Хронокондуктометрический метод определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов в бифидо-, лактосодержащих и дрожжевых препаратах

Асташкина, Анна Павловна

Хронокондуктометрический метод определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов в бифидо-, лактосодержащих и дрожжевых препаратах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Асташкина, Анна Павловна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Томск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Хронокондуктометрический метод определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов в бифидо-, лактосодержащих и дрожжевых препаратах»

Автореферат диссертации на тему "Хронокондуктометрический метод определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов в бифидо-, лактосодержащих и дрожжевых препаратах"

Vх'

На правах рукописи

Асташкина Анна Павловна

ХРОНОКОНДУКТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СУММАРНОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИФИДО-, ЛАКТОСОДЕРЖАЩИХ И ДРОЖЖЕВЫХ ПРЕПАРАТАХ

Специальность 02.00.02 - аналитическая химия

2 7 ЯНВ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Томск-2010

4843236

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» на кафедре физической и аналитической химии

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Бакибаев Абдигалп Абдиманапович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Темерев Сергей Васильевич

кандидат химических наук Хустенко Лариса Анатольевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Казанский государственный технологический университет

Защита состоится 9 февраля 2011 г. в 1630 час. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при ГОУ ВПО НИ ТПУ по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ГОУ ВПО НИ ТПУ по адресу: 634050, г. Томск, ул. Белинского, 53.

Автореферат разослан_декабря 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

/ /

кандидат химических наук, доцент <37 Гиндуллина Т.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ухудшение экологической обстановки, стрессы, нарушение питания привело к разработке и практической реализации концепции «пробиотики и функциональное питание», разработанной в последнее десятилетие XX века. В настоящее время производится огромное количество новых биопрепаратов и продуктов питания для человека, регулирующих равновесие кишечной микрофлоры, созданных на основе живых микроорганизмов (лактобактерии, бифидобактерии, дрожжи) и продуктов их жизнедеятельности. Ассортимент таких препаратов представлен достаточно широко, контроль качества которых необходимо проводить на всех технологических стадиях их производства. Основными критериями качества препаратов является анализ на активность и количество живых клеток в препарате, которое регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.

В основном преобладают микробиологические методы, которые требуют больших затрат времени, и позволяют проводить лишь качественный или полуколичествеппый анализ. Широко распространенные оптические методы анализа трудоемки и требуют использование дорогостоящих реактивов.

Электроаналитические методы относятся к наиболее мощным и распространенным в России методам аналитической химии. Эти методы играют значительную роль в создании детекторов для хроматографических и родственных методов, а также очень важны для разработки химических сенсоров и биосенсоров. Популярность электрохимических методов в различных областях, обусловлена простотой в приборном оформлении, низкой стоимостью, оперативностью и легкостью автоматизации. Потенциометрические и вольтамперометрические методы используются для определения ферментативной активности (кислотообразующей активности и метаболической активности). Ограничение электрохимических методов обусловлено сложностью пробоподготовки объектов анализа.

Кондуктометрический метод анализа пока не нашел широкого применения в области определения активности по сравнению с другими физико-химическими

методами, но широко применяется для контроля роста микробной биомассы в селективных питательных средах. Это связано с высокой чувствительностью метода, экспрессностью и относительно низкой стоимостью анализа.

Поэтому поиск новых вариантов электрохимических методов для определения активности микроорганизмов и разработка экспрессных и высокочувствительных методик количественного определения активности микроорганизмов в препаратах для контроля качества является актуальным и имеет большую практическую значимость.

Исследования, положенные в основу диссертационной работы, выполнялись в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» (У.М.Н.И.К.) (2008-2010 гг.), номер государственного контракта № 8846 и в рамках федеральной целевой программы «Проведение научных исследований научными группами под руководством целевого аспиранта» (2010-2011гг), номер государственного контракта П54 от 02.04.2010г.

Цель работы: хронокондуктометрическое исследование закономерностей ферментативных превращений субстратов бифидо-, лактобактериями и дрожжевыми клетками и разработка способа определения их суммарной ферментативной активности (СФА).

Для достижения цели поставлены следующие основные задачи:

1. Разработать основные положения и кинетическую модель субстратного способа определения СФА микроорганизмов.

2. Разработать принципы методов определения СФА микробных суспензий субстратным способом с использованием хронокондуктомерии и хроно-рН-метрии.

3. Определить значения СФА микроорганизмов в некоторых пребиотических препаратах хронокондуктометрическим методом, используемых для контроля качества препаратов.

4. Провести исследование влияния температуры и природы субстратов с целью разработки теста на соответствия препарата.

5. Разработать методологию создания макета прибора «Анализатор метаболической активности биокатализаторов» для проведения экспресс измерения суммарной ферментативной активности микробных суспензий.

Научная новизна данной работы заключается в следующем:

- Впервые предложен субстратный способ количественного определения СФА микроорганизмов.

- Впервые проведено количественное определение СФА в препаратах, содержащих пробиотические микроорганизмы штаммов ¡..¡'¡шиагшп 8Р-АЗ, Ш/к1итЬас1егтт Ь$(1ит и Ъфйит айо\е&сепйв и дрожжевые культуры рас Еасскаготусев сегех-'тае и Басскаготусез саг!.1Ье^епз)з хронокондуктометрическим и хроно-рН-метрическим методами.

- Впервые показано, что совокупность значений СФА по определенному набору субстратов микроорганизмов в препарате является качественной характеристикой препарата.

- Впервые показано, что температурная зависимость СФА микроорганизмов по субстрату в исследованных препаратах являются качественной характеристикой препарата.

Практическая значимость. Разработан субстратный способ количественного определения активности (суммарной ферментативной) микроорганизмов хронокондуктометрическим и хроно-рН-метрическим методом, характеризующийся простотой в исполнении, относительно низкой стоимостью анализа, экспрессностыо, настройкой на любой препарат, содержащий живые клетки микроорганизмов.

Определены значения СФА микроорганизмов в препаратах, содержащих пробиотические микроорганизмы штаммов Ь.Р1ап1агит 8Р-АЗ, В'фйитЪас1егшт Ь'фйит и В1/1с1ит асЬэкэсепИя и дрожжевые культуры рас Васскаготусея сегехчзгае и БассЬаготусез сагЬЬе^епз1$, хронокондуктометрическим и хроно-рН-метрическим методом и предложено использовать значение СФА микроорганизма по субстрату в качестве параметра контроля качества препарата.

Предложено использовать температурные зависимости СФА по субстрату и

совокупности СФА препаратов по различным субстратам как параметр соответствия при контроле качества препарата.

Обоснована целесообразность применения кондуктометрического метода для контроля стационарной фазы роста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов (лакто- и бифидобактерий) в технологическом процессе. Предлагаемый метод позволяет более точно определить технологически важный момент перехода экспоненциальной в стационарную фазы кривой роста микробной суспензии по сравнению с используемыми.

Разработанный алгоритм определения СФА микробных суспензий хронокондуктометрическим методом реализован в макете прибора1 «Анализатор метаболической активности биокатализаторов» (Патент на полезную модель РФ № 76340 от 11.04.2008), который прошел апробацию на действующих производствах предприятий г. Томска (филиал ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Томск ФГУП НПО «Вирион» и ОАО «Томское пиво») для контроля биотехнологических процессов.

На защиту выносятся:

1. Основные положения субстратного способа определения активности микробных суспензий;

2. Алгоритм методик количественного определения СФА микробных суспензий в препаратах субстратным способом с использованием методов кондуктометрии и рН-метрии).

3. Значения СФА некоторых пребиотических препаратов по субстрату для экспрессной оценки активности препаратов.

4. Совокупность значений СФА некоторых пребиотических препаратов по определенному набору субстратов как параметр качества препарата в тесте на соответствие.

