Хроматография медленно диффундирующих веществ в неравновесном режиме тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.20 ВАК РФ

УДК 543.544 //а правах рукописи

£ #

^ ЛЕБЕДЕВ ЮРИЙ ЯКОВЛЕВИЧ

ХРОМАТОГРАФИЯ

МЕДЛЕННО ДИФФУНДИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В НЕРАВНОВЕСНОМ РЕЖИМЕ

Специальность 02.00.20 — Хроматография

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва—1997

Диссертация выполнена в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург).

Научный консультант - доктор химических наук

профессор Мчедлишвили Б.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Золотарев П.П. кандидат химических наук Ланин С.Н.

Ведущая организация - Санкт-Петербургский Государственный

технический университет

Защита состоится 04 декабря 1997 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.95.02 при Институте физической химии РАН (117915, Москва, Ленинский пр., 31)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии РАН

Афтореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

Коломиец Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы связана с возрастающим интересом к проблемам хроматографии биологически активных веществ (БАВ). Такой интерес вызван постоянно расширяющимся кругом практических задач, решаемых с помощью колоночной хроматографии БАВ. К наиболее актуальным можно отнести задачи биотехнологии (по масштабированному и препаративному разделению, выделению и концентрированию БАВ с целью получения особо чистых биопрепаратов), некоторые задачи медицины (по экстракорпоральной деток-сикации человека методами гемо-, плазмо- и ликворосорбции), задачи молекулярной биологии (по получению информации о физико-химических характеристиках БАВ), задачи анализа БАВ (с целью идентификации состава и количества конкретных компонентов в сложных биохимических средах). Недостаточное развитие научных основ хроматографии БАВ тормозит решение перечисленных задач. Простое же перенесение на хроматографию БАВ принципов, характерных для низкомолекулярных и минеральных веществ, не привело к желаемому успеху. Главная причина этого состоит в том, что хроматография БАВ, как правило, осуществляется в неравновесном (НР) режиме — не характерном для низкомолекулярных веществ. НР режим вызван, прежде всего, медленной внутридиффузионной кинетикой межфазного массообмена БАВ в колонке и принудительным сокращением времени протекания самого процесса хроматографии (для сохранения биологической активности веществ). Учитывая сказанное, а также факт, что вопросам элютивной неравновесной хроматографии (в том числе хроматографии БАВ) не уделялось должного внимания, в силу новизны этого направления, можно считать проведение теоретических и экспериментальных исследований в этой области весьма актуальным. Детальное исследование закономерностей неравновесной хроматографии будет, без сомнения, способствовать решению перечисленных задач.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении общих закономерностей неравновесного движения медленно диффундирующих веществ в колонке, разработке на их основе хроматоидентификации БАВ, а также в выявлении возможности проведения хроматографии БАВ в условиях НР режима. Для достижения этих целей решались следующие задачи: 1) разработка и анализ теории неравновесного движения и разделения веществ в колонке; 2) экспериментальное исследование элютивного движения некоторых БАВ в колонке для случая отсутствия (эксклюзионный вариант) и наличия (ионообменный вариант) взаимодействия между пористым материалом и БАВ; 3) проверка адекватности теории и эксперимента по закономерностям движения и разделения БАВ в условиях НР режима; 4) разработка и анализ

теории неравновесной хроматографии, адекватной различным элютивным методам ввода пробы в колонку.

Научная новизна. 1) Построена линейная теория неравновесного движения хроматографичесшй зоны медленно диффундирующего вещества для случая внутридиффузионной кинетики межфазнога мдссообмепа, новыми элементами которой являются: решения (для обеих фаз колонки) уравнений хроматографии в НР режиме для случаев произвольного я «импульсного» краевых условий на входе колонки; аналитические соотношения, дающие взаимно-однозначное соответствие между основными характеристиками движения зоны (объем удерживания, высота и ширина зоны и др.) т— с одной стороны, и параметрами хроматографической системы — с другой. 2) Впервые экспериментально установлены и теоретически обоснованы новые закономерности движения зоны в НР режиме, такие, как смещецие зоны от скорости элюции, дисперсности гранул и от других параметров; пародоксальные (с позиций традиционных воззрений) изменения высоты и ширины зоны от параметров системы; 3) Впервые установлено (на теоретическом и экспериментальном уровнях), что хроматоидентификация веществ в НР режиме возможна по сумме равновесных и кинетических параметров массообмена и гидроструктурных параметров (скорости элюции, дисперсности гранул, длины колонки). 4) Обоснована на теоретическом и экспериментальном уровнях (на примере эксклю-зионной хроматографии БАВ) возможность экспресс-разделения веществ с близкими молекулярно-равновесными свойствами по различию их молекуляр-но-кинетических свойств. 5) Установлена адекватность теории динамики движения и разделения медленно диффундирующих веществ в НР режиме с экспериментом для БАВ. 6) Впервые доказана на теоретическом и экспериментальном уровнях неравноценность методов ввода пробы в колонку на закономерности движения и разделения веществ в условиях НР режима.

Практическая значимость достигается в разработках, открывающих следующие возможности: 1) априорную количественную оценку основных характеристик движения зоны в НР режиме по предложенным аналитическим соотношениям; 2) хроматоидентификацию веществ, движущихся в НР режиме, по равновесным, кинетическим и гидроструктурным параметрам системы; 3) способы перевода движения зоны из неравновесного (НР) режима в квазиравновесный (КВ) режим варьированием физико-химических или гидроструктурных параметров системы; 4) экспериментальное определение эффективных коэффициентов диффузии веществ в порах сорбента по наклону прямых в координатах «относительный объем задержки вещества — обратная скорость элюции»; 5) экспресс-разделение веществ с близкими молекулярно-равновесными свойствами за счет различия их молекулярно-кинетических свойств (коэффициентов диффузии) методом эксклюзионной хроматографии в НР режиме.

