Иммобилизация пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1 с целью дальнейшего использования в аналитической химии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Л'6

? '

На правах рукописи

ОЮМлибЛео!

КОТЛЯР ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА НА ВОДНОМ СИЛИКАГЕЛЕ И СВ-1 С ЦЕЛЬЮ ДАЛЬНЕЙШЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Астрахань - 2000

Работа выполнена на кафедре физической химии Астраханского государственного педагогического университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Алыков Н.М.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

заслуженный деятель науки и техники РФ Коренман Я.И.

кандидат химических наук, доцент Лебедева А.П.

Ведущая организация: Красноярский государственный университет

Защита состоится 25 декабря 2000 года в 10 час. в ауд. № 3 на заседании диссертационного Совета К-113.71.02 при Астраханском государственном педагогическом университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим направлять в адрес университета: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1. АГПУ

Автореферат разослан/^НОиеЛ/ы^ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета к.х.н., доцент М.А. Карибьянц

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем аналитической химии сегодняшнего дня является проблема идентификации и количественного определения различных ферментов. Вместе с тем, ферменты составляют неотъемлемую часть современной биотехнологии и предприятия, занятые различными биотехнологическими процессами, используют самые разнообразные методики идентификации и количественного определения ферментов в различных товарных препаратах или матери&тах, из которых они их извлекают.

Обычно извлечение ферментов осуществляется с помощью молекулярных сит. Этот процесс в ряде случаев долгий, малоэффективный и дорогой. Практически не используются в практике методы концентрирования и извлечения ферментов из природных материалов с использованием неорганических сорбентов. Это связано с тем, что большинство известных неорганических сорбентов либо вообще не концентрируют ферменты, либо обладает по отношению к ферментам небольшой емкостью. В результате предварительных исследований нами было установлено, что особым образом приготовленные силикагели, а также СВ-1, получаемый из опок Астраханской области, могут специфично сорбировать некоторые высокомолекулярные физиологически активные вещества, в том числе и ферменты.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физической химии Астраханского государственного педагогического университета и РАН по направлению «Органический анализ», в рамках комплексной программы «Экологическая безопасность России».

Цель работы. Поиск концентрирующих агентов и самоконцентрирование окислительно-восстановительных ферментов на природных сорбентах, а также на специально приготовленных силикагелях.

Работа включает следующие этапы: изучение изотерм сорбции ферментов на выбранных сорбентах;

- расчет термодинамических характеристик сорбции и представление механизма сорбции;

- использование пероксидазы хрена, иммобилизованной . на сорбентах для идентификации и количественного определения ряда токсикантов в объектах окружающей среды (фенола, резорцина, пирокатехина, пирогаллола, адреналина).

В качестве задачи предполагается решение вопроса об использовании ферментных препаратов для технологических целей без выделения их с сорбента.

Научная новизна. Впервые проведена иммобилизация фермента пероксидазы хрена на природных алюмосиликатных сорбентах Астраханской области (СВ), водном силикагеле, дана оценка сорбционной емкости используемых сорбентов по отношению к ПХ. Произведен расчет аминокислот, углеводов, входящих в состав ПХ на водном силикагеле и на алюмосиликатах современными методами квантовой химии (РМЗ,АМ1). Представлен механизм сорбции ПХ на данных сорбентах.

Практическая значимость. Для иммобилизации пероксидазы с целью ее дальнейшего использования в аналитической химии предложены водный силикагель, сорбент СВ-1, получаемый путем нехимической переработки опок Астраханской области, обладающий высокой сорбционной емкостью и низкой стоимостью. Разработаны методики определения фенола, резорцина, пирокатехина, пирогаллола, адреналина в водных растворах. Использование разработанных методик позволяет определять гидроксилсодержащие органические соединения быстро, надежно и без использования дорогостоящих реактивов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения изотерм сорбции и термодинамики сорбции ПХ на водном силикагеле и природном сорбенте СВ-1.

2. Результаты изучения кинетики пероксидазного окисления с использованием иммобилизованной на природном сорбенте СВ-1, водном силикагеле пероксидазы хрена.

3. Результаты теоретических расчетов модели адсорбции аминокислот, углеводов, входящих в состав ПХ на поверхности алюмосиликатов и силикатов, теплоты образования и геометрия адсорбционных комплексов, результаты сравнительного анализа различных методов расчета, указанных моделей.

4. Механизм сорбции оксидаз на водном силикагеле и сорбенте СВ-1.

5. Спектрофотометрический и титриметрический методы определения гидроксилсодержащих органических соединений в водных растворах, основанные на использовании иммобилизованной на СВ-1 пероксидазы хрена.

Апробация ñafioгы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Астраханского государственного педагогического университета (1997-2000), Всероссийской научной конференции по эколого-биологическим проблемам Волжского региона и Северного Прикаспия (Астрахань, 1999, 2000), Международной конференции по аналитической химии (Москва, 2000), Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием («Экоаналитика-2000», Краснодар, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шесть глав, выводов и списка литературы (228 источников). Работа изложена на 179 страницах текста, содержит 18 рисунков и 20 таблиц.

1. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ

В обзоре представлены сведения о структуре и физико-химических свойствах пероксидазы хрена, а также дана краткая характеристика методов определения пероксидаз, их активности in vivo и in vitro. Даны основные направления использования пероксидаз, иммобилизованных на различных носителях. Приведены обзор и критическая оценка использования пероксидаз в аналитической химии. Показаны преимущества использования иммобилизованных пероксидаз над нативными. Отмечено отсутствие в литературе сведений о механизме сорбции пероксидаз на каких-либо сорбентах.

2. АДСОРБЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОКСИДАХ АЛЮМИНИЯ, КРЕМНИЯ И СОРБЕНТАХ ГРУППЫ СВ

Широкие возможности использования сорбентов группы СВ, получаемых путем нехимической переработки опок Астраханской области, для концентрирования и последующего определения в различных объектах ряда органических соединений, физиологически активных веществ, таких как фенолы, гормоны, ферменты требует объяснения такого уникального явления, как способность сорбировать разнообразный набор различных веществ. В данной главе работы сделана попытка создания более или менее ясного представления о сорбции на различных оксидах органических веществ и, е связи с этим, внесение ясности в вопрос о том, почему же СВ ведет себя ка* универсальный сорбент.

3. СОРБЦИОННОЕ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА НА ВОДНОМ СИЛИКАГЕЛЕ И СВ-1

Определение содержания пероксидаз в различных биологических и природньп объектах облегчается при использовании различных приемов и средств концентрирования Сорбционнос концентрирование осуществляют, используя или сорбенты общей

назначения (например, силикагели) или специальные сорбенты (например, катиониты или хелатные сорбенты). В этом направлении используются органические реагенты, иммобилизованные на сорбентах.

Особое место среди перечисленных сорбентов занимают природные сорбенты, одним из которых является сорбент СВ-1, получаемый из опок Астраханской области. Основными задачами, которые необходимо было решить, были:

- определение возможности сорбции ПХ на различных сорбентах;

- определение рН сорбции ПХ на водном силикагеле и СВ-1;

- определение термодинамических характеристик сорбции ИХ водным силикагелем и СВ-1, которые можно получить в результате изучения изотерм сорбции при различных температурах;

- изучение влияния иммобилизации фермента (ПХ) на его активность - изучение кинетики окислительно-восстановительной реакции;

• - представление механизма сорбции, используя данные, полученные путем эксперимента И квантово-механических расчетов;

- разработка методик концентрирования на водном силикагеле и СВ-1 и последующее использование иммобилизованного фермента для определения фенолов, адреналина в водных растворах.

Методы исследования сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1

Реагенты. Раствор пероксидазы хрена готовили экстрагированием фермента из корней хрена (1 г корней хрена на 100 г воды). Рабочий раствор готовили разбавлением исходного и использовали в течение дня. Органические реагенты имели квалификацию ч., х.ч. или ч.д.а . В качестве сорбентов использовали водный силикагель, СВ-1, который получ&чи обработкой опок Астраханской области.

Аппаратура. Оптические плотности растворов измеряли на фотоэлектрическом колориметре КФК-2. Измерение рН готовых систем проводили на иономере И-130 (индикаторный электрод - стеклянный, электрод сравнения - хлорсеребряный).

Общая схема проведения анализа. Влияние рН на сорбцию, определение констант сорбции, кинетику окислительно-восстановительной реакции с участием иммобилизованного фермента изучали в статическом режиме при температурах 25СС и 4°С, с ошибкой ± 0,2°С.

Изучение сорбционной способности неорганических сорбентов по отношению к ПХ

Порядок выполнения работы. Была проведена серия опытов по изучению сорбционной способности неорганических сорбентов по отношению к ПХ. Фермент извлекали из корней хрена экстракцией водой. Для качественного определения присутствия фермента использовался реактив Нади, получаемый смешением в равных объемах 1 % спиртового раствора а-нафтола, 1 % раствора диметилпарафенилендиамина и 1,5 % раствора карбоната натрия. В качестве сорбентов использовали гидроксид алюминия, оксид алюминия, диоксид марганца, карбонат кальция, сульфат бария, СВ-1 и водный силикагель.

Сорбировали ПХ следующим образом. В воронку на фильтр помещали 2 г сорбента, добавляли 2 см3 жидкой фазы, затем сорбент промывали дистиллированной водой и добавляли реактив Нади. Одновременно готовилась и холостая проба.

На основании полученных экспериментальных данных установлено, что сульфат бария и карбонат кальция не удерживают на своей поверхности фермент. Это связано с невозможностью кулоновского взаимодействия сорбент - сороат из-за низких зарядов и

большим размером молекул сорбата. Диоксид марганца и оксид алюминия п.и удерживают на своей поверхности пероксидазу. Возможно, этот факт связан с небольи энергией процесса сорбции ПХ на данных сорбентах, что объясняется высокой прочност структуры данных оксидов (ДНА|2оз = - 1676 кДж/моль, ДНмпог = - 521,5 кДж/моль низким поляризующим действием катионов алюминия и марганца. Лучшие результг сорбции оказались на гидратированном силикагеле и сорбенте СВ-1. Это связанс близостью размеров амино- и карбоксильных групп с размерами кластеров сорбентов также радиусом пор.

Определение рН сорбции

Порядок выполнения работы. В 11 пробирок приливали по 2 см3 вытяжки хре; 7 см3 буферного раствора с рН от 1 до 11, разбавляли до 10 см3 дистиллированной водо! добавляли в каждую пробирку по 0,2 г сорбента. Интенсивно встряхивали в течен 10 мин, центрифугировали и доводили рН растворов в пробирках до 7,0. В центрифу! приливали по 1 см3 0,1 н раствора пероксида водорода, через 30 мин добавляли 0,5 с 10 % - ного раствора серной кислоты и отгитровывали остаток Н2О2 0,1 н раствор' перманганата калия. Было выявлено, что ПХ лучше сорбируется в кислых и умерен кислых средах (рис. 1).

ДС, ед/см3 50 ■

20 ■

10 ■

0 -.-,--.-;-,-.-.-.-г—,

123456789 10 11

РН

В качестве интервала сорбции выбран рН 4-6. При более низких значениях р возможна денатурация белковой части молекулы фермента и вследствие это] невозможностью его использования в аналитической химии. Как оптимальный д; дальнейших исследований выбран рН 5,5.

Изучение процесса сорбции ПХ на водном силикагеле и СВ-1

Порядок выполнения работы. В 6 пробирок вносили от 0,05 до 0,8 см3 0,001 ! раствора вытяжки из корней хрена, по 0,1 см3 раствора реактива Нади и доводили объем всех растворов до 10 см3 дистиллированной водой; измеряли оптические плотное! растворов при 480 нм в кювете толщиной 2 см относительно воды к фотоэлектроколориметре КФК-3. По полученным величинам оптических плотностей концентраций строили градуировочные графики, по которым определяли равновеснь концентрации ПХ. В такие же исходные растворы вносили но 0,2 г сорбента, интенсивн встряхивали содержимое пробирок, центрифугировали, проводили индикаторную реакцш и затем вновь измеряли оптические плотности растворов. По известным величина: оптических плотностей растворов после сорбции по градуировочным графикам строил изотермы сорбции в координатах «удельная сорбция равновесная концентрация» (ри< 2.3).