5. Температурные зависимости СФА некоторых пребиотических препаратов по субстрату как параметр качества препарата в тесте на соответствие

Апробация работы. Основные результаты работы представлены устными и

1 Макет прибора изготовлен ООО « Ыш ИТМ» г. Томск

стендовыми докладами на конференции «Биотехнология XXI века: проблемы и перспективы» (Москва, 2007), Региональной научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008), VIII Научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), X Юбилейной всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2010), Евразийском симпозиуме по инновациям в катализе и электрохимии (Алматы, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 6 статей, 1 патент на полезную модель и 10 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 121 странице, содержит 9 таблиц, 33 рисунка и библиографию из 140 наименований. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и приложения.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен обзор литературы, в котором описана современная классификация пробиотических препаратов. Обобщены и классифицированы существующие методы определения ферментативной активности живых клеток, способы и параметры контроля качества продуктов, содержащих дрожжевые и пробиотические клетки.

Во второй главе приведены теоретические основы ферментативного катализа, сформулированы основные положения предлагаемого субстратного

способа, разработана кинетическая модель субстратного способа и предложен математический аппарат для обработки хронокондуктометрических и хроно-рН-метрических данных.

В третьей главе описаны условия проведения экспериментов, способы приготовления растворов, технические характеристики используемого аналитического оборудования.

В четвертой главе приведены значения СФА бифидо-, лактосодержащих и дрожжевых продуктов, результаты исследования влияния на СФА концентрации клеток, температуры, природы субстрата. Приведены результаты кондуктометрического исследования прироста пробиотических культур в процессах промышленного производства.

Основное содержание работы Для определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов пребиотических препаратов впервые предложен субстратный способ, основанный на превращении внесенного определенного субстрата ферментами живых клеток в условиях их голодания в продукт (метаболит) и определении его количества. Изменение концентрации метаболита регистрируется подходящим электрохимическим методом.

Основные положения субстратного способа определения СФА живых клеток

Процесс превращения субстрата (Б) в основной продукт (Р) при участии ферментативных комплексов живых клеток с концентрацией (Сея) при определенной температуре (1:) может быть представлен следующей схемой:

Суммарную скорость всех последовательно и параллельных реакций (н') можно описать кинетическим уравнением (1) и определить по скорости образования основного продукта реакции:

XV = с1СР/с1т = к Скд-Сб (1)

где Сх и С„ - текущие концентрации субстрата и живых клеток, СР -концентрация продукта, к' - константа скорости реакции второго порядка, т - время измерения. Для упрощения модели формулируем условия проведения анализа:

1. концентрация субстрата Cs должна быть достаточно высокой, чтобы за время измерения ее расход был малозначительным (Cs=const);

2. в анализируемом образце должны отсутствовать дополнительные источники питания микроорганизмов (ZCs, = 0) для размножения микроорганизмов (Cra=const);

3. в анализируемом образце должны отсутствовать ингибиторы (Q = 0) и яды приводящие к гибели клеток и деструкции ферментных комплектов живых клеток;

4. скорость образования и расходования всех промежуточных продуктов (веществ) одинаковы в течение всего времени протекания процесса в стационарном режиме, то С; = const; dQ/dt = 0.

Тогда скорость утилизации субстрата Cs ферментами живых клеток См будет пропорциональна изменению концентрации метаболитов СР при соблюдении вышеуказанных условий (CKJICS = const) и равна константе скорости нулевого

где к = к' Скд-Сэ - константа скорости нулевого порядка.

После интегрирования (2) получаем уравнение прямой, тангенс угла наклона которой равен константе скорости реакции (к):

где Ср0 -концентрация продукта в начальный момент времени (т = 0). Константа скорости не является относительным параметром, поэтому впервые введено понятие суммарной ферментативной активности по субстрату (а8), характеризующее активность 1 клетки.

Отношение константы скорости реакции (к) к количеству клеток (Скл) (или концентрации ферментов) определяем как удельную суммарную ферментативную активность (СФА) микроорганизма по отношению к субстрату (Б) при анализируемой температуре:

порядка:

if = dCp/dT = k

(2)

Ср = Ср0 + кт,

(3)

При выполнении всех вышеперечисленных условий субстратный способ характеризует анализируемый объект по определенному субстрату.

Методологически объект исследования разводится в дистиллированной воде, вносится субстрат и определяется скорость образования основного продукта по изменению удельной электрической проводимости или показателя кислотности.

Природа и содержание продуктов, образующихся в условиях анализа, определены на основании литературных данных, данных хромато-масс-спектрометрического и титрометрического методов. В частности, для дрожжей в аэробных условиях основным электропроводящим продуктом является угольная кислота, образующаяся в результате гидролиза углекислого газа, для лактобактерий и бифидобакгерий - молочная кислота.

Для пересчета удельной электропроводности (мСм/м) слабодиссоциирующего электролита в его концентрацию теоретически получено выражение, при условии что 1-а (4) и рассчитаны коэффициенты А степенной (п=2) зависимости для основных метаболитов:

СР = , , =А-к\ (5)

где Ср - концентрация основного метаболита, моль/дм3, Д^ - молярная электрическая проводимость при бесконечном разбавлении, См-см7моль; К„ - константой диссоциации кислоты, моль/дм3,КГ— значение удельной проводимости раствора метаболита, мСм/м, при этом: для углекислоты - А=1,45* 10"3, для молочной кислоты - А=5,97* 10"6.

Степенная зависимость концентрации основного диссоциирующего продукта в анализируемой среде от ее электропроводности подтверждена экспериментально (5):

л-(к-,-*,)', (6)

где А - множитель при степенной функции, к0 и г, - значение начальной и текущей удельной электропроводности и (мСм/м), I - показатель степени.

Из экспериментальных данных вычислены параметры зависимости

концентрации угольной и молочной кислот от электропроводности, которые составили А = 8'10"4, /=1,997 (Я = 0,998), молочной - А = 2'10"5, /=1,733 (Я = 0,998) при 20 °С, соответственно.

Выражение (5) использовано для перевода экспериментальных данных электропроводности в единицы концентрации основного метаболита.

1. Определение СФА хропокпдуктометрическнм методом 1.1. Значения СФА дрожжевых препаратов

Из литературных данных известно, что ферментативная активность дрожжевых препаратов обычно определяется по зимазной и мальтазной активности с использованием газометрического метода (выделение СОг), продолжительность анализа при этом составляет не менее 60 минут.

Нами предложен экспрессный (15 минут) хронокондуктометрический субстратный способ определения ферментативной активности препаратов. Способ основан на регистрации изменения электропроводности анализируемой среды дрожжей в результате ферментативного превращения внесенного субстрата. В качестве субстратов выбраны углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза), которые расщепляются до углекислоты и воды (основные метаболиты). Зависимости изменения электропроводности и концентрации углекислоты от времени в результате ферментативного превращения субстратов представлены па рис. 1-2. Концентрацию углекислоты рассчитывали по выражению (6).

Из рис. 1-2 видно, что временная зависимость от концентрации основного метаболита имеет более выраженный линейный характер. Константа скорости ферментативных реакций равна тангенсу угла наклона регрессионной прямой.

Тангенс угла наклона линейного участка на графике зависимости концентрации основного метаболита от времени равен константе скорости нулевого порядка [моль/(дм3-с)]. Тогда СФА, выраженная в единицах концентрации [моль/(с-кл.)], показывает количество молей основного метаболита, образовавшееся за секунду при расщеплении субстрата одной клеткой, и пригодна для сравнительного анализа.

Рис. 1. Изменение проводимости Рис. 2. Изменение концентрации анализируемой среды (прессованные углекислоты в анализируемой среде дрожжи) с внесением субстратов: 1- (прессованные дрожжи) при внесении глюкозы (к = 0.0125), 2 - фруктоза (к = субстратов: 1-глюкозы (к = 7-10"5), 2 -0.0106), 3- сахароза (к = 0.0077), 4- без фруктоза (к = 6-10"5), 3-сахароза (к = 3-10"5) I внесения субстрата (к = 0.0003) I = 20°С. = 20°С.

Каждый из субстратов расщепляется с определенной скоростью и характеризуется константой скорости реакции расщепления (ферментации). Значения СФА дрожжевых препаратов по различным субстратам (аБ) в единицах концентрации (выражение 6) представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Значения СФА дрожжей в анализируемых препаратах по углеводным субстратам при I = 20°С.

а*Ч013 моль/(скл.)

