Использование метода фотодинамического воздействия на клетки в биолюминесцентном определении микроорганизмов и фотостерилизации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правахрукописи

Пометун Евгений Владимирович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ФОТОСТЕРИЛИЗАЦИИ

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Савицкий А.П. доктор химических наук, профессор Угарова Н.Н..

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Чухрай Е.С. кандидат биологических наук Никандров В.В.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится «2/У» мая 2005 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «¿Цл апреля 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

Г,

С си *

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Первичным процессом фотобиологических реакций является поглощение света молекулами вещества. В большинстве случаев эти молекулы представляют собой биологический субстрат, который сам претерпевает дальнейшие фотохимические изменения. В некоторых случаях в качестве первичных акцепторов световой энергии выступают вещества, которые передают эту энергию на другие молекулы, а сами при этом обычно не претерпевают химических превращений. Такие вещества называют фотосенсибилизаторами, а процессы, в которых они участвуют, - фотосенсибилизационными. В качестве сенсибилизатора в клетках могут выступать как естественные метаболиты - хлорофилл, флавины, порфирины, билирубин (эндогенные сенсибилизаторы), так и широкий круг попадающих в клетки экзогенных веществ -акцепторов видимого света (красители, ароматические углеводороды). Частным случаем фотосенсибилизированных процессов является фотоповреждение биологических систем в присутствии сенсибилизаторов с участием молекулярного кислорода - так называемое фотодинамическое действие.

В последние годы возрос интерес исследователей к фотодинамическому повреждению бактериальных клеток - фото динамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ). В основном это связано с необходимостью поиска новых путей стерилизации зараженных объектов и лечения микробных инфекций из-за быстрых эволюционных изменений в природе, приводящих к появлению широкого разнообразия антибиотико-устойчивых патогенных штаммов.

Из литературы также известно, что основной мишенью фотодинамического повреждающего действия, как правило, является клеточная мембрана (По Т. ЗШШа Ыоркуя., 1983. 94:р. 1 - б), что влияет на ее проницаемость. Это позволило предположить, что данное явление может быть использовано в методе биолюминесцентного определения концентрации клеток в качестве альтернативного пути экстракции внутриклеточного АТФ для увеличения его чувствительности и точности. Дело в том, что при определении концентрации АТФ биолюминесцентным методом, микробные клетки предварительно разрушают для высвобождения внутриклеточного АТФ, используя различные экстрагенты: кислоты, растворители или поверхностно-активные вещества. Светляковая люцифераза, используемая в биолюминесцентном анализе АТФ, довольно сильно ингибируется такими экстрагентами. Для уменьшения ингибирующего действия образец приходится разбавлять. Следует также учитывать, что наибольшая эффективность разрушения клеточной мембраны достигается при высоком отношении объема экстрагента к объему пробы, что, естественно, сильно уменьшает концентрацию АТФ в образце. Эти обстоятельства приводят к снижению чувствительности метода. Кроме того, метод биолюминесцентной АТФ-метрии позволяет количественно определить в первую очередь общую зараженность образца, но не зараженность определенным видом микроорганизмов. Определение же специфической

обсемененности на фоне общей микробной зараженности объекта требует дополнительные подходы, приводящие к существенному усложнению методик. Сенсибилизаторы различного строения могут по-разному взаимодействовать с микроорганизмами с различным строением клеточной стенки {Malik Z, et. al J. of Photochem. and Photobiol, 1990. 5: p. 281 - 293). Это открывает перспективу селективного определения и стерилизации бактерий одного типа на фоне других. Таким образом, выявление особенностей фото динамического воздействия различных сенсибилизаторов на клетки микроорганизмов с разным строением клеточной стенки является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования.

> изучение процесса вытекания АТФ из дрожжевых и Грам-отрицательных клеток в зависимости от разных факторов в свете выяснение возможности использования данного явления как альтернативного метода экстракции внутриклеточного АТФ в биолюминесцентной АТФ-метрии;

> проведение сравнительной характеристики некоторых фотоагентов по их влиянию на жизнеспособность Грам-отрицательных и Грам-положительных микроорганизмов в свете применения фотодинамического воздействия как способа стерилизации зараженных микробами объектов.

Научная новизна. Впервые был выявлен и изучен эффект вытекания внутриклеточного АТФ при действии димигина на дрожжевые клетки и мезо-тетра(4-К-метил-пиридил)порфина (ТМРуР) на E.coli. Установлено, что данный эффект зависит от: типа микроорганизма, химического строения фотоагента, рН суспензии клеток и природы буферного раствора. Причем оптимальные условия для дрожжей и Е. coli сильно отличаются. Получены зависимости концентрации вытекшего АТФ от: времени темновой предынкубации клеток с фотоагентом, концентрации сенсибилизатора, от дозы и мощности источника света. Показано преимущество нового подхода: повышение чувствительности более, чем в 2 раза. Были найдены минимальные концентрации метиленового синего (MB), толуидинового синего О (ТВО) и ТМРуР, достаточные для полного подавления жизнеспособности L. monocytogenes и E.coli 0157 Н7 при облучении красным светом. Показано, что производные порфирина обладают гораздо более высокой фотодеструктивной активностью по сравнению с фенотиазиниевыми красителями.

Практическая значимость работы. 1) Предложен новый метод экстракции АТФ из клеток при биолюминесцентном анализе их количества, позволяющий увеличить чувствительность метода. 2) Показана возможность определять дрожжевые клетки на фоне Грам-отрицательных. 3) Показано, что клетки Е. coli, несущие ген люциферазы можно использовать для быстрого и сравнительно дешевого скрининга потенциальных фотосенсибилизаторов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях: международной конференции "Биокатализ-2000" (Москва, 2000); 11-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (США, 2000); конференции молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В. Березина "Инженерная энзимология", посвященной 80-летию И.В. Березина (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 206 ссылок. Работа изложена на 138 страницах, содержит 1 схему, 32 рисунка и 16 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали АТФ-реагент ИММОЛЮМ (Хим. ф-т МГУ им. М.В.Ломоносова), содержащий иммобилизованную люциферазу светляков, D-люциферин, MgCh, компоненты буферной системы, стабилизаторы; АТФ-реагент LL (Хим. ф-т МГУ им. М.В.Ломоносова), содержащий растворимую рекомбинантную люциферазу светляков, D-люциферин, MgCh, компоненты буферной системы, стабилизаторы; динатриевую соль аденозин-5'-трифосфорной кислоты (АТФ) ("Reanal", Венгрия); 10 мМ HEPES-буфер, содержащий 150 мМ NaCl, 0,6 мМ КС1, 10 мМ MgSO4 и 0,2%-ную глюкозу, приготовленный из солей марки о.с.ч. ("Sigma", США) и глюкозы х.ч. ("Реахим", Россия); 0,01 М фосфатный буферный раствор (PBS), содержащий 0,138 М NaCl и 0,0027 М К.С1, приготовленный из хлоридов марки о.с.ч. ("Sigma", США) и перекристаллизованных фосфатов марки х.ч. ("Реахим", Россия); жидкую питательную среду Лурия-Бертани (LB), содержащую 5 г/л дрожжевого экстракта ("Difko", США), 10 г/л бакто-триптона ("Sigma", США) и 10 г/л NaCl марки о.с.ч. ("Sigma", США);_готовую агаризованную питательную cpeдy_VRB-Agaг ("Merck", Германия); ампициллин ("Sigma", США); полимиксин В-сульфат ("Sigma", США); свежеперегнанный ДМСО (ЗАО "Росфарм", Россия); 96-луночные планшеты ("Nalge Nunc International", США).

Все растворы готовили на деионизированной воде, полученной на установке Milli-Q ("Millipore", Франция). Питательные среды и буферный раствор PBS стерилизовали автоклавированием (30 мин, 0,5 ати). Стерилизацию буферного раствора HEPES осуществляли путем его фильтрования через мембранные нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,22 мкм ("Millipore", Франция).

Объектами исследования были: микробные клетки Е. coli O157:H7 ATCC 43889 (Университет г. Гвелф, Канада); Е. coli LE 392 (Хим. ф-т МГУ им. М.В. Ломоносова); Е. coli, несущие плазмиду PLR с геном люциферазы светляков (Хим. ф-т МГУ им. М.В. Ломоносова); L monocytogenes Lm 353 (Университет г. Гвелф, Канада); Saccharomyces cerevisiae (Институт

биохимии им. А.Н.Баха РАН); фотосенсибилизаторы димигин (2,4-ди(ос-метоксиэтил)дейтеропорфирин - IX) (Институт биомедицинской химии РАМН); метиленовый синий (MB) и толуидиновый синий О (ТВО) ("Sigma", США); тозилат мезо-тетра(4л-метил-пиридил)порфина (ТМРуР) ("Sigma", США и Институт биомедицинской химии РАМН); хлорид мезо-тетра(4-К-гидроксиэтил-пиридил)порфина (TEtOHPyP) (Институт биомедицинской химии РАМН); хлорид окта-4,5-карбо-(2-оксиэтил-триметиламмоний)фталоцианина оксиалюминия (РсАЮН) (ГНЦ РФ НИОПИК).

Получение и очистка биомассы. Музейные культуры пересевали с косяков в питательные среды LB или BHI и инкубировали 10 - 12 ч. при 30 - 37°С и 120 об./мин. Ночные культуры клеток разбавляли питательной средой того же состава до достижения их концентрации 103 - 107 КОЕ/мл или проводили пересев полученных бульонных культур в свежую питательную среду при соотношении объемов: "бульонная культура : свежая среда" - 1:5 и продолжали инкубировать в тех же условиях в течение 2 - 4 ч. Титр клеток устанавливали спектрофотометрически при длине волны 600 нм. Затем клетки отмывали соответствующим поставленной задаче буферным раствором от питательной среды путем двукратного центрифугирования (4500 об./мин, 10 мин), на центрифуге Centrifuge 5415 ("Eppendorf, Германия). Все манипуляции с микроорганизмами проводили в ламинарных шкафах S/N 22213 - 1833, Class IIA/B3 ("Thermo", США) (при работе с патогенными штаммами бактерий L monocytogenes Lm 353 и Е. coli O157:H7 ATCC 43889) и GS ("Babcock", Германия) (в случае всех остальных). Культивирование микроорганизмов проводили в термостатируемой качалке Certomat ("B.Braun", Германия).

Измерение концентрации АТФ проводили либо методом внутреннего стандарта (реагент ИММОЛЮМ), либо методом градуировочного графика (реагент LL). В первом случае в кювету люминометра вносили 150 мкл реагента и измеряли фоновый сигнал //. Затем добавляли 50 мкл образца и измеряли сигнал образца h. Добавляли 10 мкл раствора АТФ-стандарта, встряхивали и измеряли сигнал /*. Концентрацию АТФ ([АТФ], мкМ) рассчитывали по формуле: [АТФ], мкМ = = К*(/г - I/)/(l2 - /j), где К = 0,19 (для внешнего АТФ) и 1,9 (для общего АТФ). Во втором случае в кювету люминометра вносили 90 мкл реагента и измеряли фоновый сигнал. Добавляли 10 мкл раствора АТФ известной концентрации и регистрировали интенсивность биолюминесценции. Разность между измеренным и фоновым сигналом которая характеризует биолюминесценцию измеряемого раствора и пропорциональна [АТФ]. Интенсивность биолюминесценции регистрировали на люминометрах 1250 ("LKB Wallac", Финляндия), model 355Oi ("New Horizons", США) и Femtomaster FB 12 ("Bertold Detection System GmbH", Германия).

