Пробоподготовка QuEChERS и дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция при одновременном определении микотоксинов различных классов хроматографическими методами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Авдеева Надежда Михайловна

Пробоподготовка (^иЕСЬЕЫБ и дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция при одновременном определении микотоксинов различных классов хроматографическими методами

02.00.02 - аналитическая химия

г я но я 20)3

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Саратов 2013

005541499

Работа выполнена на кафедре химии ФГБОУ ВПО «Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Амелин Василий Григорьевич

Официальные оппоненты: Горячева Ирина Юрьевна

доктор химических наук, доцент, Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, профессор кафедры общей и неорганической химии

Иванов Александр Вадимович

доктор химических наук, доцент, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, доцент кафедры аналитической химии

Ведущая организация: ФГБУН «Институт геохимии и

аналитической химии им. В.И. Вернадского Российской академии наук (ГЕОХИ РАН)»

Защита диссертации состоится 19 декабря 2013 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 на базе Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, СГУ, Институт химии, I корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в ЗНБ им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.

Автореферат разослан «19» ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук У Русанова Т. Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Микотоксины - вторичные метаболиты жизнедеятельности микроскопических плесневых грибов - загрязняют пищевые продукты растительного, животного происхождения и могут нанести серьезный урон здоровью как животных, так и человека. Чаще всего они находятся в продуктах не по отдельности, одновременное же присутствие нескольких видов микотоксинов приводит к увеличению их' токсичного действия в результате синергетического эффекта. Все микотоксины разделяются на несколько классов и отличаются по своим свойствам и строению, что приводит к трудностям их одновременного определения. Существующие в РФ ГОСТ и методические указания на определение микотоксинов в продуктах растительного и животного происхождения основаны на использовании хроматографических методов анализа: ТСХ, ВЭЖХ с флуориметрическим или УФ -детекторами, ГЖХ с детектором по захвату электронов. Для извлечения микотоксинов из анализируемых объектов в основном используют жидкостно-жидкостную экстракцию. Для очистки экстрактов от соэкстрагируемых веществ (белки, жиры, липиды, стеролы, полярные органические кислоты, каратиноиды, хлорофилл) используют твердофазную экстракцию и коммерческие иммуноаффинные колонки для избирательного извлечения микотоксинов (единичных или определенного класса). Обычно данные методики длительны (пробоподготовка может занимать от 3 до 5 ч), трудоемки, требуют больших количеств токсичных органических растворителей и дорогостоящих одноразовых иммуноаффинных колонок, применимых при определении только отдельных классов или единичных нормируемых микотоксинов (афлатоксинов Bl, В2, G1,G2, Ml, охратоксина А, Т-2, дезоксиниваленола, зеараленона, патулина).

В последнее время для одновременного извлечения микотоксинов и определения их методами ГЖХ (ВЭЖХ)-МС/МС используют пробоподготовку по QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Однако при такой пробоподготовке определение микотоксинов более доступными хроматографическими методами с флуориметрическим, УФ - и элетроннозахватным детекторами затруднено в связи с недостаточной очисткой экстрактов.

Цель данной работы: разработка экспрессного комбинированного способа одновременного определения микотоксинов различных классов в продуктах растительного и животного происхождения, совмещающего пробоподготовку QuEChERS и дисперсионную жидкостно-жидкостной микроэктракцию с хроматографическим определением.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: •Установить возможность комбинации методов пробоподготовки QuEChERS и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции (ДЖЖМЭ) для одновременного извлечения микотоксинов различных классов из одной навески зерна, кормов и продуктов питания.

• Оптимизировать условия пробоподготовки, для получения высокой чистоты экстрактов из различных матриц, необходимой при анализе хроматографическими методам (высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ, флуориметрическим детектированием, газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата).

•Установить оптимальные условия получения производных афлатоксинов и трихотеценовых микотоксинов, хроматографического разделения данных соединений, а также охратоксинов, зеараленона и патулина.

• Разработать методики определения микотоксинов различных классов в зерне, кормах и продуктах питания.

Научная новизна. Установлена возможность одновременного извлечения исследуемых микотоксинов (афлатоксинов М1, В1, В2, 01, в2; трихотеценовых типа А: Т-2 токсина, НТ-2 токсина, Т-2-тетраол токсина, Т-2-триол токсина, неосаланиола, диацетоксискирпенола; трихотеценовых типа В: дезоксиниваленола, ниваленола, 15-ацетилдезоксиниваленола, 3-ацетилдезоксиниваленола, фузаренона X; охратоксина А и охратоксина В; зеараленона; патулина) из одной навески зерна, кормов и продуктов питания с использованием пробоподготовки С?иЕСЫЖ.8.

Предложен способ дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции для дополнительной очистки и избирательного извлечения микотоксинов разных классов (афлатоксинов, трихотеценовых микотоксинов, зеараленона и патулина) из экстракта одной навески, полученного после С>иЕСЬЕК8. Исследовано и оценено влияние различных факторов на условия проведение приготовления образцов при совместном использовании С>иЕСЬЕЯ8 и ДЖЖМЭ.

Практическая значимость.

1. Предложен способ одновременного извлечения двадцати микотоксинов различных классов из одной навески образцов зерна, кормов, пищевых продуктов с использованием пробоподготовки (ЗиЕСИЕНЗ и дополнительного избирательного извлечения из экстракта методом дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции отдельных групп микотоксинов: афлатоксинов и патулина, трихотеценовых микотоксинов, охратоксинов и зеараленона.

2. Разработан способ определения микотоксинов в продуктах растительного и животного происхождения, включающий пробоподготовку (ЗиЕСЬЕЯЗ, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию и последующее определение в экстракте:

-пяти афлатоксинов, двух охратоксинов, зеараленона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметическим детектированием;

- патулина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием;

-одиннадцати трихотеценовых микотоксинов методом газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата

Использование данного способа извлечения позволило снизить время анализа, сократить объемы токсичных растворителей, а также снизить себестоимость анализа за счет использования малых количеств насыпных сорбентов и растворителей, недорогостоящего оборудования. Предложенные методики проверены на реальных образцах зерна, кормов и пищевых продуктах. Продолжительность анализа составила 1,5-2 ч.

На защиту выносятся:

• Новый способ одновременного извлечения микотоксинов различных классов, основанный на совмещение методов пробоподготовки QuEChERS и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции.

• Результаты по оптимизации условий экстракции и очистки экстракта при совместном использовании методов QuEChERS и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции из одной навески зерна, кормов и продуктов питания для определения двадцати микотокисинов (афлатоксинов Ml, Bl, В2, Gl, G2; трихотеценовых: Т-2 токсина, НТ-2 токсина, T-2-тетраол токсина, T-2-триол токсина, неосоланиола, диацетоксискирпенола, дезоксиниваленола, ниваленола, 15-ацетилдезоксиниваленола, 3-ацетилдезоксиниваленола, фузаренона X; охратоксинов А и В; зеараленона; патулина).

• Оптимальные условия получения производных афлатоксинов и трихотеценовых микотоксинов, селективного и эффективного разделения микотоксинов различных классов хроматографическими методами с различными детекторами.

• Результаты валидации методик и определения микотоксинов различных классов в реальных образцах зерна, кормов и продуктах питания.

Личный вклад автора заключался в проведении экспериментальных исследований по получению производных микотоксинов; в выборе оптимальных условий хроматографического разделения и определении микотоксинов различных классов; в разработке способов извлечения и очистки экстрактов микотоксинов из зерна, кормов и различных продуктов питания, в интерпретации результатов эксперимента, в формулировании научных положений и выводов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на следующих конференциях и симпозиумах: Международной молодежной научной конференции «ЛОМОНОСОВ-2011, 2012, 2013» (Москва, МГУ), Международной конференции 5th International Symposium on Recent Advancesin Food Analysis, 2011 r. (Прага, Чехия), Всероссийской школе - конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, 2012 г (Саратов), VI Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием, «Менделеев - 2012» 2012 г. (Санкт-Петербург, СПбГУ), Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева, 2012 г. (Чебоксары), международной конференции 36th International Symposium on Capillary Chromatography, 2012 г. (г. Рива дель Гардо, Италия), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2013), международной конференции 19th International Symposium on Separation Sciences. New Achievements In Chromatography, 2013 г. (Пореч, Хорватия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, 6 статей (из них 5 статей опубликованы в журналах из списка ВАК) и 10 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, включая введение, 5 глав, выводы, список литературы (146 источников) и одно приложение. Работа содержит 30 рисунков и 13 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложены новизна и практическая значимость результатов исследований, представлены основные положения, выносимые на защиту.

В обзоре литературы кратко рассмотрены основные классы микотоксинов. Рассмотрены существующие на сегодняшний день способы отбора проб и пробоподготовки образцов различных матриц для извлечения микотоксинов. Представлен обзор хроматографических методов, применяемых для одновременного определения исследуемых веществ разных классов или отдельных микотоксинов. Обсуждены возможные трудности при определении микотоксинов.

