Хроматографические методы экспресс-анализа. Изменение в анализе ферментационных растворов штаммов-продуцентов низкомолекулярных биологически активных веществ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.20 ВАК РФ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

р г 6 он

На правах рукописи

Полануер Борис Миронович

КРОМАТОГРАФШСККЕ МЕТОДЫ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА. ВМЕНЕНИЕ В АНАЛИЗЕ ФЕРМЕНТАЦИОННЫХ РАСТВОРОВ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЬК ВЕЩЕСТВ.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

по специальности: 02.00.20 - Хроматография

Москва-1996

Работа выполнена в Государственном Научном Центре РФ ГосЮШгенетаки и селекщи промышленных микроорганизмов

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор В.Г.Березкин Д.Х.Н.. профессор Б. Г. Беленький д.х.н. Б.В.Мчедлишвили

Ведущая организация: Московская ордена Трудового Красного Знамени Государственная Академия Тонкой Химической Технологии им.М.В. Ломоносо

Защита состоится " 17 " октября 1996 г. в 1330 на заседании -- Специализированного Совета Д. 002.95.02 Института Физической Химии РД по адресу: 117915, Москва, Ленинский просп., 31

С диссертацией можно ознакомиться, в библиотеке Института Физической Химии РАН

Автореферат разослан, "12" сентября 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета.

кандидат химических наук

Коломиец

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность:современная биотехнологическая промышленность - наиболее перспективный, а зачастую и единственный способ получения целого ряда выществ. используемых в' качестве пи- • щевых и кормовых добавок, лекарственных препаратов, сырья для химической и фармацевтической промышленности. Основная доля продукции биотехнологической промышленности, как в количественном, так и в стоимостном выражении приходится на синтезируемые микроорганизмами низкомолекулярные соединения:- аминокислоты, антибиотики, нуклеотиды, нуклеозиды, витамины "и т. д. Неотъ-емлимой частью создания новых, более эффективных и экономичных биотехнологических процессов является разработка соответствующих аналитических методов, обеспечивающих контроль протекания этих процессов.

При этом необходимо решать задачи массового анализа при отборе перспективннх штаммов-продуцентов биологически активных веществ и экспресс-анализа при оптимизации условий ферментации и контроле промышленных биотехнологических процессов. Основные требования к аналитическим методикам контроля в биотехнологии, учитывая обьем й характер выполняемой, работы г экспрессность анализа, простота подготовки проб и возможность получения точных количественных результатов с ошибкой не более 5%.

Биотехнологические образцы, которые являются объектами анализа, представляют собой очень сложные смеси, содержаще компоненты исходной питательной среды и продукта их превращений, происходящих в процессе стерилизации, клетки микроорганизмов и их фрагменты., высокомолекулярные соединения (белки, нуклеиновые кислоты полисахариды и т.д. ). низкомолекулярные соединения (аминокислоты, углеводы, окси- и "кетокислоты и т. д. ). продукты неэнзиматических процессов, протекающих при ферментации (пигменты, продукты реакции Майара и т. д.), а такие неорганические соединения, прежде всего различные соли, вносимые в ферментационные среды: Анализ дополнительно усложняется тем. что основой' образца, как правило, является водная матрица, общее содержание органических вещебтв в которой, может достигать 20-30%.

Вследствие этого, непосредственное определение, даже одного

компонента в биотехнологическом образце каким-либо спектральным аналитическим методом (спектрофотометрией. флуоресцентной спектроскопией и т.д.) в большинстве случаев, не позволяет получить достоверных результатов. Что касается получивших в последнее время широкое распространение энзиматических методов, то их использование обычно не обеспечивает нужной точности при анализе.сложных смесей. В связи с этим перед анализом ^образцов необходимо провести хотя бы частичное разделение их на компоненты и группы компонентов. Для этого можно применить ряд методов - высаливание, экстракции, отгонку и т.д. Однако во многих случаях аналитический метод» включающий сложную пробоподготовку становится излишне длительным, более дорогостоящим, а зачастую не очень надежным. Вследствие этого, огромное значение в анализе биотехнологических образцов приобретают хроматографические методы. Эти методы так или иначе обеспечивают частичное фракционирование образца непосредственно в процессе анализа. Кроме того. при использовании хроматографических методов, как правило, удается добиться разделения компонентов со схожими характеристиками и их количественного определения. Многообразие существующих хроматографических методов позволяет решать задачи анализа очень сложных многокомпонентных смесей, На сегоднашний день •- -разработаны метода определения самых разнообразных веществ в так называемых биомедицинских образцах, однако при этом не уделялось внимания биотехнологическим образцам и разработке хроматографических методов анализа, учитывающих их специфику. Особенно это относится к анализу в биотехнологических образцах низкомолекулярньк соединений, что и определяет актуальность данной работы.

Целью данной работы была разработка общего подхода к анализу ферментационных растворов штаммов микроорганизмов - продуцентов низкомолекулярных биологически активных веществ с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии и его практическому использованию. Особое внимание при этом уделялось наиболее распространенным объектам крупнотонаашых биотехнологичзских -производств - аминокислотам, нуклеозядам. витаминам, а также побочным продуктам, " накапливающимся при их биосинтезе и ухудшающим экономические и , экологические показатели процессов.

Научная новизна настоящей работы заключается в создание общего подхода к хроматографическому .экспресс-анализу низкомолекулярных органических веществ в ферментадаоных растворах этаммов-продуцен-тов биологически активных соединений. При разработке аналитических методик значительное внимание уделялось повышению точности анализа и сокращению ошибки определения до 5%, а также сокращению времени анализа (как правило до 15-20 мин на пробу) и максималь-' ному его упрощению и удешевлении. В работе показано, что выполнение этих, на первый взгляд взаимопротиворечнЕых требований возможно за счет упрощения пробоподготовки. Показано, что основной вклад в ошибку определения полярных компонентов в столь сложных с точки зрения хроматографии объектах вносит, как правило, стадия пробоподготовки. Эта стадия является и дорогостоящей, и наиболее длительной, и вносит наиболее существенный вклад в загрязнение окружающей среды при функционировании аналитической лаборатории. Упрощение стадии пробоподготовки позволяет не только повысить точность анализа, но и удешевить метод, сделать его более надежным и быстрым. Однако упрощение пробоподготовки приводит к необходимости разделять более сложные смеси и. следовательно, усложняет собственно хроматографическув составляющую анализа. Вследствие этого необходимо повышать селективность на стадиях хроматог-• рафического разделений и •детектирования. Вместе с' этим, упрощение пробоподготовки повышает точность анализа при определении примесей. схожих по свойствам с основным компонентом, но содержащихся в сотни раз меньших количествах. Иначе говоря, предлагаемый в работе подход связан с разработкой объектно-ориентированных-хрома-тографических методик, направленных на определение конкретных низкомолекулярных компонентов в конкретных образцах ферментационных растворов штаммов-продуцентов. Возможность его практической реализации в значительной степени связана со спецификой анализируемых объектов - штаммы-сверхпродуценты, полученные с использованием методов генетики и генной инженерии, как правило, секрети-руют в окружающую их среду сравнительно большие количества целевого продукта и связанных с его биосинтезом веществ и сравнительно немного других низкомолекулярных метаболитов.

Поставленные задачи в работе решаются за счет комплексного использования двух хроматографических подходов - газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для экспресс-анали-

за летучих полярных соединений в биотехнологических образцах с прямым вводом водных проб разработан новый класс сорбентов, в которых впервые в качестве неподвижной фазы или ее компонента используется расплав кристаллогидрата фторида калия.. Показано, что сам расплав кристаллогидрата фторида калия можно использовать как неподвижную фазу, с очень малой способностью к межмо-лекулярнш взаимодействиям, что позволяет применять его для экспресс-анализа полярных веществ. Для повышения селективности разделения использованы сорбенты, содержащие'органическую неподвижную фазу (Апиезон J1, Тритон Х-305, ПЭГ-40М и т.д.) и кристаллогидрат фторида калия. Для оценки вклада кристаллогидрата фторида калия в удерживание на подобных сорбентах их свойства сопоставлены со свойствами сорбентов, содержащих наряду с органической неподвижной фазой легко дегидратирующийся кристаллогидрат тринатрийфосфата.

С использованием подобных сорбентов разработан ряд методик анализа биотехнологических образцов, в частности, при изучении потребления метанола метилотрофными микроорганизмами. накопления ацетона, этанола и бутанола бактериями рода Clostridium, образования -продуктов гликолиза бациллярными -шташами-проду- -центами рибофлавина, инозина, тавддина. фенилаланина, триптофана и других веществ.

Для анализа кислых летучих соединений использованы сорбенты модифицированные фосфорной кислотой, в сочетании с элзоентами, содержащими муравьиную кислоту. Подобные системы применены для определения низших кислот и 2-кетокислот в ферментационных растворах бациллярных штаммов, а также микроорганизмов рода Clostridiuni и продуцентов"на основе E.coli.-

Для экспресс-анализа нелетучих веществ в работе широко использована высокоэффективная жидкостная хроматография. Для решения одной из наиболее актуальных задач - определения аминокислот, использовано разделение в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ и селективное УФ-детектарование 'их медных комплексов. Изучен механизм сорбции подобных комплексов и показано,, что он включает обращен-но-фазное удерживание, взаимодействие с остаточными силанольными группами твердого носителя и лигандообмен как в подвижной, так и в'неподвижной фазе. Оценены вклады функциональных групп в удерживание медных комплексов аминокислот и показано, что они меняются

в зависимости от структуры аминокислот и состава элюента. Предложен метод бесстандартной идентификации аминокислот, разделяемых и детектируемых в виде медных комплексов с использованием логарифмических индексов удерживания, причем в основу шкалы индексов по- . ложены характеристики удернмвания н-алкиламинокислот. На основании этого подхода разработаны методики определения аминокислот в ферментационных растворах ряда штаммов-продуцентов.

При разработке методов экспресс-анализа заряженных веществ. к которым относится большая часть целевых продуктов микробного биосинтеза предложено испорзовать "ион-конкурентную об-ращенно-фазнув хроматографию". Этот подход применяли и для сокращения времени анализа и для определения в образцах ферментационных растворов следовых количеств некоторых компонентов.

