. 2. АСМ изображения пленок ПДДА/ХО на поверхности ВОПГ. На врезках произведено выделение объектов методом секущей плоскости. ПДДА наносили из растворов 5 мМ К-фосфата в присутствии (А) 20 мМ КС1 и (Б) 20 мМ К1. Размер изображения / х / мкм2.

Отметим, что аналогичное распределение наночастиц золота (Аи), имеющих схожий с холиноксидазой размер 10 нм и несущих отрицательный заряд, было получено при их адсорбции на поверхность В0ПГ/Мп02 (Рис. 3). С помощью сканирующей

Рис. 3. СЭМ изображения пленок ПДДА/Аи на поверхности ВОПГ/МпОу. нанесение ПДДА из 5 мМК-фосфата в присутствии (А) 20мМКС1, (Б) 20 мМ К1. Размер изображения 40*40 мкм2.

Исследование спектров поглощения пленок ПДДАКа/Аи и ПДДАю/Аи, приготовленных в условиях эксперимента на прозрачной подложке свидетельствуют о сдвиге максимума поглощения на 10 нм в сторону длинноволновой области спектра одновременно с достоверным повышением оптической плотности примерно на 20 м(Ю в случае адсорбции полимера из 20 мМ К1 (Рис. 4). Принимая во внимание данные СЭМ, можно предположить, что адсорбция золотых наночастиц на ПДДАК1 приводит к иному распределению наночастиц на поверхности и преимущественно в агрегированном состоянии.

115

О 1П,_ _ | Рис. 4. Спектры поглощения пленок ПДДАкс/Аи и ПДДАщ/Аи на

поверхности полиметилметакрилата. (1)- ПДДАю/Аи, (2)-ЛДДАкс1/Аи, (3)- подложка перед нанесением золотых

U ос _ , , ,

с ^ наночастиц.

I 75

35

450 500 550 S00 650 X, НМ

Итак, адсорбция противоположно заряженных частиц (в частности, молекул ХО или наночастиц Аи) на слой ПДДА, предварительно адсорбированный из растворов, содержащих К.С1 и К1 (Рис. 5) может протекать по следующей схеме:

электронной микроскопии было обнаружено равномерное распределение единичных наночастиц золота практически без образования агрегатов на поверхности ПДДА, преадсорбированного в присутствии KCl, в то время как для поликатиона, нанесенного из раствора KI, наблюдается образование крупных агрегатов наночастиц золота с неразрешаемой внутренней структурой.

+ КС! ЛПДДАЛ+К1

ПДЦАкс! * ПДДАк,

Рис. 5. Схематичное представление

процесса образования пленки ПДДА/ХО(Аи) при адсорбции Г1ДЦЛ в присутствии КС1 и К/.

1) ПДЦАКС1/ХО (Аи) 2) ПДДАК|/Х0 (Аи)

(1) ПДДАКС|/ХО - Г1ДДА в присутствии хлорид-анионов предположительно присутствует в растворе в виде отдельных молекул. При адсорбции полиэлектролита на поверхность происходит равномерное распределение ионогенных групп (сайтов связывания с противоположно заряженными объектами). Последующая адсорбция ХО приводит формированию плотной пленки фермента в виде равномерно распределенных небольших агрегатов. Аналогичная ситуация наблюдается при адсорбции золотых наночастиц. Чувствительность полученного биосенсора по холину составляет 35,3 мА М"1 см"2.

(2) ПДДЛк,/ХО - в данном случае йодид-анионы способны более эффективно экранировать заряды ПДДА, что приводит к ассоциации молекул полиэлектролита в растворе. [3 этих условиях поликатион адсорбируется на поверхность в форме агрегатов, тем самым увеличивая количество ионогенных групп на единицу площади, экспонированных в раствор и доступных для взаимодействия с противоположно заряженными объектами. Это позволяет молекулам ХО и золотым наночастицам адсорбироваться с образованием крупных и плотных доменов. Чувствительность полученного биосенсора по холину в этом случае увеличивается и составляет 183.3 мА М" ' см"2.

Влияние ионной силы и природы низкомолекулярного катиона исследовали, адсорбируя ПДДА из растворов, содержащих различные концентрации катионов 1л+, К и Сэ+. В данном случае на стадии адсорбции ПДДА ионная сила создавалась добавлением к 10 мМ фосфату соответствующего катиона хлорид в концентрации 0.1, 0,5 и I М. Результаты исследований приведены на Рис. 6.

Рис. 6. Активность биосенсора (ПДДА/ХО) от концентрации соли в растворе ПДДА. ПДДА наносили из

растворов 10 мМ K-фосфата в присутствии 0,1, 0,5 и 1 МHCl (и), NaCl (О), KCl (V) или CsCI (А).

О 200 400 600 800 1000 Концентрация соли, мМ

Данная зависимость свидетельствует о том, что увеличение ионной силы раствора для всех исследованных хлоридов приводит к уменьшению активности биосенсора (амперометрического отклика на стандартную концентрацию холина). Возможным объяснением данному факту является то, что адсорбция полиэлектролита из растворов с высокой ионной силой происходит в более компактной и менее заряженной конформации, что приводит к ослаблению электростатического взаимодействия холиноксидазы и поликатиона.

Влияние природы катиона в растворе холиноксидазы на активность биосенсора проверялось путем замены Na-фосфатного буфера на Li, К, Cs-фосфатный буфер, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии эффекта катиона на процесс адсорбции холиноксидазы. Влияние анионов изучали путем определения активности биосенсора, полученного в результате адсорбции ХО из растворов, содержащих 35 мМ К-фосфатного буфера и KF, КС1, КВг и KI в концентрации 35 мМ. Добавление в раствор холиноксидазы анионов F", СГ практически не изменяет ее способность эффективно адсорбироваться на пленки. В то же время Вг", а особенно Г приводят к заметному снижению активности конструкции. В случае нанесения фермента в присутствии йодид-аниона (ПДДА/ХОК0 наблюдается трехкратное падение активности системы. В этих условиях формирование первого слоя ПДДА происходит стандартным образом. Поскольку в ряду анионов F" > СГ > Вг" > Г наименьшая энергия гидратации наблюдается для йодид-аниона, то сила его взаимодействия с положительно заряженными группами ПДДА оказывается наибольшей, что в свою очередь препятствует эффективной посадке фермента. Чувствительность полученного биосенсора по холину составляет 11,6 мА М"' см"2.

В литературе описаны различные методы предварительной подготовки поверхности с целью улучшения эффективности адсорбции полиэлектролитов. Так, одним из подходов является включение углеродных наноматериалов, в качестве отрицательно заряженного многозарядного объекта, в состав фермент-полиэлектролитных пленок, полученных по технологии ПНП. Для этой цели в данной работе были использованы окисленные мультистенные углеродные нанотрубки (МСУНТ) и наностержни (УНС). Результаты показали, что использование окисленных МСУНТ и

11

600^

% 500-

400^

X

§ 300-

ю

200-

S

§

6 100-

0-

УНС (ПДДА/МСУНТ(УНС)/ПДДА/ХО) приводит к увеличению отклика биосенсора в 2,5 раза, что, скорее всего, связано с увеличением исходной шероховатости поверхности. При увеличении количества подслоев из ПДДА и УНС до 6 активность биосепсора ((ПДДА/УНС)б /ПДДА/ХО) увеличивается в 7,6 раза относительно простой бислонной конструкции ПДДА/ХО. Чувствительность полученног о биосенсора по холину составляет 268,3 мА М"1 см"2.

Холиновын биосенсор на основе пленарных электродов. Для создания холипового биосенсора были использованы графитовые планарные электроды, содержащие медиаторный слой МпОт . Медиатор, поликатиои и фермент наносили па поверхность планарных электродов капельным методом по технологии ПНП. В качестве базовой конструкции мы рассматривали биосенсор, представляющий бислойпую пленку ПДДА/ХО. В первую очередь были исследованы параметры адсорбции компонентов, такие как время адсорбции и концентрация полиэлектролита и фермента, время высушивания слоев. Оптимальные условия адсорбции компонентов представлены в Таблице 1.

Таблица I. Условия адсорбции компонентов пленки ПДДА/ХО.

Параметр ПДДА ХО

Время адсорбции, мин 40 10

Ко н центрация, мг/мл 1 0,75

Время высушивания слоя, 60 20

мин

Влияние катиоппо-апиоппого состава буферного раствора поликатиона па активность холипового биосенсора. Результаты изучения влияния низкомолекулярных анионов, а также высоких значений ионной силы раствора (0,02 - ЗМ), из которого происходит адсорбция ПДДА. на отклик холиноксидазпого биосепсора. показали, что увеличение ионной силы, создаваемой бромид- или хлорид-анионами приводит к уменьшению активности образующегося биосенсора. Сравнение активностей сенсоров, в которых ПДДА был адсорбирован из 20 мМ растворов различных галогенидов, показало, как и следовало ожидать, что только в случае адсорбции ПДДА в присутствии йодид-аниопов происходит увеличение отклика биосенсора. Изучение влияния катиониого состава буферного раствора проводилось сравнением активностей биосенсоров, полученных адсорбцией ПДДА из 50 мМ фосфатных буферных растворов в присутствии Li+, Na^. \С, Cs+. Оказалось, что в случае пленок, сформированных па поверхности планарных электродов, также как и для пленок па графитовых стержнях, не наблюдается значительного влияния природы катиона в растворе поликатиона.

* Dontsova Е.А., Zeifman Y.S., Budashov I.A., Eremenko A.V., Kalnov S.L., Kurochkin Г. N.. Screen-prinled carbon electrode l'or choline based on МпОг nanoparticles and choline oxidase/polyelectrolyte layers. Sensors and Actuators B: Chemical, 2011. V. 159 (1), P. 261-270.

Влияние этилового спирта па адсорбцию компонентов. Как обсуждаюсь в литературном обзоре, уменьшение диэлектрической проводимости растворителя приводит к усилению взаимодействий полимер-полимер между сегментами полимерной молекулы и снижению силы взаимодействий полимер-растворитель, что сказывается в свою очередь на улучшении адсорбции полимера на поверхность. При нанесении поликатиона в присутствии этилового спирта в диапазоне 0-40%, было выявлено 30% увеличение активности биосенсора при адсорбции ПДДА из 30% раствора этанола. В то же время добавление этилового спирта в раствор холиноксидазы при се нанесении на поликатион не дает эффекта увеличения активности биосенсора.

Зависимость активности биосенсора от числа циклов нанесения слоев полимера и фермента. Одним из способов увеличения количества фермента в пленке является увеличение числа циклов нанесения слоев полиэлектролит/фермент. Было показано, что при увеличении количества циклов нанесения компонентов пленки активность биосенсора возрастает и достигает максимума в случае конструкции (ПДДА/ХО)5. При дальнейшем увеличении циклов адсорбции ПДДА и ХО (п > 8) активность сенсора начинает идти на спад. В случае адсорбции полимера из раствора, содержащего 20 мМ йодид-аиионов. зависимость активности биосепсора от количества слоев (ПДДА^/ХО),,, выглядит аналогичным образом. При этом абсолютное значение максимума то же, что и в случае адсорбции ПДДА из растворов, не содержащих Nal. однако достигается уже при трех слоях ПДДА/ХО. Такой результат можно объяснить существованием диффузионных затруднений проникновения субстрата (и/или продукта реакции) к иммобилизованному ферменту (поверхности электрода) при увеличении толщины пленки.

Отдельно было показано, что в отличие от холиновых биосенсоров на основе графитовых стержней, использование напоматериалов для создания подслоя для последующего нанесения пленки ПДДА/ХО, не дало увеличение отклика. Измерение шероховатости поверхности пленарного электрода и графитовых стержней до и после нанесения диоксида марганца показано, что шероховатость плапарных электродов значительно выше в обоих случаях (Табл. 2), что и может быть объяснением наблюдаемого эффекта.

Таблица 2. Шероховатость графитовых стержней и плапарных электродов.

Параметр Графитовый стержень Планар н ы й эл е ктрод

Шероховатость (Ra) поверхности графита, нм 14±3 86±20

Шероховатость (R„) слоя Мп02, нм 23 ±4 82±20

Л„ определяет величину среднего значения отклонения координаты : (шероховатости поверхности) образца в пределах анализируемой области.

