Иммуноаффинное концентрирование и тест-определение некоторых полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов

Юрасов, Николай Александрович

Иммуноаффинное концентрирование и тест-определение некоторых полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Юрасов, Николай Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Саратов МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Иммуноаффинное концентрирование и тест-определение некоторых полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов»

Автореферат диссертации на тему "Иммуноаффинное концентрирование и тест-определение некоторых полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов"

На правах рукописи

ЮРАСОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИММУНОАФФИННОЕ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И МИКОТОКСИНОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 О НОЯ 2011

Саратов 2011

4859228

Работа выполнена в Саратовском государственном университете имени Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Русанова Татьяна Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Бабкина Софья Сауловна

кандидат химических наук Нестеренко Ирина Сергеевна

Ведущая организация: Владимирский государственный университет

имени А.Г. и Н.Г. Столетовых

Защита состоится 01 декабря 2011 года в 14 ч. 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская 83, С ГУ, Институт химии, I корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в ЗНБ им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Автореферат разослан 31 октября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

Русанова Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Разработка простых и доступных широкому кругу потребителей методик, позволяющих осуществлять контроль качества окружающей среды, продуктов питания и кормов является в настоящее время одной из важнейших задач аналитической химии. В этом плане возможности иммунохимических методов разделения, концентрирования и определения токсикантов, характеризующихся высокой селективностью и чувствительностью, использованы не полностью.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ1) и микотоксины относятся к высокотоксичным и широко распространенным загрязнителям, которые содержатся в объектах окружающей среды и пищевых продуктах в следовых количествах. Чаще всего для их определения используют дорогостоящие и трудоемкие хроматографические методы анализа. В то же время актуальной является разработка доступных потребителю экспрессных методов их определения, а также способов выделения и концентрирования указанных токсикантов из объектов сложной природы. Все большую популярность в аналитической практике приобретают иммуноаффинные колонки для концентрирования токсикантов и иммунотесты для их обнаружения, основанные на специфическом взаимодействии антиген-антитело, построенном на принципе биологического распознавания. Одной из тенденций развития иммуноаффинного концентрирования является использование золь-гель технологии при иммобилизации иммунореагентов, позволяющей регулировать размер пор полимерной сетки и обеспечивать защитное окружение для биомолекул. Однако в литературе описаны лишь единичные примеры применения золь-гель материалов в качестве иммуноаффинных сорбентов и отсутствуют сведения о сравнении различных подходов к иммобилизации антител при концентрировании аналитов. Применение иммунофильтрационных тестов ограничено высоким матричным фоном для сложных объектов анализа и, как правило, определением индивидуальных токсикантов. Таким образом, изучение и применение в иммуноаффинном концентрировании новых материалов с иммобилизованными антителами, поиск подходов к снижению фонового сигнала и одновременному определению нескольких аналитов с использованием иммунофильтрационных тестов является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка и оптимизация простых, экспрессных иммунохимических методик

1 IgG - вторичные кроличьи антивидовые антитела; АН - ацетонитрил; Ат - антитела; БАП - бенз[а]пирен; ВЭЖХ-МС/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемкым масс-спектрометрическим детектированием; ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием; ДОН -дезоксиниваленол; ДОН-ПХ, НТ-2-ПХ,- конъюгаты аналитов с пероксидазой хрена; ДС - декстран сульфат; ЗЕА - зеараленон; ИАК - иммуноаффинная колонка; ИФА - иммунофильтрационный анализ; КМЦ -карбоксиметилделлюлоза; КУ - контрольный уровень; MT - микогоксин(ы); MT-ЩФ, ЗЕА-ЩФ, ОТА-ЩФ -конъюгаты микотоксинов с щелочной фосфатазой; НТ-2 - НТ-2 токсин; OTA - охратоксин А; ПАУ -полициклические ароматические углеводороды; ПХ - пероксидаза; ФУМ - фумонизин B1; хрена; ПЭГ -полиэтиленгликоль; ПЭПА - полиэтиленполиамины; Т-2 - Т-2 токсин; TMOC - тетраметоксисилан; ТФЭ -твердофазная экстракция; ФБ - фосфатно-солевой буферный раствор; ЩФ - щелочная фосфатаза.

концентрирования и тест-определения представителей полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов.

Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

- изучены сорбционные свойства иммуносорбентов на основе золь-гель материала с инкапсулированными антителами (Ат) и сефарозного геля с ковалентно-связанными Ат специфичными к ПАУ и охратоксину A (OTA);

- разработаны методики иммуноаффинного концентрирования ПАУ и OTA из природных вод и красного вина, соответственно, с последующим хроматографическим или флуориметрическим определением;

- расширены возможности иммунофильтрационных мембранных тест-систем в плане одновременного анализа трех микотоксинов (OTA, зеараленона (ЗЕА), фумонизина В1 (ФУМ)) при иммобилизации специфических антител на отдельных зонах мембраны;

- оценена возможность использования иммунофильтрационного тест-метода для определения микотоксинов на двух контрольных уровнях (КУ), показана применимость данного подхода при анализе реальных объектов;

- оптимизированы методики иммунофильтрационного тест-определения микотоксинов, что позволило уменьшить матричный эффект при использовании пероксидазы хрена (ПХ) в качестве ферментной метки;

- разработаны методики тест-определения микотоксинов (OTA, ЗЕА, ФУМ, дезоксиниваленола (ДОН), суммы Т-2- и НТ-2-токсина (Т-2/НТ-2) в пшенице, кукурузе и силосе.

Методы и объекты. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс иммунохимических (иммуноаффинные колонки, иммуно-фильтрационные мембранные тесты) и физико-химических (флуориметрия, спектрофотометрия, ВЭЖХ, ГХ-МС) методов анализа и исследования. Объектами исследования явились следующие вещества: ПАУ - пирен, бенз[а]пирен (БАП); микотоксины - зеараленон, охратоксин А, фумонизин В1, Т-2 и НТ-2 токсины, дезоксиниваленол.

Научная новизна состоит в следующем:

- проведена сравнительная оценка сорбционных свойств золь-гель материалов и сефарозного геля с иммобилизованными антителами, специфичными к ПАУ и OTA;

- показана возможность использования иммуноаффинных колонок на основе золь-гель материалов для выделения и концентрирования ПАУ из водных сред и колонок на основе сефарозного геля для выделения OTA из красного вина;

- разработаны и оптимизированы иммунофильтрационные мембранные тесты для индивидуального определения микотоксинов (ЗЕА, OTA, ФУМ, ДОН, Т-2/НТ-2) и одновременного определения двух-трех аналитов указанного ряда в пшенице, кукурузе, силосе;

- оценена возможность снижения матричного фона при одновременном определении микотоксинов в сложных матрицах (пшеница, кукуруза, силос)

методом иммунофильтрационного анализа с использованием ПХ в качестве ферментной метки путем введения добавок полимеров;

- разработана методика визуального определения микотоксинов на двух контрольных уровнях, позволяющая оценивать степень загрязненности анализируемых образцов выше или ниже установленных количественных пределов.

Практическая значимость работы.

Разработаны тест-методики для индивидуального и одновременного определения нескольких микотоксинов (ЗЕА, OTA, ФУМ, ДОН, Т-2/НТ-2) в пшенице, кукурузе, кормовом силосе, а также методики концентрирования пирена, БАП и OTA из водных сред. Методики могут быть использованы в экологическом контроле, контроле качества пищевых продуктов и кормов. Оптимизированы условия иммобилизации антител в золь-гель материалы на основе тетраметоксисилана (ТМОС). Разработан подход к обнаружению аналитов на нескольких контрольных уровнях с использованием иммунофильтрационных мембранных тест-систем и подход к количественной оценке результатов тестов с использованием офисной техники (компьютер и планшетный сканер).

Положения, выносимые на защиту:

Способы концентрирования пирена, БАП и OTA с использованием иммуноаффинных колонок на основе двух типов сорбентов: золь-гель материала с инкапсулированными антителами и сефарозного геля с ковалентно-связанными антителами.

Подход к одновременному иммунофильтрационному тест-определению аналитов на двух контрольных уровнях, основанный на варьировании концентрации иммобилизованных антител.

Способ снижения матричного фона при использовании пероксидазы хрена в качестве ферментной метки путем введения добавок катионного полиэлектролита.

Оригинальные методики индивидуального и одновременного тест-определения микотоксинов (OTA, ЗЕА, ФУМ, ДОН, Т-2/НТ-2) методом мембранного иммуноферментного анализа в пшенице, кукурузе, силосе.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: IV Всероссийская научно-практическая конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, Россия, 2009); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011» (Москва, Россия, 2011); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, Россия, 2010); Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, Россия, 2009); 1st Int. summer school "Nanomaterials and nanotechnologies in living systems" (Москва, Россия, 2009);

VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009» (Йошкар-Ола, Россия, 2009); Съезд аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, Россия, 2010); IV Международная конференция «Экстракция органических соединений» (ЭОС-2010) (Воронеж, Россия, 2010); VI и VII Всероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2010,

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 18 публикаций, в том числе 3 статьи в международном и российских журналах из списка ВАК, 6 - в сборниках статей, 9 тезисов докладов международных и всероссийских конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего Л5" ссылок, приложения. Работа изложена на -И9 страницах, содержит рисунков и 58 таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проекты №№ 08-03-00725а, 10-03-91168-ГФЕН_а, 11-03-93963-ЮАР_а.

Глава 1. Литературный обзор. Рассмотрено применение иммунохимического взаимодействия антитело-антиген в методах разделения и концентрирования и тест-методах, развиваемых в диссертационной работе. Подробно описаны принципы иммуноаффинной экстракции, аналитические характеристики иммуноаффинных колонок, их преимущества по сравнению с традиционными экстракционными методами, достоинства новых золь-гель материалов, используемых в качестве сорбентов. Уделено внимание иммунофильтрационным мембранным тестам, их возможностям и ограничениям. Рассмотрены существующие подходы и принципы реализации тест-методик, их область применения в анализе реальных объектов.

Глава 2. Экспериментальная часть. В качестве объектов исследования выступили представители групп ПАУ и микотоксинов:

2011).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Пирен

Бенз[а]пирен

Зеараленон

Охратоксин А Фумонизин В1

Токсин R1 R1 R3 R4 R5

Дезоксиниваленол =0 ОН ОН Н ОН

НТ-2 -ОСОСН2СН(СН3)2 н ОАс ОН ОН

Т-2 -ОСОСН2СН(СНз)2 н ОАс ОАс ОН

В работе использовали коммерческие антитела, специфичные к исследуемым токсикантам, и конъюгаты аналитов с ПХ. Конъюгаты аналитов с щелочной фосфатазой (ЩФ) синтезированы в Гентском университете2.

Конструкция колонок для иммуноаффинной экстракции представлена на рис. 1. Между пористыми фильтрами (фритами) в колонку помещали 2 типа материалов: 1) золь-гель сорбент на основе ТМОС с инкапсулированными антителами, специфичными к ПАУ; 2) гель на основе бромцианактивированной сефарозы 4В с ковалентно иммобилизованными антителами, специфичными к OTA. Концентрацию аналитов, элюированных из колонок, определяли методами флуориметрии (флуориметр RF-5301PC, «SHIMADZU», Япония) и ВЭЖХ со спектрофотометрическим и флуориметрическим детекторами (хроматографическая система «Стайер», Аквилон).