Практическую значимость работы подтверждает то, что в ходе ее выполнения разработан ряд оригинальных методик, многие из которых включены в лабораторные и опытно-промышленные регламенты на производство целого ряда низкомолэкулярных биологически активных веществ биотехнологичесими методами. Комплексное использование этих методик продемонстрировано на примере процессов биосинтеза незаменимых аминокислот - лейцина и валина -штаммаш Е.соН, а также витамина В2 бациллярными продуцентами. Использование различных вариантов хроматографии - газовой, нормально-фазной и обращенно-фазной шадкостной позволило не только повысить конверсию субстратов в целевые продукты, но и снизить накопление побочных веществ микроорганизмами.

Апробация работы: результаты работы представлялись и докладывались на Научных конференциях ГосНШгенетики, 3 и 5 Дунайских симпозиумах по хроматографии (Братислава, 1983 г., Ялта, 1985 г.). Всесоюзной конференции "Контроль и управление биотехнологическими процессами " (Горький, 1985 г.), 1У Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства пищевой промышленности медицины и научных исследований (Ереван. 1988). ХГ Международном Симпозиуме по капиллярной хроматографии (Контерей, США, 1990), VI Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва 1991), XII и XIII Международных Симпозиумах по использованию ВЭНчи капиллярного электрофореза в биомедицинских исследованиях (Верона, Италия, 1993 и Прага, Чехия, 1995). Всероссийской конференции "Биосинтез и деградация микробных полимеров"

(Пущюга, 1995). Международном Симпозиуме по Хроматографии (Иокогама. Япония, 1935). Годичной Сессия Научного Совета РАН по хроматографии (1895). VII Всероссийском Симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (1995). Международном Симпозиуме "Хроматография и спектроскопия в анализа объектов окружающей среды и токсикологии" ЦБСЗЕ'ЭЗ, Санкт-Петербург. 1996). - " ■

Публикации-Основное содержание работы изложено в 26 статьях и 19 тезисах докладов конференций. Разработанные аналитические методики включены в 13 технологических регламентов.

Структура я объем работы. Диссертация состоит из введения, результатов и их обсуждения (главы 1-3). экспериментальной части (глава -4). выводоз и списка литературы. Работа излозена на 193 страницах, содержи* 56 рисунков к 21 таблицу. Библиография включает 238 названий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введений развиты представления о задачах, реиаемых при разработке и практическом внедрении аналитического обеспечения биотехнологических процессов. Сформулированы основные требования к аналитическому методу: простота, быстрота, надежность, достоверность и. что'немаловажно, дешевизна. Показано, что одновременное выполнение этих требований возможно за счет разработки объектно-ориентированных аналитических методик, упрощения и сокращения стадии пробоподготовки и повышения селективности анализа на стали! разделения и детектирования. С этой точки зрения и рассмотрены имевшиеся в литературе данные. Показано, что проблемам аналитического обеспечения разработки и практи-- ческого внедрения новых биотехнологических процессов в литературе не уделялось должного внимания.

Глава 1 посвящена проблемам газо-хроыатографического анализа летучих полярных соединений в ферментационных растворах с прямым вводом водной пробы. Подобный анализ, особенно в случае . образцов с высоким содержанием нелетучих термолабильных компонентов. к которым относятся- ферментационные растворы, сопряжен с рядом трудностей. В связи с этим значительное внимание в работе уделено'разработке и исследованию свойств сорбентов нового типа, предназначенных для прямого ввода водных проб. Отличием

этих сорбентов от известных является содержание в них фторида калия. Эта соль обладает рядом уникальных свойств, в частности способностью к образовании, очень прочного кристаллогидрата с низкой температурой плавления. Показано, что безводный фторид калия является очень эффективным дезакткватсром поверхности твердого носителя при анализе полярных веществ, вводимых в виде паров к растворов в органических растворителях. По способности к межколекулярным взаимодействиям с сорбагаки он сопоставим с таким распространенным неорганическим модификатором как гидроокись калия, а также тринатрийфосфатом, пр;шенявнимся для-.модификация тзердых носителей при газо-хроматографическом анализе органических оснований. " В качестве неподвижной кидкой фазы с широким температурным диапазоном при этом использовали гидрированный. Агшез он Я (Ар1егоп Ш),

Полученные результаты свидетельствует, что сравниваеше соли практически не влияют на удерживание неподвижной фазой ароматических углеводородов (Табл.1).

Таблица 1.

Индексы удерживания, I, ароматических углеводородов на колонках с гидрированным апиезоном. содержащих эквимоляркые количества НОН, КГ и йаэР04 при 100° С

Ашезон Щ + Апиезон Ь

Соединение КОН . КГ На3Р04 *

Бензол 683

Толуол 798

р-Ксилол 900

м-Ксилол ' - 902

о-Нсилол 926

685 683 683

800 800 796

899 901 899

902 902 901

924 925 926

*(По МсР.еупоЫз)

Влияние неорганических модификаторов проявляется при использовании в качестве тест-веществ, например, органических оснований, способных к различным типам межмолекуляркых взаимодейс-

твий, включая донорно-акцептороное и образование водородных связей. Вклад фторида калия в удерживание органически оснований -доноров водорода и электронной пары - практически совпадает с вкладом едкого кали и существенно ниже, чем у тринатрийфосфата (Табл.2). ■ • ....

Это свойство позволило использовать колонку с-сорбентом, модифицированным фторидом калия в качестве колонки сравнения при изучении механизма взаимодействия третичных органических оснований с трикатрийфосфатом. В ходе этой работы было, в частности, показано, что фторид калия не способен к межмолэкулярным взаимодействиям с пиридинами - донорами электронной пары.

Сопоставление свойств фторида калия и тринатрийфосфата проводили и при использовании сорбентов, содержащих кристаллогидраты этих солей.

Таблица 2

Индексы удерживания,I. органических оснований на колонках с апиезоном ЬН, содержащих КОН, № и Иа3Р04 при 100°С.

Апиезон ЬН+

Соединение КОН KF Na3 PO,

Пиридин 750 748 786

Триэтиламин 683 686 714

М, N-Диметилгексилашн 895 896 915

Дипропилэтиламик 338 838 842

н. Гексиламин 841 840 884

N-Метклгексилавдн 884 882 924

Дипропиламин 750 749 789

Дибутиламин 949 948 978

Анилин • 970 . 968 1030

N-Метиланилин 1063 1061 1086

Для экспрёсс^анализа в водных растворах ' летучих веществ ' нейтрального и основного характера впервые предложен сорбент, в котором роль неподвижной фазы выполняет расплав кристаллогидрата фторида калия (Тал=42°С). Характерным свойством этого расп-

- и -

лава, как неподвижной фазы, является очень низкая способность к дисперсионному взаимодействию (ДЙ(СНг)= 440 Дж/моль при 100°С). Установлено,- что за счет уникально высокой энергии взаимодействия соли с кристаллизационной водой, сохранение характеристик колонок с подобным сорбентом может обеспечиваться за счет вода, вводимой вместе с пробой. При этом полярные соединения выходят в" размытой зоне' вода, не препятствующей их обнаружении при помощи пламенно-ионизационного детектора. При насыаешга газа-носителя водой при комнатной температуре становится возможным также . анализ полярных веществ, вводимых в виде паров (Рис.1). Поскольку не было ясно, возможно ли растворение летучих органи-" ческих веществ в подобной неподвижной фазе или разделение происходит за счет их сорбции на границе раздела газ-жидкость, были проведены опыты с модельными системами расплав кристаллогидрата фторида калия - бензол и расплав кристаллогидрата фторида калия - пиридин. Методом УФ спектрофотометрии было показано, что при этом действительно возможно растворение летучих органических веществ в расплаве кристаллогидрата соли.

Оценка возможности использования расплава кристаллогидрата тринатрийфосфата, НазР04*12Н20, (Тпл. =72°С) показала, что, как неподвижная фаза, он также обладает пониженной способностью к дисперсионным взаимодействиям (Ав(СН2-)= 380 Дж/моль при 80°С). В то же время этот кристаллогидрат легко дегидратируется. Де- . гидрагатция кристаллогидрата и сопровождающая ее смена механизма разделения с газо-жидкостного на газо-адсорбционный приводит к увеличению удерживания и размыванию хроматографкческих зон. Вследствие этого, расплав кристаллогидрата тринатрийфосфата менее удобен для использования в качестве неподвижной фазы и в работе ему уделяли меньшее внимание.

Для сопоставления предложенной неподвижной фазы - расплава кристаллогвдрата фторида калия с органическими неподвижными фазами были определены константы тест-вещест Мак-Рейнольдса. Проведенные наш поиск по компьютерной базе данных содержащей константы Мак-Рейнольдса для 230 органических неподвижных фаз, пористых полимерных сорбентов и расплавов органических солей показал, что кристаллогидрат фторида калия не имеет аналогов. В шкале Рошнайдера Мак-Рейнольдса для него характерна небольшая способность к большинству видов взаимодействий, за исключением.

ЗшлиГк

Рис.1 Газо-хроматографяческий анализ стандартных "смесей с использованием расплава кристаллогидрата фтористого калия как неподвижной фазы. -

Стальная колонка 1м*3мм, 10% КГ*2Н20 на Хромосорбе И АИ, 60-80 меш. температура колонки"80°С. Проба - 10 мкл водного раствора, а - разделение смеси н.спиртов.

Пики: 1 - метанол, 2- - этанол, з - пропанол. 4 - бутанол. • б- Разделение снеси органических оснований. Пики: 1 - этиламин. 2 - пиридин, 3 - 2-амино-2-метилпропа-нол-1, 4 - 3,5-диыегилпиридин.

образования водородных связей.

Способность.кристаллогидрата фторида калия к. иеимолекулярным взаимодействиям была дополнительно оценена в иестипараметрической термодинамической шкале, разработанной совместно с проф.Р.В. Головней. При этом было показано, что для расплава кристаллогидрата фторида калия характерны очень низкая способность прежде всего к дисперсионным взаимодействиям. Энергетический вклад на метилено-вое звенов молекуле н-алкана, составил 440 кДяс/моль, что в 4-5 раз ниае. чем у известных на сегодняшний день органических неподвижных фаз. Сопоставимая способность к дисперсионным взаимодействиям отмечена у некоторых расплавов солей, содержащих органический катион и неорганический анион (С. Poole et al.. 1988).

Низкая способность к меясмолекулярным взаимодействиям обуславливает малое удерживание полярных сорбатов на этой неподвижной фазе и позволяет проводить анализ за короткое время и при срав- -нительно низких температурах. Дополнительным преимуществом кристаллогидрата фторида калия по сравнению с органическими неподвижными фазами является отсутствие фонового тока при использовании пламенно-ионизационного детектора, что позволяет повысить чувствительность анализа при определение следовых количеств органических веществ в водных растворах. Очень высокой оказалась и эффективность наполненных колонок с этой неподвижной фазой - ЧТТ до 4000/м по" н-бутанолу. Колонки с сорбентом, содержащим в качестве неподвижной фазы кристаллогидрат фторида калия -мы использовали при изучении потребления метанола метилотрофны-ми микроорганизмами, накопления индола Е.coli и для решения других аналитических задач.