Защищаемые положения. 1) Развитие линейной теории сугубо неравновесного движения вещества хроматографической зоны в колонке (для случаев ионообменной, адсорбционной, эксклюзиошюй хроматографии БАВ) при учете внутридиффузионной кинетики межфазного массообмена, основные защищаемые положения которой включают: общие решения (для обеих фаз колонки) уравнений хроматографии для HP режима при произвольных и «импульсных» краевых условиях; аналитические соотношения между основными характеристиками движения зоны и параметрами хроматографической системы; строгую хромато-идентификацию веществ. 2) Факт существования новых (не характерных для традиционной хроматографии) закономерностей движения медленно диффундирующих веществ (в том числе БАВ) в колонке, подтвержденных экспериментально и получивших теоретическое обоснование. 3) Обоснование возможности экспресс-разделения БАВ с близкими мо-лекулярно-равновесными свойствами в условиях HP режима хроматографии. 4) Неравноценность методов ввода пробы в колонку на закономерности движения и разделения веществ в HP режиме. 5) Адекватность развитой теории неравновесного движения и разделения медленно диффундирующих веществ с экспериментом для БАВ.

Апробация и публикации. Результаты выполненных исследований по теме диссертации докладывались на XI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Алма-Ата, 1975), на Всесоюзной научной конференции «Биологически активные вещества природного и синтетического происхождения» (Ленинград, 1977), на I Всесоюзной конференции по применению хроматографии в биологии и медицине (Москва, 1983), на Всесоюзном семинаре, посвященном памяти A.B. Киселева (Москва, 1985), на I-V Всесоюзных и VI-VII Российских симпозиумах по молекулярной жидкостной хроматографии (Дзержинск, 1979; Звенигород, 1982; Рига, 1984; Алма-Ата, 1987; Рига, 1990; Москва 1993; Москва, 1996).

По теме диссертации опубликованы 23 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), основной части, включающей теоретические и экспериментальные результаты исследования (главы 2 — 5), заключения и выводов, списка литературы, двух приложений. Общий объем работы 120 стр. на стандартных листах, включая 27 рисунков, 1 таблицу, 2 приложения, список цитируемой литературы из 113 наименований.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ОСНОВНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

ГЛАВА 1 ОСНОВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КВАЗИРАВНОВЕСНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ СЛУЧАЯ ВНУТРИДИФФУЗИОННОЙ КИНЕТИКИ МЕЖФАЗНОГО МАССООБМЕНА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

При развитии неравновесной хроматографии медленно диффундирующих веществ (в том числе БАВ) наибольший интерес представляет учет внутри-диффузионного механизма межфазного массообмена в колонке. В этом случае хроматографическую систему из колонки с гранулами пористого материала и раствора (растворителя и компонентов, подлежащих разделению) целесообразно охарактеризовать следующими параметрами:

и, Я, Ь, б, а, Г., Ц или у, И, Ук, Г., Э. (1)

где и, v, Я, Ь, Ук , б, а — гидроструктурные параметры: и(у) — линейная (объемная) скорость элюции, Я — средний радиус сферических гранул, Ь, б, Ук — высота, площадь и объем рабочей части колонки (Уи = (1 - а)\'к, Усв = а\'к — соответственно объем всех гранул и объем между гранулами в колонке), а — порозность; Г., Б. — физико-химические параметры: Г — эффективный коэффициент равновесного распределения компонента «Ь> между фазами, Б. — эффективный коэффициент диффузии «Ь> компонента в порах гранулы.

Закономерности хроматографической системы с параметрами (1) выявляются в главе 1 (традиционные закономерности, характерные для КВ режима) и в главах 2-5 (нетрадиционные закономерности, характерные для НР режима).

Первый раздел главы 1 содержит основные сведения по теории квазиравновесной хроматографии. Упор сделан на теорию, развитую Бреслером С.Е. с сотрудниками. В ее основе — «концепция запаздывания» момента установления межфазного равновесия в колонке: время установления межфазного равновесия уже не мгновенное, как в равновесной хроматографии, а конечное, но малое по сравненшо со временем реализации самого процесса. Основные характеристики выходной зоны, такие как объем удерживания (V*) и ширина (ЭУ) зоны, совпадают со среднестатистическими характеристиками концентрационной кривой — средним объемом элюции (V ) и корнем квадратным из дисперсии (б 2):

V* = V = V + ГУ , АУ = 23'2о = 4(ГУ уК2/150)''2. (2)

хром СВ СТ 7 V 4 сг ' 4 7

Второй раздел главы 1 посвящен обзору экспериментальных данных с участием БАВ, которые не могут быть объяснены с позиций традиционной хроматографии. Тем самым, показана ограниченность традиционной теории.