Аналитические характеристики планарных холиновых биосенсоров и кинетические параметры холиноксидазы в пленках полимера. Аналитические характеристики планарных холиновых биосенсоров, проявивших высокую активность: ПДДА/ХО, ПДЦАеюн/ХО, ПДДАш/ХО, (ПДДА/ХО)5 и (ПДДА№1/ХО)з, представлены в Табл. 3. Электроды сохраняют не менее 50% активности при хранении с осушителем при 4°С в течение 5 месяцев.

Следует отметить высокую чувствительность конструкции (ПДДА/ХО)5 и (ПДДАМа1/ХО)3 и низкие пределы обнаружения по холину. Разработанные сенсоры характеризуются самым низким пределом обнаружения (50 нМ) среди известных на данный момент сенсоров на холин и почти на порядок превосходят предел обнаружения описанного в литературе биосенсора, имеющего более сложную конструкцию Р1/МСУНТ/(ПАА/ПВС)3/(ПДДА/ХО)8 (2-10"7М). В зависимости от конкретного практического приложения может быть использован тот или иной биосенсор.

Таблица 3. Сравнение аналитических характеристик наилучших конструкций, полученных на поверхности планарных холиновых электродов.

Конструкция ПДДА/ХО ПДДАКя|/ ХО ПДЦАеюц/ ХО (ПДЦА/ХО)5 (ПДДА»а1 /ХО)3

Предел обнаружения, М Ю-7 7,5-10"8 7,5-Ю"8 5-10"8 5-10"8

Воспроизводимость, % (ЯБОдля 10 электродов) 4,1 3,7 4,4 4,1 5,8

Д, % (холин 10"4 М) -0,3±0,3 -0,8±0,2 -1,0±0,8 -0,1±0,8 -1,3±0,6

Чувствительность, мА-М"1 см"2 51 68 68 102 102

Линейный диапазон, М 3-10"'-3-10"4 -7 -4 10 -З'Ю -7 -4 10 -3-10 -7 -4 10 -5-10 -7 -3 10 -10

Д - операционная стабильность, % снижения отклика за измерение.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что техника трафаретной печати совместно с методом ПНП позволяют получить воспроизводимую, стабильную и чувствительную систему для всех выбранных конструкций электродов.

Таким образом, систематическое изучение факторов, влияющих на свойства фермент-полиэлектролитных пленок, нанесенных на поверхность графита, позволило сделать следующие выводы. Если поверхность имеет низкую шероховатость (графитовые стержни), то для увеличения количества мест связывания фермента можно использовать низкомолекулярные электролиты (например, К1) для перевода молекул полиэлектролита в ассоциированное состояние, а также углеродных наноматериалов (окисленные нанотрубки и наностержни). С другой стороны, если поверхность изначально имеет высокую шероховатость (планарные электроды), большое значение имеют условия адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация), а также последующая обработка полиэлектролитных слоев (время высушивания). Также было

обнаружено, что присутствие этанола, а также йодид-анионов при формировании полиэлектролитного слоя, приводит к увеличению активности сенсорных покрытий.

Фенольный биосенсор на основе пленарных электродов. Для создания фенольного планарного биосенсора была также использована технология ПНП. Основными составляющими сенсора являются графитовый электрод, созданный методом трафаретной печати, на который методом послойного нанесения полиэлектролитов адсорбированы ПДДА и фермент тирозиназа. Принцип определения фенола основан на двух последовательных ферментативных реакциях: оксигидроксилирование фенола с последующим окислением пирокатехина до хинона в присутствии молекул кислорода. В результате последней реакции образующиеся хинон и/или фенокси-радикал могут восстанавливаться па поверхности электрода при отрицательных потенциалах (уэ. А^А£С1). Ток их восстановления пропорционален концентрации фенола в растворе. При создании тирозиназных планарных биосенсоров нами были использованы подходы к формированию фермент-полиэлектролитных пленок, такие же, как и при разработке планарных холиноксидазных сенсоров. Результаты оптимизации параметров адсорбции компонентов представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Условия адсорбции компонентов пленки ПДДА/Тир.

Параметр ПДДА Тирозиназа

Время адсорбции, мин 50 10

Концентрация, мг/мл 5 0,625

Время высушивания слоя, мин 30 20

Изменение анионного состава буферного раствора ПДДА (добавление 20 мМ растворов галогенидов) при последующей адсорбции Тир не привело к изменению активности биосенсора, что, скорее всего, связано с особенностями структуры фермента.

Увеличение числа циклов нанесения слоев (ПДДА/Тир)„ от 1 до 2 привело также к двукратному увеличению активности биосенсора. Дальнейшее увеличение числа слоев Тир приводит лишь к уменьшению отклика сенсора.

Использование наноматериалов для создания фенольного биосенсора. Конструирование поверхностей методом послойного нанесения полиэлектролитов предполагает использование не только фермента, имеющего суммарный отрицательный заряд глобулы, но и большого спектра положительно и отрицательно заряженных объектов для придания поверхности необходимых характеристик. Из ранее проведенных исследований известно, что включение заряженных объектов в состав сенсора увеличивает его чувствительность. Для достижения поставленной цели исследовалось влияние некоторых белковых и неорганических материалов на чувствительность биосенсора. В качестве таких объектов в нашей работе использовались: окисленные мультистенные углеродные нанотрубки, наночастицы золота, диаметром 10 им и геннноинженерный белок ОР18 бактериофага Т4, образующий в растворе трубчатые структуры (длина 100-120 им, ширина 40 нм, высота 15-20 нм). Указанные структурированные объекты включались в конструкцию тирозиназного электрода,

используя подход ПНП и измерялась активность полученных биосенсоров (Табл. 5). В качестве контроля использовали простую бислойную конструкцию ПДДА/Тир.

Таблица 5. Аналитические характеристики конструкций с включением нанообъектов. Стандартное отклонение (УД) и относительное стандартное отклонение (!180) вычислялось

для 10 электродов.

Конструкция Отклик на фенол 2-Ю'6 М, нА Предел обнаружения, нМ ИБО, %

ПДДА/Тир 181±19 12 10

ПДДА/УНТ/ПДДА/Тир 354±28 8 8

ПДДА/СР18/ПДЦАЯир 273±19 11 7

ПДДА/Аи/ПДДА/Тир 310±66 9 21

Как видно из представленных данных, добавление слоя из нанообъектов значительно повышает активность биосенсоров. Самой активной оказалась конструкция, содержащая углеродные нанотрубки, предел обнаружения уменьшился почти в два раза. Использование наночастиц золота также привело к увеличению активности, но при этом и сильно увеличился разброс значений. Наименьшее увеличение активности наблюдалось в случае нанесения на электрод белковых нанотрубок.

Так как добавление дополнительного слоя нанотрубок увеличило активность электродов почти вдвое, следующим этапом работы стала проверка влияния количества подслоев из нанотрубок на активность образующегося биосенсора. При добавлении каждого следующего слоя нанотрубок поверхность сенсора становится более разветвленной и способна адсорбировать на себя большее количество полимера и фермента. При наличии двух подслоев наблюдался максимальный эффект, активность биосенсора увеличивалась в 3,5 раза. Плотность посадки фермента на поверхности можно также увеличить добавлением слоев тирозиназы на уже сформированную поверхность из нанотрубок. Для этого на электрод с конструкцией (ПДДА/МСУНТ)2/ПДДА/Тир наносились стандартным методом дополнительные слои ПДДА и Тир. Таким образом, для самой чувствительной конструкции (ПДДА/МСУНТ)2/(ПДДА/Тир)2 удалось понизить предел обнаружения фенола до 2,6 нМ.

Аналитические характеристики планарных фенольных биосенсоров. Аналитические характеристики наиболее активных конструкций суммированы в Табл. 6. Как и в случае холиновых биосенсоров в зависимости от требуемой чувствительности анализа может быть использована как сложная, так и простая конструкция.

Таблица 6. Сравнение аналитических характеристик наилучших конструкций, полученных на поверхности планарных фенольных сенсоров.

Конструкция ПДЦА/Тир (ПДДА/МСУНТ):/ ПДДА/Тир (ПДДА/МСУНТ)2/ (ПДДА/Тир),

Предел обнаружения по фенолу, нМ 12 3,3 2,6

Линейный диапазон, М 25-10'9 -1-Ю"5 7-Ю"9 - МО"5 6-Ю"9 - МО"5

Чувствительность, мА-М"1 см"2 440 1540 1760

Д, % (фенол 2-10"6М) -0,5±0,2 -0,5±0,3 -0,6±0,3

Воспроизводимость, % (ИБО для 10 электродов) 10,5 6,3 6,3

Д - операционная стабильность, % снижения отклика за измерение.

Применение холннового и фенольного бносенсоров для анализа ферментов-маркёров в крови. В этой части работы изложены результаты исследования возможности электрохимического определения активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови с использованием разработанных биосенсоров на холин и фенол. Биосенсоры представляли собой планарные графитовые электроды с нанесенной бислойной конструкцией ПДДА/ХО - для анализа холина и ПДЦА/Тир - для анализа фенола.

Согласно литературным данным для анализа АХЭ в качестве субстрата используют ацетилхолин, для анализа БХЭ - бутирилхолин, а для анализа КЭ и ПОН1 может использоваться фенилацетат. Среди предложенных реагентов лишь бутирилхолин является высокоспецифичным субстратом для БХЭ, использование АХ и ФА требует добавления ингибиторов для удаления мешающих активностей. Так, в частности, ацетилхолин, помимо АХЭ, способен гидролизоваться также и БХЭ, а фенилацетат с разной степенью эффективности гидролизуется всеми ферментами.

В данной работе была разработана и использована следующая схема определения активностей выбранных ферментов. Сначала требуемое количество гемолизата инкубировали со специфическими ингибиторами в оптимальных условиях инкубации в течение фиксированного времени, после чего туда же добавляли требуемое количество соответствующего субстрата и инкубировали еще в течение времени I. Здесь и далее такую смесь, содержащую гемолизат, ингибитор и субстрат, называли инкубационной смесыо. Затем аликвоту инкубационной смеси переносили в электрохимическую ячейку с буфером. Как было показано в предварительных экспериментах, 25-ти кратное (и более) разбавление инкубационной смеси, происходящее в электрохимической ячейке, приводит к значительному снижению скорости ферментативного гидролиза и может быть принято за ее остановку. Далее измеряли количество продукта (холина или фенола) накопившегося к моменту остановки реакции разбавлением, используя соответствующий биосенсор. Отклик биосенсора на образовавшийся в инкубационной смеси продукт пропорционален активности соответствующего фермента в гемолизате.

Подбор оптимальных условий измерения продуктов ферментативного гидролиза. Для всех исследуемых ферментов были подобраны оптимальные условия по концентрации субстрата и содержанию гемолизата в инкубационной смеси, времени инкубации с субстратом, а также степени разбавления инкубационной смеси в электрохимической ячейке. Данные по оптимизации измерений суммированы в Табл. 7.

Таблица 7. Оптимизированные условия определения активностей ферментов-маркёров в крови

мышей.

Фермент АХЭ БХЭ КЭ ПОН1

Км, мМ 1,0±0,3 4,0±0,9 0,5±0,1 0,17±0,07

Оптимальная концентрация субстрата 3 мМ ацетилхолина 10 мМ бутирилхолина 1,5 мМ фенилацетата 2 мМ фенилацетата

Время инкубации с субстратом, мин 30 30 5 10

Разведение гемолизата в инкубационной смеси 1:1 1:1 3:5 2:5

Разбавление инкубационной смеси в ячейке, раз 25 25 40 100

Таким образом, используя подобранные условия, можно измерять активности ферментов-маркёров в формате «конечной точки» по количеству холина либо фенола, накопившегося в инкубационной смеси в течение фиксированного периода времени, и его последующего определения с использованием соответствующего планарного биосенсора.