Однако наряду с несомненными достоинствами выявились и определенные недостатки этих колонок, прежде всего низкая сорбци-онная емкость. Следствием этого была необходимость поддерживать достаточно низкие концентрации анализируемых компонентов (не более 0.1 г/л по метанолу) в образцах для получения достоверных количественных результатов. Недостатками расплава кристаллогидрата фторида' калия, как неподвижной фазы,, следует считать также способность- к' дегидратации при использовании сухого газа-носителя, хотя и меньшую.чем у большинства используемых в хроматогра-фической практике кристаллогидратов.солей, а таете ограниченный температурный интервал (60-100°С), обусловленный как обезвожива-

нием, так и уносом кристаллогидрата соли. В связи с этим возникла задача получения сорбентов, сочетающий достоинства кристаллогидрата фторида калия - возможность прямого ввода проб и их анализа в мягких условиях - и традиционных неподвижных фаз - большая с'орбционная емкость, селективность к разнообразие типов. Сочетание этих требований было наш достигнуто при использовании сорбентов. содержащих одновременно как органическую неподвижную фазу, так и кристаллогидрат фторида калия. При этом, в зависимости от типа органической неподвижной фазы, возможно как совместное" нанесение соли и органической фазы из-водно-спиртового раствора, так и последовательное их нанесение: соль из водного раствора, органическая фаза - из органического растворителя.

Проведенные эксперименты показали, что полученные таким образом сорбенты пригодны для анализа полярных веществ в водных растворах с прямым вводом пробы. Дане при использовании в качестве неподвижной фазы эталонно-неполярного углеводорода сква-лана, например, спирты элшрувтся симметричными пиками (Рис. 2а). При этом наблидается интересная закономерность - при снижении температуры колонки ниже точки плавления кристаллогидрата фторида калия эффективность колонки резко падает и зоны спиртов размываются, хотя и остаются симметричными (Рис.26).

О важной ролн кристаллогидрата фторида в разделение на подобных сорбентах свидетельствуют результаты, полученные с использованием сорбента, содержащего наряду со скваланом легко обезвоживающийся "кристаллогидрат тринатрий$осфата. В отличии от кристаллогидратат фторида калия сорбент, содержащий кристаллогидрат тринатрийфосфата' обезвоживается уже в процессе нанесения неподвижной фазы. Восстановить кристаллогидрат возможно, введя в колонку 1000-1500 мкл воды при низкой температуре (40-60°С).. Однако обезвоживание кристаллогидрата, по-видгаюму. происходит- и при температурах колонки ниже его температуры плавления. Об этом свидетельствует необратимая сорбция н-спиртов вводимых в виде паров. При введения спиртов в виде водного раствора количество злю-ируадихся компонентов на колонке, содержащей расплав кристалле-' гидрата тринатрийфосфата и сквалан, зависит как и в случае сорбентов, содержащих- кристаллогидрат фторида калия в качестве единственной ' неподвижной фазы, и сухого газа-носителя, от объема пробы. При пробе в 1 мкл элшрувтся 2, при пробе в 5 мкл - 3 и.

Рис.2 Разделение смеси спиртов. Стальная колонка.2м*4мм. .10% Сква-лана и 5% КР*2Н20 на Хромосорбе V/ А». 100-120 меш Температура колонки 50°С (а) и 40°С (б). Проба - 10 мкл водного раствора. Пики: 1 - метанол, 2 - этанол, 3 - изо-пропанол, 4 - терт-бутанол , 5 -н-пропанол, 6 - 2-бутанол. 7 - изо-бутанол, 8 - н-бутанол

наконец, при пробе в 10 мкл - 4 члена гомологического ряда н-спиртов (Рис.3)."Таким образом, именно расплав кристаллогидрата фторида калия обеспечивает уникальную способность содержащих его

__1_._2_3_4_5 • «_7_8_9 ыт

Рис.3 Разделение смеси н.спиртов. Стальная колонка 1м*4мм, 10% Ыа3Р04*12Н20 и 5% сквалаяа на Хромосорбе И кИ, 100-120 меш. температура колонки 60°С. Проба - 1 (а). 5 (б) и 10 (в) мкл водного раствора. Пики: 1 - метанрл, 2г~, этанол, .3 - пропанол.. 4 - бутанол.

сорбентов к разделению полярных веществ, вводимых в виде водных растворов, при низких температурах.

Поскольку для сквалана характерны легкость окисления и ограниченный температурный интервал, наряду с ним в работе изучали и другие органические неподвижные фазы различной полярности, более удобные с практической точки зрения: При этом полярнйе вещества различных классов - спирты, ароматические и алифатические амины, серусодержащие соединения - также элвдровались симметричными зонами при сравнительно низких температурах (Рис.4,5). При использовании подобных бинарных неподвижных фаз исчезала необходимость в добавлении водяного пара в газ-носитель. С нашей точки зрения подобное поведение- полярных- сорб'атов также связано с возможной ролью кристаллогидрата фторида калия в сорбентах. Наряду с низкой температуройплавления важной характеристикой его расплава является высокая плотность (около 2,3 г/см при 45еС). Это существенно

Рис.4 Разделение смеси метилпиридинов . Стальная колонка 0,3м*3.чм. 5% Тритона Х-305 и 5% КР*2Нг0 на Инертоне Я АИ, 0.1 - 125 мм. температура колони: 80°С. Проба - 1 мкл водного раствора. Пики: 1 - пиридин. 2 - 2-метилпиридин,■3 - 4-метиллиридин, 5 -2,6-диметилпиридин. 6 - 3,5-диметилпирщш. 7 - 3,4-диметилпирвдин.

<31

I ^ £ з 3 I I £

Рис.5 Разделение бифункциональных соединений. Стальная колонка 3м*3мм. 5% Тритона 1-305 и 5™ КР*2Иг О на Хромосорбе V/ А»., 100-120 меш. температура колонки 90°С. Проба - 1 мкл водного раствора. Пики: 1 - З-гидрокси-2-бутанон (ацетоин), 2 - 1-амино~2-лропанол, 3-2-меркаптоэтанол, 4 - 1.5-пентаметилендиамин (путресцин). 5 - 1.3-бутандиол

больше, чем для большинства органических неподвижных фаз, в связи с чем. расплавленный кристаллогидрат, по-видимому, растекается пленкой по поверхности твердого носителя. Поверх этой пленки в свою очередь может образовываться'пленка органической жидкости. ■При этом, с одной стороны, кристаллогидрат фторида калия фактически изолирует полярные сорбаты от поверхности утвчердого . носителя. взаимодействие с которым может вносить очень существенный вклад в их удерживание и размывание хроматографических зон (Рис.6). С другой стороны, слой органической жидкости, вероятно

Газ-носитель

к стл

Неподвижная фаза Расплав кристаллогидрате фторида калия

Твердый носитель

*» » * . • /-О Пшврний Сорвет

! Нелотркы* еор»»7 \

Рис. 6.Предполагаемая роль расплава кристаллогидрата фторида калия в унификации поверхности твердого носителя при его совместном использовании с органическими неподвижными фазами.

препятствует уносу кристаллизационной воды и самой соли, что позволяет эксплуатировать колонки в более широком диапазоне температур - 40-160°С. '

Еклад же самого кристаллогидрата фторида калия в газо-хро-матографическое удерживание, как мы отметили выше, сравнительно невелик, о чем свидетельствует сопоставление констант Мак-Рейнольдса йля предложенных сорбентов с соответствующими данными для. органических неподвижных фаз (Табл.3).

таблица 3

Влияние обработки кристаллогидратом фторида калия на полярность сорбентов, оцененную в шкале Мак-Рейнольдса (13

Стационарная Бензол Бутанол-1 2-пентанон 1-нитро Пиридин фаза пропан

Ц (0) (1.55) (2.72) (3.7) (2.26)

КГ*2Нг0 16 418 270 186 184

НПГА. - . 259(232) 494(421) ,356.(311) 472(461) 437(424)

Сквалан 656(653) 622(590) 653(627) 698(652) 717(699)

Тритон Х-305 262(262) 474(467) 301(314) 538(488) 437(430)

ПЭГ-2ОН_410(368) 312(322) 525(536) 507(510) 598(572)

В скобках приведены данные таблиц Мак-Рейнольдса для соответствующих неподатных фаз

Подтверждением этого служит также сравнение свойств самого кристаллогидрата фторида калия и содержащих его бинарных неподвижных' фаз с свойствами традиционных неподвижных фаз, пористых полимерных сорбентов и расплавов органических солей в уже упоминавшейся шестипараметрической термодинамической шкале (I*. \f.GolDvnya, В.М.Ро1апиег, 1990). В этой шкале в соответствии с общепринятыми представлениями по бензолу тестируют способность сорбента к дисперсионному и слабому протоноакцеп-торному, по н-бутанолу - к ориентационнному с протонодонорными и протоноакцептсрными вкладами, по 2-пентанону - к ориентаци-онному и протонсакцепторному без протонодорнорного вклада, по нитропропану - к сильному ориентационному и слабому протоноак-цепторному (р=3,6Д). по пиридину - к слабому ориентационному и сильному протоноакцепторному. Хотя в последние годы шкала Рош-найдера - Мак-Рейнольдса и была обьектом активной критики, она пс-презшему остается общепринятой. В предложенном варианте этой шкалы мерой взаимодействия служат не сами индексы удерживания, а их энергетические эквиваленты, оцененные с учетом различия в способности неподвижных фаз к взаимодействию с метиленовым звеном в молекуле н-алкана. Дополнительным шестым параметром является энергетический - вклад на метиленовой звено в молекуле н-ал-кана. АЙ(СН2). оценивающий способность сорбента.к дисперсионному взаимодействию.

Оценка предложенных нами сорбентов в этой шкале (Табл.4) подтвердила уникально низкую способность кристаллогидрата фторида калия к основным типам взаимодействий в' условиях' газовой хроматографии. Вероятно, вследствии этого способность исследованных нами комбинированных неподвижных фаз к. межмолекулярным взаимодействиям, оцененная' в этой шкале определяется, главным образом, их органическим компонентом.