Субстрат препарат

Пивоваренные низовые дрожжи ЗассЬаготусеБ саг1зЬе^епз18 Сухие хлебопекарные дрожжи «Сафт-момент Прессованные хлебопекарные дрожжи

Глюкоза 0,14±0,02 3,0±0,5 2,1 ±0,3

Фруктоза 1,1±0,2 0,8±0,1 1,9±0,3

Сахароза 0,27±0,04 1,7±0,3 1,6±0,2

Мальтоза 0,8±0,1 1,5*0,2 1,1±0,2

Значения СФА хлебопекарных дрожжей по мальтозе и глюкозе, найденные предлагаемым способом, хорошо согласуются со значениями СФА, рассчитанными по нормативам газометрического метода определения мальтазной и зимазной активности хлебопекарных дрожжей - 1,54 10"13 моль/(с-кл.) и 2,2 10"13 моль/(с-кл.), соответственно. Кроме того, субстратный способ определения СФА в три раза менее продолжительный (10 мин), чем газометрический (не менее 60 мин).

Оценено влияние потерь углекислого газа в атмосферу при определении СФА дрожжевых препаратов, которые составляют 0,1% от образовавшегося во время анализа, что как минимум на порядок ниже погрешности метода (2%), поэтому потерями углекислого газа во время анализа можно пренебречь.

Установлено, что значение СФА в условиях эксперимента в диапазоне концентраций клеток от 105 до 4-108 кл./см3 остается постоянным.

Предложенный субстратный способ хронокондуктометрического определения СФА препаратов имеет высокую чувствительность и экспрессность и рекомендован для разработки теста для определения качества дрожжесодержащих препаратов.

1.2.3начешш СФА лакто- и бифндосодсржащих препаратов

Известно, что активность (специфическая) большинства пробиотических препаратов традиционно определяют по количеству жизнеспособных клеток в препарате и кислотообразующей способности, выраженной в градусах Тернера, продолжительность анализа при этом составляет 72 часа

Нами впервые предложено использовать для контроля качества пробиотических препаратов значение СФА. Хронокондуктометрическим субстратным способом определено значение СФА бифидо- и лактосодержащих препаратов. В качестве субстратов выбраны углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза), которые ферментируются до молочной 90% и уксусной 10% кислот (основные метаболиты). Значения СФА пробиотических препаратов в единицах концентрации представлены в таблице 2. Концентрацию основных метаболитов рассчитывали по выражению (6).

Таблица 2.

СФА пробиотических микроорганизмов (лакто- и бифидобактерий) по углеводным субстратам в пробиотиках при t = 20 °С.

препарат а8'-10,4моль/(кл. с)

Глюкоза Фруктоза Лактоза Мальтоза Сахароза

Бифидобактерин 2,1 ±0,3 4,2±0,6 0,006±0,001 4,9±0,7 0,7±0,1

Бифидогум 1,3±0.2 1,7±0,3 0,013 ±0,002 10,2±1,5 1,3±0,2

Лактобактерин 0,08±0,01 0,09±0,01 0,02±0,003 0,04±0,01 0,04±0,01

Ацидогум 0,020±0,001 0,020±0,003 0,022±0,003 - 0,04±0,01

Лактогум 0,013±0,002 0,010±0,001 0,021±0,001 - 0,04±0,01

Как видно, из табл. 2, микроорганизмы препаратов характеризуются различными значениями суммарной ферментативной активности. Различия микроорганизмов по субстратной специфичности обусловлено биохимическими особенностями лакто-, и бифидобактерий и технологией изготовления препарата.

2. Определение СФА хроно-рН-метрнческим методом Субстратный способ также впервые реализован в хроно-рН-метрическом методе. Альтернативный метод определения СФА микроорганизма по субстрату основан на регистрации изменения кислотности среды, с последующим пересчетом в концентрацию основного метаболита (выражение 7).

Ср =В-{Ю~Р" -1(ГгН°)\ (7)

где Ср - концентрация основного метаболита (углекислота для дрожжей или молочная кислота для пробиотических микроорганизмов), моль/дм3, В - экспериментально найденный множитель степенной функции, pH - текущий показатель кислотности анализируемой среды, рНо- начальный показатель кислотности среды.

Из экспериментальных данных вычислены параметры зависимости концентрации угольной кислоты и молочной кислоты от электропроводности, которые составили для угольной кислоты В = 3'10"9, (R = 0,9987), молочной - В = 2-10"IO,(R = 0,998) при 20°С.

Значение СФА вычислено по выражению 3, в котором константа скорости ферментативной реакции определена из временной зависимости концентрации

основного метаболита. В таблице 3 представлены значения одновременного определения СФА препаратов по глюкозе хроноко иду кто метрическим и хроно-рН-метрическим методами.

Таблица 3.

Значение СФА микроорганизмов в анализируемых препаратах по глюкозе, полученные двумя методами при I = 20°С (в условиях повторяемости, п = 9).

Препарат аь-10имоль/(с кл.)

Хронокондуктометрический метод Хроно-рН-метрический

Сухие хлебопекарные дрожжи «Сафт-момент 30±5 25±3

Прессованные хлебопекарные дрожжи 21±3 22±4

Пивоваренные дрожжи 1,4±0,2 1,1 ±0,3

Лактобактерин 0,08±0,01 0,05±0,0)

Бифидобактерин 3,1 ±0,4 3,0±0,6

Бифидогум 1,3±0,2 1,0±0,2

Полученные данные практически совпадают по значениям для двух методов. Несмотря на простоту аппаратурного оборудования рН-метра, на точность его измерения влияет много факторов (стабильность электрода сравнения, чувствительность к электрическим шумам). Поэтому случайная погрешность измерений хроно-рН-метрическим методом заметно выше хронокондуктометрических.

3. Влияние температуры на значение СФА микроорганизмов Важным фактором при определении активности микробных суспензий, оказывающим влияние на скорость ферментативного процесса и константу скорости, является температура.

Исследовано влияние температуры на СФА бифидо-, лактосодержащих препаратов и дрожжей в диапазоне от 4 °С до 55 °С по углеводным субстратам. Зависимость значения СФА микробных суспензий от температуры имеет сложный характер, что обусловлено генотипом и физиологическим состоянием культуры, изменением растворимости и степени диссоциации метаболитов и

подвижностью ионов в анализируемой среде. Характер зависимости СФА дрожжей в единицах электропроводности по глюкозе представлен на рисунке 3.

Рис. 3. Зависимость СФА дрожжевых клеток по глюкозе от температуры: прессованные хлебопекарные дрожжи, ■ - пивоваренные дрожжи, ▲ - сухие хлебопекарные дрожжи.

Из рис. 3 видно, что каждый препарат дрожжевых клеток характеризуется активностью выше среднего в диапазоне температур: для хлебопекарных сухих -15-25°С, прессованных - 23-33°С, пивных 12-18°С. Найденные диапазоны можно использовать в технологических процессах с участием данных микроорганизмов с максимальной эффективностью. Полученные зависимости также позволяют устанавливать температурные условия хранения препаратов.

Для пробиотических препаратов исследовано влияние температуры на значение СФА® микробных суспензий. Максимальные значения СФА исследованных препаратов представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Температура максимального значения СФА микроорганизмов в пробиотических и дрожжевых препаратах по углеводным субстратам хронокондуктометрическим методом (в условиях повторяемости, п = 9).

препарат мальтоза глюкоза туктоза сахароза

1,°С аМо" См/(м-с-кл.) 1,°С а -10 См/(м-с-кл.) Ос 8*40" См/(м-с-кл.) 1,°С а^10 См/(м-с-кл.)

Бифидо-бактерии 22 3,9±0,6 13 16,3±2,4 12 16,5±2,5 15 3,6±0,5

Бифидогум 17 12,0±1,4 12 2,5±0,4 10 6,5±0,8 14 1,6±0,2

Лакто-бактерин 30 0,22±0,03 18 0,11 ±0,02 30 0,09±0,02 30 0,20±0,03

Хлебопекарские дрожжи

Прессованные 35 0,28±0,04 30 1,9±0,3 20 0,9±0,1 20 0,9±0,3

Сухие «Сафт-момент» 30 0,51 ±0,08 20 1,5±0,2 20 0,14±0,02 25 0,23±0,03

Следует отметить, что температура максимальной активности исследованных препаратов по различным углеводным субстратам различается.