Оценка влияния матрикса на аналитический сигнал при определении активностей ферментов-маркёров. Для исследования матрикс-эффекта (то есть возможного мешающего вклада иных, не связанных с целевыми ферментами, компонентов крови) были получены калибровочные зависимости по концентрациям коммерческих препаратов этих же ферментов в чистых растворах, а также в присутствии гемолизата. Полученные зависимости представляют собой параллельные прямые, что свидетельствует о вкладе в отклик только собственной ферментативной активности гемолизата и отсутствии влияния матрицы на амперометрический сигнал. На Рис. 7 представлена типичная зависимость ферментативного гидролиза фенилацетата от концентраций коммерческого препарата параоксоназы в чистых растворах и в присутствии гемолизата.

2000-1

.1500-

1000-

500-

0 20 40 60

Концентрация ПОН1, мЕд/мп

Рис 7. Зависимость ферментативного

гидролиза фенилацетата от концентраций коммерческого препарата параоксоназы в чистых растворах (я), а также в присутствии гемолизата (•).

Из полученных зависимостей откликов сенсоров от концентраций коммерческих препаратов ферментов в буферном растворе были рассчитаны пределы обнаружения этих ферментов на основании минимально определяемых концентраций аналитов (холина и фенола), вычисленных при соотношении сигнал/шум = 3. Результаты представлены в сравнении с активностями выбранных ферментов в норме в крови человека Табл. 8.

Таблица 8. Пределы обнаружения ферментов-маркёров.

Фермент АХЭ БХЭ КЭ ПОН1

Расчетный предел обнаружения, мЕд/мл 4,5 2 2 0,2

Активность в норме, мЕд/мл 5000-9600 900-12000 220-320 13000123000

Как видно из таблицы пределы обнаружения, полученные с использованием разработанных биосенсоров, во много раз превосходят минимальное значение активности этих ферментов в крови человека, что позволит использовать для анализа большие разведения и соответственно малые объемы крови (несколько мкл).

Верификация биосенсорных измерений стандартной спектрофотометрической методикой. Для верификации биосенсорных измерений активности ферментов-маркёров с использованием стандартного спектрофотометрического метода были проведены опыты по селективному in vitro ингибированию наблюдаемых активностей каждого фермента в цельной крови (гемолизате).

Селективное ингибирование in vitro активностей АХЭ, БХЭ и КЭ в цельной крови проводили с использованием гемолизата крови мышей и следующих ингибиторов: изо-ОМПА для БХЭ, (-)-гуперзина А - для АХЭ и параоксоиа - для КЭ. Измерение остаточной активности ПОН1 в препарате гемолизата крови мыши проводилось после 20-ти минутного ингибирования параоксоном и 10-ти минутного ингибирования ЭДТА. Измерение активности эстераз проводилось электрохимически в оптимальных условиях согласно разработанному формату анализа и спектрофотометрически по стандартным методикам. В спектрофотометрическом методе для определения активностей АХЭ и БХЭ

использовали тиоаналоги субстратов: ацетилтиохолин и бутирилтиохолин. для определения активностей КЭ и ПОН1 использовали ФА.

Кривые титрования ферментативных активностей (зависимости % ингибирования от концентрации ингибитора), полученные биосенсорным и спектрофотометрическим методами, оказались достаточно близки, даже при условии использования разных субстратов (Рис. 8).

10* 10* 10' 10; 101' 10' 10* 101 10" Концентрация 1$о-ОМРА. м

^ингибирования спвирофотомвтрия

10 е ю1' 10'" 10е 10* 10 10'; 10 10'

Концентрация (-)-гуперзина А. М

Концентрация параоксона, М

спектрофотомефия

0.5 1,0 1,6 2,0 2,5 Концентрация ЭДТА, мМ

Рис. 8. Кривые титрования активности АХЭ (-)-гуперзином А (А). БХЭ изо-ОМПА (Б). КЭ

параоксоном (В), ПОИ1 ЭДТА в крови мышей (Г), полученные при использовании спектрофотометрической (•) и биосенсорной (к) методик. На вставке: корреляция между результатами измерения, полученными электрохимическим и спектрофотометрическим методами, Я = 0,999, 0,987, 0.972, 0,982. соответственно.

В Табл. 9 приведены величины 1С50 для каждого фермента, полученные двумя методами. Из таблицы видно, что сравниваемый аналитический параметр имеет близкие значения при использовании спектрофотометрической и биосенсорной методик, что подтверждает достоверность и корректность определяемых активностей ферментов и является успешным результатом первого этапа верификации разработанного формата анализа.

Таблица 9. Значения 1С ¡о для in vitro ингибирования ферментов-маркёров крови мышей по данным спектрофотометрической и электрохимической методик

Фермент Ингибитор ICso±SE, М (Спектрофотометрия) ICso±SE, М (Биосенсор)

АХЭ (-)-гуперзин А (7,9±0,4)-10"? (1,01 ±0,1)-Ю-8

БХЭ изо-ОМРА (1,4±0,1)-10"в (0,85±0,09)-10"6

КЭ параоксон (12±3)-10"6 (9±1)-10"6

ПОН1 ЭДТА (1,12±0,05)-10° (1.Ы0.07 )-1(Г

Селективное in vivo ингибирование активностей АХЭ, БХЭ и КЭ в цельной крови (гемолизате). Для исследования возможности применения биосенсорного определения активностей АХЭ. БХЭ и КЭ при отравлениях ФОС с использованием спектрофотометрической и биосенсорной методик было проведено измерение активностей этих ферментов в крови мышей через I час после в/бр введения возрастающих доз модельного фосфорорганического соединения - дибутилфосфата (C4Hg0)2P(0)0CH(CF3)2 (ЛД50 > 2000 мг/кг). Эта часть работы выполнена при сотрудничестве с лабораторией Молекулярной токсикологии Института физиологически активных веществ РАН, Черноголовка. Результаты дозозависимого ингибирования АХЭ и БХЭ в крови мышей, полученные двумя методами, представлены на Рис. 9 в виде % ингибирования эстераз (в сравнении с контролем) от дозы дибутилфосфата.

Доза дибутилфосфата, мг/кг

Рис. 9. Дозозависгшое ингибирование БХЭ и АХЭ в крови мышей через 1 час после в/бр введения дибутилфлосфата (С.4Нд0)2Р(0)0СН(СР¡)2, N=4-6. Активности эстераз в цельной крови определяли спектрофотометрически (открытые символы) и биосенсорными методами (заштрихованные символы) и представляли в виде % ингибирования активности соответствующей эстеразы у контрольных животных. Показано, что БХЭ и КЭ являются более чувствительными биомаркерами по сравнению с АХЭ (ЕД50 = 26,4+2,4, 6,1+0,2 и 132.5+8.7 мг/кг (М=6), соответственно). Наблюдается хорошее соответствие между результатами, полученными обоими методами: зависимости между величинами активностей АХЭ, БХЭ и КЭ. измеренными

спектрофотометрически и с использованием биосенсора, характеризуются высокими коэффициентами корреляции - 0,99, 0,98 и 0,98, соответственно. Полученные данные подтверждают достоверность биосенсорных измерений и демонстрируют применимость разработанных планарных биосенсоров на холин и фенол для мониторинга воздействия ФОС на живые организмы, в том числе на человека.

Определение активности параоксоназы в крови человека. Так как в крови содержится ряд ферментов, также способных гидролизовать фенилацетат, то для выделения вклада параоксоназы необходимо использовать специфические ингибиторы. Как было показано, ЭДТА в концентрации 2,5 мМ способен полностью и селективно ингибировать активность ПОН1. Поэтому мы предлагаем использовать следующий формат анализа активности ПОН1: измерение полной активности ферментов крови по фенилацетату и измерение остаточной активности пробы после преинкубации с ЭДТА. Далее по разности полученных значений находится активность ПОН1.

Для демонстрации практического применения разработанного метода определения активности ПОН1 были проведены эксперименты по определению активности параоксоназы в крови человека. Для анализа использовали капиллярную кровь 5 человек в возрасте от 21 до 53 лет. Затем готовили препараты гемолизатов, в которых определяли активность ПОН1 биосенсорным и спектрофотометрическим способами (Рис. 10). Коэффициент корреляции двух методов составил 0,989.

Рис. 10. Определение активности ПОН1 в образцах крови 5 человек.

Таким образом, с использованием планарных холинового и фенольного биосенсоров разработан высокочувствительный метод определения активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови. Высокая чувствительность биосенсоров позволяет определять ферменты-маркёры в низких концентрациях, что обуславливает использование малых количеств (несколько мкл) пробы для анализа. Также была показана применимость новых биосенсоров для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы.

Применение фенольного биосенсора для определения активности НАГазы в молоке. Для определения мастита коров на ранних стадиях заболевания необходимо с высокой чувствительностью определять активность НАГазы в цельном молоке. В данной работе предлагается измерять активность целевого фермента по концентрации фенола,

выделяющегося при гидролизе специфического субстрата фенил-М-ацетил-Р-О-глюкозамипида (ФНАГ) под действием НАГазы, с использованием разработанного тирозиназного сенсора планарного типа.

В настоящей работе была использована следующая схема определения активности НАГазы (Рис. 11). Требуемое количество цельного молока инкубировали с субстратом ФНАГ в течение определенного времени. Здесь и далее такую смесь (молоко, субстрат) называли инкубационной смесью. Далее инкубационную смесь центрифугировали, отбирали аликвоту и добавляли в электрохимическую ячейку. Стократное разбавление инкубационной смеси, происходящее в электрохимической ячейке (как было показано в предварительных экспериментах) также приводило к значительному снижению скорости ферментативного гидролиза и может быть принято за ее остановку. Далее измеряли количество фенола, накопившегося к моменту остановки реакции разбавлением, используя тирозиназный биосенсор. Отклик сенсора на наработавшийся в инкубационной смеси фенол пропорционален активности НАГазы в молоке, молоко ^ ^ФНАГ

I

\]

инкубация

центрифугирование ->

(фильтрация)

отбор

Разбавление Биосенеорное

->■ в 100 раз в -> определение -> Анализ НАГазы

ячейке фенола

Рис. 11. Схема биосенсорного измерения активности НАГазы в молоке.

Подбор оптимальных условий измерения продукта ферментативного гидролиза. Условия определения активности НАГазы в молоке суммированы в Табл. 10. Таблица 10. Оптимизированные условия определения активности НАГазы в молоке.

Концентрация ФНАГ, мМ 18,75

Время анализа, мин 23

Разведение молока в инкубационной смеси 1:3

Разбавление инкубационной смеси в ячейке, раз 100

Поскольку казеин составляет большую часть белков молока, в среднем 2,7%, было исследовано его влияние на активность фермента в растворе. Было показано, что уже при малых концентрациях казеина (0,05%) достигается увеличение активности НАГазы по сравнению с активностью в чистом буферном растворе более чем в 4 раза. При дальнейшем увеличении концентрации казеина активность фермента изменяется незначительно.

Измерение активности НАГазы в молоке коров. Для выявления влияния матрикс-эффекта молока на измерение активности НАГазы были сняты зависимости отклика электрода от активности фермента, вводимого в инкубационную смесь, содержащую или не содержащую пастеризованное молоко (нет НАГазной активности).

При измерении активности коммерческого препарата НАГазы, растворенного в молоке, был также обнаружен эффект увеличения активности фермента по сравнению с раствором в нитратном буфере (Рис. 12).

Как видно из графика, активность НАГазы в молоке (за счет стабилизации белковыми компонентами) такая же, как и в 0,05% растворе казеина. Так как молоко не имело собственной ферментативной активности, совпадение построенных зависимостей для молока и раствора казеина показывает, что молоко не мешает определению активности коммерческого препарата НАГазы. Рассчитанный предел обнаружения НАГазы в инкубационной смеси, содержащей разбавленное в 4 раза молоко, составил 0,2 мЕд/мл, при линейном диапазоне 0,2-125 мЕд/мл. В цельном молоке эти характеристики составили 0,8 мЕд/мл и 0,8-500 мЕд/мл, соответственно.