ГЛАВА 2 БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводили с антибиотиком тетрацик-линового ряда окситетрациклином (ОТЦ) (в колонке с сульфокатионитом) — в случав изучения закономерностей, адекватных ионообменной хроматографии, а также с белками и витамином Вп(в колонках с биогелями или макропористым стеклом) — в случае изучения закономерностей, адекватных экск-люзионной хроматографии (таблица). Все исследования с ОТЦ проводили в кислотной среде (рН = 1,6); в этом случае ОТЦ представлял собой однозарядный катион. Опыты по элюции БАВ методом «поршня» не отличались от общепринятых методик: соответствующим элюентом (таблица) уравновешивали сорбент в колонке; вводили узкую пробу БАВ и сразу же пропускали через колонку тот же элюент до полного вымывания БАВ. Опыты по элюции пробы ОТЦ методом «равновесного массораспределения» осуществляли путем ввода в верхнюю часть колонки (за сутки до начала элюции) 0,5 мл раствора антибиотика с 1М ЫаС1, рН = 1,6. Временной контроль концентрации БАВ на выходе колонки осуществляли автоматически с помощью ультрафиолетового детектора и самописца.

Таблица

Объекты и материалы исследования

Объекты Материалы Физико-химические параметры

ММ, Да Г Б, см2/с

Окситетрациклин (ОТЦ) Дауэкс 50x4 460 111 1,6Т0-9

Биогель Р-100 0,85 3,51 О"7

Витамин Вр Биогель Р-150 1300 1,0 4, Г1 О"7

МПС-Ш-1000 0,60 9,МО"7

РНК-аза Биогель Р-100 14'103 — —

Химотрипсиноген (ХТНГ) Биогель Р-100 23,7-103 — —

Гемоглобин (ГМГ) Биогель Р-100 Биогель Р-150 67Т01 0,21 0,31 2,810" 4,7Т0'9

Сыворот. альбумин (СА) Биогель Р-100 МПС-1М-1000 69103 0,42 4,310'8

Примечание. Опыты с антибиотиком осуществляли в 1М водном растворе №С1 при рН = 1,6, а с витамином и белками — в физиологических условиях: 0.05М фосфатном буфере (рН = 7,4), 0,15М №С1.

В предварительных экспериментах в статике были изучены закономерности равновесия и кинетики межфазного массораспределения ОТЦ и В12. По линейным участкам изотерм массораспределения были рассчитаны коэффициенты & равновесного массораспределения (таблица) и определены границы концентраций, в которых выполнялись «линейные» закономерности массораспределения. Экспериментальные кинетические кривые по сорбции ОТЦ на катеоните «дауэкс-50» имели (в координатах «степень сорбции — корень квадратный из времени») ярко выраженные линейные участки (для разных диаметров гранул), что отвечало внутридиффузионному механизму кинетики сорбции. По наклону этих прямолинейных участков был рассчитан эффективный коэффициент диффузии ОТЦ.

Параметры Г и О для белков (таблица) определены из динамических экспериментов, адекватных квазиравновесному (КВ) режиму. В последнем случае (гауссовые зоны) использовались формулы (2).

ГЛАВА 3 ТЕОРИЯ ДВИЖЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОИ

ЗОНЫ В НЕРАВНОВЕСНОМ РЕЖИМЕ ДЛЯ СЛУЧАЯ ВНУТРИДИФФУЗИОННОЙ КИНЕТИКИ МЕЖФАЗНОГО МАССООБМЕНА И ЛИНЕЙНОЙ ИЗОТЕРМЫ МАССОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ

Теория неравновесного движения компонента в колонке строится на основе известного уравнения материального баланса

а аС/ох + (1 - а) Ойр1<Л = -сш дС/дх (3)

и на основе асимптотического интегрального уравнения внутридиффузионной кинетики межфазного массообмена (10К 2 < 1)

I

ак = 3 Г л 121 С® { РЖ"2 (I - - к1/2 } с^ . (4)

о

Здесь С(хД), аг.(х,1) — средние концентрации целевого компонента в подвижной и неподвижной фазах; I — время, х — координата длины. Подробное обоснование адекватности уравнения (4) для НР режима хроматографии дано в приложении 1 диссертации. Решение уравнений (3)-(4) с «нулевыми» начальными и произвольным краевым условиями вида

С(х,1)Ц =0, ак(х,{)||__0 = 0, С(х,1)|х_0 = ДО (5)

получено операционным методом (Приложение 2 диссертации). Результаты представим в следующем виде:

с | = АЛ (Т- 5)-'2 exp [X - ] d^ ; (6)

т >0 2л/я: D

т

Л2.

ЗГА. f R2 Г

aR| = г-- J £)] J ц-32 exp - - Л) ' > (7)

т >0 2V71 D 4ll

о о

Структура решений (6)-(7) включает две безразмерные координаты X, т , объединяющие в совокупности основные параметры (1) системы:

Я = 3(1 - a)FDx/cxuR2 = ЗГ1ЭУ/vR2 ; (8)

хх = DR2(t - x/u) - D(V - V J/vR2 ; (9)

где V = aust — объем элюата, выходящего из колонки. В элютивном варианте, осуществляемом методом «поршня», краевая функция в выражениях (6)-(7) может быть представлена в виде дельта-функции

C(x,t)|s 0 = f(t) = (Q/aus)8(t), (10)

где Q — общее количество целевого компонента, введенного в колонку. С учетом (10) концентрационные профили элюционной кривой описываются следующими выражениями:

С = (QD/vR2)(A./27T1,2 хх 3 2)ехр(А. - А.2/4хх) ; (11)

aR = 3(QDr/vR2)[(Tt х;1'2) ехр(-А.2/4хч) - erfc(X/2xxl-)] ехр(А.) , (12) где erfc(y) = 1 - Ф(у), а Ф(у) — интеграл вероятности. На базе выражений (11 )-{12) получен перечень основных аналитических соотношений для характеристик зоны, адекватных элюционному варианту хроматографии в HP режиме:

t*- h/u V* - V e*tv =---=-- = Х/2 (13)

(1 - a) Fh/au ГУт

— относительное время (или объем) задержки целевого компонента;

t*- h/u V * - V ЗЯ

в- =--Ü-= -=--(14)

(1 - a) Th/au ГУот 2(1+А.)