Таблица 4

Оценка полярности КР*2Н20 и некоторых неподвижных фаз по величинам энергетических эквивалентов индексов удерживания

Сорбент -¿С(СНг) -ДС(I). Дж/моль

Дж/моль Бензол Пента Бутанол 1-нитро Пири

н0нг2 пропан дин

КР*2Нг0 440 2944 3947 4435 3687 3855

1еподвижные фазы

Апиезон Л 2124 ' 14191' 13001 13698' 15741 15501

Сквалан 2179 14227 12855 13661 14206 15230

БЕ-ЗО 1811 13517 13215 11942 14489 14975

Диоктилфталат 2103 15607 16319 16340 18675 18212

ОУ-17 1922 14838 14377 15165 17202 17317

Тритон Х-305 1810 16562 19133 17032 20634 12043

Силар ЮС 1546 18136 20826 19883 24645 23176

ОГ-1 1597 15178 13275 15840 18243 16195

рей-гои 1684 14423 18966 , 16760 20617 .20364

ДЕГА 1588 16372 18945 17262 20914 21549

Зрганические соли

Тетрабутиламмошш,

хлорид 1588 16245 '28394 16849 22566 •21136

ди-н.Пропиламмойяя

тиоцианат 1538 17774 22209 18917 22363 21347

- 21 -

Полимерные сорбенты

Хромосорб 101 1853 15347. 13287 14420 13390 17510

Хромосорб 102 1605 14970 13127 14613 11745 16236

Хромосорб' 104 1988 14170 11030 15358 15867 17394

Смешанные фазы

Сквалан/КР*2Н20 2270 14890 14120 14820 15840 16280

АпиезонЬ/КР*2Н20 2160 14690 ' 13980 14730 16010 15980

Тритон X-305/KF*2H20 1850 16950 19720 17200 22980 21050

n3r-20M/KF *2Н2 0 1 1710 18180 15420 19700 19820 22180

НПГА/КР*2Нг0 1650 15080 17920 16250 18580 18780

В то же время нельзя исключить, что соль или ее кристаллогидрата распределены в объеме органической неподвижной фазы, особенно в случае таких неподвижных фаз как Тритон Х-305, ПЭК Подтверждением этому служат проведенные нами опыты, показавшие частичный переход ионов калия в слой Тритона Х-305. Возможно также формирование структурированного слоя неподвижной фазы на поверхности расплава'кристаллогидрата, "растворение соли или ее" кристаллогидрата в органической неподвижной фазе может быть причиной ряда дополнитенльых эффектов - с одной стороны взаимодействий полярных сорбатов с солью, • с другой стороны - их "высаливания" из объема неподвижной жидкой фазы. Формирование структурированного слоя может объяснить наблюдаемый нами эффект - резкое снижение эффективности сорбента содержащего кристаллогидрат фторида калия и сквалан при температуре колонки ниже точки плавления кристаллогидрата.

Наполненные колонки с кристаллогидратом фторида калия и органическими неподвижными фазами мы активно используем на протяжении последних 10 лет для разработки целого ряда аналитических методик, связанных с определением летучих • полярных веществ нейтрального и основного характера в водных образцах, прежде всего в ферментационных растворах. С их помощью, в частности, решали задачи, связанные с изучением потребления метанола мети-лотрофными бактериями и дрожжами, накопления продуктов брожения различными штаммами микроорганизмов рода Clostridium, как при

выборе продуцентов, так и при установлении их видовой принадлежности (Рис.7а). образования 2.3-бутандиола. ацетоина (2-гидрок-ся-бутандиона-3) й диацетила (2,3-бутандиона) при ферментации различных бациллярных продуцентов (Рис.76), накопления ацетомо-лочной кислоты штаммами Е. coli - продуцентами, валяна и лейцина.

Рис.7. Хроматограммы ферментационных растворов микроорганизмов род Clostridium - продуцентов органических растворителей (А) и В. subtlll; - продуцента рибофлавина.

Стальная колонка 3м*3мм,'5% Тритона Х-305 и 5% KF*2HZ0 на Хромосорбе AW, 100- 120 меи. температура колонки 60°С (а) и 130°С (б). Проба -мкл ферментационного раствора.

Пики: А) - 1 - айетон. 2 - этанол, 3 - изо-пропанол, 4 - н. 5ута-н'ол. Б) - 1 - 2.3-бутандион (даацетил). 2 - 2-гидрокси-З-бутанон (ацетоин). 3 - 2,3-бутандиол

В .качестве примера использования подобных колонок можно текже привести определение остаточных органических растворителей в кристаллических препаратах искуственного подсластителя -аспартама и незаменимой аминокислота - треонина. В первом случае объектом анализа был метанол, во втором - этанол. Обычно извлечение следовых количеств летучих полярных веществ из кристаллической матрицы, с которой они связаны прежде всего водородными связями представляет очень слоннув задачу, а прямой ввод термолабильных нелетучих веществ в газо-хроматографи-ческу колонку для термодесорбции летучих компонентов приводит к быстрой порче колонки. Используя' сорбент, содержащий кристаллогидрат фторида калия и сквалан мы снизили температуру испарителя и колонки до 60 и 30° С, соответственно, и вводили образцы. представляющие собой 10% растворы соответствующих препаратов в воде. Вода при этом способствовала разрушению водородных связей спиртов с органической, матрицей, что и делало возможным анализ в столь мягких условиях. Предложенный подход позволил определять остаточные органические растворители в концентрациях до 10"5 г/г кристаллического препарата. Указанный подход носит универсальный характер и монет быть применен для_ анализа широкого спектра биотехнологаческих. и фармацерти-. ческих препаратов, получение которых включает стадий перекристаллизации из- органических растворителей или синтез в этих растворителях.

Значительный интерес в качестве объекта анализа представляли низшие карбоновне кислоты - уксусная, пропионовая, изо-масляная и масляная, накопление которых приводит к ингиди-рованию роста и процессов биосинтеза у большинства промышленных штаммов, а также кето-кислоты - предшественники соответствующих аминокислот, прежде всего пировиноградная. 2-кетоизовалериано-вая и 2-кетоизокапроновая. Для анализа кислых веществ в работе использовали сорбенты.с полизтиленгликолем ПЭГ-40М или полиэти-ленгликолем. терминированным 2-нитротерефталевой кислотой ОТАР) на диатомите, обработанном ортофосфорной кислотой. По-видимому, жидкая фосфорная кислота с ее "высокой плотностью и термической стабильностью при анализе кислых веществ выполняет ту же роль, что кристаллогидрат фторида калия при. анализе основных. Для улучшения разделения газ-носитель насыщали при ком-

натной температуре парами воды или муравьиной кислоты. Оба этих вещества не детектируются пламенно-ионизационным детектором, а их добавка позволила существенно снизить удерживание малолетучих 2-кетокислот (Рис.8) и обеспечить их элюцию симметричными.

Рис. 8. Обнаружение 2-кетокислот в ферментационных растворах штаммоЕ Е. coli - продуцентов незаменимых аминокислот валина и лейцина. Стеклянная колонка Зм*4мм. 5%ПЭГ-40М и 3% Н3Р04 на Хромосорбе WAW, 100- 120 меш. температура колонки 1706 С. Проба - 1 ыкл ферментационного раствора. Газ-носитель - азот, насыщенный парами муравьиной кислоть при комнатной температуре.

Пики - 1 - уксусная кислота, 2 - ацетоин, з - пировиноградна$ кислота, 4 - 2-кетоизовалериановая кислота, 5 - 2 - кетоизокапроноваз кислота

хроматографичесшш зонами. " Использование экспресс-анализа 2-кетокислот при изучении биосинтеза незаменимых аминокислот -валина и лейцина - рассмотрено в гл.4. В целом пара наполненных колонок - "основная" (Тритон

т о

в сч

•з 1С

Tt

Х-305/КГ*2Н20) и "кислая" (ПЭГ-40М/Н3Р04) - обеспечивала решение большинства задач, связанных с определением летучих' веществ в' ферментационных растворах. Нелетучие соединения при этом сорбировались необратимо. Дополнительная селективность достигалась за счет того, что "кислая" колонка необратимо сорбировала основные, а "основная" - кислые летучие компоненты образцов, соответственно. Сочетание "кислой" колонки с "основной" предколонкой в варианте "вычитающий" хроматографии позволяло определять в образцах только нейтральные летучие соединения. Периодическая замена верхней части сорбента .или использование предколцнок- обеспечивали достаточно долгую жизнь основных колонок. Сорбенты готовили непосредственно в лаборатории в количестве, достаточном для зполнения 5-10 колонок. Проведенные расчеты показали, что стоимость сорбента для заполнения одной колонки не превышает 7 долларов США. Хроматографические характеристики сорбентов не изменялись при их хранении в течение 5 лет.

Глава 2 посвящена проблемам, связанным с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии для экспресс-анализа низкомолекулярных веществ в ферментационных растворах. В отличии от газовой хроматографии в ВЗЖХ могут аналилзироваться летучие, так и нелетучие соединения, .что предъявляет повышенные требования к селективности разделения. и детектирования. Объектами анализа в ходы выполнения работы были основные классы низкомолекулярных природных веществ - аминокислоты, сахара, нуклеозиды, витамины и т.д. Каждый из этих классов веществ требовал подбора селективных условий разделения и детектирования. Поскольку автору не хотелось бы превращать автореферат в сборник аналитических методик, оста--новимся на некоторых основных направлениях разработки этих методик.

Учитывая, что аминокислоты являются одним из наиболее важных объектов промышленной биотехнологии как в количественном, так и в стоимостном выражении на них обращено особое внимание. Анализ аминокислот является, по-видимому, одной из самых распространенных задач хроматографии. Он играет огромную роль в изучении состава белков, а также исследовании различных нарушений метаболизма и связанных с ниЙ^ заболеваний. Одной из первых работ, в этом направлении следует считать выполненные в начале 50-х годов исследования Штейна и Мура, приведшие к созданию аминокислотного анали-

затора - прибора использующего ионнообменное разделение аминокислот с последующим детектированием продуктов их реакции с нингид-рином. За последующие 40' лет основные изменения в этом методе не носили принципиального характера и были связаны, главным образом, с сокращением времени анализа за счет уменьшения размера частиц сорбента и увеличения скорости подвижной фазы,4"--.автоматизацией и стандартизацией метода.