Верификация биосенсорных измерений. Для проверки применимости метода к решению проблемы ранней диагностики мастита коров, было проведено биосенсорное измерение активности НАГазы в образцах молока, взятых от здоровых и больных маститом коров в одном из подмосковных хозяйств. Активности НАГазы в образцах молока, измеренные электрохимическим и спектрофотометрическим методами, представлены на Рис. 13. Из литературы известно, что молоко принято делить на 3 класса в зависимости от содержания в нем соматических клеток. Активность НАГазы выше 12 мЕд/мл свидетельствует о начальной стадии заболевания животного маститом. Было выявлено только два образца молока, относящиеся ко второму классу качества и два образца с высоким содержанием НАГазы, свидетельствующее о прогрессирующем мастите. Эти данные были также подтверждены результатами качественного калифорнийского теста. Коэффициент корреляции двух методов составил 0,972.

Рис. 12. Зависимость активности НАГазы, измеренной биосенсорным

методом от концентрации коммерческого препарата в чистом буферном растворе (к.), молоке и в присутствии 0,05% казеина (»).

Концентрация ФНАГ18,75 мМ, время инкубации - 25 минут.

О 10 20 30 40 60 60 70

С (НАГазы), мЕд/мл

электрохимия, мЕд/мл

Рис. 13. Корреляция разработанного метода со спектрофотометрическим измерением

активности НАГазы.

Таким образом, был разработан биосенсорный формат определения активности НАГазы в молоке коров для диагностики мастита на ранней стадии заболевания на основе планарных фенольных сенсоров.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано влияние галогенид анионов (И", СГ, ВГ, Г) на адсорбцию ПДДА и последующее нанесение отрицательно заряженных частиц (холиноксидазы и золотых наночастиц). Установлено, что нанесение ПДДА из растворов, содержащих йодид-анион приводит к формированию поверхности, обеспечивающей пятикратное увеличение чувствительности холинового биосенсора на основе графитовых стержней, вида Мп02/ПДДАК1/Х0.

2. Исследовано влияние предварительной подготовки поверхности сенсора с использованием наноструктурированных объектов (мультистенные углеродные нанотрубки и наностержни, белковые нанотрубки, наночастицы золота) на активность холинового и фенольного биосенсоров. Показано, что подготовка поверхности увеличивает активность холинового и фенольного биосенсоров в 7,6 и 3,5 раза, соответственно.

3. Разработаны планарные холиновые и фенольные биосенсоры на основе холиноксидазы и тирозиназы, соответственно. Исследовано влияние условий адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация, время высушивания слоев) и определены параметры, влияющие на активность биосенсоров: анионный состав буферного раствора, присутствие растворителя, количество циклов нанесения слоев ПДДА/фермент, присутствие многозарядных нанообъектов. Аналитические характеристики разработанного холинового биосенсора: предел обнаружения по холину - 50 нМ, воспроизводимость - 4,1%, чувствительность - 102 м/М см'2. Аналитические характеристики фенольного биосенсора: предел обнаружения по фенолу - 2,6 нМ, воспроизводимость - 6,3%, чувствительность - 1760 мА-М"1 см"2.

4. Разработан биосенсорный формат определения активностей ацетил- и бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы и N-aneran-ß-D-глюкозаминидазы в биологических жидкостях на основе холиновых и фенольных сенсоров планарного типа. Пределы обнаружения АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 и НАГазы составили 4,5, 2, 2, 0,2 и 0,2 мЕд/мл, соответственно.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Gromova M.S., Sigolaeva L.V., Fastovets M.A., Evtushenko E.G., Babin I.A., Pergushov

D.V., Amitonov S.V., Eremenko A.V., Kurochkin I.N. Improved adsorption of choline oxidase on a polyelectrolyte LBL film in the presence of iodide anion. // Soft Matter, 2011. V.7. P. 7404-7409.

2. Курочкин И.Н., Еременко A.B., Сиголаева Л.В., Громова М.С. Донцова Е.А., Торгонская A.A., Крайнова H.A., Дубачева Г.В., Порус М.С., Махаева Г.Ф., Рудакова

E.H., Пергушов Д.В., Будашов И.А, Евтушенко Е.Г., Зезин А.Б., Варфоломеев С.Д. Фермент-полимерные нанокомпозиты как основа диагностической платформы для медико-биологических исследований. // Постгеномные исследования и технологии, под. ред. Варфоломеева С.Д., 2011. С. 219-295.

3. Еременко A.B., Курочкин И.Н., Осипова М.С. (Громова М.С.), Сиголаева Л.В., Донцова Е.А., Варфоломеев С.Д., Донченко В.К., Жаковская З.А., Зигель В.В., Пилип А.Г. Биосенсорные системы - как средства ранней диагностики экологической безопасности. // Научно-информационный бюллетень «Экологическая безопасность», 2009. №1-2. Т. 21-22. С. 16-24.

4. Осипова М.С. (Громова М.С.), Никитина С.Е., Соколовская Л.Г., Сиголаева J1 Курочкин И.Н. Оптимизация конструкции холинчувствительного биосенсора в anaj ингибиторов холинэстераз. // Материалы международной научной конферен студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», секция «Химия», Мое 2005, С. 97.

5. Дубачева Г.В., Соколовская Л.Г., Порус М.В., Осипова М.С. (Громова М.С.). Влияние природы полиэлектролитов на каталитические свойства ферментов, иммобилизованных на поверхности сенсоров, Материалы четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Секция «Биокатализ и биокаталитические технологии», Москва, 2007, С. 272.

6. Осипова М.С. (Громова М.С.) Разработка сенсора на холин с использованием технологии последовательного нанесения полиэлектролитов, Тезисы Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», Белгород, 2008, С. 120.

7. Krainova N.A., Gromova M.S. Carbon nanomaterials for choline oxidase biosensor based on polyelectrolyte self-assembling nanofilms, Материалы международной научной конференции «BIOCATALYSIS-2009», Arkhangelsk, Russia, 2009, P. 91.

8. Громова М.С. Использование углеродных наноматериалов для создания холиноксидазного биосенсора с использованием технологии последовательного нанесения полиэлектролитов, Материалы пятого Московского международного

конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Секция «Биокатализ и биокаталитические технологии», Москва, 2009, С. 282.

9. Kondrashina A.V., Tarhonskaya H.A., Gromova M.S., Sigolaeva L.V., Kurochkin I.N. The method of layer-by-layer formation of active bioanalytical surfaces based on choline oxidase and polyelectrolytes, 1st Russian-Helenic Symposium «Biomaterials and bionanomaterials: resent advantage and safety-toxicology issues», (Крит, Греция), 2010, P.53

Ю.Громова M.C. Контролируемое формирование фермент - полиэлектролитных тонких пленок на основе холиноксидазы, Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Химия», подсекция «Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнология», 2010, 59_953_18217.

11. Кондрашина А.В., Громова М.С., Сиголаева Л.В., Курочкин И.Н. Биосенсорный способ определения нагазы в коровьем молоке для ранней диагностики мастита коров, Материалы шестого Московского международного конгресса «Биотехнология -состояние и перспективы развития», Москва, 2011, Т.1., С. 68.

12. Кондрашина А.В., Громова М.С., Сиголаева Л.В., Курочкин И.Н. Тирозиназный биосенсор для высокочувствительного определения ферментов-маркеров патологических состояний, Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» , секция «Химия», подсекция «Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнология», 2011, 21230_а17а.

13.Makhaeva G., Rudakova Е., Sigolaeva L., Krainova N., Gromova M., Eremenko A., Kurochkin I., Richardson R. J. Blood cholinesterases assay and detection of exposure to organophosphorus compounds (OPC) by a new screen-printed choline oxidase biosensor, Материалы международной научной конференции 14th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference, Интерлакен. Швейцария, 2011, P.72.

Заказ № 313-1/11/2011 Подписано в печать 23.11.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1.2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.т

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ферменты-маркёры патологических состояний.

1.1.1. Ацетилхолинэстераза.

1.1.2. Бутирилхолинэстераза.

1.1.3. Карбоксилэстераза.

1.1.4. Параоксоназа.

1.1.5. К-ацетил-р-О-глюкозаминидаза.

1.2. Методы определения активностей ферментов-маркёров.

1.2.1. Методы определения холинэстераз крови.

1.2.2. Методы определения активности КЭ.

1.2.3. Методы определения активности ПОН1.

1.2.4. Методы определения субклинического мастита коров.

1.2.5. Методы определения активности НАГазы.

1.3. Методы определения ключевых аналитов.

1.3.1. Холиноксидаза и методы определения холина.

1.3.2. Тирозиназа и методы определения фенола.

1.4. Технология последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП).

1.4.1. Факторы, влияющие на рост пленок.

1.4.2. Режимы роста полимерных пленок.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.1.1. Создание планарных графитовых электродов.

2.1.2. Формирование пероксидчувствительного слоя.

2.1.3. Формирование холиноксидазных биосенсоров.

2.1.4. Окисление мультистенных углеродных нанотрубок (МСУНТ) и стержней (УНС).

2.1.5. Титрование карбоксильных групп мультистенных углеродных нанотрубок.

2.1.6. Формирование тирозиназных биосенсоров.

2.1.7. Измерение электрохимических откликов.

2.1.8. Приготовление гемолизата крови для анализа.

2.1.9. Электрохимическое определение активности ацетилхолинэстеразы

2.1.10. Ингибирование активности АХЭ в крови мышей (-)-гуперзином А в экспериментах in vitro.

2.1.11. Электрохимическое определение активности бутирилхолинэстеразы

2.1.12. Ингибирование активности БХЭ в крови мышей изо-ОМПА в экспериментах in vitro.

2.1.13. Электрохимическое определение активностей карбоксилэстеразы.

2.1.14. Ингибирование активности КЭ в крови мышей параоксоном в экспериментах in vitro.

2.1.15. Спектрофотометрическое определение активностей эстераз в экспериментах по дозозависимому ингибированию in vivo.

2.1.16. Электрохимическое определение активности параоксоназы в крови.

2.1.17. Ингибирование активности ПОН1 в крови мышей ЭДТА в экспериментах in vitro.

2.1.18. Спектрофотометрическое определение активности ПОН1 в крови человека.

2.1.19. Электрохимическое определение активности НАГ азы.

2.1.20. Спектрофотометрическое определение активности НАГ азы в молоке.

2.1.21. Получение АСМ-изображений.

2.1.22. Квазиупругое динамическое светорассеяние.

2.1.23. Получение СЭМ-изображений.

2.1.24. Турбидиметрическое титрование.

2.1.25. Спектры поглощения наночастиц золота.

2.1.26. Обработка результатов.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Холиновые биосенсоры.

3.1.1. Характеристика типа исходной поверхности.

3.1.2. Влияние анионного состава буферного раствора на процесс адсорбции поликатиона.

3.1.3. Влияние катионного состава буферного раствора и ионной силы на процесс адсорбции поликатиона.

3.1.4. Влияние природы одновалентного катиона и аниона на процесс адсорбции холиноксидазы.

3.1.5. Использование углеродных наноматериалов для создания холинового биосенсора.

3.1.6. Холиновый биосенсор на основе планарных электродов.

3.1.7. Изучение влияния времени адсорбции и концентрации компонентов на активность планарного холинового биосенсора.

3.1.8. Влияние катионно-анионного состава буферного раствора поликатиона на активность холинового биосенсора.

3.1.9. Влияние этилового спирта на адсорбцию компонентов.

3.1.10. Зависимость активности биосенсора от числа циклов нанесения слоев полимера и фермента.

3.1.11. Аналитические характеристики планарных холиновых биосенсоров и кинетические параметры холиноксидазы в пленках полимера.

3.2. Фенольный биосенсор на основе планарных электродов.

3.2.1. Изучение параметров, влияющих на активность фенольного биосенсора.

3.2.2. Использование наноматериалов для создания фенольного биосенсора.

3.2.3. Аналитические характеристики планарных фенольных биосенсоров.

3.2.4. Стабильность планарных фенольных биосенсоров при хранении.

3.3. Применение холинового и фенольного биосенсоров для анализа ферментов-маркёров в крови.

3.3.1. Подбор оптимальных условий измерения продуктов ферментативного гидролиза.

3.3.2. Оценка влияния матрицы на аналитический сигнал при определении активностей ферментов-маркёров.

3.3.3. Верификация биосенсорных измерений стандартной спектрофотометрической методикой.

3.3.3.1. Селективное in vitro ингибирование активностей ферментов-маркёров в цельной крови (гемолизате).