Экспериментальная часть. Реактивы. В работе использовали стандартные растворы в ацетонитриле по 100 мкг/мл: дезоксиниваленола, ниваленола, фузаренона X, 15-ацетилдезоксиниваленола, 3-ацетилдезоксиниваленола, диацетоксискирпенола, НТ-2 токсина (RomerLabs Diagnostic GmbH, Германия), Т-2 токсина, Т-2 триола, Т-2 тетраола, неосоланиола, зеараленона, патулина (Stylab, Россия), стандартную смесь афлатоксинов в ацетонитриле (TS-108, Trilogy Analytical Laboratory, США): B1 (2,0 мкг/мл), В2 (0,50 мкг/мл), G1 (2,0 мкг/мл) и G2 (0,50 мкг/мл), стандартный раствор афлатоксина Ml 0,5 мкг/мл в ацетонитриле (RomerLabs Diagnostic GmbH, Германия), стандартные растворы 10 мкг/мл в ацетонитриле: охратоксина A (RomerLabs Diagnostic GmbH, Германия) и охратоксина В (Fluka, Германия).

Аппаратура. В работе применяли жидкостной хроматограф Flexar LC (Perkin-Elmer, США) с УФ - и флуориметрическим детекторами, газовый хроматограф Clarus-600 с детектором по захвату электронов (ДЗЭ) (Perkin-Elmer, США). Одновременное разделение афлатоксинов, зеараленона, патулина и охратоксинов проводили на хроматографической колонке SUPELCOSIL™LC-18 5 мкм, 4,6 х 250 мм. Длины волн возбуждения и детектирования на флуориметрическом детекторе - для афлатоксинов 360 нм и 450 нм соответственно, для охратоксинов и зеараленона 333 нм и 460 нм соответственно. Для определения патулина применяли УФ — детектор, длина волны детектирования 274 нм. Капиллярную колонку Rtx-CL Pesticides® (Restek Corporation, США) длиной 30 м и внутренним диаметром 0,32 мм (толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм) использовали для разделения трихотеценовых микотоксинов.

Для характеристики эффективности процесса пробоподготовки рассчитывали коэффициент концентрирования (К) и степень извлечения (К) микотоксинов из с с V

образцов: К = — ; R =-^-^-100; - где ск и с() - концентрация аналита в конечном с„ c0V0

анализируемом растворе и начальная концентрация аналита в исходной пробе; VK и V„ - объем конечного анализируемого раствора-концентрата и объем пробы.

Выбор условий хроматографического разделения различных классов микотоксинов. В данной главе показан выбор оптимальных условий одновременного разделения четырех различных классов микотоксинов (афлатоксинов, охратоксинов, патулина и зеараленон) методом ВЭЖХ и условия разделения одиннадцати трихотеценовых микотоксинов методом газо-жидкостной хроматографии.

Молекулы афлатоксинов, зеараленона и охратоксинов имеют плоскую сопряженную я - систему, благодаря которой способны интенсивно флуоресцировать.

Поэтому исследуемые соединения можно определять одновременно с помощью флуориметрического детектора, путем смены длин волн возбуждения и детектирования в течение анализа. Для определения патулина использовали УФ-детектирование. Благодаря параллельному использованию УФ и флуориметрического детекторов в одном приборе стало возможным одновременное определение девяти микотоксинов разных классов.

Афлатоксины и патулин являются гидрофильными соединениями: увеличение объема воды в подвижной фазе позволяет разделять данные вещества. Однако в этом случае происходит тушение флуоресценции афлатоксинов. Для решения этой проблемы переводили афлатоксины в производные с трифторуксусной кислотой (ТФУК) и йодом до разделения их на колонке. В результате реакции дериватизации происходит насыщение двойных связей в фурановом кольце, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции производных, а также позволяет разделить все исследуемые афлатоксины. Установлено, что использование трифторуксусной кислоты позволяет получать устойчивые производные с максимальной интенсивностью флуоресценции:

Применение 50 мкл трифторуксусной кислоты является оптимальным объемом дериватизирующего агента для получения производных с максимальным выходом продукта. В выбранных условиях разделения при параллельном использовании флуориметрического и УФ- детекторов также возможно определение патулина, применение трифторуксусной кислоты позволяет чувствительно определять данный токсин.

Охратоксины и зеараленон являются гидрофобными соединениями, поэтому в используемых подвижных фазах ацетонитрила гораздо больше, чем воды. Также установлено, что использование 1 % раствора уксусной кислоты вместо воды в подвижной фазе позволяет наиболее чувствительно определять микотоксины в связи с протонированием гидроксильной группы у охратоксинов. Зеараленон в выбранных хроматографических условиях отделяется от охратоксинов, поэтому данные соединения определяли одновременно.

Для одновременного разделения девяти исследуемых микотоксинов разных классов использовали градиентное элюирование. Подвижную фазу меняли от более к менее полярной, а также варьировали скорость потока элюента. Замена воды на водный раствор уксусной кислоты позволяет селективно разделять все исследуемые микотоксины. На рис. 1 представлена хроматограмма смеси микотоксинов в оптимальных условиях разделения.

Селективность и эффективность разделения микотоксинов в подобранных условиях проверяли на разных хроматографических колонках Symmetry® С18, SUPELCOSIL™LC18 размерами 150 х 3,9 мм, 250 х 4,6 мм (диаметром зерна сорбента 5 мкм). Установлено, что с увеличением размера колонки эффективность разделения микотоксинов увеличивается. Поэтому колонка 250 х 4,6 мм позволяет наиболее эффективно и селективно разделять данные соединения.

о

о

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма стандартной смеси микотоксинов, полученная при параллельном использовании УФ - (а) и флуориметрического (б) детекторов: патулин (1,0 мкг/ мл) (7), афлатоксин С2 (0,01 мкг/мл) (2), афлатоксин В2 (0,01 мкг/мл) (5), афлатоксин М1 (0,01 мкг/мл) (4), афлатоксин в1 (0,01 мкг/мл) (5), афлатоксин В1 (0,01 мкг/мл) (б), охратоксин В (0,01 мкг/мл) (7), охратоксин А (0,01 мкг/мл) (8), зеараленон (0,02 мкг/мл) (9). Условия

разделения:

Подвижная фаза СН3СК СНзСООН 1% вод. Скорость потока, мл/мин Время, мин Длины волн ФЛД, нм Длины волн УФ детектора, нм

30 70 1,3 5 360,450 274

30 70 1,4 10 360,450 274

50 50 1,4 0,5 333,460 274

60 40 0,7 0,5 333,460 274

70 30 0,7 14 333,460 274

Чувствительность определения микотоксинов также зависит от температуры колонки. Установлено, что при температуре 30 °С термостата колонки наблюдается наибольшая интенсивность флуоресценции микотоксинов.

Важным фактором, определяющим чувствительность определения, являются длины волн возбуждения и детектирования. Установлено, что для пяти афлатоксинов использование длин волн возбуждения и детектирования 360 и 450 нм является оптимальным, а для зеараленона и охратоксинов - 333 и 460 нм. Для патулина поглощение максимально при длине волны 274 нм.

Трихотег{еновые микотоксины относятся к сесквитерпенам, наличие гидроксильных групп у данных соединений позволяет переводить их в легколетучие производные, которые высокочувствительны в ГЖХ с детекторами ДЭЗ и ПИД. Использование детектора, основанного на принципе электронного захвата, позволяет повысить чувствительность метода в 3-50 раз, по сравнению с использованием ПИД. По данной причине газожидкостную хроматографию с детектором электронного захвата применяли для определения трихотеценовых микотоксинов.

В данной работе использовали капиллярные колонки длиной 30 м, неподвижная жидкая фаза, которых состоит из 95% диметилполисилоксана и 5 % фенила, толщина пленки составляла 0,25 и 0,5 мкм. Применяемая неподвижная жидкая фаза является неполярной, может выдерживать температуры выше 300 °С, подходит для разделения

галогенсодержащих соединений, алкалоидов и пестицидов. Данная неподвижная фаза удовлетворительно подходит для разделения смеси фторпроизводных трихотеценовых микотоксинов. Ее толщина влияет на разделение трихотеценовых и с увеличением толщины пленки неподвижной фазы от 0,25 до 0,5 мкм эффективность разделения незначительно ухудшается. Линейное программирование температуры от 120 °С до 280 °С позволяет селективно разделять исследуемые микотоксины.

В качестве дериватизирующих агентов использовали трифторуксусную кислоту, трифторуксусный ангидрид (ТФА), пентафторпропионовый ангидрид (ПФПА), гептафтормасляный ангидрид (ГФМА). В результате реакции дериватизации образ

С£СЛ сг,сг1 сг, ст.

| • I !