Рис. 1 Влияние рН на процесс сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле

Г-105 г/г

[С]'10 ед/см

Рис. 2. Изотермы сорбции ПХ при различных температурах на СВ-! (1 — при Т= 277 К, 2 - при Т=298 К)

Г-103 г/г

3

[С]-105 ед/см3

Рис. 3. Изотермы сорбции ПХ при различных температурах на водном силикагеле

(1 — при Т= 277 К, 2 - при Т=298 К)

Как видно из рис. 2, 3 для СВ-1 и для сшшкагеля характерна Лэнгмюровская сорбция ПХ из водных растворов. Сорбцию ПХ проводили для двух температур: Т1 = 277 ± 0,5К, Т2 = 298 ± 0,5 К. По изотермам, построенным для Т1 и Т2 бьши рассчитаны изменения энтальпии, энтропии и изобарно-изотермического потенциала сорбции. Результаты этих расчетов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные характеристики сорбции ПХ из водных растворов

Сорбент/ дн, Д 5298, Д Б277, Д 0298, "Д 0277, Емкость

характе- кДж/ Дж/ Дж/ кДж/ кДж/ сорбента,

ристика моль молЬ'К моль-К моль моль мг/г

Водный -51,5 -112,67 - 112,67 -20,5 -17,9 46

силикагель

СВ-1 -28,6 -114,60 - 114,53 -34,18 -31,87 50

Как видно из табл.!, величина изменения энтальпии (АН) приблизительно находится на уровне образования водородной связи. Можно предположить, что здесь наблюдается не только образование водородной связи, но и взаимодействие карбонильных групп пептидной связи и молекул воды на поверхности сорбента.

Значения изменения энтропии (Дв) и изобарно-изотермического потенциала также находятся на уровне формирования водородной связи. Вместе с тем, отрицательные значения ДЭ свидетельствуют о дополнительной агрегации молекул фермента на поверхности сорбента. Например, здесь могут образовываться глобулы, большие свернутые частицы, дополнительные внутримолекулярные водородные связи.

Изучение влияния исследуемых сорбентов на ферментативную активность ПХ

Порядок выполнения работы. В колбу емкостью 250 см3 вносили 10 см3 вытяжки фермента, 1 г сорбента, интенсивно встряхивали в течение 10 мин, а затем вносили 10 см3 0.1 н раствора НгОд. Отбирали пробы через 1,5. 10, 15. 20, 25, 30 и 60 мин. действие фермента прекращали добавлением 1 см3 10%-ного раствора серной кислоты, центрифугировали и отгитровывали неразложившийся пероксид водорода 0,1 н раствором КМпОд. Аналогично проводили опыт с пробой без сорбента.

Полученные кинетические кривые (рис.4) свидетельствуют о том, что фермент, иммобилизованный на изучаемых сорбентах, становится более активным. Данные результаты можно объяснить так называемым процессом «открытия кармана»: взаимодействие белковой части фермента с сорбентом приводит к изменению структуры фермента так, что ион железа гема становится более доступным для реакции с пероксидом водорода.

С,ед/см3

Рис.4. Кинетика реакции пероксидаза - пероксид водорода (1 - в водном растворе, 2-на СВ-1)

4. КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА СОРБЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА

Приведен краткий обзор и критическая оценка современных методов квантово! химии. Дана сравнительная характеристика всевалентных полуэмпирических методов Продемонстрирована необходимость использования нескольких полуэмпирически: методов расчета комплекса сорбат - сорбент для адекватной оценки сорбционноп процесса ' аминокислотных остатков, входящих в состав фермента, а также дл: моделирования процесса сорбции пероксидаза хрена на неорганических сорбентах.

Теоретическое обоснование протекания процесса сорбции в кислой среде

Данные, полученные путем эксперимента, подтверждаются проведенным] квангово-химическими расчетами полуэмпирическим методом РМЗ по программе МОРА( 93.

Таблица 2. Теплоты образования комплексов сорбент - сорбат, полученные путем квантово-химических расчетов методом РМЗ

Соединения ДН образования, кДж/моль

Водный силикагель СВ-1

НСООН - 14.766 - 10,528

N11, - 10.320 - 6,958

- 222.988 - 179,093

Из сопоставления АНоор комплексов сорбат - сорбент (табл.2) для СНООН и №Ь, Ш4+ можно сделать вывод, что в элементарном акте адсорбции фермента преимущественно участвуют аминогруппы, а не карбоксилы. Видно также, что N114*' взаимодействует с поверхностью значительно сильнее, чем >Шз. Этот факт может служить объяснением наблюдаемой зависимости сорбции фермента от рН

Моделирование сорбции ПХ на водном силикагеле и СВ-1

Квантово-химическое моделирование процесса сорбции ПХ на выбранных сорбентах проходило следующим образом: в качестве модельных участников выбраны молекулы аминокислот и углеводородов, входящих в состав ПХ. Рассчитано взаимодействие данных предполагаемых активных центров фермента с активными частями сорбента (табл. 3).

Таблица 3. Теплоты образования комплексов (кДж/моль) сорбат-сорбент (5Ю2 ■ п Н20), _расчитанные квантово-механическими методами_

Сорбат ДН образования, кДж/моль

Метод РМЗ Метод АМ1

Аспарагиновая кислота -54,54 -43,69

Треонин -30,64 -40,66

Серии -11,82 -12,15

Глутаминовая кислота 19,29 -11,32

Пролин -9.50 -10,27

Глицин -29,72 -23,51

Алании -13,83 -13.35

Валин -23,48 -37,29

Метионин -30,40 -31,39

Изолейцин -11,94 9,71

Лейцин 15,37 -15,31

Тирозин -23,62 -21,64

Фенилаланин -27,61 -30,30

Лизин -9,30 -13,82

Гистидин , -109,61 -76,90

Аргинин -168,25 -91,33

Гидроксипролин -27,52 -37,35

Сахароза -8,59 -31,37

Галактоза -7,09 -19,40

Арабиноза -33,89 -51,20

Ксилоза -17,58 -13,9437

Фукоза -32,30 -40,80

Манноза -42,83 -40,68

Аминосахар -31,10 -24,96

Маннозоамин -19,74 12,12

Галакюзоамин -25.74 -19.10

Таблица 4. Теплоты образования комплексов (кДж/моль) сорбат-сорбент (СВ-1), расчитанные квантово-механическими методами

Сорбат ДН образования, кДж/моль

Метод РМЗ Метод АМ1

Аспарагиновая кислота -57,30 -58,48

Треонин -6,71 -15,52

Серии -38,81 -77,24

Глутаминовая кислота -74,66 -32,60

Пролин 1,92 -6,01

Глицин -15,98 -5,99

Алании -17,86 -16,62

Цисте и н -33,17 -31,48

Валин -7,22 -16,23

Метионин -17,26 -30,40

ИзолеГшии -16,15 -11,20

Лейцин -8,67 -9,17

Тирозин -16,58 -25,67

Фенил аланин -25,32 -13,29

Лизин -13.76 -1,12

Гистидин -111,60 -87,18

Аргинин -31,87 -14,14

Гидроксипролин -18,92 -36,11

Сахароза -57,27 -15,03

Галактоза -56,38 -25,00

Арабиноза -123,41 -17,27

Ксилоза -71.89 -18,79

Фу коза -60,56 -29,92

Манноза -11,66 -10,36

Аминосахар -66,87 -10,67

Маннозоамин -17,93 -18,97

Галактозоамин -54,90 -77,68

Анализ взаимодействия сорбат-сорбент (водный силикагель)

Наибольшей теплотой образования характеризуются комплексы водного силикагеля с аспарагиновой кислотой, треонином, цистеином, лейшшом, тирозином, лизином, гистидином, аргинином. Высокие величины можно объяснить возникающими водородными связями между водородом карбоксильной группы и кислородом гидроксогруппы силикагеля и одновременно другим кислородом кремния связанного с атомом кремния и водородом другой карбоксильной группы (например, аспарагинова; кислота). Такое взаимодействие наблюдается в щелочных, нейтральных и слабокислы? растворах. В сильнокислых растворах взаимодействие сорбент - сорбат осуществляете; при помощи водородных связей азога аминогруппы кислоты и водорода гидроксогруппь силикагеля. Причем, первый случай образование водородной связи при участщ карбоксильной группы характеризуется большей теплотой образования, так как в этои случае получается более симметричная структура. При этом увеличивается длина связи О -С (у кислоты), и укорочение О - Н связи и удлинение связи - О (у силикагеля) Рассмотренный пример с аспарагиновой кислотой характерен для всех представленных I таблице 3 дикарбоновых кислот.

В случае с треонином происходит образование водородной связи кислород; карбоксильной группы кислоты и водорода гидроксогруппы силикагеля. При это.\ происходит увеличение длинны связи - О в силикагеле. Дополнительно осуществляете! взаимодействие водорода гидроксильной группы кислоты с кислородом, входящего I

состав кластера силикагеля. Взаимодействие азота с водородом и образование водородной связи характерно, лишь как и в случае с аспарагиновой кислотой в сильно кислой среде, при образовании иона МНз+. При анализе комплекса цистеина с силикагелем (при использовании метода AMI) следует отметить, что в данном случае из-за стерической доступности и карбоксильной и аминогруппы происходит одновременное взаимодействие водородов кластера силикагеля с азотом и кислородом аминокислоты. При этом увеличивается связь N - Н, S - С в аминокислоте. В методе РМЗ показывается взаимодействие водорода, соединенного с серой в аминокислоте с кислородом кластера силикагеля. При этом происходит значительное удлинение связи S - Н в аминокислоте. При этом аминогруппа становится менее доступной для образования водородной связи силикагеля при использовании метода РМЗ.

Комплекс с лейцином можно охарактеризовать следующим образом: происходит взаимодействие не только азота аминогруппы с водородом силикагеля, но и кислорода аминокислоты с водородом кластера силикагеля, а также взаимодействие водорода углеводородного радикала аминокислоты с кислородом кластера силикагеля (согласно методу РМЗ) Метод AMI в данном случае подтверждает указанные выше взаимодействие, но при этом молекула аминокислоты расположена почти параллельно кластеру силикагеля. В методе РМЗ наклон молекулы сорбата к плоскости сорбента = 45°.

Комплекс с тирозином подобен рассмотренному выше комплексу с лейцином со следующими отличиями: не происходит взаимодействия кислорода карбоксильной группы С = О с водородом силикагеля. Ароматический радикал не участвует во взаимодействии и располагается под углом и 90° к плоскости, в которой происходит взаимодействие. В методе AMI углеводородный радикал расположен под углом к 105° к плоскости сорбента.

В комплексе с лизином образуется лишь одна водородная связь между азотом аминокислоты и водородом силикагеля, что подтверждается двумя квантово-химическими методами.

В случае с гистидином происходит взаимодействие трех кислородов силикагеля с водородами гистидина. При этом в образовании связи участвуют два водорода, которые связаны с азотом и один, который связан с углеродом, находящимся между ними. Такое взаимодействие можно объяснить образующейся достаточно симметричной структурой. Метод AMI доказывает аналогичную структуру комплекса

Комплекс с аргинином отличается от рассмотренных выше тем, что молекула сорбата расположена почти перпендикулярно к поверхности сорбента. При этом согласно методу РМЗ происходит взаимодействие азота аминогруппы аргинина с водородом кластера силикагеля и менее ярко выраженное взаимодействие кислорода кластера

сорбента с водородом углеводородного радикала аминокислоты. Метод AMI дает анатогичную картину.

Средними значениями теплот образования комплексов сорбент-сорбат характеризуется комплекс с серином, глутаминовой кислотой, пролином, аланином, фенилаланином, гидроксипролином. Эти более низкие значения можно объяснить тем, что образуется всего лишь одна водородная связь (как, например, у фенилаланина водород аминокислоты связан с кислородом кластера сорбента). Ориентация молекулы сорбата вертикальная, поэтому взаимодействие с азотом аминогруппы невозможно. Такое взаимодействие осуществляется у аланина

В случае с серином образование второй водородной связи возможно при протонировании аминогруппы в кислой среде. Молекула сорбата оказывается расположенной к плоскости сорбента под углом в 45° при проведении расчетов в методе РМЗ. Метод AMI показывает почти горизонтальную ориентацию молекулы сорбата на кластере сорбента. Образование водородной связи происходит при этом с кислородом карбоксильной группы аминокислоты с водородом кластера сорбента и кислородом кластера сорбента, а водородом углеводородного радиката аминокислоты. При этом азот не участвует в образовании водородной связи.

У глутамина происходит аналогичная серину ориентация молекулы сорбата i поверхности сорбента и образование одной водородной связи водорода аминогрупп: расположенной рядом с карбоксильной группой с кислородом кластера сорбента (мет( РМЗ). Метод AMI показывает горизонтальную ориентацию молекулы глутамина 1 сорбенте и образование двух водородных связей при участии водородов двух аминогруг кислоты и кислородов силикагеля.

У пролина во взаимодействии в слабокислых растворах принимает участие водорс углеводородного радикала аминокислоты и кислород сорбента, при этом ориенташ молекулы вертикальная, в сорбенте связь О - Н в гидроксогруппе, которая участвует образовании водородной связи, увеличивается (согласно методу РМЗ). Метод AN показывает возможность взаимодействия карбоксильной группы кислоты с поверхность сорбента (водород гидроксогруппы аминокислоты связан с кислородом сорбента).

