Иммобилизация белков в микрочастицы, сформированные методом последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правахрукописи

ВОЛОДЬКИН ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИММОБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ В МИКРОЧАСТИЦЫ, СФОРМИРОВАННЫЕ МЕТОДОМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЙ АДСОРБЦИИ ПРОТИВОПОЛОЖНО ЗАРЯЖЕННЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ

02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: д.х.н., профессор Ларионова Н.И.

к.ф-м.н. Сухорукое Г.Б.

Официальные оппоненты: д.х.н. Румш Л.Д.

д.х.н. Изумрудов ВА.

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии Наук, Пущино

Защита состоится " 2-6 " апреля 2005 г. в 16 часов на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.59 по химическим наукам в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова но адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Сакодынская И.К.

Актуальность проблемы. Одним из интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии является иммобилизация высокомолекулярных биологически активных веществ (ВБАВ) в нано- и микрообъекты. Такого рода системы используются в различных областях промышленности и медицины (в качестве систем направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов).

Традиционные методы включения (иммобилизации) ВБАВ в микрочастицы сферической формы (микро-сферы и -капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и т.д. Эти методы предполагают использование органических растворителей, поверхностно-активных соединений, а также поперечно-сшивающих агентов, что может привести к снижению биологической активности иммобилизованного препарата. Более того, в большинстве случаев, получаемые сферические микрочастицы полидисперсны.

Поэтому актуальной задачей является разработка новых подходов к иммобилизации ВБАВ в микрочастицы в мягких условиях (с сохранением биологической активности ВБАВ), с возможностью контроля размера микрочастиц.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы является разработка новых способов включения ВБАВ (на примере белков) в полиэлектролитные (ПЭ) микрочастицы в водной среде с использованием метода последовательной адсорбции полиэлектролитов (ПАП), а также дизайна таких микрочастиц в зависимости от их потенциального назначения.

Метод ПАП является новым методом, приводящим к формированию организованных полиэлектролитных структур - многослойных ПЭ пленок. Удаление деградируемой сферической коллоидной микроматрицы, покрытой такой ПЭ пленкой, приводит к формированию полых ПЭ микрокапсул. Анализ литературы показал наличие большого числа способов включения макромолекулярных соединений в ПЭ микрокапсулы. Однако, эти способы имеют ряд существенных недостатков: применение органических растворителей и растворов с экстремальными неполное удаление

деградируемой матрицы, токсичность компонентов матрицы и т.д. В целях разработки новых методов включения поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы включения белков, основанные на:

а) ПАП на агрегатах белка, полученных высаливанием;

б) Включении белков в ПЭ микросферы, полученные методом ПАП на деградируемых микрочастицах из СаСОз.

2. Получить и охарактеризовать СаСОз микрочастицы, используемые в качестве матрицы при получении ПЭ микросфер методом ПАП.

3. Изучить включение белков в СаСОз микрочастицы и сформированные на основе этих частиц ПЭ микросферы; выбрать оптимальные условия включения. Охарактеризовать полученные белок-содержащие микрочастицы (размер, структура, стабильность, условия хранения).

4. Исследовать активность иммобилизованных препаратов, а также факторы, регулирующие высвобождение белков из микрочастиц.

5. Изучить возможность применения белок-содержащих ПЭ микрочастиц в качестве каталитических систем и для доставки включенных белков в живой организм.

Научная новизна,

1. Впервые получены и охарактеризованы сферические микрочастицы с узким распределением по размерам и контролируемым диаметром от 3 до 12 микрон. Предложены способы включения белков в микрочастицы путем адсорбции в порах частиц и соосаждением (получение частиц в присутствии белка).

2. Разработан метод получения белок-содержащих ПЭ микрочастиц путем ПАП на высоленных агрегатах белка. Впервые получены ПЭ микросферы путем ПАП на микрочастицах с последующим удалением карбонатной матрицы. Предложены способы иммобилизации белка: а) включением в сформированные микросферы и б) при получении микросфер на основе микрочастиц с включенным белком. Разработанные методы позволяют включать большие количества белка/фермента (до 60-70 вес. %) с высокими выходами (70-80 %) и сохранением биологической активности.

3. Предложены способы покрытия микросфер ПЭ оболочкой, что позволяет удерживать иммобилизованный белок в интервале рН 2-9 и в водно-органических смесях, а также регулировать скорость высвобождения иммобилизованного препарата (медленное высвобождение в течение нескольких дней).

Практическая значимость.

1. Продемонстрирована возможность применения микросфер для проведения ферментативного катализа в водно-органичеких средах и использования антиген-содержащих микросфер из биосовместимых ПЭ в качестве вакцин против внутриклеточных патогенов.

2. Конструирование ПЭ микросфер с применением метода ПАП позволяет делать дизайн таких частиц в зависимости от цели их применения:

а) покрытие ПЭ оболочкой позволяет не только удерживать включенный препарат при изменении внешних условий и защитить его от нежелательных макромолекул (ингибиторы, протеазы и т.д.), но и контролировать скорость его высвобождения (путем изменения числа ПАП при формировании оболочки).

б) включение магнитных наночастиц в структуру микросфер дает возможность манипулировать микросферами с помощью внешнего магнитного поля (способ отделения частиц от реакционной среды, альтернативный центрифугированию и фильтрации).

в) адсорбция на поверхности микросфер полимера, обладающего специфическими свойствами, придает эти свойства микросферам (показано многократное снижение связывания белка с микросферами, на поверхности которых адсорбировали полиглутаминовую кислоту, ковалентно модифицированную полиэтиленгликолем).

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на XIIth Intern. Workshop on Bioencapsulation (Vitoria, Spain, 2004), Europolymer Conference 2004 (Gargnano, Italy, 2004), BMBF-Symposium Nanobiotechnologie (Hannover, Germany, 2003), XI Intern. BRG Workshop on Bioencapsulation (Illkirch, France, 2003), V Симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2002), Intern. Conference "Biocatalysis-2002" (Moscow, 2002), X Intern. BRG Workshop on Bioencapsulation (Prague, Czech Republic, 2002), III Международная конференция "Химия высокоорганизованных веществ в нанотехнологии" (Петергоф, Санкт-Петерсбург, 2001), Intern, student conference on fundamental sciences "Lomonosov-2001" (Moscow, 2001), 13th Intern. Symp. on Microencapsulation (Angers, France, 2001), IXth Intern. BRG Workshop and 62th ICB Seminar (Warsaw, Poland, 2001), 28th Intern. Symp. on Control. Rel. of Bioact. Mater. (San Diego, California, USA, 2001).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликована 21 печатная работа.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, включая 63 рисунка и 3 таблицы. Список литературы содержит 217 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Иммобилизация белков путем ПАП на агрегатах белка

Для иммобилизации белков нами предложено в качестве матрицы микронного размера для ПАП использовать "нерастворимые" агрегаты белка, полученные при высаливании. На Схеме 1 представлено формирование микрочастиц с белком путем последовательной адсорбции полистиролсульфоната натрия (ПСС) и полиаллиламина гидрохлорида (ПАА) на высоленных агрегатах химотрипсина (ХТР).

Процесс проводили в кислой среде (5 мМ HCl) во избежание автолиза ХТР, а адсорбцию первого полиэлектролита ПСС проводили в высокой ионной силе для предотвращения преждевременного растворения агрегатов белка. ХТР-содержащие ПЭ микрочастицы представляют собой замкнутые частицы неправильной формы, которая соответствует форме, а также размеру (1-10 микрон) исходных агрегатов белка. Схема 1

ПЭ микрочастицы с ХТР

Данный метод характеризуется высокой эффективностью включения белка (70-80 % от высоленного ХТР), высоким содержанием белка в сухом препарате (50-80 вес. %), а также стабильностью при хранении в растворе 1 мМНС1. ПЭ и белок равномерно распределены в структуре микрочастиц.

Изменение поверхностного заряда молекул ХТР при смене рН среды приводит к ослаблению взаимодействия белка со свободными (не связанными ионными контактами) заряженными группами полиэлектролитов ПСС и ПАА в микрочастицах, и ХТР высвобождается из микрочастиц (Рис. 1А). При увеличении числа стадий ПАП, использованных при получении частиц, молекулы белка более прочно связываются с полиэлектролитами. При этом рН-профиль смещается в щелочную область, а скорость высвобождения белка уменьшается. (Рис. \А И Б).

Белок в растворе, % Белок в растворе, % Б

3456789 10 II о 1 1 3 4 5 24

Рис. 1. (А) - Влияние рН на высвобождение белка из микрочастиц. 40 мМ универсальный буфер. Время инкубации 1 час. (Б) - Кинетика высвобождения белка из микрочастиц. 50 мМ ТРИС-буфер, рН 8,0. Число стадий ПАЛ - 1 (е), 3 (■), 5 (А), 11(Ф).

ПЭ микрочастицы с белком остаются в нерастворимой форме вплоть до что связано с прочностью комплекса ПАА-ПСС. Потенциометрическое титрование стехиометрическогр комплекса ПАА-ПСС показало, что изменение числа ионных контактов между ПЭ происходит в интервале рН 10-11.

Сохранение ферментативной активности иммобилизованного ХТР составило 5±3 % по сравнению с нативным. Мы полагаем, что существенное падение активности иммобилизованного ХТР может быть связано со следующими факторами: а) стерические затруднения при диффузии субстрата к молекулам белка; б) высокая локальная концентрация ХТР в частицах приводит к конверсии субстрата лишь частью молекул фермента (вблизи поверхности частиц); в) измененная при агрегировании конформация молекул фермента фиксируется при образовании белок-ПЭ комплекса в процессе ПАП.

Высвобождение белка их микрочастиц является обратимым процессом. 43 % от изначально содержавшегося в частицах белка может быть включена в "пустые" частицы (белок вышел при рН 8,0, остаточное количество белка 8 %) после инкубации "пустых" частиц в растворе ХТР (10 мг/мл) в условиях прочного связывания белка Белок связывается с

нескомпенсированными зарядами ПЭ комплекса.

Включенный из раствора в "пустые" микрочастицы ХТР сохранял 88±13 % активности от нативного, что свидетельствует об отсутствии ингибирования нативного фермента при контакте с комплексом ПСС-ПАА. При таком включении содержание белка в частицах в 2,5 раза меньше (по сравнению с исходными частицами, полученными на агрегатах ХТР). При этом возможно другая локализация молекул ХТР в сетке ПЭ комплекса.