о=с—о—с=о

I •

сг,

Н0—С=0

Увеличение количества фтора в молекуле ангидрида, приводит к повышению чувствительности определения, поэтому наибольшие значения площадей хроматографических пиков трихотеценовых микотоксинов наблюдали при использовании гептафтормасляного ангидрида. Установлены оптимальные условия проведения реакции дериватизации трихотеценовых микотоксинов с гептафтормасляным ангидридом: применение 50 мкл дериватизирующего агента, 50 мг гидрокарбоната натрия и выдерживание 15 мин при 60 °С (рис. 2).

111111111III111111111 1111111111111111111111111II11 И 11111111IIIII11111 16 18 20 22 24 26 ВР?Г'

пт

ин

|МИ|М11|М11|1111|1М1|11 10 12 14

Рис. 2. Хроматограмма стандартной смеси трифторпроизводных трихотеценовых микотоксинов с концентрацией 0,1 мкг/мл: Т-2-тетраол (/), ниваленол (2), дезоксиниваленол (5), 15-ацетилдезоксиниваленол (4), 3-ацетилдезоксиниваленол (5), неосоланиол (б), фузаренон X (7), диацетоксискирпенол (8), Т-2 триол (9), НТ-2 (10), Т-2 (11). Условия разделения:

Подвижная фаза

Скорость Температура Температура Температура

потока, мл/мин

2,0

инжектора, °С

250

детектора,

300

термостата колонки, °С 120 170 220 280

Скорость Время, мин нагрева, °С/мин

1,0 2,0 5,0 1,0

5,0 8,5 7,0

Пробоподготовка при определении микотоксинов в зерне, кормах и пищевых продуктах. В данной главе рассмотрена возможность применения совместно двух способов пробоподготовки QuEChERS и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции для одновременного извлечения микотоксинов разных классов из одной навески зерна и кормов, мяса и молочных продуктов.

Выбор условий QuEChERS для одновременного извлечения микотоксинов из одной навески. Масса навески для извлечения микотоксинов. Экстракцию микотоксинов осуществляли из сложных органических матриц. С увеличением массы от 2 до 10 г навески увеличивается фон матрицы, степень извлечения микотоксинов незначительно изменяется, по этой причине установлено, что 2 г образца зерна, кормов и мяса и 5 г для молока и молочных продуктов вполне достаточно для проведения анализа.

Экстракция микотоксинов. Установлено, что для извлечения микотоксинов из сухих образцов таких, как зерно или корма, оптимальным оказалось использование 15,0 мл ацетонитрила и 10,0 мл воды. Для образцов мяса 15,0 мл ацетонитрила (без добавления воды) достаточно, чтобы получить максимальные степени извлечения микотоксинов. При извлечении микотоксинов из молока соотношение ацетонитрил: вода (10:5) является оптимальным. Установлено, что время перемешивания с выбранными растворителями также влияет на степень извлечения микотоксинов. Оптимальное время для извлечения микотоксинов из молока составило 30 мин, а зерна, кормов и мяса - 10 мин.

Влияние высачивателей и буферирующих солей. Использовали разные соотношения солей для получения наилучших степеней излечения. Применение 4,0 г безводного MgS04, 1,0 г NaCl, 1,0 г Na3C6H507 ' 2Н20 и 0,5 г Na2HC6H507 ' 1,5Н20 позволяет максимально извлекать микотоксины из всех исследуемых матриц (зерно, корма, мясо и молоко).

Очистка экстракта. Установлены оптимальные соотношения масс сорбентов необходимых для очистки экстрактов микотоксинов. Применение в качестве сорбентов 200 мг DSC-18 и 200 мг Bondesil PSA является оптимальным и позволяет извлекать микотоксины (исключая охратоксины и зеараленон) в диапазоне 50-80% в зависимости от компонента и используемой матрицы образца. Добавление 950 мг сульфата магния, необходимого для удаления воды, достаточно для получения максимальных степеней извлечения микотоксинов.

Выбор условий ДЖЖМЭ для извлечения микотоксинов. Экстракты, полученные после QuEChERS недостаточно чистые, компоненты матрицы мешают определить исследуемые микотоксины методами высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ - и флуориметрическим детекторами или методом газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата. Поэтому для дополнительной очистки и избирательного извлечения микотоксинов применяли метод дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции.

Объем диспергатора. В данной работе микроэкстракцию сочетали с методом QuEChERS, поэтому в качестве диспергатора использовали только ацетонитрил (экстракт). Установлено, что с увеличением объема диспергатора степень извлечения микотоксинов увеличивается, за исключением трихотеценовых микотоксинов для которых 2 мл ацетонитрильного экстракта оказались оптимальными. Для остальных микотоксинов использование 4 мл диспергатора позволяет получать максимальные

и

степени извлечения. Важно также соотношение вносимого диспергатора в воду. Установлено, что при анализе всех исследуемых матриц оптимальным является использование соотношения ацетонитрильного экстракта и воды для трихотеценовых микотоксинов - 2:8, для охратоксинов и ЗОН- 4:10. При извлечении афлатоксинов и патулина из зерна и кормов соотношение диспергатора и воды - 2:5 является оптимальным, для извлечения афлатоксинов из мяса - 2:5, а из молока - 3:7.

Выбор экстрагента и его объема. В качестве экстрагентов использовали растворители, в которых растворимость микотоксинов выше, чем в диспергаторе. Установлено, что оптимальный результат для двух типов трихотеценовых микотоксинов достигается при использовании 300 мкл хлороформа, для афлатоксинов, охратоксинов, патулина и зеараленона максимальные значения степени извлечения получены при применении 400 мкл хлороформа (рис.3).

90 ^

Рис. 3. Зависимость степени извлечения микотоксинов от объема хлороформа.

Влияние рН среды. Исследуемые микотоксины различаются по химической структуре, поэтому рН среды проведения дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции может оказывать

« 60 ■ V

Г 50 ■

0

5 40 -

1 3091

5 20 ■ и 10

о -

200 250 300 350 Объем хлороформа, мкл

^нТрихстеценоаые

типа А -^»Трихотеценовые

типа В -*-Афлэгоксйны

Охратсксины

-г-ПЗТ>71ИМ

-V- Зезраленон

влияние на степень извлечения данных веществ. Установлено, что в щелочной среде (рН = 11) выше извлечение трихотеценовых типа В: дезоксиниваленола, 15-ацетилдезоксиниваленола, 3-ацетилдезоксиниваленола, фузаренона X, ниваленола. Увеличение щелочности среды также позволяет лучше извлекать микотоксины типа А этого класса, однако не так значительно, как для типа В. Для лучшего массопереноса между водным раствором и органическими растворителями (для всех остальных исследуемых микотоксинов) лучшим оказалось применение раствора с рН = 4,5, в этом случае достигаются максимальные степени извлечения у охратоксинов, афлатоксинов, патулина, зеараленона.

Влияние ультразвука. Обработка пробы ультразвуком способствует большему диспергированию экстрагента. Установлено, что при проведении микроэкстракции с хлороформом влияние ультразвука на степень извлечения микотоксинов незначительно.

Влияние скорости и продолжительность центрифугирования. Установлено, что центрифугирование проб в течение 10 мин со скоростью 2700 об/мин является оптимальным условием при проведении дисперсионной жидкостно-жидкостно микроэкстракции, дальнейшее увеличение продолжительности данной стадии не оказывает влияние на степень извлечения.

Способы одновременного определения микотоксинов в зерне, кормах и пищевых продуктах из одной навески. В данной главе представлены результаты определения микотоксинов в зерне, кормах и продуктах питания при совместном использовании (ЗиЕСЫЖЗ и микроэкстракции. Рассмотрены традиционные способы

извлечения микотоксинов и сопоставлены с представленной в данной работе методикой.

Одновременное определение микотоксинов в зерне и кормах. Большинство методик закрепленных в ГОСТ и методических указаниях в РФ пригодны для извлечения и определения только небольшого числа микотоксинов (патулина, пяти афлатоксинов, охратоксина А, зеараленона, дезоксиниваленола и Т-2 токсина). Одновременное определение микотоксинов позволяет значительно сократить время пробоподготовки и количество реактивов необходимых для анализа. Были сравнены характеристики существующих утвержденных методик и разработанной нами. Как видно из табл. 1, совместное применение (ЗиЕСИЕЯЗ и ДЖЖМЭ позволило значительно сократить объемы токсичных растворителей, время и стоимость анализа, что является приоритетным при определении микотоксинов. Степени извлечения микотоксинов, полученные разработанным методом, удовлетворительны и позволяют извлекать микотоксины практически на том же уровне, что и по методикам, изложенным в ГОСТ и методических указаниях.

Таблица 1. Сравнение методик определения микотоксинов разных классов в зерне, кормах и продуктах питания.