— относительное время (или объем) задержки целевого компонента, фиксируемое наблюдателем в неподвижной фазе с координатой h, где t*(V*), t, *(V *)

— время (объем) удерживания компонента, фиксируемое наблюдателем со-

к; = ^^ = Г(Х - 0,27Л2) (15)

ответственно в подвижной и неподвижной фазах, иначе, I* — время фиксирования на хроматограмме точки с максимальной концентрацией;

, _ ак(хД') _ а^хд*) с(х,0

— коэффициент неравновесного (реального) массораспределения компонента между фазами в момент времени I*;

АУ~ = 0,31 ГУ , АУ" = 1,59ГУ ^,АУ=1,9У к (16)

ст ст 7 7 сг

— ширина зоны в объемных единицах (рис. 1, АУ = АУ" + АУ+);

4= АУ7АУ+ = Дг/ДГ = 0,19 (17)

— коэффициент симметрии зоны;

Смакс = 0,925(дЭ/у112) ^ ехр(А,); (18)

>/!+Х х г------

ак— = (дОГ/\^2)[1,45-— ехр(-—) - Зег1с(\'0,5(Н А.)) ехр(А.)] (19)

А. 2

— высоты зоны в подвижной и неподвижной фазах.

В качестве основного критерия реализации НР режима принято неравенство, противоположное неравенству Бреслера С.Е. для КВ режима, т.е.

(1 - Ь/и) < Д^ или Атч < 1/15, (20)

где ^ ф= Я2/15В — среднее время диффузии компонента в грануле; (I — Ь/и) (или Дд — среднее время нахождения компонента во всем пористом материале колонки (Дтх= (1-а)ГЬ/аи = ГУ^ Д- , Атх= О^/Я2). Взяв за основу неравенство (20) и соотношения (13), (15), (16), приходим к следующему перечню критериев реализации НР режима хроматографии:

к < 0,2 или тч* < 0,007 или т/ < 0,03 (21)

или в наглядной форме —

(К;/Г)<О,19,0(Л.*<О,1. (22)

ГЛАВА 4 АНАЛИЗ ТЕОРИИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ С УЧАСТИЕМ БАВ

Полная картина влияния параметров и, Я, Ь, Г, О на идентификацию пика на хроматограмме, на высоту, ширину и симметрию зоны (для НР режима) прослеживается по формулам (11)-(19) и рисункам 1-2. Это результаты теории. Некоторые экспериментальные результаты по этим вопросам приведены на рис. 3-4. Подчеркнем главные особенности.

Рис. 1. Элюционные кривые в относительных координатах для подвижной и неподвижной фаз в НР режиме. X : 0,05(1,1'), 0,08(2,2') 0,1(3,3'), 0,3(4); а) Ь = 1:1,6:2 (Г,ОД,и=соп51) или Г,:Г\: Г = 1:1,6:2 (ОД.и^согт); б) Бг04=1:2:6 (Г,Ь,иД=соп50 или и, ,,-и3,.:и4=1:0,5.0,166 (ГД),11,К-ео1Ы) или Я,.:!<,. 1:0.72:0,41 (Г.ПДи-согШ).

OJL Q2 *50 % 90

Рис.2. Влияние параметров системы (v,R,h,r,D) на относительные характеристики зоны в HP режиме (а) и в KB режиме (б).

Характеристики зоны: I- GlV* = (V* — V )/(ГУ ); 1(V* — VJ/(vR7D) — относительные объемы задержки; 2- '/W/rV ; V- iV/(vR^D) — относительные ширины; 3-lO 'C^/iQ/rV^); 3'- 10 ?CM"c/(QD/vR2);^"- 10:CM"7(QD/vR2) — относительные высоты. М=ЗГУ —const, N=l,8sD/vR2 = const.

V,w

Рис.3. Выходные кривые элюции антибиотика ОТЦ в НР режиме на сульфокатио-шгге дауэкс 50x4. s = 0,25см2; VJcm3): 0,92(1-3), 1,53(4-6), 3,06(7-9); R = (455±20)мкм; и(см/мин); 19,3(1), 2,0(2), 0,95(3)" 21,5(4), 4,7(5), 1,0(6), 21,9(7), 10,5(8), 4,7(9).

(\T-VCB)/VCT loo

1—|—Н-1—

J_0 еу^мин

;ugua »о-о—2'

ОД

ОЦ Q0

• Jks 10 6

V

-J—I—I—1—I—I_I—1—1_I_I—

iO 20 30 U 50

Рис.4. Влияние скорости элюции (v) и объема гранул в колонке (V ) на относительные объемы задержки антибиотика ОТЦ(1,1', 1"), витамина В, ,(2,2') н белков — БсА(З), ГМГ(4,4',4"), РНК-азы (5), ХТНГ (6). Пористые материалы: катионит дауэкс 50x4 (1,1',1"), s = 0,35 см2, V =(0,46 — 6,1) см3, R (мкм): 49"(1), 140 (Г), 455 (1"); биогель Р-100 (2',4',4",5,6), s = 0,965 см2, R = (105+20) мкм, V г= (9 — 55) см3, и = 0,11см/мин 0",5,6); биогель Р-150 (2.4). s = 1,8см3, R ~ 132мкм, Vcr= (23 — 103) см3; макропористое стекло (3). V = 15см3, R = 50мкм, s = 0,946 см2