3.3.3.2. Селективное in vivo ингибирование активностей АХЭ, БХЭ и КЭ в цельной крови (гемолизате).

3.3.3.3. Определение активности параоксоназы в крови человека.

3.4. Применение фенольного биосенсора для определения активности НАГ азы в молоке.

3.4.1. Подбор оптимальных условий измерения продукта ферментативного гидролиза.

3.4.2. Измерение активности НАГазы в молоке коров.

3.4.3. Верификация биосенсорных измерений.

4. ВЫВОДЫ.

Определение холина и фенола является важной биологической, клинической и токсикологической задачей. Более того, измерение активностей многих ферментов основано на регистрации продуктов гидролиза производных холина и фенола. К таким ферментам относятся ацетилхолинэстераза (АХЭ), бутиририлхолинэстераза (БХЭ), карбоксилэстераза (КЭ), параоксоназа (ПОН1) и Ы-ацетил-Р-Б-глюкозаминидаза (НАГаза).

Определение активности эстераз является важной задачей как при проведении экспериментальных исследований в токсикологии, нейробиологии, фармакологии, так и в клинической практике - терапии, в т.ч. анестезиологии и клинической токсикологии. АХЭ эритроцитов и БХЭ плазмы используют в качестве чувствительных биомаркёров для определения воздействия на организм фосфорорганических отравляющих веществ, пестицидов [1] и антихолинэстеразных лекарственных средств [2]. Уровень активности БХЭ определяет реакцию организма на введение миорелаксантов типа сукцинилхолина [3, 4], и ряд лекарственных препаратов [5], характеризует защитные свойства организма при действии фосфорорганических токсикантов [6-8]. КЭ участвует как в детоксикации, так и в метаболической активации многих экзогенных соединений, включая лекарственные вещества и различные токсины, попадающие из окружающей среды [9]. ПОН1 также отвечает за гидролиз фосфорорганических соединений (ФОС) в организме, и кроме того является индикатором риска развития атеросклероза и ряда сердечно-сосудистых заболеваний, хронических нарушений функции печени, почечной недостаточности и других метаболических нарушений. НАГаза является одним из биомаркёров мастита коров, и определение ее активности может быть использовано для диагностики этого заболевания на ранней стадии [10].

На сегодняшний день наиболее распространенным методом определения активности выше перечисленных ферментов-маркёров в биологических жидкостях является спектрофотометрия [11-14]. Развитие оптических методов достигло высокого уровня и позволяет осуществлять высокопроизводительный анализ ферментативной активности в лабораторных условиях [15]. При анализе этих ферментов в крови, основной проблемой спектрофотометрического определения методом Эллмана является высокое базовое поглощение гемоглобина, приводящее к снижению чувствительности метода [13, 14].

Для диагностики мастита используют различные методы, основанные на контроле содержания в молоке соматических клеток, нуклеиновых кислот, АТФ [16]. Также были исследованы некоторые классы ферментов молока (оксидазы и редуктазы, трансаминазы, липазы, эстеразы, фосфатазы, гликозидазы и др.) с целью поиска надежного биомаркёра для диагностики мастита [10]. В результате проведенного анализа этих ферментов, с точки зрения их пригодности для массовых экспресс-исследований, включая сложность пробоподготовки, время проведения анализа, стоимости оборудования и реагентов, квалификации пользователей, был выбран лизосомальный фермент НАГ аза. Для определения активности НАГазы используют фотометрические и флуориметрические методы [17, 18] и практически не описаны биосенсорные подходы [19].

Однако в насюящее время растет потребность в массовых экспресс-исследованиях активностей этих ферментов непосредственно по месту лечения и в полевых условиях для чего требуются малые объемы пробы. Использование высокочувствительных портативных биосенсоров для определения активностей ферментов-маркёров патологических состояний представляет большой интерес для подобного рода задач медико-биологического мониторинга.

Разработан большой спектр проводящих поверхностей для создания амперометрических биосенсоров. Среди них наиболее часто используемыми материалами для создания рабочих электродов являются графит (пасты, стержни, печатные электроды), платина, золото [20, 21].

Одним из простых, дешевых и удобных способов формирования сенсорных покрытий является метод последовательной адсорбции полиэлектролитов и ферментов (ПНП). Он заключается в чередующейся электростатической адсорбции на поверхность сенсора компонентов, несущих противоположный заряд и позволяет включать различные виды материалов в состав пленочных структур полиэлектролитов [22].

Качество сборки полиэлектролитных конструкций зависит от индивидуальных особенностей поверхности для адсорбции, структуры полиэлектролитов, количества слоев и т.д. Толщины слоев и другие физико-химические характеристики этих конструкций оказались чувствительными к таким факторам, как рН [23], ионная сила [24], температура [25], анионно-катионный состав [26-27], время адсорбции полиэлектролитов [28]. Однако особенности формирования фермент-полиэлектролитных комплексов на твердой поверхности при их нанесении методом ПНП недостаточно изучены.

Следует подчеркнуть, что формирование сенсорных покрытий на поверхности электрода по технологии ПНП выполняется в мягких условиях, что важно для сохранения активности биокатализаторов, в том числе ферментов, в составе нанопленки. Кроме того, дополнительное увеличение чувствительности биосенсора может быть достигнуто путем включения наноматериалов и медиаторов электронного переноса в нанопленку, а также за счет формирования многослойных структур [29-31].

Таким образом, целью настоящей работы явилось детальное исследование влияния условий формирования фермент-полиэлектролитных пленок на основе холиноксидазы и тирозиназы на поверхности электродов для разработки высокочувствительных биосенсоров на холин и фенол, соответственно, а также исследование возможности практического применения разработанных планарных биосенсоров для анализа АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОН1 в крови млекопитающих и НАГ азы в молоке коров.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

4. ВЫВОДЫ

1. Исследовано влияние галогенид анионов (Т", СГ, Вг", I") на адсорбцию ПДДА и последующее нанесение отрицательно заряженных частиц (холиноксидазы и золотых наночастиц). Установлено, что нанесение ПДДА из растворов, содержащих йодид-анион приводит к формированию поверхности, обеспечивающей пятикратное увеличение чувствительности холинового биосенсора на основе графитовых стержней, вида Мп02/ПДДАК1/Х0.

2. Исследовано влияние предварительной подготовки поверхности сенсора с использованием наноструктурированных объектов (мультистенные углеродные панотрубки и наностержни, белковые нанотрубки, наночастицы золота) на активность холинового и фенольного биосенсоров. Показано, что подготовка поверхности увеличивает активность холинового и фенольного биосенсоров в 7,6 и 3,5 раза, соответственно.

3. Разработаны планарные холиновые и фенольные биосенсоры на основе холиноксидазы и тирозиназы, соответственно. Исследовано влияние условий адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация, время высушивания слоев) и определены параметры, влияющие на активность биосенсоров: анионный состав буферного раствора, присутствие растворителя, количество циклов нанесения слоев ПДДА/фермент, присутствие многозарядных нанообъектов. Аналитические характеристики разработанного холинового биосенсора: предел обнаружения по холину - 50 нМ,

1 2 воспроизводимость - 4,1%, чувствительность - 102 мА-М" см" . Аналитические характеристики фенольного биосенсора: предел обнаружения по фенолу - 2,6 нМ, воспроизводимость - 6,3%, чувствительность - 1760 мА-М"1 см"2.

4. Разработан биосенсорный формат определения активностей ацетил- и бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы и Ы-ацетил-р-О-глюкозаминидазы в биологических жидкостях на основе холиновых и фенольных сенсоров планарного типа. Пределы обнаружения АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОН1 и НАГ азы составили 4,5, 2, 2, 0,2 и 0,2 мЕд/мл, соответственно.

1. Richardson R.J. Anticholinesterase insecticides. In: Comprehensive Toxicology, (McQueen C.A. Ed.) // Oxford: Academic Press, 2010, V. 13. P. 433-444.

2. Giacobini E. Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease. // Neurochem Res., 2003. V. 28. P. 515-22.

3. Lockridge O. Genetic variants of human serum cholinesterase influence metabolism of the muscle relaxant succinylcholine. // Pharmacol. Therap., 1990. V. 47. P. 35-60.

4. Pirmohamed M., Park B.K. Genetic susceptibility to adverse drag reactions. // Trends Pharmacol. Sci., 2001. V. 22. P. 298-305.

5. Wierdl M., Morton C.L., Danks M.K. et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a horse liver butyrylcholinesterase: evidence for CPT-11 drug activation. // Biochem. Pharmacol., 2000. V. 59. №7. P. 773-81.

6. Masson P., Carletti E., Nachon F. Structure, activities and biomedical applications of human butyrylcholinesterase // Protein Pept. Lett., 2009. V. 16. P. 1215-1224.

7. Masson P., Nachon F., Broomfield C.A et al. A collaborative endeavor to design cholinesterase-based catalytic scavengers against toxic organophosphorus esters. // Chem. Biol. Interact., 2008. V. 175. № 1-3. P. 273-280.

8. Satoh Т., Role of carboxylesterases in xenobiotic metabolism. // Revs. Biochem. Toxicol., 1987, V. 8. P. 155-181.

9. Kitchen B.J., Middleton G. Enzymic methods for estimation of the somatic cell count in bovine milk. // J Dairy Res. 1976. V. 43. № 2. P. 491-498.

10. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.J. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. //Biochem. Pharmacol., 1961. V. 7. P. 88-95.

11. Okabe H., Sagesaka K., Nakajima N. et al. New enzymatic assay of cholinesterase activity. // Clin. Chim. Acta, 1977. V. 80. P. 87-94.

12. Worek F., Mast U., Kiderlen D., Diepold C, Eyer P. Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood. // Clin Chim Acta, 1999. V. 288. P. 7390.

13. Рудакова Е.В., Болтнева Н.П., Махаева Г.Ф. Сравнительный анализ эстеразной активности крови человека, мыши и крысы. // Бюл. Эксп. Биол. Мед, 2011. Т. 152, №7. С. 80-83.

14. Haigh J.R., Lefkowitz LJ., Capacio B.R. et al. Advantages of the WRAIR whole blood Cholinesterase assay: comparative analysis to the micro-Ellman, Test-mate ChE, and Michel (DeltapH) assays. // Chem Biol Interact, 2008. V.175. P. 417-420.

15. Kitchen B.J. Review of the progress of dairy science: bovine mastitis: milk compositional changes and related diagnostic tests. // J Dairy Res. 1981. V. 48. № 1. P. 167-188.

16. Choukri A. Improvement in subclinical mastitic milk detection methods. // Arab Gulf J of Scientific Re. 2000. V. 18. № 3. P: 184-188.

17. Pemberton R.M., Hart J.P., Mottram T.T. An assay for the enzyme N-acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAGase) based on electrochemical detection using screen-printed carbon electrodes (SPCEs). //Analyst. 2001. V. 126. № 11. P. 1866-1871.

18. Chaubey A., Malhotra B. D. Mediated biosensors. // Biosens. Bioelectron., 2002. V. 17. P. 441-456.

19. Mehrvar M., Abdi M. Recent developments, characteristics, and potential applications of electrochemical biosensors. // Anal. Sei., 2004. V. 20. P. 1113 1126.

20. Львов, Ю. M. , Дехер, Г. Сборка мультислойных упорядоченных пленок последством чередующейся адсорбции противоположно заряженных макромолекул. // Кристаллогр., 1994. Т. 39 (4). Р. 696-716.

21. Kim B-S., Gao Н., Argun A.A., Matyjaszewski К., Hammond P.Т. All-Star Polymer Multilayers as pH-Responsive Nanofilms. // Macromolecules, 2009. V.42. P. 368-375.

22. McAloney R. A., Sinyor M., Dudnik V., Goh M. C. Atomic Force Microscopy Studies of Salt Effects on Polyelectrolyte Multilayer Film Morphology. // Langmuir, 2001. V. 17 (21). P. 6655-6663.

23. Salomaki M., Vinokurov I. A., Kankare J. Effect of Temperature on the Buildup of Polyelectrolyte Multilayers. // Langmuir, 2005. V. 21 (24). P. 11232-11240.