Мико-токсин Методика Способ пробо-подготовки Общий объем растворителей, мл R,% Примерная стоимость пробоподготовки для одного образца, отн.ед. Метод определения Время анализа, ч

Афл. В1, В2, 01,02 ГОСТР 53162-2008 ЖЖЭ:СНзСИ: Н20:СН30Н Иммуно-аффинная колонка 60 60-90 680 вэжх- ФЛД 2-3

ЗОН МУ 5177-90 ЖЖЭ сн3см н2о Очистка (гексаном, бензолом) 335 85-90 1560 вэжх- УФ 4-5

ДОН МУ 5177-90 ЖЖЭ СН3СЫ:Н20 Очистка на колонке с А1203, активированным углем 145 80-85 920 вэжх- УФ 4-5

Т-2 токсин МУ 318484 ЖЖЭ СНзС1Ч:КС1 Очистка (гексаном, бензолом) 315 50-60 1450 гжх-дэз 3-4,5

Охра-токсин А МУК 4.1.2204-07 ЖЖЭ СН3СШШ Иммуно-аффннные колонки 155 88,80 520 вэжх- ФЛД 2-3

Пату-лин ГОСТ 28038-89 ЖЖЭ СН3СООС2Н, :Н20 Колонка с силикагелем 250 80 1300 вэжх- УФ 4-5

Одновременное определение 19 микотоксинов ОиЕСШ^; ДЖЖМЭ 15,5 60100 90 гжх-дэз, вэжх- ФЛД, УФ 1,5-2

2 г пробы +15 мл аието нитрила + 10 мл воды

О мин встряхивание

Добавление высалив ателей и буфер ирующпх солей

г°п

__| | встряхивание

-— цеатрнфугнрованне

Очистка 8 мл экстракта с сорбентазги

-О- д

ДЩЖМЭ; хлороформ смешттЕзстгя с экстршггом

30с 30с

30 с

Смесьзк'стрзгентэн экстракта вводится с помощью шпркпав воду

Рис. 4. Схема определения микотоксинов в зерне, кормах и мясе. (Продолжительность анализа 1,5-2,0 ч.)

В предложенной нами методике девятнадцать микотоксинов извлекали одновременно из зерна и кормов методом (ЗиЕСЫЖЗ. Полученный экстракт делили на три части и проводили дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию, отдельно для афлатоксинов и патулина, охратоксинов и зеараленона, трихотеценовых микотоксинов. Общая схема пробоподготовки представлена на рис. 4.

Степень извлечения микотоксинов оценивали по добавкам двух различных уровней, ее значение варьируется от 48 до 100 % в зависимости от выбранной

матрицы (пшеница, ячмень, кукуруза, шрот рапсовый, жмых рапсовый, комбикорм на зерновой основе, силос). Установлено, что использование микроэкстракции позволило эффективно сконцентрировать микотоксины из экстракта зерна и кормов, в зависимости от условий пробоподготовки для микотоксинов различных классов коэффициент концентрирования составляет 10,6 - 74,6. Нижняя граница определяемых содержаний для микотоксинов в зерне и кормах составляет 0,1 - 40 мкг/кг. Относительное стандартное отклонение не превышает 0,1. Предел обнаружения (cmin) и предел определения (cUm) для микотоксинов определяли по соотношению сигнал : шум = 3:1 и 10:1 соответственно. В табл. 6 представлены аналитические характеристики методики определения микотоксинов в зерне и кормах.

Таблица 2. Аналитические характеристики методики определения девятнадцати микотоксинов в зерне и кормах (и=3; Р= 0,95).

Миктоксин Диапазон линейности, мкгАп t Добавки, мкг/кг К Sr Cmin* мкг/кг. Зерно Cum, мкг/кг. Зерно Cmin* мкг/кг. Корма Cline мкг/кг. Корма

НВЛ 0,05-2,0 0,9955 50,100 6Об 122 0,05 10 20 15 40

ДОН 0,08-2,0 0,9976 50,100 6Ш 11,8 0,09 20 30 20 50

15АДОН 0,08-2,0 0,9945 50,100 57±7 10,9 0,08 20 30 20 50

ЗДДОН 0,08-2,0 0,9940 50,100 56И5 10,7 0,08 20 30 20 50

ФЗХ 0,08-2,0 ода 50,100 58fc4 11,1 0,09 20 30 20 50

ДАС 0,05-2,0 0,9964 50,100 62±8 11<> 0,04 15 25 15 40

НТ-2 0,05-2,0 0,9935 50,100 72±8 13,8 0,05 8 20 10 30

Т-2токсин 0,05-2,0 0,9867 50,100 8ftt5 153 0,05 15 30 10 30

Т-2 триал 0,05-2,0 0,5923 50,100 70t6 13,4 0,04 10 25 25 50

Т-2тетраол 0,05-2,0 0,9897 50,100 71±5 133 0,05 10 20 10 30

НСЛ 0,05-2,0 0,9993 50,100 69ь8 13,1 0,05 10 20 15 40

АфаШ 0,001-0,05 одаз 1Д5,0 80t5 32,6 0,03 0,1 03 1,0 4,0

Афл.В2 0,001-0,05 0,9991 1,0,5,0 75J4 30,6 0,05 0,1 03 13 5,0

Афает 0,001-0,05 0,9989 1Д5,0 6Я4 263 0,08 ОД оз 1,0 4,0

Афл.(32 0,001-0,05 0,9972 1Д5,0 78J=8 31,8 0,03 ОД оз 13 5,0

Охр. А 0,025-0,25 0,9975 1025 91=0 74,6 0,02 1,0 23 2,0 10

OiqiB 0,050,25 0,9964 1025 8St8 69,7 0,05 2,0 5,0 23 15

ЗОН 0,1-1,0 0,9874 50,100 64±8 525 0,09 4,0 10 5,0 20

Пшулин 03-Ю 0,9893 100,200 5214 213 0,07 20 50 40 80

В качестве примера, на рис. 5 представлены хроматограммы экстракта из пшеницы с добавлением микотоксинов. Применение (ЗиЕСЫЖБ и ДЖЖМЭ позволило устранить мешающее влияние матрицы. Результаты определения разных видов кормов и зерна представлены в таблице 3

Рис. 5. Хроматограммы экстракта пшеницы с добавлением мико-токсинов. Определение микотоксинов методами ВЭЖХ - УФ (а), -ФЛД (б) и ГХ-ДЭЗ (в): патулин (50 мкг/ кг) (/), афлатоксинн в2 (5,0 мкг/кг) (2), афлатоксин В2 (5,0 мкг/кг) (3), афлатоксин (5,0 мкг/ кг) (4), афлатоксин В1 (5,0 мкг/кг) (5), охратоксин В (25 мкг/ кг) (6), охратоксин А (25 мкг/кг) (7), зеараленон (50 мкг/кг) (8), Т-2-тетраол (50 мкг/кг) (9), ниваленол (50 мкг/кг) (10), ДОН

(11) (50 мкг/кг), 15АДОН (50 мкг/кг)

(12), ЗАДОН (50 мкг/кг)

(13), неосоланиол (50 мкг/кг) (14), фузаренон X (50 мкг/кг) (15), ДАС (50 мкг/кг) (16), Т-2 триол (50 мкг/кг) (1Т), НТ-2 (50 мкг/кг) (18), Т-2 (50 мкг/кг) (19).

Время, мин

Таблица 3. Результаты определения микотоксинов в зерне и кормах (и=3, Р= 0,95).

Мико-токсин Пшеница Ячмень Кукуруза Шрот рапсовый Жмых рапсовый Комбикорм Силос

НВЛ 160,3±9,8 - - - - - -

ДОН 210,0±14,5 - - 180,1±9,5 210,4±16,8 -

15АДО - - - - - -

ЗАДОН - - - - - 10,4±0,5 -

ФЗХ - - - - - - -

ДАС - - - - - 20,5±1^ -

НТ-2 - - 307,0±5,4 - - - 49,8±5,2

Т-2 19,4±0,9 - 1400±82 13,2±0,65 - - 399,8±19,9

Т-2 триол - - - - - - -

Т-2 тяраол - - - - - - 25,5±1,6

НСЛ - - - - - - -

Афл В1 - 1,1±0,2 - - - - -

Продолжи те табл. 3

Афл В2 - - - 3,6±0,25 - - -

АфлС1 - - - - 17,0±0,8 - -

Афл С2 - - 0,1±0,008 - 0,6±0,04 - 0,1±0,01

Охр А - 41,1±0Д - - - - -

Охр В - - - - - 2,5±0,3 -

ЗОН - 14,2±0,8 - - - - -

Патулин - - - - - - 30,8±2,5

Эг 0,05-0,07 0,04-0,08 0,06-0,08 0,05-0,07 0,05-0,08 0,05-0,09 0,05-0,09

-* не обнаружено

Одновременное определение микотоксинов в мясе и субпродуктах мясных. На сегодняшний день в РФ микотоксины не нормируются в мясе и мясных продуктах, нет утвержденных методик определения исследуемых веществ в данных объектах. Известно, что микотоксины, попадая с кормом в желудочно-кишечный тракт сравнительно быстро обезвреживаются, превращаясь в менее токсичные или нетоксичные соединения. Однако, некоторые микотоксины в зависимости от дозы потребления задерживаются в организме в течение нескольких недель и могут быть обнаружены в тканях животных, получавших загрязненные микроскопическими грибами корма. Разработанная нами методика позволяет извлекать восемнадцать микотоксинов разных классов одновременно из одной навески (2 г) методом (ЗиЕСЬЕЯЗ. Экстракцию образцов проводили с применением 15 мл ацетонитрила, без добавления воды (рис. 4). Экстракт, полученный после данной стадии, делили и проводили ДЖЖМЭ отдельно для разных классов микотоксинов. Степень извлечения данных соединений находится в диапазоне 40-100 %. Предел обнаружения для разных видов матриц изменяется от 2 до 30 мкг/кг. В табл. 4 представлены характеристики методик определения для разных видов мяса и субпродуктов (говядина, свинина, курица печень свиная, почки свиные, селезенка свиная).