Определение КОЕ/мл проводили по стандартным методикам путем посева на чашках Петри с агаризованной средой.

Облучение клеточных суспензий, помещенных в ячейки 96-луночного планшета (по 200 мкл), проводили либо с помощью собранной нами установки, состоящей из реостата, лампы накаливания (белый свет), водяного фильтра и оптоволоконных жгутов, подведенных непосредственно к облучаемой поверхности (мощность варьировали в диапазоне 0 - 17'мВт); либо при помощи мультидиодной лампы, излучающей свет с длинной волны 660 нм и удельной мощностью 7,6 мВт/см2 (Университет г. Гвелф, Канада) на расстоянии от поверхности облучаемых образцов 1,8 см. Площадь облучаемой поверхности ячейки составляла 25 мм2.

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре UV-150-02 ("Shimadzu", Япония), JJH измеряли на рН-метре МР 220 ("Mettler", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУ5ВДЕНИЕ

1. Вытекание внутриклеточного АТФ из клеток Saccharomyces cerevisiae и Е. coli LE 392 при фотодинамическом воздействии на них 1.1. Влияние условий фотодинамического воздействия на процесс вытекания АТФ из клеток

Облучение образцов, не содержавших сенсибилизатора. В начале работы было необходимо проверить, насколько воздействие света в отсутствие сенсибилизатора влияет на содержание внеклеточного АТФ в исследуемых образцах клеток. Для этого был проведен ряд экспериментов, в которых облучению подвергали суспензии клеток S. cerevisiae и Е. coli LE 392, не содержащих фотосенсибилизатора. Облучение клеточных суспензий, не содержащих красителей не приводило к заметному изменению концентрации АТФ во внеклеточной среде вне зависимости от дозы облучения. Таким образом, в отсутствие сенсибилизатора вытекание внутриклеточного АТФ из исследуемых клеток не происходит, и облучение само по себе не оказывает влияния на уровень содержания свободного АТФ в образцах.

Длительность темновой инкубации с фотосенсибилизатором. Одним из существенных факторов, влияющих на фотодеструкцию клеток, является длительность темновой инкубации их с фотосенсибилизатором. Мы предположили, что этот параметр может также влиять и на концентрацию вытекающего из клеток АТФ. Для выяснения влияния данного фактора на концентрацию внеклеточного АТФ был проведен ряд экспериментов, в которых облучению подвергались образцы клеток дрожжей и Е. coli, предварительно инкубированные с фотосенсибилизатором в течение 0-115 минут (рис. 1 и 2).

Для Грам-отрицательных клеток Е. coli LE 392 в качестве фотосенсибилизаторов были использованы производные порфирина и фталоцианина: димигин, ТМРуР, TEtOHPyP и РсАЮН. Было установлено, что в широком диапазоне световых доз и времен темновой предынкубации облучение образцов, содержащих димигин, TEtOHPyP и РсАЮН не вызывало заметного

увеличения концентрации АТФ во внеклеточной среде. Вытекание АТФ из клеток Е. coli при фотодинамическом воздействии наблюдали только в присутствии ТМРуР (рис. 1). В то же время не оказывавший фотовоздействия на Е. coli димигин вызывал вытекание АТФ из облученных дрожжевых клеток.

Рис. 1. Зависимость концентрации вытекшего АТФ из клеток Е. coli при фотовоздействии от времени предынкубации с ТМРуР. Доза = 10,2 Дж; концентрация [ТМРуР] = 73,34 мкМ; буферный раствор - HEPES (рН 7,2).

Рис. 2. Зависимость концентрации вытекшего АТФ из клеток дрожжей при фотовоздействии от времени инкубации с димигином в темноте. Доза = 10,2 Дж; концентрация димигина =74,55 мкМ; буферный раствор - HEPES (рН 7,2).

Зависимости, представленные на рис. 1 и 2, имеют схожий характер. В случае, когда клетки инкубировали с фотосенсибилизатором в темноте непродолжительное время, последующее облучение не приводило к заметному изменению концентрации АТФ во внеклеточной среде. При

более длительной предынкубации концентрация АТФ, вытекшего в результате фотовоздействия, росла линейно с увеличением времени инкубации, достигала стационара и далее уменьшалась.

Рост концентрации вытекшего АТФ с увеличением длительности темновой предынкубации

можно объяснить тем, что адсорбционное равновесие сенсибилизат0р(р.р) ^ сенсибилизатор^етка) достигается не мгновенно, а требует некоторого времени. При достижении этого равновесия фотодинамический эффект сохраняется постоянным, а дальнейшее его падение, скорее всего, связано с более глубоким повреждением клеток, при котором значительная их часть высвобождает АТФ-гидролизующие ферменты.

Таким образом, было установлено, что наибольшее увеличение концентрации внеклеточного АТФ в результате фотодинамического воздействия димигина на дрожжевые клетки и ТМРуР на Е. coli достигается после предварительной инкубации клеток с фотоагентом в темноте в течение 55 -80 минут (для S. cerevisiae) и 45 - 65 минут (в случае Е. coli LE 392).

Природа буферного раствора и рН среды. Химический состав среды, в которой суспендированы клетки во время облучения, может оказывать существенное влияние на эффективность фотодинамического воздействия. В ряде экспериментов образцы суспендировали в растворах различного состава: в питательной среде Лурия-Бертани (LB), в 10 мМ буферном растворе HEPES и в 0,01 М фосфатном буфере (PBS) (рис. 3).

Когда в роли реакционной среды выступала питательная среда LB, концентрация внеклеточного АТФ и не изменялась ни при фотовоздействии димигина на дрожжевые клетки, ни при облучении содержащих ТМРуР образцов клеток Е. coli.

При фотовоздействии димигина на дрожжевые клетки (рис. 3, А), суспендированные в буферном растворе PBS, концентрации внеклеточного АТФ увеличивалась в 4 раза по сравнению с контролем, а при переходе к HEPES -буферу эффект вытекания АТФ усиливался, и содержание АТФ во внеклеточной среде облученных образцов в 18 раз превышало его концентрацию до облучения. Концентрация же общего АТФ (табл. 1) дрожжевых клеток до и после облучения оставалась практически неизменной вне зависимости от природы буферного раствора.

Таблица 1. Концентрация общего АТФ в облученных и необлученных образцах клеток S. cerevisiae и Е. coli, суспендированных в разных буферных растворах и проинкубированных с соответствующим сенсибилизатором в течение 60 минут. Условия, как на рис. 3.

При фотодинамическом воздействии на клетки Е. coli (рис. 3, Б) наблюдали противоположную тенденцию. При этом содержание общего АТФ падало после облучения до уровня концентрации АТФ внешнего (табл. 1). Эти данные указывают на то, что уменьшение концентрации АТФ внутри клеток Е. coli в этих экспериментах не может быть результатом только диффузии АТФ во внеклеточную среду. Скорее всего, фотовоздействие в данном случае приводит к ингибированию синтеза АТФ у бактерии, в то время как ответственные за гидролиз АТФ ферменты либо сохраняют свою активность, либо фотовоздействие вызывает их активацию.

Для определения оптимальных значений рН среды были проведены эксперименты, в которых облучению в присутствии сенсибилизатора подвергали клетки Е. coli и S. cerevisiae, суспендированные в буферных растворах PBS и HEPES (соответственно) при разных значениях рН, и сравнивали эффективности методов экстракции АТФ путем фотовоздействия с классическим методом (разрушение ДМСО). Оказалось, что оптимальное значение рН внеклеточной среды для обоих микроорганизмов находилось в районе 7,2.

Таким образом эффект вытекания внутриклеточного АТФ в результате фотодинамического воздействия зависит как от рН суспензии клеток, так и от природы буферного раствора.

Концентрация сенсибилизатора. Для того, чтобы установить оптимальные концентрации фотосенсибилизаторов, при которых вытекание АТФ из исследуемых бактерий было бы максимальным, были получены зависимости концентрации внеклеточного АТФ в суспензиях, клеток S. cerevisiae (рис. 4, А) и Е. coli LE 392 (рис. 4, Б) от концентрации сенсибилизатора при облучении образца. Для клеток дрожжей, концентрация внеклеточного АТФ достигает максимального значения при содержании димигина в образце 74,55 мкМ. Концентрация внеклеточного АТФ для клеток Е. coli достигает максимума при концентрации ТМРуР > 7 мкМ.

Рис. 4, Зависимость концентрации внеклеточного АТФ от концентрации фотосенсибилизатора для клеток дрожжей (А) и клеток Е. coli (Б). Условия: (А) 5*106 КОЕ/мл клеток дрожжей, HEPES-буфер (рН 7,2); 1,2*108 КОЕ/мл клеток Е. coli, PBS-буфер (рН 7,2); доза облучения = 15 Дж; время темновой инкубации 60 мин.; облучение белым светом.

Доза облучения и пути ее достижения. Доза прилагаемого облучения должна оказывать существенное влияние на вытекание АТФ из клеток. Величина дозы определяется не только мощностью источника света, но и временем экспозиции: увеличение дозы может быть достигнуто либо путем варьирования мощности источника света при постоянной длительности облучения, либо изменением длительности облучения, но при постоянной мощности. Мы провели ряд опытов, в которых варьировали экспозицией при постоянстве мощности и, наоборот. Результаты представлены на рисунках 5 и 6.

На рис. 5 приведены данные, полученные при фотодинамическом воздействии димигина на дрожжевые клетки. При постоянной мощности увеличение дозы достигалось путем увеличения длительности облучения (кривая а). В интервале от 0 до 24 Дж концентрация вытекшего в результате фотовоздействия АТФ линейно росла с увеличением световой дозы, а затем не изменялась вплоть до 40 Дж. Иную картину наблюдали в случае, когда увеличение дозы

достигалось путем повышения мощности источника (рис. 5, б). При дозе до 4,5 Дж концентрация вытекшего во внеклеточную среду АТФ линейно зависела от дозы (кривые а и б совпадали). Однако при более высоких дозах увеличение концентрации внеклеточного АТФ описывалось квадратичной зависимостью. В диапазоне от 10 до 15 Дж концентрация внеклеточного АТФ сохранялась постоянной, а при дальнейшем повышении мощности концентрация внеклеточного АТФ облученных образцов даже уменьшалась.

Рис. 5. Зависимость концентрации внеклеточного АТФ после фото динамического воздействия димигина на клетки дрожжей от дозы облучающего света при разных путях ее достижения: а) фиксированная мощность (6 мВт) при различной экспозиции (0 - 110 минут); б) фиксированная экспозиция (20 минут) при различной мощности (0-17 мВт ).

Наблюдаемые явления (рис. 5) можно объяснить тем, что при длительных временах экспозиции и невысокой мощности света возможно частичное восстановление функций клеточной мембраны, что затрудняет вытекание АТФ во внеклеточную среду. С другой стороны, при коротких временах облучения и повышенной мощности света клетка "не успевает" включить механизмы, препятствующие потере АТФ. Падение же концентрации внеклеточного АТФ облученных образцов после плато на дозовой кривой (рис. 5, б), скорее всего, связано с высвобождением активных АТФ-аз во внеклеточную среду, что подтверждается одновременным падением содержания общего АТФ.