Рис. 1. Иммуноаффинная колонка для Рис. 2. Картридж многоразового

концентрирования или детектирования использования для иммунофильтрационного анализируемого компонента анализа

2 Автор выражает благодарность Prof. Sarah De Saeger (Гентский университет, Бельгия) за предоставленные

иммунореагенты для определения микотоксинов и Prof. Dietmar Knopp (Мюнхенский технический университет,

Германия) за предоставленные иммунореагенты для определения полициклических ароматических

углеводородов.

Для тест-определения микотоксинов использовали устройство, показанное на рис. 2. На рабочий участок полимерной нейлоновой мембраны Immunodyne ABC (размер пор 0.45 мкм), размером 7x7 мм наносили 4 пятна вторичных антител (IgG) (по 1,5 мкл). Мембраны сушили 30 мин при 37°С, блокировали 30 мин в 2% растворе казеина в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБ); сушили 45 мин при 37°С. Специфические антитела (разведенные в ФБ, 0,8 мкл) наносили в области иммобилизации IgG и сушили мембраны в течение 10 мин. Мембрану помещали в пластиковый картридж на адсорбент (ватный диск). Анализ включал в себя последовательное пропускание через мембрану экстракта анализируемого образца (600 мкл), конъюгата аналита с ферментом (60 мкл), промывочного раствора (3 раза по 60 мкл ФБ), субстрата (120 мкл). Каждую последующую стадию осуществляли после полного впитывания раствора адсорбентом. Ферментативную реакцию останавливали добавлением бидистиллированной воды (200 мкл).

Кроме визуальной оценки результатов теста проводили цифровую обработку сканированного изображения мембран. Полученные изображения обрабатывали в программе "Adobe Photoshop CS3". Показано, что наибольший отклик на продукты ферментативной реакции дает цветовая модель RGB. В случае применения в качестве фермента ЩФ оптимальной цветовой компонентой является G (зеленый цвет), в случае фермента ПХ - R (красный цвет).

Глава 3. Иммуноаффинное концентрирование ПАУ и охратоксина А.

На первом этапе работы проведено сравнение двух типов сорбентов с иммобилизованными специфичными к пирену и OTA антителами. Долю сорбированного токсиканта рассчитывали на основе площадей хроматографических пиков для растворов до и после колонки. Показано, что в случае пирена более эффективным сорбентом является золь-гель материал (табл. 1), а в случае охратоксина А - гель на основе бромцианактивированной сефарозы, что, вероятно, обусловлено малым размером пор золь-гель материала (средний радиус пор составил 1,6 нм) и затрудненной диффузией молекул OTA. Далее изучали сорбционные характеристики выбранных материалов и оптимизировали условия сорбции токсикантов и их элюирования из колонки.

Концентрирование ПАУ с использованием золь-гель материалов. После промывки колонки ФБ пирен элюировали органическим растворителем, приводящим к разрушению иммунокомплекса антиген-антитело. В качестве возможных элюентов апробированы ацетонитрил (АН) и этанол. Показано, что практически полная десорбция пирена из колонки достигалась при элюировании 2 мл АН, что и использовалось нами в дальнейшем. Использованные колонки регенерировали пропусканием избытка АН и ФБ и повторяли сорбцию. Установлено, что колонки позволяют проводить до 12 циклов сорбция-десорбция без потери сорбционной активности.

Таблица 1

Сорбция пирена сорбентами с иммобилизованными антителами (п=3, Р=0,95)

Масса пирена, введенного в колонку, нг Масса сорбированного пирена, нг Доля сорбированного пирена, %

золь-гель материал сефарозный гель

20 20 ± 1 101 ±3 97 ±3

50 50 ±2 100 ±2 97 ±2

75 75 ± 1 100 ± 1 95 ±2

100 100 ±2 100 ±2 93 ±3

500 492 ±3 98 ± 1 81 ±4

Для оценки неспецифической сорбции пирена на золь-гель сорбенте проводили эксперименты с использованием золь-гель материала, приготовленном по такой же методике, но без введения Ат. Так, при пропускании 250 мл раствора пирена с концентрацией 0,5 нг/мл доля сорбции пирена на колонке с Ат и без Ат составила 96 и 47 % соответственно, что говорит о значительном вкладе иммунохимического взаимодействия в удерживание пирена на сорбенте.

Колонки с золь-гель материалами позволяют концентрировать пирен из растворов, содержащих до 125 нг с высокой степенью извлечения. При этом величина фактора концентрирования пирена из его растворов с концентрацией 0,5 нг/мл достигает 100 (при пропускании 250 мл раствора и его элюировании 2 мл растворителя) при степени извлечения 96 %. После предварительного выделения и концентрирования пирена из анализируемых водных растворов определяли его содержание методом ВЭЖХ или флуориметрии. Метрологические характеристики определения пирена с предварительным концентрированием на иммуноаффинной колонке и без концентрирования представлены в табл. 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики определения пирена в модельных растворах

Метод нгос, нг/мл Про, нг/мл 8Г

Флуориметрия - 5 1,5 0,03

с предварительным концентрированием 0,07 0,02 0,05

ВЭЖХ - 10 3,5 0,02

с предварительным концентрированием 0,1 0,03 0,04

Исследование влияния на сорбцию пирена гомологично сходных с ним веществ (бенз[а]пирен, хризен, фенантрен) показало, что при содержании в растворе 4-8 кратного избытка этих веществ пирен сорбируется практически полностью и степень извлечения Я составляет не менее 96%.

Аналогично получали золь-гель сорбенты, содержащие Ат специфичные к БАП. Доля сорбированного БАП, рассчитанная на основе площадей хроматографических пиков для растворов до и после колонки, представлена в табл. 3. Фактор концентрирования БАП из модельных растворов объемом 250 мл и концентрацией 1,6 нг/мл (элюирование 2 мл АН) составил 98±5.

Разработанные методики концентрирования пирена и БАП апробировали на реальных объектах (табл. 4, 5).

Таблица 3

Сорбция бенз[а]пирена золь-гель сорбентом с иммобилизованными антителами

Масса БАП, введенного в колонку, нг Масса сорбированного БАП, нг Доля сорбированного БАП, %

200 196 ±2 98 ± 1

500 485 ±7 97 ± 1

800 736 ±4 92 ± 1

1000 920 ±7 92 ±2

Таблица 4

Определение пирена в объектах окружающей среды методом ВЭЖХ с предварительным концентрированием на ИАК

Введено (нг/мл) Водопроводная вода Талая вода

Найдено (нг/мл) Открываемость, % Найдено (нг/мл) Открываемость, %

- <0,07 - 0,13 -

0,50 0,55 ± 0,08 110 0,6 ±0,1 120

5,0 4,8 ± 0,6 96 5,2 ± 0,8 104

Таблица 5

Результаты анализа водных объектов на бенз[а]пирен

Объект Найденное содержание, нг/мл

Водопроводная вода Не обнаружено

Волжская вода Не обнаружено

Вода дорожных стоков 0,3 ±0,1

Правильность методики концентрирования ПАУ из водных природных объектов с последующим ВЭЖХ определением подтверждена методом «введено-найдено». Таким образом, стадия иммуноаффинного концентрирования позволила определять пирен в водных растворах на уровне сотых долей нг. ИАК позволяют концентрировать ПАУ и обеспечивать снижение предела обнаружения аналита в десятки раз.

Концентрирование OTA с использованием сефарозного геля. Для концентрирования OTA его водные растворы пропускали через колонку, заполненную сефарозным гелем с ковалентно иммобилизованными специфичными антителами. После промывки колонки ФБ OTA элюировали органическим растворителем. Показано, что оптимальным элюентом является смесь ацетонитрил : уксусная кислота (99:1 об. %), объем элюата - 2,5 мл

(табл. 6), при этом средняя степень извлечения OTA из его растворов, содержащих 2,5-20 нг/мл составила 93 %.

Таблица 6

Сорбция OTA на ИАК с сефарозным гелем при элюировании чистым ацетонитрилом и смесью ацетонитрил : уксусная кислота (99:1)

С, нг/мл (до колонки) Степень извлечения R, %

ацетонитрил ацетонитрил : уксусная кислота (99:1)

2,5 85 + 2 96 + 3

5,0 87 + 4 95+2

10 81 ±3 93 ±4

20 74 + 5 89 + 5

Разработанные колонки применены для извлечения OTA из красного вина. Результаты определения OTA в красном вине при использовании иммуноаффинных колонок и последующего ВЭЖХ-Фл детектирования представлены в табл. 7. Правильность определения подтверждена методом «введено-найдено».

Таблица 7

Оценка правильности методики определения OTA в красном вине с предварительным концентрированием на ИАК с сефарозным гелем {п=3)

Введено, нг/мл Найдено, нг/мл Критерий Стьюдента, табл. Критерий Стьюдента, расч.

1,0 0,94 ± 0,08 4,3 3,2

2,0 2,03 ± 0,07 4,3 1,6

3,5 3,42 ± 0,09 4,3 3,8

Глава 4. Мембранные иммунофильтрационные тесты для одновременного определения зеараленона, охратоксина А, фумонизина В1.

К настоящему времени накоплен опыт создания иммунофильтрационных тест-систем для индивидуального определения целого ряда микотоксинов. В то же время интерес представляет разработка методик их одновременного определения, что связано с вероятным присутствием нескольких микотоксинов в природных матрицах. Широкие возможности с этой точки зрения представляют мембранные иммунофильтрационные тесты, позволяющие иммобилизовать специфические антитела на отдельных зонах мембраны. Принцип действия таких тестов заключается в конкуренции за места связывания специфических Ат между аналитом и его конъюгатом с ферментом. В отсутствии аналита в пробе со специфическими антителами связывается конъюгат, обеспечивая протекание ферментативной реакции после добавления субстрата, приводящее к возникновению окраски. Присутствие аналита в пробе выше определенной концентрации (контрольного уровня, КУ) приводит к отсутствию окраски.

В качестве объектов для исследования возможности одновременного определения нескольких аналитов нами выбраны широко распространенные загрязнители зерновых культур - ЗЕА, OTA и ФУМ. В качестве ферментой метки использовали ЩФ, так как она обеспечивает, как правило, меньший фоновый сигнал.

Разработка методики иммунофильтрационного анализа (ИФА) включала: 1) выбор оптимальных условий приготовления мембран (концентрации вторичных антивидовых антител (IgG) и специфичных к аналиту Ат) и проведения иммуноанализа в модельных растворах (объемов и состава промывочных растворов, концентрации конъюгата аналита с ферментом, цветовой компоненты, времени детектирования окраски); 2) выбор способа пробоподготовки объекта анализа и условий проведения иммуноанализа в реальных объектах.

Выбор оптимальных условий определения микотоксипов в модельных растворах. В иммунофильтрационных тестах поверхность мембран предварительно модифицируют вторичными IgG, что позволяет иммобилизовать первичные (специфичные к аналиту) Ат с определенной ориентацией. Ранее использовали неразбавленные коммерческие препараты IgG, при этом влияние их концентрации на аналитический сигнал не изучалось. Нами оценена возможность уменьшения их концентрации с целью снижения себестоимости анализа. Показано, что при определении ЗЕА и OTA оптимальным является 50-кратное разбавление IgG, которое заметно не влияет на визуальное определение пятен при различных разведениях Ат и конъюгата. Значение цветовой компоненты G, (выбранной как наиболее оптимальной при использовании в качестве фермента ЩФ) незначительно возрастает при увеличении разведения IgG (~ на 10 ед. при уменьшение концентрации в 50 раз) и более чувствительно к разведению специфических антител (возрастание ~ на 30 ед. при уменьшении концентрации в 2,5 раза) и в любом случае значительно ниже порога восприятия окраски 245 ед. Для определения ФУМ разбавление IgG приводило к заметному уменьшению сигнала, поэтому в дальнейшей работе использовали их без разбавления.