Комплексы гидроксипролина не отличаются от охарактеризованных комплекс! пролина, так как взаимодействие появившейся гидроксогруппы аминокислоты с сорбентс не осуществляется вследствие более выгодного взаимодействия азота аминокислоты водородом силикагеля.

Комплекс аланина аналогичен комплексу с фенилаланином.

Из комплексов с углеводами наибольшей энергией по величине (приблизителы равной средней по величине для аминокислот) характеризуется галактоза, ксило: манноза. Эго можно объяснить возникновением нескольких; водородных связей углевода поверхностью сорбента. При этом возможно несколько степеней свободы (ориентации д молекулы сорбата). В отличие от аминокислот в образовании водородной связи участву кислород "кольца".

Более низкие значения ДН комплексов аминопроизводных углеводов мож] объяснить тем, что здесь возможно меньшее количество степеней свободы возникновения связей (преимущество отдается связи азот аминопроизводного углевода водородом сорбента), и вследствие этого образования меньшего количества связей.

Малая энергия комплексов сорбент-сорбат характерна для валина, изолейцш: Метод РМЗ объясняет это явление возможностью образования внутримолекулярш водородной связи в молекуле аминокислоты (азот аминокислоты и водор< углеводородного радикала, кислород карбоксильной группы и водород углеводородно радикхта).

Низкая энергия сорбции арабинозы объясняется взаимодействием кислоро. гидроксогруппы с водородом поверхности сорбента и не участии кислорода углеводно «кольца» в образовании водородной связи.

При завершении анализа следует отметить, что все углеводы рассчитывали компьютером в форме кресла.

Анализ взаимодействия сорбат-сорбент (СВ-1)

Величины, рассчитанные квантово-химическими методами AMI и PN показывают, что как и в случае с силикагелем наибольшей теплотой образован характеризуются комплексы с цистеином, тирозином, гистидином, галактозой. Причем э представленные значения несколько выше, представленных в таблице 4, характеризуют ДН сорбат-сорбент (силикагель). Эту закономерность можно объяснить возможност( участия атома алюминия в донорно-акцептороном взаимодействии. Подобное наблюдает в случае с тирозином. Неподеленная пара атома азота взаимодействует со свободна орбиталью атома алюминия. При этом ароматический радикал расположен поч параллельно поверхности сорбента (в случае с силикагелем молекула сорбата расположе под углом = 30°). Вследствие этого возможно дополнительное взаимодействие водоро гидроксогруппы фенильного радикала с кислородом сорбента.

Понижение энтальпии взаимодействия аспарагина, треонина с СВ-1 по сравнению водным силикагелем можно объяснить вертикальной ориентацией молекулы сорбата н сорбенте, а также возникновением внутренней водородной связи алюминий - кислород кластере сорбента.

Более высокие энергии связи аминопроизводных углеводов с сорбентом в случа СВ-1 можно объяснить возникновением двух водородных связей различной природы (: случае с SiCb • иНгО происходит образование водородной связи кислород гидроксогруппы углевода и водорода сорбента), в случае с СВ-1 - одна аналогична случаю с силикагелем, а другая связь образуется азотом аминогруппы углевода и ато» алюминия поверхности сорбента.

При анализе рассчитанной методами РМЗ и AMI энергии взаимодействия сорбент сорбат в случае с СВ-1, можно отметить, что образуются только отрицательные величины Это связано с большим количеством активных центров на поверхности сорбента в отличи от поверхности водного силикагеля.

Сравнивая теплоты образования комплексов с водным силикагелем и СВ-1 можш заметить, что сорбция на водном силикагеле сопровождается значительно меньшими п< абсолютной величине тепловыми эффектами по сравнению с СВ-1, причем така зависимость прослеживается как в экспериментальных результатах, так и в теоретически: расчетах. Это говорит о корректности использованной кластерной модели и применени: для расчетов подобных взаимодействий квантово-химических методов AMI и РМЗ. Kai полученные величины теплот адсорбции, так и геометрия адсорбционных комплексо! позволяют говорить о том, что сорбция протекает за счет образования по тем или иньп механизмам различной силы водородных связей между поверхностью и молекулам! сорбатов. Следует отметить, что метод РМЗ лучше воспроизводит взаимодействие сорбент сорбат при участии водородных связей, лучше представлена геометрия возникающие адсорбционных комплексов. Сравнивая величины, полученные методом AMI и РМЗ мь можем отметить, что они коррелируют между собой.

Моделирование процесса сорбции гема

В ходе предварительных исследований было получено, что используемы! программы полуэмпирических квантово-химических расчетов не могут произвести расче" взаимодействия гем-сорбент из-за отсутствия необходимых параметров для атома железа.

Поэтому модель сорбции гема создавали следующим образом:

- изучили возможность сорбции аминокислотного окружения на изучаемы; сорбентах;

- изучили возможность неэмпирической программы GAMESS для расчет; упрощенной модели гема;

- полуэмпирический расчет модели гема с заменой железа на другой сходный ш свойствам элемент.

В этом разделе мы планировав учесть поляризующее действие иона Ме3+ н; порфириновое кольцо.

При реализации первого этапа были получены данные, которые характеризую' низкие величины АН сорбции порфиринового кольца на изучаемых сорбентах (ДН = - 9,3-кДж/моль комплекса сорбат-сорбент (водный силикагель), ДН = - 11,99 кДж/мол! комплекса сорбат-сорбент (СВ-1) по методу РМЗ).

При расчетах неэмпирическими методами при использовании программы GAMESS мы представили гем в следующем виде

H3N Ml2

/

Рис. 5. Модель тема для неэмпирических расчетов.

При этом гидроксогруппа располагалась под углом » 90° над поверхностью связей Fe - N. Но программа не смогла рассчитать саму молекулу сорбата, так как в ней нет характеристик для связи Fe3+ - N. Максимальная возможность программы - расчет FeHi из-за большого числа электронов атома железа.

Вследствие этого, атом железа был заменен на атом алюминия. При этом введен поправочный коэффициент равный life /I|Ai = 7,890 эВ / 5,986 эВ = 1,3180 Расчет представленной выше модели показал, что А13+ оказывает слабое поляризующее действие на "порфириновое кольцо", вследствие чего энергия сорбции "кольца" на поверхности сорбента увеличивается (ДН = -13,86 кДж/моль для водного силикагеля), ДН = - 14,81 кДж/моль для СВ-1 по методу РМЗ.

Ион Fe3+ относится к III группе катионов и оказывает более сильное поляризующее действие и, вследствие учета поправочного коэффициента энергии взаимодействия сорбент-сорбат (порфириновое кольцо) равны для водного силикагеля -15,18 кДж/моль, для СВ-1-17,06 кДж/моль

5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

После промывания водой сорбент удерживает фермент на своей поверхности. В таком виде концентрат пероксидазы может быть использован как энтеросорбент для разложения перекисных соединений в организме, непосредственно в кишечнике, как реагент для определения большого ассортимента токсичных тяжелых металлов (Hg, Cr, Cd, Zn и др.), а также в биотехнологии, так как в этом случае ПХ не вымывается с сорбента, находящегося в твердой фазе в реакционной смеси.

Изучалась возможность создания титриметрического и фотометрического методоЕ определения фенолов, адреналина. Титриметрический метод основан на ингибированш реакции окисления пероксида водорода пероксидазой хрена фенольными соединениями. Е ходе предварительных исследований выявлено, чго выше перечисленные соединенш значительно влияют на скорость окислительно-восстановительной реакции, уменьшение 1 реакции в 0,7-2 раза в зависимости от соединения. Происходит также изменение окрасю раствора при получении трехкомпонентного соединения: иммобилизованный фермен' (ПХ) - фенол - пероксид водорода: возникновение красного окрашивания в случае < адреналином, фиолетового - с пирокатехином, коричневого - в случае с резорцином Вследствие чего возможно проведение фотометрирования растворов без индикатора. Так» соединения как кортизона ацетат, диоксикорстерона ацетат, аскорбиновая кислота, а токоферрола ацетат также влияют на скорость окислительно-восстановительной реакции но изменения окраски растворов трехкомпонентного соединения не происходит, поэтом; фотометрирование растворов не представляется столь успешным как в первом случае Следует учитывать и тот фактор, что диоксикорстерона ацетат, а-токоферрол плох! растворяются в воде и этиловом спирте, поэтому в дальнейшем планируется провеет! подбор растворителя для данных соединений.

Изучение возможности определения гидроксилсодержащих органических соединений

В результате опытов разработаны два метода определения фенолов, адреналина в водных растворах: спектрофотометрический и титриметический. Иммобилизацию пероксидазы на СВ-1 проводили по следующей методике: в пробирки с дистиллированной водой вносили 0,5 г сорбента, 1 см3 раствора фермента (с концентрацией 18,7 ед/г), буферный раствор с оптимальным значением рН интенсивно встряхивали, центрифугат сливали, сорбент промывали дистиллированной водой и использовали для проведения исследований.

Фотометрический метод определения некоторых фенола, резорцина, пирокатехина,

пирогаллола, адреналина

Выполнение определения. В пробирку с иммобилизованным ферментом вносится 6 см3 аммонийно-ацетатного буферного раствора (рН 6,5), от 0 до 2 см3 10"4 раствора исследуемого фенола, разбавляют дистиллированной водой до 10 см3 и вносят 1 см3 0,1 н раствора пероксида водорода, интенсивно встряхивают 10 мин и не ранее, чем через 30 мин измеряют оптические плотности при соответствующей длине волны: адреналин - 490 им, резорцин - 440 нм, пирокатехин - 590 нм. По полученным данным строили градуировочные графики.

Л2 1

0,8

0,6-1 0,4 0,2 0

2 3

ОТО^мхь/л

0,25 0,2 0,15 0.1 -0,050

0

2 3

С-105 мхь/л

Рис 6. Градуировочный график для определения резорцина в водных растворах (у = 0,523х-0,02)

0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

0

1

Рис.7 Градуировочный график для определения фенола в водных растворах (у = 0,08х + 0,02)

0,4 А 0,35 0,3 0,25 0,2 015 0,1 0,05 0

2 3

С-10^ мапь/л

Рис.8 Градуировочный график для определения пирокатехина в водных растворах (у = 0.16х 4 0.04)

0

2 3

С-105 мзгь'л

Рис.9 Градуировочный ¡ рафик для определения пирогаллола в водных растворах (у = 0,1 Зх + 0,06)

C'ICF мхь/л

Рис.10 Градуировочный график для определения адреналина в водных растворах в присутствии иммобилизованного на СВ-1 фермента (у-0,13х + 0,06)

Правильность предложенной методики проверена методом «введено-найдено» результаты которого представлены в таблицах 5-9

Таблица 5. Проверка правильности определения фенола в воде методом "введено-найдено" с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ (п = 6, Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено Л" нг/мл Vi данным методом ■In с использованием метода сравнения*

6,00 6,80 6,80 + 0,81 6,70± 0,73

8,00 7,30 7,30 ±0,86 7,20 ±0,91

12,00 11,20 11,20 ± 1,02 11,20+ 1.22

16,00 17,40 17,40 + 1,71 17,40 ±2,61

20,00 21,90 21,90 ±2,54 21,90 ±2,82

30,00 : 27,80 27,80 ±2,97 27,80 ± 2,98

* - Клементьева A.B. // Астраханский край: история и современность (к 280-летию образования Астраханской губернии. Астрахань, 26-27 ноября 1997.) Материалы Всероссийской научно-практической конференции. С. 252.