При облучении суспензии клеток Е. coli LE 392 в присутствии ТМРуР (рис. 6), зависимости концентрации внеклеточного АТФ от дозы облучения представляют собой кривую с насыщением. При дозах, не превышающих 17 Дж, концентрация внеклеточного АТФ пропорциональна дозе вне зависимости от способа ее достижения. При этом концентрация общего АТФ уменьшалась с увеличением световой дозы и достигала уровня концентрации внеклеточного АТФ при дозах > 17 Дж. Концентрация внутриклеточного АТФ уменьшалась по экспоненциальному закону с ростом световой дозы.

О 10 20 30 40

Доза облучения, Дж

Рис. 6. Зависимость концентрации внеклеточного АТФ для суспензии клеток Е. coli LE 392 после фотодинамического воздействия ТМРуР от дозы облучающего света при разных путях ее достижения. (•) - фиксированная мощность (7 мВт) при различной экспозиции (0-110 мин.); (□) - фиксированная экспозиция (10 мин.) при разной мощности (0 - 25 мВт). Конц. клеток в образце = 1,2*108 КОЕ/мл; конц. ТМРуР = 7 мкМ; время темновой предынкубации - 60 минут; буфер -PBS (pH 7,2). Пунктирная линия - аппроксимация на прямую всех точек при дозе < 17 Дж.

Таким образом, для достижения максимальных концентраций внеклеточного АТФ для клеток дрожжей при фотодинамическом воздействии димигина, облучение следует проводить при непродолжительной экспозиции и высокой мощности источника света (но не превышающей 12,5 мВт). Для клеток Е. coli LE 392 (при действии ТМРуР) максимальный эффект при облучении белым светом наблюдается при дозе > 17 Дж, причем способ достижения дозы не имеет значения.

Влияние фазы роста на фотодинамический эффект. Выяснение того, насколько существенна фаза роста в случае применения фотодинамического воздействия для разрушения клеток в АТФ-метрии, являлось важной задачей. Для ее решения провели ряд экспериментов, в которых облучению подвергали клетки, находившиеся в позднем стационаре. Концентрации вытекшего из них АТФ сравнивали с результатами аналогичных опытов на клетках, пребывавших в логарифмической фазе роста. Было показано, что как для клеток S. cerevisiae, так и для клеток Е. coli, находившихся в логарифмической фазе роста, концентрация внеклеточного АТФ в облученных образцах изменялась при переходе от одной концентрации клеток к другой. Для клеток в стационарной фазе, концентрация внеклеточного АТФ была сравнительно невысока и не зависела от их содержания в пробе. Когда же клетки, находившиеся в стационаре, разбавляли жидкой питательной средой до достижения их концентраций, соответствующих логарифмической фазе, концентрация внеклеточного АТФ после фотодинамическом воздействии увеличивалась пропорционально концентрации клеток в суспензии (Табл. 2)

Таблица 2. Концентрации вытекшего АТФ из клеток Е. coli LE 392 и дрожжей S, cerevisiae после фотодинамического на них воздействия. Образцы отбирали из культур, находившихся в стационаре, и разбавляли в десять раз._

Saccharomyces cerevisiae Е. coli LE 392

Концентрация клеток в образце, млн. КОЕ/мл [АТФ]внекл, нМ Концентрация клеток в образце, млн. КОЕ/мл [АТФ]внекл., нМ

Исходная После разбавления Исходная После разбавления

35 3,5 108 ±4 3000 300 105 ±6

37 3,7 118 ±4 3700 370 130 ±7

Таким образом, было установлено, что эффект вытекания АТФ не зависит от того, в какой фазе роста находилась клетка перед воздействием света. Результаты же, полученные ранее, скорее всего, объясняются тем, что при высоких плотностях клеток фотодинамическому разрушению подвергается только та их часть, которая не экранирована соседними клетками от падающего света.

1.2. Фотодеструкция как метод экстракции АТФ в биолюминесцентной

АТФ-метрии

Для подтверждения возможности применения эффекта вытекания АТФ из фотоповрежденных клеток в биолюминесцентной АТФ-метрии, были проведены следующие эксперименты. Клетки, находившиеся в логарифмической фазе роста, отмывали от питательной среды и ресуспендировали в соответствующем буферном растворе при рН 7,2. Затем путем последовательных разбавлений тем же буфером получали серии образцов с разным содержанием КОЕ/мл. После этого каждый из образцов разделяли на две части, к одной из которых добавляли раствор красителя в соответствующем буфере, а к другой - чистый буферный раствор того же объема. Конечные концентрации красителей в образцах соответствовали полученным ранее оптимальным значениям (см выше). Затем не содержавшие фотосенсибилизатора образцы обрабатывали десятикратным избытком ДМСО, встряхивали и выдерживали в течение 3-5 минут. Далее из полученных экстрактов отбирали аликвоты по 10 мкл, которые вносили в кювету люминометра (уже содержавшую 90 мкл АТФ-реагента) и регистрировали интенсивность биолюминесценции. Другие образцы подвергали инкубации в темноте в течение 60 минут и облучали белым светом. До и после облучения отбирали пробы и вводили их в биолюминесцентную реакцию при таких же объемных соотношениях "реагент:проба", как и в случае с экстрактами ДМСО. Результаты представлены на рис. 7 и 8.

Рис. 7. Зависимости интенсивности биолюминесценции аликвот, отобранных из образцов клеток 5. cerevisiae, суспендированных в ИЕРЕ8-буфере (рН 7,2) - (А) не содержавших фотоагента и обработанных десятикратным избытком ДМСО; (Б) содержавших 74,55 мкМ димигина и облученных белым светом - от концентрации клеток в исходных образцах.

Рис. 8. Зависимости интенсивности биолюминесценции аликвот, отобранных из образцов клеток Е. coli LE 392, суспендированных в фосфатном буфере (рН 7,2) - (А) не содержавших фотоагента и обработанных десятикратным избытком ДМСО; (Б) содержавших 7 мкМ ТМРуР и облученных белым светом - от концентрации клеток в исходных образцах.

Таким образом, на примере дрожжей S. cerevisiae и Грам-отрицательных бактерий Е. coli LE 392 было показано, что при определении концентрации клеток методом биолюминесцентной АТФ-метрии, в качестве альтернативного пути экстракции внутриклеточного АТФ возможно использование фотодинамического воздействия на бактерии. Более того, переход от классического способа экстракции (обработка ДМСО) к фотодинамическому позволяет увеличить более, чем в 2 раза, чувствительность метода в целом.

1.3. Влияние фотодинамического воздействия на проницаемость мембраны клеток E.coli PLR in vivo

Жизнеспособные рекомбинантные клетки Е. coli, плазмида которых несет ген люциферазы, содержат все необходимые компоненты биолюминесцентной реакции, кроме люциферина. При его добавлении к суспензии таких клеток наблюдается слабый биолюминесцентный сигнал, поскольку при физиологических значениях рН люциферин заряжен отрицательно (рКа его карбоксильной группы 3,5), поэтому при рН 7,2 лишь небольшая доля молекул субстрата способна пересечь клеточную мембрану и проникнуть внутрь клетки. На примере клеток Е. coli, несущих плазмиду pJGR, было показано (Дементьева Е.И., Угарова КН., Кобболд П.Х. Биохимия, 1996. 61: р. 1285 - 1293), что небольшие концентрации антибиотика полимиксина В увеличивают проницаемость клеточной мембраны, что позволяет варьировать концентрацию субстратов внутри клеток при физиологических значениях рН. При добавлении раствора антибиотика к суспензии таких клеток, содержащей люциферин во внеклеточной среде, наблюдался рост интенсивности биолюминесценции во времени благодаря диффузии субстрата внутрь клетки (сигнал при этом в сотни раз превышал исходный в отсутствие полимиксина при рН 7,2), а затем медленное уменьшение сигнала за счет снижения концентрации внутриклеточного АТФ.

В свете гипотезы о том, что одной из основных мишеней фотодинамического воздействия на клетки является клеточная стенка, мы предположили, что для фотовоздействия на Е. coli, плазмида которых несет ген люциферазы, должны быть характерны закономерности, аналогичные описанным выше. Для проверки данного предположения мы провели ряд соответствующих экспериментов. Результаты приведены на рис. 9.

На рис. 9 представлены кривые, описывающие изменение во времени интенсивности биолюминесценции рекомбинатных клеток Е. coli PLR, суспензия которых либо содержала 5* 10"4 ед. на 1 кл. антибиотика полимиксина В (рис. 9, А), либо была предварительно подвергнута воздействию белым светом дозой 25,2 Дж в присутствии фотосенсибилизатора (73,34 мкМ ТМРуР) (рис. 9, Б). Видно, что как присутствие полимиксина, так и фотодинамическое воздействие оказывали сильное влияние на биолюминесцентный сигнал. Как и в случае, описанном для Е. coli pJGR, в присутствии антибиотика интенсивность биолюминесценции Е. coli PLR росла, достигая максимального значения в 2700 у.е. уже через 1,5 минуты после введения

люциферина (рис. 9, А). Затем наблюдали медленное падение сигнала. Добавление раствора люциферина к суспензии клеток Е. coli PLR после фотодинамического на них воздействия (рис. 9, Б) привело к похожим результатам. Сначала наблюдали быстрый рост интенсивности биолюминесценции (до 2500 у.е.), а затем медленное ее падение.

Рис. 9. Биолюминесценция рекомбинантных клеток Е. coli PLR (1*10 КОЕ/мл), суспендированных в HEPES-буфере (рН 7,2): А - не содержавших фотоагента и обработанных полимиксином В (5*10"4 ед. на 1 кл.); Б - содержавших 73,34 мкМ ТМРуР и облученных белым светом. К 200 мкл исследуемых клеток добавляли 25 мкл 6 мМ раствора люциферина. Момент введения люциферина показан стрелкой.

Отдельно было показано, что при добавлении раствора люциферина к суспензии необлученных исследуемых клеток, но подвергавшихся часовой предынкубации с ТМРуР наблюдается только очень слабый рост биолюминесцентного сигнала.

Полученные данные подтверждают выдвинутое ранее предположение. Кроме того, в последствии оказалось, что облучение клеточной суспензии Е. coli PLR в присутствии димигина, TEtOHPyP и РсАЮН, т.е. соединений, фотовоздействие которых не вызывало вытекание АТФ (как было показано в. начале работы), не приводит и к облегчению диффузии люциферина внутрь клеток.

Таким образом, мы получили дополнительное подтверждение того, что одной из основных мишеней фотодинамического воздействия на Е. coli является клеточная стенка. Эти результаты позволяют сделать и другой важный вывод: клетки Е. coli PLR можно использовать для быстрого скрининга потенциальных фотосенсибилизаторов.