Таблица 4. Аналитические характеристики определения микотоксинов в мясе и субпродуктах мясных (и=3; Р— 0,95 )

Микопжеин Диапазон линейно-сщмкг/мл Добавки, мкг/кг л,% К С11111! 5 мкг/кг. Мясо С[~[т > мкг/кг. Мясо С т1п > мкг/кг. Субпродукты Сцт, мкг/кг. Субпродукты

нал 0,08-2,0 0,9955 100200 60±2 123 0,05 20 50 25 65

ДОН 0,1-2,0 0,9976 100200 5&±5 11,9 0,05 20 50 25 60

15АДОН 0,1-2,0 0,9915 юодо 55±8 113 0,08 25 60 30 70

ЗАДОН 0,12,0 0,9940 100200 45ь8 9,2 0,09 25 60 30 70

ФЗХ 0,1-2,0 0,9868 юодо 50±5 10,2 0,05 25 60 30 70

ДАС 0,1-2,0 0,9964 ЮОДО 42±4 8,6 0,04 20 55 25 50

НТ-2 0,08-2,0 0,9935 юодо 67±5 13,7 0,05 15 50 20 50

Т-2 токсин 0,08-2,0 0,9867 100200 7014 14,4 0,02 15 45 20 50

Т-2 триал 0,1-2,0 0,9923 100200 66±6 133 0,04 20 50 25 60

Т-2тираал 0,1-2,0 0,9897 юодо 69ь6 14,1 0,05 20 50 15 35

НСЛ 0,1-2,0 0,9993 100200 6Ш2 123 0,05 20 50 25 60

АфлВ1 0,05-025 одаз 5,0,10 5&ь8 22,1 0,03 2,0 10 10 30

АфлВ2 0,050,25 0,9991 5Д10 56Ь7 213 0,05 Я5 15 8,0 15

Афиет 0,050,25 0,9989 5Д10 55±8 20,9 0,М 2,0 10 10 30

Афл.С2 0,05А,25 0,9972 5,0,10 5&6 213 0,05 2^ 15 10 25

ОхрА 0,05-0,5 0,9975 10-^50 95±8 72,4 0,02 2,0 5,0 4,0 20

Охр. В одед5 0,99« 10;50 89±7 67,8 0,04 4,0 10 8,5 25

ЗОН 0,1-1,0 ода 50;100 54±4 41,1 0,05 5,0 15 15 45

Некоторые хроматограммы экстрактов данных объектов исследования представлены на рис. 6, 7. Установлено присутствие микотоксинов в субпродуктах свиных: обнаружен охратоксина А в печени (5,0 ± 0,1, ^=0,02) и почках (2,5±0,2, ^=0,08), а также афлатоксина В1 в печени свиной (ОД) ±0,007, ^=0,04). Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0,08.

Г\

Время, мин б

1 ;з

V У

Время, мин

Рис. 6. Хроматограмма экстракта мяса свинины без добавления (а) и с добавлением (б) афлатоксинов (25 мкг/кг):02(Д В2 (2), (3), В1 (4).

Время, мин Рис. 7. Хроматограмма экстракта печени свининой без добавления (а) и с добавлением (б): Охратоксина В (50 мкг/кг) (/), Охратоксина А (50 мкг/кг) (2), Зеараленона (100 мкг/кг) (3).

Одновременное определение микотоксинов в молоке и молочных продуктах.

Аналитические характеристики методики определения афлатоксина М1 (метаболита В1) и четырех микотоксинов данного класса (В1, В2, 01, в2) в молоке, кефире и сыре представлены в табл. 5. Афлатоксины извлекали из исследуемых образцов совместно методами ОиЕСЬЕЯЗ и ДЖЖМЭ, с использованием смеси ацетонитрил и вода (10:5). Схема пробоподготовки для молока и молочных продуктов представлена на рис. 8. Афлатоксины удовлетворительно извлекаются из исследуемых объектов, степень извлечения составляет 50-74%. Коэффициент концентрирования в зависимости от определяемого микотоксина варьируется от 36,6 до 39,0. Относительное стандартное отклонение результатов не превышает 0,08. Предел обнаружения для афлатоксинов составил 0,1-0,25 мкг/кг. При извлечении

афлатоксинов из сыра чувствительность снижается, это связано с влиянием матрицы образца.

Таблица 5. Аналитические характеристики определения микотоксинов в молоке и молочных продуктах (л=3; Р = 0,95).

Мико-токсин Диапазон линейности, мкг/мл Добавки, мкг/кг Д,% К (-пйп ' мкг/кг. Жидкие маточные прсаукш мкг/кг Жидкие молочные продукт Спит ми/га . Сыры СЦт, мкг/кг. Сыры

В1 0,01-0,15 0Д1,0 0,9983 65±10 39,0 0,02 0,1 025 0,12 030

В2 0,01-0,15 0Д1,0 0,9991 6Ш 36,6 0,04 0,1 оз 0,15 0,40

а 0,01-0,15 0Д1.0 ода буЬ6 38,4 0,02 0,1 025 0,15 035

(32 0,01-0,15 0,5;1,0 0,9972 6Ш 372 0,04 0,1 025 0,15 035

М1 0,01-0,15 0,5; 1,0 0,9992 624В 37^ 0,02 02 0,4 '025 0,45

Для определения афлатоксинов М1 и В1 в молоке и молочных продуктах рекомендован ГОСТ 30711-2001. Для извлечения афлатоксинов используют жидкостно-жидкостную экстракцию, для очистки экстрактов применяют колонки с силикагелем. Степень извлечения микотоксинов данным способом составляет около 60 %. На пробоподготовку затрачивается около 200 мл растворителей. Продолжительность анализа одной пробы 4-5 ч.

Использование предлагаемого способа определения микотоксинов в молоке позволяет значительно снизить объемы токсичных растворителей и стоимость пробоподготовки (в 15-20 раз).

Схема пробоподготовки молока и молочных продуктов представлена на рис. 8.

Результаты определения пяти афлатоксинов в разных образцах молока и молочной продукции представлены в табл. 6.Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0,08. Продолжительность анализа не более 1,5 ч.

Таблица 6. Результаты определения афлатоксинов в молоке и молочных продуктах (/»= 3; Р= 0,95).

Матрица Найдено, мкг/кг

В1 Эг В2 в2 5г М1 Эг

Молоко с фермы - - - - - - - - 0,10± 0,01 0,1

Кефир «Ополье», 1% - - - - 1 - - - 0,10± 0,005 0,05

Напиток кисломолочный «Тан» 1,8% - - - - - - - - 0,12± 0,007 0,06

Сыр «Российский» 0,67± 0,04 0,06 0,20± 0,02 0,08 - - - - 0,37± 0,04 0,1

Сыр «Дваро» - - - - - - - - 0,31± 0,02 0,06

Сыр «Гауда» - - - - - - 0,27± 0,02 0,07

*- не обнаружено

-О-

ДЖЖМЭ: 400 шел хлор о форма смешивается с 3 млэксгракга

Смесь экстр агента и экстракта вводится с помощью шприпа в 7 мл волы

ижгрифугнровашге

ПТ-1 1мпн I__

Отбор микроширипем нижнето слоя хлороформного экстракта

упаривание в токе азота

Дериватлзация с трпфторуксусной кислотой

Анализ метолом ВЭЖХ - ФЛД. Опрсэк кэше афлхгакснновВ1, В2, С1,С2 нМ1

Рис. 8. Схема пробоподготовки для молока и молочных продуктов при определении афлатоксинов (продолжительность анализа 1-1,5 ч).

На рис. 9 представлена хроматограмма экстракта из молока в отсутствие и присутствии афлатоксинов. Как следует из рисунка, матрица образца после пробоподготовки не влияет на определение афлатоксинов.