Таблица 6. Проверка правильности определения резорцина в воде методом "введено-

найдено" с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ (п = 6,Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X х=х± ч/л ч/л

нг/мл данным методом с использованием метода сравнения*

6.00 6,50 6,50 ±0,51 6,30 ± 0,54

8,00 8,80 8,80 ±0,86 9,00 ±1,00

12,00 10,70 10,70 + 0,96 10,50 ± 1,46

16,00 17,10 17,10 ±1,04 16,90 ± 1,62

20,00 22,00 22,00 ± 1,40 21,60 ± 1,83

30,00 27,90 27,90 ± 2,94 27,80 ±2,96

Таблица 7. Проверка правильности определения пирокатехина в воде методом "введено-найдено" с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ (и = 6, Р = 0,95)

Введено (X), Найдено X х = х±--^ф- ч/л

Нг/мл нг/мл данным методом с использованием метода сравнения*

6,00 6,30 6,30 ± 0,72 6,30 ± 0,74

8,00 7,50 7,50 + 0,81 7,50 ± 1,90

12,00 10,10 10,10 ±0,94 10,10 ± 1,51

16,00 16,70 ¡6,70 ± 1,21 16,70 ± 1,87

20,00 21,90 21,90 ± 1,29 21,90 ± 1,95

30,00 32,10 32,10 ± 1,86 32,10 ±2,31

Таблица 8. Проверка правильности определения пирогаллола в воде методом "введено-найдено" с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ (п - 6, Р = 0,95)

Введено (X), Нг/мл Найдено X нг/мл Х = Х + *° Л данным методом ч/Л с использованием метода сравнения*

6,00 4,90 4,90 ± 0,84 4,80 ± 1,12

8,00 7,60 7,61 ± 1,02 7,70 ± 1,27

12,00 10,10 10,10± 1.13 9,60 ± 1,31

16,00 16,40 16,40 ± 1,24 16,20 ± 1,42

20,00 21,80 21,80 ± 1,47 22,60 + 2,63

30,00 27,20 27.20 ± 1,91 26,90 + 3,31

Таблица 9.Проверка правильности определения адреналина в воде методом "введе! найдено" с использованием иммобилизованной на СВ-1 ИХ {п = 6, Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X нг/мл у1п данным методом х-х±[°'1§> с использованием метода сравнения*

6,00 6,20 6,20 ±0,31 6,40 ± 0,35

8,00 7,60 7,60 ± 0,48 7,10 ±0,52

12,00 10,30 10,30 ± 0,73 11,20 ±0,86

16,00 16,50 16,50 + 0,96 17,30 ±1,02

20,00 21,30 21,30 ± 1,17 21,40 ± 1,36

30,00 31,80 31,80+1,32 32.50 ±2,08

Титриметрический метод определения фенолов, адреналина

Выполнение определения. В пробирки с иммобилизованным ферментом внос реагенты в соответствии с выше указанной методикой, интенсивно встряхивают 10 мин титруют через 30 мин 0,02 н раствором перманганата калия. Используя полученн: результаты титрировагшя. строили график зависимости концентрации перманганата кал от внесенного объема каждого соединения. Достоинство данного метода заключается том, что он позволяет определять вышеуказанные соединения и в неокрашенных раствор (возможность применения методики для определения аскорбиновой кислоты, кортизо ацетата). Правильность предложенной методики проверена методом «введено-найденс результаты которого представлены в таблицах 10-14.

Таблица 10. Проверка правильности определения фенола в воде методом "введен найдено" титриметрическим методом с использованием иммобилизованной на СВ-1 Г (л = 6, Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X. нг/мл данным методом ■¿п фотометрическим методом

10,00 11,80 11,80 ±1,6 10,20±1,02

20,00 17,90 17,90+2,8 21,90+2,54

30,00 28,20 28,20±3,1 27,80±2,97

50,00 47,70 47,70+3,4 -

70,00 71,90 71,90±3,6 -

100.00 97,20 97,20±4,3 -

** - УозЬтига КтоэЫ, Suzuki ТакШко, 5ата<1а Мазаак1, НоЬо ТояЫуик!// Випзск1 ка§ак 1902. V. 41. Р.191-196.

Таблица 11. Проверка правильности определения резорцина в воде методом "введено найдено" титриметрическим методом с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ ( = 6, Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X нг/мл \'п данным методом 4п фотометрическим методом

10,00 9,30 9,30±1,00 9,60±0,94

20,00 18,80 18,80±1,30 22,0± 1,04

30,00 27,20 27.20±3,20 27,9±2,94

50,00 53,10 53,10±3,60 -

70,00 67,10 67,10±4.10 -

100,00 103,60 103,60±4,5 -

Таблица 12. Проверка правильности определения пирокатехина в воде мен..

найдено" титриметрическим методом с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ (/

= б, Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X нг/мл — А • 9 у!П данным методом — Г Х = Х±1° \!п фотометрическим методом

10,00 9,10 9,10+1,30 9,10±0,87

20,00 18,40 18,40+1,80 21,90±1,29

30,00 27,60 27,60+2,3 32,10±1,86

50,00 47,1 47.1+2.7 -

70,00 73,4 73,4+3,3 -

100,00 > 102,5 102,5±3,6 -

Таблица 13. Проверка правильности определения пирогаллола в воде методом "введен! найдено" титриметрическим методом с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ I = 6, Р = 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X нг/мл данным методом л/Л фотометрическим методом

10,00 11,20 11,20+1,30 9,40±1',08

20,00 17,80 17,80+1,70 21,80±1,47

30,00 31.60 31.60±2,2 27,20±1,91

50,00 52,10 52,10±2,7 -

70,00 67,90 67,90±3,2 -

100,00 97,30 97,30+3,8 -

Таб.шц.1 14. Проверка правильное!и определения адреналина в воде методом "введено найдено" титриметрическим методом с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ ( - 6. Р 0,95)

Введено (X), нг/мл Найдено X нг/мл У У 4- ^а ^' Гп ' данным методом V« фотометрическим методом

10,00 10,80 10,80+0,80 9,40+0,63

20,00 18,50 18,50+1,30 21,30±1,17

30,00 27,20 27,20+1,60 31,80+1,32

50,00 52,40 52,40+2,0 -

70,00 73,60 73,60±2,5 -

100,00 103,90 103,90+3,4 -

Как видно из представленных в таблицах 10-14 величин доверительного интервала большей точностью характеризуется ферментативный метод определения I использованием фотометрирования. Титриметрический метод привлекает своей простото? и экспрессностью. Данный метод позволяет определять фенолы для концентраций I интервале 10-100 нг, в то время как ферментативный метод с использованием фотометрирования позволяет снизить нижнюю границу до 1 нг.

Существенным недостатком разработанного титриметрического метода являете; трудность в определении пирокатехина и адреналина. Так как эти вещества имеют одинаковое расположение гидроксильных групп, их ингибирующее действие на реакции: окисления пероксида водорода псроксидазой хрена идентичное. Поэтому необходимс визуальное предварительное определение эффектора (раствор в присутствии адреналина имеет ярко выраженное красное окрашивание).

Моделирование системы проточного анализа ФАВ с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ

Порядок выполнения работы. В 8 пробирок приливают по б мл буферного раствора с рН 6,5, 1 мл вытяжки из корней хрена (ЮОг на 300 мл НгО) 0,5 г сорбента. Интенсивно встряхивают 10 мин, затем в пробирки вносят 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1, 1,5, 2 мл 104 М раствора адреналина гидрохлорида, добавляют 1 мл Н2О2, интенсивно встряхивают 10 мин. и не ранее, чем через 30 мин, снимают оптические плотности при длине волны X = 490 нм. Дачее сорбент промывают дистиллированной водой, центрифугируют. В пробирки снова вносят 0, 0,1, 0.2. 0,4, 0,8, 1, 1,5, 2 мл 10"4 М раствора адреначина гидрохлорида, 1 мл 0,1 н Н2О2, интенсивно встряхивают 10 мин и снова по истечении 30 мин измеряют оптические плотности при указанных выше длинах волн.

Сорбент вновь промывают водой, центрифугируют и повторяют опыт с адреначином.

По полученным величинам строили зависимости «оптическая плотность -концентрация адреначина». Полученная сходимость результатов по определению адреначина в воде позволяет сделать вывод о возможности использования иммобилизованного фермента на менее 3 раз.

ВЫВОДЫ

1. Изучены условия сорбции пероксидазы хрена из водных растворов на ссросп :а\ СВ-1 '.! водном силикагеле: концентрация веществ, рН и температура. Показано, чго сорбция протекает в диапазоне значений рН 4-6. В целом установлено, что СВ-1 способен более эффективно концентрировать пероксидазу хрена, чем водный силикагель. Получены изотермы Лэнгмюра сорбции ПХ, рассчитаны константы сорбции, величины предельной сорбции, основные термодинамические характеристики.

2. Процесс иммобилизации пероксидазы хрена на поверхности исследуемых сорбентов связан с образованием водородных межмолекулярных связей различных частей фермента с поверхностью сорбентов. Наибольшей теплотой образования характеризуются комплексы, в образовании которых принимают участие две и более водородных связи (комплекс с цистеином, тирозином, гистилином). Более высокие величины эначьпии взаимодействия в случае сорбат-сорбент для СВ-1 можно объяснить возможностью образования дополнительной водородной связи с участием свободной орбитачи атома ачюминия и неподеленной пары азота аминогруппы, кислорода гидроксогруппы. Величины АН комплексов сорбат-сорбент для аминокислот и углеводов рассчитаны двумя полуэмпирическими методами (AMI, РМЗ) с хорошей сходимостью результатов. При этом следует отмстить, что метод РМЗ дает более реачьную структуру комплексов сорбат-сорбент.

3. Проведено теоретическое обоснование протекания процесса сорбции а кислой среде. Доказано, что происходит взаимодействие ионизированных в кислой среде аминогрупп фермента с гидроксогруппами сорбента. Проведено теоретическое изучение влияния иона железа на процесс иммобилизации пероксидазы хрена на исследуемых сорбентах.

4. Проведено изучение влияния иммобилизации на ферментативную активность пероксидазы хрена. Полученные кинетические кривые позволяют сделать вывод о том, что на изучаемых сорбентах фермент сохраняет свою актнв/юсть и дополнительно приобретает стабильность, что дает возможность его использования в экспрессных методиках в условиях полевой лаборатории.

5. Разработаны методики спектрофо гометрического и титриметрического определения фенолов, адреначина с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ. Как видно из

представленных величин доверительного интервала большей точностьк характеризуется спектрофотометрический ферментативный метод определения Титриметрический метод привлекает своей простотой и экспрессностью. Данный мето; позволяет определять фенолы для концентраций в интервале 10-100 нг, в то время ка» ферментативный метод с использованием фотометрирования позволяет снизит! нижнюю границу до 1 нг.

6. Проведено изучение возможности использования иммобилизованного на СВ-1 фермента ПХ в проточном анализе. Полученные данные по определению адреналина f воде позволяют сделать вывод о возможности использования иммобилизованного фермента на менее 3 раз.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Алыков Н.М, Васильева Е.С., Котляр Е.Г., Попович Н.В., Морозов Б.Б., Титова О.Л. Яковлева Л.В. Сорбционное концентрирование на сорбентах группы СВ и последующе« определение в природных объектах ряда ФАВ. // Естественные науки. Журн фундаментальн. и прикладн. исследований. Изд-во АГПУ, 1999. Лг 1. С. 17-21.

2. Алыков U.M., Котляр Е.Г. Сорбционное концентрирование пероксидаз нг неорганических сорбентах. // Естественные науки. Журн. фундаментальн. и прикладн исследований. Изд-во АГПУ. В печати.

3. Алыков U.M., Котляр Е.Г. Сорбционное концентрирование пероксидаз не неорганических сорбентах // Тез. докл. Всеросс. конф. «Химический анализ веществ v материалов». Москва, 16-21 апреля 2000. С. 159-160.

4. Алыков Н.М.. Пащенко К.П., Алыков H.H., Локтионова Е.Г. Изучение MeToaaMv квантовой химии основных энергетических и структурных индексов кластеров сорбенгг СВ-1. // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПУ. 29 апреля 1997 г. Астрахань: Изд-вс АГПУ, 1997. С. 32.

5. Алы кое Н.М., Котляр Е.Г. Использование пероксидазы хрена для определения фенолов // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПУ. 26 мая 2000 г. Астрахань' Изд-во АГПУ. 2000. С.7.

6. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Сорбционное концентрирование пероксидаз с целые аналитического использования. // Тез. докл. III Всеросс. конф. «Экоаналитика-2000» с междунар. участием, Краснодар, 2000. Краснодар: Кубанский ун-т, 2000. С.253.

7. Азыков Н.М., Котляр Е.Г. Концентрирование растительных пероксидаз на водном силикагеле. // Эколого-биологические проблемы волжского региона и Северногс Прикаспия. Материалы II Всероссийской научн. конф. 20-22 октября 1999 г. Астрахань: 1999. С. 27-28.

8. Алыков U.M., Котляр Е.Г., Иванникова Е.Ю. Изучение растительных пероксидаз и и? сорбции на водном силикагеле и сорбентах группы СВ. // Тез. докл. итоговой научн конф. АГПУ. 22 апреля 1999 г. Астрахань: Изд-во АГПУ, 1999. С.43.

9. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Определение некоторых физиологически активных веществ с использованием пероксидазы хрена иммобилизованной на водном силикагеле и СВ-1. h Эколого-биологические проблемы волжского региона и Северного Прикаспия Материалы Ш Всероссийской научн. конф. 4-6 октября 2000 г. Астрахань: 2000. С.40.

10. Алыков Н.М., Котляр Е.Г., Пащенко К.П. Теоретическое и экспериментальное изучение процесса сорбции пероксидазы хрена. // Эколого-биологические проблемы волжского региона и Северного Прикаспия. Материалы III Всероссийской научн. конф. 4-6 октября 2000 г. Астрахань: 2000. С.38.

11. Атыкова Т.В., Клементьева A.B., Котляр Е.Г. Изучение сорбции фенолов на сорбенте СВ-1 с использованием реакции азосочетания. Всерос.науч.конф. «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия»: Астрахань, 1920 октября 1998. Матер конф. С.5.