Различие температурных зависимостей СФА исследованных культур в препаратах по субстратам обусловлено биохимическими особенностями штаммов и предлагается использовать в качестве параметра теста на соответствие при | контроле качества препарата

4. Влияние природы субстрата Известно, что скорость утилизации субстрата живыми клетками культуры зависит от биохимических свойств культуры и природы субстратов. Нами показано, что СФА различных исследованных культур по одному и тому же субстрату отличается, также как отличается и СФА препарата по различным субстратам. Поскольку трудно установить основной продукт (метаболит) с I субстратами неуглеводного типа, в таблице 5 приведены значения СФА в единицах проводимости.

Рис. 4. Совокупность а8 лакгосодержащих препаратов: ® - «Лактобактерин», И-«Ацидогум», @ - «Лактмум» по различным субстратам при I = 20°С.

1,60 1 1,40 -

1,50

" 0,80 -

0,84 0,83

1 «

Ч:

Ж ■

1 р

ж ■

103 ЩЩ

глицин арабиноза мальтоза сахароза глюкоза фруктоза лактоза

Рис. 5. Совокупность а8 хлебопекарных препаратов по различным субстратам: прессованные дрожжи. Ш - сухие дрожжи «Сафт-момент» при t = 20°С.

Следует отметить, что совокупность СФА анализируемых культур по различным субстратам (рис. 4, 5) может быть использована для контроля качества препарата в тесте на соответствие.

Установлено, что в условиях одного эксперимента концентрация клеток постоянна, следовательно, значения СФА микробной суспензии можно использовать для определения количества клеток в препарате (выражение 3).

Исследовано количество живых клеток в пробиотических препаратах до и после сублимации в различных сублиматорах субстратным хронокондуктометрическим методом. Установлено, что после сублимации (I сутки) количество живых клеток в препарате, определенное как микроскопическим, так и хронокондуктометрическим методом, уменьшается на порядок за счет гибели и повреждения клеток.

Таким образом, субстратный способ хронокондуктометрического определения активности микроорганизмов имеет ряд преимуществ по сравнению

с уже известными методами контроля качества пребиотических препаратов.

Хронокондукгометрический субстратный способ прост в исполнении, характеризуется экспрессностью, минимальным расходом реактивов, настройкой на любой препарат, содержащий живые клетки микроорганизмов, низкой величиной стоимости приборов и может быть рекомендован для разработки методик определения ферментативной активности микроорганизмов в препаратах и проведения теста на соответствие.

Результаты исследования СФА препаратов хронокондуктометрическим субстратным методом использованы для разработки макета прибора «Экспресс-анализатор метаболической активности биокатализаторов» (экспресс-анализатор МАБ). Макет прибора содержит три независимых аналитических ячейки, каждая из которых оснащена кондуктомегрическим датчиком и термодатчиком. Реализовано два варианта перемешивания содержимого ячейки (вибрация, барботирование). Для макета прибора разработано специальное программное обеспечение^, позволяющее проводить анализ и обработку экспериментальных данных, настраивать на новый объект. Разработанный макет экспресс-анализатора прошел апробацию на биотехнологических предприятиях Томска: филиала ФГУП НПО «Микроген» в г. Томск НПО «Вирион» и ОАО «Томское пиво». Экспресс-анализатор «МАБ» можно использовать для экспресс-контроля качества полупродуктов, продуктов и сред в биотехнологических производствах, микробиологических и экологических лабораториях.

2 Программное обеспечение разработано программистом ИДО НИ ТПУ Голодниковым В.В.

Таблица 5

Значение СФА микроорганизмов в пребиотических препаратах по субстратам при I = 20°С (в условиях повторяемости, п=9)

Препарат а6'-10" (См/м-с Кл) по субстратам

Фруктоза Арабиноз а Мальтоза Сахароза Лактоза Аспарагинова я кислота Мочевина

Дрожжевые препараты Пивоваренные дрожжи Б, сагЬЬегрегшз 0,42±0,06 0,7±0,1 0,05±0,01 0,15±0,02 0,14±0,02 0,04±0,01 - -

ссованные дрожжи 1,0±0,2 0,9±0,1 0,18±0,03 0,23±0,04 0,9±0Д 0,030±0,004 0,072±0,004 0,05±0,01

и «Сафт-момент» 1,5±0,2 0,12±0,02 0,25±0,04 0,8±0,1 0,08±0,01 0,017±0,003 0,06±0,01 0,08±0,01

ОЖЖИ «Приправыч» 0,9±0Д 0,35±0,05 0,23±0,03 0,08±0,01 0,07±0,01 0,01±0,003 0,06±0,01 0,06±0,01

Пробиотические препараты Лактобактерин 0,05±0,01 0,04±0,01 - 0,029±0,004 0,04±0,01 0,05±0,01 0,50±0,08 -

,011±0,00 3 0,032±0,005 - - 0,020±0,003 0,030±0,003 - -

0,009±0,00 1 0,007±0,001 - - 0,011±0,002 0,07±0,01 - -

кгерин 1,6±0,2 1,9±0,3 0,50±0,07 2,6±0,4 0,22±0,03 0,003±0,0005 4,0±0,6 -

0,45±0,09 1,2±0,2 - 5,9±0,9 0,61±0,08 0,0030±0,0005 6,2±0,9 -

±0,09 1,0±0,2 0,62±0,09 0,8±0Д 0,8±0,1 - - -

,9 10,9±1,6 - 2,9±0,4 11,5±1,7 - - -

бифидо 6±1 8,1±1,2 - - 10,6±1,6 - - -

лакто 2,2±0,3 0,9±0,1 - - 4,8±0,7 1,3±0,2 - -

инэ-форте 1,8±0,3 2,6±0,4 - - 3,1±0,5 1,3±0,2 - -

Выводы

1. Впервые сформулированы основные положения субстратного способа определения СФА микроорганизмов, основанного на превращении внесенного определенного субстрата живыми клетками в метаболит в условиях их голодания, и определении электропроводящего метаболита электрохимическим методом. Впервые введен показатель СФА препарата по субстрату как параметр качества препарата.

2. Впервые разработан экспрессный принцип методики определения СФА микроорганизмов по субстрату с использованием метода хронокондуктометрии, включающий регнсграцшо изменения удельной электрической проводимости с дальнейшим пересчетом ее на концентрацию основного метаболита. Разработанный алгоритм определения СФА реализован в макете прибора «Анализатор метаболической активности биокатализаторов».

3. Впервые разработан экспрессный принцип метод определения СФА микроорганизмов по субстрату с использованием метода хроно-рН-метрии, включающий регистрацшо изменения кислотности среды с дальнейшим пересчетом ее на концентрацию основного метаболита.

4. Впервые определены значения СФА препаратов, содержащих дрожжевые клетки рас Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis и нробиотические микроорганизмы штаммов L.Plantarum 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum, по углеводным субстратам и предложено использовать для контроля качества препаратов.

5. Установлена функциональная зависимость СФА пребиотических препаратов от температуры, позволяющая использовать их в тесте на соответствие при контроле качества препаратов. Установлено, что совокупность СФА микроорганизмов в препаратах по различным субстратам, можно использовать как параметр качества препарата.

6. Впервые предложено использовать показатель СФА препарата в качестве альтернативного, экспрессного способа определения количества меток в препарате.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Патент на полезную модель №76340 МПК (2006.01) С12 Ml/00, €12 Ml/34; С12 Ml/18; С12 Ml/04; С12 М1/02 от 14. 04. 2008 Анализатор метаболической активности биокатализаторов Бакибаев A.A., Яговкин А. Ю., Лсташкипа А.П., Медведев Д. М., и др.

2. Асташкппа А.П., Яговкин А.Ю., Жук В.В., Бакибаев A.A., и др. Экспресс-анализатор микробной активности в культуральных средах // Биотехнология XXI века: проблемы и перспективы - 2007. - г. Москва. - Инноватика, 2007. - С. 145-146.