Таким образом, продемонстрирована возможность включения белков путем ПАП на агрегатах белка. Удерживание белка в частицах зависит от числа стадий ПАП и Микрочастицы из ПЭ комплекса могут быть использованы в качестве микроконтейнеров для захвата белка из внешнего раствора.

2. Иммобилизация белков в ПЭ микросферы, полученные на основе СаСОэ микрочастиц

Наряду с достоинствами метода включения белков в ПЭ микрочастицы, описанными в главе 1, такими как высокие выходы включения и высокое содержание белка, предложенный метод имеет ряд недостатков: потеря ферментативной активности иммобилизованного ХТР, а также невозможность контроля размера белок-содержащих ПЭ микрочастиц, имеющих нерегулярную форму. Альтернативной матрицей для включения белка в ПЭ микрочастицы методом ПАП нами предложено использовать сферические микрочастицы из В данной главе описаны два способа иммобилизации белков в ПЭ микросферы - включение в сформированные микросферы, полученные на СаС03 частицах (глава 2.1) и путем получения микросфер на основе СаСОз частиц с включенным белком (глава 2.2).

2.1. Включение белков в сформированные "каркасные" ПЭ микросферы 2.1.1. Получение пористых микрочастиц из СаСОз

Нами разработан метод получения пористых сферических микрочастиц из СаСОз (Рис 2А), имеющих узкое распределение по размерам и диаметр от 3 до 12 мкм. Рентгеновский анализ широкого угла рассеяния показал, что СаСОз частицы практически полностью (>99,2 %) состоят из модифик -

ватерит Внутренняя структура частиц схожая: диаметр пор 30-90 нм, а площадь поверхности частиц лежит в интервале 6-13 м2/г. В работе использовали СаСОз микрочастицы диаметром 4,8 мкм

Рис. 2. Фотографии СаСОз микрочастиц (А) и "каркасных" (ПАА/ПСС)4 микросфер (Б). Сканирующая электронная микроскопия.

2.1.2. Получение ПЭ микросфер "каркасного" типа. Включение белков

ПЭ микросферы (Рис. 2Б) получали путем ПАП - (ПАА/ПСС)4 на СаСОз микрочастицах (при этом нерастворимый комплекс ПАА-ПСС формировался в порах внутреннего объема карбонатных частиц, схема 2, 1-2) с последующим удалением СаСОз матрицы при рН<6,0 или в присутствии ЭДТА (схема 2, 2-3). Содержание в микросферах Размер ПЭ микросфер равен размеру

исходных микрочастиц.

Локализация ПЭ была изучена с помощью конфокальной сканирующей флуоресцентной микроскопии (КСФМ), спектроскопии координационного рассеяния и трансмиссионной электронной микроскопии. Показано, что микросферы состоят из ПЭ комплекса ПАА-ПСС, локализованного во всем объеме частиц Вблизи поверхности микросфер удельное содержание ПЭ выше, что объясняется их диффузией в поры микрочастиц в процессе ПАП

Молекулы белков могут включаться в микросферы из раствора посредством взаимодействия с некомпенсированными заряженными группами полиэлектролитного комплекса (схема 2, 3-4). Микросферы имеют пористую структуру (после удаления карбонатной матрицы), благодаря чему белки беспрепятственно проникают во внутренний объем микросфер.

Содержание включенного таким образом белка (ХТР и глюкозооксидазы (ГОД)) составило 5-12 % от массы микросфер, а выходы включения 93+5 и 90±2 %, соответственно. Иммобилизованные ХТР и ГОД полностью сохраняют ферментативную активность от нативного, соответственно).

СаСОз микрочастицы Схема 2.

Включение обоих белков в микросферы зависело от среды (Таблица 1). Вблизи р1 (8,5 для ХТР и 5,5 для ГОД) наблюдалась наибольшая емкость частиц по обоим белкам, что может быть связано с наименьшим отталкиванием между адсорбированными молекулами белков. Высокое количество включенных белков, имеющих разные р1 (ХТР и ГОД), указывает на возможность включения в "каркасные" микросферы в широком

интервале белков, имеющих различные заряды.

Таблица 1. Влияние рН на включение белков в (ПАА/ПСС)4 "каркасные" микросферы.

Белок мг белка/г микросфер, включенного при рН

рНЗ рН 5 рН 7 рН9

год 92±10 124±15 49±7 54±10

| ХТР 49±4 45±3 54±4 79±3

2.13. Покрытие "каркасных" микросфер с белком ПЭ оболочкой

Изменение рН приводит к изменению заряда белка, его взаимодействия с ПЭ комплексом микросферы и, как следствие, высвобождению при рН, отличных от рН при включении (Рис. 3, А2). Для предотвращения "утечки" белка нами предложен метод покрытия микросфер с химотрипсином ((ПАА/ПСС)4-ХТР) ПЭ оболочкой. Адсорбция диэтиламиноэтил декстрана (ДЕ), 500 кДа (схема 2, 4-5) на поверхности микросфер приводит к блокированию проникновения ПЭ внутрь частиц. При ПАП (ПСС и ПАА) на таких частицах формируется ПЭ оболочка (схема 2, 5-6). Высвобождение белка из микросфер с оболочкой происходит лишь при рН>10, когда разрушается комплекс ПАА-ПСС, то есть в оболочке образуются дефекты

Рис. 3. (А) - Высвобождение ХТР из "каркасных" микросфер (ПАА/ПСС)4 (2) и тех же микросфер, покрытых оболочкой (схема 2, б) (1). 30 мМ, универсальный буфер, 150 мМ NaCl. Время инкубации 30 мин. (Б) - Прирост оптической плотности при гидролизе бензоил-тирозин-р-нитрониилида (БТНА) нативным ХТР и ХТР, включенным в "каркасные" микросферы, покрытые оболочкой. Среда ацетонитрил:вода (90:10 об. %). |ХТР]=4*1(Г М, [БТНА^бЧО"* М.

В процессе создания ПЭ оболочки на поверхности "каркасных" микросфер с ХТР содержание белка практически не изменилось (потери составили 13 %), и ХТР сохранил ферментативную активность (88±11 % от нативного). Покрытие микросфер с ХТР ПЭ оболочкой позволяет не только удержать белок при изменении внешних условий, но и защищает его от проникновения нежелательных макромолекулярных веществ, таких как ингибиторы, протеазы и т.д.

Полученные микросферы с оболочкой оказались более эффективными катализаторами, чем нативный фермент в водно-органической смеси ацетонитрил:вода (90:10 об. %) (Рис. ЗБ). ХТР не высвобождался из микросфер в процессе гидролиза, а большая активность иммобилизованного ХТР может быть связана с фиксированием активной конформации белка при иммобилизации, а также большим содержанием воды в микросферах благодаря наличию в их структуре гидрофильных ПЭ. Микросферы с оболочкой открывают перспективы использования таких частиц в качестве катализатора при проведении ферментативного катализа в водно-органических смесях.

Удаление микрокатализаторов из реакционной среды после проведения реакции обычно проводят центрифугированием или фильтрацией, что требует применения специального оборудования. Нами предложен альтернативный метод сепарации ПЭ микрочастиц. Магнитные наночастицы были

адсорбированы на поверхности оболочки микросфер (0,68 пг наночастиц на микросферу) с белком (ХТР) и "закреплены" путем двух дополнительных стадий адсорбции ПСС и ПАА. Включение магнитных наночастиц позволяет манипулировать микросферами с помощью внешнего магнитного поля, к примеру постоянного магнита.

2.2. ПЭ микросферы с белком, полученные путем ПАП на белок-содержаших СаСОз микрочастицах

Иммобилизация белка в ПЭ микросферы может быть осуществлена путем получения микросфер при использовании в качестве деградируемой матрицы белок-содержащих микрочастиц. Предложены методы включения

белков в микросферы "каркасного" типа и гелевые микросферы с ПЭ оболочкой.

2.2.1. Изучение включения белков в СаСОз микрочастицы

Включение белков в СаСОз микрочастицы проводили двумя способами: адсорбцией в порах сформированных СаСОз микрочастиц и методом соосаждения, когда СаСОз микрочастицы получали в присутствии белка.

Электрокинетический потенциал поверхности СаСОз микрочастиц при рН 10, 9, 8 и 7 составил -11±5, -9±2, 6±3 и 10±4 мВ, соответственно. При одинаковом знаке заряда частиц и белка, количество белка, включенного методом адсорбции в порах, меньше, чем при разноименных зарядах (Рис. 4). То есть адсорбция белка определяется электростатическими взаимодействиями. Более низкая структурная стабильность лактальбумина (ЛАК) по сравнению с ХТР и лизоцимом (ЛИЗ) могут быть причиной большей адсорбции ЛАК, чем остальных белков (ДОтденаТур ХТР; ЛИЗ; и ЛАК равны 11,6; 14,5; и 5,4 ккал/моль). Количество связанных с микрочастицами белков (рН 8,0, ТРИС-буфер) оказалось в несколько раз выше в случае метода соосаждения, чем адсорбции в порах. При этом профили изотерм связывания схожи.

Включенный белок, г/г носителя

Рис. 4. Зависимость количества белков, включенных в СаСОз микрочастицах при рН 7-10. Метод адсорбции в порах. Время инкубации 1 час.

2.2.2. Получение белок-содержащих ПЭ микросфер

Микросферы с белком "каркасного" типа были получены путем ПАП -(ПАА/ПСС)4 на СаСОз микрочастицах с включенным белком с последующим удалением карбонатной матрицы (схема 3,1-3). В процессе ПАП большая часть включенного в СаСОз белка (50-70 %) теряется за счет вытеснения полиэлектролитами.

Снижение количества вытесненного таким образом белка (до 20-30 %) возможно при фиксировании молекул белка в геле, образованном в порах СаСОз микрочастиц. Гелевые микросферы с оболочкой были получены на основе микрочастиц с включенным белком в соответствии со схемой

(схема 3, 1-4-6). Молекулы альгината натрия (АЛГ) проникают в поры белок-содержащих СаСОз частиц и образуют внутри частиц Са-альгинатный гель (/4). После ПАП бисовместимых ПЭ (полилизина (ПЛЛ) и АЛГ) и удаления СаСОз матрицы в кислой среде (рН 5,0), формируются белок-содержащие гелевые микросферы с ПЭ оболочкой (схема 3,4-6).

Структура "каркасных" и гелевых микросфер была подтверждена при применении КСФМ к микросферам, полученным с использованием флуоресцентно меченых ПЭ и белка.

Гелевые микросферы, полученные на основе микрочастиц с белком

(овальбумин, включенние методом соосаждения), характеризуются высоким

содержанием белка (55±7 %) и высокими выходами включения (60-70 %). Различное число ПАП (ПЛЛ/АЛГ^, использованное при получении ПЭ оболочки частиц, дает возможность контролировать высвобождение включенного белка (Рис. 5А).