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ.

1.1. Структура и свойства пероксидазы.

1.2. Определение пероксидаз, их активности in vivo и in vitro.

1.3. Использование пероксидазы, иммобилизованной на различных носителях.

1.4. Использование в иммуноопределении пероксидаз различного происхождения.

1.5. Миметические пероксидазы.

1.6. Применение пероксидазы хрена в аналитической химии.

1.7. Возможные направления для проведения исследований.

II. АДСОРБЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ И ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОКСИДАХ АЛЮМИНИЯ, КРЕМНИЯ И СОРБЕНТАХ СВ.

2.1. Общее положение теории сорбции.

2.1.1. Изотермы адсорбции.

2.1.2. Площадь, занимаемая одной адсорбированной молекулой.

2.1.3. Аттракционное взаимодействие.

2.2. Адсорбируемость.

2.2.1. Влияние на адсорбируемость природы сорбента.

2.2.2. Влияние на адсорбируемость природы растворителя.

2.2.3. Влияние на адсорбируемость электронного и молекулярного строения сорбата.

2.3. Общие вопросы хемосорбции.

2.4. Адсорбция с участием свободной пары электронов.

2.4.1. Кислород- и азотсодержащие поверхностно-активные вещества.

2.4.2. Серосодержащие вещества.

2.4.3. Природа адсорбционных сил.

III. ИЗУЧЕНИЕ СОРБЦИОННОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА (ИХ) НА РАЗЛИЧНЫХ СОРБЕНТАХ.

3.1. Определение активности пероксидазы хрена в корнях растений.

3.2. Изучение процессов сорбции пероксидазы хрена на различных сорбентах.

3.2.1. Изучение сорбционной способности неорганических сорбентов по отношению к пероксидазе хрена.

3.2.2. Влияние рН на иммобилизацию пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1.

3.2.3. Изучение процесса сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1.

3.2.4. Изучения влияния сорбента на ферментативную активность пероксидазы хрена.

IV. КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА СОРБЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.

4.1. Краткий обзор использованных методов.

4.1.1. Метод полного пренебрежения дифференциальным перекрыванием.

4.1.2. Метод MINDO.

4.1.3. Краткая характеристика методов AMI и РМЗ.

4.2. Теоретическое обоснование протекания процесса иммобилизации пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1 в кислой среде.

4.2.1. Моделирование сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1. 123.

V. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТА ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ.

5.1. Изучение возможности определения гидроксилсодержащих органических соединений.

5.2. Фотометрический метод определения фенолов и адреналина с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ.

5.3. Титриметрический метод определения фенолов и адреналина с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ.

5.4. Моделирование системы проточно-инжекционного анализа ФАВ с использованием иммобилизованной ПХ.

ВЫВОДЫ.

Одной из актуальных проблем аналитической химии сегодняшнего дня является проблема идентификации и количественного определения различных ферментов. Вместе с тем, ферменты составляют неотъемлемую часть современной биотехнологии и предприятия, занятые различными биотехнологическими процессами, используют самые разнообразные методики идентификации и количественного определения ферментов в различных товарных препаратах или материалах, из которых они их извлекают.

Обычно извлечение ферментов осуществляется с помощью молекулярных сит. Этот процесс в ряде случаев долгий, малоэффективный и дорогой. Практически не используются методы концентрирования и извлечения ферментов из природных материалов с использованием неорганических сорбентов. Это связано с тем, что большинство известных неорганических сорбентов либо вообще не концентрируют ферменты, либо обладает по отношению к ферментам небольшой емкостью. В результате предварительных исследований нами было установлено, что особым образом приготовленные силикагели, а также сорбент СВ-1 могут специфично сорбировать некоторые высокомолекулярные физиологически активные вещества, в том числе и ферменты.

Задачей исследования явился поиск концентрирующих агентов и концентрирование окислительно-восстановительных ферментов на природных сорбентах, а также на специально приготовленных силикагелях.

Работа включает следующие этапы:

- изучение изотерм сорбции пероксидазы хрена (ПХ) на водном силикагеле и сорбенте СВ-1;

- изучение влияния рН на процесс сорбции пероксидазы хрена;

- расчет термодинамических характеристик сорбции (энтальпии, энтропии, изобарно-изотермического потенциала) и представление механизма сорбции; 6

- использование пероксидазы, иммобилизованной на СВ-1 и водном силикагеле для идентификации и количественного определения ряда токсикантов в объектах окружающей среды (фенолов и их производных, адреналина).

В качестве задачи предполагается решение вопроса об использовании ферментных препаратов для технологических целей без выделения их с сорбента.

Научная новизна

Впервые проведена иммобилизация фермента пероксидазы хрена на природных алюмосиликатных сорбентах Астраханской области (СВ), дана оценка сорбционной емкости сорбента СВ-1 по отношению к ПХ. Современными квантово-химическими методами (AMI, РМЗ) произведен расчет аминокислот, углеводов, входящих в состав ПХ на водном силикагеле и на алюмосиликатах современными методами квантовой химии (методами РМЗ и AMI). Представлен механизм сорбции ПХ на данных сорбентах.

Практическая значимость

Для иммобилизации пероксидазы с целью ее дальнейшего использования в аналитической химии предложены водный силикагель и сорбент СВ-1, получаемый путем нехимической переработки опок Астраханской области, обладающий высокой сорбционной емкостью и низкой стоимостью. Разработаны методики определения фенолов и адреналина в водных растворах. Использование разработанных методик позволяет определять гидроксилсодержащие органические соединения быстро, надежно и без использования дорогостоящих реактивов.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения изотерм сорбции и термодинамики сорбции ПХ на водном силикагеле и природном сорбенте СВ-1. 7

2. Результаты изучения кинетики пероксидазного окисления с использованием иммобилизованного на природном сорбенте СВ-1 и водном силикагеле пероксидазы хрена.

3. Результаты теоретических расчетов модели адсорбции аминокислот, углеводов, входящих в состав ПХ на поверхности алюмосиликатов и силикатов (теплоты образования и геометрия адсорбционных комплексов).

4. Результаты сравнительного анализа различных методов расчета, указанных моделей.

5. Механизм сорбции оксидаз на водном силикагеле и сорбенте СВ-1.

6. Спектрофотометрический и титриметрический методы определения гидроксилсодержащих органических соединений в водных растворах, основанные на использовании иммобилизованной на СВ-1 пероксидазы хрена.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Астраханского государственного педагогического университета (1997-2000), Всероссийской научной конференции по эколого-биологическим проблемам Волжского региона и Северного Прикаспия (Астрахань, 1998-2000), Международной конференции по аналитической химии (Москва, 2000), Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием (Экоаналитика-2000, Краснодар, 2000).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 7 тезисов докладов. 9

I. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ

ВЫВОДЫ

1. Изучены условия сорбции пероксидазы хрена из водных растворов на сорбентах СВ-1 и водном силикагеле: концентрация веществ, рН и температура. Показано, что сорбция протекает в диапазоне значений рН 4-6. В целом установлено, что СВ-1 способен более эффективно концентрировать пероксидазу хрена, чем водный силикагель. Получены изотермы Лэнгмюра сорбции ПХ, рассчитаны константы сорбции, величины предельной сорбции, основные термодинамические характеристики.

2. Процесс иммобилизации пероксидазы хрена на поверхности исследуемых сорбентов связан с образованием водородных межмолекулярных связей различных частей фермента с поверхностью сорбентов. Наибольшей теплотой образования характеризуются комплексы, в образовании которых принимают участие две и более водородных связи (комплекс с цистеином, тирозином, гистидином). Более высокие величины энальпии взаимодействия в случае сорбат-сорбент для СВ-1 можно объяснить возможностью образования дополнительной водородной связи с участием свободной орбитали атома алюминия и неподеленной пары азота аминогруппы, кислорода гидроксогруппы. Величины АН комплексов сорбат-сорбент для аминокислот и углеводов рассчитаны двумя полуэмпирическими методами (AMI, РМЗ) с хорошей сходимостью результатов. При этом следует отметить, что метод РМЗ дает более реальную структуру комплексов сорбат-сорбент.

3. Проведено теоретическое обоснование протекания процесса сорбции в кислой среде. Доказано, что происходит взаимодействие ионизированных в кислой среде аминогрупп фермента с гидроксогруппами сорбента. Проведено теоретическое изучение

160 влияния иона железа на процесс иммобилизации пероксидазы хрена на исследуемых сорбентах.

4. Проведено изучение влияния иммобилизации на ферментативную активность пероксидазы хрена. Полученные кинетические кривые позволяют сделать вывод о том, что на изучаемых сорбентах фермент сохраняет свою активность и дополнительно приобретает стабильность, что дает возможность его использования в экспрессных методиках в условиях полевой лаборатории.

5. Разработаны методики спектрофотометрического и титриметрического определения фенолов, адреналина с использованием иммобилизованной на СВ-1 ПХ. Как видно из представленных величин доверительного интервала большей точностью характеризуется спектрофотометрический ферментативный метод определения. Титриметрический метод привлекает своей простотой и экспрессностью. Данный метод позволяет определять фенолы для концентраций в интервале 10-100 нг, в то время как ферментативный метод с использованием фотометрирования позволяет снизить нижнюю границу до 1 нг.

6. Проведено изучение возможности использования иммобилизованного на СВ-1 фермента ПХ в проточном анализе. Полученные данные по определению адреналина в воде позволяют сделать вывод о возможности использования иммобилизованного фермента на менее 3 раз.

161

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Алыков Н.М, Васильева Е.С., Котляр Е.Г., Попович Н.В., Морозов Б.Б., Титова O.JL, Яковлева JI.B. Сорбционное концентрирование на сорбентах группы СВ и последующее определение в природных объектах ряда ФАВ. // Естественные науки. Журн. фундаментальн. и прикладн. исследований. Изд-во АГПУ, 1999. № 1. С. 17-21.

2. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Сорбционное концентрирование пероксидаз на неорганических сорбентах. // Естественные науки. Журн. фундаментальн. и прикладн. исследований. Изд-во АГПУ. В печати.

3. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Сорбционное концентрирование пероксидаз на неорганических сорбентах // Тез. докл. Всеросс. конф. «Химический анализ веществ и материалов». Москва, 16-21 апреля 2000. С. 159-160.

4. Алыков Н.М., Пащенко К.П., Алыков H.H., Локтионова (Котляр) Е.Г. Изучение методами квантовой химии основных энергетических и структурных индексов кластеров сорбента СВ-1. // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПУ. 29 апреля 1997 г. Астрахань: Изд-во АГПУ, 1997. С. 32.

5. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Использование пероксидазы хрена для определения фенолов. // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПУ. 26 мая 2000 г. Астрахань: Изд-во АГПУ, 2000. С.7.

6. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Сорбционное концентрирование пероксидаз с целью аналитического использования. // Тез. докл. III

162

Всеросс. конф. «Экоаналитика-2000» с междунар. участием, Краснодар, 2000. Краснодар: Кубанский ун-т, 2000. С.253.

7. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Концентрирование растительных пероксидаз на водном силикагеле. // Эколого-биологические проблемы волжского региона и Северного Прикаспия. Материалы II Всероссийской научн. конф. 20-22 октября 1999 г. Астрахань: 1999. С. 27-28.

8. Алыков Н.М., Котляр Е.Г., Иванникова Е.Ю. Изучение растительных пероксидаз и их сорбции на водном силикагеле и сорбентах группы СВ. // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПУ. 22 апреля 1999 г. Астрахань: Изд-во АГПУ, 1999. С.43.

9. Алыков Н.М., Котляр Е.Г. Определение некоторых физиологически активных веществ с использованием пероксидазы хрена иммобилизованной на водном силикагеле и СВ-1. // Эколого-биологические проблемы волжского региона и Северного Прикаспия. Материалы III Всероссийской научн. конф. 4-6 октября 2000 г. Астрахань: 2000. С.40.

10.Алыков Н.М., Котляр Е.Г., Пащенко К.П. Теоретическое и экспериментальное изучение процесса сорбции пероксидазы хрена. // Эколого-биологические проблемы волжского региона и Северного Прикаспия. Матариалы III Всероссийской научн. конф. 4-6 октября 2000 г. Астрахань: 2000. С.38.

П.Алыкова Т.В., Клементьева A.B., Котляр Е.Г. Изучение сорбции фенолов на сорбенте СВ-1 с использованием реакции азосочетания. Всерос.науч.конф. «Эколого-биологические

163 проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия»: Астрахань, 19-20 октября. 1998. Материалы конференции С.5.

164

1. Угарова Н.Н., Лебедева О.В.//Биохимия. 1978 Т.43. №10. С.1731-1742.