3. Асташкппа А.П., Яговкин А. Ю., Бакибаев А. А. Кондуктометрический метод определения метаболической активности биокатализаторов // Электрохимические методы анализа в контроле и производстве: Материалы региональной научно-практ. конф., посвященной 70-летию со дня рождения A.A. Каплина - г. Томск, 29-30 октября 2007. - Томск: Изд. ТПУ,

2007.-С. 50-51.

4. Асташкппа А.П.,, Яговкин А.Ю, Бакибаев A.A.. Электрохимический способ определения метаболической активности микроорганизмов// Аналитика и Аналитики: Рефераты докладов II Международного форума г. Воронеж, 15-21 ноября 2008 - Воронеж: Изд. ВГТА,

2008.-Т. 2. -С.501.

5. Асташкина А.П., Яговкин А.Ю., Бакибаев A.A.. Электрохимический способ определения метаболической активности клеток // Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2008: Материалы VIII научной конф. - г. Томск, 13-18 октября 2008. - Томск: Изд. ТПУ, 2008. -С. 178.

6. Асташкппа А.П., Яговкин А.Ю., Бакибаев A.A. Субстратный способ определения СФА дрожжевых клеток // Вестник Казанского технологического университета. Серия: Прикладная химия и технология. -2009. -№2. - С.96-102.

7. Асташкппа А.П., Бакибаев A.A., Яговкин А.Ю., Шарахова О.В, Субстратный способ определения суммарной ферментативной активности лактобактерий //Сибирский медицинский журнал. Серия: Медицина - 2009 - № 3. - С.46-48.

8. Асташкппа А.П., Бакибаев A.A., Яговкин А.Ю., Шарахова О.В. Кондуктометрический субстратный способ определения суммарной ферментативной активности препаратов, содержащих бифидобактерии // Сибирский медицинский журнал. Серия: Медицина. - 2009. -№ 3. - С.48-50.

9. Асташкппа А.П., Асташкина М П. Субстратный метод для оценки жизнеспособности клеток суспензионных и каллусных культур // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев. М.: Изд-во МГУ. - 2009. -С.2-3.

10. Асташкина А.П. Исследование процесса старения прессованных дрожжей субстратным способом // Химия и химическая технология в XXI веке: Материалы X Юбилейной всероссийской конференции студентов и аспирантов - г. Томск, ТПУ, 13-15 мая 2009. -Томск: Изд. ТПУ, 2009. - С. 145.

11. Асташкппа А.П., Яговкин А.Ю., Бакибаев A.A. Температурные зависимости суммарных ферментативных активностей суспензий пробиотиков // Известия высших учебных заведений. Химия и химическая технология. - 2010-Т. 53. -X« 2. - С. 114-116.

12. Асташкппа A.II., Яговкин А.Ю., Бакибаев A.A. Субстратный способ определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов // Евразийский симпозиум по инновациям в катализе и электрохимии: Материалы международного научно-практ. симпоз., посвященного 100-летию академика Д.В. Сокольского. - Алматы, 26-30 мая 2010. - Алматы, 2010.-С.99.

13. Асташкппа А.П., Яговкин А.Ю., Бакибаев A.A. Хронокондуктометрический способ и прибор для определения показателя суммарной ферментативной активности при контроле процесса производства дрожжей и пробиотиков» // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: Материалы III Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых - г. Бийск, 28-30 апреля 2010,- Бийск: Изд. Наукоград, 2010. - С.29-30.

14. Асташкина, А.П. Современные взгляды на биологическую роль бифидо- и лактобактерий А.П.Асташкина // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: химия, биология, фармация - 2010.- № 1 .-С. 133-139.

15. Асташкина А.П., Яговкин А.Ю., Демешева М.И., Бакибаев А.А Экспрессный субстратный способ контроля биотехнологических процессов и продуктов. // Биотехнология и биомедицинская инженерия: Материалы III Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию Курского государственного медицинского университета, с международным участием - г. Курс, 7-8 июня 2010. -: Курск: Изд. КГМУ Росздрава, 2010. - С.29-30.

16. Асташкива А.П., Медведев Д.М., Тартынова М.И., Бакибаев A.A. Хронокондуктометрический субстратный способ определения суммарной ферментативной активности бифидо-, лактосодержащих биопрепаратов //Теоретическая и экспериментальная химия: IV-я Международная конференция, посвященная М.И. Бакиеву - Караганда, 4-5 октября 2010. - Караганда: КарГУ, 2010. - С.17-21.

17. Асташкина А.П., Тартынова М.И, Медведев Д.М., Бакибаев A.A. Хронокондуктометрический субстратный способ определения активности дрожжей // Вестник Казахского нац. университета. Серия химическая - 2010. - Т. 60 - № 4. - С.221-225.

Автор выражает благодарность консультанту - к.х.н., Яговкину А.Ю. за всестороннюю помощь при подготовке и написании диссертационной работы, д.х.н„ профессору, заведующему каф. ЭБЖ ИНК Романенко C.B. за помощь в постановке ряда экспериментов, инженеру каф. ФАХ Медведеву Д.М. за консультативную помощь при написании диссертационной работы, также хочется поблагодарить за внимательное отношение и конструктивные предложения по работе д.х.н., проф. каф ФАХ Колпаковой H.A., к.х.н., доценту каф. ФАХ Пикуле H.H., к.х.н., доценту каф. ФАХ Михеевой Е.В., к.х.н., доценту каф. ФАХ Тартыновой М.И.

Подписано к печати 27.12.10. Бумага офсетная. Печать RISO. Формат 60x84/16. Тираж 125 экз. Заказ № 38-0287 Центр ризографии и копирования. Ч/П Тисленко О.В. Св-во №14.263 от 21.01.2002 г., пр. Ленина, 41, оф. № 7а.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Асташкина, Анна Павловна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Препараты, содержащие лакто-, бифидобактерии и дрожжи.

1.1.2. Препараты с дрожжевыми культурами.

1.2. Показатели качества препаратов.

1.2.1. Показатели качества бактерийных препаратов (пробиотики)

1.2.2. Показатели качества дрожжевых препаратов.

1.3. Методы определения активности микроорганизмов.

1.4. Электрохимические методы определения активности клеток.

1.4.1. Определение жизнеспособности или количества клеток.

1.4.2. Ферментативная и метаболическая активность.

ГЛАВА 2.Теоретическая часть.

2.1. Ферментативная кинетика.

2.2. Кинетическая модель субстратного способа определения суммарной ферментативной активности живых клеток.

ГЛАВА З.Экспериметальная часть.

3.1. Хроноконд уктометрия.

3.2. Хроно-рН-метрия.

3.3. Приготовление калибровочных растворов и раствора субстрата.

3.4. Объекты исследования.

3.5. Алгоритм методики определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов.

ГЛАВА 4.Определение СФА дрожжевых, лакто- и бифидосодержащих препаратов 4.1. Определение СФА хронокондуктометрическим методом.

4.1.1. Определение показателя СФА дрожжевых препаратов.

4.1.2. Диапазон определяемых концентраций живых клеток.

4.1.3. Влияние природы субстрата на показатель суммарной ферментативной активности.

4.1.4. Влияние температуры на показатель СФА дрожжевых препаратов.

4.1.5. Изучение прогресса старения дрожжевых клеток в препаратах.

4.2. Определение СФА лакто- и бифидосодержащих препаратов.

4.2.1. Диапазон определяемых конг1ентраций живых клеток в препаратах.

4.2.2. Влияние природы субстрата.

4.2.3. Влияние температуры на показатель СФА®.

4.3. Применение хронокондуктометрического метода для контроля жидкого и сухого лиофилизированного препаратов.

4.4. Использование кондуктометрического метода для контроля прироста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов.

4.5. Реализация субстратного способа определения суммарной ферментативной активности хроно-рН-метрическим методом.

Выводы

Введение диссертация по химии, на тему "Хронокондуктометрический метод определения суммарной ферментативной активности микроорганизмов в бифидо-, лактосодержащих и дрожжевых препаратах"

В основном преобладают микробиологические методы, которые требуют больших затрат времени, и позволяют проводить лишь качественный или полу количественный анализ. Широко распространенные оптические методы анализа трудоемки и требуют использование дорогостоящих реактивов.