Идентификация пика в традиционной (формула (2)) и в неравновесной (13) хроматографиях существенно различна: в первой объем удерживания возрастает линейно с увеличением параметров Г, h и не зависит от параметров u, R, D; во второй — он определяется всеми параметрами (1) системы (рис. 1,2), причем возрастание от параметров Г, h — квадратичное, от параметра D — линейное, а от параметров v и R2 — обратно пропорциональное. В наиболее полном виде обсуждаемое различие проявляется на зависимости 0*Lv от X (рис.2). Реальная величина 0(V* в HP режиме (Х<0,2) составляет менее 10% от идеальной величины (в установившемся KB режиме, А>30), иначе, — в HP режиме степень смещения точки С относительно точки С , на кривой

1 макс цснт.тяж. 1

составляет (90-100)%, что легко проверить по соотношению (tx_t*)/t = 1 - 0,5л. Предсказываемые особенности по идентификации пикав HP режиме хорошо согласуются с экспериментом (рис.3-4). Так, в системе с сильным взаимодействием «сорбент-сорбат» (Г = 111) увеличение скорости элюции или радиуса гранул приводит к уменьшению объема удерживания (V*) антибиотика; относительный же объем задержки (V* - Усв)/ГУсг для ОТЦ падает не только с увеличением параметров u, R, но и с уменьшением объема катионита в колонке (u = const). В эксклюзионном варианте (Г < 1) — картина аналогичная (рис.4): при малых объемах пористого материала в колонке или больших скоростях элюции «задержка» белков может вообще отсутствовать, т.е. белки могут выходить из колонки (в силу неравновесности движения) со свободным объемом (V ). Равновесное движение точки С наблюдается лишь при длительном нахождении белков в колонке (V /v > 10 час — для гемоглобина и V /v > 3 час — для альбумина); в последнем случае величина (V* - Vci))/V совпадает с величиной коэффициента Г. Предсказываемый теорией эффект снижения величины (V* - Vcb)/V с уменьшением объема пористого материала (V ) ярче выражен у более высокомолекулярного компонента (ГМГ), чем у ХТНГ и РНК-азы и исчезает для низкомолекулярного компонента (Вр), что коррелирует с уменьшением коэффициентов диффузии D при переходе от Вр к ГМГ (таблица). Экспериментальные данные по смещению объема удерживания белков от параметров u, h являются одним из факторов (неравновесных факторов) отклонения калибровочной зависимости (в координатах «V* - lgM») от линейной. Такие отклонения обнаружены и в эксклю-зионной хроматографии полимеров: линейность нарушается в области высоких молекулярных масс (М). Таким образом, представленные на рис.3-4 необычные экспериментальные результаты по влиянию параметров u, R, h, Г, D на идентификацию БЛВ по хроматограмме находятся в хорошем согласии с развитой теорией для HP режима.

Существенная неравновесность межфазного массообмена в колонке (Kd7 Г = aR(x,t*)/rCMiKc(x,t*) < 19%) обуславливает асимметрию элюционных кри-

вых (рис. 1,3): «крутой» передний фронт — из-за «проскока» вещества зоны вдоль колонки; «пологий» задний фронт, так как основная масса вещества сосредотачивается по всей длине колонки в поверхностном слое гранул, а затем медленно десорбируется из них. Коэффициент симметрии зоны имеет довольно малую величину (^ = 0,19 ед.). Зависимости высоты Смакс и ширины АУ зоны, движущейся в НР режиме, от параметров ииЯ парадоксальны в сравнении с традиционными зависимостями, характерными для гауссовых зон (рис.2). Действительно, с увеличением параметров и, Я высота пика растет в НР режиме и падает в КВ режиме. Эти закономерности наблюдались для всех задействованных в эксперименте БАВ, например, для ОТЦ — рис.3. Тенденция роста Смако с увеличением параметров и (или Я2) для НР режима близка к линейной, что подтверждается экспериментом и теорией, так как из формулы (18) при А. < 0,2 следует:

С икс = АиГч2+В, где А = даз/]0(Г\'сг)20, В = О.ЗК^/ГУ т. Необычные закономерности, обнаруживающиеся в движении зоны в НР режиме, расширяют возможности хроматографии БАВ. Обнадеживающие предпосылки для этого связаны с фактом, что положение пика на хроматог-рамме определяется не только параметрами Г, Ь, но и параметрами и, Я, Б. Следовательно, появляется возможность влиять на удерживание компонентов нетрадиционным способом — путем варьирования параметрами и, И.; кроме того, появляется возможность разделения веществ с близкими коэффициентами равновесия (Г ~ Г0) — за счет различия коэффициентов диффузии и О,. Теоретические же предпосылки обсуждаемых возможностей базируются на следующем соотношении:

0,5(ГД>, - Г 20 )

К =-—-<1,61. (23)

ра'д 1,59 ГуЭ, + 0,31 Г2202 Последнее следует из определения степени разделения К^ ^ , расширенного на асимметричные зоны, —

с - V V; - V/

К = —:-=-— (24)

ра1Л М + + Д12- ДУ,+ + ДУ2-и формул (13), (16). Легко видеть, что разделение в НР режиме возможно как в случае близких коэффициентов Г.. так и в случае близких коэффициентов Э :

К |= ,К | = 0^22-Г,2) . (25)

раи Г=г2 1,59 0+0,31 разд 0 =Е) 1,59 Г,2+0,31 г22

Как известно, в условиях КВ режима разделение веществ с Г1 = Г, невозможно (К = 0), а разделение веществ с О! = П2 определяется разницей коэффициентов Г и Г2 в первой степени.