Оптимальные разведения антител и конъюгатов выбирали таким образом, чтобы, с одной стороны, при пропускании растворов, не содержащих микотоксинов, наблюдались яркие визуально детектируемые пятна, а с другой стороны, в присутствии микотоксинов на КУ пятна не проявлялись. Влияние концентрации иммунореагентов на примере определения ЗЕА представлено на рис. 3. В качестве оптимальных выбраны разведения анти-ЗЕА Ат 1:1500 и конъюгата ЗЕА-ЩФ 1:5000, которые удовлетворяют ранее приведенным требованиям и обеспечивают наибольшую чувствительность анализа за счет наименьшей концентрации специфических антител. Аналогично выбраны оптимальные концентрации иммунореагентов при определении OTA и ФУМ (табл. 8). При регистрации изменения параметра G от времени после добавления субстрата выбрано оптимальное время детектирования, составившее 6 мин (рис. 4).

240 i" 220 -200 -180 160 140 H I 120 ] \ 100

ja. _

1:250 П1

1:500 □ 2

1:1000 □ 3

1:1500 1:2000 Ш4 H5

1:2500

Разведение Ат

Рис. 3. Влияние разведения анти-ЗЕА Ат и конъюгата ЗЕА-ЩФ на величину параметра в в отсутствие (1-3)и присутствии (4-6) ЗЕА (20 нг/мл) в модельном растворе. Разведение конъюгата ЗЕА-ЩФ: 1:1000(1,4), 1:2000 (2,5), 1:5000(3,6). Время развития окраски 10 мин (п=3)

Рис. 4. Изменение координаты в во времени при определении ЗЕА в модельных растворах (1,2) и экстракте пшеницы (3,4) в отсутствие (1,3) и присутствии (2,4) аналита. Концентрация добавки ЗЕА 10 нг/мл. Разведение анти-ЗЕА Ат и конъюгата ЗЕА-ЩФ 1:1500 и 1:5000 соответственно (п-3)

Выбор оптимальных условий определения микотоксинов в пшенице, кукурузе и силосе. Из искусственно загрязненной пшеницы и кукурузы микотоксины экстрагировали раствором АН/Н20 (70:30) с последующим центрифугированием, фильтрованием и разбавлением ФБ в 3 раза (силос в 4,2 раза). Контрольный уровень выбирали согласно требованиям ИЮПАК, как 50 % от установленного ЕС максимально допустимого содержания микотоксинов в зерновых культурах. Установлено, что оптимальные условия индивидуального определения ЗЕА, OTA и ФУМ в пшенице и кукурузе существенно не отличались от ранее выбранных для модельных смесей. При определении силоса пропускание экстракта приводило к заметному матричному эффекту, что потребовало увеличения концентраций иммунореагентов (табл. 8). В качестве примера на рис. 5 представлен вид мембран при определении микотоксинов в силосе. Т.о., разработанные иммунофильтрационные тесты позволяют определять МТ при совместном присутствии на выбранных контрольных уровнях (табл. 9). Правильность разработанного тест-метода подтверждена методом «введено-найдено», а также методом ВЭЖХ-МС/МС. Результаты определения микотоксинов в образцах контаминированной кукурузы представлены в табл. 10.

С (OTA), мкг/кг: 0 12,5 25

С (ФУМ), мкг/кг: 0 1250 2500

Рис. 5. Вид мембран при определении ЗЕА, OTA и ФУМ в экстракте силоса. Время развития окраски 6 мин

Таблица 8

Оптимальные разведения специфических Ат и конъюгатов (МТ-ЩФ) для детектирования микотоксинов в исследуемых объектах

Микотоксин Модельные растворы Пшеница Кукуруза Силос

Ат МТ-ЩФ Ат МТ-ЩФ Ат МТ-ЩФ Ат МТ-ЩФ

ЗЕА 1:2500 1:5000 1:1500 1:5000 1:2000 1:5000 1:250 1:5000

OTA 1:100 1:500 1:100 1:500 1:150 1:500 1:50 1:500

ФУМ 1:50 1:100 1:40 1:100 1:40 1:100 1:25 1:100

Таблица 9

Контрольные уровни определения микотоксинов в объектах

Микотоксин Модельные растворы, мкг/л Пшеница, мкг/кг (нг/мл) Кукуруза, мкг/кг (нг/мл) Силос, мкг/кг (нг/мл)

ЗЕА 5 50(5) 100(10) 125(10)

OTA 0,25 2,5 (0,25) 2,5 (0,25) 25 (2)

ФУМ 50 500 (50) 500 (50) 2500 (200)

Таблица 10

Результаты определения микотоксинов в образцах кукурузы

Объект ЗЕА OTA Фумонизины Bl, В2, ВЗ

тест-метод вэжх-мс/мс С, мкг/кг тест-метод вэжх-мс/мс С, мкг/кг тест-метод вэжх-мс/мс С, мкг/кг

№ 1 н.о. .... н.о. ---- н.о.

№2 н.о. + + + + 11 ± 1 ± ± ± - В1 (3,1 ±0,3)-102 В2 93 ± 7

№3 ---- н.о. ---- н.о. .... В1 33 ±4

№4 + + + + (1,7 ± 0,5)-102 ---- н.о. + + + + В1 (7,4 ± 0,9)-102 В2 (2,5 ± 0,2)-102 ВЗ 52 ± 8

(-) - отрицательный результат - развитие интенсивной пурпурной окраски пятна на мембране при концентрации микотоксина < 100 (ЗЕА); 2,5 (OTA); 500 (ФУМ) мкг/кг; (±) - отрицательный результат - развитие малоинтенсивной пурпурной окраски пятна на мембране при концентрации микотоксина < 100 (ЗЕА); 2,5 (OTA); 500 (ФУМ) мкг/кг; (+) - положительный результат - отсутствие пурпурной окраски пятна на мембране при концентрации микотоксинов > 100 (ЗЕА); 2,5 (OTA); 500 (ФУМ) мкг/кг. н.о. - микотоксин не обнаружен.

Рассчитанные в соответствии с рекомендациями ИЮПАК аналитические характеристики разработанных тест-систем приведены в табл. 11. Согласно рекомендациям ИЮПАК, метод может быть рекомендован для скрининга, т.к. правильность (отношение суммарного количества правильных результатов к общему числу анализов) составляет более 95 % и процент ложно-отрицательных результатов не превышает 5%.

Таблица 11

Аналитические характеристики одновременного тест-определения ЗЕА, OTA и ФУМ в образцах искусственно загрязненной пшеницы и кукурузы

Пшеница

Параметр ЗЕА OTA ФУМ

Введено микотоксина, нг/мл <5 >5 <0,25 >0,25 <50 >50

Число положительных результатов (М10Лож.) 1 43 2 43 2 44

Число отрицательных результатов (Млриц.) 39 2 38 2 38 1

Общее число образцов (/V) 40 45 40 45 40 45

Процент ложноположительных результатов 2,5 5 5

Процент ложноотрицательных результатов 4,4 4,4 2,3

Правильность, % 96,5 95,3 96,5

Специфичность, % 97,5 95,0 95,0

Чувствительность, % 95,6 95,6 97,7

Куку руза

Введено микотоксина, нг/мл < 10 > 10 <0,25 >0,25 <50 >50

Число положительных результатов (Мполож) 1 34 1 34 0 35

Число отрицательных результатов (Л^триц.) 23 2 23 2 24 1

Общее число образцов (А/) 24 36 24 36 24 36

Процент ложноположительных результатов 4,2 4,2 0

Процент ложноотрицательных результатов 5,0 5,0 2,8

Правильность, % 95,0 95,0 98,3

Специфичность, % 95,8 95,8 100

Чувствительность, % 94,4 94,4 97,2

Определение микотоксинов на двух контрольных уровнях иммунофильтрационным мембранным тест-методом. Предложен подход к тест-определению микотоксинов на двух концентрационных контрольных уровнях, основанный на варьировании разведения специфических Ат, иммобилизуемых на различных зонах мембраны. Подход апробирован при определении ЗЕА и OTA в модельных растворах и экстрактах пшеницы и кукурузы. В качестве контрольных уровней выбраны концентрации, соответствующие Vi и 2 ПДК для каждого из аналитов. Присутствие микотоксина в пробе выше 2 ПДК приводит к подавлению окраски обоих пятен с различной концентрацией антител, присутствие микотоксина в пробе в концентрации между Vi и 2 ПДК приводит к подавлению только одного из пятен. Таким образом, при использовании таких тест-систем потребитель может судить о степени загрязненности объекта анализа микотоксином. Кроме того, такой подход повышает надежность обнаружения токсиканта в пробе.

Подобраны оптимальные разведения антител для полного подавления окраски пятна при соответствующей концентрации микотоксина, время детектирования окраски на модельных системах и в объектах для каждого МТ (ЗЕА, OTA), а также для их смеси (рис. 6, табл. 12).

А Б В Г

Рис. 6. Расположение зон иммобилизации антител, специфичных к соответствующему

аналиту (А) и вид мембран при одновременном определении ЗЕА и OTA на двух контрольных уровнях в экстракте пшеницы; концентрации ЗЕА и OTA: 0; 0 нг/мл (Б), 5; 0,25 нг/мл (В), 20; 1 (Г) нг/мл, соответственно

Таблица 12

Оптимальные параметры определения микотоксинов на двух контрольных уровнях в пшенице и кукурузе

Параметр Пшеница Кукуруза

ЗЕА | OTA ЗЕА [ OTA

Разведение ДО 1:50

Разведение Ат для определения микотоксинов на уровнях 2 ПДК / Уг ПДК 1:50/ 1:1500 1:25/1:100 1:50/ 1:2000 1:25/1:150

Разведение конъюгата МТ-ЩФ 1:5000 1:500 1:5000 1:500

Время развития окраски 6 мин

Правильность предложенного подхода и результатов тест-определения подтверждена методом добавок (рис. 7) и независимым методом (ВЭЖХ-МС/МС). Данный подход может быть расширен в плане повышения количества контрольных уровней и их различного выбора.

G ,________

Рис. 7. Результаты определения ЗЕА и OTA в экстрактах незагрязненной (объект 1), искусственно загрязненной (объекты 2, 3) и естественно загрязненной кукурузы (объекты 4, 5). Концентрации ЗЕА и OTA составляют 0 и 0 (1), 10 и 0,25 (2), 40 и 1 (3), 19 и 0 (4), 0 и 1,2 (5) нг/мл соответственно. (п=3)

я Анти-ЗЕА1:50 □ Анти-ЗНА 1:2000 И Анта-ОТА 1:25 ПАнти-ОТА 1:150

Глава 5. Снижение фонового сигнала в иммунофильтрационных тестах при использовании в качестве фермента пероксидазы хрена.