Кондуктометрический метод анализа пока не нашел широкого применения в области определения активности по сравнению с другими физико-химическими методами, но широко применяется для контроля роста микробной биомассы в селективных питательных средах. Это связано с высокой чувствительностью метода, экспресспостью и относительно низкой стоимостью анализа.

Для достижения цели поставлены следующие основные задачи:

Научная новизна данной работы заключается в следующем:

- Впервые предложен субстратный способ количественного определения СФА микроорганизмов.

- Впервые проведено количественное определение СФА в препаратах, содержащих пробиотические микроорганизмы штаммов L.Plantarum 8Р-АЗ, Bifidumbacterium bifidum и Bifidum adolescentis и дрожжевые культуры рас Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis хронокондуктометрическим и хроно-рН-метрическим методами.

Впервые показано, что совокупность значений СФА по определенному набору субстратов микроорганизмов в препарате является качественной характеристикой препарата.

Впервые показано, что температурная зависимость СФА микроорганизмов по субстрату в исследованных препаратах являются качественной характеристикой препарата.

Практическая значимость. Разработан субстратный способ количественного определения активности (суммарной ферментативной) микроорганизмов хронокондуктометрическим и хроно-рН-метрическим методом, характеризующийся простотой в исполнении, относительно низкой стоимостью анализа, экспрессностью, настройкой на любой препарат, содержащий живые клетки микроорганизмов.

Определены значения СФА микроорганизмов в препаратах, содержащих пробиотические микроорганизмы штаммов L.Plantarum 8Р-АЗ, Bifidumbacterium bifidum и Bifidum adolescentis и дрожжевые культуры рас Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis, хронокондуктометрическим и хроно-рН-метрическим методом и предложено использовать значение СФА микроорганизма по субстрату в качестве параметра контроля качества препарата.

Предложено ^ использовать температурные зависимости СФА по субстрату и совокупности СФА препаратов по различным субстратам как параметр соответствия при контроле качества препарата.

1. Основные положения субстратного способа определения активности микробных суспензий;

4. Совокупность значений СФА некоторых пребиотических препаратов по

1 Макет прибора изготовлен ООО « НПП ИТМ» г. Томск определенному набору субстратов как параметр качества препарата в тесте на соответствие. 5. Температурные зависимости СФА некоторых пребиотических препаратов ' по субстрату как параметр качества препарата в тесте на соответствие Апробация работы. Основные результаты работы представлены устными и стендовыми докладами на конференции «Биотехнология XXI века: проблемы и перспективы» (Москва, 2007), Региональной научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008), VIII Научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), X Юбилейной всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2009), III

Всероссийской научно-практической конференции с международным i участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2010), Евразийском симпозиуме по инновациям в катализе и электрохимии (Алматы, 2010).

По материалам диссертации опубликовано б статей, 1 патент на полезную модель и 10 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 121 странице, содержит 9 таблиц,

33 рисунка и библиографию из 140 наименований. Работа состоит из ----введения, четырех глав, выводов, списка литературы и приложения.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

выводы

2. Впервые разработан экспрессный принцип методики определения СФА микроорганизмов по субстрату с использованием хронокондуктометрии, включающий регистрацию изменения удельной электрической проводимости с дальнейшим пересчетом ее на концентрацию основного метаболита. Разработанный алгоритм определения СФА реализован в макете прибора «Анализатор метаболической активности биокатализаторов».

3. Впервые разработан экспрессный принцип метод определения СФА микроорганизмов по субстрату с использованием метода хроно-рН-метрии, включающий регистрацию изменения кислотности среды с дальнейшим пересчетом ее на концентрацию основного метаболита.

4. Впервые определены значения СФА препаратов, содержащих дрожжевые клетки рас Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis и пробиотические микроорганизмы штаммов L.Plantarum 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum, по углеводным субстратам и предложено использовать для контроля качества препаратов.

6. Впервые предложено использовать показатель СФА препарата в качестве альтернативного, экспрессного способа определения количества клеток в препарате.

Автор выражает благодарность консультанту - к.х.н., Яговкину А.Ю. за всестороннюю помощь при подготовке и написании диссертационной работы, д.х.н., профессору, заведующему каф. ЭБЖ ИНК Романенко C.B. за помощь в постановке ряда экспериментов, инженеру каф. ФАХ Медведеву Д.М. за консультативную помощь при написании диссертационной работы, также хочется поблагодарить за внимательное отношение и конструктивные предложения по работе д.х.н., проф. каф ФАХ Колпаковой H.A., к.х.н., доценту каф. ФАХ Пикуле Н.П., к.х.н., доценту каф. ФАХ Михеевой Е.В., к.х.н., доценту каф. ФАХ Тартыновой М.И.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Асташкина, Анна Павловна, Томск

1. Белоусова Е.А. Всемирный конгресс по гастроэнтерологии (Монреаль, 2005) // Фарматека. 2006. - № 1. - С. 17-21.

2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. / Т. 1, Т.З.: Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ. - 2001.

3. Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R, et al. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition // Am. J. Clin. Nutr. 2001. V.73. - P.365-373.

4. Мазанкова JT.H., Лыкова1 Е.А. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике // Детские инфекции. -2004.- №1.-С. 18-23.

5. Бондаренко В.М.,- Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией. // Журн. Микробиолог.- 2004. №1.- С. 8492.

6. Семченко, А.В. Изучение рынка пробиотиков // Фундаментальные исследования. 2007. - № 12.-С. 351-357.

7. PlummerS, Weawer М, Dee Р, Hunter J. Clostridium difficile pilot study: effects of probiotic supplementation on the incidence of Cdifficile diarrhea // Int. Microbiol. 2004. - V.7.- №1.- P.59-62. •

8. G.I. Novik, A.A.Samartsev, N.I. Astapovich et al. Biological activity of probiotic microorgammisms. //A. Biochem. And Microbiol. 2006.- V.42.-№2.- P.166-172.

9. Грачева H.M., Ющук Н.Д., Чупринина Р.П. и др. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов / Пособие для врачей и студентов. М.: 1999.- 44с.

10. Бондаренко B.M., Чупринина Р.П., Воробьева M.A. Механизм действия пробиотических препаратов // БИОпрепараты.- 2003.- № 3.- С. 2-5.

11. З.Андреева И.В., Доказательства обоснованности профилактического применения пробиотиков // Фарматека.- 2006.- №6.- с.3-8.

12. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия.// Эксперим. и клин. гастроэнтерол.-2004.-№.3.- С. 83-87.

13. Бондаренко В.М. // Микробиология. 2004.- №1.- С.84-92.

14. Шостакович-Корецкая JI.P., Кривуша Е.Л., Чергинец А.В. Тактический подход к коррекции дисбиоза кишечника у детей пробиотическими препаратами. Опыт применения препарата Линекс // Украинский медицинский журнал.- 1999.- № 2.- С. 61-64.

15. Несчистляев В.А., Молохова Е.И., Чистохина Л.П. // Вестник биотехнолог, и физико-хим. Биологии им. Ю.А. Овчинникова.- 2006. -Т.2.- №4.- С. 29-30.

16. Бондаренко В.М. Поликомпонентные пробиотики: механизм действия и терапевтический эффект при дисбиозах кишечника //Фарматека. -2005.-№115.- С. 46-54.

17. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. / М: КМК Scientific Press.- 2003.- С.224.

18. Colombel J, Cortot A, Neut C, et al. Yoghurt with Bifidobacterium,longum reduces erythromcyin-induced gastrointestinal effects I I Lancet- 1987.-V.2.- P. 43-47.

19. Шульпекова Ю.О. Применение пробиотиков в клинической практике // РМЖ.- 2003.- Т. 5.-№ 1.

20. Guandalini S, Pensabene L, Zikri MA, et al. Lactobacillus GG administered in oral rehydration solution to children with acute diarrhea: a multicenter European trial. //J Pediatr Gastroenterol Nutr.- 2000.- V.30.- P.54-60.

21. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции нормальной микрофлоры // РМЖ.- 2000.- № 13- С. 14.