При введении микрочастиц в живой организм предотвращение захвата частиц иммунной системой (фагоцитоз) может быть достигнуто путем уменьшения адсорбции белков сыворотки крови на частицах. Известно, что для таких целей используется модифицирование поверхности (или составляющих поверхности) полиэтиленгликолем (ПЭГ). На поверхности гелевых микросфер с ОВА адсорбировали полиглутаминовую кислоту (ПГК) и ПГК-ПЭГ. Количество бычьего сывороточного альбумина (компонент сыворотки крови), связавшегося с микросферами было в 4,4 раза меньше в случае частиц, покрытых ПГК-ПЭГ, чем ПГК.

70- Белок в растворе, % ^

во- —

и □ ОВА-Сэ-А/ТГ-(Плл/АлгЬ

40 I ОВД-Сэ-АЯГ-<Плл/Алг)1

30-

1н Зч 1д Зд 8д Время

Рис. 5. (А) - Зависимость количества высвободившегося из гелевых микросфер ОВА от времени. 50 мМ ацетатный буфер, рН 5,5. (Б) - Продуцирование антител через 2 недели после однократного подкожного введения микросфер с Asp Í2 мышам (14-20 мкг белка/мышь). 1 - Asp Í2, 2 - микросферы без белка, 3 -микросферы с белком. Твердофазный иммуноферментный анализ.

3. Изучение иммунного ответа на микросферы с Asp fi in vivo

В некоторых случаях захват иммунной системой чужеродных организму микрообъектов может быть использован для доставки веществ, включенных в чужеродный объект. Таким объектом могут быть ПЭ микросферы с включенным белком.

Совместно с сотрудниками лабораторий под руководством к.х.н. ЕА. Марквичевой и к.б.н. Е.В. Свирщевской (Институт биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова, РАН) были получены микросферы Asp {2-(ПЛЛ/АЛГ)4 (микросферы получали на основе СаССЬ микрочастиц с белком, включенным методом АП). Asp О является патогенным белком, выделенным из гриба Aspergillus Fwnigatus. Одним из заболеваний, вызываемых этим патогеном является инвазивный аспергиллез легких.

Метод проточной цитометрии показал захват микросфер с белком моноцитами крови человека (72 % клеток содержали микросферы с Asp f2). Эффективная активация как гуморального, так и цитотоксического иммунного ответа была показана методом твердофазного иммуноферментного анализа по выработке иммуноглобулинов соответственно, уже через две

недели после подкожного введения микросфер мышам (Рис. 5Е).

Наличие иммунного ответа характеризует микросферы, полученные на основе биосовместимых ПЛЛ и АЛГ, как потенциальный эффективный препарат пролонгированного действия для однократного вакцинирования против внутриклеточных патогенов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод включения белков в ПЭ микрочастицы путем ПАП на высоленных агрегатах белка. Полученные микрочастицы характеризуются высоким содержанием белка (50-80 вес. %), высвобождение которого регулируется путем изменения числа стадий ПАП и среды.

2. Получены и охарактеризованы пористые сферические микрочастицы с узким распределением по размерам и контролируемым диаметром от 3 до 12 микрон. Предложено получение ПЭ микросфер "каркасного" типа и гелевых микросфер с оболочкой путем ПАП на деградируемых микрочастицах с последующим удалением карбонатной матрицы. Диаметр микросфер, равный диаметру исходных микрочастиц, может быть задан от 3 до 12 микрон.

3. Разработаны методы включения белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа и гелевые микросферы с ПЭ оболочкой. Методы основаны на включении белка в сформированные микросферы и использовании при получении ПЭ микросфер белок-содержащих микрочастиц.

4. Предложен способ покрытия "каркасных" микросфер ПЭ оболочкой, что дает возможность удержать белок в микросферах при изменении и

диэлектрической проницаемости среды. При этом включенный фермент сохраняет биологическую активность.

5. Показана возможность включения белков в гелевые микросферы на основе биосовместимых ПЭ. Высокое содержание белка (55 % по весу для овальбумина), а также медленное и контролируемое высвобождение белка позволяют использовать гелевые микросферы в качестве систем доставки включенного препарата.

6. Продемонстрирована принципиальная возможность практического применения микросфер, в частности, в качестве биокатализаторов в водно-органичеких средах и для получения вакцин против внутриклеточных патогенов.

7. Технологичность частиц может быть расширена включением магнитных наночастиц (отделение частиц от реакционной смеси при воздействии магнитного поля). Модификация поверхности микросфер, например при адсорбции на поверхности ПКГ-ПЭГ, позволяет подавить нежелательное взаимодействие с компонентами биологических сред.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ларионова Н.И., Балабушевич Н.Г., Виллемсон А.Л., Володькин Д.В.. Балкина А.С. (2005) Создание систем доставки белков, обеспечивающих повышенную биодоступность. // III Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 14/18 Марта, с. 29.

2. Volodkin D. У.. Petrov A. I., Prevot M. and Sukhorukov G. В. (2004) Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation. Langmuir, 20 (8), p. 3398-3406.

3. Sukhorukov G.B.. Volodkin D.V.. Gunther A.M., Petrov A.I., Shenoy D.B. and Mohwald H. (2004) Porous calcium carbonate microparticles as templates for encapsulation ofbioactive compounds. J. Mater. Chem., 14, p. 2073-2081.

4. Volodkin D.V.. Larionova N.I. and Sukhorukov G.B. (2004) Protein Encapsulation via Porous СаСОз Microparticles Templating. Biomacromolecules, 5, p. 1962-1972.

5. Volodkin P.V.. Larionova N.I. and Sukhorukov G.B. (2004). Encapsulation of bioactive macromolecules in polyelectrolyte microparticles templated on porous microspheres. II XIIth International Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spain, 24/26 September, p. 141-144.

6. Markvicheva E., Svirschchevskaja E., Volodkin P.. Selina O., Gerstenberger M., Bartkowiak A. and Sukhorukov G. (2004). Encapsulated protein and PNA delivery system for the development of vaccines against intracellular pathogens. International Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spain, 24/26 September, p. 89-92.

7. Володькин Д.В.. Балабушевич Н.Г., Сухорукое Г.Б., Ларионова Н.И. (2003) Включение белков в полиэлектролитные микрочастицы путем послойной адсорбции полиэлектролитов на агрегатах белка. Биохимия, 68(2), с. 283-289.

8. Volodkin P.V.. Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B. and Larionova N.I. (2003) Model system for controlled protein release: pH-sensitive polyelectrolyte microparticles. STP Pharma Sciences, 13 (3), p. 163-170.

9. Volodkin P.V.. Petrov A.I., Larionova N.I. and Sukhorukov G.B. (2003) A new approach for encapsulation of macromolecules by incorporation into matrix of colloidal particles. II XIth International BRG Workshop on Bioencapsulation. State of Art of Bioencapsulation Science and Technology, Illkirch, France, 25/27 May, poster 11.

10. Georgieva R., Gunther A., Volodkin P. V., Sukhorukov G. В., Mohwald H., Ponath E. and Voigt A. (2003) Biologisch funktionalisierte Mikrokapseln. // BMBF-Symposium Nanobiotechnologie, Hannover, Germany, 07/08 Oktober, 2003, poster 65.

11. Volodkin D.V., Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B. and Larionova N.I. (2002) Formulation and process variables affecting pancreatic proteinases release from polyelectrolyte microparticles. //Xth International BRG Workshop on Bioencapsulation. Cell Physiology and Interactions ofBiomaterials and Matrices. Prague, Czech Republic, 26/28 April, p. 173-176.

12. Volodkin D.V., Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B. and Larionova N.I. (2002) Entrapment of a-chymotrypsin and trypsin in polyelectrolyte microparticles. // International conference Biocatalysis-2002: Fundamentals & applications, Moscow, Russian Federation, 22/27 June, p. 145-146.

13. Balabushevitch N.G., Tiourina 0., Volodkin D.V., Sukhorukov G.B., Larionova N.I. (2002) Entrapment of peroxidase into hollow polyelectrolyte microcapsules. // International conference Biocatalysis-2002: Fundamentals & applications, Moscow, Russian Federation, 22/27 June, p. 69-70.

14. Володькин Д.В., Балабушевич Н.Г., Сухорукое Г.Б., Ларионова Н.И. (2003) Иммобилизация протеиназ в полиэлектролитные микрочастицы. // Тез. докл., V Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 22/24 Апреля, с. 119.

15. Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B., Moroz N.A., Kazanskaya, N.F., Larionova N.I., Volodkin D.V., Donath E. and MOhwald H. (2001) Encapsulation of proteins by layer-by-layer adsorption of polyelectrolytes onto protein aggregates: Factors regulating the protein release. Biotechnology and Bioengineering, 76(3), p. 207-213.

16. Larionova N.I., Volodkin D.V., Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B. and MOhwald H. (2001) Microcapsules responsive to physiological pH fabricated by layer-by-layer adsorption of polyelectrolytes on protein aggregates. Sci. Pharm., 69 (3), p. 175-176.

17. Larionova N.I., Sukhorukov G.B., Balabushevitch N.G., Moroz N.A., Volodkin D.V., Donath E. and MOhwald H., (2001) Encapsulation of proteins in polyelectrolyte microcapsules. Factors regulating the protein release. 28th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials. San Diego, California, USA, 23/27 June, Session 3, p. 7177.

18. Larionova N., Volodkin P., Balabushevitch N. and Sukhorukov G. (2001) pH-sensitive microcapsules prepared by means of consecutive adsorption of oppositely charged polyelectrolytes onto protein aggregates. // IX International BRG Workshop and ICB Seminar "Bioencapsulation in Biomedical, Biotechnological and Industrial Applications", Warsaw, Poland, 11/13 May, Session II-3, p. 1-4.

19. Volodkin D.V., Balabushevitch N.G., Larionova N.I. and Sukhorukov G.B. (2001) Protein loaded multilayer polyelectrolyte microcapsules. Preparation, characterization and protein release. International Symposium on Microencapsulation, Angers, France, 5/7 September, p. 101.

20. Володькин Д.В. (2001) Микрокапсулирование химотрипсина послойной адсорбцией полиэлектролитов на агрегатах белка. // Международная студенческая конференция "Ломоносов-2001", Москва, 10/13 Апреля, с. 133.