Теоретический прогноз о реальности разделения смеси компонентов с близкими коэффициентами равновесия ^продемонстрирован на рис.5а. Экспериментальное же обоснование возможности хроматографии БАВ с близкими Г в НР режиме проведено на модельной смеси (рис.6)". Компоненты смеси из латекса и альбумина характеризовались близкими по величине коэффициентами Г и различающимися, примерно в четыре раза, коэффициентами Ц (в силу отсутствия взаимодействия обеих частиц с поверхностью макропористого стекла и полной доступностью для частиц пор стекла). Разделение смеси «латекс — белок» в заданной системе в условиях КВ режима невозможно, а в условиях НР режима оно реализовалось со степенью К = 0,43. Оценка же по формуле (25) дает несколько большую величину (0,48), что обусловлено, по-видимому, неполной адекватностью реальной и теоретической моделей (в теории не учитывались «продольные» диффузионные факторы мас-сопереноса в колонке). Механизм разделения в данном случае обусловлен только различием в коэффициентах диффузии веществ. Возможность разделения более сложной смеси (из вируса и примесных белков) методом экск-люзионной хроматографии в НР режиме продемонстрирована в работах [4,10]. Этим самым показана возможность организации экспресс-разделения БАВ в условиях НР режима и подтверждена адекватность выводов теории с экспериментом.

ГЛАВА 5 ОСОБЕННОСТИ НЕРАВНОВЕСНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ ВВОДА ПРОБЫ В КОЛОНКУ

При хроматографии веществ пробу вводят в колонку, как правило, методом «поршня» — сугубо неравновесным способом. Однако, бывают и исключения из этого правила: смесь распределяют в верхней части колонки до равновесного или до некоторого промежуточного состояния и затем проводят элюцию с конкретной скоростью. Вопрос о равноценности или неравноценности методов ввода пробы на закономерности хроматографии имеет принципиальное значение именно для медленно диффундирующих веществ, так как время предварительного массораспределения вещества пробы может до-

Идея хроматографии данной смеси в условиях НР режима и теоретическое обоснование метода принадлежат Лебедеву Ю.Я., а практическое воплощение осуществлено совместно с Мчедлишвили Б.В., Красильниковым И.В., Коликовым В.М. на кафедре биофизики Ленинградского политехнического института [4].

w ад (v-v^/rv

ст

Рис.5. Хроматограммы идеализированной смеси из компонентов «1», «2», «3» в HP режиме при вводе пробы в колонку методами «поршня» (а) и «посадки» (б). Г =Г,=r,=r=const; D :D,:D = 1:2:6, h, R, u = const; X.=0,05, X =0,1, X =0,3; К,,"™ = 0,23(a) = 0,06(6) — D/D, = 2; K,/™ = 0.40(a) = 0,10(6) — D/D;= 3; К, = 0,73(a) = 0,21(6) —D3/D2 = 6.

2\k 8

21 h |6 8 iO V,WI VCB(4B+Vnop)

Рис.6. Эксклюзионные хроматограммы смеси из латексных части (г=940А) и сывороточного альбумина (г=50А) на макропористом стекле (г=8000А). вхЬ = 0,7x9,2 = 6,44см3 ; Я = ЮОмкм; С = 1,9опт.ед/мл при 219 нм; С , = (4 — 10)опт.ед/мл при 280нм; 1 — латекс, Г =Т," 0=1,8х10-9 см2/сек; 2 — белок,"Т=1, 0=6,6х10'9 см2/сек; и(см/мин): 0,01 (а) — КВ режим, 57(6) — НР режим.

стигать десятков часов, что скажется на производительности хроматографии в целом, с какими бы целями она не проводилась — с аналитическими, либо препаративными.

Количественные различия в методах ввода пробы удобно охарактеризовать с помощью параметра qR"p:

qR,,p = QC''Q , 1 - qR"p = Qa/Q . (26)

Он имеет смысл долевой массы целевого компонента, сосредоточенной в верхнем слое подвижной фазы; Qc, Q" — истинные массы компонента в подвижной и неподвижной фазах: Q = (Q* + Qa) — общая масса целевого компонента в пробе. Некоторые типичные варианты ввода пробы характеризуются следующими значениями параметра qR'lp : метод «поршня» (qR"p =1) — проба полностью сосредоточена во внешнем растворе; метод «посадки» (q "р = 0) — проба полностью сосредоточена в пористом материале; метод «равновесного массораспределения» qR"p= (1+Г(1 - а)/а)~'= ( H 1,5Г)"', при этом в экск-люзионной хроматографии 0,4 < q np < 1, а в хроматографии с взаимодействием 0 < qR"p < 0,4); метод «эквимолярного распределения» (qR"p = 0,5).