2. Saunders B.G., Holmes-Siedle А.С., Stark В.Р.// Peroxidase. Butterworth. 1964. London.

3. Maely A.C.// Methods Enzymol. 1955. V. 2. P. 801-813.

4. Clementi P., Palade C.E. //J.Cell. Biol. 1969. V. 41. P.33-58.

5. Shin J.H.C., Shannon L.M., Kay E., Lew I.Y.// J. Biol. Chem. 1971. V.246. P. 4546-4554.

6. Delincee H., Radola B.J. // Biochim. et. Biophys. acta. 1970. V. 200. P. 404407.

7. Shannon L.M., Kay E., Lew I.Y. // J. Biol. Chem. 1966. V.241. P. 2166-2172.

8. Welinder K.G., Smillie L.B, Schonbaum G.R. // Canad. J. Biochem. 1972. Y.50. P. 44-62.

9. Welinder K.G. // FEBS Letters. 1976. V.72. P. 19-23.

10. Welinder K.G., Smillie L.B.// Canad. J. Biochem. 1972. V.50. P.63-90.

11. Welinder K.G. // FEBS Letters 1973. V.30. P.243-245.

12. Угарова H.H., Рожкова Г.Д., Васильева Т.Е., Березин И.В.// Биохимия .1978. Т.43. Р.793-798.

13. Ellis W.D., Dunford Н.В.// Canad. J. Biochem. 1968. V.46. P.1231-1235. 14.Strickland E.H.//Biochim. et. Biophys. acta. 1968. V.46. P.1231-1235.

14. Chance В.// Science. 1949. V.109. P.204-208.

15. George P.//Nature. 1952. V.169. P.612-613.

16. Dunford H.B., Stillman J.S. // Coord.Chem.Rev.1976. V.19. P. 187-251.

17. Tamura M., Hori H. // Biochem.et biophys.acta. 1972. V.284. P. 20-29.

18. Yamada H., Yamazaki I. // Arch.Biochem. and Biophys. 1974. V.165. P.728-738

19. Critchlow H.E., Dunford H.B.// J. Biol, chem.1972. V. 247. P.3714-3725.

20. Ebermann R., Gehrinder W.// J.Chromatogr.1985 V. 348. №1. P.313-316.

21. Gantzer M.L.// Miles Lab.Inc. Пат. 4556640, США. Заявл. 29.06.83, № 508836. Опубл. 03.12.85. МКИ G 01 N 33/52. НКИ 436/66.165

22. Аронбаев Д.М., Аронбаева Н.И.//А.с. 1285374. СССР. Заявл. 12.12.84, N 3822043/28-13. Опубл.в Б.И. 1987. №3. МКИ G 01 N 33/58.

23. Alexander P.W., Maitra С.// Anal. Chim. acta. 1988. V. 208. №1-2. P.173-181.

24. WuT.G., Bellama J.M.// Anal.Lett. 1989. V.22. №5. P.l 107-1124.

25. Nolasco H., Moreno O. //J.Chromatogr.l991.V.539. №1. P.198-206.

26. Akaza I., AotaN. // Talanta.1990. V.37. №9. P.925-929.

27. Nohta H., Watanabe Т., Nagaoka H., Ohkura Y. // Anal.Sci.l991.V.7. №3.P.437- 441.

28. Revol Andre, Aguettant Daphne // Заявка 2677126 Франция, МКИ5 G 01 n 35/52, 21/78, с 12 Q 1/28. A 61 В/ FAMA (S.A.)-FR. N 9107256. Заявл. 27.05.91. Опубл. 04.12.92.

29. Yao Т., Sato M., Wasa T.// J. Chem. Soc. Jap. Chem. and Ind Chem. 1985. № 7. P.1501-1503.

30. Hwang Hoon, Dasgupta Purnendu K. // Microchim. acta. 1985, V.3 № 1-2. P. 77-78.

31. Abdel-Latif M.S., Suleiman A.A., Guilbant G.G. // Anal. Lett. 1988. V.21. №6. P.943-951.

32. Cosgrove M., Moody G.J., Thomas J.D.R. // Analyst. 1988. V.113. № 12. P.1811- 1815.

33. Tatsume Т., Okawa Y, Watanabe T. // Anal. Chem. 1989. V.61. № 21. P.2352-2355.

34. Botre F., Mazzei F., Lanzi M., Lorenti G., Botre CI. // Anal. Chem. acta. 1991. V.255. № 1. P.59-62.

35. Smit M.H., Rechnitz G.A. // Anal. Chem. 1992. V. 64. № 3. P. 245-249.

36. Tominaga M., Taniguchi I.A. // Bunscki kagaku. 1991. V. 40. № 11. P. 859861.

37. Tatsume Т., Gondaira M., Watanabe T. // Anal. Chem. 1992. V. 64. № 10. P.1183-1187.

38. Rap. Int. Congr. Anal. Sci., Chiba, 25-31 Aug., 1991 /Reda Т., Miyaoko S.,166

39. Ozawa S., Mitsushita F., Kobayashi D., Senda M. // Anal. Sci. 1991. 7. Pt. 2, Suppl. P. 1443-1446.

40. Wang Joseph, Naser najih // Anal. Lett. 1992. V. 25. № 6. P.999-1009.

41. Plenary, lecture: Pap. Meet. . Anal.Appl.Chem.Modif.Electrodes; Bristol, Jan. 7-8, 1992/Gorton L., Jonsson-Pettersson G., Csoregi E., Johansson K., Dominguez E., Marko-Varga G.//Analyst.l992. V.l 17. №8. P.1235-1241.

42. Hlavay J., Guilbaut G.// Acta. Chem. hung. Models Chem.1993. V.130. № 1. P.83-93.

43. Wang J., Lin Y. //Anal. Chem. acta. 1993. V. 271. № 1. P.53-58.

44. Marshall R.W., Gibson T.D. // Anal. Chem. acta. 1992. V. 266. № 2. P.309-315.

45. Dan Li Wang, Heller A. //Anal. Chem. 1993. V. 65. № 8. P.1069-1073.

46. Weller M.G., Weil L., Niessner R. // Microchim. acta. 1992. V.3. № 1-2. P.29-40.

47. Wang J., Dempsey E., Eremenko A., Smyth M.R.//Anal.Chim.acta. 1993. V. 279. №2. P.203-208.

48. Wang J., Chen Q. // Anal.Chem. 1993. V. 65. №19. p.2698-2700.

49. Cosnier S., Popescu I.C. // Anal. Chem. acta. 1996. V.319. № 1-2. P.145-151.

50. Morales A., Cespedes F., Munoz J., Martinez. Fabregas E., Alegret S.//Anal.chim.acta. 1996. V.332. №2-3. P131-138.51 .Li Jinghong, Yan Juchao, Deng Qing, Cheng Guangjin, Dong Shaojun // Electrochim. acta. 1997. V. 42. № 6. P. 961-967.

51. Rap 2 nd Workshop Biosens. and Bioanal. Techn. Environ. Anal., Lund, Sept. 11-13, 1997 / Lingren A., Emneus J., Ruzgas T., Gorton L., Marko Varga Gy. // Anal. chim. acta. 1997. V. 347. № 1-2. P. 51- 62.

52. Gonzales Martinez M.A., Morais S., Puchades R., Maquieira A., Abad A., Montoya A. //Anal. Chem. 1997. V.69. № 14. P.2812-2818.

53. Guo Yizhu, Dong Shaojun // Anal. Chem. 1997. V. 69. № 10. P.1904-1908.

54. Wang J, Liu Jie, Cepra G. // Anal. Chem. 1997. V.69. № 15. P.3124-3127.167

55. Tatsuma T., Ariyama K., Oyama N. 11 Anal. Chim. acta. 1996. V 318. № 3. P. 297-301.

56. Zhu Yimin, Zhang Jinghong, Dong Shaojun // Anal. Chim. acta. 1997. V. 353. № l.P. 45-52.

57. Kiba Nobidoshi, Itagaki Akito, Fukumura Satoru, Saegusa Kazuya, Furusawa, Motohisa//Anal. Chim. acta. 1997. V. 354. № 1-3. P. 205-210.

58. Heimoller P., Kurth H.-H., Rabong R., Gurner W.V., Kettrup A., Gab S. // Anal. Chem. 1998.V.70. № 7. P. 1437-1439.

59. Chut Shi Lin, Li Juan, Gan Swee Ngin //Analyst. 1997. V.122. № 11. P. 14311434.

60. Lvovich V., Scheeline A. // Anal. Chim. acta. 1997. V. 354. № 1-3. P.315-323.

61. Compagrnone D., Schweicher P., Kauffman J.M., Guilbault G.G. // Anal. Lett. 1998. V. 31. №7. P. 1107-1120.

62. Li Yuan-Zong, Town-shend Alan // Anal. Chim. acta. 1998. V.59. № 1-2. P. 149-156.

63. Liu Zhimung, Niwa O., Horinchi T., Kurita R., Torimitsu, Keulki // Pittsburgh Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc., Orlando, Fla, March 7-12, 1999: PITTCON'99 Book Abitr. Orlando (Fla)., 1990. P. 751.

64. Williams E.J, Campbell A.K., Anal.Biochem. 1986. V.155. №2. P. 249-255.

65. Kricka L.J., Marcinkowski J.M., Wilding P., Lekhakula S. // Talanta. 1990. V. 37. № 10. P.971-974.

66. Janssens P.M.W., KornaatN., Tieleman R., Monnens L.A.H., Willems J.L. // Clin. Chem. 1992. V. 38. № 2. P.216-222.68.0'Toole AA., Kricka L.J., Thorpe G.H.G., Whitehead Th.P. // Anal.chim.acta. 1992. V. 266. №2. P. 193-1999.

67. Hara T., Nakamura K., Satomura S., Matsuura S.// Anal.Chem. 1994. V. 66. №3. P.351-354.

68. Kolosova A.Yu., Blintsov A.N., Samsonova J.,V., Egorov A.M.//1681.t.Congr.Anal.Chem., Moscow, June 15-21 1997. Abstr. V.2. Moscow. 1997. C.R2 .

69. Pap.2nd Workshop Biosens. And Bioanal. Techn. Environ. Anal., Lund. Sept. 11-13. 1997. V. 347. №1-2. P.187-198.

70. Zhang Honghica,Nacer N., Wojciechowski M., Stewart T.N., Shafer L., O'Daly J.P., Henkens R.W.//Pittsburgh Conf. Anal. Chem. and Appl.Spectrosc., Atlanta, Ga, March 16-21.1997. PITTCON'97:Book Abstr. Atlanta (Ga).1997. P. 1246.

71. Pfortner P., Weller M.G., NiessnerR. // Fresenius'J.Anal.Chem. Fresenius'Z. anal. Chem.. 1998. V.360. №2. P.192-1998.

72. Fawar Katmeh M., Godfrey A.J.M., Stevenson D., Aherne G.W.//Analyst. 1997. V. 122. №5. P.481-486.

73. Saito Y., Nakashima S., Mifune M., Odo J., Tanaka Y., Chikuma M., Tanaka

74. H.//Anal. Chim. acta. 1985. V.172. P.285-287. 76.Sun Shushend, Zheng Zhiping// Anal.Chem. 1990.V. 18. №4. P.329-333.

75. Ci Yunxiang, Chang Wenbao, He Hongbin, Liu Jingshi // Acta Sci.Natur. Univ. Pekinensis. 1990. V. 26. №4. P.454-460.

76. Mifune M., Odo J., Motohashi N., Saito Y., Iwado A., Tanaka Y., Chikuma M., Tanaka H.// Anal.Sci. 1991. V.7. №2. P.277-281.

77. Genfa Z, Dasgupta P.K.//Anal.Chem. 1992. V. 64. № 5. P.517-522.

78. Yoshmura Futoshi, Suzuki Takihiko, Samada Masaaki, Hobo Toshiyuki// Bunscki kagaku. 1992. V. 41. P. 191-196.

79. Wang Fang, Wu Yan Zhong, Wu Xiao - Wei, Shong Shu - Seng, Ci Yun -Xiang // Fresenius'J.Anal.Chem.1992. V. 344. №12. P.556-558 .

80. Ci Yun-Xiang, Tu Jian- Ke, Yao Feng Ji, Liu Zhao - Lan, Lin Sa, Zheng Wei - Qing // Anal.Chim.Acta.1993. V.277. № 1. P.67-72.

81. Kiranas E.R., Tzouwara Karayanni S.M., Karayannis M.I./ Analyst. 1993. V.118. № 6. P.727-729.169

82. Biomimetic of peroxidase and enzymatic assay for ascorbic acid / Zhu Min, Huang Xue Mei, Shen Han - Xi, Li Rong // Anal. Chim.acta. 1996. V. 334. №3. P.303-307.