Основными недостатками метода ионнообменного разделения являются длительное время анализа и последующей регенерации аналити- -ческой колонки (как правило 40-60 мин), а также..малая чувствительность. Кроме того для проведения постколоночной реакции необходимо специальное оборудование, что усложняет и удорожает прибор. Сокращение времени хроматографического разделения, удешевление ' оборудования и резкое увеличение чувствительности ( до фемто-молей) возможно при использовании, газо-хроматографического анализа летучих производных аминокислот.. К сожалению, пробоподготовка аминокислот для газо-хроматографического анализа - многостадийный и трудоемкий процесс, и общая продолжительность анализа еще выше, чем в случае аминокислотного анализатора.

В связи с.этим в последние два десятилетия проделана огромная экспериментальная работа, направленная на создание'методов анализа аминокислот без использования специализированных аминокислотных анализаторов. Сокращение времени ВЭЖХ анализа аминокислот достигается за счет использования различных вариантов распределе-тельной хроматографии. Разделение неполярных аминокислот (вапина, лейцина, триптофана, фенилаланина к т. д.) с детектированием по поглощению при 214 нм возможно без их предварительной дериватиза-ции, возможен также ВЭЖХ анализ ароматических аминокислот их предшественников и продуктов превращения с'УФ детектированием при 260-280 нм. Однако в ВЭЖХ , аминокислоты обычно предварительно превращают в производные. ■ характеризующиеся большим удерживаниям в колонке и содержащие флуоресцирующие или поглощающие в ультрафиолетовой области спектра группы.

Следует отметить, что используемые на сегодняшний день методы • анализа аминокислот разрабатывали либо для определения состава белков, либо длй определения аминокислот в биомедицинских образцах и не учитывают специфики определения аминокислот в ферментационных растворах микроорганизмов-продуцентов.

Для решения задач анализа аминокислот в ферментационных растворах нами была использована способность аминокислот образовывать комплексы с двухвалентной медью, интенсивно поглощающие в ультрафиолетовой области спектра. Ряд работ по тгатообиекному разделе- . нию аминокислот с использованием элюентов содержащих ионы меди выполнен Даванковым с соавторами. Образование медных комплексов аминокислот и их разделение в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ было изучено в работах Grushki et al. Однако возможность практического . применения подобных комплексов для определения отдельных аминокис- . лот практически не изучали.

Нами разделение-и Детектирование медных комплексов аминокислот интенсивно использовалось в течении последних 8 лет для их количественного определения в ферментационных растворах промышленных микроорганизмов. Ери этом значительное внимание было уделено выбору оптимальных условий разделения для различных образцов за счет варьирования основных хроматографических параметров - содержания органического модификатора в неподвижной фазе, характера ион-парного реагента, температуры колонки. Существенное увеличение содержания ионов меди в элюенте снижает его прозрачность в ультрафиолетовом диапазоне и затрудняет работу детектора, а 'предпринятые нами попытки использтэвать вместо'немодифицированного силикагеля или сбращенно-фазного сорбента аминофазу (т.е. увеличить лигандообменную составляющую разделения) привели к уширению хроматографических зон и снижению селективности разделения.

Полученные нами данные свидетельствуют, что добавка органического растворителя к э'люенту приводит к изменении удерживания медных комплексов аминокислот (Табл.5).

Схожие зависимости были получены и при исследовании влияния другого широко распространенного в ВЭЖХ-органического модификатора - метанола на удерживание медных комплексов аминокислот; Полученные результаты показали, что в случае медных комплексов аминокислот не соблюдается известное в обращенно-фазной хроматографии эмпирическое "правило трех" - при увеличении концентрации органического модификатора- на 10% удерживание сорбатов "уменьшается не втрое. При исследовании влияния концентрации метанола и ацетонйтрила в элюенте на удерживания' медных комплексов алифатических аминокислот, было установлено, что соответс-

Таблица 5

Факторы емкости (к') аминокислот при различных концентрациях ацетонитрила в элюенте.

Аминокислота 0 10 20 30 40

Gly 3.30 2. 34 1.69 1.84 2.51

Ala 3.90 2. 49 2.44 1.88 2.53

AABA - 6.32 3. 05 2.09 2.24 • 2.79

n-Val 10.19 " 4. 07 2.77 2.72 3.18

n-Leu 23.23 7. 19 4.83 4.26 4.09

Ser 2.86 2. 04 1.59 1.61 2.17

Val 11.06 3. 79 2.62 2.70 3.12

Ile 20.46 5. 65 3.89 3. 74 3.66

Lys _ 10. 28 "7.75 6.54 8.05

Phe _ И. 70 8.66 7.17 4.47

Ihr 3.31 2. 26 1.77 1.86 2.21

Pro 6. 83 3. Ol 2.18 2.42 2.46

Met 12.66 4. 63 3.21 3.17 3.29

Clt 5.34 2. 71 1.93 1.99 2.48

Hiá 10.02 ' "4. 63 * • 2.69" "3.77 ••

Leu 17.67 7. 14 4.61 4 3.96

Arg _ 12. 59 8.97 Э. 59 8.99

Glu- 2.20 1. 38 1.15 1.41 1.68

Gin . 5.52 4. 63 4.12 3.26 4. 14

Asp 2.77 1, 14 1.05 1.90 2.29

Asn 6. 69 4.' 94 4.49 4.62 4. 83

Туг 4. 81 2. 54 ' 2.37 2.14 2.59

твующие' зависимости во многоих случаях имеют. U-образную форму (Рис.9).Аналогичные U-образные зависимости удерживания органических оснований от концентрации органического компонента в подвижной фазе отмечены ранее при разделении соединений основного характера - тиамина, кофеина й- морфина - в условиях "псёвдо-обра-щеннофазной хроматографии" на немодифицированном силикагеле с водно-метанольными элоентами. (G.В.Сох and R.W.Stout 1987) и в условиях ион-парной хроматографии (H.'Llngeman et al. 1986). По-

добные зависимости по мнению авторов этих работ обусловлены смешанным мехг-"измом сорбции, включающим вклады гидрофобных и ионно-обменных взаимодействий в удерживание, к'

метанол. "

Рис. 9. Зависимость удерживания медных комплексов аминокислот от содержания органического модификатора .(метанола) в элюеяте.

Таким образом. гУ-образная зависимость удерживания сорбата от концентрации органического компонента в подвижной фазе считается доказательством сложного механизма удерживания сорбата. включающего взаимодействия, по крайней мере, двух типов. В исследованном наш разделении медных комплексов аминокислот также возможна реализация по крайней мере двух механизмов - обращен-но-фазного взаимодействия медных комплексов аминокислот с гидрофобным октадецильныы слоем и лигандо-обменного взаимодействия аминокислот с сорбированными на поверхности силикагеля ионами меди (Рис.10). С увеличением концентрации органического модификатора в элюенге вклад гидрофобных взаимодействий уменьшается, что -приводит к снижению удерживания медных комплексов аминокислот. Одновременно снижается и растворимость в элюенте ионов меди (II), что. в частности, проявляется в смене цве'та сорбента в используемых в работе стеклянных колонках. Следствием этого является. увеличение вклада лигаядообменных взаимодействий на поверхности твердого носителя и увеличение удерживания аминокис-

дот. Сочетание вкладов двух механизмов и обуславливает наличие

АА - аминокислоты

СиАА

SiOH _Л

Cu(Il)

Cu(ll)

CuAA

Cu(II) CuAA

CuAA Cu(II)

CUAA

SiOCuSiQHt _J_ft_

Cu(II) Cu(AA)

CuAA

Cu(Il)

Cu(AA)

SiOCu J_

Твердый носитель

Рис.Ю.Предполагаемый механизм лигандообменного разделения медных комплексов аминокислот на обращенно-фазном сорбенте.

'"точки перегиба." Для'различных аминокислот баланс между этими двумя механизмами различается и перегиб возможен как при 20 так и при 40% ацетонитрила в элюенте (Рис.9).

На основании изучения зависимости удерживания медных, комплексов аминокислот от содержания органического модификатора в . элюенте становится возможным выбор оптимальных-условий разделения.

Предсказание удерживания возможно, такке и на основании рассчитанных нами вкладов отдельных функциональных групп и метиленовых звеньев. . .

Полученные наш данные свидетельствуют о нелинейности вкладов метиленовых групп в удерживание даже в случае медных комл-пексов н-алкиламинокислот. Эти результаты хорошо коррелируют с развитыми Р. Головней с соавт.. представлениями о нелинейности вкладов метальных звеньев в удерживание низших членов' гомологических рядов полярных сорбатов в условиях газо-кидкостной хроматографии. .Что касается других функциональных групп, то можно отметить резкое увеличение удерживания в случае основных амино-

нслот. не коррелирующее с их высокой гидрофильностыо. Дополни-ельный вклад в сорбцию их медных комплексов может быть объяс-ен наличием агорой'основной группы. Удерживание кислых амино-ислот существенно ниже и хорошо коррелирует с их гидрофиль-[остью. Закономерности удерживания неполярных аминокислот сов-¡адают с наблюдавшийся ранее при их разделении в режиме обра-;енно-фазной хроматографии.

Наблюдается монотонное возрастание удерживания медных комплексе н-алкиламинокислот с ростом длины углеводородной цепи (Рис.11). Это позволяет использовать н-алкиламшокислоты.для создания шкалы логарифмических индексов удерживания (индексов Кована) и, следовательно, для бесстандартной идентификации аминокислот, разделяемых и детектируемых в виде медных комплексов. В качестве маркеров при этом мы использовали глицин, аланин, аминомасля-ную кислоту, норвалин и норлейцнн. Логарифмические индексы удерживания ряда аминокислот при различном, содержании ацетонитрила в элюенте приведены в табл.6.

Следует отметить, что для аминокислот с алкильным радикалом - валина, лейцина, изолейцина, а также неполярных аминокислот - .

г з.4

Я ацетонитрила'

5

номер гомолога

о

Рис. 11. Зависимость логарифма удерживания н-алкиламинокислот от порядкового номера гомолога при различных концентрациях органического модификатора - ацетонитрила - в элюенте

фенилаланина и триптофана - индексы удерживания мало зависят от содержания ацетонитрила в элвенте. Для полярных аминокислот индксы удерживания, как и вклады функциональных групп резко варьируются при смене состава элюента, что обусловлено, по-видимому, сложным механизмом собрции аминокислот в исследуемых, условиях. Это также открывает дополнительные возможности для их идентификации в биотехнологических образцах. , . - Таблица 6 .