Традиционно в качестве ферментной метки в иммунофильтрационных тестах применяют пероксидазу хрена. Это обусловлено ее коммерческой доступностью, относительной дешевизной и стабильностью. Однако при анализе сложных матриц (кукуруза, корма, перец, какао и т.д.) ее использование ограничено значительным матричным фоном. Причиной этого эффекта может являться адсорбция экстрагируемых из образца веществ белковой природы на поверхности мембраны, что приводит к неспецифическому окислению субстрата и возникновению окраски по всей площади рабочей зоны мембраны. В связи с этим, поиск путей снижения матричного фона образца в мембранном ИФА при использовании ПХ в качестве метки является актуальной задачей. С этой целью, как правило, проводят дополнительную стадию очистки экстракта, что существенно усложняет процедуру анализа. В данной работе исследована возможность снижения фонового сигнала путем варьирования состава и объема промывочных растворов, а также использования добавок полимеров различной природы при проведении ферментативной реакции. Исследования проводили на примере тест-определения микотоксинов трихотеценовой группы (ДОН, Т-2/НТ-2), являющихся широко распространенными природными загрязнителями зерновых культур и кормов для животных.

Предварительно подбирали оптимальные условия (концентрации иммунореагентов, цветовую компоненту, время детектирования окраски) индивидуального и одновременного определения ДОН и НТ-2 в модельных системах. Установлено, что наиболее чувствительной цветовой компонентой для тест-систем с использованием ПХ-метки является К (красный цвет). Результаты определения ДОН и НТ-2 токсина в модельных растворах при выбранных оптимальных условиях (табл. 13), представлены на рис. 8 и показывают принципиальную возможность одновременного определения аналитов иммунофильтрационным мембранным тест-методом.

Оптимизация методики пробоподготовки пшеницы, кукурузы и силоса. Установлено, что использование описанных в литературе методик пробоподготовки (экстракция ФБ и АН/Н20, 40/60 об.%) приводит к высокому матричному фону (окрашиванию всей рабочей зоны мембраны) и не позволяет детектировать аналитический сигнал при анализе кукурузы и силоса, а также снижает воспроизводимость при анализе пшеницы. Отмечено, что разбавление полученного водно-органического экстракта пшеницы и кукурузы в 10 раз, силоса - в 17 раз, а также последующее фильтрование приводят только к незначительному снижению фонового сигнала. Дополнительное центрифугирование экстракта также не дает положительного результата и не является целесообразным.

Онг/мл 12,5 нг/мл ДОН 25 нг/мл ДОН 1 нг/мл НГ-2 2 нг/мл НГ-2 12,5 нг/мл ДОН + 1 нг/мл НТ-2 25 нг/мл ДОН + 2 нг/мл НГ-2

а)

С (ДОН/НТ-2),

О/О 12,5/0 25/0 0/1 0/2 12,5/1 25/2 „г/мл ■ анти-ДОН 1:1200 П анти-ДОН 1:1300 §3 анти-НТ-2 1:1800 И анти-НТ-2 1:1900

Рис. 8. Результаты одновременного определения НТ-2 и ДОН в модельных системах: а) вид мембран при различной концентрации токсинов в анализируемом растворе; б) изменение параметра Я. Для НТ-2 и ДОН разбавление 1:0 и 1:50 соответственно. Время развития

окраски 4 мин (п=4)

Изучение влияния состава промывочных растворов на результаты тест-определения показало, что растворы казеина (0,1-0,5%) в ФБ, обладающие блокирующим действием, незначительно снижают матричный фон лишь в начальный момент времени.

Согласно данным литературы3 добавки полимеров улучшают аналитические характеристики иммунохимических систем на основе ПХ. Нами изучено влияние добавок полимеров катионной (полиэтиленполиамины (ПЭПА), хитозан 87 кДа и 200 кДа), анионной (карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), декстран сульфат (ДС)) и неионогенной (полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ)) природы в диапазоне концентраций (0,05-1%) на развитие фонового сигнала. При проведении анализа через мембрану пропускали экстракты пшеницы, кукурузы и силоса, мембрану промывали ФБ, а затем пропускали раствор полимера и субстрата (последовательное пропускание) или добавляли полимер одновременно с субстратом. Установлено, что добавки растворов КМЦ, ДС и ПЭГ 6000 не дают положительных результатов. В то же время использование хитозана различной степени полимеризации и ПЭПА позволяет снизить матричный фон как при последовательном, так и при одновременном

3 Веселова И.А., Кирейко А.В., Шеховцова Т.Н. // Прикл. биохим. и микробиол. 2009. Т. 45. № 2. С. 143-148.

пропускании с субстратом (пример вида мембран представлен на рис. 9). Наибольшее снижение фонового сигнала наблюдалось при применении растворов ПЭПА 0,5% (пшеница), 1% (кукуруза) и 0,1% (силос), что использовано в дальнейшей работе. Значения параметра R фона лежат в пределах 235±5 ед. (окраска визуально не детектируется), что позволяет наблюдать четкие пятна в отсутствии микотоксинов в пробе.

Рис. 9. Влияние добавок ПЭПА на вид мембран при определении НТ-2 токсина в экстракте кукурузы (разбавленном в 10 раз и фильтрованном). Раствор ПЭПА пропущен перед субстратом, время развития окраски 7 мин.

Положительное действие полиэлектролитов катионной природы (ПЭПА и хитозана), вероятно, объясняется тем, что они способны образовывать полиэлектролитные комплексы с веществами белковой и углеводной природы, адсорбированными на поверхности мембран и преимущественно отрицательно заряженными при данных экспериментальных условиях.

Выбранные условия пробоподготовки и уменьшения фонового сигнала применены для определения ДОН и Т-2/НТ-2 в образцах пшеницы и кукурузы, КУ определения аналитов представлены в табл. 13 и соответствуют требованиям ЕС и РФ к содержанию микотоксинов в продуктах и кормах. Разработанные методики применяли для анализа контаминированных и искусственно загрязненных образцов пшеницы, кукурузы, силоса. Правильность определения ДОН и суммы Т-2/НТ-2 подтверждены независимым методом ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием и методом добавок. Примеры результатов тест-определения представлены на рис. 10 и в табл. 14. Таким образом, предложенный подход позволил разработать иммунофильтрационные тесты с ПХ в качестве ферментной метки для определения микотоксинов в сложных матрицах.

Таблица 13

Оптимальные условия определении ДОН и суммы НТ-2 и Т-2 в зерновых культурах и силосе методом иммунофильтрационного тест-анализа

Параметр Модельные растворы Пшеница, кукуруза Силос

Т-2/НТ-2 ДОН Т-2/НТ-2 ДОН Т-2/НТ-2 ДОН

Разведение антител 1:1800 1:1200 1:1800 1:1200 1:1200 1:1000

Разведение конъюгатов 1:4000 1:700 1:4000 1:700 1:4000 1:700

Концентрация ПЭПА, % 0 0,5-1 0,1

Контрольный уровень, мкг/кг (нг/мл) (2) (25) 100(2) 1250 (25) 500(10) 1000 (20)

Без добавки ПЭПА 0,5 % ПЭПА 1 %

А_ Б В Г__Д__Е

•нт»-ДОИ Ат (1:1000*) (1:10ТО )

{^1:1200)

С дон, нг/мл: 0 10 20 0 20

СНт-2, нг/мл: 0 5 0 10 10

Рис. 10. Вид мембран при анализе экстракта силоса с введенными добавками микотоксинов (Б - Е), А - расположение зон антител на мембране и их разведение

Таблица 14

Результаты определения микотоксинов в контаминированных образцах кукурузы

Объект ДОН Т-2/НТ-2

Тест-метод вэжх-мс/мс, С, мкг/кг Тест-метод ВЭЖХ-МС/МС, С, мкг/кг

№ 1 ± ± ± ± - - (8±2)102 НТ-2 20 ±8

№2 0 ++++++ НТ-2 9 ± 3 Т-2 (1,5 ± 0,6)Ю2

№3 (1,4 ± 0,4)-102 ++++++ НТ-2 (1,5 ± 0,6)102 Т-2 (1,5 ± 0,5)-102

№4 ± ± - - - ± (7±2)-102 0

(-) - отрицательный результат - развитие интенсивной голубой окраски пятна на мембране при концентрации микотоксина < 1250 (ДОН); 100 (суммы НТ-2 и Т-2) мкг/кг;

(±) - отрицательный результат - развитие малоинтенсивной голубой окраски пятна на мембране при концентрации микотоксина < 1250 (ДОН); 100 (суммы НТ-2 и Т-2) мкг/кг; (+) - положительный результат - отсутствие голубой окраски пятна на мембране при концентрации микотоксинов > 1250 (ДОН); 100 (суммы НТ-2 и Т-2), мкг/кг.

ВЫВОДЫ:

1. Предложены новые варианты использования взаимодействия «антиген-антитело» в иммуноаффинных колонках для концентрирования и иммунофильтрационных мембранных тестах для экспрессного определения некоторых представителей полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов.

2. Получены иммуносорбенты на основе двух типов материалов (золь-гель сорбенты на основе тетраметоксисилана с инкапсулированными антителами и сефарозный гель с ковалентно-связанными антителами) для выделения и концентрирования пирена, бенз[а]пирена и охратоксина А из жидких сред. При выбранных оптимальных сорбентах и условиях сорбции степень извлечения указанных токсикантов составила не менее 92 %. Разработанные иммуноаффинные колонки применены при определении указанных ПАУ в объектах окружающей среды (образцы природных вод и ливневых стоков) и охратоксина А в красном вине.

3. Разработаны методики одновременного тест-определения микотоксинов -охратоксина А, зеараленона и фумонизина В1 - методом мембранного иммунофильтрационного анализа с использованием щелочной фосфатазы в качестве ферментной метки. Оптимизирована процедура приготовления мембран и выбраны условия определения микотоксинов в модельных смесях, экстрактах пшеницы, кукурузы и силоса. Контрольные уровни обнаружения ЗЕА, OTA и ФУМ в пшенице составили 50; 2,5 и 500 мкг/кг, соответственно, в кукурузе 100; 2,5 и 500 мкг/кг, и в силосе 125; 25 и 1250 мкг/кг. Методики отличаются экспрессностью (25 мин для 10 образцов), простотой процедуры пробоподготовки и выполнения анализа, возможностью внелабораторного использования.

4. Предложен подход к одновременному определению микотоксинов на двух контрольных уровнях, основанный на варьировании концентрации иммобилизованных на мембране специфичных антител. Подход применен для определения охратоксина и зеараленона в образцах пшеницы и кукурузы на уровнях VS и 2 ПДК.

5. Установлена возможность снижения матричного фона в иммунофильтрационных тестах при использовании в качестве метки традиционного фермента - пероксидазы хрена - путем введения добавок катионных полиэлектролитов. Наибольший эффект при определении микотоксинов в экстрактах пшеницы, кукурузы и силоса достигается при использовании растворов полиэтиленполиаминов при концентрации 0,5 %, 1% и 0,1 % соответственно.

6. Разработаны методики иммунофильтрационного индивидуального и одновременного тест-определения ДОН и суммы Т-2/НТ-2 токсинов (фермент -пероксидаза хрена) в экстрактах пшеницы, кукурузы (силоса) на контрольных уровнях 25 (20) нг/мл и 2 (10) нг/мл, соответственно. Методики апробированы при анализе искусственно и природно-загрязненных образцов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Русанова Т.Ю., Левина H.A., Юрасов H.A., Горячева И.Ю. Нанопористые золь-гель материалы с иммобилизованными антителами для иммуноаффинного концентрирования пирена // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9, вып. 3. С. 391-398.

2. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Rusanova T.Yu., Yurasov N.A., Galve R., Marco M.-P., De Saeger S. Gel-based immunotest for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol and ochratoxin A in red wine II Anal. Chim. Acta. 2010. Vol. 672. P. 3-8.

3. Юрасов H.A., Бурмистрова H.A., Русанова Т.Ю. Одновременное определение зеараленона и охратоксина А в пшенице иммунофильтрационным тест-методом // Известия Саратовского университета. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2011. Вып. 2. С. 13-18.

4. Горячева И.Ю., Русанова Т.Ю., Басова Е.Ю., Юрасов H.A. Новые тест-системы для контроля содержания микотоксинов в продуктах растительного

происхождения // Матер. IV Всеросс. конф. "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», Барнаул, 2009. Кн. 2. С. 138139.

5. Левина H.A., Юрасов H.A., Русанова Т.Ю. Флуориметрическое определение пирена с предварительным иммуноаффинным концентрированием // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сборник науч. трудов VII Всеросс. конф. молодых ученых с межд. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК», 2010. С. 178-180.

6. Малышева И.В., Буланова Т.Ю., Юрасов H.A. Определение дезоксиниваленола и НТ-2 токсина в пшенице и кукурузе иммуно фильтрационным тест-методом // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сборник науч. трудов VIII Всерос. конф. молодых ученых с межд. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2011. С. 121-123.

7. Юрасов H.A., Бурмистрова H.A., Русанова Т.Ю. Новый подход для полуколичественного определения микотоксинов иммунохимическим тест-методом // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сборник науч. трудов VIII Всерос. конф. молодых ученых с межд. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2011. С. 153-155.

8. Потанина С.Г., Юрасов H.A., Русанова Т.Ю., Горячева И.Ю. Флуориметрическое определение охратоксина А с предварительным иммуноаффинным концентрированием // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: межвуз. сборник науч. трудов VIII Всерос. конф. молодых ученых с межд. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2011. С. 177-179.

9. Юрасов H.A., Потанина С.Г., Русанова Т.Ю. Иммуноаффинное концентрирование и флуориметрическое определение охратоксина А // XIII межд. научная конф. «Физико-химические основы ионообменных и хроматографических процессов (ИОНИТЫ-2011), Воронеж, 16-22 октября 2011. Изд-во «Научная книга». С. 433-435.

Ю.Русанова Т.Ю., Юрасов H.A., Гришанина Е.В. Технология Ленгмюра-Блоджетт в пьезоэлектрических иммуносенсорах // Всероссийская школа-конференция «Супрамолекулярные системы на поверхности раздела», поев. 175-летию со дня рождения Д.И.Менделеева, 25-27 мая 2009 г., Москва. С. 78.

11.Levina N., Rusanova Т., Yurasov N., Goryacheva I. Nanostructured sol-gel materials with immobilized antybodies for immunoaffinity preconcentration of trace organic contaminants // 1st Int. summer school "Nanomaterials and nanotechnologies in living systems", June 29 - July 4, Moscow, 2009. P. 271-273.

12.Русанова Т.Ю., Таранов B.A., Юрасов H.A., Штыков C.H., Горячева И.Ю. Определение пирена в водных средах методом пьезокварцевого микровзвешивания // VII Всеросс. конф. по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009», 21-27 июня 2009 г.: тезисы докладов. Map. гос. ун-т., Йошкар-Ола, 2009. С. 185-186.

13.Юрасов H.A., Левина H.A., Русанова Т.Ю. Иммуноаффинные колонки для концентрирования пирена из водных растворов // Всеросс. молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. С. 92.

М.Юрасов H.A., Русанова Т.Ю. Иммунофильтрационный тест-метод определения Охратоксина А в кормах для животных // Всеросс. молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. С. 93.

15.Русанова Т.Ю., Горячева И.Ю., Левина H.A., Юрасов H.A. Флуориметрическое определение пирена с предварительным иммуноаффинным концентрированием на золь-гель сорбентах // Съезд аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности», 26-30 апреля 2010 г.: тезисы докладов. М., 2010. С. 248-249.

16.Юрасов H.A., Русанова Т.Ю., Горячева И.Ю. Масс-спектрометрическое определение 2,4,6-трихлорфенола в красном вине II Тезисы докладов Всеросс. конф. «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». Краснодар, 26 сентября - 01 октября 2010 г. Краснодар, 2010. С. 153.

17.Русанова Т.Ю., Левина H.A., Юрасов H.A., Горячева И.Ю. Твердофазная экстракция полициклических ароматических углеводородов золь-гель материалами с иммобилизованными антителами // Тезисы докладов IV межд. конф. «Экстракция органических соединений» (ЭОС-2010). Воронеж, сентябрь 2010 г. С. 105.

18.Буланова Т.Ю., Малышева И.В., Юрасов H.A. Иммунофильтрационные мембранные тесты для определения микотоксинов // Материалы межд. молодежного форума «Ломоносов-2011». Секция «Химия», 11-15 апреля 2011 г., Москва, 2011.С. 80.

Подписано в печать 26.10.2011. Формат 60x84 VI6. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Объем 1.5 печ. л. Тираж 120 экз. Заказ № 227-Т

Типография С ГУ г. Саратов, ул. Б. Казачья 112а тел.: (845-2) 27-33-85

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Юрасов, Николай Александрович

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ .ОБЗОР. ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В МЕТОДАХ РАЗДЕЛЕНИЯ И

ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1.1. Иммуноаффинное концентрирование ПАУ и микотоксинов.

1.1.1. Устройство и принцип работы иммуноаффинной колонки.

1.1.2. Аналитические характеристики иммуноаффинных колонок.

1.1.3. Применение золь-гель технологии в создании сорбентов для иммуноаффинных колонок.

1.2. Иммунофильтрационные тесты.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Вещества и материалы.

2.2. Конструкция и характеристики иммуноаффинной колонки.

2.3. Конструкция иммунофильтрационного теста.

2.4. Оборудование и методика измерений.

2.5. Расчет аналитических характеристик тест-метода.

ГЛАВА 3. ИММУНОАФФИННОЕ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ПАУ И ОХРАТОКСИНА А.

3.1. Иммуноаффинное концентрирование ПАУ.

3.1.1. Сравнение сорбционных свойств золь-гель материала и сефарозного геля.

3.1.2. Изучение сорбционных свойств золь-гель материала, содержащего антитела, специфичные к пирену.

3.1.3. Изучение селективности золь-гель сорбента по отношению к другим ПАУ.

3.1.4. Получение золь-гель материала с иммобилизованными антителами на бенз[а]пирен и изучение его сорбционных свойств.

3.1.5. Применение полученных золь-гель колонок при определении ПАУ в природных объектах.

3.2. Иммуноаффинное концентрирование охратоксина А.

3.2.1. Золь-гель сорбенты для иммуноаффинного концентрирования охратоксина А.

3.2.2. Сефарозный гель для иммуноаффинного концентрирования охратоксина А.

ГЛАВА 4. МЕМБРАННЫЕ ИММУНОФИЛЬТРАЦИОННЫЕ ТЕСТЫ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗЕАРАЛЕНОНА, ОХРАТОКСИНА А, ФУМОНИЗИНА В1.

4.1. Выбор оптимальных условий индивидуального определения микотоксинов в модельных растворах.

4.1.1. Оптимизация условий определения зеараленона.

4.1.2. Оптимизация условий определения охратоксина А.

4.1.3. Оптимизация условий определения фумонизина В1.

4.2. Одновременное определение ЗЕА и OTA в модельных растворах.

4.3. Оптимизация условий определения микотоксинов в пшенице.

4.4. Оптимизация условий определения микотоксинов в кукурузе.

4.5. Одновременное определение ЗЕА, OTA и ФУМ в модельных растворах, пшенице и кукурузе.

4.6. Новый подход к определению микотоксинов иммунохимическим мембранным тест-методом на двух контрольных уровнях.

4.7. Определение микотоксинов в кормовом силосе.

ГЛАВА 5. СНИЖЕНИЕ ФОНОВОГО СИГНАЛА В ИММУНОФИЛЬТРАЦИОННЫХ ТЕСТАХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

В КАЧЕСТВЕ ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.

5.1. Выбор оптимальных условий тест-определения ДОН и НТ-2 токсина в модельных системах.

5.1.1. Оптимизация условий определения НТ-2 токсина.

5.1.2. Оптимизация условий определения ДОН.

5.2. Одновременное определение ДОН и НТ-2 в модельных растворах.

5.3. Выбор оптимальных условий иммунофильтрационного определения микотоксинов в пшенице и кукурузе.

5.3.1. Оптимизация методики пробоподготовки пшеницы и кукурузы.

5.3.2. Влияние процедуры анализа на определение токсикантов.

5.4. Одновременное определение ДОН и суммы Т-2 и НТ-2 токсинов в пшенице и кукурузе.

5.5. Определение ДОН и суммы Т-2 и НТ-2 токсинов в кормовом силосе.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Иммуноаффинное концентрирование и тест-определение некоторых полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов"

Актуальность темы.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и микотоксины относятся к высокотоксичным и широко распространенным загрязнителям, которые содержатся в объектах окружающей среды и пищевых продуктах в следовых количествах. Чаще всего для их определения используют дорогостоящие и трудоемкие хроматографические методы анализа. В то же время актуальной является разработка доступных потребителю экспрессных методов их определения, а также способов выделения и концентрирования указанных токсикантов из объектов сложной природы. Все большую популярность в аналитической практике приобретают иммуноаффинные колонки для концентрирования токсикантов и иммунотесты для их обнаружения, основанные на специфическом взаимодействии антиген-антитело, построенном на принципе биологического распознавания. Одной из тенденций развития иммуноаффинного концентрирования является использование золь-гель технологии при иммобилизации иммунореагентов, позволяющей регулировать размер пор полимерной сетки и обеспечивать защитное окружение для биомолекул. Однако в литературе описаны лишь единичные примеры применения золь-гель материалов в качестве иммуноаффинных сорбентов и отсутствуют сведения о сравнении различных подходов к иммобилизации антител при концентрировании аналитов. Применение иммуно фильтрационных тестов ограничено высоким матричным фоном для сложных объектов анализа и, как правило, определением индивидуальных токсикантов. Таким образом, изучение и применение в иммуноаффинном концентрировании , новых материалов с иммобилизованными антителами, поиск подходов к снижению фонового сигнала и одновременному определению нескольких аналитов с использованием иммунофильтрационных тестов является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка и оптимизация простых, экспрессных иммунохимических методик концентрирования и тест-определения представителей полициклических ароматических углеводородов и микотоксинов.

Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

- изучены сорбционные свойства иммуносорбентов на основе золь-гель материала с инкапсулированными антителами и сефарозного геля с ковалентно-связанными Ат специфичными к ПАУ и охратоксину A (OTA);

- оценена возможность использования иммунофильтрационного тест-метода для определения микотоксинов на двух контрольных уровнях, показана применимость данного подхода при анализе реальных объектов;

Методы и объекты. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс иммунохимических (иммуноаффинные колонки, иммуно-фильтрационные мембранные тесты) и физико-химических (флуориметрия, спектрофотометрия, ВЭЖХ, ГХ-МС) методов анализа и исследования. Объектами исследования явились следующие вещества: ПАУ - пирен, бенз[а]пирен (БАЛ); микотоксины - зеараленон, охратоксин А, фумонизин В1, Т-2 и НТ-2 токсины, дезоксиниваленол.