83. Huang Xue Mei, Zhu Min, Mao Lu - Yuan, Shen Han - Xi // Anal. Sci.1997. V. 13. №1. P.145-147.

84. Mao Lu Yuan, Li Rong, Zhu Min, Huang Xue - Mei, Shen Han - Xi // Pittsburgh Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc., Atlanta, Ga., March 1621,1997. PITTCON'97. Book Abstr. - Atlanta (Ga), 1997. P.25.

85. Li Yuan Zong, He Ning, Wang Xiaoging, Chang Wen - bas, Ci - Yun -xiang //Analyst. 1998. V.123. №2. P.359-364.

86. Murty K.V.S.S., Rao Ekambareswara К., Sastry Ch. Suryaprakasa // Analyst. 1984, V.1096. №3. P. 405-406.

87. Kawasaki Т., Tanabe K., Maeda M., Tsuji A.// Abstr Jap. Pittburgh Conf. And Expo. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. Atlantic City, N. J., March 9-13, 1987. Pittsburgh, Pa. 1987. P. 116.

88. Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Стародумова Н.Н.// Журн. анал.химии. 1987. Т. 42 . №10. С.1824 1828.

89. Toci Jun' inchi.// Analyst. 1987. V. 112. №11. P.1565-1568.

90. Uchida K., Yoshzawa D., Tomoda M., Saito S.// Anal. Sci. 1987. V. 3. №2. P.181-183.

91. Siedel J., Deeg R., Seidel H., Mollering H., Staepels J., Gauhl H., Ziegenhorn J.// Anal Lett. 1988. V.21. №6. P. 1009-1017.

92. Brochot J.A., Siddiqu I.W. // Anal.chim.acta. 1989. V. 224. №2. P. 329-337.

93. Abstr.Plen and Keynote Lett. And Posters ISM, Wiesbaden, 28 Aug. 1 Sept., 1989 // Walter В., Ballsmiter R.//Fresenius'J. anal.Chem. 1989. V. 334. №7. P.718.170

94. Ngo T.T. // 197th ACS Nat.Meet, Dallas, Tex, Apr. 9-14, 1989: Abstr. Rap -Washington (D.C.). 1989. P.612.

95. Maslowka J, Owczarek A. // Przem. Chem. 1989. V. 68. № 9. P. 413-416 .

96. Пат. 4978612 США МКИ5 С 12 Й 1/61/ Kobayashi M, Sugao M.; Konica Corp. № 117799; Заявл. 05.11.87. Опубл. 18.12.90. Приор. 17.11.86. № 61273433 (приор. Япония). НКИ 435/10.

97. A.c. 1705745 СССР, МКИ5 G 01 № 33/48/ Пентюк A.A., Истомин В.М, Мусин P.A., Лычик Г.А, Луцюк Н.Б, Илика В.Г.; Винниц. мед. ин-т. № 4760330/14. Завл. 20.11.89. Опубл. 15.01.92. Бюл. № 2.

98. Walter В, Ballshmiter К. // Fresenius J. Anal. Chem. 1992. V. 342. № 10. P.827-833 .

99. Pascual С, Del Casillo M.D, Romay C. // Anal. Lett. 1992. V. 25. № 5. P.837-849.

100. С. Yun-Xiang, Tie Jian-Ke, Wang Qin-Wei, Chang Wen-Bao // Anal, chim. acta. 1992. V. 269. № 1. P.109-114.

101. Ohta Takafumi, Yamauchi Yuki, Takitani Shoji // Fresenius J. Anal. Chem. 1992. V. 343. № 6. P.550-552.

102. Долманова И.Ф, Золотова Г.А, Шеховцова Т.Н. // 15 Менделеев, съезд по общ. и прикл. химии. Минск, 24-29 мая, 1993. Т.1. Минск. 1993.С. 332-333.

103. Шеховцова Т.А, Беклемишев М.К, Долманова И.Ф. // Анал. объектов окруж. среды: Тез.докл 3 Всерос. конф. «Экоаналитика-98» с Международным участием, 20-25 сент, 1998. Краснодар. 1998. С. 451-452.

104. Wang J, Reviejo A.J. //Analyst. 1993. V. 118. № 9. P. 1149-1151.

105. Сафронов M.H, Балмасова С.И. // 4 Конф. «Биоантиоксидант», Москва, 2-4 июня, 1992: Тез.докл. Т.1. М. 1993. С. 227-228.

106. Vampola С, Matt J, Fan Т, Perguson В. // Pittsburg Conf, Anal. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. Atlanta, GA, March 8-12 th, 1993: Abstr. Atlanta, (GA). 1993. P. 406.171

107. Gazaryan I.G., Loginov D.B., Lialulin A.L., Shekhovtsova T.N. // Anal. Lett. 1994. V. 27. № 15. P. 2917-2930.

108. Shekhovtsova Т., Bagirova N., Gazaryan I. // Int. Congr. Anal. Chem., Moscow, June 15-21,1997: Abstr. V.2. Moscow. 1997. P 16.

109. Багирова H.A., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. // Анал. объектов окруж. среды: Тез.докл 3 Всерос. конф. «Экоаналитика-98» с Международным участием, Краснодар, 20-25 сент., 1998. Краснодар, 1998. С. 192.

110. Goral V.N., Nelen M.I., Ryabov A.D. // Anal. Lett. 1995. V. 28. № 12. P. 2139-2148.

111. Garcia Sanchez F., Navas Diaz A., Bonzalez Garcia J.A. // Anal. chim. acta. 1995. V. 310. №3. P. 399-406.

112. Kurova V.S., Goral V.N., Reshetova M.D., Ryabov A.D. // Int. Congr. Anal. Chem. Moscow, June 15-21, 1997: Abstr. T.l. Moscow, 1997. P. 17.

113. Mjadkova M., Panchenko O., Abramenko Т., Savitskaya J. // Int. Congr. Anal. Chem., Moscow, June 15-21,1997: Abstr. V.2. Moscow, 1997. P. 15.

114. Kolosova A. Yu., Blinkov A.N., Egorov A.M. // Int. Congr. Anal. Chem., Moscow, June 15-21, 1997: Abstr. V.2. Moscow. 1997. P.14.

115. Ling Ma Zhi, Ping Wang Yan, Xong Bai Tain // Pitsburgh Conf. Anal, chem. and Appl. Spectrosc., Atlanta, GA, March 16-21, 1997: PITTCON'97: Book Abstr. Atlanta (GA). 1997. P.498.

116. Zhu Min, Huang Xuemei, Li Jie, Shen Hanxi // Anal. chim. acta. 1997. V. 357. №3. P. 261-267.

117. Shekhovtsova T.N., Muginova S.V., Bagirova N.A. // Mendeleev Commun.- 1997. №3. P. 119-120.

118. Мугинова C.B., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. // Анал. объектов окруж. среды: Тез.докл 3 Всерос. конф. «Экоаналитика-98» с Международным участием, Краснодар, 20-25 сент., 1998. Краснодар. 1998. С. 343-344.172

119. Donahue William F. // Envion. Toxicol. and Chem. 1998. V. 17. № 5. P.783.787.

120. Baker W.L.// Anal. Lett. 1998. V. 31. № 8. P. 1325-1335.

121. Meyer J., Karst U. // // Pitsburgh Conf. Anal. chem. and Appl. Spectrosc.,

122. Orlando, Fla, March 7-12, 1999: PITTCON'99: Book abstr. Orlando (Fla).,1999. P. 562.

123. Kamidale Т., Tani Т., Watanabe Hiroto // Anal. Sei. 1998. V. 14. № 4. P.725.729.

124. Alykov N.M., Voronin N.I., Resnyanskaya A.S. // Ecological congress,1.ternational J. 1997. V. 1. N 3. P. 41.

125. Alykov N.M., Dedkov Y.M., Alykov N.N. Int. Simposium «ARS Separatoria' 98». GNIEW, Poland, June 15-18, 1998. Abstract V. 1. P. 35.

126. Алыков H.H. // Астраханский край: история и современность (к 280-летию образования Астраханской губернии. Астрахань, 26-27 ноября 1997.) Материалы Всероссийской научно-практической конференции. С. 239.

127. Алыков Н.М., Воронин H.H., Алыков H.H., Гламозда A.B. и др.// III Всерос. Конф. «Экоаналитика-98». Краснодар, 20-25 сентября 1998. Тез. докл. С. 171.

128. Клементьева A.B. // Астраханский край: история и современность (к 280-летию образования Астраханской губернии. Астрахань, 26-27 ноября 1997.) Материалы Всероссийской научно-практической конференции. С. 252.

129. Алыкова Т.В., Клементьева A.B., Котляр Е.Г. Всерос. конф. «Экологобиологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия».

130. Астрахань, 19-20 октября 1998. Матер, конф. С. 5.

131. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Васильева Е.С., Пащенко К.П. // Естественные науки. 1999. Т. 1. № 1. С. 12.

132. Яковлева JI.B. // Астраханский край: история и совремеенность (к 280-летию образования Астраханской губернии. Астрахань, 26-27 ноября1731997.) Материалы Всероссийской научно-практической конференции. С. 259.

133. Алыков Н.М., Гламозда A.B., Васильева Е.С., Титова O.JL, Яковлева JI.B. // Конференция по эколого- биологическим проблемам Волжского региона и Северного Прикаспия». Астрахань, 3-4 октября 1998. Тез. докл. С. 38.

134. Алыков Н.М., Васильева Е.С., Котляр Е.Г. и др. // Естественные науки. 1999. Т. 1. № 1.С. 17.

135. Алыков Н.М., Гламозда A.B., Морозов Б.Б., Титова О.Л., Яковлева Л.В., Васильев В.А. и др. // Материалы Российской конференции «Эколого- биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия». Астрахань, 19-20 октября 1998. Тез. докл. С. 11.

136. Alykova T.V., Vasiliev V.A., Kazmina Е.А., Klementiena A.V. // Internetional Congress on analitikal chemistry. Moscaw. June. 15-21 1997. Abstr. V. 2. P. 28.

137. Алыков H.M., Васильев В.А. // Всерос. науч. конф. «Экоаналитика-98». Краснодар. 22-25 сентября. 1998. Тез. докл. С. 170.

138. Алыкова Т.В., Васильев В.А., Казьмина Е.А., Кашина А.Н. и др. // Астраханский край: история и совремеенность (к 280-летию образования Астраханской губернии. Астрахань, 26-27 ноября 1997.) Материалы Всероссийской научно-практической конференции.

139. Нечаев Е.А. Хемосорбция органических веществ на оксидах и металлах. Харьков. В. Ш., Изд-во Харьковского университета, 1989. 144 с.

140. Giles С.Н., Мао Ewan T.N., Naruwa S.N., Smith D. // J. Chem. Soc. 1960. P. 3973-3993.

141. Дамаскин Б.Б., Петрий O.A., Батраков B.B. Адсорбция органических соединений на электродах. М., 1968.

142. Грег С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость. М., 1970.

143. Kipling Y.Y. Adsorption from solution of nonelectrolytes. N.-Y., 1965.174

144. Зелизный A.M., Литковец Е.А., Грущак В.Т // Укр. хим. жури. 1971. Т. 37, №4. С. 337-342.

145. Armistead C.G., Tyler A.J., Hockey J.A. // Trans. Far. Soc. 1971. Vol. 67, N. 2. P. 493-499.

146. Harkins W.J., Gans D.W. // J. Amer. Chem. Soc. 1931, V. 53, N. 17. P. 2804-2806.

147. Husbands D.J., Tailis W., Waldsax A. // Powder Technol. 1971. V. 5, N 1. P. 31-38.

148. Devis K.M., Denchar J.A., Jbbitson D.A. Adsorption of phenols from nonpolar solvents oh to silica gel // J. Chem. Soc. Far. Trans. Part 1. 1973. N 6. P. 1117-1126.

149. Адам H.K. Физика и химия поверхностей. М.; JL, 1947.

150. Филимонов В.Н. Исследование природы центров физической адсорбции методом инфракрасной спектроскопии // Основные проблемы теории физической адсорбции. М., 1970. С. 116-131.

151. Ветрова Г.А., Зелизный A.M., Литковец Е.А // Укр. хим. журн. 1970. Т. 36, № 7. С. 683-687.

152. Ветрова Г.А., Зелизный A.M., Литковец Е.А // Журн. физ. химии 1970. Т. 44, № 10. С. 2573-2576.

153. De Boer J.H., Houben G.M.M., Lippens B.C. // J. Catalysis. 1962. V. INI. P. 1-7.

154. Гарниченко Л.Г., Киселев В.Ф., Красильноков К.Г // Докл. АН СССР. 1959. Т. 125, № 6. С. 1277-1280.

155. Tamamushi В., Tamaki К. Adsorption of long-chain electrolytes at the solid/liquid interface. Part 2 // Trans. Far. Soc. 1959. V 55. N. 7. P. 1007-1012.

156. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л., 1974.