! I 1 £ ' « ' I ! ! ; 1 ) 1 " 1 1 Время, мин Время, мин

Рис. 9. Хроматограмма экстракта из молока в отсутствие (а) и присутствии афлатоксинов (0,5 мкг/кг): в2 (7), В2 (2), М1 (3), (4), В1 (5).

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый подход для одновременного извлечения микотоксинов различных классов, основанный на совместном использовании методов (ЗиЕСИЕКЗ и ДЖЖМЭ, позволяющий получить экстракты, компоненты матрицы которой не мешают определению микотоксинов при проведении анализа методами ВЭЖХ-УФ, ФЛД и ГЖХ-ДЭЗ.

2. Определены оптимальные условия проведения пробопоготовки (ЗиЕСЬЕЯЗ для одновременного извлечения микотоксинов различных классов из одной навески зерна и кормов, мяса, молочных продуктов (масса навески, объемы водной и органической фаз, природа и масса буферирующих солей и сорбентов).

3. Показана возможность и установлены оптимальные условия дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции микотоксинов из экстрактов, полученных методом 0иЕСЬЕЯ8. Изучено влияние различных факторов на проведение ДЖЖМЭ (объем и природа экстрагента, объем диспергатора, влияние рН водного раствора, время и скорость центрифугирования, влияние ультразвука). Степень извлечения микотоксинов из пищевых продуктов растительного и животного происхождения при совмещении (ЗиЕСЬЕЯЗ и ДЖЖМЭ составила 40-100 %.

4. Предложены способы одновременного определения девятнадцати микотоксинов в зерне и кормах, восемнадцати микотоксинов в мясе и мясных продуктах, пяти афлатоксинов в молоке и молочных продуктах. Пределы определения для микотоксинов в зерне и кормах составили 0,3 - 80 мкг/кг, для мясной продукции 5-70 мкг/кг, для молока и молочных продуктов 0,25 - 0,45 мкг/кг. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0,1. Показано, что совместное применение методов (ЗиЕСЫЖЗ и ДЖЖМЭ позволяет значительно снизить себестоимость и продолжительность анализа.

5. Оптимизированы условия получения производных афлатоксинов и трихотеценовых микотоксинов при их определении на ВЭЖХ с флуориметрическим

детектором и на ГЖХ с детектором электронного захвата соответственно. Высокая чувствительность определения достигнута оптимизацией условий дериватизации ТТМ с гептафтормасляным ангидридом и афлатоксинов с трифторуксусной кислотой.

6. Экспериментально установлены условия хроматографического разделения девяти микотоксинов различных классов (афлатоксинов, охратоксинов, патулина и зеараленона и одиннадцати микотоксинов класса трихотеценовых типа А и В (дезоксиниваленола, ниваленола, 15-ацетилдезоксиниваленола, 3-

ацетилдезоксиниваленола, фузаренона X, НТ-2, Т-2 токсина, Т-2 триола, Т-2 тетраола, неосоланиола, диацетоксискирпенола).

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

Статьи в журналах из списка ВАК:

1. Карасева Н.М., Амелин В.Г., Третьяков A.B. Одновременное определение микотоксинов ряда трихотеценов, охратоксина А, зеараленона в зерне и продуктах его переработки, кормах и мясе методом газожидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии. 2013. Т. 68. № 1. С. 64-70.

2. Карасева Н.М., Амелин В.Г., Третьяков A.B. Хроматографические методы определения микотоксинов в пищевых продуктах растительного и животного происхождения // Журн. аналит. химии . 2013. Т. 68. № 3. С. 212-223.

3. Карасева Н.М., Амелин В.Г., Третьяков A.B. Сочетание метода QuEChERS с дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракцией и получением производных при определении микотоксинов в зерне и комбикормах газожидкостной хроматографией с детектором по захвату электронов // Журн. аналит. химии . 2013. Т. 68. № 6. С. 612-618.

4. Карасева Н.М., Амелин В.Г., Третьяков A.B. Определение афлатоксинов В1 и Ml в молоке: быстрый и простой способ пробоподготовки // Молочная промышленность. 2013. №9. С. 10-11.

5. Карасева Н.М., Амелин В.Г., Никешина Т.Е. Экспрессный способ определения афлатоксинов В1, В2, Gl, G2 в зерне и кормах // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013. № 3. С. 12-15.

Статьи в научных з/сурналах:

1. Карасева Н.М., Амелин В.Г., Третьяков A.B. Одновременное определение патулина, трихотеценовых микотоксинов и зеараленона в зерне и кормах // Ветеринария сегодня. 2013. №2 (5). С. 25-30.

Тезисы докладов на конференциях:

1. Карасева Н.М. Определение афлатоксинов в зерновых культурах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Материалы XVIII Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». М.: МАКС Пресс. [Электронный ресурс]. 2011.

2. Karaseva N.M., Tretyakov А. V., Amelin V.G. Simultaneous detection of trichothecenes, zearalenone and ochratoxin A in cereals, feed and meat by gas chromatography with electron capture detector // Book of Abstracts 5,h Int. Symp. on Recent Advances in Food Analysis. 2011. P. 294.

3. Карасева Н.М. Совмещение дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции и получения производных микотоксинов при определении их в зерне и кормах методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов // Материалы XIX Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «JIomohocob-2012». М.: МАКС Пресс. [Электронный ресурс]. 2012. С 31.

4. Карасева Н.М. Совместное использование QuEChERS и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции для извлечения и определения десяти микотоксинов разных классов из зерна и кормов при определении микотоксинов в пищевых продуктах животного и растительного происхождения // Химия биологически активных веществ: Межвузовский сборник научных трудов Всероссийской школы -конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием. Саратов: Изд-во "КУБиК". 2012. С. 247.

5. Карасева Н.М. Применение жидкостно-жидкостного микроэкстракционного концентрирования с диспергированием экстрагента для определения микотоксинов НТ-2 и Т-2 в зерне и кормах // Менделеев-2012. Аналитическая химия. VI Всероссийская конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием. Тезисы докладов. СПб.: Изд-во «Соло». 2012. С.72.

6. Карасева Н.М. Определение микотоксинов в кормах и зерне при совместном использовании метода QuEChERS и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции // Современные проблемы химической науки и образования: сб. материалов Всерос. конф. с междунар. участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева: в 2 т. T. I. Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та. 2012. С. 268.

7. Karaseva N.M., Amelin V.G., Tretyakov A.V. Application of dispersive liquid-liquid microextraction and derivatization combined with QuEChERS for the determination of trichothecene mycotoxins in cereal products by capillary gas chromatography with electron-capture detector // Abstract Book 36th ISCC And 9th GC/GC Symposium. Riva del Garda, Italy. 2012. P. 184.

8. Карасева Н.М. Определения десяти микотоксинов различных классов в зерне и кормах из одной навески // Материалы XX Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». М.: МАКС Пресс. [Электронный ресурс]. 2013.

9. Карасева Н.М., Амелин В.Г, Третьяков A.B. Одновременное определение афлатоксинов, охратоксина А, зеараленона и патулина в зерне и кормах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Материалы сезонной научной школы в области аналитической хроматографии и капиллярного электрофореза. Краснодар.: «ОфисАльянс». 2013. С. 80.

10. Karaseva N.M., Amelin. V.G., Tretaykov A.V. Combination QuEChERS, dispersion liquid-liquid microextraction and HPLC with fluorescence detection for simultaneous extraction and determination of eight mycotoxins in cereal and feed // Abstract Book 19th International Symposium on Separation Sciences New Achievements In Chromatography Porec.Croatia.[Электронный ресурс]. 2013.

Методические рекомендации:

Карасева Н.М., Амелин В.Г., Третьяков A.B. Методические рекомендации по определению трихотеценовых микотоксинов (ниваленол, дезоксиниваленол, НТ-2 и Т-2) в кормах и зерне методом газожидкостной хроматографии. Владимир: ФГБУ ВНИИЗЖ:14 с. Утв. 26.06.12.

Автор выражает глубокую благодарность кандидату химических наук Алексею Викторовичу Третьякову, заведующему лабораторией химического анализа Федерального центра охраны здоровья животных, за предоставленную возможность использования аналитического оборудования и коллекции стандартных образцов микотоксинов, а также за помощь в обсуждении результатов работы и подготовке диссертации.

Подписано к печати 18.11.2013 года. Формат 60x108 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 120 экз. Заказ № 267-Т

Отпечатано в типографии СГУ Саратов, Большая Казачья 112-а Тел. (8452) 27-33-85

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых»

Авдеева Надежда Михайловна

ПРОБОПОДГОТОВКА (¿иБСИЕ!^ И ДИСПЕРСИОННАЯ ЖИДКОСТНО-ЖИДКОСТНАЯ МИКРОЭКСТРАКЦИЯ ПРИ ОДНОВРЕМЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ МИКОТОКСИНОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

высшего профессионального образования «Владимирский государственный университет

04201365727

На правах рукописи

02.00.02 - аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Амелин В. Г.