22. Хавкин А.И. Жихарева Н.С. Влияние продуктов питания, обогащенных пробиотиками, на функцию кишечника // Вопросы современной педиатрии.- 2003.- Т.2.- №1.- С.12-16.

23. Бондаренко В.М., Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов // Фарматека.- 2003.- № 7.- С.56-63.

24. Weizman Z, Asli G, Alsheikh A. Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: comparison of two probiotic agents.// Pediatrics.- 2005.- V.l 15.- №1.- P.5-9.

25. Naruszewicz M., Johansson M., Zapolska-Downar D., et al. Effect of Lactobacillus plantarum 299v on cardiovascular disease risk factors in smokers // Am J Clin Nutr.- 2002.- V.76.- №6.- P. 1249-1255

26. Rautava 5, Kalliomaki M, Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immnomodulatory protection against atopic disease in the infant // J Allergy Clin Immunol.- 2002.- V.l09.- №1.- P.l 19121.

27. Reid G. Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics. FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria // Cordoba, Argentina, -2001.-V. 34.- P. 345-350.

28. Sugita T, Togawa M. Efficacy of lactobacillus preparation biolactis powder in children with rotavirus enteritis. //Jpn Pediatr.-1994.- V.47.- P.2755-2762.

29. Raza S, Graham SM, Allen SJ, et al. Lactobacillus GG promotes recovery from acute nonbloody diarrhea in Pakistan. // J Pediatr Infect Dis.- 1995.-V.14.- P.107-111.

30. Pant A.R, Graham S.M, Allen S.J, et al. Lactobacillus GG and acute diarrhea in young children in the tropics //J Trop Pediatr.- 1996.- V.42.-P.162-165.

31. Фараджева Е.Д., Болотов Н.А. Производство хлебопекарных дрожжей: практическое руководство. / СПб.:Профессия, 2002.- 167 с.

32. Ляликов Б. Г., Морозов И. А. «Свой» и «чужой» этанол. // Химия и жизнь.- 1987.-№7.- С. 69.

33. Дрожжи спиртовых заводов. // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал.- 2003.- № 4.- С. 1485.

34. Dickinson J.R. In European Brewery Convention Mongraph 28, EBC Symposium of Saccharomyces cervisiae, 2000

35. Walker C.U. Yeast physiology and biochemistry./ Wiley Chichester.- 199840.http://scientistcentral.com

36. Barnett, James' A. Beginning of microbiology and biochemistry the contribution of yeast research. // Microbiology. 2003.- V.149.- P. 557— 567

37. E. Nevoigt Progress in Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008.- V 72.- № 3.- P. 379 - 412

38. R. Sreenivas Rao, R.S. Prakasham, et. Al. Xylitol production by Candida sp.: parameter optimization using Taguchi approach // Process Biochemistry, -2004.- V.39.-P.951-956.

39. Berzelius J. J.Considerations respecting a new power which acts in the formation of organic bodies. // Edinburgh New Philosophical Journal.-1836.- V.21.- P.223—228.

40. Бабьева И. П., Чернов И. Ю. Биология дрожжей./ М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004.- с.402.

41. Тулякова Т. В., Пасхин А. В., Седов В. Ю. Дрожжевые экстракты— безопасные источники витаминов, минеральных веществ и аминокислот // Пищевая промышленность.- 2004.- № 6.- с.5-8.

42. Phaff H.J., Miller М. W., Mrak Е.М. The life of Yeasts I 2 ed., Camb. L., 1979.- 431p.

43. Способ очистки воды от нефтяных загрязнений Халилова Х.Х., Мамедов // М.К. Химия и технология воды. 2008.- Т. 30.- № 3.- С. 339344.

44. Проблемы и методы биологической диагностики и индикации почв / сборник статей. М. Наука, 1976.- с.358.

45. I.J. Van der Klei, M.Veenhuis. Yeast and Filamentous fungi as model organisms in microbody research // Biochimica et Biophysica Acta,- 2006.-V.1763.-P. 1364-137.

46. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., и др. Молекулярная биология клетки: / В 3-х т. 2-е изд., перераб. и доп. Пер. с англ.— М.: Мир, 1994.— 517с.

47. Liti G, Carter DM, Moses AM, Warringer J, Parts L et al population genomics of domestic and wild yeasts //Nature, 2009.- V.458.- P.337-341.

48. Н.П. Пикула, А.А. Бакибаев, Г.Б. Слепченко Метрологическое обеспечение и контроль качества химического анализа. / Учебное пособие. Томск: ТПУ.-2005.- 153с.54.http://vv4vw.iso-centr.ru/isodictionary55.http://www.c-cert.ru

49. Азгальдов Г.Г. Теория и практика оценки качества товаров (основы квалиметрии)./ М.: Экономика, 1982. 256с.

50. Азгальдов Г.Г. Практическая квалиметрия в системе качества: ошибки и заблуждения // Методы менеджмента качества. — 2001, № 3

51. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. / Под рред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой.- М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002,- 608с.

52. Тарасова И.Б. Разработка бактерийного препарата Лактобактерин для нормализации биофлоры кишечника. Автореф. дисс.д-ра.биол. наук,-М.-1970.-29с.

53. Фармакопейная статья предприятия 42-0135-2415-02 «Лактобактерин сухой»

54. Фармакопейная статья предприятия 42-0135-2415-02 «Бифидобактерин сухой»

55. ФС 42394700 рост на среде Блаурока определение КОЕI

56. Безбородов А.М. Ферменты микроорганизмов и их применение / Биотехнология. М.: Наука, 1984.

57. Печуркин Н.С., Брильков А.В., Марченкова Т.В. Популяционные аспекты биотехнологии./Новосибирск: Наука, 1990. 173 с.

58. Грачева И.М., Гаврилова Н.М., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров / М.: Пищевая промышленность, 1980. 448 с.

59. Волкова Р.А., Бектимиров Т.А. Валидация методов контроля микробиологических препаратов. // Фармация, 2008.

60. И.А. Еремина, Н.И. Лузина, О.В. Кригер. Микробиология продуктов растительного происхождения. / Учебное пособие. Кемеровскийтехнологический институт пищевой промышленности.- Кемерово, 2003.- с. 87

61. Коновалов СЛ. Биохимия дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1980. -271с.

62. Бабьева И. П., Чернов И. Ю. Биология дрожжей. / М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004.- с.402.

63. Микробиология пива. Под. Ред. Ф. Дж. Приста, Й. Кемпбелла / Профессия. С-Пб.: 2005. С.251.N73.http://www.idgplc.com74.http://www.biomerieux.fr75.ГОСТ 10444412-88.

64. Fleet, G.H., Praphailong, W., Yeasts in: Spoilage of Processed Foods: / Causes and Diagnosis, AIFST. -2001. P. 383—397.

65. Yun-Xiang Ci, Jun Feng, Zi-wei Jiang, Da-zhen Luo The voltammetric behavior of Saccharomyces cerevisiae // Bioelectrochemistry and Bioenergetics.- 1997.- V. 43.- Iss. 2.- August.- P.293-296

66. Биотехнология:Учебник / И.В. Тихонов, E.A. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. Акад. РАСХН Е.С. Воронина. СПб.: ГИОДР, 2008. -590с.

67. Большой медицинский энциклопедический словарь / Из-во: ЭКСМО.2007.- 768с.8ЬН.Н.Фирсов Микробиология: словарь терминов / М.:Дрофа. -2006. 345с.

68. Будников' Г.К., Улахович Н.А., Медянцева Э.П. Основы электроаналитической химии. / Изд-во КазГУ, Казань. 1986. 288с.

69. Современные методы аналитической химии: / В 2-х т: Т. 2 (пер. с нем., • под ред. Гармаша А.В.) Отто М. Изд-во: Техносфера Мир химии, Москва. 2004.- 288с.

70. Электроаналитические методы: Теория и практика (под ред. Шольца Ф.; пер. с англ. под ред. Майстренко В.Н.) Калерт X. Инцельт Д. Бонд

71. A.M. Изд-во: Бином. Москва. 2006. 326с.

72. Крешков А.П. Основы аналитической химии. Физические и физико-химические (инструментальные) методы анализа. Кн. 3. М.: Химия, 1977. 488с.