В диссертации показано, что математическая формулировка хроматогра-фической задачи, отвечающая различным способам ввода пробы, сводится к системе уравнений (3),(4) с краевой функцией f(t) в виде

ДО = (Q/v){qR"" S(t) + 3(D/R2)( 1 - qR"p)[(7rtD/R2)''2 - 1]}. (27) По сути можно воспользоваться общими решениями (6)-(7), подставив в них выражение (27). В результате приходим к решению, адекватному произвольному способу введения пробы; для подвижной фазы оно таково: С = (QD/vR2){ qR"p QJ2 7t'\3'2) ехр(-А2/4тх) + + 3(1 - qr"p)[(7ttn ) 1/2 ехр(-А2/4тх) - erfc(A./2Txi;2)f}exp(A) . (28) В частном случае — методе «поршня» выражения (27), (28) трансформируются в выражения (10), (11). В другом частном случае — методе «посадки», выражение (28) упрощается до

С = 3(QD/vR2)[(Ttix )-"2 ехр(-А.74тх) - erfc(X/2Tx1,2)]}exp(À.) . (29) Некоторые представления о закономерностях движения зоны в HP режиме при произвольных значениях параметра qRnp можно видеть из рис.7. В системах с фиксированными параметрами (1) (т.е. при A=const) при увеличении параметра q "р (т.е. по мере перехода от метода «посадки» к методу «поршня») неравновесность режима все более усугубляется; усиливается асимметрия зоны; наблюдается более значительное смещение объема удерживания относительно центра тяжести зоны и более заметное «сжатие» зоны. В двух предельных случаях (методах «поршня» и «посадки») различие в величине

объемов удерживания можно видеть как из рис.8, так и из сравнения соотношения (13) с соотношением

* t*- h/u V* - V за.

etvl= -=-ü- =--(30)

• qRnp =0 (1 - a) rh/cxu rvcr 2(1+A.)

Экспериментальные данные на рис.8 находятся в качественном согласии с выводами теории: при переходе от метода ввода пробы с qR"p = 0,006 к вводу пробы методом «поршня» (qRlip =1) свойства зоны все более неравновесны и, следовательно, методы ввода пробы неравноценны. Эта тенденция ярко проявляется в HP режиме (Л. = 0,1, рис.7 и X = 0,29, рис.8) и постепенно нивелируются при переходе к системам с большими значениями координаты а. (рис.7,8), т.е. при переходе к КВ режиму движения зоны. Так, в крайних случаях qR"p = 0 и qRnp = 1 (рис.7) относительная разница концентраций и относительное смещение пиков

2(Cq""p=r Cq""p=0)/(CqR%=l + S^W' 2(Vq*Rnp=0 " VqR""=^

составляют в HP режиме соответственно 15% и 9%, а в КВ режиме ~ 0% и 0%. В диссертации показано, что влияние параметров (1) на свойства движения зоны (при любом фиксированном параметре qRnp) качественно аналогично влиянию, которое имеет место в методе «поршня» (рис. 1а, кривые 1-3).

Неравноценность методов ввода пробы в колонку проявляется не только в свойствах движения зоны, но и в эффективности самой хроматографии в HP режиме (рис.5). На рис.5 продемонстрированы прогнозы теории по разделению смеси с близкими коэффициентами межфазного равновесного массо-распределения Г., т.е. для случая, нереализуемого традиционной хроматографией. Разделение такой смеси в HP режиме возможно за счет различия коэффициентов диффузии компонентов. Как видно, разделение улучшается по мерс перехода к смеси с более различающимися коэффициентами диффузии; эта тенденция прослеживается для обоих методов — «поршня» и «посадки». Наконец, однозначно следует вывод о неравноценности методов ввода пробы на процесс хроматографии: наиболее рациональным (по эффекгивности) следует считать метод «поршня». Эффективность разделения при методе «поршня» превышает эффективность разделения при методе «посадки» примерно в 3,5 раза. Таким образом, хроматографию веществ в HP режиме рационально проводить методом «поршня», так как в этом случае повышается эффективность и производительность процесса разделения.

_с__sc

QD/tTR2

Рис.7. Выходные элгациоиные кривые в относительных координатах при различных методах ввода пробы в колонку, а) Х.=0,1(НР режим), б) X = 25 (KB режим). q,lp : 1(1, Г) — метод «поршня»; 0,75(2); 0,5(3) — метод «эквимолярного распределения»; 0,25(4); 0(5,5') — метод «посадки», h/h = 250 при D,F,u,R = const или Г6/Га = 250 при D,u,R,h = const.

Чкл

Рис.8. Экспериментальные элюционные кривые для антибиотика ОТЦ в колонке с катионитом дауэкс 50x4. Уп = 0.5мл, Сп ^ = 7мг/мл; а) и = 33,3см/мин, X = 0,29; б) и = 2,99см/мин, X = 3,4; q,|t™ 1(],Г) — метод «поршня», 0,006(2,2') — метод «равновесного массораспределения».

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Феноменологическая теория сугубо неравновесной хроматографии, построенная на основе асимптотического (для начальных времен) интегрального уравнения внутридиффузионной кинетики межфазного массообмена, — теория информативная, так как устанавливает новые элементы: аналитические выражения для концентрационных профилей зон в каждой из фаз колонки; аналитические соотношения между основными характеристиками зоны и физико-химическими и гидроструктурными параметрами хроматографической системы; соотношение для эффективности разделения компонентов; критерии реализации НР режима; набор безразмерных переменных (к, т . Чклр), упрощающих анализ.

2. Закономерности движения зоны в НР режиме существенно отличаются от традиционных: прежде всего, из-за высокой асимметричности зоны, отсутствия равновесной точки в пределах зоны, смещения пика (относительно его положения равновесия) на хроматограмме от скорости элюции или дисперсности гранул, парадоксального увеличения высоты зоны с ростом скорости элюции или размера гранул. Особенности НР режима усугубляются по мере уменьшения параметров Г, О, И и увеличения параметров и, К, т.е. по мере уменьшения безразмерной координаты X.