24. Salomaki M., Tervasmaki P., Areva S., Kankare J. The Hofmeister anion effect and the growth of polyelectrolyte multilayers. // Langmuir, 2004. V. 20. P. 3679-3683.

25. Salomaki M., Kankare J. Specific Anion Effect in Swelling of Polyelectrolyte Multilayers. //Macromolecules 2008. V. 41 (12). P. 4423-4428.

26. Enarsson L.-E., Wagberg L. Adsorption Kinetics of Cationic Polyelectrolytes Studied with Stagnation Point Adsorption Reflectometry and Quartz Crystal Microgravimetry. // Langmuir, 2008. V. 24. P. 7329-7337.

27. Wang J., Liu G., Jan M. R. Ultrasensitive Electrical Biosensing of Proteins and DNA: Carbon-Nanotube Derived Amplification of the Recognition and Transduction Events. // J. Am. Chem. Soc., 2004. V. 126. P. 3010-3301.

28. Zhao W., Xu J.-J., Shi C.-G., Chen H.-Y., Multilayer membranes via layer-by-layer deposition of organic polymer protected Prussian blue nanoparticles and glucose oxidase for glucose biosensing. // Langmuir, 2005. V. 21. P. 9630-9634.

29. Ordentlich A., Barak D., Kronman C. Dissection of human acetylcholinesterase active centre determinants of substrate specifity. // J. Biol. Chem., 1993. V. 268(23). P. 1708317095.

30. Keesey J., Biochemica Information. // Boehringer Mannheim Biochemicals, 1987.

31. Plageman LR, Pauletti GM, Skau KA. Characterization of acetylcholinesterase in Caco-2 cells. // Exp Biol Med (Maywood), 2002. V. 227(7). P. 480-486.

32. Lindstrom J., Mutation Causing Muscle Weakness. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1998. V. 95. P. 9070-9071.

33. Zhang X.J., Yang L., Zhao Q. Induction of acetylcholinesterase expression during apoptosis in various cell types. // Cell Death and Differentiation, 2002. V. 9. P. 790-800.

34. Chatonnet A., Lockrige O. Comparison of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase. // Biochem. J., 1989. V. 260. P. 625-634.

35. A1-Kassab A.S., Vijayakumar E. Profile of serum cholinesterase in systemic sepsis syndrome (septic shock) in intensive care unit patients. // Eur. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1995. V. 33, P. 11-14.

36. Ohayo-Mitoko G.J.A., Kromhout H., Simwa J.M. Self reported symptoms and inhibition of acetylcholinesterase activity among Kenyan agricultural workers. // Occup. Environ. Med., 2000. V. 57. P. 195-200.

37. Solberg Y., Belkin M. The role of excitotoxicity in organophosphorus nerve agents central poisoning. //Trends in Pharmacol. Sci., 1997. V. 18. P. 183-185.

38. Francis P. Т., Palmer A. M., Snape M. The cholinergic hypothesis of Alzheimer's disease: a review of progress. // J. Neurol. Neurosurg Psychiatry, 1999. V. 66. P. 137-144.

39. Schulpis K.H., Karikas G.A., Tjamouranis J. Acetylcholinesterase activity and biogenic amines in phenylketonuria. // Clin. Chem., 2002. V. 48 (10). P. 1794-1796.

40. Silver A. The Biology of Cholinesterases. // Amsterdam, 1974. P. 576.

41. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике, Минск, 2000. Т. 2. С. 258-260.

42. Soreq Н., Zakut Н. Peripheral anionic site. Human Cholinesterases and Anticholinesterases, 1993. P.14-15.

43. Lenz D.E., Yeung D., Smith J.R, Sweeneyd R.E., Lumleya L.A., Cerasolia D.M. Stoichiometric and catalytic scavengers as protection against nerve agent toxicity: A mini review. // Toxicology, 2007. V. 233 (1-3). P. 31-39.

44. Gorelick D.A., Enhancing cocaine metabolism with butyrylcholinesterase as a treatment strategy. // Drug Alcohol Depend, 1997. V. 48 (3). P. 159-165.

45. Iwasaki Т., Yoneda M., Nakajima A. et al. // Intern. Med., 2007. V. 46 (19). P. 1633-1639.

46. Lockridge O., Masson P. Pesticides and susceptible populations: people with Butyrylcholinesterase genetic variants may be at risk. // Neurotoxicol., 2000. V. 21. P. 113126.

47. Махаева Г.Ф., Малыгин В.В., Мартынов И.В. Отставленная нейротоксичность при действии фосфорорганических пестицидов. // Агрохимия, 1987. Т. 12. С. 103-124.

48. Yen Т., Nightingale B.N., Burns J.C. Butyrylcholinesterase (BCHE) genotyping for post-succinylcholine apnea in an australian population. // Clin. Chem., 2003. V. 48(8). P. 12971308.

49. Shawn R. F., Doctor B.P. Rapid, quantitative, and simultaneous determination of AChE and BChE levels in unprocessed whole blood. // U.S. Patent № 6746850 B2, 08.06.2004.

50. Satoh Т., Hosokawa M. The mammalian carboxylesterases: from molecules to functions. // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol, 1998. V. 38. P. 257-188.

51. Satoh T., Taylor P., Bosron W.P., Sanghani S.P., Hosokawa M., La Du B.N. Current progress on esterases: from molecular structure to function. // Drug Metab. Dispos., 2002. V. 30(5). P. 488-493.

52. Li B., Sedlacek M., Manoharan I., Boopathy R., Duysen E.G., Masson P., Lockridge O. Butyrylcholinesterase, paraoxonase, and albumin esterase, but not carboxylesterase, are present in human plasma. // Biochem. Pharmacol., 2005. V. 70. P. 1673-1684.

53. Wheelock C.E., Shan G., Ottea J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. // J. Pestic. Sci., 2005. V. 30(2). P. 75-83.

54. Aldridge W. N. The esterases: perspectives and problems. // Chem. Biol. Interact. 1993. V. 87, P. 5-13.

55. Hosokawa M. Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs. // Molecules, 2008. V. 13. P. 412-431.

56. Saboori A.M., Newcombe D.S. Human monocyte carboxylesterase, Purification and kinetics. // J. Biol. Chem., 1990. V. 265(32). P. 19792-19799.

57. Kleingeist B., Bocker R., Geisslinger G., Brugger R. Isolation and pharmacological characterization of microsomal human liver flumazenil carboxylesterase // J. Pharm Pharmaceut Sci, 1998. V. 1(1). P. 38-46.

58. Satoh T., Role of carboxylesterases in xenobiotic metabolism. // Revs. Biochem. Toxicol., 1987. V. 8. P. 155-181.

59. Heymann E. Enzymatic Basis of Detoxication. // Acad. Press., 1980. V. 2. P. 291-323.

60. Prokai L., Prokai-Tatrai K. Metabolism-based drug design and drug targeting. // Pharm. Sci. Tech. Today., 1999. V. 2(11). P. 457-463.

61. Fukuto T.R. Mechanism of action of organophosphorus and carbamate insecticides. // Environ. Health. Perspect., 1990. V. 87. P. 245-254.

62. Maxwell D.M. The specificity of carboxylesterase protection against the toxicity of organophosphorus compounds. /'/' Toxicol. Appl. Pharmacol., 1992. V. 114. P. 306-312.

63. Redinbo M.R., Bencharit S., Potter P.M. Human carboxylesterase 1: from drug metabolism, // Biochemical Society Transactions, 2003. V. 31(3). P. 620-624.

64. Sun H., Yazal J.E1., Lockridge O., Schopfer L.M., Brimijoin S., Pang Y.-P. Predicted Michaelis-Menten complexes of cocaine-butyrylcholinesterase. // J. Biol. Chem., 2001. V. 276. P. 9330-9336.

65. McRee D. Protecting against cocaine, heroin, and sarin gas. // Chem. Biol., 2003. V. 10. P. 295-297.

66. Potter P.M, Pawlik C.A, Morton C.L, Naeve C.W, Danks M.K. Isolation and partial characterization of a cDNA encoding a rabbit liver carboxylesterase that activates the prodrug irinotecan (CPT-11). // Cancer Res., 1998. V. 58. P. 2646-2651.

67. Xu G., Zhang W., Ma M.t K., McLeod H. L. Human, Carboxylesterase 2 Is Commonly Expressed in Tumor Tissue and Is Correlated with Activation of Irinotecan. // Clinical Cancer Research, 2002. V. 8. P. 2605-2611.

68. Cai L., Tang X., Guo L., An Т., Wang Y., Zheng J. Decreased serum levels of CE-2 in patients with ovarian cancer. // Tumori, 2009. V. 95. P. 473-478.

69. Aviram M. Does paraoxonase play a role in susceptibility to cardiovascular disease? // Molecular Medicine Today, 1999. V. 5 (9). P. 381-386.

70. Billecke S., Draganov D., Counsell R., Stetson P., Watson C., Hsu C., La Du B.N. Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze lactones and cyclic carbonate esters. // Drug Metab Dispos., 2000. V. 28 (11). P. 1335-1342.

71. Draganov D.I., Teiber J.F., Speelman A., Osawa Y., Sunahara R., La Du B.N. Human paraoxonases (PON1, PON2, and PON3) are lactonases with overlapping and distinct substrate specificities. // J Lipid Res., 2005. V. 46 (6). P. 1239-1247.

72. Khersonsky O., Tawfik D.S. Structure-reactivity studies of serum paraoxonase PON1 suggest that its native activity is lactonase. // Biochemistry, 2005. V. 44 (16). P. 6371-6382.

73. Nishio E., Watanabe Y. Cigarette smoke extracts inhibits plasma paraoxonase activity by modification of the enzyme's free thiols. // Biochem Biophys Res Commun., 1997. V. 236. P. 289-293.

74. James R.W., Leviev I., Righetti A. Smoking is associated with reduced serum paraoxonase activity and concentration in patients with coronary artery disease. // Circulation, 2000. V. 101 (19). P. 2252-2257.

75. Dcbord J., Dantoine T., Bollinger J.C., Abraham M.H., Verneuil B., Merle L. Inhibition of arylesterase by aliphatic alcohols. // Chem Biol Interact., 1998. V. 113 (2). P. 105-115.

76. Moser V.C., Chanda S.M., Mortensen S.R., Padilla S. Age- and gender-related differences in sensitivity to chlorpyrifos in the rat reflect developmental profiles of esterase activities. // Toxicol Sci., 1998. V. 46 (2). P. 211-222.

77. Karanth S., Pope C. Carboxylesterase and A-esterase activities during maturation and aging: relationship to the toxicity of chlorpyrifos and parathion in rats. // Toxicol Sci., 2000. V. 58 (2). P. 282-289.

78. Seres I., Paragh G., Deschene E., Fulop T., Jr., Khalil A. Study of factors influencing the decreased HDL associated PON1 activity with aging. // Exp Gerontol., 2004. V. 39 (1). P. 59-66.

79. Wehner J.M., Murphy-Erdosh C., Smolen A., Smolen T.N. Genetic variation in paraoxonase activity and sensitivity to diisopropylphosphofluoridate in inbred mice. // Pharmacol Biochem Behav., 1987. V. 28 (2). P. 317-320.

80. Michalski J.C., Klein A. Glycoprotein lysosomal storage disorders: alpha- and beta-mannosidosis, fucosidosis and alpha-N-acetylgalactosaminidase deficiency. // Biochim

81. B: . і1 nnn ir ілссліоч D £C\ о ЛlUpIiyS /Л.СІСІ., ІУУУ. V . 14JJ {¿'J)- Г. &7-ОЧ.

82. Kitchen B.J., Masters C. J. Purification and properties of bovine mammary gland N-acetyl-P-D-glucosaminidase, Biochimica et Biophysica Acta, 1985. V. 831. P. 125-132.

83. Harty D.W., Chen Y., Simpson C.L., Berg T., Cook S.L., Mayo J.A., Hunter N. Jacques N.A. Characterisation of a novel homodimeric N-acetyl-beta-D-glucosaminidase from Streptococcus gordonii. // Biochem Biophys Res Commun., 2004. V. 319 (2). P. 439-447.

84. Y. T. Li and S. C. Li. a-mannosidase, b-N-acetylhexosaminidase, and b-galactosidase from jack bean meal. // Methods Enzymol., 1972. V. 28. P. 702-713.