21. Балабушевич Н.Г., Володькин Д.В.. Мороз НА., Сухорукое Г.Б., Донат Е., Ларионова Н.И. (2001) Микрокапсулирование ферментов путем последовательной адсорбции полиэлектролитов на белковых агрегатах. // III Международная конференция "Химия высокоорганизованных веществ и нанотехнология", Петергоф, Санкт-Петербург, 26/29 Июня, с. 140-141.

Отпечатано на ризографе вОНТИГЕОХИРАН Тираж 100 экз.

Pli 00

2 1 Â ri F 7ПП5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

V ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Интерполиэлектролитные комплексы.

1.1. Образование, строение и свойства.

1.2. Белок-полиэлектролитные комплексы.

Глава 2. Формирование и свойства ПЭ пленок, полученных методом последовательной адсорбции полиэлектролитов (ПАП) на плоских подложках.

2.1. Получение пленок методом ПАП.

2.2. Структура и свойства "многослойных" ПЭ пленок.

Глава 3. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом ПАП

3.1. Формирование полиэлектролитных оболочек на поверхности

11 коллоидных частиц.

3.2. Образование полых полиэлектролитных микрокапсул.

3.3. Некоторые физико-химические свойства полых ПЭ микрокапсул.

Глава 4. Включение макромолекулярных соединений в ПЭ микрочастицы/капсулы с применением метода ПАП.

4.1. Мультислои макромолекул на поверхности коллоидных частиц.

4.2. Включение макромолекул в ПЭ микрокапсул путем изменения проницаемости их оболочки.

I 4.3. Покрытие кристаллов белков ПЭ оболочкой.

4.4. Метод, основанный на преципитации вещества на поверхности коллоидной матрицы.

11 4.5. Включение макромолекул в микрокапсулы, полученные на основе МФ-микрочастиц. 4.6. Обобщение методов включения: преимущества и недостатки. ■'у'/ Постановка задачи.

Глава 5. Кристаллизация карбоната кальция. экспериментальная часть

Глава 6. Материалы, оборудование и методы исследования.

6.1. Материалы и реактивы.

6.2. Оборудование.

6.3. Методы исследования

6.3.1. ПЭ микрочастицы, полученные на высоленных агрегатах белка. а. Получение ПЭ микрочастиц. б. Определение содержания белка в микрочастицах и растворах. в. Определение эстеразной активности химотрипсина. г. Высвобождение белка из микрочастиц при различных рН. д. Изучение кинетики высвобождения белка из микрочастиц. е. Повторное включение белка в ПЭ микрочастицы, полностью высвободившие белок.

6.3.2. Белок-содержащие СаСОз микрочастицы. а. Получение СаСОз микрочастиц. б. Включение белков в СаСОз микрочастицы методом адсорбции в порах. в. Получение белок-содержащих СаСОз микрочастиц методом совместного осаждения.

6.3.3. Включение белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа. а. Получение "каркасных" ПЭ микросфер (ПАА/ПСС)4. б. Иммобилизация белков путем включения в сформированные ПЭ микросферы. в. Изучение высвобождения белков из микросфер.

6.3.4. Измерение активности ГОД.

6.3.5. Измерение амидазной активности ХТР.

6.3.6. Получение магнитных наночастиц Рез04.

6.3.7. Модификация микросфер магнитными наночастицами Fe304.

6.3.8. Получение ПЭ микросфер путем ПАП на белок-содержащих СаСОз микрочастицах. а. Включение белков в микросферы (ПАА/ПСС)4. б. Включение Asp f2 в микросферы (ПЛЛ/АЛГ)4.

Эксперименты in vivo.

6.3.9. Белок-содержащие гелевые микросферы с ПЭ оболочкой. а. Иммобилизация ОВА. б. Модификация микросфер ПГК-ПЭГ. Изучение адсорбции БСА.

6.3.10. Изучение стабильности комплекса ПСС-ПАА при изменении рН

6.3.11. Получение ПЭ и белков, меченых флуоресцентной меткой.

6.3.12. Подготовка ДС и ДЕ для использования в работе.

6.4. Физико-химические методы, использованные при работе с микрочастицами.

6.4.1. Световая оптическая микроскопия.

6.4.2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ).

6.4.3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ).

6.4.4. Метод адсорбции/десорбции азота (метод Брунауэра-Эммета-Теллера).

6.4.5. Конфокальная флуоресцентная сканирующая микроскопия (КСФМ).

6.4.6. Флуоресцентная микроскопия.

6.4.7. Микрогравиметрия.

6.4.8. Спектроскопия координационного рассеяния (СКР).

6.4.9. Элементный анализ.

6.4.10. Расчет концентрации микросфер.

6.4.11. Измерение гидродинамического радиуса полиэлектролитов.

6.4.12. Измерение ^-потенциала СаСОз микрочастиц.

6.4.13. Лиофильное высушивание.

6.4.14. УФ-видимая спектроскопия.

6.4.15. Флуоресцентная спектроскопия.

6.4.16. Рентгеноструктурный анализ широкого угла рассеяния. результаты и обсуждение

Глава 7. Иммобилизация ХТР путем ПАП на агрегатах белка.

7.1. Получение, структура и свойства белок-содержащих микрочастиц

7.2. Высвобождение белка из микрочастиц.

7.3. Изучение активности иммобилизованного ХТР.

Глава 8. Включение белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа.

8.1. Синтез и характеристика пористых микрочастиц из карбоната кальция

8.2. Получение и структура (ПАА/ПСС)4 микросфер "каркасного" типа.

8.3. Белок-содержащие "каркасные" ПЭ микросферы. а. Включение белков в сформированные микросферы (ПАА/ПСС)4. б. Создание дополнительной ПЭ оболочки на поверхности "каркасных" микросфер с белком. в. Изучение каталитической активности микросфер с ХТР в водно-органических смесях. г. Модификация микросфер наночастицами РезС>4.

8.4. Формирование ПЭ микросфер путем ПАП на белок-содержащих СаСОз микрочастицах.

8.4.1. Изучение включения белков в СаСОз микрочастицы. а. Метод адсорбции в порах (АП). б. Метод совместного осаждения (СО).

8.4.2. Получение белок-содержащих ПЭ микросфер. а. Включение белков в микросферы (ПАА/ПСС)4. б. Включение Asp f2 в микросферы (ПЛЛ/АЛГ)4.

Изучение иммунного ответа на микросферы с Asp f2 in vivo.

8.5. Сравнительные характеристики методов включения белков в ПЭ микросферы "каркасного типа".

Глава 9. Иммобилизация белков в гелевые микросферы с ПЭ оболочкой

9.1. Включение ОВА в гелевые Са-альгинатные микросферы.

9.2. Высвобождение ОВА из Са-альгинатных микросфер.

9.3. Модификация микросфер ПГК-ПЭГ.

ВЫВОДЫ.

Одним из интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии является иммобилизация высокомолекулярных биологически активных веществ (ВБАВ) в нано- и микрообъекты, такие как липосомы, мицеллы, микро- и нано-частицы (-капсулы, -сферы). Такого рода системы используются в различных областях промышленности (в том числе в каталитических целях) и медицины (в качестве систем направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов).

Традиционные методы включения ВБАВ в микрообъекты фиксированного размера и формы (сферы, капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и т.д. [1]. Эти методы предполагают использование органических растворителей, поверхностно-активных соединений, а также поперечно-сшивающих агентов, что может повлечь снижение биологической активности иммобилизованного препарата. Более того, в большинстве случаев, получаемые сферические микрочастицы полидисперсны. Поэтому актуальной является разработка новых методов иммобилизации ВБАВ в микрообъекты в мягких условиях.

Данная работа посвящена разработке новых подходов к включению ВБАВ (на примере белков) в полиэлектролитные микрочастицы с применением метода последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов. Этот процесс не требует сложного аппаратурного оформления и осуществляется в водных растворах, являющихся естественной средой для большинства ВБАВ. Особое внимание уделено возможности дизайна полученных микрочастиц в зависимости от цели их применения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрены полиэлектролитные (ПЭ) пленки и микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов, а также способы включения высокомолекулярных соединений в такие объекты. Поэтому первая глава литературного обзора посвящена образованию комплексов между полиэлектролитами, то есть интерполиэлектролитным комплексам.

выводы

1. Разработан метод включения белков в ПЭ микрочастицы путем ПАП на высоленных агрегатах белка. Полученные микрочастицы характеризуются высоким содержанием белка (50-80 вес. %), высвобождение которого регулируется путем изменения числа стадий ПАП и рН среды.

2. Получены и охарактеризованы пористые СаСОз сферические микрочастицы с узким распределением по размерам и контролируемым диаметром от 3 до 12 микрон. Предложено получение ПЭ микросфер "каркасного" типа и гелевых микросфер с оболочкой путем ПАП на деградируемых СаСОз микрочастицах с последующим удалением карбонатной матрицы. Диаметр микросфер, равный диаметру исходных СаСОз микрочастиц, может быть задан от 3 до 12 микрон.

3. Разработаны методы включения белков в ПЭ микросферы "каркасного" типа и гелевые микросферы с ПЭ оболочкой. Методы основаны на включении белка в сформированные микросферы и использовании при получении ПЭ микросфер белок-содержащих СаСОз микрочастиц.

4. Предложен способ покрытия "каркасных" микросфер ПЭ оболочкой, что дает возможность удержать белок в микросферах при изменении рН и диэлектрической проницаемости среды. При этом включенный фермент сохраняет биологическую активность.

5. Показана возможность включения белков в гелевые микросферы на основе биосовместимых ПЭ. Высокое содержание белка (55 % по весу для овальбумина), а также медленное и контролируемое высвобождение белка позволяют использовать гелевые микросферы в качестве систем доставки включенного препарата.

6. Продемонстрирована принципиальная возможность практического применения микросфер, в частности, в качестве биокатализаторов в водно-органичеких средах и для получения вакцин против внутриклеточных патогенов.

7. Технологичность частиц может быть расширена включением магнитных наночастиц Рез04 (отделение частиц от реакционной смеси при воздействии магнитного поля). Модификация поверхности микросфер, например при адсорбции на поверхности ПКГ-ПЭГ, позволяет подавить нежелательное взаимодействие с компонентами биологических сред.

1. Arshady R., Microspheres, microcapsules and liposomes. Vol. II: Medical and biotechnology applications. Chapter 14, Targeted delivery of microparticulate carriers. London: Citus books, 1999, 683 p.

2. Зезин А.Б., Рогачева В.Б. Полиэлектролитные комплексы. М.: Химия, 1973,27 с.