157. Giles С.Н., Easton J.A., Мс Kay R.B. // Trans. Far. Soc. 1966. V. 62, V 523. P. 1963-1975.

158. Muller К. // J. Res. Inst. Catalysis, Hokkaido Univ. 1967. V. 15, N 1. P. 8993.175

159. Schubert H. Zuz // Chem. Phus. Chem. und Anwendungsthech. grenzflächenaktiven Stoffe, Ber. 6. Int. Kongr. В (Gruppen 1-2). 1973. S. 169178.

160. Нечаев E.A., Волгина В .А. // Журн. физ. химии. 1974. Т. 48, № 9. С. 2309-2314.

161. Hirst W., // Trans. Far. Soc. 1959. Vol. 47. P. 315-322.

162. Giles C.H., Me Kay R.B. // J. Bacteriol. 1965. V. 89, N 2. P. 390-397.

163. Hesse G., Sauter O. //Naturwiss. 1947. V. 34. N 9. S. 277-288.

164. Rupprecht H., Biedermann M. // Colloid and Polimer Sei. 1974. V. 252, N 4. P.558-565.

165. White С.E., Gordon N.E. // J. Phys. Chem. 1928. V 32, N 3. P. 380-400.

166. Norman V.J. //Austral J. Chem. 1970. V. 23., N 11. P. 2171-2176.

167. Gurwitsch L. // Kolloid Z. 1923. V. 32, N 1. S. 80-91.

168. Rebinder P. //Z. Phys. Chem. 1927. V. 129, N 1. S. 161-175.

169. Jacques J., Mathieu J. P. // Bull. Soc. Chim. France. 1946. P. 94-98.

170. Chipalkatti H. R., Giles C. H, Vallance D. G. M. // J. Chem. Soc. 1954. P. 4375-4390.

171. Фукс H. A. // Успехи химии. 1949. T. 18, № 2. С. 206-236.

172. Ruiz S. R., Chovin P., Moureau H. // Bull. Soc. Chim. France. 1946. Vol. 13, N9-10. P. 592-594.

173. Basu S. // Chem. and Ind. 1956. N 29. P. 764-765.

174. Burkin A. R., Halsey G. // J. Chem. Soc. 1963. P. 1014-1023.

175. Flaig Baumann R., Neuwinger H. D., Boehn H. P. // Fortschr. Kolloide u. Polymere. 1971. Bd. 55, N 1. S. 7-15.

176. Giles C. H., Me Kay R. B. //J. Chem. Soc. 1961. P. 58-63.

177. Kagiga T., Sumida Y., Tachi T // Bull. Chem. Soc. Japan. 1971. V. 44, N 10. P. 1219-1223.

178. Айдлер P. К. Коллоидная химия кремнезема и силикатов. M.: Госстройиздат, 1959. 288 с.lie

179. Giles С. H., Mehta H. V., Stewart С. E., Subramanian R. V. // J. Chem. 1954. P. 4360-4374.

180. Волькенштейн Ф. Ф. Физико химия поверхности полупроводников. M., 1973.

181. Киселев А. В., Лыгин В. И. Инфракрасные спектры поверхностных соединений и адсорбированных веществ. М., 1972. 459 с.

182. Киселев В. Ф. Поверхностные явления в полупроводниках и диэлектриках. М., 1970.

183. Урбах М. И., Нечаев Е. А // Электрохимия. 1980. Т. 16, № 8. С. 12641268.

184. Brodskii A. M., Usbakh M. I. // Pgogress in Surface Sei. 1977. V. 8 (3). P. 103-122.

185. Brodskii A. M., Urbakh M. I. // Physica Status Solidi (b). 1976. V. 76. N 1. P. 93-104.

186. Бродский A. M., Урбах M. И. // Электрохимия. 1977. T. 13. № 2. С. 191200.

187. Бродский А. М., Урбах М. И. // Электрохимия. 1976. Т. 12. № 5. С. 826827.

188. Эндрюс Л., Кифер Р. Молекулярные комплексы в органической химии. М., 1967.

189. Нечаев Е. А., Федосеев Н. Ф., Звонарева Г. В. // Коллоид, журн. 1982. Т. 44, №6. С. 1185-1189.

190. Нечаев Е. А., Стрельцова О. А. // Коллоид, журн. 1978. Т. 40. № 1. С. 148-152.

191. Нечаев Е. А., Слолвьев Г. С. // Теор. и эксп. химия. 1971. Т. 6. № 6. С. 815-820.

192. Нечаев Е. А., Павличенко В. А., Белоусова Н. А., Силина Т. Ф. // Электрохимия, 1986. Т. 22. № 3. С. 320-324.

193. Дяткина С. Л., Дамаскин Б. Б. // Электрохимия. 1969. Т. 5. № 4. С. 438441.177

194. Киселев А. В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: ВШ, 1986.

195. Герасимов Я. И. Курс физической химии.сТ. 1. М.: Химия, 1970.

196. Фролов Ю. Г. Курс коллоидной химии. М.: Химия, 1982.

197. Абрамзон А. А., Зайченко Л. П. И др. Поверхностно активные вещества. Л.: Химия, 1988.

198. Айлер Р. К. Химия кремнезема. М.: Мир, 1982.

199. Дункен X., Лыгин В. И. Квантовая химия адсорбции на поверхности твердых тел. М.: Мир, 1980. 288 с.

200. Жидомиров Г. Н., Чувылкин Н. Д. // Успехи химии. 1986. Т. 55. № 3. С. 353.

201. Губанов В. А., Жуков В. П., Литинский А. О. Полуэмпирические методы молекулярных орбиталей в квантовой химии. М.: Наука, 1976. 219 с.

202. Молекулярные постоянные неорганических соединений // Спр. под ред. К. С. Краснова. Л.: Химия, 1979. 446 с.

203. Рабинович В. А., Хавин 3. Я. Краткий химический справочнок. Л.: Химия, 1991.432 с.

204. Щембелов Г. А., Устынюк Ю. А., Мамаев В. М. и др. Квантокохимические методы расчета молекул. М.: Химия, 1980. 256 с.

205. Вилков Л. В., Мастрюков В. С., Садова Н. И. Определение химического строения свободных молекул. Л.: Химия, 1978. 224 с.

206. Методы расчета электронной структуры атомов и молекул. Под. ред. М. Г. Веселова. Л.: ЛГУ, 1976.

207. Лыгин В. И. // Журн. физич. химии. 1994. Т. 68. № 5. С. 866.

208. Лыгин В. И., Магомедбеков X. Г., Вагабов А. А. // Вестник МГУ. Химия. 1982. Т. 23. № 3. С. 278.

209. Литинский А. О., Лебедев Н. Г. // Журн. физич. химии. 1995. Т. 69. № 1. С. 138.178

210. Лыгин В. И., Магомедбеков X. Г., Лыгина И. А. // Журн. структ. Химии. 1981. Т. 22. №4. С. 156.

211. Лыгин В. И. // Кинетика и катализ. 1994. Т. 35. № 4. С. 526.

212. Бурштейн К. Я., Шорыгин П. П. Квантовохимические расчеты в органической химии и молекулярной спектроскопии. М.: Наука, 1989. 104 с.

213. Губина Л. Н., Лыгин В. И. // Журн. физич. химии. 1980. Т. 54. № 5. С. 1310.

214. Воронцова И. К., Михейкин И. Д. // Там же. 1993. Т. 67. № 9. С. 1805.

215. Воронцова И. К., Михейкин И. Д. // Там же. 1994. Т. 68. № 9. С. 1619.

216. Киселев А. В. // Успехи химии. 1956. Т. 25. Вып. 6. С. 705.

217. Киселев А. В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции ихроматографии. М.: Высшая школа, 1986.

218. Травень В. Ф. Электронная структура и свойства органических молекул. М.: Химия, 1989.

219. Лыгин В. И., Улендеева А. Д., Беньковский В. Г., Ляпина Н. К. // Докл. АН СССР. 1977. Т. 233. № 2. С. 420.

220. Pariser R., Parr R.G.// J. Chem. Phys. 1953. V. 21. P. 466, 767.

221. Pople J.A.// Trans. Faraday. Soc. 1953. V. 49. P.1375.

222. Pople J.A., Segal.G.A. // J. Chem. Phys. 1965. V. 43. P. 136.

223. Dahl J.P., Ballhausen C.J.// Adv. Quant. Chem. 1968. V. 4. P.170.

224. Jug KM Theor. Chim. Acta. 1969. V. 14. P. 91.

225. Voigt В.// Theor. Chim. Acta. 1973. V. 31. P. 289.

226. Dixon R.N.// Mol. Phys. 1967. V.12. P.83.

227. Pople J.A, Beveridge D.L.// Approximate Molecular Orbital Theory. N.Y., Mc Graw-Hill Book. 1970

228. Duhl J.P., Johanson H. // Theor. Chim. Acta. 1968. V. 11. P. 8.

229. Becker C.A.L., Duhl J.P. // Theor. Chim. Acta. 1970. V.19. P.135.

230. Choplin F., Kaufman G. // Theor. Chim. Acta. 1972. V. 25. P. 54.

231. Jug KM Theor. Chim. Acta. 1973. V. 30. P. 231.

232. Brown R.D., Rody K.R.// Theor. Chim. Acta. 1970. V. 16. P. 175, 194.179

233. Brown R.D., James B.H., O'Dwyer M.F.// Theor. Chim. Acta. 1970. V.17. P. 264, 279.

234. Минкин В.И., Симкин Б.Я., Меняев P.M. // Теория строения молекул. М., Высшая школа, 1970. С.210-211

235. Stewart J.J.P. // J. Comput. Chem. 1989. V. 10. P.289

236. Кеннеди Дж. Ф., Кабрал И.М.А.// Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы М.: Мир, 1988. С. 30.

237. Оверчук Е.И., Войт A.B., Авраменко В.А. // Журн. физич. химии. 1994. Т. 68. №9. С. 1617. '1. На правах рукописи1. КОТЛЯР ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

238. ИММОБИЛИЗАЦИЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА НА ВОДНОМ СИЛИКАГЕЛЕ И СВ-1 С ЦЕЛЬЮ ДАЛЬНЕЙШЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИил/ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук0200.02 Аналитическая химия1. Астрахань 2000

239. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

240. Цель работы. Поиск концентрирующих агентов и концентрирование окислительно-восстановительных ферментов на примере пероксидазы хрена (ПХ) на природных сорбентах, а также на специально приготовленных силикагелях.

241. В качестве задачи предполагается решение вопроса об использовании ферментных препаратов для технологических целей без выделения их с сорбента.

242. Положения, выносимые на защиту:

243. Результаты изучения процесса сорбции и термодинамики сорбции ПХ на водном силикагеле и природном сорбенте СВ-1.

244. Результаты изучения кинетики пероксидазного окисления с использованием иммобилизованной на природном сорбенте СВ-1, водном силикагеле пероксидазы хрена.

245. Механизм сорбции оксидаз на примере пероксидазы хрена на водном силикагеле и сорбенте СВ-1.

246. Ферментативные фотометрическая и титриметрическая методика определения гидроксилсодержащих органических соединений в водных растворах, основанные на использовании иммобилизованной на СВ-1 пероксидазы хрена.

247. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 7 тезисов докладов.

248. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы (238 источников). Работа изложена на 179 страницах текста, содержит 16 рисунков и 22 таблицы.

249. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ

250. АДСОРБЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОКСИДАХ АЛЮМИНИЯ, КРЕМНИЯ И СОРБЕНТАХ ГРУППЫ СВ

251. Методы исследования сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1

252. Аппаратура. Оптические плотности растворов измеряли на фотоэлектрическом колориметре КФК-3. Измерение рН готовых систем проводили на иономере И-130 (индикаторный электрод стеклянный, электрод сравнения - хлорсеребряный).

253. Общая схема проведения анализа. Влияние рН на сорбцию, определение констант сорбции, кинетику окислительно-восстановительной реакции с участием иммобилизованного фермента изучали в статическом режиме при температурах 25°С и 4°С, с ошибкой + 0,2°С.

254. Изучение сорбционной способности неорганических сорбентов по отношению к ПХ

255. Сорбировали ПХ следующим образом. В воронку на фильтр помещали 2 г сорбента, добавляли 2 см3 жидкой фазы, затем сорбент промывали дистиллированной водой и добавляли реактив Нади, пероксид водорода Одновременно готовилась и контрольная проба.

256. Рис. 1 Влияние рН на процесс сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле

257. Изучение процесса сорбции ПХна водном силикагеле и СВ-1

258. Рис. 2. Изотермы сорбции ПХ при различных температурах на СВ-1 (1 — при Т= 277 К, 2 при Т=298 К)1. С. 105 ед/см3

259. Рис. 3. Изотермы сорбции ПХ при различных температурах на водном силикагеле1 при Т= 277 К, 2 - при Т=298 К)