85. Kitchen B., Kwee W.S., Middleton G., Andrews R.J. Relationship between the level of N-acetyl-D-glucosaminidase (NAGase) in bovine milk and the presence of mastitis pathogens. //J. Dairy Res., 1984. V. 51.P.11-16.

86. Waage S., Mork T., Roros A., Aasland D., Hunshamar A., Odegaard S.A. Bacteria associated with clinical mastitis in dairy heifers. // J Dairy Sci., 1999. V. 82 (4). P. 712-719.

87. Viguier C., Arora S., Gilmartin N., Welbeck K., O'Kennedy R. Mastitis detection: current trends and future perspectives. // Trends Biotechnol., 2009. V. 27 (8). P. 486-493.

88. Pyorala S. Indicators of inflammation in the diagnosis of mastitis. // Vet Res., 2003. V. 34 (5). P. 565-578.

89. Albera E., Kankofer M. Antioxidants in colostrum and milk of sows and cows. // Reprod Domest Anim., 2009. V. 44 (4). P. 606-611.

90. Kalow W., Genest K. A method for the detection of atypical forms of human serum cholinesterase. Determination of di- bucaine mumbers. // J. Biochem. & Physiol., 1975. V. 35. P. 339.

91. Novel Choline derivative and method for determining serum Cholinesterase activity. European Patent EPO160980, Publication date 16.10.1991

92. United States Patent № 4596772. Publication date 24.06.1986

93. Okabe H., Sagesaka K., Nakajima N., Noma A. New enzymatic assay of Cholinesterase activity.// Clin. Chim. Acta., 1977. V. 80. P. 87-94.

94. Pohanka M., Hrabinova M., Kuca K., Simonato J.P. Assessment of Acetylcholinesterase Activity Using Indoxylacetate and Comparison with the Standard Ellman's Method. // Int J Mol Sei., 2011. V. 12(4). P. 2631-2640.

95. Schmidt E. Alkaline phosphatase standard method.// Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem.,1992. V. 30. P. 163-170.

96. Padilla S., Lassiter T.L., Hunter D. Neurodegeneration Methods and Protocols. // Humana Press Inc., 1999. V. 22. P. 237-245.

97. Johnson C.D., Russell R.L. A rapid, simple radiometric assay for Cholinesterase, suitable for multiple determinations. // Analytical Biochemistry, 1975. V. 64(1). P. 229-238.

98. Michel H.O. An electrometric method for the determinationof red blood cell and plasma Cholinesterase activity. // J. Lab. Clin. Med, 1949. V. 34, P. 1564.

99. Khaled E., Hassan H.N., Mohamed G.G., Ragab F.A., Seleim A.E. Disposable Potentiometrie sensors for monitoring Cholinesterase activity. // Talanta, 2010. V.83(2). P. 357-363.

100. Katsu T., Kayamoto T. Determination of Cholinesterase in blood serum with a benzoate-sensitive membrane electrode. // Anal. Chim. Acta, 1991. V. 254. P. 95-97.

101. Ivanov A., Evtugyn G., Budnikov H. Cholinesterase sensors based on screen-printed electrodes for detection of organophosphorus and carbamic pesticides. // Anal Bioanal Chem., 2003. V. 377. P. 624-631.

102. Montesinos T., Perez-Munguia S., Valdez F., Marty J.-L. Disposable Cholinesterase biosensor for the detection of pesticides in water miscible organic solvents. // Analyt. Chim. Acta, 2001. V. 431. P. 231-237.

103. Morelis R.M., Coulet P.R., Simplot A. Rapid and sensitive discrimination of acetylcholinasterase activity in amniotic fluid with a cholin sensor. // Clin. Cim. Acta, 1991. V. 203. P. 295-304.

104. Palleschi G., Lavagnini M.G., Moscone D. Determination of serum Cholinesterase activity and dibucain numbers by an amperometric choline sensor. // Bios, and Bioel., 1990. V. 5. P. 27-35.

105. Stoytcheva M., Zlatev R., Valdez B. Electrochemical sensor based on Arthrobacter globiformis for Cholinesterase activity determination. // Bios, and Bioel., 2006. V. 22(1). P. 1-9.

106. Stem S. H., Johnsen B. A, Fonnum F. Carboxylesterases, importance for the detoxification of organophosphorus anticholinesterases and trichothecenes. // Biochem. Pharmacol., 1985. V. 34 (15). P. 2779-2785.

107. Dass P., Mejia M., Landes M., Jones R., Stuart B., Thyssen J. Cholinesterase: review of methods. // Clin. Chem, 1994. V. 34. P. 135-157.

108. Katsu T., Hanada N. Ion-selective electrode for salicylate assay in bloom serum. // Anal. Chim. Acta, 1996. V. 321. P. 21-25.

109. Chanda S.M., Mortensen S.R., Moser V.C., Padilla S. Tissue-specific effects of chlorpyrifos on carboxylesterase and Cholinesterase activity in adult rats: An in vitro and in vivo comparison. //Fundam. Appl. Toxicol., 1997. V. 38. P. 148-157.

110. Vanasperen K. A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method, //J. Ins. Physiol., 1962. V. 8. P.401-416.

111. Saboori A. M., Newcombe D. S., Human monocyte carboxylesterase, Purification and kinetics. // J. Biol. Chem., 1990, V. 265(32), P. 19792-19799.

112. Shan G., Hammock B. D. Development of Sensitive Esterase Assays Based on a-Cyano-Containing Esters G. // Analytical Biochemistry, 2001. V. 299. P. 54-62.

113. Billecke S., Draganov D., Counsell R., Stetson P., Watson C., Hsu C., La Du B.N. Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze lactones and cyclic carbonate esters. // Drug Metab Dispos. 2000. V. 28. № 11. P. 1335-1342.

114. Browne R.W., Koury S.T., Marion S., Wilding G., Muti P., Trevisan M. Accuracy and biological variation of human serum paraoxonase 1 activity and polymorphism (Q192R) by kinetic enzyme assay. // Clin Chem., 2007. V. 53(2). P. 310-317.

115. Gaiaukov L., Tawlik D.S. The development of human sera tests for HDL-bound serum PON1 and its lipolactonase activity. // J Lipid Res., 2007. V. 48(7). P. 1637-1646.

116. Khersonsky O., Tawfik D.S. Chromogenic and fluorogenic assays for the lactonase activity of serum paraoxonases. // Chembiochem., 2006. V. 7(1). P. 49-53.

117. Sheldrake R.F., Hoare R.J., McGregor G.D. Lactation stage, parity, and infection affecting somatic cells, electrical conductivity, and serum albumin in milk. // J Dairy Sci., 1983. V. 66(3). P. 542-547.

118. Djabri B., Bareille N., Beaudeau F. Quarter milk somatic cell count in infected dairy cows: a meta-analysis. // Vet Res., 2002. V. 33(4). P. 335-357.

119. Pearsona J.K.L., Wrighta C.L., Greer D.O. A study of methods for estimating the cell content of bulk milk. // J Dairy Res., 1970. V. 37(3). P. 467-480

120. Schalm O.W., Noorlander D.O. Experiments and observations leading to development of the California mastitis test. // J Am Vet Med Assoc., 1957. V. 130(5). P. 199-204.

121. Frundzhyan V.G., Parkhomenko I.M., Brovko L.Y., Ugarova N.N. Improved bioluminescent assay of somatic cell counts in raw milk. // J Dairy Res., 2008. V. 75(3). P. 279-283.

122. Stannard C.J., Gibbs P.A. Rapid microbiology: Applications of bioluminescence in the food industry a review. // Luminescence, 1986. V. 1(1). P. 3-10.

123. Spencer G.R., Simon J. The catalase, California and cell count tests for detecting abnormalities in milk. //Am J Vet Res., 1960. V. 21. P. 578-584.

124. Willits R.E., Babel F.J. Disc flotation test for measurement of catalase activity in milk. // J Dairy Sci., 1965. V. 48(10). P. 1287-1289.

125. Bogin E., Ziv G., Avidar J., Rivetz B., Gordin S., Saran A. Distribution of lactate dehydrogenase isoenzymes in normal and inflamed bovine udders and milk. // Res Vet Sci., 1977. V. 22(2). P. 198-200.

126. Kitchen B.J., Middleton G., Durward I.G., Andrews R.J., Salmon M.C. Mastitis diagnostic tests to estimate mammary gland epithelial cell damage. // J Dairy Sci,. 1980. V. 63(6). P. 978-983.

127. Ball H.J., Greer D. N-acetyl-beta-D-glucosaminidase test for screening milk samples for subclinical mastitis. // Vet Rec., 1991. V. 129(23). P. 507-509.

128. Kitchen B.J., Middleton G., Salmon M. Bovine milk N-acetyl-beta-D-glucosaminidase and its significance in the detection of abnormal udder secretions. // J Dairy Res., 1978. V. 45(1). P. 15-20.

129. Pugh D., Leaback D.H., Walker P.G. Studies on giucosaminidase, N-acetyl-beta-glucosaminidase in rat kidney. // Biochem J., 1957. V. 65. P. 464-469.

130. Humbert G., Guingamp M.F., Linden G. The Clarifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. // J Dairy Res., 2006. V. 73. P. 464-471.

131. Choukri A. Improvement in subclinical mastitic milk detection methods. // Arab Gulf J of Scientific Res., 2000. V. 18. P. 184-188.

132. Mottram T., Hart J., Pemberton R. Biosensing techniques for detecting abnormal and contaminated milk. // Robotic Milking: Proceedings of the International Symposium, Wageningen Press, 2000. P 108-113.

133. EnzyChromTM Choline Assay Kit, Quantitative Colorimetric Choline Determination

134. EnzyChromTM Choline Assay Kit, Fluorometric Choline Determination

135. Chen Z, Ren X, Meng X, Chen D, Yan C, Ren J, Yuan Y, Tang F. Optical detection of choline and acetylcholine based on H(2)0(2)-sensitive quantum dots. // Biosens Bioelectron., 2011. V. 28(1). P. 50-55.

136. Rahman Md. A., Park D.S., Shim Y.B. A performance comparison of choline biosensors: anodic or cathodic detections of H202 generated by enzyme immobilized on a conducting polymer. // Biosens. Bioelectron., 2004. V. 19. P. 1565-1571.

137. Shimomura T., Itoh T., Sumiya T., Mizukami F., Ono M. Amperometric determination of choline with enzyme immobilized in a hybrid mesoporous membrane. // Talanta, 2009. V. 78(1). P.217-220.

138. Bai Y.H., Du Y., Xu J.J., Chen H.Y. Choline biosensors based on a bi-electrocatalytic property of Mn02 nanoparticles modified electrodes to H202. // Electrochemistry Communications, 2007. V. 9. P. 2611-2616.

139. Yang M., Yang Y., Yang Y., Shen G., Yu R. Bienzymatic amperometric biosensor for choline based on mediator thionine in situ electropolymerized within a carbon paste electrode. // Anal. Biochem., 2004. V. 334. P. 127-134.

140. Yang M., Yang Y., Yang Y., Shen G., Yu R. Microbiosensor for acetylcholine and choline based on electropolymerization/sol-gel derived composite membrane. // Analytica Chimica Acta, 2005. V. 530. P. 205-211.

141. Razóla S.S., Pochet S., Grosfíls K., Kauffmann J.M. Amperometric determination of choline released from rat submandibular gland acinar cells using a choline oxidase biosensor. //Biosens. Bioelectron., 2003. V 18, P. 185-191.

142. Hsieh B.C., Matsumoto K., Cheng T.J., Yuu G., Chen R.L. Choline biosensor constructed with chitinous membrane from soldier crab and its application in measuring cholinesterase inhibitory activities, J Pharm Biomed Anal., 2007. V. 45. P. 673-678.

143. Shi H., Yang Y., Huang J., Zhao Z., Xu X., Anzai J., Osa T., Chen Q. Amperometric choline biosensors prepared by layer-by-layer deposition of choline oxidase on the Prussian blue-modified platinum electrode. // Talanta, 2006. V.70. P. 852-858.