3. Паписов И.М., Литманович А.А. Специфичность кооперативных взаимодействий между простыми синтетическими макромолекулами и ее связь с длиной цепи. ВМС А, 1977, т. 19(4), с. 716-722.

4. Biesheuvel P.M., Stuart М. А. С. Electrostatic Free Energy of Weakly Charged Macromolecules in Solution and Intermacromolecular Complexes Consisting of Oppositely Charged Polymers. Langmuir, 2004, v. 20, p. 2785-2791.

5. Зезин А.Б. Кооперативные реакции между полиэлектролитами и полиэлектролитные комплексы. Диссертация докт. хим. наук., М.: МГУ, 1977,370 с.

6. Зезин А.Б., Луценко В.И., Рогачева В.Б. Кооперативное взаимодействие полиэлектролитов в водных растворах. ВМС А, 1972, т. 14(4), с. 772-779.

7. Зезин А.Б., Кабанов В.А. Новый класс комплексных водорастворимых полиэлектролитов. Успехи химии, 1982, т. 51(9), с. 1447-1483.

8. Калюжная Р.И. Реакции образования и свойства полиэлектролитных комплексов на основе слабых полиэлектролитов. Диссертация канд. хим. наук, М.: МГУ, 1975, 129 с.

9. Зезин А.Б., Рогачева В.Б., Комаров B.C., Разводовский Е.Ф. Образование амидных связей в полиэлектролитных комплексах. ВМС А, 1975, т. 17(12), с. 2637-2643.

10. Изумрудов В.А., Бронич Т.К., Новикова М.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Реакции замещения в трехкомпонентных макромолекулярных системах. ВМС А, 1982, т. 14(2), с. 339-348.

11. Кабанов В. А., Зезин А.Б., Харенко А.В., Калюжная Р.И. Водорастворимые полиэлектролитные комплексы. Докл. АН СССР, 1976, т. 230, с. 139-145.

12. Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Принципы образования водорастворимых ПЭК. ВМС Б, 1979, т. 21, с. 84-89.

13. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Реакции образования нестехиометричных полиэлектролитных комплексов. ВМС А, 1983, т. 25, с. 1972-1978.

14. Изумрудов В.А., Касаикин В.А., Зезин А.Б. Конформация полиэлектролитов и реакции образования полиэлектролитных комплексов. ВМС, А, 1976, т. 18, с. 2488-2494.

15. Харенко О.А., Изумрудов В.А., Харенко А.В., Касаикин В.А., Зезин

16. A.В., Кабанов В.А. Процессы ассоциации-диссоциации в растворах нестехиометрических полиэлектролитных комплексов. ВМС А, 1980, т. 22(1), с. 218-224.

17. Изумрудов В.А., Бронич Т.К., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Кинетика и механизм реакции макромолекулярного замещения в растворах полиэлектролитов. Док. АН СССР, 1984, т. 278(2), с. 404-408.

18. Бакеев К.Н., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Эффект молекулярной избирательности в интерполимерных реакциях. ВМС Б, 1987, т. 29(7), с. 483-484.

19. Бакеев К.Н., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Кинетика и механизм реакции образования полиэлектролитных комплексов. Докл. АН СССР, 1987, т. 299, с. 1405-1408.

20. Изумрудов В.А., Савицкий А.П., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Особенности кинетики и механизма интерполиэлектролитных реакций. ВМС Б, 1983, т. 25, с. 805-806.

21. Кабанов В.А., Евдаков В.П., Мустафаев М.И., Блохина В.Д., Агафьева

22. B.C. Кооперативное связывание сывороточного альбумина с кватернизованными поли-4-винилпиридинами и структура образующихся комплексов. Мол. Биол., 1977, т. 11(3), с. 582-589.

23. Кабанов В. А., Каргина О.В., Ульянова М.В., Литвинов И. А. Исследование надмолекулярной структуры кристаллизующихся полиэлектролитных комплексов на основе изотактической полиакриловой кислоты. ВМС Б, 1982, т. 24, с. 17-19.

24. Калюжная Р.И., Рудман А.Р., Венгерова Н.А., Разводовский Е.Ф., Эльцефон Б.С., Зезин А.Б. Условия образования и свойства мембран из полиэлектролитных комплексов на основе слабых полиэлектрлитов. ВМС А, 1975, т. 17(12), с. 2786-2792.

25. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами. Докл. АН СССР, 1984, т. 275, с. 1120-1123.

26. Кабанов В.А., Мустафаев В.И. Влияние ионной силы и рН среды на поведение комплекса БСА с поли-4-винил-Ы-этилпиридинийбромидом в водных растворах. ВМС А, 1981, т. 23, с. 255-260.

27. Мустафаев М.И. Комплексы неприродных полиэлектролитов с белками. Диссертация докт. хим. наук, М.: МГУ, 1981, 344 с.

28. Стрельцова З.А. Свойства белков в комплексе с кислыми полисахаридами и другими полиэлектролитами. Диссертация канд. хим. наук, М.: 1975, 137 с.

29. Vorlop К., Capan Е., Dautzenberg Н., Czichocki G. Novel and effective entrapment of polyelectrolyte-enzyme-complexes in LentiKats®. IX International BRG Workshop of Bioencapsulation, Poland, Warsaw, 2001, poster 2.

30. Купцова C.B. Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами. Диссертация канд. хим. наук, М.: 2000, 128 с.

31. Гладилин А.К. Принципы конструирования биокаталитических систем на основе полиэлектролитов в среде органических растворителей. Диссертация докт. хим. наук, М.: МГУ, 1999, 293 с.

32. Ларионова Н.И., Унксова Н.Е., Миронов В.А., Сахаров И.Ю., Казанская Н.Ф., Березин И.В. Исследование комплексообразования растворимых карбоксиметиловых эфиров полисахаридов с белками. ВМС А, 1981, т. 23(8), с. 1823-1829.

33. Самсонов В.Г. Полимерные комплексы, включающие синтетические полиэлектролиты и физиологически активные вещества. ВМС А, 1979, т. 21(4), с. 725-733.

34. Агеева Е.В., Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабилизация антител в смесях "вода-этанол" комплексообразованием с гепарином. Вестник Московского Университета. Серия Химия., 2003, т. 44(1), с. 3-5.

35. Dumitriu S. and Chornet E. Inclusion and release of proteins from polysaccharide-based polyion complexes. Adv. Drug Deliv. Rev., 1998, v. 31, p. 223-246.

36. Xia J., Dubin P.L., Kim Y., Muhoberac B.B. and Klimkowski V.J. Electrophoretic and Quasi-Elastic Light Scattering of Soluble Protein-Polyelectrolyte Complexes. J. Phys. Chem., 1993, v. 97, p. 4528-4534.

37. Mattison K.W., Brittain I.J. and Dubin P.L. Protein-Polyelectrolyte Phase Boundaries. Biotechnol. Prog., 1995, v. 77, p. 632-637.

38. Wen Y.P. and Dubin P.L. Potentiometric Studies of the Interaction of Bovine Serum Albumin and Poly Dimethyldiallyammonium Chloride). Macromolecules, 1997, v. 30, p. 7856-7861.

39. Gao J.Y., Dubin P.L. and Muhoberac B.B. Capillary Electrophoresis and Dynamic Light Scattering Studies of Structure and Binding Characteristics of Protein-Polyelectrolyte Complexes. J. Phys. Chem., 1998, v. 702, p. 5529-5535.

40. Mattison K.W. and Dubin P.L. Description and Characterization of Soluble Protein-Polyelectrolyte Complexes. Polym. Prep., 1998, v. 39, p. 667-668.

41. Zaitsev S.Y., Gorokhova I.V., Kashtigo T.V., Zintchenko A. and Dautzenberg H. General approach for lipases immobilization in polyelectrolyte complexes. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2003, v. 221, p. 209-220.

42. Kabanov V.A., Skobeleva V.B., Rogacheva V.B. and Zezin A.B. Sorption of Proteins by Slightly Cross-Linked Polyelectrolyte Hydrogels: Kinetics and Mechanism. J. Phys. Chem. B, 2004, v. 108, p. 1485-1490.

43. Langer R. New methods of drug delivery. Science, 1990, v. 249, p. 1527-1533.

44. Hoffman A.S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, v. 43, p. 3-12.

45. Kokufuta E. and Takahashi K. Stoichiometric Complexation of Bovine Trypsin with Potassium Poly(Vinyl Alcohol Sulfate) and Enzyme Activity of the Complex. Polymer, 1990, v. 31, p. 1177-1182.

46. Muniruzzaman M., Hijikata T.S., Nagano A. and Ikada Y. Structure Change of Basic Fibroblast Growth Factor Through Gelatin Complexation. Polym. Prep., 1998, v. 39, p. 247-248.

47. Pierce B.L.J., Gibson T.D. and Bunnel R.A. Preliminary Model and Evidence for the Mechanism of Stabilization of Analytical Enzymes in Aqueous Solution by Electrolyte and Sugar Derivatives. Spec. Publ.-R. Soc. Chem., 1998, v. 767, p. 54-60.

48. Jiang H.L. and Zhu K.J. Preparation and characterization of protein-loaded polyanion/gelatin complex. Pharm. Dev. and Tech., 2001, v. 6(2), p. 231-240.

49. Iler R.K. Multilayers of Colloidal Particles. J. Colloid Interface Sci., 1966, v. 21(6), p. 569-575.

50. Lee H., Kepley L.J., Hong H.G., Akhter S. and Mallouk Т.Е. Adsorption of Ordered Zirconium Phosphonate Multilayer Films on Silicon and Gold Surfaces. J. Phys. Chem., 1988, v. 92(9), p. 2597-2601.

51. Decher G. and Hong J.D. Buildup of Ultrathin Multilayer Films by a Self-Assembly Process. 1. Consecutive Adsorption of Anionic and Cationic Bipolar Amphiphiles on Charged Surfaces. Makromol. Chem. Macromol. Symp., 1991, v. 46, p. 321-327.

52. Decher G., Hong J.D. and Schmitt J. Buildup of Ultrathin Multilayer Films by a Self-Assembly Process. 3. Alternating Adsorption of Anionic and Cationic Polyelectrolytes on Charged Surfaces. Thin Solid Films, 1992, v. 210(1-2), p. 831-835.

53. Houska M. and Brynda E. Interactions of proteins with polyelectrolytes at solid/liquid interfaces: Sequential adsorption of albumin and heparin. J. Colloid Interface Sci., 1997, v. 188(2), p. 243-250.

54. Lvov Y., Onda M., Ariga K. and Kunitake T. Ultrathin films of charged polysaccharides assembled alternately with linear polyions. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1998, v. 9(4), p. 345-355.