Владимир - 2013

Работа выполнена

на кафедре химии ФГБОУ ВПО «Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых».

Список сокращений

ТТМ - Трихотеценовые микотоксины

ДОН - Дезоксиниваленол

ЗАДОН - 3-ацетилдезоксиниваленол

15 АД ОН - 15-ацетилдезоксиниваленол

НВЛ - Ниваленол

ФЗХ - Фузаренон X

ДАС - Диацетоксискирпенол

НСЛ - Неосоланиол

ЗОН - Зеараленон

ТФА - Трифторуксусный ангидрид

ТФУК - Трифторуксусная кислота

ГФМА - Гептафтормасляный ангидрид

ПФПА - Пентафторпропионовый ангидрид

ГХ - Газовая хроматография

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография

СВЭЖХ - Сверхскоростная высокоэффективная жидкостная

- хроматография

ДМД - Диодно-матричный детектор

ФЛД - Флуориметрический детектор

ДЭЗ - Детектор электронного захвата

ПИД - Пламенно - ионизационный детектор

МС - Масс-спектрометрическое детектирование

НЖФ - Неподвижная жидкая фаза

ПФ - Подвижная фаза

ТФМЭ - Твердофазная микроэкстракция

ЖЖЭ - Жидкостно-жидкостная экстракция

ДЖЖМЭ - Дисперсионная жидкостно-жидкостная

- микроэкстракция

СТФЭ - Сверхскоростная твердофазная экстракция

ТФЭ - Твердофазная экстракция

МДУ Максимально-допустимый уровень

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).................................................11

1.1. Краткая характеристика микотоксинов........................................................11

1.2. Способы пробоподготовки при определении микотоксинов.....................17

1.3. Хроматографические методы определения микотоксинов различных

классов.....................................................................................................................22

1.4. Способы одновременного определения микотоксинов..............................34

1.5. Возможные трудности при определении микотоксинов...........................36

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)..................................................................38

2.1. Реактивы и материалы....................................................................................38

2.2. Аппаратура.......................................................................................................39

2.3. Вспомогательное оборудование....................................................................40

2.4. Методики извлечения двадцати микотоксинов различных классов из

одной навески образцов зерна, кормов и продуктов питания...........................40

2.5. Хроматографическое разделение и определение микотоксинов...............43

ГЛАВА 3. ВЫБОР УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ МИКОТОКСИНОВ...................44

3.1. Условия разделения афлатоксинов, охратоксинов, патулина

и зеараленона..........................................................................................................45

3.2. Условия разделения трихотеценовых микотоксинов.................................56

3.3. Резюме к главе 3..............................................................................................62

ГЛАВА 4. ПРОБОПОДГОТОВКА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНЕ, КОРМАХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ.... 63

4.1.Выбор условий С*иЕСЬЕ118 для одновременного извлечения микотоксинов

из одной навески....................................................................................................63

4.2. Выбор условий ДЖЖМЭ для извлечения микотоксинов...........................67

4.3. Резюме к главе 4..............................................................................................73

ГЛАВА 5. СПОСОБЫ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНЕ, КОРМАХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ ИЗ

ОДНОЙ НАВЕСКИ................................................................................................74

5.1.Одновременное определение микотоксинов в зерне и кормах...................74

5.2. Одновременное определение микотоксинов в мясе и субпродуктах мясных.....................................................................................................................82

5.3. Одновременное определение микотоксинов в молоке и молочных продуктах................................................................................................................87

5.4. Резюме к главе 5..............................................................................................93

ВЫВОДЫ..................................................................................................................94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................96

ПРИЛОЖЕНИЕ.....................................................................................................ИЗ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Микотоксины - вторичные метаболиты жизнедеятельности микроскопических плесневых грибов - загрязняют пищевые продукты растительного, животного происхождения и могут нанести серьезный урон здоровью как животных, так и человека. На сегодняшний день известно более 450 микотоксинов. Все микотоксины разделяются на несколько классов и отличаются по своим свойствам и строению, что приводит к трудностям их одновременного определения. Существующие в РФ ГОСТ и МУК для определения единичных микотоксинов или отдельных классов в продуктах растительного и животного происхождения основаны на использовании хроматографических методов анализа: ТСХ, ВЭЖХ с флуориметрическим или УФ - детекторами, ГЖХ с детектором по захвату электронов. Для извлечения микотоксинов из анализируемых объектов в основном используют жидкостно-жидкостную экстракцию. Для очистки экстрактов от соэкстрагируемых веществ (белки, жиры, липиды, стеролы, полярные органические кислоты, каротиноиды, хлорофилл) используют твердофазную экстракцию и коммерческие иммуноаффинные колонки для избирательного извлечения микотоксинов (одного или определенного класса). Обычно данные методики длительны (пробоподготовка может занимать от 3 до 5 ч), трудоемки, требуют больших количеств токсичных органических растворителей и дорогостоящих одноразовых иммуноаффинных колонок.

В последнее время для извлечения микотоксинов и определения их методами ГЖХ(ВЭЖХ)-МС/МС используют пробоподготовку по QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Однако при такой пробоподготовке определение микотоксинов более доступными хроматографическими методами с флуориметрическим, УФ - и электронно-захватным детекторами затруднено в связи с недостаточной очисткой экстрактов.

Цель данной работы: разработка экспрессного комбинированного способа одновременного определения микотоксинов различных классов в продуктах растительного и животного происхождения, совмещающего пробоподготовку С>иЕСЬЕ118 и дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию с хроматографическим определением.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

•Установить возможность комбинации методов пробоподготовки РиЕСЬЕЯ8 и дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции для одновременного извлечения микотоксинов различных классов из одной навески зерна, кормов и продуктов питания.

•Оптимизировать условия пробоподготовки для получения высокой чистоты экстрактов из различных матриц, необходимой при анализе, хроматографическими методам (ВЭЖХ - УФ, ФЛД; ГХ-ДЭЗ).

•Установить оптимальные условия получения производных афлатоксинов и трихотеценовых микотоксинов, хроматографического разделения данных соединений, а также охратоксинов, зеараленона и патулина.

• Разработать методики определения микотоксинов различных классов в зерне, кормах и продуктах питания.

Научная новизна. Установлена возможность одновременного извлечения исследуемых микотоксинов (афлатоксинов М1, В1, В2, 01, С2\ трихотеценовых типа А: Т-2 токсина, НТ-2 токсина, Т-2-тетраол токсина, Т-2-триол токсина, неосоланиола, диацетоксискирпенола; трихотеценовых типа В: дезоксиниваленола, ниваленола, 15-ацетилдезоксиниваленола, 3-ацетилдезоксиниваленола, фузаренона X; охратоксина А и охратоксина В; зеараленона; патулина) из зерна, кормов и продуктов питания с использованием пробоподготовки С)иЕСЬЕ118.

Предложен способ ДЖЖМЭ для дополнительной очистки и избирательного извлечения микотоксинов разных классов (афлатоксинов, трихотеценовых микотоксинов, зеараленона и патулина) из экстракта,

полученного после (^иЕСИЕКЗ. Исследовано и оценено влияние различных факторов на условия приготовления образцов при совместном использовании ОиЕСЬЕБ^ и ДЖЖМЭ.

Практическая значимость.

Предложен способ одновременного извлечения двадцати микотоксинов разных классов из одной навески образцов зерна, кормов, пищевых продуктов с использованием пробоподготовки С>иЕСНЕ118 и дополнительного избирательного извлечения из экстракта методом ДЖЖМЭ отдельных групп микотоксинов: афлатоксинов и патулина, трихотеценовых микотоксинов типа А и В, охратоксинов и зеараленона.

1. Разработан способ определения микотоксинов в продуктах растительного и животного происхождения, включающий пробоподготовку РиЕСЬЕЯ8, ДЖЖМЭ и последующее определение в экстракте:

- пяти афлатоксинов, двух охратоксинов, зеараленона методом ВЭЖХ с флуориметическим детектированием;

- патулина методом ВЭЖХ с УФ детектированием;

- одиннадцати трихотеценовых микотоксинов методом газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата.

Применение данного способа извлечения позволило снизить время анализа, сократить объемы токсичных растворителей, а также снизить себестоимость анализа за счет использования малых количеств насыпных сорбентов и растворителей. Предложенные методики проверены на реальных образцах зерна, кормов и пищевых продуктов. Продолжительность анализа составила 1,5-2 ч.

На защиту выносится:

Новый способ одновременного извлечения микотоксинов различных классов, основанный на совмещение методов пробоподготовки РиЕСЬЕЯЗ и ДЖЖМЭ.