144. Wang J., Liu G., Lin Y. Amperometric choline biosensor fabricated through electrostatic assembly of bienzyme/polyelectrolyte hybrid layers on carbon nanotubes. // Analyst, 2006. V. 131(4). P.477-83.

145. Shi H., Song Z., Huang J., Yang Y., Zhao Z., Anzai J., Osa T., Chen Q. Effects of the type of polycation on the amperometric response of choline biosensors prepared by a layer-by-layer deposition technique, Mater. Sci. Eng. C, 2005. V.25. P. 433-435.

146. Meulenberg, Е.Р. Phenoiics: Occurrence and Immunochemical Detection in Environment and Food. // Molecules, 2009. V. 14. P. 439-473.

147. Parellada J., Narváez A., López M.A., Domínguez E., Fernández J.J., Pavlov V., Katakis I. Amperometric immunosensors and enzyme electrodes for environmental applications. // Anal. Chim. Acta., 1998. V. 362. P. 47-57.

148. Himmelwright R.S., Eickman N.C., Lubien C.D., Lerch K., Solomon E. Chemical and spectroscopic studies of the binuclear copper active site of Neurospora Tyrosinase: comparison to hemocyanins. // J. Am. Chem. Soc., 1980. V. 102. P. 7339-7344.

149. Streffer K., Vijgenboom E., Tepper A., Makower A., Scheller F.W., Canters G.W., Wollenberger U. Determination of phenolic compounds using recombinant tyrosinase from Streptomyces antibioticus. // Anal. Chim. Acta., 2000. V. 427. P. 201-210.

150. Montereali M. R., Vastarella W., Delia Seta L., Pilloton R. Tyrosinase biosensor based on modified screen printed electrodes: measurements of total phenol content. // Intern. J. Environ. Anal. Chem., 2005. V. 85. P. 795-806.

151. Alarcon G., Guix M., Ambrosi A., Ramirez Silva M.T., Palomar Pardave M. E., Merkoci A. Stable and sensitive flow-through monitoring of phenol using a carbon nanotube based screen printed biosensor. // Nanotechnology, 2010. V. 21. P. 245-502.

152. Mita D. G., Attanasio A., Arduini F., Diano N., Grano V., Bencivenga U., Rossi S., Amine A., Moscone D. Enzymatic determination of BPA by means of tyrosinase immobilized on different carbon carriers. // Biosens. Bioelectron., 2007. V. 23. P. 60-65.

153. Abdullah J., Ahmad M., Heng L.Y., Karuppiah N., Sidek H. Chitosan-based tyrosinase optical phenol biosensor employing hybrid nafion/sol-gel silicate for MBTH immobilization. // Talanta, 2006. V. 70(3). P.527-532.

154. Дубачёва Г.В., Соколовская JI.Г., Сиголаева Л.В. Тирозиназные биосенсоры на основе наноструктурированных пленок полиэлектролитов. // Сенсорные системы, 2006. V. 20(4). Р. 336-343.

155. Campuzano S., Serra В., Pedrero М. Amperometric flow-injection determination of phenolic compounds at self-assembled monolayer-based tyrosinase biosensors. // Analytica Chimica Acta., 2003. V. 494. P. 187-197.

156. Zhou Y.L., Tian R.H., Zhi J.F. Amperometric biosensor based on tyrosinase immobilized on a boron-doped diamond electrode. // Biosens. Bioelectron., 2007. V. 22(6). P. 822-828.

157. Notsu H., Tatsuma Т., Fujishima A. Tyrosinase-modified boron-doped diamond electrodes for the determination of phenol derivatives. // J of Electroanal Chem., 2002. V. 523. P. 86-92.

158. Katsuhiko A., Jonathan P. H., Qingmin J. Biomaterials and Biofunctionality in Layered Macromolecular Assemblies. // Macromol. Biosci., 2008, V. 8(11). P. 981-990.

159. Tang Z., Wang Y., Podsiadlo P., Kotov N. A. Biomedical Applications of Layer-by-Layer Assembly: From Biomimetics to Tissue Engineering. // Adv. Mater. (Weinheim, Ger.), 2006. V. 18(24). P. 3203-3224.

160. Caruso F., Caruso R. A., Mohwald H. Nanoengineering of Inorganic and Hybrid Hollow Spheres by Colloidal Templating. // Science, 1998. V. 282. P. 1111-1114.

161. Bertrand P., Jonas A., Laschewsky A., Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties. // Macromol. Rapid Commun, 2000. V. 21(7). P. 319-348.

162. Klitzing V. R. Internal structure of polyelectrolyte multilayer assemblies. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2006. V. 8(43). P. 5012-5033.

163. Steitz R., Jaeger W., Klitzing R. Influence of Charge Density and Ionic Strength on the Multilayer Formation of Strong Polyelectrolytes. // Langmuir, 2001. V. 17(15). P. 44714474.

164. Voigt U., Jaeger W., Findenegg G. H., Klitzing R. Charge Effects on the Formation of Multilayers Containing Strong Polyelectrolytes. // J. Phys. Chem. B, 2003. V. 107(22). P. 5273-5280.

165. Voigt U., Khrenov V., Tauer K., Hahn M., Jaeger W., Klitzing R. The effect of polymer charge density and charge distribution on the formation of multilayers. // J. Phys.: Condens. Matter, 2003. V. 15(1). P. S213-S218.

166. Decher G., Schmitt J. Fine-Tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. // In Trends in Coiioid and Interface Science VI, 1992. P. 160-164.

167. Dubas S. T., Schlenoff J. B. Swelling and Smoothing of Polyelectrolyte Multilayers by Salt. //Langmuir, 2001. V. 17(25). P. 7725-7727.

168. Lösche M., Schmitt J., Decher G., Bouwman W. G., Kjaer K. Detailed Structure of Molecularly Thin Polyelectrolyte Multilayer Films on Solid Substrates as Revealed by Neutron Reflectometry. // Macromolecules, 1998. V. 31(25). P. 8893-8906.

169. Steitz R., Leiner V., Siebrecht R., Klitzing R. Influence of the ionic strength on the structure of polyelectrolyte films at the solid/liquid interface. // Colloids Surf. Physicochem. Eng. Aspects, 2000. V. 163(1). P. 63-70.

170. Xiuming J., Zhichun C., Deshui L., Qi W., Xianfu L. Basic Law Controlling the Growth Regime of Layer-by-Layer Assembled Polyelectrolyte Multilayers. // Macromol. Chem. Phys., 2008. V. 209(2). P. 175-183.

171. Yan Y.-fi, Liu G.M., Tang Y.C., Zhang G. In situ Investigation on Layer-by-Layer Deposition of Polyelectrolytes by Quartz Crystal Microbalance. // Chin. J. Chem. Phys., 2008. V. 21. P. 291.

172. McAloney R. A., Sinyor M., Dudnik V., Goh M. C. Atomic Force Microscopy Studies of Salt Effects on Polyelectrolyte Multilayer Film Morphology. // Langmuir, 2001. V. 17 (21). P. 6655-6663.

173. Leontidis E. Hofmeister anion effects on surfactant self-assembly and the formation of mesoporous solids. // Curr. Opin. Colloid Interface Sei., 2002. V. 7(1-2). P. 81-91.

174. Dubas S.T., Schlenoff J.B. Factors Controlling the Growth of Polyelectrolyte Multilayers. //Macromolecules, 1999. V. 32(24). P. 8153-8160.

175. Ghimici L., Dragan S. Behaviour of cationic polyelectrolytes upon binding of electrolytes: effects of polycation structure, counterions and nature of the solvent. // Colloid Polym. Sei., 2002. V. 280(2). P. 130-134.

176. Poptoshev E., Schoeler B., Caruso F. Influence of Solvent Quality on the Growth of Polyelectrolyte Multilayers. // Langmuir, 2004. V. 20(3). P. 829-834.

177. Sui Z., Salloum D., Schlenoff J. B. Effect of Molecular Weight on the Construction of Polyelectrolyte Multilayers: Stripping versus Sticking. // Langmuir, 2003. V. 19. P. 24912495.

178. Zhang J., Senger B., Vautier D., Picart C., Schaaf P., Voegel J.-C., Lavalle P. Natural polyelectrolyte films based on layer-by layer deposition of collagen and hyaluronic acid. // Biomaterials, 2005. V. 26(16). P. 3353-3361.

179. Elbert D.L., Herbert C.B., Hubbell J.A. Thin Polymer Layers Formed by Polyelcctrolytc Multilayer Techniques on Biological Surfaces. // Langmuir, 1999. V. 15(16). P. 5355-5362.

180. Lukkari J., Salomaki M., Aaritalo T., Loikas K., Laiho T., Kankare J. Preparation of Multilayers Containing Conjugated Thiophene-Based Polyelectrolytes. Layer-by-Layer Assembly and Viscoelastic Properties. // Langmuir, 2002. V. 18(22). P. 8496-8502.

181. Lavalle P., Picart C., Mutterer J., Gergely C., Reiss H., Voegel J.-C., Senger B., Schaaf P. Modeling the Buildup of Polyelectrolyte Multilayer Films Having Exponential Growth. // J. Phys. Chem. B, 2004. V. 108. P. 635-648.

182. Porcel C., Lavalle P., Ball V., Decher G., Senger B., Voegel J.-C., Schaaf P. From Exponential to Linear Growth in Polyelectrolyte Multilayers. // Langmuir, 2006. V. 22(9). P.4376-4383.

183. Richert L., Lavalle P., Payan E., Shu X. Z., Prestwich G. D., Stoltz J.-F., Schaaf P., Voegel J.-C., Picart C. Layer by Layer Buildup of Polysaccharide Films: Physical Chemistry and Cellular Adhesion Aspects. // Langmuir, 2004. V. 20(2). P. 448-458.

184. Tan H.L., McMurdo M.J., Pan G., Van Patten P.G. Temperature Dependence of Polyelectrolyte Multilayer Assembly. // Langmuir, 2003. V. 19(22). P. 9311-9314.

185. Elzbieciak M., Zapotoczny S., Nowak P., Krastev R., Nowakowska M., Warszynski P. Influence of pH on the Structure of Multilayer Films Composed of Strong and Weak Polyelectrolytes. // Langmuir, 2009. V. 25. P. 3255-3259.

186. Berndt P., Kurihara K., Kunitake T. Adsorption of poly(styrenesulfonate) onto an ammonium monolayer on mica: a surface forces study. // Langmuir, 1992. V. 8(10). P. 2486-2490.

187. Bertrand P., Jonas A., Laschewsky A., Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties. // Macromol. Rapid Commun, 2000. V. 21(7). P. 319-348.

188. Advincula R., Aust E., Meyer W., Knoll W. In Situ Investigations of Polymer Self-Assembly Solution Adsorption by Surface Plasmon Spectroscopy. // Langmuir, 1996. V. 12(15). P. 3536-3540.

189. Изумрудов В.А. Явления самосборки и молекулярного «узнавания» в растворах (био)полиэлектролитных комплексов. // Успехи химии, 2008. Т. 77(4). С. 401-415.

190. Tsuchida Е., Abe К. Interactions between macromolecules in solution and intermacromolecular complexes. // Adv. Polym. Sci., 1982. V. 45. P. 1-119.

191. Izumrudov V.A., Gorshkova M.Y., Volkova I.F. Controlled phase separations in solutions of soluble polyelectrolyte complex of DIVEMA (copolymer of divinyl ether and maleic anhydride). // Eur. Polym., 2005. V. 41. P. 1251-1259.

192. Schachl K., Alemu H., Kalcher K., Moderegger H., Svancara I., Vytras K. Amperometric determination of hydrogen peroxide with a manganese dioxide film-modified screen printed carbon electrode. // J. Anal. Chem., 1998. V. 362(2). P. 194-200.

193. Yang M., Yang Y., Yang H., Layer-by-layer self-assembled multilayer films of carbon nanotubes and platinum nanoparticles with polyelectrolyte for the fabrication of biosensors. // Biomaterials., 2006. V. 27. P. 246-55.

194. Boehm H.P. Chemical identification of surface groups. // Adv. Catalysis, 1966. V.16. P. 179-274.

195. Kreibig U., Genzel L. Optical absorption of small metallic particles. // Surface Science, 1985, V.156.P. 678-700.