Научная новизна состоит в следующем:

- оценена возможность снижения матричного фона при одновременном определении микотоксинов в сложных матрицах (пшеница, кукуруза, силос) методом иммунофильтрационного анализа с использованием ПХ в качестве ферментной метки путем введения добавок полимеров;

Практическая значимость работы. Разработаны тест-методики для индивидуального и одновременного определения нескольких микотоксинов (ЗЕА, OTA, ФУМ, ДОН, Т-2/НТ-2) в пшенице, кукурузе, кормовом силосе, а также методики концентрирования пирена, БАП и OTA из водных сред. Методики могут быть использованы в экологическом контроле, контроле качества пищевых продуктов и кормов. Оптимизированы условия иммобилизации антител в золь-гель материалы на основе тетраметоксисилана. Разработан подход к обнаружению аналитов на нескольких контрольных уровнях с использованием иммунофильтрационных мембранных тест-систем и подход к количественной оценке результатов тестов с использованием офисной техники (компьютер и планшетный сканер).

Положения, выносимые на защиту:

Подход к одновременному имму но фильтрационному тест-определению аналитов на двух контрольных уровнях, основанный на варьировании концентрации иммобилизованных антител.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: IV Всероссийская научнопрактическая конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, Россия, 2009); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011» (Москва, Россия, 2011); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, Россия, 2010); Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, Россия, 2009); 1st Int. summer school "Nanomaterials and nanotechnologies in living systems" (Москва, Россия, 2009); VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009» (Йошкар-Ола, Россия, 2009); Съезд аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, Россия, 2010); IV Международная конференция «Экстракция органических соединений» (ЭОС-2010) (Воронеж, Россия, 2010); VI и VII Всероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2010, 2011).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 178 ссылок, приложения. Работа изложена на 179 страницах, содержит 78 рисунков и 58 таблиц.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

ВЫВОДЫ:

2. Получены иммуносорбенты на основе двух типов материалов (золь-гель сорбенты на основе тетраметоксисилана с инкапсулированными антителами и сефарозный гель с ковалентно-связанными антителами) для выделения и концентрирования пирена, бенз[а]пирена и охратоксина А из жидких сред. При выбранных оптимальных сорбентах и условиях сорбции степень извлечения указанных токсикантов составила, не менее 92 %. Разработанные иммуноаффинные колонки применены при определении указанных ПАУ в объектах окружающей среды (образцы природных вод и ливневых стоков) и охратоксина А в красном вине.

3. Разработаны методики одновременного тест-определения микотоксинов - охратоксина А, зеараленона и фумонизина В1 — методом мембранного иммунофильтрационного анализа с использованием щелочной фосфатазы в качестве ферментной метки. Оптимизирована процедура приготовления мембран и выбраны условия определения микотоксинов в модельных смесях, экстрактах пшеницы, кукурузы и силоса. Контрольные уровни обнаружения ЗЕА, OTA и ФУМ в пшенице составили 50; 2,5 и 500 мкг/кг, соответственно, в кукурузе 100; 2,5 и 500 мкг/кг, и в силосе 125; 25 и 1250 мкг/кг. Методики отличаются экспрессностыо (25 мин для 10 образцов), простотой процедуры пробоподготовки и выполнения анализа, возможностью внелабораторного использования.

6. Разработаны методики иммунофильтрационного индивидуального и одновременного тест-определения ДОН и суммы Т-2/НТ-2 токсинов (фермент - пероксидаза хрена) в экстрактах пшеницы, кукурузы (силоса) на контрольных уровнях 25 (20) нг/мл и 2 (10) нг/мл, соответственно. Методики апробированы при анализе искусственно и природно-загрязненных образцов.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Юрасов, Николай Александрович, Саратов

1. Senyuva H.Z., Gilbert J. Immunoaffinity column clean-up techniques in food analysis: a review // J. of Chromatography B. 2010. Vol. 878, P. 115-132.

2. МУК 4.1.2204—07. Методические указания «Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии».

3. Zhong Y.B., Zhang L.J., Zhang Н.С., Liu J.X., Wang J.P. Immunoaffinity-based solid phase extraction for the determination of melamine in animal-derived foods followed by LC // Chromatographia. 2011. Vol. 73. P. 1211-1215.

4. Rahmani A., Jinap S., Soleimany F., Khatib A., Tan C.P. Sample preparation optimization for the simultaneous determination of mycotoxins in cereals // Eur. Food Res. Technol. 2011. Vol. 232. P. 723-735.

5. Li B., Li C., Jiang H., Wang Z., Cao X., Zhao S., Zhang S., Shen J. Purification of nine sulfonamides from chicken tissues by immunoaffinity chromatography using two monoclonal antibodies //J. AO AC Int. 2008. Vol. 91, № 6. P. 1488-1493.

6. Klinglmayr C., Nobauer K., Razzazi-Fazeli E., Cichna-Markl M. Determination of deoxynivalenol in organic and conventional food and feed by sol-gel immunoaffinity chromatography and HPLC-UV detection// J. Chromatogr. B. 2010. Vol. 878. P. 187-193.

7. Li Y., Wang Y., Yang H., Gao Y., Zhao H., Deng A. Establishment of an immunoaffinity chromatography for simultaneously selective extraction of Sudan I, II, III and IV from food samples // J. Chromatogr. A. 2010. Vol. 1217. P. 7840-7847.

8. Wang Y., Xu Y., Zhang X., Wang E., Dong Y. Preparation of an immunoaffinity column and its application in sample cleanup for methandrostenolone residues detection // J. Chromatogr. B. 2011. Vol. 879. P. 2149-2154.

9. Reiter E.V., Cichna-Mark M., Chung D.-H., Zentek J., Razzazi-Fazeli E. Immuno-ultrafiltration as a new strategy in sample clean-up of aflatoxins // J. Sep. Sci. 2009. Vol. 32. P. 1729-1739.

10. Chen H.-X., Huang T., Zhang X.-X. Immunoaffinity extraction of testosterone by antibody immobilized monolithic capillary with on-line laser-induced fluorescence detection // Talanta. 2009. Vol. 78. P. 259-264.

11. Qiao Y., Yang H., Wang B., Song J., Deng A. Preparation and characterization of an immunoaffinity chromatography column for the selective extraction of trace contraceptive drug levonorgestrel from water samples // Talanta. 2009. Vol. 80. P. 98-103.

12. Qiu S., Xu L., Cui Y.-R., Deng Q.-P., Wang W., Chen H.-X., Zhang X.-X. Pseudo-homogeneous immunoextraction of epitestosterone from human urine samples based on gold-coated magnetic nanoparticles // Talanta. 2010. Vol. 81. P. 819-823.

13. Zhang S., Wang J., Li D., Huang J., Yang H., Deng A. A novel antibody immobilization and its application in immunoaffinity chromatography // Talanta. 2010. Vol. 82. P. 704-709.

14. Аффинная хроматография. Методы: Пер. с англ./Под ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла. М.: Мир. 1988. - 278 с.

15. Chapuis-Hugon F., du Boisbaudry A., Madru В., Pichon V. New extraction sorbent based on aptamers for the determination of ochratoxin A in red wine // Anal. Bioanal. Chem. 2011. Vol. 400. P. 1199-1207.

16. Vukovic G.L., Pavlovic S.D., Ristic M.S. Comparison of two sample preparation procedures for HPLC determination of ochratoxin A // Arch. Biol. Sci. (Belgrade). 2009. Vol. 61, №4. P. 639-644.

17. Belajova E., Rauova D. Comparison of two clean up techniques in isolation of ochratoxin A from red wine // Czech J. Food Sci. 2010. Vol. 28. P. 233-241.

18. Vega M., Munoz K., Sepulveda C., Aranda M., Campos V., Villegas R., Villarroel O. Solid-phase extraction and HPLC determination of Ochratoxin A in cereals products on Chilean market // Food Control. 2009. Vol. 20. P. 631-634.

19. Rhouati A., Paniel N., Meraihi Z., Marty J.-L. Development of an oligosorbent for detection of ochratoxin A // Food Control. 2011. Vol. 22. P. 1790-1796.

20. De Girolamo A., McKeague M., Miller J.D., DeRosa M.C., Visconti A. Determination of ochratoxin A in wheat after clean-up through a DNA aptamer-based solid phase extraction column//Food Chem. 2011. Vol. 127. P. 1378-1384.

21. Jeronimo P.C.A., Araujo A.N., Montenegro M.C.B.S.M. Optical sensors and biosensors based on sol-gel films (review) // Talanta. 2007. Vol. 72. № 1. P. 13-27.

22. Gupta R., Kumar A. molecular imprinting in sol-gel matrix // Biotechnology Advances. 2008. Vol. 26. P. 533-547.

23. Avnir D., Braun S., Lev O., Ottolenghi M. Enzymes and Other Proteins Entrapped in SolGel Materials // Chem. Mater. 1994. Vol. 6. P. 1605-1614.

24. Dave B.C., Dunn B., Valentine J.S., Zink J.I. Sol-Gel Encapsulation Methods for Biosensors // Anal. Chim. Acta. 1994. Vol. 66. P. 1120A-1127A.

25. Dave B.C., Miller J.M., Dunn B., Valentine J.S., Zink J.I. Encapsulation of proteins in bulk and thin film sol-gel matrices // J. Sol-Gel Sci. Technol. 1997. Vol. 8. P. 629-634.

26. Dunn B., Zink J.I. Probes of Pore Environment and Molecule-Matrix Interactions in SolGel Materials // Chem. Mater. 1997. Vol. 9. P. 2280-2291.

27. Adhikari B., Majumdar S. Polymers in sensor applications // Prog. Polym. Sci. 2004. Vol. 29. P. 699-766.

28. Tan F., Yan F., Yu H. A designer ormosil del for preparation of sensitive immunosensor for carcinoembrionic antigen based on simple direct electron transfer // Electrochemistry Comm. 2006. Vol. 8. P. 1835-1839.

29. Dooby M.A., Baker S.P., Bright F.V. Affinity and mobility of polyclonal anti-dansyl antibodies sequestered within sol-gel-derived biogels // Chem. Mater. 2000. Vol. 12. P. 11421147.

30. Pulido-Tofino P., Barrero-Moreno J.M., Perez-Conde M.C. Analysis of isoproturon at trace level by solid phase competitive fluoroimmunosensing after enrichment in a sol-gel immunosorbent//Analytica Chimica Acta. 2006. Vol. 562. P. 122-127.

31. Hodson R.J., Brook M.A., Brennan J.D. Capillary-scale monolithic immunoaffinity columns for immunoextraction with in-line laser-indused fluorescence detection // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. P. 4404-4412.

32. Development and application of a sol-gel immunosorbent based method for the determination of isoproturon in surface water / Zhang X., Martens D., Kramer P.M. et all // J. of Chromatography A. 2006. Vol. 1102. P. 84-90.

33. Incapsulation of biomolecules for bioanalytical purposes: preparation of diclofenac antibody-doped nanometer-sized silica particles by reverce micelle and sol-gel processing /

34. Tsagkogeorgas F., Ochsekuhn-Petropoulou M., Niessner R., Knopp D. // Anal. Chem. Acta.2006. № 573-574. P. 133-137.

35. Flow injection fluorescence immunoassay for gentamicin using sol-gel derived mesoporous biomaterial Yang H.-H., Zhu O.Z., Qu H.-Y. et all // Anal. Biochemistry. 2002. № 208. P. 71-76.