• Индексы удерживания медных комплексов белковых' аминокислот в шкале• : н-алкиламинокислот при различных концентрация ацетонитрила в элюент

Аминокислота 0X 10% 20% 30% 40%

I I I I I

Gly 100 100 100 10D 100

Ala 200 200 200 200 200

ААЗА 300 300 300 ЗОО 300

n-Val 400 400 400 • 400 400

n-Leu 500 500 500 500 500

Ser....... 65. .83 115 ,. 81 - -106

Val 488 487 490 498 492

Ile ' 583 558 561 - 571 556

Lys 487 723 839 1059 656

Phe 510 762 875 756 815'

Thr 129 143 200 192 117

Pro 314- 295 305- 340 204

Met 494 473 472 477 466

His 382 445 388 568

Leu 563 599 592 586 587

Arg 517 639 723 766 814

Glu -49 :—146 -141 -20 -52

Gin 272 506 634 514 703

Asp 51 .-259 -213 . 208 139

Asn 310 467 591 673 719

T.yr ' 243 210 350 274 224

Возможность использовать логарифмические индексы аминокислот

щественно облегчает их идентификацию при анализе ферментацион-jx растворор и позволяет использовать данные, полученные на од-1й обращенно-фазной колонке при переходе на другую. Подтверждены этому служат факторы емкости (к') и логарифмические индексы ¡ерживанйя (I)' медных комплексов аминокислот для двух разных ко-ihok с Сепароном С18 и колонки с Llchrosorb С8 (Табл. 7). Разуме-■ся при количественном анализе реальных образцов следующими эта-ш после бесстандартной идентификации по индексу удерживания бы-| количественное определение с использованием внешнего стандарта.

Таблица 7.

Сравнение индексов удерживания медных комплексов некоторых инокислот на трех различных колонках (элюент - 0.001 М CuS04 в % ацетонитриле)

инокислота Колонка

Сепарон С18 Llchrosorb С8 Сепарон

п 591 588 594

г 115 119 ИЗ

1 490 493 488

ё 561 560 '557

s 839 836 854

э 875 880 878

г 200 207 203

э 305 301 308

1 -141 -133 -142

t 472 : 465 469

Было проведено изучение влияния температуры на удерживание иных комплексов аминокислот в условиях обращенно-фазной хрома-графии. При этом было обнаружено, что с ростом температуры коней от 20 до 45°С наблюдается незначительное снижение удержива-1 разделяемых-веществ. • В то же время, при "этом заметно снижалось зравлическое сопротивление колонки, что позволяет рекомендовать змостатирование колонки, для увеличения продолжительности зке-[Гатавди хроматографического оборудования. Хроматографичбское разделение и детектирование аминокислот з 1е медных комплексов автором широко использовалось начиная с ¡7 г. для экспресс-анализа ферментационных растворов штам-

мов-продуцентов глутаминовой кислоты, глутамина, фенилаланинг гистидана, ' триптофана, серина, треонина, пролила и т.д. Во бс случая изученные нами закономерности сорбции позволяли разрабат! вать методики, обеспечивающие разделение в изократическом ■ режш за 5-15 мин. Пробоподготовка. как правило, сводилась к разведен] образца и удалению биомассы центрифугированием. За счет, упрощен пробоподготовки ошибка анализа не превышала 5%. В случае появлен в образце неизвестных пиков их аминокислотная природа может бы подвержена за счет детектирования при двух •1длинах волн.' 230 и Z нм. Расчет- индекса удерживания позволяет в этом случае провода бесстандартну» идентификацию аминокислот, которая затем подтвер далась хроматографированием соответствующих стандартов. . Удешевл ние анализа и снижение расхода растворителей достигалось за сч использования простейших изократических систем и рецикла элюента его полной заменой после 100-200 анализов. Примеры использован этого подхода для определения целевой. и побочных аминокислот ферментационных рартворах штаммов Е.coli - продуцентов валина лейцина (рис.12.) приведены в гл.4.

Рис. 12. Разделение медных-, комплексов ' алкиламинокислот. Колонка 150*3 мм. сорбент - Separon С18, 5 мкм. злюент - 1 мМ ацетата 20%. ацетонитрила, 0.5 мл/мин,- Детектирование - 245 нм. Пики: 1 - глицин, 2 - аланин, 3 - 2-аминомасляная кислота, 4 -5. - норвалин, 6 лейцин, 7 - изолейцин, 8 - норлейцин. 9 - гомс А - стандарт. Б'- ферментационный раствор продуцента валина

Как указано выше, объектами анализа с использованием ВЭЖХ наряду с аминокислотами являлись- представители большинства классов нелетучих нг.чкомолекулярных метаболитов - сахара, нуклеозиды. нуклеотиды. водорастворимые витамины. При разработке соответству-вщих аналитических методик всегда учитывались.отмеченные выше.требования - высокая точность, экспрессность, простота и дешевизна, ориентированность на конкретную задачу, возможность адаптации' к простейшему хроматографическому оборудованию.

Для анализа Сахаров в ферментационных растворах, например, при- ' меняли нормально-фазную хроматографию на колонках с аминофазой с использованием в качестве элюента смесей ацетошприл-вода. При этом наряду с углеводами,- прежде всего глюкозой, фруктозой и саха- • розой, в образцах детектировали также высокомолекулярные полифрук-таны, продуцируете бациллярными штаммами, рибофлавин, бетаин (К.М.Н-триметилглицин) и другие аминокислоты . Последнее обстоятельство позволило наметить подход к одновременному анализу пот-' ребления углеводов и накопления целевого продукта при непрерывной ферментации продуцентов некоторых аминокислот, в частности, лейцина. валияа. пролина и т.д. . Использование сорбентов с силикагель-ной матрицей Еместо более дорогих полимерных катионитов, а также -рецикл элюента также позволили существенно удешевить анализ. • •

Для разделения нуклеозидов. секретируемых бациллярными штаммами мы использовали простейший элюент - 0,5% раствор муравьиной кислоты в 5% ацетонитриле (Рис.13). Ускорение анализа нуклеозидов было достигнуто за счет использования комплексооб-разующих элюентов, содержащих р-циклодекстрин. В случае, например. продуцента тимядина это позволило изменить, порядок выхода и добиться сокращения общего времени анализа до 5 мин и элюции целевого продукта менее чем за 2.5 мин. Поскольку разделение проводили в изократическом режиме, рецикл элюента был возможен и при использовании этой методики. Ион-парную хроматографию в аналогичной системе с добавкой тетрабутиламмоний бромида применяли при определении внутриклеточных пулов нуклеотидов у штаммов-продуцентов уридкн-5' -монофосфата.

Был развит общий подход к"экспресс-анализу заряженных .низкомолекулярных ¿орбатов. к которым можно отнести большинство-объектов разрабатываемых нами методик. Этот подход, с нашей точки зрения можно охарактеризовать как "ион-конкурентную обра-

.U05 --- .1 AU Wavrlciiglli 240 .— ifltJ hui

Рис. 14. Определение нуклеозидов в - ферментационных растворах бациллярных продуцентов. Колонка - 150*3 мм, сорбент - Separon С18, 5 мкм. Проба - 1 мкл ферментационного раствора, детектирование - ди-одно-матричное. Элюент: а)5%ацетонитрила. 0.5% уксусной кислоты, 0,1% триэтиламина

Пики: а:' 1 - цитидин, 2 г .деоксицитидин, 3 - деоксиуридин, 4 -гипоксантин. 5 - тимин. 6 - гуанозин. 7 - тимидин

щенно-фазную хроматографию". В классической ион-парной хроматографии в элюент добавляют ионные детергенты с зарядом, противоположным заряду анализируемых соединений, для того чтобы повысить селективность разделения. При этом время пребывания в колонке веществ с тем же зарядом, что ион-парные реагенты существенно сокращается,. :однако они взаимодействуют с сорбентом, что обеспечивает жх фракционирование. На возможность подобного эффекта указывали В. A.Bldlingmeyer et al (.1979). впервые его продемонстрировали R.M. HcCormlck. anfl В. L. Karger (1980). Коли-

гственная модель ион-парной хроматографии развитая . .¡.З^апаМп. З.И.ОепИпЕ (1982). подтвердила, что ион-парные эагенты могут десорбировать полярные сорбаты одного с ними знака.

Нами на основе этого эффекта был предложен ряд методик, ззволяющих наряду с сокращением времени анализа детектировать некоторых случаях компоненты, присутствующие в образцах в ледовых количествах. За счет сокращения времени пребывания в элонке уменьшалось размывание хроматографических зон, что поддало чувствительность детектирования. В качестве примеров рактического использования этого подхода можно упомянуть экс-ресс-анализ лизина в виде медного комплекса, когда добавление элюент основного ион-парного реагента - тетрабутиламмония ромида или триметилгексадециламмония бромида обеспечивало не олько сокращения времени анализа впятеро, но и уменьшало раз-

1люент а) 1 мкм ацетата меди в 20% ацетонитриле

б) 1 мкм ацетата меди и ЮмМ тетрабутиламмоний бромида !ики: 1 - глутаминовая кислота. 2 - валин. 3 - лизин

Еще один пример применения этого подхода - разработанный метод экспресс-анализа таурина. когда пробоподготовка - дериватизация 2.4-динитрофтобензолом.. подкисление реакционной смеси и экстракции хлороформом производных большинства аминокислот приводили к тому, что образец содержал только ДНФ-таурин и ДНФ-цистеиновую кислоту.

o»/f а. 4

А

ctialf

Б

Рис. 36. Анализ ДНФ-таурина в условиях обращенно-фазной" (а) и

"конкурентной обращенно-фазной" (б) хроматографии.

Колонка - 50*4 мм. сорбент - Силасорб С18. 10 мкм.

Элюент а) 25% метанол, 0.1% уксусной кислоты, общее время анализа -

б) общее время' анализа - 12 сек Лики: 1 - ДНФ-цистеиновая кислота, 2 - ДНФ-таурин

Разделение этих двух веществ в режиме ион-конкурентной хроматографии с использованием элюента, содержащего алкилсульфокислоту бкпо возможно за 8-16 сек (Рис.16), причем в соответствии'с теоре-

веской моделью увеличение углеводородной цепи ион-парного реа-знта приводило к уменьшению удерживания сорбатов . Использование юн-конкуре-. гной обращенно-фазной хроматографии" для ВЭЖХ анализа 4бофлавина и идентификации в ферментационном растворе фосфорили-званных флавинов рассмотрено в гл. 4.

В главе 3 содержатся примеры использования разработанных зтодик для комплексного анализа ферментационных растворов гаммов-продуцентов низкомолекулярных биологически активных ве-зств на примере рекомбинантных штаммов Е.coll - продуцентов алина и лейцина, а также рекомбинантных. бацилярных продуцентов . • ибофлавина.