2. Фотодинамическое воздействие на Грам-отрицательные и Грам-положительные бактерии (на примере Е. coli О157:Н7 И L. monocytogenes Lm353)

2.1. Бактерицидный эффект MB, ТВО И ТМРуР на Е. coliO157:H7 И L. monocytogenes Lm 353 и минимальные ингибирующие концентрации

Было изучено фотодинамическое воздействие нескольких фотосенсибилизаторов на жизнеспособность бактерий с различной видовой принадлежностью. В качестве модельных культур были использованы патогенные штаммы Е. coli O157:H7 ATCC 43889 (Грам-отрицательные) и L. monocytogenes Lm 353 (Грам-положительные), а в качестве фотосенсибилизаторов - фенотиазиниевые красители метиленовый синий (MB) и толуидиновый синий О (ТВО) и положительно заряженное производное порфирина - ТМРуР. В ходе экспериментов суспензии исследуемых клеток в фосфатном буфере (рН 7,4) в присутствии и в отсутствие фотосенсибилизаторов облучали красным светом (А, = 660 нм). Облучение проводили мультидиодной лампой в течение 60 минут после предварительной инкубации образцов в темноте в течение 1 часа. Расстояние от источника света до поверхности облучаемых образцов составляло 1,8 см.

В отсутствие фотосенсибилизаторов применяемое облучение не оказывало существенного влияния на жизнеспособность исследуемых бактерий. Методом посевов на чашках с агаризованной средой было показано, что темновая предынкубация бактерий в присутствии фотосенсибилизаторов приводит к уменьшению количества жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) для обоих штаммов в 2 - 4 раза. Последующее облучение вызывает падение КОЕ на 5 - 6 порядков, т.е. до уровня, позволяющего считать культуру стерильной. Следовательно, все использованные красители оказывают сильное фотодеструктивное воздействие на оба штамма.

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) фотосенсибилизатора (т.е. такая концентрация красителя, при уменьшении которой не происходит полного подавления роста клеток в пробе после облучения) является удобным параметром, характеризующим эффективность фотодинамического действия данного сенсибилизатора на тот или иной микроорганизм. Определение МИК различных фотоагентов на разные бактерии при одинаковых условиях облучения позволяет не только сравнить между собой действие изучаемых сенсибилизаторов, но и оценить степень устойчивости данного штамма микроорганизмов к фотодинамическому воздействию. Были получены МИК исследуемых фотосенсибилизаторов при фотовоздействии на Е. coli О157:Н7 и L. monocytogenes Lm 353 в описанных выше условиях (Табл. 3).

Данные таблицы 3 показывают, что величины МИК всех исследованных фотосенсибилизаторов для Грам-отрицательных бактерий Е. coli в 2 - 4 раза превышают МИК для Грам-положительных клеток L. monocytogenes. Таким образом, Грам-положительные бактерии

менее устойчивы к фотодинамическому воздействию, что согласуется с литературными данными и, по-видимому, связано со структурными различиями клеточных стенок бактерий (наличие внешней мембраны у Е. coli).

Таблица 3. Минимальные ингибирующие концентрации исследованных фотосенсибилизаторов.

Штаммы микроорганизмов МИК, мкг/мл (мкМ)

ТМРуР MB ТВО

Listeria monocytogenes Lm 353 1,56(1,14) 0,78(2,1) 0,195 (0,6)

Escherichia coli 0157:H7 6,25 (4,6) 1,56(4,2) 0,39(1,3)

При сравнении потенциальной эффективности использованных сенсибилизаторов следует принимать во внимание не только величину МИК каждого фотоагента, но и его коэффициент экстинкции на длине волны облучающего света, а также квантовый выход образования синглетного кислорода (при той же длине волны). Результаты пересчета МИК, нормированные на оптическую плотность при 660 нм с введением поправки на квантовый выход представлены в таблице 4. Расчетные величины МИК для обоих штаммов микроорганизмов увеличиваются в ряду ТМРуР < ТВО < MB. Их соотношение составляет 1:2:25 в случае клеток Е. coli и 1:4:54 - для L. monocytogenes, соответственно. Таким образом, производное порфирина ТМРуР обладает большей по сравнению с фенотиазиниевыми красителями квантовой эффективностью фотодинамического воздействия на клетки.

Таблица 4. Минимальные ингибирующие концентрации исследуемых красителей, нормированные на оптическую плотность при 660 нм и умноженные на квантовый выход синглетного кислорода.

Такие различия в эффективности действия сенсибилизаторов частично могут быть обусловлены их различным сродством к клеточной стенке бактерий. Время жизни синглетного кислорода крайне мало. Это приводит к тому, что фотоокислению могут подвергаться субстраты, находящиеся в непосредственной близости к месту его генерации (т.е. к месту локализации фотоагента). Следовательно, чем сильнее сродство того или иного сенсибилизатора к поверхности клетки, тем большая часть его молекул примет непосредственное участие в фотодинамическом действии. В нашем случае аффинность порфиринового производного выше, чем у фенотиазиниевых красителей.

Большие различия фотодеструктивной способности МВ и ТВО (схожих по строению и фотохимическим свойствам) можно объяснить следующим образом. Как правило, взаимодействуя

с клеткой, фенотиазиниевые красители связываются с полифосфатами внешней мембраны и при последующем облучении вызывают окисление липидов и белков (в том числе мембран-связанных ферментов). Коэффициент распределения ТВО втрое больше, чем MB, что может быть одной из причин большей эффективности ТВО как фотосенсибилизатора.

2.2. Влияние фотодинамического воздействия на содержание внутри- и внеклеточного АТФ в Е. coli О157:Н7 и L. monocytogenes Lm 353

Было изучено влияние длительности облучения на содержание внеклеточного и внутриклеточного АТФ для исследуемых бактерий. Суспензию клеток в фосфатном буфере (108 -109 КОЕ/мл Е. coli или L. monocytogenes), содержащую сенсибилизатор, инкубировали в темноте в течение 60 минут, а затем облучали в течение часа красным светом мультидиодной лампы. В процессе облучения отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию внутри- и внеклеточного АТФ биолюминесцентным методом, а также количество жизнеспособных клеток методом посева на чашках Петри (КОЕ/мл).

Было показано, что при фотодинамическом воздействии на клетки Е. coli и L. monocytogenes одними и теми же сенсибилизаторами в одинаковых условиях облучения, зависимости исследуемых параметров (количество КОЕ/мл и уровень содержания АТФ) значительно различаются для этих штаммов. Для клеток Е. coli O157:H7 (рис 10, А) концентрация внутриклеточного АТФ уменьшается параллельно с уменьшением КОЕ/мл, а концентрация внеклеточного АТФ возрастает. Для клеток L. monocytogenes Lm 353 (рис 10, Б) уже через 30

минут облучения КОЕ/мл уменьшается до нуля, в то время как концентрация внутриклеточного АТФ падает всего в 2 раза. Даже через 60 минут определяется небольшая концентрация внутриклеточного АТФ. Концентрация внеклеточного АТФ увеличивается и достигает уровня, характерного для концентрации внутриклеточного АТФ до начала облучения. Одной из вероятных причин различия в вытекании АТФ из фотодинамически поврежденных Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий может быть различие в структуре клеточной стенки. Более сложное строение клеточной стенки Грам-отрицательных микроорганизмов делает их более устойчивыми к фото деструкции: полное подавление жизнеспособности Е. coli требует более высоких концентраций сенсибилизатора, чем необходимых для инактивации Грам-положительных клеток Listeria. Однако, малая толщина клеточной стенки Е. coli обеспечивает быстрое высвобождение метаболитов во внеклеточную среду при фотодинамическом воздействии. В то же время, для Грам-положительных бактерий вытекание внутриклеточного АТФ происходит гораздо медленнее благодаря большей толщине стенки, что позволяет регистрировать внутриклеточный АТФ в образцах Listeria, которые уже не содержат клеток, способных к образованию колоний.

Таким образом, фотодинамическое воздействие использованных фотосенсибилизаторов на исследуемые бактериальные клетки приводит к: 1) уменьшению концентрации внутриклеточного АТФ; 2) уменьшению числа жизнеспособных клеток; и 3) возрастанию концентрации внеклеточного АТФ (вытеканию АТФ). Это позволяет предположить, что при фотовоздействии происходит серьезное повреждение клеточной стенки бактерии, приводящее к потере метаболитов и ее гибели. Чем выше концентрация сенсибилизатора в образце, тем быстрее и глубже происходит повреждение клеточной стенки, на что указывает более резкое увеличение концентрации внеклеточного АТФ. С другой стороны, при фотодинамическом воздействии, как правило, падает общее содержание АТФ в образцах. Это позволяет полагать, что фотоокисление компонентов клеточной стенки, скорее всего, приводит к ингибированию синтеза АТФ, в то время как ответственные за гидролиз АТФ ферменты сохраняют свою активность. Таким образом, часть внутриклеточного АТФ, "не успевая" вытечь из клетки, разлагается внутри нее, а часть диффундирует через образовавшиеся поры во внеклеточную среду. При более же высоких концентрациях фотосенсибилизатора ферменты, гидролизующие АТФ, также могут подвергаться инактивации, в результате чего наблюдается более быстрый рост и более высокий уровень содержания АТФ вне клетки.

Таким образом, по полученным результатам можно заключить, что независимо от штамма микроорганизма и природы фотосенсибилизатора, первичная стадия фотодинамического воздействия включает повреждение клеточной стенки бактерии и вытекание внутриклеточного содержимого, что приводит к гибели клетки. С другой стороны, концентрация фотоагента, требуемая для эффективной фотоинактивации бактерий (МИК), сильно зависит как от физико-

химических свойств красителя, так и от типа клеточной стенки микроорганизмов. При этом биолюминесцентная АТФ-метрия оказывается удобным методом изучения механизма фотодинамического воздействия и позволяет в режиме "реального времени" извлекать дополнительную информацию о процессах, протекающих в клетке при ее фотоинактивации.

ВЫВОДЫ

1. Показан эффект вытекания внутриклеточного АТФ из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Грам-отрицательных Escherichia coli при фотодинамическом воздействии на клетки производными порфирина. Установлено, что данный эффект зависит от типа клеток и химического строения сенсибилизатора. Димигин, вызывающий фотоповреждение и вытекание АТФ из дрожжевых клеток, не оказывает фотодинамичекого действия на клетки Е. coli.

2. Показано, что эффект вытекания внутриклеточного АТФ в результате фотодинамического воздействия зависит от рН суспензии клеток и от природы буферного раствора.

3. Установлено, что концентрация вытекающего АТФ зависит от концентрации сенсибилизатора, времени темновой инкубации с фотоагентом, от дозы и мощности облучающего света. Определены оптимальные условия фотодинамического воздействия, при которых концентрация вытекающего АТФ из клеток максимальна.

4. Показано, что этот эффект не зависит от фазы роста бактерий, пропорционален количеству клеток в образце и может быть успешно использован в качестве альтернативного пути экстракции АТФ при определении концентрации клеток биолюминесцентным методом.

5. Показано, что производные порфирина обладают гораздо более высокой квантовой эффективностью в процессе фотодинамического повреждения по сравнению с фенотиазиниевыми красителями.

6. Показано, что биолюминесцентная АТФ-метрия является быстрым и информативным методом изучения фотодинамического воздействия и позволяет извлекать дополнительную информацию о протекающих процессах в клетке при ее фотоинактивации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Романова Н.А., Пометун Е.В., Савицкий А.П., Угарова Н.Н. Биолюминесцентное определение аденозин-5'-трифосфата, вытекающего из клеток дрожжей при их фотодинамическом повреждении. // Вестник МГУ, 2000, Т,41, №6, С. 404 - 407.