55. Dhamodharan R. and McCarthy T.J. Adsorption of alginic acid and chondroitin sulfate-A to amine functionality introduced on polychlorotrifluoroethylene and glass surfaces. Macromolecules, 1999, v. 32(12), p. 4106-4112.

56. Qiu X.P., Leporatti S., Donath E. and Mohwald H. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles. Langmuir, 2001, v. 17(17), p. 5375-5380.

57. Decher G., Lehr В., Lowack K., Lvov Y. and Schmitt J. New Nanocomposite Films for Biosensors Layer-by-Layer Adsorbed Films of Polyelectrolytes, Proteins or DNA. Biosens. Bioelectron., 1994, v. 9(9-10), p. 677-684.

58. Lvov Y., Ariga K., Ichinose I. and Kunitake T. Layer-by-layer architecture of concavalin A by means of electrostatic and biospecific interactions. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1995, v. 22, p. 2313-2314.

59. Lvov Y., Ariga K., Ichinose I. and Kunitake T. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. J. Amer. Chem. Soc., 1995, v. 117(22), p. 6117-6123.

60. Lvov Y.M. and Sukhorukov G.B. Protein architecture: Assembly of ordered films by means alternated adsorption of opposite charged macromolecules. Membr. Cell. Biol., 1997, v. 11, p. 277-303.

61. Sukhorukov G.B., Montrel M.M., Petrov A.I., Shabarchina L.I. and Sukhorukov B.I. Multilayer films containing immobilized nucleic acids. Their structure and possibilities in biosensor applications. Biosens. Bioelectron., 1996, v. 11(9), p. 913-922.

62. Stockton W.B. and Rubner M.F. Molecular-level processing of conjugated polymers .4. Layer-by- layer manipulation of polyaniline via hydrogen-bonding interactions. Macromolecules, 1997, v. 30(9), p. 2717-2725.

63. Sukhishvili S.A. and Granick S. Layered, erasable polymer multilayers formed by hydrogen-bonded sequential self-assembly. Macromolecules, 2002, v. 35(1), p. 301-310.

64. Kotov N.A. Layer-by-layer self-assembly: The contribution of hydrophobic interactions. Nanostruct. Mater., 1999, v. 12(5-8), p. 789-796.

65. Gao M.Y., Richter В., Kirstein S. and Mohwald H. Electroluminescence studies on self-assembled films of PPV and CdSe nanoparticles. J. Phys. Chem. B, 1998, v. 102(21), p. 4096-4103.

66. Gao M.Y., Gao M.L., Zhang X., Yang Y., Yang B. and Shen J.C. Constructing РЫ2 Nanoparticles into a Multilayer Structure Using the Molecular Deposition (Md) Method. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1994, v. 24, p. 2777-2778.

67. Feldheim D.L., Grabar K.C., Natan M.J. and Mallouk Т.Е. Electron transfer in self-assembled inorganic polyelectrolyte/metal nanoparticle heterostructures. J. Amer. Chem. Soc., 1996, v. 118(32), p. 7640-7641.

68. Schmitt J., Decher G., Dressick W.J., Brandow S.L., Geer R.E., Shashidhar R. and Calvert J.M. Metal nanoparticle/polymer superlattice films: Fabrication and control of layer structure. Adv. Mater., 1997, v. 9(1), p. 61-66.

69. Yonezawa Т., Onoue S.Y. and Kunitake T. Growth of closely packed layers of gold nanoparticles on an aligned ammonium surface. Adv. Mater., 1998, v. 10(5), p. 414-416.

70. Keller S.W., Kim H.N. and Mallouk Т.Е. Layer-by-Layer Assembly of Intercalation Compounds and Heterostructures on Surfaces toward Molecular Beaker Epitaxy. J. Amer. Chem. Soc., 1994, v. 116(19), p. 8817-8818.

71. Нао E.C., Yang В., Zhang J.H., Zhang X., Sun J.Q. and Shen S.C. Assembly of alternating Ti02/CdS nanoparticle composite films. J. Mater. Chem., 1998, v. 8(6), p. 1327-1328.

72. Caruso F., Caruso R.A. and Mohwald H. Production of hollow microspheres from nanostructured composite particles. Chem. Mater., 1999, v. 11(11), p. 3309-3314.

73. Schutte M., Kurth D.G., Linford M.R., Colfen H. and Mohwald H. Metallosupramolecular thin polyelectrolyte films. Angew. Chem. Int. Ed., 1998, v. 37(20), p. 2891-2893.

74. Kurth D.G. and Osterhout R. In situ analysis of metallosupramolecular coordination polyelectrolyte films by surface plasmon resonance spectroscopy. Langmuir, 1999, v. 15(14), p. 4842-4846.

75. Ariga K., Lvov Y., Onda M., Ichinose I. and Kunitake T. Alternately assembled ultrathin film of silica nanoparticles and linear polycations. Chem. Lett., 1997, v. 2, p. 125-126.

76. Lvov Y., Ariga K., Onda M., Ichinose I. and Kunitake T. Alternate assembly of ordered multilayers of Si02 and other nanoparticles and polyions. Langmuir, 1997, v. 13(23), p. 6195-6203.

77. Caruso F. and Mohwald H. Preparation and characterization of ordered nanoparticle and polymer composite multilayers on colloids. Langmuir, 1999, v. 15(23), p. 8276-8281.

78. Caruso R.A., Susha A. and Caruso F. Multilayered titania, silica, and Laponite nanoparticle coatings on polystyrene colloidal templates and resulting inorganic hollow spheres. Chem. Mater., 2001, v. 13(2), p. 400-409.

79. Serizawa Т., Takeshita H. and Akashi M. Electrostatic adsorption of polystyrene nanospheres onto the surface of an ultrathin polymer film prepared by using an alternate adsorption technique. Langmuir, 1998, v. 14(15), p. 40884094.

80. Schmitt J., Grunewald Т., Decher G., Pershan P.S., Kjaer K. and Losche M. Internal Structure of Layer-by-Layer Adsorbed Polyelectrolyte Films a

81. Neutron and X-Ray Reflectivity Study. Macromolecules, 1993, v. 26(25), p. 7058-7063.

82. Kotov N.A., Dekany I. and Fendler J.H. Ultrathin graphite oxide-polyelectrolyte composites prepared by self-assembly: Transition between conductive and non-conductive states. Adv. Mater., 1996, v. 8(8), p. 637-&.

83. Eckle M. and Decher G. Tuning the Performance of Layer-by-Layer Assembled Organic Light Emitting Diodes by Controlling the Position of Isolating Clay Barrier Sheets. Nanoletters, 2001, v. 1(1), p. 45-49.

84. Schoeler В., Kumaraswamy G. and Caruso F. Investigation of the Influence of Polyelectrolyte Charge Density on the Growth of Multilayer Thin Films Prepared by the Layer-by-Layer Technique. Macromolecules, 2002, v. 35, p. 889-897.

85. Caruso F., Serizawa Т., Furlong D.N. and Okahata Y. Quartz Crystal Microbalance and Surface Plasmon Resonance Study of Surfactant Adsorption onto Gold and Chromium Oxide Surfaces. Langmuir, 1995, v. 11, p. 1546-1552.

86. Akari S., Schrepp W. and Horn D. Imaging of single polyethylenimine polymers adsorbed on negatively charged latex spheres by chemical force microscopy. Langmuir, 1996, v. 12(4), p. 857-860.

87. Losche M., Schmitt J., Decher G., Bouwman W.G. and Kjaer K. Detailed structure of molecularly thin polyelectrolyte multilayer films on solid substrates as revealed by neutron reflectometry. Macromolecules, 1998, v. 31(25), p. 8893-8906.

88. Fendler J.H. Self-assembled nanostructured materials. Chem. Mater., 1996, v. 8(8), p. 1616-1624.

89. Kotov N.A., Haraszti Т., Turi L., Zavala G., Geer R.E., Dekany I. and Fendler J.H. Mechanism of and defect formation in the self-assembly of polymeric polycation-montmorillonite ultrathin films. J. Amer. Chem. Soc., 1997, v. 119(29), p. 6821-6832.

90. Laschewsky A., Mayer В., Wischerhoff E., Arys X. and Jonas A. Polyelectrolyte complexes at interfaces. Berichte Der Bunsen-Gesellschaft-Physical Chemistry Chemical Physics, 1996, v. 100(6), p. 1033-1038.

91. Fischer P., Laschewsky A., Wischerhoff E., Arys X., Jonas A. and Legras R. Polyelectrolytes bearing azobenzenes for the functionalization of multilayers. Macromol. Symp., 1999, v. 137, p. 1-24.

92. Hammond P.T. Recent explorations in electrostatic multilayer thin film assembly. Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 1999, v. 4(6), p. 430-442.

93. Bertrand P., Jonas A., Laschewsky A. and Legras R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties. Macromol. Rapid Commun., 2000, v. 21(7), p. 319348.

94. Shiratori S.S. and Rubner M.F. pH-Dependent Thickness Behavior of Sequentially Adsorbed Layers of Weak Polyelectrolytes. Macromolecules, 2000, v. 33, p. 4213-4219.

95. Schonhoff M. Layered polyelectrolyte complexes: physics of formation and molecular properties. J. Phys.: Condens. Matter, 2003, v. 15, p. 1781-1808.

96. Dubas S.T. and Schlenoff J.B. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid: Construction and deconstruction. Macromolecules, 2001, v. 34(11), p. 3736-3740.

97. Arys X., Jonas A.M., Laguitton В., Laschewsky A., Legras R. and Wischerhoff E. Ultrathin multilayers made by alternate deposition of ionenes and polyvinylsulfate: from unstable to stable growth. Thin Solid Films, 1998, v. 329, p. 734-738.

98. Dubas S.T. and Schlenoff J.B. Factors controlling the growth of polyelectrolyte multilayers. Macromolecules, 1999, v. 32(24), p. 8153-8160.

99. Decher G., Lvov Y. and Schmitt J. Proof of Multilayer Structural Organization in Self-Assembled Polycation Polyanion Molecular Films. Thin Solid Films, 1994, v. 244(1-2), p. 772-777.

100. Laschewsky A., Wischerhoff E., Bertrand P. and Delcorte A. Polyelectrolyte multilayers containing photoreactive groups. Macromol. Chem. Phys., 1997, v. 198(10), p. 3239-3253.

101. Ariga K., Lvov Y. and Kunitake T. Assembling alternate dye-polyion molecular films by electrostatic layer-by-layer adsorption. J. Amer. Chem. Soc., 1997, v. 119(9), p. 2224-2231.