3. Закономерности неравновесного движения зоны ярко проявляются как в системах с сильным «сорбент-сорбат» взаимодействием (ионообменный вариант), так и в системах, где это взаимодействие отсутствует (эксклюзион-ный вариант); в этом смысле они универсальны.

4. Идентификация пика на хроматограмме (по объему удерживания) определяется всеми параметрами системы, как физико-химическими (Г, О), так и гидроструктурными (и, Я, Ь). Этот вывод существенно исправляет основное утверждение классической хроматографии о зависимости объема удерживания компонента лишь от параметров Г, Ь.

5. В условиях НР режима хроматографии возможно фракционирование веществ с близкими молекулярно-равновесными свойствами; в этом случае разделение обусловлено различием молекул в молекулярно-кинстических (диффузионных) свойствах.

6. В НР режиме хроматографии различным методам ввода узкой пробы в колонку отвечают различные свойства в движении и разделении компонентов; наиболее рациональным методом ввода пробы следует считать метод «поршня».

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ, ОТРАЖАЮЩИХ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебедев Ю.Я., Самсонов Г.В. Элютивная неравновесная хроматография органических веществ с учетом их диффузии в зернах сорбента // Коллоидный журнал. 1975. Т.37. №6. С. 1109-1115.

2. Самсонов Г.В., Елькин Г.Е., Лебедев Ю.Я. Исследование режимов неравновесной динамики сорбции и хроматографии при медленной диффузии // Рефераты докладов XI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Физическая химия. Химическая физика и катализ. Электрохимия. №3. Изд. «Наука», Москва, 1975, стр.83.

3. Лебедев Ю.Я., Самсонов Г.В. Анализ решений уравнений неравновесной динамики сорбции вещества при линейной изотерме и учете внутридиф-фузионной кинетики // Журнал физической химии. 1976. Т.50. №2. С.534-536.

4. Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В., Лебедев Ю.Я., Красилъников И.В. Разделение биополимеров методом жидкостной ситовой хроматографии в условиях неравновесного режима. // Коллоидный журнал. 1977. Т.39. №3. С.562-567.

5. Лебедев Ю.Я. Анализ решений уравнений динамики сорбции при линейной изотерме и учете диффузионной кинетики. Неустановившийся режим //Жури. физ. химии. 1977. Т.51. №9. С.2387-2389.

6. Лебедев Ю.Я., Самсонов Г.В. Закономерности элютивной динамики сорбции антибиотиков на сульфокатионитах // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции «Биологически активные вещества природного и синтетического происхождения». Октябрь 1977. стр. 11-12, Ленинград. 1977.

7. Лебедев Ю.Я., Мчедлишвили Б.В. Разделение полимеров методом неравновесной жидкостной ситовой хроматографии // Тезисы докладов I Всесоюзного симпозиума «Молекулярная жидкостная хроматография», стр.20, Черноголовка, 1979.

8. Лебедев Ю.Я. Кинетико-динамические закономерности сорбции вещества при линейной изотерме и диффузионном механизме межфазного обмена // Коллоидный журнал. 1979. Т.41. №6. С.1087-1094.

9. Лебедев Ю.Я. Теоретические аспекты препаративной хроматографии биополимеров // Тезисы докладов I Всесоюзной конференции «Хроматография в биологии и медицине». Москва. 1983. С. 11-12.

10. Лебедев Ю.Я., Мчедлишвили Б.В. Степень разделения в ситовой препаративной хроматографии вирусных суспензий // Тезисы докладов III Всесоюзного симпозиума «Молекулярная жидкостная хроматография». Рига. 1984. С.5-7.

11. Лебедев Ю.Я. Теоретические аспекты препаративной хроматографии биополимеров // Сб. научных трудов «Хроматография в биологии и медицине». Москва. 1985. С.71-83.

12. Лебедев Ю.Я. Неравновесная препаративная хроматография в биотехнологии // Тезисы докладов Международного симпозиума «Хроматография в биологии и медицине». Москва. 2-ой МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова. 1986. С.160-161.

13. Лебедев Ю.Я. Влияние скорости элюции в ЖСХ на разделение веществ с близкими коэффициентами межфазного распределения // Тезисы докладов IV Всесоюзного симпозиума «Молекулярная жидкостная хроматография». Москва. Инст. физичес. химии АН СССР. 1987. С.181-183.

14. Подосенова Н.Г., Лебедев Ю.Я. О корректности применения ситовой хроматографии к анализу ММР полимеров // Тезисы докладов V Всесоюзного симпозиума «Молекулярная жидкостная хроматография». Рига. 1990. С. 100.

15. Подосенова Н.Г., Лебедев Ю.Я. О корректности применения ситовой хроматографии к анализу молекулярно-массового распределения полимеров // Журнал физической химии. 1991. Т.65. №10. С.2729-2735.

16. Лебедев Ю.Я. Анализ отклонения межфазного массораспределения от равновесия для хроматографической зоны // Журнал физической химии. 1993. Т.67. №4. С.765-768.

17. Лебедев Ю.Я. Режимы движения хроматографической зоны для случая внутридиффузионной кинетики межфазного массообмена // Журнал физической химии. Т.68. №10. С. 1733-1739.

18. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ // Тезисы докладов VII Всероссийского симпозиума «Молекулярная жидкостная хроматография». Москва. 1996. С.23.