Биосинтез неполярных незаменимых аминокислот - лейцина и валина ротекает по схожим метаболическим путям. На первой стадии проводит конденсация двух молекул пировиноградной кислоты синтетазой цетогидрокешшслот (AHAS) с образованием ацетомолочной кислоты, а следующем этапе ацетомолочная кисло.та измеризуется и восстанав-ивается с образованием 2-кетоизовалериановой кислоты - предшест-енника валина. 2-Кетоизовапериачовая кислота может аминироваться валин. либо пройдя еще несколько стадий превращаться в 2-кетои-|Окапроновую кислоту - предшественник лейцина. Повторение этих ;тадий' может приводить к образованию 2-кетокислоты - предшествен-мка гомолейцина. Примеси лейцина при получении валина или валина 1ри получении лейцина, а также гомолейцина при получении любой из )тих аминокислот крайне нежелательны, поскольку в процессе вьщеле-¡ия они сокристаллизувтся с целевым продуктом и усложняют его зчистку. Допустимое содержание примесей разветвленных аминокислот ю превышает 0,1% от целевой аминокислоты, иначе говоря речь идет } соотношении основной компонент-примесь 1/1000. При столь малом :одернании примесей любые методы анализа аминокислот, включающие предварительную пробоподготовку, могут привести к занижению результатов анализа, необходам прямой ввод пробы в колонку. В мировой практике для этих целей используют аминокислотный анализатор и колонки повышенной емкости, стоимость которых составляет около 30000 долларов. Подобные колонки для нас недоступны и в связи с этим ВЭЖХ в виде медных комплексов становится не просто предпочтительным. а единственйо возмодным методом анализа. Типичные хроматог-раммы смеси гидрофобных аминокислот и ферментационных растворов, соответствующих продуцентов приведены на рис. 17. При анализе опи-

Рис. 17.Разделение медных комплексов алкиламинокислот. Колонка -150*3 мм. сорбент - Separon С18, 5 мкм, элюент - 1 мМ ацетата меда 20% ацетонитрила, 0,5 мл/мин. Детектирование - 245 нм. А - стандартная смесь, Б - ферментационный раствор продуцента .лейцина. Пики: 1 - вапин, 2 - лейцин, 3 - фенилаланин, 4 - гомолейцин

санным методом ферментационного раствора нового штамма - продуцента лейцина был обнаружен;незнакомый пик, по индексу удерживания и площади соответствующий фенилаланину в концентрациях 1-4 г/л. Поскольку накопление фенилаланина было нехарактерно для ранее изученных продуцентов валина и лейцина, была проведена дополнительная идентификация этйго компонента с использованием обращенно-фазной хроматографии с диодно-матричным. детектированием. При этом не только время удерживания, но и спектр оказались типичны именно для

фенилаланина. Обаружение фенилаланина в ферментационных растворах продуценте: лейцина подтвердило важную роль соответствующих тран-саминаз при биосинтезе лейцина.

Наряду с ВЗЙХ при исследовании биосинтеза валина и лейцина широко использовали газовую хроматографию, главным образом для идентификации в ферментационных растворах предшественников аминокислот и тем самым обнаружения дисбаланса между активностью различных ферментов их биосинтеза. Контроль содержания пирувата -позволил подтвердить, что "узким местом" в биосинтезе валина и •лейцина не является АНАБ, поскольку пировиноградная кислота. в ферментационной среде не накапливалась. В связи с этим возникла необходимость в количественном определении в образцах ацетомо-лочной кислоты - соединения нестабильного, которое практически невозможно превратить в летучее производное. Вместо этого пробы закисляли, прогревали и ацетомолочная кислота количественно превращалась в ацетоин. Содержание образовавшегося ацетоина определяли на колонке.с Тритон Х-305/КР*2Н20 также, как определение накопления нейтральных продуктов гликолиза у бациллярных штаммов.

- На..ранее, описанной "кислой".колонке газо-хрсматографически определяли' уровни накопления 2гКетокислот, секреция которых свидетельствует либо о недостаточной активности трансаминаз. либо о недостатке"ашнокислот - доноров аминогруппы. Поскольку ВЭЖХ анализ свидетельствовал, как правило, о накоплении в ферментационных растворах глутаминовой кислоты или фенилаланина (доноров аминогруппы при биосинтезе валина и лейцина, соответственно), можно было предположить, что отсутствие в образцах пи-ровиноградной кислоты, накопление ацетомолочной кислоты (до ю г/л), и 2-кетокислот свидетельствует, скорее, о недостаточной активности трансаминаз. Таким образом, комплексное использование хроматографических методов анализа позволило определить, лимитирующие стадии в биосинтезе аминокислот реконбинатными штаммами. , .

Комплекс-хроматографических методов анализа был - использован и при оптимизации процесса биосинтеза рибофлавина бациллярными штаммами, созданными в ГосНИИгенетике. Для всех бациллярных штаммов характерно превращение в процессе гликолиза значительной часта углеводов (до 30%) в летучие нейтральные С4 сое-

динения - ацетоин, диацетил. бутандиол. Возможно также превращение части углеводов (до 30%) в полимеры - полиглюканы и по-лифруктаны. Следствием этого является снижение экономичности процессов биосинтеза и ухудшение их технологических и экологических характеристик. Для анализа нейтральных С4-соединений мы использовали газовую хроматограию на колонках с сорбентами, содержащими Тритон Х-305/КР*2Н20. Анализ Сахаров проводили в режиме нормально-фазной хроматографии, причем одновременно детектировали углеводные полимеры синтезируемые микроорганизмами. Анализ самого рибофлавина, а также его предешестненников и про-

1

Рис.18.Определение флавинов в внутриклеточном пуле (а) и фермен ном растворе (б) бациллярного' продуцента рибофлавина. Колонка - 250*3 мы. сорбент - Силасорб С18, -5 мкм. Элюент А -.0 этиламина и 0.5% уксусной кислоты, элюент Б - 0.1% тризтиламина уксусной кислой в 50% ацетонитриле, линейный градиент от О д ' за 20 мин. Детектирование УФ при 260 нм и флуориметрическое Пики: 1 - АТФ. 2 - ГТФ, 3 - ФМН. 4 - рибофлавин. 5 - ФАЛ

летов дальнейших превращений проводили в режиме обращенно-фаз-ш и ион-кс-курентной обращенно-фазкой хроматографии. Получение при этом результаты были использованы при создании новых гаммов и оптимизации параметров их культивирования. В частнос-I. уровень накопления летучих С4 соединений был снижен в де-?тки раз. что позволило улучшить экономические и экологические фактеристики процесса биосинтеза рибофлавина. В ходе изучения {утриклеточных пулов макроэргов - АТФ и ГТФ - с использованием ЭЖХ была обнаружена связь их концентрации с биосинтезмо рибоф-авина. При этом было показано, что для штаммов-продуцентов, в глячии от исходных штаммов дикого типа, характерно наличие 1утри клетки свободного рибофлавина, а также продуктов его зефорилирования, играющих роль коферментов - ФМН и ФАЛ. ФМН и Щ обнаружили также в ферментациош{ых растворах штаммов-проду-5нтов (Рис.19).

-.005---.02 AU Wavelength 250 --- 500 и»

ис. 20. Анализ флавинов в ферментационном растворе в условиях конкурентной обращенно-фазной" хроматографии. - • олонка - 150*3 мм. сорбент - Separon С18. 5 мкм. Элюент - . , 1% триэтиламйна. 0.5% уксусной кислоты и О мМ 1-октансульфокислоты.

ики: 1 - 2.4-диметилрибитиллюмазин. 2 - ФАД, 3 - рибофлавин

Если при анализе внутриклеточных пулов ФМН и ФАЛ использовалк флуоресцентное детектирование, то для подтверждения их секреци. применили спектральные данные полученные при помощи диодно-ма'г ричного детектора. Поскольку чувствительность диодно-матричноп детектирования была недостаточна для реиения этой задачи использовали негативную ион-парную хро.чатогафию. Применение элюента содержащего 1-гексансульфокислоту обеспечило злюцию фосфорилирован-ных флавинов за короткое время и узкими зонами, что позволило определите их спектры (Рис.20). Таким образом впервые была проде: монстрирована способность бациллярных культур— продуцентов рибофлавина к накоплению свободного рибофлавина внутри клетки и егс секреции его фосфорилированных производных. Тот же подход б*« применен к при определении ферментативной активности ФАД-синтета-зы у различных бациллярных штаммов.

Экспериментальная часть работы изложены в главе 4. Описано оборудование использованное в ходе выполнения работы, подготовка сорбентов и колонок, условия проведения хроматографи-ческого анализа, приведены конкретные аналитические методики. Показано, как проводили количественное определение, расчет ошибки определения и т.д..

Выводы

1. Развит общий подход к хроматографическому экспресс-анализу низкомолекулярных веществ в ферментационных растворах штаммов промышленных микроорганизмов - продуцентов биологически активных соединений. Показано, что экспрессность анализа достигается за счет упрощения пробоподготоакк к повышения селективности хроматографического разделения и детектирования, а также разработки объектно-ориентированных методик.

2.Для решения задач экспресс-анализа летучих компонентов ферментационных растворов автором предложена серия новых га-зо-хроматографических сорбентов, содержащих фторид калия. Оценена способность этих сорбентов к мекмолекулярным взаимодействиям в условиях газовой хроматографии. Показано, 'что расплав кристаллогидрата фторида калия обладает уникально низкой спо-

'собностью к межмолекулярным взаимодествияи с полярными сорбата-ми. что обеспечивает' экспрессность анализа при использовании его

в качестве неподвижной Фазы,

3. Из:- 'на сорбента, содержание органическую неподвижную фазу и расплав кристаллогидрата фторида калия. Показано, что в этих сорбентах кристаллогидрат фторида калия унифицирует поверхность твердого носителя, сникая неспецифическую сорбцию полярных веществ, а также мо:кет растворяться в слое органической неподвижной фазы снижая общее удерживание сорбатов.

4. Возможности применения этих сорбентов продемонстрированы на примере ряда аналитических задач, в частности, изучения потребления нэтанола ыетилотрофннми микроорганизмами, накопления ацетона, этанола и бутанола бактериями рола Clostridium, образования и потребления ацетоина и бутандиола в процессах культивирования бациллярных продуцентов инозина, фешлаланина я рибофлавина и т.д.