73. Т. Deak, L.R. Beuchat Use of indirect conductimetry for predicting growth of food spoilage yeasts under various environmental conditions// Journal of industrial Microbiology and Biotechnology. 1993. V. 12. № 3. P. 301-308.

74. J.Sawai, R. Doi, Y.Maekawa, H. Kojima Inderect conductimetric assay of antibacterial activities //Journal of Industrial Microbiology ¿¿Biotechnology. 2002.- V.29. P.296-298.

75. Dupont J., Menard D., Herve C., Minier B. Analytical procedure for use of conductance measurement to estimate Escherichia coli in Shelifish.//J. Appl Bacteriol. 1994. - V.77, P.296-302

76. Eden R., Eden G. Impedance Microbiology.// Research Studies Press.- 1984 Herts, UK. P.93-98; Lanzanova M, Mucchetti G., Neviani E. Analysis of conductance changes as a growth index of lactic acid bacteria in milk //J.Dairy Sci.-1993. V.70. P.20-28

77. Adams M. R., J.J. Bryan, P.J. Thomston. A medium designd for monitoring pitching yeast contamination in beer using a conductimetric technique. //Appl. Microbial. Lett. 1989V.8. P 55-58.

78. Watson-Craik I.A., Aidoo K.E., Anderson J.G. Induction of conductance and capacitance changes by food-borne fungi. // Food Microbiol. 1989. V. 6. P. 231-244

79. Deak T. Foodborne yeasts. //Adv. Appl. Microbiol.- 1991. V. 36. P. 179278.

80. Miyake M, Inaba N. Maeda H., Y. Ifuku. Rapid detection of yeast in orange juice by the conductance method. //J. Antibact antifung Agent. 1990. V. 18. P. 173-278.

81. Neil M. Dixon and Douglas B. Kell The control and measurement of C02 during fermentations // Journal of Microbiological Methods. -1989. V. 10. pp. 155 -176.

82. Firstenberg-Ende R. Rapid estimation of the number of microorganisms in raw meat by impedance measurement. // Food Technol. 1983. V.37. P. 6470.

83. Патент РФ 2 247 570 C2 Осипова И.Г., Чумаева T.B., Васильева Е.А. и др. Способ оценки специфической активности препаратов пробиотиков различных лекарственных форм и производственных штаммов по уровню их адгезивной активности

84. US Patent Issued on February 6, 1996, No. 5489515. Primarry Ralph J Gitomer // Device for analyzing the metabolism of cells

85. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. Пер. с англ. и предисл./ М.: Мир. 1979. С. 273.

86. Варфоломеев С. Д., Зайцев С.В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. М.: Изд-во: Моск. ун-та, 1982. -345с.

87. Безбородов А.М. Ферменты микроорганизмов и их применение // Биотехнология. М.: Наука, 1984.

88. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. Т.1. с. 392;

89. Н.А. Колпакова Сборник задач по химической кинетике: учебное пособие /Н.А. Колпакова , С.В. Романенко, В.А. Колпаков Томский политехнический университет. Томск: Изд-во ТПУ, 2009. -280с.

90. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия: Учеб. для спец. вузов /Под ред. А.Г. Стромберга. -4-е изд., испр. М.: Высш.шк., 2001.-527 е.: ил.

91. Справочник Химика Т.2. Изд-во: Химия. JIO. С. 12.

92. Асташкина М.П. Введение в культуру in vitro Василькашероховатого (Centaurea scabiosa 1.). Дисс.маг. биол. Наук. Томск2009.-55 с.

93. Растворы электролитов. Электрическая проводимость растворов электролитов // Методическое пособие В.Е. Катюхин. Томск; РШФ ТПУ, 2003. 28 с.

94. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник.-Ленград: Химия.- 1978. 392с.

95. Чебунина Е.И.Методические указания к лабораторному практикуму по дисциплине «Физико-химические процессы пищевой биотехнологии» для студентов специальности «биотехнология».- Улан-Удэ. 2005. Изд-во: ВСГТУ с.40

96. К. Смарт//Спутник пивовара. Весна 2001. С.10-17.

97. Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей: Справочник. М.: Агропромиздат, 1990. -335с.

98. Ж. Риберо-Гайон, Э. Пейно, П. Риберо-Гайон, П. Сюдро. Теория и практика виноделия. Перевод с французского Ф. Д. Шитикова.- Под редакцией Г. Г. Валуйко. М.: «Пищевая промышленность», - 1979. 155с.

99. Dupont J., Menard D., Herve С., Minier В. Analytical procedure for use of conductance measurement to estimate Escherichia coli in Shelifish.//J. Appl Bacteriol. 1994/ V.77. P. 296-302

100. Лыкова E.A., Бондаренко B.M., Изачик Ю.А. и др. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей // Ж. Микробиол. 1996. №2. с.88-91.

101. Fucushima Y., Kawata Y., Нага Н., Terada A., Mitsuoka Т., Effect of follow-up formula containing bifidobacteria on fecal flora and fecal metabolites in healthy children // Bioscience Microflora.- 1997. V.16 № 2.P.65-72.

102. E. Wasilewska, L. H. Markiewicz, M. Bielecka Bifidobacterium, strains inhibiting the gastrointestinal tract of rat as potential probiotics for animals //Journal of Animals and feed S/- 2008. V.17. P. 398-410.

103. Lievin V., Peiffer I., Hudault S. et al. Bifidobacterium strains from resident infant human ■ gastrointestinal microflora exert antimicrobial activity.Gut.2000. Vol.47. P.646-652.

104. Schell M.A., Karmirantzou M., Snel B. et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflect its adaptation to the human gastrointestinal tract. Proc.Natl.Sci.USA. 2002. Vol. 99. № 22. P. 14422-14427.

105. Pujol P., Huguet J., Banquells M., et al. The effect of fermented milk conteining Lactobacillus casei on the immune response to exercise //Sport Med Training Rehab.- 2000. V6.P.1-15.

106. Goldin B.R. Gorbach S. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial ensime activity //J Clin. Nutral.- 1984. V.6. P.756-761.

107. Hoesl C.L, Altwein JE. The probiotic approach: an alternative treatment option in urology. //Eur Urol .-2005. V.47. P. 288-296.

108. Shornikova AV, Isolauri E, Burkanova L, et al. A trial in the Karelian Republic of oral rehydration and Lactobacillus GG for treatment of acute diarrhoea. //Acta Paediatr.- 1997. V.86. P.460-465.

109. Совершенствование способа получения пробиотических препаратов / А.В. Семченко, А.В. Казьянин, Е.В. Орлова, В.А. Несчисляев // Фундаментальные исследования. 2007. - № 12. - С. 350.

110. Конь И. Я. Кисломолочные продукты в питании детей. Материалы Всероссийской конференции с межд. участием "Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека" Москва. -1999. с.176.

111. Мазанкова Л.Н., Лыкова Е.А. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике.// Детские инфекции.-№1-2004-с. 18-23.

112. Fedorak RN, Madsen KL. Probiotics and Prebiotics in Gastrointestinal Disorders. Curr Opin Gastroenterol.- 2004. V.20. № 2. P. 146-155.

113. Жихарева Н.С.; Хавкин А.И., Терапия антибиотикассоциированного дисбактериоза // РМЖ. 2006. Т. 14. № 19.

114. Wollowski, I, Rechkemmer G, Pool-Zobel BL. Protective role of probiotics and prebiotics in colon; cancer // Am J Clin Nutr.-2001. V.73.- PAS 1-455.

115. Лыкова E.А., Бондаренко B.M., Изачик Ю.А. и др. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей // Ж. Микробиол. 1996. №2. с. 8 8-91. .

116. Рациональное использование отходов и вторичных сырьевых ресурсов спиртовой отрасли в технологии кормовых дрожжей. Римарева Л.В., Лозанская Т.И., Худякова Н.М // Экология промышленного производства. 2007. № 4. С. 32-34

117. Петр С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. -332с.

118. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина, 1992- 192с.

119. Кутепов A.M. Экспериментальные методы химии растворов: денсиметрия, вискозиметрия, кондуктометрия и другие методы. М.: Наука, 1997.-351 с. .