2. Romanova N.A., Pometun Ev.V., Ugarova N.N, Savitsky A.P. Bioluminescent assay of ATP leakage from yeast Saccharomyces cerevisiae after photodynamic damage of cells. // Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2000: Fundamentals and Applications", 2000, P. 58 - 59.

3. Romanova N.A., Pometun Ev.V., Brovko L.Yu., Ugarova N.N., Savitsky A.P. Bioluminescent assay of ATP leakage from yeast cells after photodynamic damage. // Proceedings of the 11th International Symposium on Biolum. and Chemilum. (Case, J.F., Herring, P.J., Robison, B.H., Haddock, S.H.D., Kricka, L.J., Stanley, P.E., Eds), 2000, USA. P. 305 - 308.

4. Romanova N.A., Brovko L.Y., Moore L, Pometun E., Savitsky A.P., Ugarova N.N., Griffiths M.W. Assessment of photodynamic destruction of Escherichia coll O157:H7 and Listeria monocytogenes by using ATP bioluminescence // Applied and Environment Microbiology, 2003, Vol. 69, No 11, P. 6393-6398.

5. Пометун Е.В., Угарова Н.Н, Романова Н.А., Бровко Л.Ю., Савицкий А.П. Фотодинамическое разрушение бактериальных клеток: перспективы практического применения. // Сборник тезисов Конференции молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В. Березина "Инженерная энзимология", посвященная 80-летию И.В. Березина, 2003, Москва, С. 26-27.

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН Тираж 100 экз.

02. ОО

H M»iiï005

78

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ И ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ.

1.1. КАТИОННЫЕ АЗИНИЕВЫЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ.

1.2. МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗА ТОРЫ.

1.3 д-АМИНОЛЕВУЛИНОВАЯКИСЛОТА.

2. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ В "БЫСТРОЙ МИКРОБИОЛОГИИ".

2.1. МЕТОДЫ "БЫСТРОЙ МИКРОБИОЛОГИИ".

2.2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ АТФ КАК ИНДИКА ТОР ПРИСУТСТВИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК В РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦАХ.

2.3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ.

2.4. МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО АТФ.

2.4.1. ЭКСТРАГЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В АТФ-МЕТРИИ.

2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АТФ В РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦАХ.

2.5.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ (ПУЛА) АТФ

2.5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОМАТИЧЕСКОГО АТФ.

2.5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНОГО АТФ.

2. б. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ОБРАЗЦОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МАТЕРИАЛЫ.

3. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ АППАРАТУРА.

4. МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА БИОМАССЫ.

4.2. ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ АТФ.

4.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФОТОВОЗДЕЙСТВИЯ НА УРОВЕНЬ СОДЕРЖАНИЯ АТФ В КЛЕТКАХ.

4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНЫХИНГИБИРУЮЩИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ.

4.5. ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МИКРОБНЫХ КЛЕТОК

4.6. ИЗМЕРЕНИЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ КЛЕТОК Е. СОЫ IN VIVO.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ВЫТЕКАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО АТФ ИЗ КЛЕТОК SACCHAROMYCES CEREVISIAE И ESCHERICHIA COLILE 392 ПРИ ФОТО ДИНАМИЧЕСКОМ НА НИХ ВОЗДЕЙСТВИИ.

1.1. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ АТФ В ИССЛЕДУЕМЫХ КЛЕТКАХ.

1.1.1. ОБЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ, НЕ СОДЕРЖАВШИХ СЕНСИБИЛИЗАТОРА.

1.1.2. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ТЕМНОВОЙ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК С ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ.

1.1.3. ПРИРОДА БУФЕРНОГО РАСТВОРА И РН СРЕДЫ.

1.1.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ СЕНСИБИЛИЗАТОРА.

1.1.5. ДОЗА ОБЛУЧЕНИЯ И ПУТИ ЕЕ ДОСТИЖЕНИЯ.

1.2. ВЛИЯНИЕ ФАЗЫ РОСТА НА ФОТОДИНАМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ.

1.3. ФОТОДЕСТРУКЦИЯ КАК МЕТОД ЭКСТРАКЦИИ АТФ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АТФ-МЕТРИИ.

1.4. ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК E.COLI PLR IN VIVO.

2. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГРАМ-ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМ-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ (НА ПРИМЕРЕ Е. COLI0157 :Н7 И L. MONOCYTOGENES LM 3 53).

2.1. БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТ MB, ТВО И TMPYP НА Е. COLI 0157.Н7 И L. MONOCYTOGENES LM 353 И МИНИМАЛЬНЫЕ k ИНГИБИРУЮЩИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ.

2.2. ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ ВНУТРИ- И ВНЕКЛЕТОЧНОГО АТФ В Е. COLI 0157. Н7 И L. MONOCYTOGENES LM 353.

ВЫВОДЫ.

Первичным процессом фотобиологических реакций является поглощение света молекулами вещества. В большинстве случаев эти молекулы представляют собой биологический субстрат, который сам претерпевает дальнейшие фотохимические изменения. В некоторых случаях в качестве первичных акцепторов световой энергии выступают вещества, которые передают эту энергию на другие молекулы, а сами при этом обычно не претерпевают химических превращений. Такие вещества называют фотосенсибилизаторами, а процессы, в которых они участвуют, -фотосенсибилизационными [1]. В качестве сенсибилизатора в клетках могут выступать как естественные метаболиты - хлорофилл, флавины, порфирины, билирубин (эндогенные сенсибилизаторы), так и широкий круг попадающих в клетки экзогенных веществ - акцепторов видимого света (красители, ароматические углеводороды). Частным случаем фотосенсибилизированных процессов является фотоповреждение биологических систем в присутствии сенсибилизаторов с участием молекулярного кислорода - так называемое фотодинамическое действие.

Повышенный интерес к фотосенсибилизируемым процессам в настоящее время обусловлен рядом практических задач, которые можно разбить на две группы. Первая включает разработку защитных мер от сенсибилизированного фотоповреждения. Создание мощных источников света и повышение уровня загрязненности окружающей среды увеличивают вероятность фотоповреждений с участием экзогенных сенсибилизаторов (например, рак кожи). С другой стороны, в организме всегда находится определенное количество эндогенных сенсибилизаторов, например протопорфирина. При наследственном заболевании эритропоэтическая протопорфирия в эритроцитах больных накапливается большое количество протопорфирина, что приводит к сенсибилизированному фотоокислению мембранных компонентов и гемолизу клеток.

Вторая группа задач связана с разработкой и усовершенствованием способов направленного фотоповреждения клеток и биологических структур. Например, весьма заманчивой является возможность стимулирования иммунной системы организма при небольших фотосенсибилизированных повреждениях компонентов крови. Вероятно, именно таким стимулированием объясняется терапевтическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения [2]. Но, в первую очередь, к этой группе относится разработка способов фоторадиационной терапии опухолей - разрушение клеток опухоли видимым светом в присутствии сенсибилизаторов, которые могут избирательно накапливаться в опухолевой ткани. В последние десятилетия были достигнуты серьезные успехи в таком альтернативном лечении опухолей, используя порфириновые производные и облучение лазерном светом [3]. Сочетание фотосинтезирующих препаратов и света приводит к появлению в опухолевом окружении реакционно-способных производных кислорода, приводящих к гибели опухоли. Данное явление известно как фотодинамическая терапия (ФДТ). По этой причине большинство встречающихся в литературе работ, связанных с изучением фотодинамического действия, были посвящены фоторазрушению клеток млекопитающих. Однако в последние годы возрос интерес исследователей к фотодинамическому повреждению бактериальных клеток -фото динамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ) [4]. В основном это связано с необходимостью поиска новых путей стерилизации зараженных объектов и лечения микробных инфекций из-за быстрых эволюционных изменений в природе, приводящих к появлению широкого разнообразия антибиотико-устойчивых патогенных штаммов. С другой стороны, необходимо учитывать, что в большинстве стран с развивающейся рыночной экономикой (включая и Россию) финансирование систем здравоохранения и санитарно-эпидемиологического контроля находится на довольно низком уровне. Это также требует поиска новых более дешевых антимикробных агентов.

Из литературы также известно, что основной мишенью фото динамического повреждающего действия, как правило, является клеточная мембрана [5-7]. Это позволило предположить, что данное явление может быть использовано в методе биолюминесцентного определения концентрации клеток [8] в качестве альтернативного пути экстракции внутриклеточного АТФ для увеличения его чувствительности и точности. Дело в том, что при определении концентрации АТФ биолюминесцентным методом, микробные клетки предварительно разрушают, используя различные экстрагенты [9, 10]: кислоты, растворители или поверхностно-активные вещества. Светляковая люцифераза, используемая в биолюминесцентном анализе АТФ, довольно сильно ингибируется такими экстрагентами [11]. Для уменьшения ингибирующего действия образец приходится разбавлять. Следует также учитывать, что наибольшая эффективность разрушения клеточной мембраны достигается при высоком отношении объема экстрагента к объему пробы, что, естественно, сильно уменьшает концентрацию АТФ в образце. Эти обстоятельства приводят к снижению чувствительности метода. Кроме того, данный метод позволяет количественно определить в первую очередь общую зараженность образца, но не зараженность определенным видом микроорганизмов. Определение же специфической обсемененности на фоне общей микробной зараженности объекта требует дополнительные подходы, приводящие к существенному усложнению методик и увеличению времени анализа [12]. Тот факт, что сенсибилизаторы различного строения могут по-разному взаимодействовать с микроорганизмами с различным строением клеточной стенки [4, 13], открывает перспективу селективного определения и стерилизации бактерий одного типа на фоне других.

Целью настоящей работы являлось выявление особенностей фотодинамического воздействия различных сенсибилизаторов на клетки микроорганизмов с разным строением клеточной стенки:

1) изучение процесса вытекания АТФ из дрожжевых и Грам-отрицательных клеток в зависимости от разных факторов в свете выяснение возможности использования данного явления как альтернативного метода экстракции внутриклеточного АТФ в биолюминесцентной АТФ-метрии;

2) проведение сравнительной характеристики некоторых фотоагентов по их влиянию на жизнеспособность Грам-отрицательных и Грам-положительных микроорганизмов в свете применения фотодинамического воздействия как способа стерилизации зараженных микробами объектов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

Показан эффект вытекания внутриклеточного АТФ из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Грам-отрицательных Escherichia coli при фотодинамическом воздействии на клетки производными порфирина. Установлено, что данный эффект зависит от типа клеток и химического строения сенсибилизатора. Димигин, вызывающий фотоповреждение и вытекание АТФ из дрожжевых клеток, не оказывает фотодинамичекого действия на клетки Е. coli.

Показано, что эффект вытекания внутриклеточного АТФ в результате фотодинамического воздействия зависит как от рН суспензии клеток, так и от природы буферного раствора.

Установлено, что концентрация вытекающего АТФ зависит от концентрации сенсибилизатора, времени темновой инкубации с фотоагентом, от дозы и мощности облучающего света. Определены оптимальные условия фотодинамического воздействия, при которых концентрация вытекающего АТФ из клеток максимальна.