36. Cuchna M., Knopp D., Niessner R. Immuaffinity chromatography of polycyclic aromatic hydrocarbons in columns prepared by the sol-gel method // Anal. Chem. Acta. 1997. № 339. P. 241-250.

37. Altstein M., Bronshtein A., Glattstein B., Zeichner A., Tamiri T., Almog J. Immunochemical approaches for purification and detection of TNT traces by antibodies entrapped in a sol-gel matrix // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 2461-2467.

38. Cuchna M., Markl P., Knopp D., Niessner R. On-line coupling of sol-gel generated immunoaffinity columns with high-performance liquid chromatography // J. of Chromatography A. 2001. №919. P. 51-58.

39. Vazquez-Lira J.C., Camacho-Frias E. Pena-Alvarez A., Vera-Avila L.E. Preparation and chractirization of a sol-gel immunosorbent doped witn 2,4-D antibodies // Chem. Mater. 2003. № 15. P.154-161.

40. Schoringhumer K., Cichna-Markl M. Sample clean-up with sol-gel enzyme and immunoaffinity columns for the determination of bisphenol A in human urine // Journal of Chromatography B. 2006. Vol. 850. № 1-2. P. 361-369.

41. Brenn-Struckhofova Z., Cichna-Markl M., Bolhm C., Razzazi-Fazeli E. Selective sample cleanup by reusable sol-gel immunoaffinity columns for determination of deoxynivalenol in food and feed samples // Anal. Chem. 2007. Vol. 79, P. 710-717.

42. Tan F., Yan F., Yu H. Sensitive reagent less electrochemical immunosensor based on an ormosil sol-gel membrane for humane chorionic gonadotrophin // Biosensors and Bioelectronics.2007. Vol. 22. № 12. P. 2945-2951.

43. Stalikas C., Knopp D., Niessner R. Sol-gel glass immunosorbent based determination of s-triazines in water and soil samples using gas chromatography with a nitrogen phosphorous detection system //Envoronment Sci. Thechnol. 2002. Vol. 36. P. 3372-3377.

44. Pulido-Tofíno P., Barrero-Moreno J.M., Pirer-Conde M.C. sol-gel glass doped with isoproturon antibody as selective support for the development of a flow-through fluoroimmunosensor // Anal. Cem. 2001. № 429. P. 337-345.

45. Bronstein A., Aharonson N., Avnir D., Turniansky A., Alstein M. Sol-gel matrixes doped with atrazine antibodies: atrazine binding properties // Chem. Mater. 1997. № 9. P. 2632-2639.

46. Bronstein A., Aharonson N., Avnir D., Turniansky A., Alstein M. Sol-gel based immunoaffinity chromatography: application to nitroaromatic compounds // Chem. Mater. 2000. № 12. P. 2050-2058.

47. Rogers K.R., Wang J., Pamidi P.Y.A. Sol-gel derived theck-film amperometric immunosensors//Anal. Chem. 1998. Vol. 70. P. 1171-1175.

48. Schneider E., Usleber E., Maertlbauer E., Dietrich R., Terplan G. Multimycotoxin dipstick enzyme immunoassay applied to wheat // Food Addit. Contam. 1995a. Vol. 12. No 3. P. 387-393.

49. Collin R., Schneider E., Briggs L., Towers N. Development of immunodiagnostic field tests for the detection of the mycotoxin, sporidesmin A // Food Agricultural Immunology. 1998. Vol. 10. №2. P. 91-104.

50. Sibanda L., De Saeger S., Van Peteghem C. Development of a portable field immunoassay for the detection of aflatoxin Ml in milk // Intern. J. Food Microbiol. 1999. Vol. 48. P. 203-209.

51. Bhattacharya R., Bhattacharya D. and Dhar T.K. A novel signal amplification technology based on catalyzed reporter deposition and its application in a Dot-ELISA with ultra high sensitivity // J. Immun. Methods. 1999. Vol. 227, № 1-2. P. 31-39.

52. Sibanda L., De Saeger S., Van Peteghem C., Grabarkiewicz-Szczesna J., Tomczak M. Detection of T-2 toxin in different cereals by flow-through enzyme immunoassay with a simultaneous internal reference // J. Agric. Food Chem. 2000. Vol. 48. P. 5864-5867.

53. De Saeger S., Sibanda L., Desmet A., Van Peteghem C. A collaborative study to validate novel field immunoassay kits for rapid mycotoxin detection // Int. J. Food Microbiology. 2002. Vol. 75. № 1-2. P. 135-142.

54. Henderson K., Stewart J. Factors influencing the measurements of oestrone sulphate by dipstick particle capture immunoassay // J. Immunol. Methods. 2002. Vol. 270. P. 77-84.

55. Xiang X., Tianping W., Zhigang T. Development of a rapid, sensitive, dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis: a colloidal dye immunofiltration assay // J. Immunol. Methods. 2003. Vol. 280. P. 49-57.

56. Pal A., Dhar T.K. An analytical device for on-site immunoassay. Demonstration of its applicabiliti in semiquantitative detection of aflatoxin B1 in a batch of samples with ultrahigh sensitivity // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. P. 98-104.

57. Pal A., Acharya D., Saha D., Dhar T.K. Development of a membrane-based immunofiltration assay for the detection of T-2 toxin // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. № 14. P. 4237-4240.

58. Paepens C., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetro I., Leglise I., Van Hove F., Van Peteghem C. A flow-through enzyme immunoassay for the screening of fumonisins in maize // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 523. P. 229-235.

59. Schneider E., Curtui V., Seidler C., Dietrich R., Usleber, E., Martlbauer E. Rapid methods for deoxynivalenol and other trichothecenes // Toxicology Letters. 2004. Vol. 153. P. 113-121.

60. Wang S., Zhang C., Zhang Y. Development of a flow-through enzyme-linked immunosorbent assay and a dipstick assay for the rapid detection of the insecticide carbaryl // Anal. Chem. Acta. 2005. Vol. 535. P. 219-225.

61. Wang S., Zhang C., Zhang Y. Development of colloidal gold-based flow-through and lateral-flow immunoassays for the rapid detection of the insecticide carbaryl // Anal. Chem. Acta. 2005. Vol. 546. P. 161-166.

62. Saha D., Acharya D., Roy D., Shrestha D., Dhar T.K. Simultaneous enzyme immunoassay for the screening of aflatoxin B1 and ochratoxin A in chili samples // Anal. Chim. Acta. 2007. Vol. 584. № 2. P. 343-349.

63. Kolosova A.Yu., De Saeger S., Eremin S.A., Van Peteghem C. Investigation of several parameters influencing signal generation in flow-through membrane-based enzyme immunoassay // Anal. Bioanal. Chem. 2007. Vol. 387. P. 1095-1104.

64. Wang S., Quan Y., Lee N. Rapid Determination of Fumonisin B1 in Food Samples by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Colloidal Gold Immunoassay. // J. Agric. Food Chem. 2006. Vol. 54. № 7. P. 2491-2495.

65. Salter R, Douglas D, Tess M, Markovsky B, Saul S.J. Interlaboratory study of he Charm ROSA Safe Level Aflatoxin Ml Quantitative lateral flow test for raw bovine milk // J. AOAC Intern. 2006. Vol. 89. № 5. P. 1327-1334.

66. De Saeger S., Van Peteghem C. Flow-through membrane-based enzyme immunoassay for rapid detection of ochratoxin A in wheat // J. Food Protect. 1999. Vol. 62. № 1. P. 65-69.

67. Sibanda L., De Saeger S., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. Development of a solidphase cleanup and portable rapid flowthrough enzyme imunoassay for the detection of ochratoxin A in roasted coffee // J. Agric. Food Chem. 2002. Vol. 50. P. 6964-6967.

68. Hawkes R., Identification of concanavalin A-bilding proteins after sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis and protein blotting // Anal. Biochem. 1982. Vol. 123. P. 143.

69. Saha D., Acharya D., Dhar Т.К. Method for homogeneous spotting of antibodies on membranes: Application to the sensitive detection of ochratoxin A // Anal. Bioanal. Chem. 2006. Vol. 385. № 5. P. 847-854.

70. Pal A., Acharya D., Saha D., Roy D., Dhar Т.К. In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples // J. Food Protection. 2005. Vol. 68. P. 2169-2177.

71. Garrett G. Modulating the red cell membrane to produce universal/stealth donor red cells suitable for transfusion // Vox Sanguinis. Vol. 94. 2007. P. 87-95.

72. Гембицкий П. А. Вредные вещества в промышленности. 7 издание. Т. 2. М: 1976. -235 с.

73. Роговин 3. А. Химия целлюлозы. М.: 1972. С. 402-404.

74. Нудьга JI. А., Плиско Е. А., Данилов С. Н. N-алкилирование хитозана // Журнал общей химии. 1973. Т. 63. С. 2756-2760.

75. Zhishen Jia, Dongfeng shen, Weiliang Xu. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydrate research. 2001. Vol. 333. № 1. P. 1-6.

76. Biagini G., Bertani A. Wound managment with N-carboxybutil chitosan // Biomaterials 1991. Vol. 12. April. P. 281-285.

77. Meneely J.P., Sulyok M., Baumgartner S., Krska R., Elliott C.T. A rapid optical immunoassay for the screening of T-2 and HT-2 toxin in cereals and maize-based baby food // Talanta. Vol. 81. 2010. P. 630-636.

78. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. Academic Press. 1996. 785 p.

79. De Saeger S., Van Peteghem C. Detection of mycotoxins by flow-through membrane-based enzyme immunoassay. European patent No. 0893690 (Bulletin 2004/29, 14.07.2004)

80. Web-сайт «Pall Corporation»: http://labfilters.pall.com/catalog/laboratory35881.asp

81. Trullols E., Ruisanchez I., Rius F.X. Validation of qualitative analytical methods // Trends Anal. Chem. 2004. Vol. 23. № 2. P. 137-145.

82. Lobeau M., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetrô I., Van Peteghem C. Development of a new clean-up tandem assay column for the detection of ochratoxin A in roasted coffee // Anal. Chim. Acta. 2005. Vol. 538. P. 57-61.

83. Майстренко B.H., Хамитов P.3., Будииков Т.К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. М.: Химия. 1996. 319 с.

84. Пурмаль А.П. Антропогенная токсикация планеты // Соровский образовательный журнал. 1998. № 9. С. 46-51.

85. Гигиенические нормативы. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования //ГН 2.1.5.1315-03 от 15.06.2003.

86. Commission regulation (ЕС) № 208/2005 of 4 February 2005 amending Regulation (EC) № 466/2001 as regards polycyclic aromatic hydrocarbons // Official Journal of the European Union, 2005, Vol. 34, P. 3-5.

87. Oliferova L., Statkus M., Tsysin G., Shpigun O., Zolotov Yu. On-line solid-phase extraction and HPLC determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water using fluorocarbon polymer sorbents // Anal. Chim. Acta. 2005. Vol. 538. P. 35-40.

88. Романовская Г.И., Оленин А.Ю., Васильева С.Ю., Крутяков Ю.А. «Химически модифицированные наночастицы серебра новый сорбент для концентрирования полициклических ароматических углеводородов из водных растворов». // ДАН. 2008, Т.422, №3, с. 339-342.