102. Laschewsky A., Wischerhoff E., Denzinger S., Ringsdorf H., Delcorte A. and Bertrand P. Molecular recognition by hydrogen bonding in polyelectrolyte multilayers. Chem. Europ. J., 1997, v. 3(1), p. 34-38.

103. Hoogeveen N.G., Stuart M.A.C., Fleer G.J. and Bohmer M.R. Formation and stability of multilayers of polyelectrolytes. Langmuir, 1996, v. 12(15), p. 36753681.

104. Hsieh M.C., Farris R.J. and McCarthy T.J. Surface "priming" for layer-by-layer deposition: Polyelectrolyte multilayer formation on allylamine plasma-modified poly(tetrafluoroethylene). Macromolecules, 1997, v. 30(26), p. 84538458.

105. Schlenoff J.B., Ly H. and Li M. Charge and mass balance in polyelectrolyte multilayers. J. Amer. Chem. Soc., 1998, v. 120(30), p. 7626-7634.

106. Caruso F. and Mohwald H. Protein multilayer formation on colloids through a stepwise self-assembly technique. J. Amer. Chem. Soc., 1999, v. 121(25), p. 6039-6046.

107. Okahata Y., Lim H. and Hachiya S. Photoresponsible capsule membranes. Permeability control of NaCl fro;m a nylon capsule coated with a synthetic bilayer-membrane containing an azo-chromophore. Makromol. Chem., Rapid. Commun, 1983, v. 4, p. 303-306.

108. Dante S., Advincula R., Frank C.W. and Stroeve P. Photoisomerization of Polyionic Layer-by-Layer Films Containing Azobenzene. Langmuir, 1999, v. 15, p. 193-201.

109. Onda M., Lvov Y., Ariga K. and Kunitake T. Sequential actions of glucose oxidase and peroxidase in molecular films assembled by layer-by-layer alternate adsorption. Biotechnol. Bioeng., 1996, v. 51(2), p. 163-167.

110. Onda M., Lvov Y., Ariga K. and Kunitake T. Sequential reaction and product separation on molecular films of glucoamylase and glucose oxidase assembled on an ultrafilter. J. Ferment. Bioeng., 1996, v. 82(5), p. 502-506.

111. Stroeve P., Vasquez V., Coelho M.A.N, and Rabolt J.F. Gas transfer in supported films made by molecular self-assembly of ionic polymers. Thin Solid Films, 1996, v. 285, p. 708-712.

112. Krasemann L. and Tieke B. Ultrathin self-assembled polyelectrolyte membranes for pervaporation. J. Membr. Sci., 1998, v. 150(1), p. 23-30.

113. Tieke В., van Ackern F., Krasemann L. and Toutianoush A. Ultrathin self-assembled polyelectrolyte multilayer membranes. Eur. Phys. J. E, 2001, v. 5(1), p. 29-39.

114. Schlenoff J.B., Multilayer thin films: sequential assembly of nanocomposite materials. Weinheim: Wiley-VCH, 2003, 524 p.

115. Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov V.I. and Mohwald H. Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: anovel approach to colloid design. Polym. Adv. Technol., 1998, v. 9(10-11), p. 759-767.

116. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Budde A. and Mohwald H. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 1998, v. 137(1-3), p. 253-266.

117. Mayya S., Schoeler B. and Caruso F. Preparation and organisation of nanoscale polyelectrolyte-coated gold nanoparticles. Adv. Funct. Mater., 2003, v. 13(3), p. 183-188.

118. Shenoy D.B., Antipov A.A., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Layer-by-Layer Engineering of Biocompatible, Decomposable Core-Shell Structures. Biomacromolecules, 2003, v. 4(2), p. 265-272.

119. Antipov A.A., Shchukin D., Fedutik Y., Petrov A.I., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2003, v. 224, p. 175184.

120. Caruso F., Yang W.J., Trau D. and Renneberg R. Microencapsulation of uncharged low molecular weight organic materials by polyelectrolyte multilayer self-assembly. Langmuir, 2000, v. 16(23), p. 8932-8936.

121. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Donath E. and Mohwald H. Sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules. J. Phys. Chem. B,2001, v. 105(12), p. 2281-2284.

122. Donath E., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules. Nachrichten Aus Chemie Technik Und Laboratorium, 1999, v. 47(4), p. 400-405.

123. Moya S., Dahne L., Voigt A., Leporatti S., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte multilayer capsules templated on biological cells: core oxidation influences layer chemistry. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2001, v. 183-185, p. 27-40.

124. Neu В., Voigt A., Mitlohner R., Leporatti S., Gao C.Y., Donath E., Kiesewetter H., Mohwald H., Meiselman H.J. and Baumler H. Biological cells as templates for hollow microcapsules. J. Microencapsul., 2001, v. 18(3), p. 385-395.

125. Donath E., Moya S., Neu В., Sukhorukov G.B., Georgieva R., Voigt A., Baumler H., Kiesewetter H. and Mohwald H. Hollow Polymer Shells from Biological Templates: Fabrication and Potential Applications. Chem. Eur. J.,2002, v. 8(23), p. 5481-5485.

126. Бобрешова М., Сухоруков Г.Б., Сабурова Е.А., Елфимова Л.И., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Лактатдегидрогеназа в интерполиэлектролитном комплексе. Функция и стабильность. Биофизика, 1999, т. 44(5), с. 813-820.

127. Caruso F., Trau D., Mohwald H. and Renneberg R. Enzyme Encapsulation in Layer-by-Layer Engineered Polymer Multilayer Capsules. Langmuir, 2000, v. 16, p. 1485-1488.

128. Trubetskoy V.S., Loomis A., Hagstrom J.E., Budker V.G. and Wolff J.A. Layer-by-layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles. Nucl. Acid Res., 1999, v. 27(15), p. 3090-3095.

129. Sukhorukov G.B., Donath E., Moy S. and Susha A.S. Microencapsulation by means of step-wise adsorption of polyelectrolytes. Microencapsulation, 2000, v. 17(2), p. 177-185.

130. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate. Biomacromolecules, 2002, v. 3(3), p. 579-590.

131. Balabushevitch N.G., Tiourina O.P., Volodkin D.V., Larionova N.I. and Sukhorukov G.B. Loading the Multilayer Dextran Sulfate/Protamine Microsized Capsules with Peroxidase. Biomacromolecules, 2003, v. 4(5), p. 1191-1197.

132. Balabushevitch N.G. and Larionova N.I. Fabrication and characterization of polyelectrolyte microparticles with protein. Biochemistry (Moscow), 2004, v. 69(7), p. 930-936.

133. Pei R., Cui X., Yang X. and Wang E. Assembly of Alternating Polycation and DNA Multilayer Films by Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Biomacromolecules, 2002, v. 13, p. 124-130.

134. Caruso F., Fiedler H. and Haage K. Assembly of beta-glucosidase multilayers on spherical colloidal particles and their use as active catalysts. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2000, v. 169(1-3), p. 287-293.

135. Schuler C. and Caruso F. Preparation of enzyme multilayers on colloids for biocatalysis. Macromol. Rapid Commun., 2000, v. 21(11), p. 750-753.

136. Ai H., Jones S.A. and Lvov Y.M. Biomedical Applications of Electrostatic Layer-by-Layer Nano-Assembly of Polymers, Enzymes, and Nanoparticles. Cell Biochem. Biophys., 2003, v. 39, p. 23-43.

137. Moya S., Donath E., Sukhorukov G.B., Auch M., Baumler H., Lichtenfeld H. and Mohwald H. Lipid coating on polyelectrolyte surface modified colloidal particles and polyelectrolyte capsules. Macromolecules, 2000, v. 33(12), p. 4538-4544.

138. Caruso F. Hollow capsule processing through colloidal templating and self-assembly. Chem. Eur. J. A, 2000, v. 6(3), p. 413-419.

139. Caruso F., Susha A.S., Giersig M. and Mohwald H. Magnetic core-shell particles: Preparation of magnetite multilayers on polymer latex microspheres. Adv. Mater., 1999, v. 11(11), p. 950-953.

140. Donath E., Sukhorukov G.B., Caruso F., Davis S.A. and Mohwald H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed., 1998, v. 37(16), p. 2202-2205.

141. Leporatti S., Voigt A., Mitlohner R., Sukhorukov G., Donath E. and Mohwald H. Scanning force microscopy investigation of polyelectrolyte nano- and microcapsule wall texture. Langmuir, 2000, v. 16(9), p. 4059-4063.

142. Caruso F., Caruso R.A. and Mohwald H. Nanoengineering of inorganic and hybrid hollow spheres by colloidal templating. Science, 1998, v. 282(5391), p. 1111-1114.

143. Itoh Y., Matsusaki M., Kida T. and Akashi M. Preparation of Biodegradable Hollow Nanocapsules by Silica Template Method. Chem. Lett., 2004, v. 33(12), p. 1552-1553.

144. Gao C., Donath E., Mohwald H. and Shen J. Spontaneous Deposition of Water-Soluble Substances into Microcapsules: Phenomenon, Mechanism, and Application. Angew. Chem. Int. Ed., 2002, v. 41(20), p. 3789-3793.

145. Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Leporatti S., Radtchenko I.L., Donath E. and Mohwald H. Polyelectrolyte multilayer capsule permeability control. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 2002, v. 198, p. 535-541.

146. Ibarz G., Dahne L., Donath E. and Mohwald H. Resealing of polyelectrolyte capsules after core removal. Macromol. Rapid Commun., 2002, v. 23(8), p. 474-478.

147. Gao C., Leporatti S., Moya S., Donath E. and Mohwald H. Swelling and Shrinking of Polyelectrolyte Microcapsules in Response to Changes in Temperature and Ionic Strength. Chem. Europ. J., 2003, v. 9(4), p. 915-920.

148. Moya S., Sukhorukov G.B., Auch M., Sonath E. and Mohwald H. Microencapsulation of organic solvents in polyelectrolyte multilayer micrometer-sized shells. J. Colloid Interface Sci., 1999, v. 216, p. 297-302.

149. Arshady R., Microspheres, microcapsules and liposomes. Vol. II: Medical and biotechnology applications. Part I and II. London: Citus books, 1999, 683 p.

150. Couvreur P. and Puisieux F. Nano- and microparticles for the delivery of polypeptides and proteins. Adv. Drug Deliv. Rev., 1993, v. 10, p. 141-162.

151. Rafati H., Coombes A., Adler J., J. H. and Davis S.S. Protein-loaded poly(DL-lactide-co-glycolide) microparticles for oral administration: formulation, structural and release characteristics. J. Controlled Release, 1997, v. 43, p. 89-102.