Показано, что этот эффект не зависит от фазы роста бактерий, пропорционален количеству клеток в образце и может быть успешно использован в качестве альтернативного пути экстракции АТФ при определении концентрации клеток биолюминесцентным методом.

Показано, что производные порфирина обладают гораздо более высокой квантовой эффективностью в процессе фотодинамического повреждения по сравнению с фенотиазиниевыми красителями.

Показано, что биолюминесцентная АТФ-метрия является быстрым и информативным методом изучения фотодинамического воздействия и позволяет извлекать дополнительную информацию о протекающих процессах в клетке при ее фотоинактивации.

1. Х.Фут, Фотосенсибшизируемое окисление и синглетный кислород, Свободные радикалы в биологии, М: Мир 1979. С. 96 150.

2. А.В.Воробей, Т.Н.Вадецкая, В.Н.Болодон, Е.А.Черницкий, Сенсибилизированное протопорфирином действие лазерного света на мембраны клеток крови. Тез. докл. Всесоюз. конф. По применению лазеров в медицине, Москва, 1984, С. 102 103.

3. R.Bonnett, Photosensitizers of the porphyrin and phthalocyanine series for photodynamic therapy. Chemical Society Reviews, 1995. 24: p. 19-33.

4. Z.Malik, J.Hanania, Y.Nitzan, Bactericidal effects of photoactivated porphyrins-an alternative approach to antimicrobial drugs. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology, 1990. 5: p. 281 293.

5. T.Ito, Mode of photodynamic action with special reference to the sensitizer cell interaction. Porphyrins and membrane damage. Stadia biophys., 1983. 94: p. 1 -6.

6. J.Moan, Photodynamic effect of DNA and cell survival of human cells sensitized by hematoporphyrin. Photobiochem. and Photobiophys., 1981. 2: p. 301 307.

7. Е.А.Черницкий, Т.Н.Вадецкая, А.В.Воробей, Влияние анестетиков на сенсибилизируемое порфиринами фотоповреждение эритроцитарных мембран. ДАН БССР, 1985. 29: С. 201 204.

8. Н.Н.Угарова, Л.Ю.Бровко, И.А.Трдатян, Е.И.Райнина, Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии. Прикладная биохимия микробиология, 1987.23(1): С. 14-24.

9. J.A.J.Webster, GJ.Hampton, F.R.Leach, ATP in soil: a new extractant and extraction procedure. Soil Biology and Biochemistry, 1984.16(4): p. 335 342.

10. D.C.Jenkinson, J.M.Oades, A method for measuring of adenosin triphosphate in soil. Soil Biology and Biochemistry, 1979.11: p. 193 199.

11. A.Lundin, A.Thore, Comparison of methods for extraction of bacterial adenine nucleotides determined by firefly assay. Applied Microbiology, 1975. 30(5): p. 713-721.

12. B.Ehreberg, Z.Malik, Y.Nitzan, Fluorescence spectral changes of hematoporphyrin derivative upon binding to lipid vesicles, Staphylococcus aureus and Escherichia coli cells. Photochem. Photobiol, 1985. 41: p. 429 435.

13. А.А.Красновский(мл.), Фотосенсибилизированная люминесценция синглетного кислорода в растворе. Биофизика, 1976. 21: С. 748 749.

14. A.N.Terenin, Photochemical process in aromatic compounds. Acta physicochim., 1943.18: p. 210-241.

15. А.А.Красновский(мл.), Люминесценция синглетного кислорода в растворах сенсибилизаторов. Возбужденные молекулы. Кинетика превращений, JI.: Наука 1982, С. 32- 50.

16. A.U.Khan, M.Kasha, Chemiluminescence arising from simultaneous transitions in pairs of singlet oxygen molecules. J. Amer. Chem. Soc., 1970. 92: p. 3293 -3300.

17. P.-T.Chou, A.U.Khan, L-ascorbic acid quenching of singlet molecular oxygen in aqueous media: generalized antioxidant property of vitamin C. Biochem. and Biophys. Res. Communs., 1983.115: p. 932 937.

18. T.Ito, Photodynamic agents as tools for cell biology. Photochemistry and Photobiology Reviews, 1983. 7: p. 141 186.

19. S.Menezes, M.Capella, L. RCaldas, Photodynamic action of methylene blue: repair and mutation in Escherichia coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B.:Biology, 1990. 5: p. 505 517.

20. A.W.Girotti, Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. Photochemistry and Photobiology, 1990. 51: p. 497 509.

21. Y Nitzan, H.Ashkenazi, Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli В by cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology, 2001. 42: p. 408 414.

22. S.Wagner, W.D.Taylor, A.Keith, W.Snipes, Effects of acridine plus near ultraviolet light on E.coli membranes and DNA in vivo. Ibid, 1980. 32: p. 771 -779.

23. C.S.Foote, Future directions and applications in photodynamic theory. SPIE Institute Series, 1990. 1S6: p. 115 126.

24. Y.Iwamoto, T.Itoyama, K.Yasuda, T.Morita, T.Shimizu, T.Masuzawa, et al., Photodynamic DNA strand-breaking activities of acridine compounds. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1993.16: p. 1244 1247.

25. C.Emiliani, M.Delmelle, The lipid solubility of porphyrin modulates their phototoxicity in membrane models. Ibid, 1983. 37: p. 487 490.

26. Y.Nitzan, A.Balzam-Sudakevitz, H.Ashkenazi, Eradication of Acinetobacter baumannii by photosensitized agents in vitro. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1998. 42: p. 211 -218.

27. M.Wilson, J.Dobson, W.Harvey, Sensitization of oral bacteria to killing by low-power laser radiation. Current Microbiology, 1992. 25: p. 77 81.

28. G.Oster, Dye binding to high polymers. Journal of Polymer Science, 1955. 16: p. 235 244.

29. L.Cincotta, A.Cincotta, J.W.Foley. Novel phenothiazinium photosensitizers for photodynamic therapy, in Advances in Photochemotherapy: Proceedings of SPIE Symposium no. 997. 1988. SPIE, Bellingham, WA.

30. T.A.Creagh, M.Gleeson, D.Travis, R.Grainger, T.McDerrnott, M.R.Butler, Is there a role for in vivo methylene blue staining in the prediction of bladder tumour recurrence? British Journal of Urology, 1995. 75: p. 477 479.

31. A.Mashberg, Final evaluation of tolonium chloride rinse for screening of high-risk patients with asymptomatic squamous carcinoma. Journal of the American Dental Association, 1983.106: p. 319 323.

32. N.S.Soukos, M.Wilson, T.Burns, P.M.Speight, Photodynamic effects of toluidine blue on human oral keratinocytes and fibroblasts and Streptococcus sanguis evaluated in vitro. Lasers in Surgery and Medicine, 1996.18: p. 253 259.

33. J.E.Schneider, S.Price, L.Maidt, J.M.Gutteridge, R.A.Floyd, Methylene blue plus light mediates 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine formation in DNA preferentially over strand breakage. Nucleic Acids Research, 1990. 18: p. 631 635.

34. B.Bachmann, J.Knuver-Hopf, B.Lambrecht, H.Mohr, Target structures for HIV-1 inactivation by methylene blue and light. Journal of Medical Virology, 1995. 47: p. 172 178.

35. E.M.Tuite, J.M.Kelly, Photochemical interactions of methylene blue and analogues with DNA and other biological substrates. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 1993. 21(103 124).

36. Y.Wakayama, M.Takagi, K.Yano, Photosensitized inactivation of E coli. cells in toluidine blue-light system. Photochemistry and Photobiology, 1980. 32: p. 601 -605.

37. M.N.Usacheva, M.C.Teichert, M.A.Biel, Comparison of Methylene Blue and Toluidine Blue photobactericidal efficacy against Gram-positive and Gram-negative microorganisms. Lasers in Surgery and Medicine, 2001. 29: p. 165 173.

38. M.Wainwright, D.A.Phoenix, J.Marland, D.Wareing, F.J.Bolton, A study of the photobactericidal activity in the phenothiazinium series. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 1997.19(75 80).

39. B.Lambrecht, S.G.Norley, R.Kurth, H.Mohr, Rapid inactivation of HIV-1 in single donor preparations of human fresh frozen plasma by methylene blue/light treatment. Biologicals, 1994. 22: p. 227 231.

40. H.Mohr, B.Lambrecht, A.Selz, Photodynamic virus inactivation of blood components. Immunological Investigations, 1995. 24: p. 73 85.

41. H.Abe, S.J.Wagner, Analysis of viral DNA, protein and envelope damage after methylene blue, phthalocyanine derivative or merocyanine 540 photosensitization. Photochemistry and Photobiology, 1995. 61: p. 402 409.

42. S.J.Wagner, D.Robinette, J.Storry, X.Y.Chen, J.Shumaker, L.Benade, Differential sensitivities of viruses in red-cell suspensions to methylene blue photosensitization. Transfusion, 1994. 34: p. 521 526.

43. M.Wilson, Photolysis of oral bacteria and its potential use in the treatment of caries and periodontal disease. Journal of Applied Bacteriology, 1993. 75: p. 299 -306.

44. T.Burns, M.Wilson, G.J.Pearson, Effect of dentine and collagen on the lethal photosensitization of Streptococcus mutans. Caries Research, 1995. 29: p. 192 -197.

45. S.Sarkar, M.Wilson, Lethal photosensitization of bacteria in subgingival plaque from patients with chronic periodontitis. Journal of Periodontal Research, 1993. 28: p. 204-210.

46. M.Wilson, T.Burns, J.Pratten, G.J.Pearson, Bacteria in supragingival plaque samples can be killed by lowpower laser light in the presence of a photosensitizer. Journal of Applied Bacteriology, 1995. 78: p. 569 574.

47. M.Wilson, N.Mia, Effect of environmental factors on the lethal photosensitization of Candida albicans in vitro. Lasers in Medical Science, 1994. 9: p. 105 109.

48. C.E.Millson, M.Wilson, A.J.MacRobert, G.Bedwell, S.G.Bown, The killing of Helicobacter pylori by low-power laser light in the presence of a photosensitizer. Journal of Medical Microbiology, 1996. 44: p. 245 252.

49. N.Komeric, M.Wilson, Factors influencing the susceptibility of Gram-negative bacteria to Toluidine Blue O-mediated lethal photosensitization. Journal of Applied Microbiology, 2002. 92: p. 618 623.

50. L.E.Bockstahler, T.P.Coohill, K.B.Hellman, C.D.Lytle, J.E.Roberts, Photodynamic therapy for herpes simplex. Pharmacology and Therapeutics, 1979. 4: p. 473 499.

51. T.D.Felber, E.B.Smith, J.M.Knox, C.Wallis, J.L.Melnick, Photodynamic inactivation of herpes simplex. Journal of the American Medical Association, 1973. 223: p. 289-292.

52. R.S.Berger, C.M.Papa, Photodye herpes therapy-Cassandra confirmed. Journal of the American Medical Association, 1977. 238: p. 133 134.

53. O.Z.Raab, Ueber die Wirkung fluorescirender Stoffe auf Infusorien. Zeitschrift Biologie, 1900. 39: p. 524 546.

54. M.Wainwright, D.A.Phoenix, J.Marland, D.Wareing, F.J.Bolton, In-vitro photobactericidal activity of aminoacridines. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1997. 40: p. 587 589.