89. Liu J., Chi Y.-G, Jiang G-B, Tai C., Hu J. Use of cotton as a sorbent for on-line precolumn enrichment of polycyclic aromatic hydrocarbons in waters prior to liquid chromatography determination// Microchem. J. 2004. Vol. 77. P. 19-22.

90. Commission Regulation (EC) No. 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. Off. J. Eur. Union L364/5.

91. СанПиН 2.3.2.1078-01 "2.3.2. Продовольственное сырье и пищевые продукты "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

92. Русанова Т.Ю., Левина Н.А., Юрасов Н.А., Горячева И.Ю. Нанопористые золь-гель материалы с иммобилизованными антителами для иммуноаффинного концентрирования пирена// Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9, вып. 3. С. 391-398.

93. Русанова Т.Ю. Нано- и супрамолекулярные системы в оптических, пьезоэлектрических сенсорах и тест-методах анализа. Дис. д-ра хим. наук. Саратов., 2009. - 320 с.

94. ИЗ. Crowser J.R. ELISA Theory and Practice // Humana Press, New Jersey. 1995. 229 p.

95. Yao В., Yang L., Hu Q., Shigendo A. Cloud point extraction of polycyclic aromatic Hydrocarbons in aqueous solution with silicone surfactants // Chin. J. Chem. Eng. 2007. Vol. 15. №4. P. 468-473.

96. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 1. Учеб. для вузов // Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова В. И. Фадеева и др.; Под ред. Ю-А. Золотова. М.: Высш. шк. 1996. -383 с: ил.

97. Вэб-сайт компании «Аквилон»: http://www.prochrom.ru/ru/view/?info=vesh&id=92.

98. Rusanova T.Yu., Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Lobeau M., Van Peteghem C., De Saeger S. Non-instrumental immunochemical tests for rapid ochratoxin A detection in red wine // Anal. Chim. Acta. 2009. Vol. 653. № 1. P. 97-102.

99. Донченко JI.B., Надыкта В.Д. //Безопасность пищевой продукции. —М.: ДеЛи принт. 2005. — 539 с.

100. Харченко С.Н., Литвин В.П., Тарабара И.М. Справочник по микозам и микотоксикозам сельскохозяйственных животных. —Киев: Урожай. 1982. —168 с.

101. Weidenborner М. Mycotoxins in Foodstuff. Springer. 2007. 900 p.

102. Золотов Ю.А., Иванов B.M., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа. -М.: Едиториал УРСС. 2002. 304 с.

103. Commission Recommendation of 17 August 2006 on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding (2006/576/EC). Off. J. Eur. Union L229/7.

104. ГОСТ P 51550-2000. Комбикорма-концентраты для свиней. Общие технические условия. С поправками от 2009 г. Госстандарт России. -М.

105. Горячева И.Ю., Русанова Т.Ю., Бурмистрова Н.А., Де Саегер С. Иммунохимические методы определения микотоксинов // Журн. анал. химии. 2009. Т.64. № 8. С. 788-806.

106. Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические методы анализа микотоксинов (обзор) // Прикл. биохим. микроб. 2010. Т. 46. № 3. С. 276-290.

107. Zheng M.Z., Richard J.L., Binder J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins//Mycopathologia. 2006. Vol. 161. P. 261-273.

108. Zinedine A., Soriano J.M., Molto J.C., Manes J. Review on the toxicity, occurrence, metabolism, detoxification, regulations and intake of zearalenone: an oestrogenic mycotoxin // Food Chem. Toxicol. 2007. Vol. 45. P. 1-18.

109. Pfohl-Leszkowicz A., Manderville R.A. Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans // Mol. Nutr. Food Res. 2007. Vol. 51. № 1. P. 61-99.

110. Berthiller F., Sulyok M., Krska R., Schuhmacher R. Chromatographic methods for the simultaneous determination of mycotoxins and their conjugates in cereals // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 119. № 1-2. P. 33-37.

111. Cavaliere C., Foglia P., Pastorini E., et al. Development of a multiresidue method for analysis of major Fusarium mycotoxins in corn meal using liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. Vol. 19. P. 2085-2093.

112. Liu R., Yu Z., He Q., Xu Y. An immunoassay for ochratoxin A without the mycotoxin // Food Control. 2007. Vol. 18. № 7. P. 872-877.

113. Alarcon S.H., Palleschi G., Compagnone D., Pascale M., Visconti A., Barna-Vetro I. Monoclonal antibody based electrochemical immunosensor for the determination of ochratoxin A in wheat // Talanta. 2006. Vol. 69. № 4. P. 1031-1037.

114. Юрасов H.A., Бурмистрова H.A., Русанова Т.Ю. Одновременное определение зеараленона и охратоксина А в пшенице иммунофильтрационным тест-методом // Известия Саратовского университета. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2011. Вып. 2. С. 13-18.

115. Вэб-сайт энциклопедии "Википедия": http://ru.wikipedia.org/wiki/Цвeтoвaя модель

116. Егоров A.M., Осипов А.П. Теория и практика иммуноферментного анализа // М.: Высшая школа. 1991. Т. 33. 288 с.

117. Cavaliere Ch., Ascenzo G. D., Foglia P., Pastorini E., Samperi R., Lagana A. Determination of type В trichothecenes and macrocyclic lactone mycotoxins in field contaminated maize // Food Chemistry. 2005. Vol. 92. P. 559-568.

118. EC Commission Decision 657/2002 of 12 August 2002. Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results. Official Journal of the European Communities L221/8.

119. Басова Е.Ю. Иммунохимические тест-методы определения токсикантов в продуктах питания и объектах окружающей среды : автореф. дисс. : канд. хим. Наук / Е.Ю. Басова; Саратовский гос. ун-т. им. Н.Г. Чернышевского. Саратов., 2010. - 22 с.

120. Монастырский О. Разработка биопрепаратов для защиты посевов и зерна злаковых культур от поражения токсиногенными грибами и накопления опасных микотоксинов -Федеральный вестник экологического права. № 2. 2004. С. 5-18.

121. Lattanzio V.M.T., Solfrizzo M., Visconti A. Enzymatic hydrolysis of T-2 toxin for the quantitative determination of total T-2 and HT-2 toxins in cereals // Anal Bioanal Chem. 2009. Vol. 395. P. 1325-1334.

122. Тутельян B.A., Кравченко JI.B. Микотоксины (медицинские и биологические аспекты). М.: Медицина. 1985. - 320 с.

123. Буряк В,Н. Микотоксикозы свиней и их профилактика // Зоотехника. 2007. № 9. С. 11-12.

124. Canady R., Raymond D. Coker, et al. Deoxynivalenol. http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v47je05.htm.

125. Visconti A., Lattanzio V.M.T., Pascale M., Haidukowski M. Analysis of T-2 and HT-2 toxins in cereal grains by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography with fluorescence detection // Journal of Chromatography A, T.1075. 2005. P. 151-158

126. Rezar V., Frankic T. Dose-dependent effects of T-2 toxin on performance, lipid peroxidation and genotoxicity in broiler chickens // Poult Sci. 2007. Vol. 86. P. 1155.

127. Krska R., Baumgartner S., Josephs R. The state-of-art in the analysis of type-A and -B trichothecene mycotoxins in cereals // Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 2001. Vol. 371. P. 285-299.

128. Lattanzio V.M.T., Pascale M., Visconti A. Current analytical methods for trichothecene mycotoxins in cereals // Trends in Analytical Chemistry. Vol. 28. № 6. 2009. P. 758-768.

129. Krska R., Welzig E., Boudra H. Analysis of Fusarium toxins in feed // Animal Feed Sci. Technol. 2007. Vol. 137. P. 241-264.

130. Ler S.G., Lee F.K., Gopalakrishnakone P. Trends in detection of warfare agents: Detection methods for ricin, staphylococcal enterotoxin В and T-2 toxin // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1133. № 1-2. P. 1-12.

131. Langseth W., Rundberget T. Instrumental methods for determination of nonmacrocyclic trichothecenes in cereals, foodstuff and cultures//J. Chromatogr. A. 1998. Vol. 815. P. 103121.

132. Buttinger G., Krska R. Determination of B-trichothecenes in wheat by post column derivatisation liquid chromatography with fluorescence detection (PCD-HPLC-FLD) // MycotoxinRes. 2003. Vol. 19. № 2. P. 139-143.

133. Takumi Y., Hiroaki K. A practical method for measuring deoxynivalenol, nivalenol and T-2+HT-2 toxin in foods by an enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies // Biosci Biotechnol Biochem. 2004. Vol. 68. P. 2076-2085.

134. Schwenecke H., Mayer D. Benzidine and Benzidine Derivatives in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. 2005. Wiley-VCH. Weinheim.

135. Кирейко A.B., Веселова И.А. Шеховцова Т.Н. Механизм реакций пероксидазного окисления о-дианизидина, 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и о-фенилендиимина в присутствии додецилсульфата натрия // Биоорг. химия. 2006. Т. 32. № 1. С. 80-86.

136. Вэб-сайт "Сведения о микотоксинах": http://www.knowmycotoxins.com.

137. Maragos М., Mecormick P. // Monoclonal antibodies for the mycotoxins deoxynivalenol and 3. acetyl, deoxyni food and agricultural immunology. 2000. Vol. 12. P. 181-192.

138. Кудряшова E.B. Функционирование и структура белков (ферментов) в коллоидных системах, на поверхности раздела фаз и в микроэмульсиях : автореф. дисс.: д-ра хим. наук / Е.В. Кудряшова ; Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова. М., 2009. с. 48.

139. Вэб-сайт энциклопедии " Химик": http//www.xumuk.ru/encyklopedia/2/3602.html.

140. Бровко О.С., Паламарчук И.А., Вишнякова А.П. Влияние молекулярной массы лигносульфоната натрия на комплексе образование с полиэтиленполиамином // Химия раст. сырья. 2011. № 1. С. 65-70.

141. Бровко О.С., Паламарчук И.А., Макаревич Н.А., Бойцова Т.А. Полимолекулярные характеристики лигносульфонатов натрия, хитозана и полиэтиленполиамина // Химия раст. сырья. 2009. № 1. С. 29-36.

142. Веселова И.А., Кирейко А.В., Шеховцова Т.Н. Повышение каталитической активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном // Прикладная биохим. и микробиол. 2009. Т. 45. №2. С. 143-148.

143. Hunter K.W., Brimfiled А.А., Miller М., Finkelman F.D., Chu S.F. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to the trichothecenes mycotoxin T-2 // Appl Environ Microbiol. 1985. Vol. 49. P. 168-172.

144. De Saeger S., Sibanda L., Paepens S., Lobeau M., Delmulle В., Barna-Vetro I., Van Peterghem C. Novel developments in rapid mycotoxin detection // Mycotoxin Research. 2006. Vol. 22. №2. P. 100-104.

145. Автор благодарит Prof. Sarah De Saeger (Гентский университет, Бельгия), Prof. R. Niessner, Prof. Dietmar Knopp (Мюнхенский технический университет, Германия) за предоставленные иммунореагенты.

146. Глубокая признательность д.х.н., проф. Горячевой И.Ю., к.х.н., доценту Бурмистровой H.A. за плодотворное сотрудничество, ценные советы и помощь, оказанную на разных этапах выполнения работы.