152. Lacasse F.X., Hildgen P. and McMullen J.N. Surface and morphology of spray-dried pegylated PLA microspheres. Int. J. Pharm., 1998, v. 174, p. 101109.

153. Prior S., Gamazo C., Irache J.M., Merkle H.P. and Gander B. Gentamicin encapsulation in PLA:PLGA microspheres in view of treating Brucella infections. Int. J. Pharm., 2000, v. 196, p. 115-125.

154. Yang L. and Alexandridis P. Physicochemical aspects of drug delivery and release from polymer-based colloids. Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 2000, v. 5, p. 132-143.

155. Brynda E. and Houska M. Preparation of organized protein multilayers. Macromol. Rapid Commun., 1998, v. 19, p. 173-176.

156. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. Incorporation of Macromolecules into Polyelectrolyte micro- and nanocapsules via surface controlled precipitation on colloidal particles. Colloid. Surf. A, 2000, v. 202, p. 127-131.

157. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B. and Mohwald H. A novel method for encapsulation of poorly water-soluble drugs: precipitation in polyelectrolyte multilayer shells. Int. J. Pharm., 2002, v. 242, p. 219-223.

158. Tiourina O.P., Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Larionova N.I., Lvov Y. and Mohwald H. Entrapment of alpha-chymotrypsin into hollow polyelectrolyte microcapsules. Macromol. Biosci., 2001, v. 1(5), p. 209-214.

159. Zhon S., Deng X. and Li H. Investigation on a novel core-coated microspheres protein delivery system. J. Controlled Release, 2003, v. 75(1), p. 27-36.

160. Ueng S.W.N., Yana L.I., Lee N., Lin S.S., Chan E.C. and Weng J.N. In vivo study of biodegradable alginate antibiotic beads in rabbits. J. Orthopaedic Res., 2004, v. 22(3), p. 592-599.

161. Дарбре А. Практическая химия белка. M.: Мир, 1989, 621 с.

162. Lippmann F., Sedimentary Carbonate Minerals. Berlin: Springer-Verlag, 1973, 146 p.

163. Colfen H. and Qi L. A Systematic Examination of the Morphogenesis of Calcium Carbonate in the Presence of a Double-Hydrophilic Block Copolymer. Chem. Eur. J., 2001, v. 7(1), p. 106-116.

164. Guo J. and Severtson S.J. Application of Classical Nucleation Theory To Characterize the Influence of Carboxylate-Containing Additives on СаСОЗ

165. Nucleation at High Temperature, pH, and Ionic Strength. Ind. Eng. Chem. Res., 2003, v. 42, p. 3480-3486.

166. Naka K. and Chujo Y. Control of Crystal Nucleation and Growth of Calcium Carbonate by Synthetic Substrates. Chem. Mater., 2001, v. 13, p. 3245-3259.

167. Colfen H. Precipitation of carbonates: recent progress in controlled production of complex shapes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 2003, v. 8, p. 23-31.

168. Meldrum F.C. and Hyde S.T. Morphological influence of magnesium and organic additives on the precipitation of calcite. J. Crystal Growth, 2001, v. (231), p. 544 -558.

169. Orme C.A., Noy A., Wierzbicki A., McBride M.T., Grantham M. and Teng H.H. Formation of chiral morphologies through selective binding of amino acids to calcite surface steps. Nature, 2001, v. 411, p. 775 -779.

170. Manoli F. and Dalas E. Spontaneous precipitation of calcium carbonate in the presence of ethanol, isopropanol and diethylene glycol. J. Crystal Growth, 2000, v. 218, p. 359-364.

171. Raz S., Weiner S. and Addadi L. Formation of high magnesian calcites via an amorphous precursor phase: possible biological implications. Adv. Mater., 2000, v. 12, p. 38-42.

172. Shen F.H., Feng Q.L. and Wang C.M. The modulation of collagen on crystal morphology of calcium carbonate. J. Crystal Growth, 2002, v. 242, p. 239-244.

173. Yang L., Guo Y., Ma X., Hu Z., Zhu S., Zhang X. and Jiang K. Cooperativity between pepsin and crystallization of calcium carbonate in distilled water. J. Inorg. Biochem., 2003, v. 93, p. 197-203.

174. Hardikar V.V. and Matijevic E. Influence of ionic and nonionic dextrans on the formation of calcium hydroxide and calcium carbonate particles. Colloids Surf. A, 2001, v. 186, p. 23-31.

175. Naka K., Tanaka Y. and Chujo Y. Effect of anionic starburst dendrimers on the crystallization of СаСОЗ in aqueous solution: size control of spherical vaterite particles. Langmuir, 2002, v. 18, p. 3655 -3658.

176. Colfen H. and Antonietti M. Crystal Design of Calcium Carbonate Microparticles Using Double-Hydrophilic Block Copolymers. Langmuir, 1998, v. 14, p. 582-589.

177. Kitamura M. Crystallization and Transformation Mechanism of Calcium Carbonate Polymorphs and the Effect of Magnesium Ion. J. Colloid Interface Sci., 2001, v. 236, p. 318-327.

178. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.

179. Nemeth I. and Juhasz S.A. trypsin and chymotrypsin inhibitor from the metacestodes of Taenia pisiformis. Parasitology, 1980, v. 80(3), p. 433-446.

180. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Ann. Rev. Biochem, 1967, v. 242(24), p. 5777-5781.

181. Машковский М.Д. Лекарственные средства. M., Медицина, 1993, т. 2., 685 с.

182. Нортрон Д., Кунитц М., Херриот Р. Кристаллические ферменты. М: Иностр. лит-ра, 1950, 346 с.

183. Efimov A.I., Properties of inorganic compounds. Hand-book. Leningrad: Chimija, 1983, 392 p.

184. Dupont L., Portemer F. and Figlarz M. Synthesis and study of a well crystallized СаСОЗ vaterite showing a new habitus. J. Mater. Chem., 1997, v. 7(5), p. 797-800.

185. Ladam G., Schaaf P., Cuisinier F.J.G., Decher G. and Voegel J.-C. Protein adsorption onto auto-assembled polyelectrolyte films. Langmuir, 2001, v. 17, p. 878-882.

186. Schwinte P., Ball V., Szalontai В., Haikel Y., Voegel J.-C. and Schaaf P. Secondary Structure of Proteins Adsorbed onto or Embedded in Polyelectrolyte Multilayers. Biomacromolecules, 2002, v. 6, p. 546-555.

187. Gergely C., Bahi S., Szalontai В., Flores H., Schaaf P., Voegel J.-C. and Cuisinier J.G. Human Serum Albumin Self-Assembly on Weak Polyelectrolyte Multilayer Films Structurally Modified by pH Changes. Langmuir, 2004, v. 20, p. 5575-5582.

188. Haynes C.A. and Norde W. Globular proteins at solid/liquid interfaces. Colloid Surf. B, 1994, v. 2, p. 517-566.

189. Galisteo F. and Norde W. Adsorption of lysozyme and lactalbumin on poly(styrenesulphonate) latices. 1. Adsorption and desorption behaviuor. Colloid Surf. B, 1995, v. 4, p. 375-387.

190. Dong L.C., Hoffman A.S. and Yan Q.J. Dextran permeation through poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J. Biomater. Sci.: Polym. Ed., 1994, v. 5, p. 473-484.

191. Galisteo F. and Norde W. Protein adsorption at the Agl-water interface. J. Colloid Interface Sci., 1995, v. 172, p. 502-509.

192. Bos M.A., Shervani Z., Anusiem A.C.I., Giesbers M., Norde W. and Kleijn J.M. Influence of the electric potential of the interface on the adsorption of proteins. Colloid Surf. B, 1994, v. 3, p. 91-100.

193. Privalov P.L. Stability of proteins. Small Globular Proteins. Adv. Protein Chem., 1979, v. 33(167), p. 167-241.

194. Peula J.M. and Nieves F.J. Adsorption of monomeric bovine serum albumin on sulfonated polystyrene model colloids. 1. Adsorption isotherms and effect of the surface charge density. Colloid. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects, 1993, v. 77, p. 199-208.

195. Stadler H., Mondon M. and Ziegler C. Protein adsorption on surfaces: dynamic contact-angle (DCA) and quartz-crystal microbalance (QCM) measurements. Anal. Bioanal. Chem., 2003, v. 375, p. 53-61.

196. Wojciecjhowski P.W., Transport and adsorption properties of cells and proteins at interfaces. New York: Marcel Dekker, 1996, 347 p.

197. Svirschevskaya E.V., Alekseeva L., Marchenko A., Viskova N., Andronova T.M., Benevolensky S. and Kurup V.P. Immune response modulation by recombinant peptides expressed in virus-like particles. Clin. Exp. Immunol., 2002, v. 127(2), p. 199-205.

198. Svirschevskaya E.V., Viskova N., Shevchenko M., Alekseeva L., Marchenko A., Benevolensky S. and Kurup V.P. High-affinity IgG to a major A. Fumigatus allergen, Asp f2, retards allergic response. Med. Sci. Monit., 2004, v. 10(10), p. 371-380.

199. Chen H., Tendeyong F. and Yiacoumi S. Equilibrium and kinetic studies of copper ion uptake by calcium alginate. Environ. Sci. Technol., 1997, v. 31, p. 1433-1439.

200. Elbert D.L. and Hubbell J.A. Self-assembly and steric stabilization at heterogeneous, biological surfaces using adsorbing block copolymers. Chem. Biol., 1998, v. 5, p. 177-183.

201. Cheng Y., Kang E.T., Neoh K.G., Wang P. and Tan K.L. Surface modification of polyaniline film grafting of poly(ethylene glycol) for reduction in protein adsorption and platelet adhesion. Synth. Met., 2000, v. 110, p. 47-55.

202. Zhu В., Eurell Т., Gunawan R. and Leckband D. Chain-length dependence of the protein and cell resistance of oligo(ethylene glycol)-terminated self-assembled monolayers on gold. J. Biomed. Mater. Res., 2001, v. 56, p. 406-416.

203. Park K.D., Kim Y.S., Han D.K., Kim Y.H., Lee E.H., Suh H. and Choi K.S. Bacterial adhesion on PEG modified polyurethane surfaces. Biomater., 1998, v. 19, p. 851-859.

204. Razatos A., Ong Y.L., Boulay F., Elbert D.L., Hubbell J.A., Sharma M.M. and Georgiou G. Force measurements between bacteria and poly(ethylene glycol)-coated surfaces. Langmuir, 2000, v. 16, p. 9155-9158.