55. Y.Nitzan, S.Gozhansky, Z.Malik, Effect of photoactivated hematoporphyrin derivative on the viability of Staphylococcus aureus. Curr. Microbiol., 1983. 8: p. 279 284.

56. G.Bertoloni, B.Salvato, M.DairAcqua, M.Vazzoler, G. Jory, Hematoporphyrin-sensitized photoinactivation of Streptococcus faecalis. Photochem. Photobiol, 1984. 39: p. 811-816.

57. Y.Nitzan, B.Shainberg, Z.Malik, Photodynamic effect of deuteroporphyrin on Gram positive bacteria. Curr. Microbiol., 1987. 15: p. 251 258.

58. J.Davila, A.Harrimam, Photosensitized oxidation of biomaterials and related model compounds. Photochem, Photobiol, 1989. 50: p. 29 35.

59. F.R.Venezio, C.DiVincenzo, R.Sherman, M.Reichman, T.C.Origotano, K.Thompson, O.H.Reichman, Bactericidal effects of photoradiation therapy with hematoporphyrin derivative. J. Infect. Dis., 1985. 151: p. 166 169.

60. M.Merchat, J.D. Spikes, G.Bertoloni, G.Jory, Studies of the mechanism of bacteria photosensitization by meso-substituted cationic porphyrins. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1996. 35: p. 149 157.

61. G.Bertoloni, M.Dall'Acqua, M.Vazzoler, B.Salvato, G. Jory, Bacterial and yeast cells as models for studying hematoporphyrin photosensitization, in A. Andreoni and R. Cubeddu (eds.). Porphyrins in tumor phototherapy, Plenum, New York, 1983: p. 177- 183.

62. G. Bertoloni, F.Zambotto, L.Conventi, F.Reddi, G.Jori, Role of specific cellular targets in the hematoporphyrin-sensitized photoinactivation of microbial cells. Photochemistry and Photobiology, 1987. 5: p. 695 698.

63. Z.Malik, H.Ladan, Y.Nitzan, Mesosomal structures and antimicrobial activity induced by hemin-oxidation or porphyrin sensitization in Staphylococci. Curr. Microbiol., 1988. 16: p. 321 328.

64. M.Kreitner, K.-H.Wagner, G.Alth, R.Ebermann, H.Foiby, I.Elmadfa, Haematoporphyrin- and sodium chlorophylin-induced phototoxicity towards bacteria and yeasts a new approach for safe foods. Food Control, 2001. 12: p. 529- 533.

65. L.M.Cowsert, Treatment of papillomavirus infections: recent practice and future approaches. Intervirology, 1994. 37: p. 226 230.

66. J.North, H.Neyndorff, J.G.Levy, Photosensitizers as virucidal agents. Journal of Photochemistry and Photobiology B.:Biology, 1993.17: p. 99 108.

67. J.Griffiths, J.Schofield, M.Wainwright, S.B.Brown, Some observations on the synthesis of polysubstituted zinc phthalocyanine sensitisers for photodynamic therapy. Dyes and Pigments, 1997. 33: p. 65 78.

68. C.E.Millson, M.Wilson, A.J.MacRobert, S.G.Bown, Photodynamic therapy for the eradictation of Helicobacter pylory. Laser Surg Med., Suppl., 1994. 6: p. 40.

69. S.Rywkin, E.Ben Hur, Z.Malik, A.M.Prince, Y.S.Li, M.E.Kenney, et al., New phthalocyanines for photodynamic virus inactivation in red blood cell concentrates. Photochemistry and Photobiology, 1994. 60: p. 165 170.

70. Z.Smetana, E.Mendelson, J.Manor, J.E. van Lier, E.Ben-Hur, S.Salzburg, et al., Photodynamic inactivation of herpes viruses with phthalocyanine derivatives. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 1994. 22: p. 37 43.

71. E.Ben Hur, A.C.Moor, H.Margolis-Nunno, P.Gottlieb,M.M.Zuk, S.Lustigman, et al, The photodecontamination of cellular blood components: mechanisms and use of photosensitization in transfusion medicine. Transfusion Medicine Reviews,1996. 10: p. 15-22.

72. C.M.Allen, J.M.Weber, J.E. van Lier, Sulfophthalocyanines for photodynamic inactivation of viruses in blood products-effects of structural modifications. Photochemistry and Photobiology, 1995. 62: p. 184 189.

73. M.Wilson, T.Burns, J.Pratten, Killing of Streptococcus sanguis in biofilms using a light-activated antimicrobial agent. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1996. 37: p. 377- 381.

74. M.Wilson, J.Pratten, Lethal photosensitization of Staphylococcus aureus in vitro: effect of growth phase, serum and pre-irradiation time. Lasers in Surgery and Medicine, 1995. 16: p. 272 276.

75. R.Bonnett, D.G.Buckley, T.Burrow, A.Galia, B.Saville, S.P.Songca, Photobactericidal materials based on porphyrins and phthalocyanines. Journal of Materials Chemistry, 1993. 3: p. 323 324.

76. T.C.Oldham, D.Phillips, Flash photolysis of sensitizers in microbes. Journal of Phys. Chem. B, 1999. 103(43): p. 9333 9349.

77. A.L.Jackie, D.Phillips, The photosensitisation of Escherichia coli using disulphonated aluminium phtalocyanine. Journal of Photochemistry and Photobiology A.:Chemistry, 2001.142: p. 145 150.

78. W.K.Philipp-Dormston, M.Doss, Comparison of porphyrin and heme biosynthesis in various heterotrophic bacteria. Enzyme, 1973.16: p. 57 64.

79. K.Szocs, F.Gabor, G.Csik, J.Fidy, delta-Aminolaevulinic acid-induced porphyrin synthesis and photodynamic inactivation of Escherichia coli B. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1999. 50: p. 8 17.

80. F.W. van der Meulen, K.Ibrahim, H.J.C.M.Sterenborg, L.V.Alphen, A.Maikoe, J.Dankert, Photodynamic destruction of Haemophilus parainfluenzae by endogenously produced porphyrins. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1997. 40: p. 204 208.

81. C.E.Millson, M.Wilson, A.J.MacRobert, S.G.Bown, Ex-vivo treatment of gastric Helicobacter infection by photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1996. 32: p. 59-65.

82. Z.Malik, S.Gozhansky, Y.Nitzan, Effects of photoactivated HPD on bacteria and antibiotic resistance. Microbios Lett., 1982. 21: p. 103 112.

83. M.Wilson, J.Dobson, S.Sarkar, Sensitisation of periodontopathogenic bacteria to killing by light from a low-power laser. Oral Microbiol Immunol, 1983. 8: p. 182 -187.

84. M.A.Griffiths, B.W.Wren, M.Wilson, Killing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro using aluminium disulphonated phthalocyanine, a light activated antimicrobial agent. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1997. 40: p. 873 876.

85. P.S. Golding, T.A. King, L. Maddocks, D.B. Drucker, A.S. Blinkhorn, Photosensitization of with malachite green isothiocyanate: inactivation efficiency and spectroscopic analysis. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1998. 47: p. 202 -210.

86. A.Dube, H.Bansal, P.K.Gupta, Dye-mediated photodynamic inactivation of Bacillus subtilis cells: Involvement of singlet oxygen and superoxide radicals. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 2000. 37: p. 245 250.

87. B.Kjeldstad, T.Christensen, A.Johnson, Uptake of hematoporphyrin derivative in bacteria and photosensitization of Propionibacterium acnes bacteria. Photobiochem. Photobiophys., 1986.10: p. 163 173.

88. F.Kjeldstad, A.Johnson, An action spectrum for blue and near ultraviolet inactivation of Propionibacterium acnes with emphasis on a possible porphyrin photosensitization. Photochemistry and Photobiology, 1986. 43: p. 67 70.

89. M.Schafer, C.Schmitz, G.Horneck, High sensitivity of Deinococcus radiodurans to photodynamically-produced singlet oxygen. Int J. Radiat. Biol., 1998. 74: p. 249 -253.

90. T.Ito, Phodynamic action of hematoporphyrin on yeast cells a kinetic approach. Photochemistry and Photobiology, 1981. 34: p. 521 - 524.

91. A.Ito, T.Ito, Possible involvement of membrane damage in the inactivation by broad-band near-UV radiation in Saccharomyces cerevisiae cells. Photochemistry and Photobiology, 1983. 37: p. 395 401.

92. W.-L.S.Lee, A.R.Shalita, M.B.Poh-Fitzpatric, Comparative studies of porphyrin production in Propionibacterium acnes and Propionibacterium granulosum. J. Bacteriol., 1978.133: p. 811 815.

93. А.Д.Иосипенко, С.Ю.Щеголев, Б.А.Шендеров и другие, Спектротурбидиметрический метод быстрой оценки чувствительности микроорганизмов к действию антибиотиков. Антибиотики, 1985. 30(3): С. 208-212.

94. I.D.Ogden, D.C.Cann, A modified conductance medium for the detection of Salmonella spp. Journal of Applied Bacteriology, 1987. 63: p. 459 464.

95. D.M.Gibson, Some modification of the media for rapid automated detection of salmonellas by conductance measurement. Journal of Applied Bacteriology, 1987. 63: p. 299 304.

96. J.R.Bishop, C.H.White, Assessment of dairy product quality and potential shelf-life. A review. Journal of Food Protection, 1986. 49(9): p. 739 753.

97. D.K.O'Tool, A review. Methods for the direct and indirect assessment of the bacterial count of milk. Journal of Applied Bacteriology, 1983. 55(2): p. 187 -201.

98. В.В.Бирюков, В.М.Кантере, Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985, 289 с.

99. C.V.Purnendu, Rapid methods and automation in dairy microbiology. J. Dairy Science., 1993. 76: p. 3101-3113.

100. A.Rowlands, H.Barkworth, Z.Hosking, O.Kemphorne, Dye tests as measures of the keeping quality of milk J. Dairy Research, 1950.17: p. 161 191.

101. R,D.Petty, L.A.Sutherland, E.M.Hunter, I.A.Cree, Comparison of MTT and A TP-based assays for the measurements of viable cell number. J. Bioluminescence and Chemiluminescence, 1995. 10: p. 29 34.

102. R.G.Kroll, The cytochrome oxidase test for the rapid detection of psychrotrophic bacteria in milk. Journal of Applied Bacteriology, 1985. 59(2): p. 137 141.

103. Н.Н.Угарова, Л.Ю.Бровко, О.В.Лебедева, И.В.Березин, Биолюминесцентные методы и реагенты для целей медицинской диагностики. Вестник Академии Медицинских Наук СССР, 1985. 7: С. 88 94.

104. C.M.Cousins, U.M.Rodrigues, R.J.Fulpord, The pyruvate test for monitoring the bacteriological quality of raw silo milk J. Dairy Research, 1981. 48: p. 45 50.

105. W.D.Oleniacz, M.A.Pisano, M.H.Risenfeld, Detection of microorganisms by an automated chemiluminescent technique, in Automation in Analytical Chemistry. 1966, Eds. Technicon Corp.: New-York. p. 323 325.

106. Л.П.Брусиловский, С.Ф. Драгу нова, И.А.Вайнберг, Экспресс-метод определения бактериальной обсемененности молока. Молочная промышленность, 1998. 5: р. 23 25.