Результаты по оптимизации условий экстракции и очистки экстракта при совместном использовании методов РиЕСЬЕЯ8 и ДЖЖМЭ из одной навески

зерна, кормов и продуктов питания для определения двадцати микотокисинов (афлатоксинов Ml, Bl, В2, Gl, G2; трихотеценовых: Т-2 токсина, НТ-2 токсина, T-2-тетраол токсина, T-2-триол токсина, неосоланиола, диацетоксискирпенола, дезоксиниваленола, ниваленола, 15-

ацетилдезоксиниваленола, 3-ацетилдезоксиниваленола, фузаренона X; охратоксинов А и В; зеараленона; патулина).

Оптимальные условия получения производных афлатоксинов и трихотеценовых микотоксинов, селективного и эффективного разделения микотоксинов различных классов хроматографическими методами с различными детекторами.

Результаты валидации методик и определения микотоксинов различных классов в реальных образцах зерна, кормов и продуктах питания.

Личный вклад автора заключался в проведении экспериментальных исследований по получению производных микотоксинов; в установлении оптимальных условий хроматографического разделения и определения микотоксинов различных классов; в разработке способов извлечения и очистки экстрактов микотоксинов из зерна, кормов и различных продуктов питания; в интерпретации результатов эксперимента, формулировании научных положений и выводов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на следующих конференциях и симпозиумах: Международной молодежной научной конференции «ЛОМОНОСОВА 11, 2012, 2013» (Москва, МГУ), Международной конференции 5th International Symposiumon Recent Advancesin Food Analysis, 2011 г. (Прага, Чехия), Всероссийской школе -конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, 2012 г (Саратов), VI Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием, «Менделеев - 2012» 2012 г. (Санкт-Петербург, СПбГУ), Всероссийской конференции с международным участием, посвящённой 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева, 2012 г. (Чебоксары), Международной конференции 36th International Symposiumon

Capillary Chromatography, 2012 г. (г. Рива дель Гардо, Италия), Всероссийской

конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез»

th

(Краснодар, 2013), Международной конференции 19 International Symposium on Separation Sciences. New Achievements In Chromatography, 2013 г. (Пореч, Хорватия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, 6 статей (из них 5 статей опубликованы в журналах из списка ВАК), 10 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, включая введение, 5 глав, выводы, список литературы (146 источников) и одно приложение. Работа содержит 30 рисунков и 13 таблиц.

ГЛАВА 1. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Краткая характеристика микотоксинов

Наиболее опасными токсичными веществами, встречающимися в продуктах питания, являются микотоксины - вторичные метаболиты микроскопических плесневелых грибов [1, 2]. Предотвратить загрязнение продуктов питания микотоксинами практически невозможно, поэтому необходим строгий контроль данных веществ в пищевых продуктах растительного и животного происхождения. В настоящее время в большинстве стран установлены максимально допустимые уровни для ряда микотоксинов в продуктах питания и кормах, превышение которых ведет к серьезным заболеваниям человека и животных.

Известно около 250 видов микроскопических плесневелых грибов, которые продуцируют более 450 токсичных метаболитов - микотоксинов [1, 3]. Данные вещества очень разнообразны, отличаются по своему строению и свойствам. Строение некоторых основных групп микотоксинов представлено в табл. 1.

Таблица 1. Строение некоторых микотоксинов.

Афлатоксины

О О Афлатоксин В1: Я=Н Афлатоксин В2: Я=Н, положение 8 и 9 гидрированы Афлатоксин М1: Я=ОН

1 9 'в О О ^^ ОСН3

О О ЛА Афлатоксин С1 Афлатоксин С2: положения 9 и 10 гидрированы

1 \ 8 / О 5 |

Трихотеценовые микотоксины

Тип А

Токсин Т-2: Я^ОН, Я2=Я3= ОСОСНз, Я4=Н, Я5=ОСОСН2СН(СН3)2 Т-2-Тетраол: Я^ОН, Я2=ОН, Я3=

ОН, Я5=ОН

Т-2-Триол:Я!=ОН, Я2=ОН Я3=

ОН, ЯгН, Я5= ОСОСН2СН(СН3)2

Токсин НТ-2: Я1=Я2=ОН, Я3=

ОСОСНз, И4=Н, Я5=ОСОСН2СН(СН3)2

Триходермол : Я]=Н, Я2= ОН,

Я3=Н, Я4=Н, Я5=Н

Триходермин. Я,=Н, Я2=ОСОСН3

Я3=Н, Я4=Н, Я5=Н

Веррукарол: Я1=Н, Я2=ОН

Я3=ОН, Я4=Н, я5=н

Скирпентриол : Я]=ОН, Я2=ОН Я3=ОН, Яд=Н, я5=н

Моноацетоксискирпенол:

Я!=ОН, Я2=ОН, Я3= ОСОСНз, ЯгН,

я5=н

Диацетоксискирпенол: Я1= ОН,

Я2=ОСОСН3, Я3= ОСОСН3, Я4=Н, Я5=Н 7,8-

Дигидроксидиацетоксискирпенол:

Я^ОН, Я2=ОСОСН3; Яз= ОСОСНз, Я4=ОН, Я5=ОН

Неосоланеол: Я1=ОН,

Я2=ОСОСН3 Я3= ОСОСНз, Ь*4=Н,

Я5=ОН

н н н

НзС

----Ri

----H

Тип В

Ниваленол: Ri=R2=R3=R4=OH Дезоксиниваленол : Ri=R3=R4=OH, R2=H

З-Ацетилдезоксиниваленол: Rr ОСОСН3, R2=H, R3=R4=OH

15-Ацетилдезоксиниваленол: R!=R4=OH, R2=H, R3=OCOCH3

Фузаренон X: R!=R3=R4= OH, R2=OCOCH3

Трихотеколон: Ri= H, R2=OH, R3=Rt=H

Трихотецин: R¡= H, R2=OCOCH2CH(CH3)2, R3=R4=H

Охратоксины

Os OR

Охратоксин A: Ri=H, Ri=Cl Охратоксин В: Ri=H, Ri=H Охратоксин С: Ri=Cl, Ri=C2H5

Патулин

Зеараленон

Фумонизины

ФуманизинА1: Ri= ОН,

R2=OH, R3=COCH3, R4=CH3

Фуманизин А2: R^ H, R2=H, R3=COCH3, R4=CH3

Фуманизин Bl: R\= OH, R2=OH, R3=H, R4=CH3

Фуманизин B2: Rj= H, R2=OH, R3=H, R4=CH3

Фуманизин B3: Rj= OH,

r2=h, r3=h, R4=ch3

Фуманизин B4: R{= H, R2=H, R3=H, R4=CH3

Фуманизин Cl: R|= OH, R2=OH, R3=H, R4=H

Фуманизин C2: Rt= OH, R2=H, R3=H, R4=H

Фуманизин C3: Rj= H, R2=H, R3=H, R4=H

Стегмацистин

4,

о

сн3

Цитрин

Контаминируют данные вещества продукты растительного происхождения: зерновые, фрукты и травы, которые в свою очередь могут поступать в виде корма для животных. В связи с этим микотоксины могут оказаться в молоке, мясе и яйцах этих животных.

Плесневелые грибы могут образоваться и при неправильном хранении кормов, а также выделять микотоксины еще во время роста растений. Для их развития большую роль играют температура и влажность, причем в разных странах, в зависимости от климата, распространены разные микотоксины.

Так, в странах с влажным, жарким или теплым климатом чаще встречаются афлатоксины [4, 5], в умеренном климате Европы, Америки и Азии - трихотеценовые микотоксины [6] .

Употребление в пищу продуктов, загрязненных микотоксинами, негативно влияет на здоровье человека и животных. Они могут вызывать целый ряд серьезных заболеваний: проявляют канцерогенные, мутагенные, иммунодепрессивные, эстрогенные, тератогенные, дерматоксические и другие свойства [1].

Среди множества микотоксинов выделяют несколько классов наиболее распространенных и опасных: трихотеценовые микотоксины, афлатоксины, охратоксины, патулин, зеараленон. Максимально допустимые уровни (МДУ) микотоксинов в продуктах питания и кормах, установленные в РФ, представлены в табл. 2 [7,8].

Таблица 2. МДУ микотоксинов в пищевых продуктах и кормах.

Субстрат Микотоксин МДУ, мг/кг

Афлатоксин В1 0,005

Дезоксиниваленол 0,7 (для ячменя) 1,0 (для пшеницы)

Зерно, мука, крупа Т-2 токсин 1,0 (зерно пшеницы, ячменя) 0,1 (для круп и муки)

Зеараленон 1,0 (для пшеницы, ржи) 0,1 (для кукурузы)

Афлатоксин В1 0,002

Дезоксиниваленол 1,0

Зерно фуражное Т-2 токсин 0,06

Зеараленон 0,1

Охратоксин А 0,005

Афлатоксин В1 0,002 (арихисовый шрот) 0,05 (подсолнечный ш