5. Экспресс-анализ аминокислот с "ошбкой определения ке более 5%, а также количественное определение примесей аминокислот при содержании ниже 0,1% от целевого продукта обеспечивается при использования подхода основанного на обращенно-фазном разделении юс комплексов с ионами меди (II). Изучено влияние органических растворителей на удерживание подобных комплексов и "показано, что их удерживание определяется по крайней мере двумя механизмами сорбции. Оценены энергетические, вклады основных Функциональных груш аминокислот в удерживание их комплексов с Cu(II) в условиях обраценко-фазнай хроматографии, показана возможность создания шкалы логарифмических индексов удерживания для повышения надежности идентификации аминокислот в биотехнологических образцах.

6. Разработан ряд методик экспресс-анализа аминокислот в ферментационных растворах микробных продуцентов (фенилаланина, валина, гисгидина, глутамика, лейцина, лиина и т. д.) опирающийся на их разделение и детектирование в виде медных комплексов. Эти методики характеризуются простотой пробоподготовки и аппаратного оформления самого хорматографического процесса, упроще-

' нием условий разделения и селективностью детектирования, общее " время анализа, включая пробоподготовку, как правило не превышает 15-20 мин. 'что позволяет применять их для массового определения аминокислот и контроля промышленных процессов.

7.Предложено использовать ■ "ион-конкурентнув" обращен-

но-фазную хроматографию при разработке методов зкспресс-анализг заряженных низкомолекулярных соединений в биологических образ цах. Б частности этот подход бал использован при разработка экспресс-методик определения таурша (время разделения 12 сек), лизина (время анализа 2 мин), анализе макролидных антибиотиков - тилозинов в ферментационных растворах штаммов-продуцентов, г также при идентификации предшественников рибофлавина и фосфори-лированных флавинов в ферментационных растворах продуцентоЕ этого витамина.

8. На примере процессов биосинтеза незаменимых аминокислот -валина и лейцина, а также витамина В2 (рибофлавина) продемонс-трированна целесообразность использования комплекса хроматогра-фических методов при оптимизации условий культивирования соот-вествующих продуцентов с целью повышения степени усвоения субстратов и накопления целевого продукта, снижения образования побочных продуктов, улучшения экологических и. экономических характеристик биотехнологических процессов.

Основные результаты диссертации изложении в следующих работах:

1. Thermodynamic distinction in 'donor-acceptor interactions

of, organic bases with KF and Ka3P04 on ftydrogenated Apiezon columns / R. V. Golovnya, I.L.Zhuravleva B.M.Polanuer // J. Chromatogr. 286 79-90 1984

2. Комплексообразование алкилпиридинов с Na PO в условиях газовой хроматографии / Р.В.Головня., И.Л.Журавлева ,

Б. М.Полануер //.Изв.АН СССР.Сер.хим... N11, 2487-2491 1934

3. Gas chromatographic determination of the temperature limit of alKylpyridine-trisodluffl phosphate complex formation.and its use in Identification / B.M.Polanuer.

I. L. Zhuravleva, R. V. Golovnya J. Chromatogr... 1S86, 365 399-41

4. Использование газо-хроматографического метода для экспресс-анализа метанола в культуральной жидкости

// Б.М.Полануер, М.В.Баев. В.К.Гордеев / Биотехнология ■ ' 1986. 5." 121-124, ' " ' ' .

5. Газо-хрома^ографическое определение индола в ферментационню растворах // Б.К.Полануер. М.И.-Турков, В.К.Гордеев/ , Биотехнология 1986. 3. 121-123,

. Кристаллчгидрат фторида калия как новая стационарная фаза для газохрсматографического анализа водных растворов полярных веществ //Б.М.Полануер. Р. В.Головня, И.Л.Куравлева, В.К.Гордеев/ Изв. АН СССР. Сер. хим... 1987, N2,348-352

. Непрерывное культивирование метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha без внешнего лимитирования //М. В.Баев. Ю.Г. Капуль-цевич. Б.М.Полануер/ Микробиология 57(1) 1988

!. Определение лизина методом высокоэффектавнойжидкостной хроматографии на динамически модифицированном силикагеле //Б.М.Полануер, Е.Л.Барсуков. - 'А.Ф.Шолин/ сб.Микробиологическая промышленность. Отечественный передовой опыт , вып. 10, 9-13 1988

). Селективное определение ароматических аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии //О.В.Сапрыкин, Б.М.Полануер, А.Ф.Шолин/ сб.Микробиологическая промышленность. Отечественный передовой опыт . вып. 10. 4-8 1988

10. Thermodynamic evaluation of the inter-molecular interactions of potassium fluoride crystal hydrate in gas chromatography //R. V. Golovnya, В. M. Polanuer / Chromatographia 1989 28 N3/.4. 179-182

11. Определение летучих соединений в ферментативных растворах бациллярных ■ штаммов газо-хроматографическим методом. //Б.М.Полануер, Ю.В.Сапрыкин, А.Ф.Шолин/ сб. Передовой опыт в медицинской и микробиологической промышленности, вып.2, 5-11 1989 г.

12. Comparison of raethode for the determination of polarity and selectivity of stationary phases In gas chromatography from a thermodynamic point of view.//R.V. Golovnya, B.M. Polanuer /

J. Chrpmatogr. 517 51-66 1990,

13. Газо-хроматографическое определение полярных соединений в водных растворах с использованием сорбентов модифицированных кристаллогидратом фтористого калия // Б.М.Полануер. Ю.В.Сапрыкин. А.Ф.Шолин/ Журнал.Аналит.Хим. 46(3) 554-560 1991

14. Determination of glutamine. 'glutamic' and pyroglutamlc acids using HPLC on dynamically modified silica //B.M.Polanuer.

N.G.Demina' N. F.Rumiantseva. A.F.Sholin/ Л.Chromatogr.. 594. 173-178 1992

15. Direct aqueous injection gas chromatographic analysis of polar

compounds using sorbents containing potassium fluoride crys hydrate//B.M: Polanuer/ Chromatographia. 33 (5/6), 279-284 is,

16. Direct aqueous injection gas chromatographic analysis of polar compounds using sorbents containing potassium fluorid crystal hydrate Express-analysis of volatile organic solvent in the fermentation broth of Clostridium strains.//В.M. Pola nuer/J. Chromatog.. 596 (1), 138-140 1992.

17. Effect of formaldehyde on growth of obligate methylotroph Methylobacillus. flagellatum in a substrate-non-limited continious culture // M.V.Baev, L.V.Chistoserdova, В.И.Pola V.E.SterKin, M.Y.Kirlukhln, Y.D.Tsygar&ov/

Arc. Microbiology 158 145-148 1992

18. Growth of obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum under stationary and nonstationary conditions during continious cultivation // M. V.Baev. N.L.Schlyar. L. V. Chistoserdova, A. Y. Chistoserdov, B.M. Polanuer, У. D:Tsygankov V.E. Sterkin Bictechnol.b Bioeng. 39 688-695 1992

19. Исследование стабильности глуташша в процессе его выделения из ферментационных растворов Л. Влияние температуры, рН i солевого состава на стабильность глутамина в модельных растворах// Демина Н. Г. . Румянцева: Н. Ф., Полануер Б.М., Шолин'А.9 Биотехнология HI, 53-55, 1992

20. Rapid assay of dinitrophenyl derivative of taurine by high-pe formance liquid chromatography //B.M.Polanuer, S.V.Ivanov, A.F.Sholin/ J. Chromatogr., 656. 81-85 1994

21 Устойчивостью аденину и продукция уридин-5'-монофосфата у-тантных штаммов Brevibacterlum .ammoniagenes //О.Э.Умнова. Б.М.Полануер, Е.С.Преображенская, Л.А.Казаринова/ Биотехноло гия 7. 5-11 1994

22. Сравнение различных методов количественного определения рибофлавина в культур альных жидкостях штаммов-продуцентов. //Б.М.Полануер, 0.А.Дедова, В.Г.Гаспаров/ Биотехнология, 5-6 44-47 1995

23. Application of "negative-ion-pair"-chromatography for the analytical method development //B.Polanuer. O.Dedova/ в сб. трудов 1*3 Международного Симпозиумах по использованию ВЭИ и капиллярного электрофореза в биомедицинских исследованиях (Прага. Чехия. 1995),

24. Influence of organic modifier on the amino acid - Cu(II) complexes retention under HPLC conditions // B.Polanuer, S.Ivanov/ Тан же.

25. Chromatographic , study . of sucrose utilization and polyfructan (levan) production by baclllar strains //O.Dedova. B.Polanuer, R.Aklshina. N.Matrosov/, Там не. •

26. Determination of Corynebacteriura ammonlagenes intracellular pools of mononucleotides by lsocratlc HPLC technique //0. Umnova, B.Polanuer/ Там же.

27. Application 'of HPLC for simultaneous determination of amino acid production and carbohydrate consumption . by industrial strains of microorganisms //B.Polanuer.

N. Matrosov/ Там же.

28. Simple assay of valine in fermentation media by reversed-phase HPLC of copper (II) complexes// B.M. Polanuer.

S. V. Ivanov/ J. Chromatogr.. 722.. 311-316 1996

29. Количественное определение тимидина и сопутствующих ему нук-леозидов в ферментационных растворах // Э.В.Кузнецов, Н.В.Ко-ролькова, А.Е.Новикова.- .А.С.Миронов, Б.М.Полануер.

Б. В.Тяг-лов, А. И.-Заика, А. С. Исаев. ... ......

Биотехнология. 9-10. 60-63.1995.30. Влияние некоторых компонентов ферментационной среды генно-инженерного штамма-продуцента рибофлавина Bacillus subtills на растворимость рибофлавина //Ю.В.Сапрыкин, Б.М.Полануер, А.Ф.Шолин/ Биотехнология. N7. 17-24 (1993)

31. Количественное определение бетаина в питательных средах и ферментационных растворах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. //Б.М.Полануер, k З.А.Ершова/ Биотехнология.

2, 56-59 1996

32. Применение хромагографических методов анализа в биотехнологии - проблемы и перспективы //Б.М.Полануер/ Биотехнология, 4. 47-57 1996

33. Газо-хроматографический анализ летучих продуктов гликолиза в процессах культивирования бациллярных штаммов - продуцентов биологически активных веществ. //Б.М.Полануер, А.П..Тарасов. А. Е. Новикова, Л. В. Шинкевич/ Труды. 2-го Международного Симпозиума "Хроматография и спектроскопия в анализе объектов окружающей среды и токсикологии" С.Петербург. Россия. 1996