107. L.M.Jay, The Lymulus lysate endotoxin assay as a test of microbial quality of ground beef Journal of Applied Bacteriology, 1977. 49: p. 99 109.

108. C.E.Dood, G.S.Stewart, W.M.Waites, Biotechnology-based methods for the detection, enumeration and epidemiology of food poisoning and spoilage organisms. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 1990. 8(11): p. 1 -49.

109. G.B.Sala-Newby, C.Goodfield, I.RJohnson et al, Ultra-sensitive detection of microbes by ATP analysis, in ATP Luminescence: Society for the Applied Bacteriology. 1989. p. 261 269.

110. J.E. and J.RKennedy, J.I.Oblinger, Application of bioluminesence to rapid determination of microbial levels in ground beef. Journal of Food Protection,1985. 48(4): p. 334-340.

111. P.D.Patel, A.P.Williams, A note on estimation of food spoilage yeasts by measurement of adenosine triphosphate (ATP) after growth at various temperatures. Journal of Applied Bacteriology, 1985. 59(2): p. 133 136.

112. Н.Н.Угарова, Л.Ю.Бровко, О.В.Лебедева, Иммобилизованные биолюминесцентные системы. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология,1986. 6. М.: ВИНИТИ: С. 88 163.

113. A.Lundin, Analitical aplication of bioluminescence: the firefly system. Clinical and Biochemical Luminescence. Eds. Kricka L.J. & Carter T.J.N. N.Y.: Marcel Dekker Inc., 1982: p. 43 74.

114. Н.А.Романова, Л.Ю.Бровко, М.Сепульведа-Бессера, Н.Н.Угарова, Изменение пула адениновых нуклеотидов в клетках бактерий E.coli 1257 при воздействии низкоинтенсивного Не-Ие-лазера. Биохимия, 1993. 58(3): С. 376 -384.

115. Д.Э.Мецлер, Биохимия, пер. с английского. М.: Мир, 1980. 340 с.

116. Н.Н.Угарова, Л.Ю.Бровко, Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ. М.: Издательство МГУ, 1981. 138 с.

117. Н.Н.Угарова, Биоаналитические применения люциферазы светляков (обзор). Прикладная биохимия микробиология, 1993. 29(2): С. 180 191.

118. A.Lundin, A.Richardson, A.Thore, Continuous monitoring of ATP converting w reactions by purifiied firefly luciferase. Analytical Biochemistry, 1976. 75: p. 611-620.

119. C.N.Cutter, W.J.Dorsa, G.R.Siragusa, A rapid microbial ATP bio luminescence assay for meat carcasses. Dairy, Food and Environmental Sanitation, 1996. 16(11): p. 726-736.4

120. K.E.Weibel, J.-R.Mor, A.Fiechter, Rapid sampling of yeast cells and automated assay of adenylate, citrate, pyruvate and glucose-6-phosphate pools. Analytical Biochemistry, 1974. 58(1): p. 208 216.

121. L.Selan, F.Berlutty, C.Passariello, M.Thaller, G.Renzini, Reliability of bioluminescence ATP assay for detection of bacteria. Journal of Clinical Microbiology, 1992. 30(7): p. 1739 1742.

122. Н.А.Романова, Л.Ю.Бровко, Н.Н.Угарова, Сравнение методов экстракции внутриклеточного АТФ микроорганизмов различного типа для биолюминесцентного определения клеток микроорганизмов. Прикладная биохимия микробиология, 1997. 33(3): С. 344 349.

123. Г.Шлегель, Общая микробиология, пер. с немецкого. М.: Мир. 1987. 567 с.

124. К.А.Лукомская, Микробиология с основами вирусологии. М.: Просвещение. 1987. 192 с.•

125. В.И.Бирюзова, Мембранные структуры микроорганизмов. М.: Наука. 1973. 136 с.1 136. K.Bancroft, E.A.Paul, W.J.Wihe, The extraction and measurement of adenosinetriphosphate from marine sediments. Limnology and Oceanography, 1976. 21: p. 473 480.

126. E.P.Sheppard, J.A.Gow, P.E.Georghiou, Luciferin-luciferase assay of ATP from bacteria. A comparison of DMSO and acetone with other solvents. Microbios, 1987. 52(210): p. 39- 50.•

127. M.Vaara, The outer membrane as the penetration barrier against mupirocin in Gram-negative enteric bacteria. Microbiology Review, 1992. 56(3): p. 395 411.

128. A.Lundin, Extraction and automated luminometric assay of ATP, ADP and AMP. In: Analytical Application of Bioluminescence and Chemiluminescence. / Eds.

129. Kricka L J., Stanley P.E., Thore G.H.G, Whitehead T.P. Orlando, USA: Academic Press., 1984: p. 491 -502.

130. D.P.Theron, B.A.Prior, P.M.Lategan, Determination of bacterial ATP levels in raw milk: selectivity of non-bacterial ATP hydrolysis. Journal of Food Protection, 1986.49(1): p. 4-7.

131. W.J.Simpson, J.R.M.Hammond, Method for ATP extraction. United States Patent. Patent Number 5,004,684. Date of Patent: Apr. 2, 1991.

132. Н.Н.Угарова, Люцифераза светляков. Кинетика и механизм регуляции. Биохимия, 1989. 54(5): С. 734 739.

133. Webster, M.S.Hall, C.N.Rich, S.E.Gilliland, S.R.Ford, F.R.Leach, Improved sensitivity of the bioluminescent determination of numbers of bacteria in milk samples. Journal of Food Protection, 1988. 51(12): p. 949 954.

134. A.D.Sutherland, C.Bell, A.Limond, J.Deakin, E.A.Hunter, The Biotrace method for estimating bacterial number in milk by bioluminescence. J. Society of Dairy Technology, 1994. 47(4): p. 117 121.

135. D.A.Bautista, L.McIntyre, L.Laleye, M.W.Griffiths, The application of ATP bioluminescence for the assessment of milk quality and factory hygiene. J. Rapid Methods and Automation in Microbiology, 1992. 1: p. 179 193.

136. L.P.M.Langeveld, C.B.Van der Waals, The ATP platform test, the D ATP test and the direct microscopic count procedure as methods of estimating the microbial quality of raw milk. Netherlands Milk and Dairy J., 1988. 42: p. 173 182.

137. S.H.Han, C.H.Kim, J.B.Kim, H.K.Shin, S.B.Lee, Determination of bacterial number in milk by ATP assay monitored by luciferin-luciferase bioluminescence reaction. Korean J. Animal Science, 1985. 27: p. 782 784.

138. R.Bossuit, A 5-minute ATP platform test for judging the bacteriological quality of raw milk. Netherlands Milk and Dairy J., 1982. 36: p. 355 364.

139. W.C.Botha, J.Luck, P.J.Jooste, The application of adenosine triphosphate method as a rapid bacteriological platform test. South African J. Dairy Technology, 1985. 17: p. 59 64.

140. L.P.M.Langeveld, C.B.Van der Waals, De ATP~verschilmethode en de microscopishe telmethode voor de kwaliteitscontrole van rauwe melk. Voedingsmiddelentechnologie, 1987.19: p. 20-23.

141. J. Van Crombrugge, G.Waes, Methods for assessing the bacteriological quality of raw milk form the farm. Bulletin of the International Dairy Federation, 1991. 256: p. 53 60.

142. C.Bell, P.A.Stallard, S.E.Brown, J.T.E.Stanley, ATP-bioluminescence techniques for assessing the hygiene condition of milk transport tankers. International Dairy J., 1994. 4(7): p. 629 640.

143. K.Seeger, M.W.Griffiths, Adenosine triphosphate bioluminescence for hygiene monitoring in health care institutions. Journal of Food Protection, 1994. 57(6): p. 509-512.

144. S.C.Murphy, S.M.Kozlowski, D.K.Bandler, K.J.Boor, Evaluation of adenosine triphosphate-bioluminescence hygiene monitoring for trouble-shooting fluid milk shelf-life problem. J. Dairy Science, 1998. 81(2): p. 817 820.

145. И.М.Пархоменко, Г.В.Перишвили, В.Б.Туровецкий, Ю.Б.Кудряшов, А.Г.Рубин, Л.Ю.Бровко, Эффект малых доз. Радиобиология, 1993. 33(1): С. 104 109.

146. С.Ю.Кондратов, Л.И.Ширина, В.В.Кржечковская, Л.Ю.Бровко, Влияние ^ голодания на функциональную активность тучных клеток и содержаниемикросомальных цитохромов в печени. Вопросы питания, 1992. N5-6: С. 45 -47.

147. D.R.Baldwin, E.O.McFalls, D.Jaimes, P.Fashingbauer, T.Nemzek, Myocardial glucose metabolism and ATP levels are decreased two days after global ischemia. J. Surgical Research, 1996. 63(6): p. 35 38.

148. C.H.White, Rapid methods for estimation and prediction of shelf life of milk and dairy products. J. Dairy Science, 1993. 76(10): p. 3126 3132.

149. W.Reybroeck, E.Schram, Improved filtration method to assess bacteriological quality of raw milk based on bioluminescence of adenosine triphosphate. Netherlands Milk and Dairy J., 1995. 49: p. 1 14.

150. S.Bishop, D.Rankine, J.N.Talbott, The nucleotides in normal human blood. J. Biologycal Chemistry, 1959. 234(5): p. 1233 1237.

151. S.J.Stannard, J.M.Wood, The rapid estimation of microbial contamination of meat by measurement of adenosine triphosphate (ATP). Journal of Applied Bacteriology, 1983. 55(3): p. 429 438.

152. Л.Ю.Бровко, И.А.Трдатян, Н.Н.Угарова, Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы. Прикладная биохимия микробиология, 1991. 27(1): С. 134 140.

153. E.Schram, A.-W.Van Witzenburg, Improved ATP methodology for biomass assay. J. Bioluminescence and Chemiluminescence, 1989. 4: p. 390 398.

154. T.Sakakibara, S.Murakami, N.Nattori, M.Nakajimu, K.Imai, Enzymatic treatment to eliminate the extracellular ATP for improving the detectability of bacterial intracellular ATP. Analytical Biochemistry, 1997. 250: p. 157 161.

155. E.Schram, Weyens-van Witzenburg, Bacteriological testing of raw milk with firefly luciferase. In: Proceedings of the 6th International Symposium on Biolum. and Chemilum. "Bioluminescence and Chemiluminescence", 1990, Cambridge. /

156. Eds. Campbell A.K., Kricka L.J., Stanley P.I.: J. Wiley & Sons, 1991: p. 503 -506.

157. Е.М.Гаврилова, Люминесцентный иммуноанализ. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, 1987. 3. М.: ВИНИТИ: С. 6 55.

158. H.Hanberger, L.E.Nillson, E.Kihlstrom, R.Maller, Postantibiotic effect on beta-lactam antibiotics on Escherichia coli evaluated by bioluminescence assay of bacterial ATP. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1990. 34(1): p. 102 -106.

159. K.J.Littel, S.Pikelis, A.Spurgash, Bioluminescent ATP assay for rapid estimation of microbial numbers in fresh meat. Journal of Food Protection, 1986. 49(1): p. 18 -22.

160. G.R.Siragusa, C.N.Cutter, W.J.Dorsa, M.Koohmaraie, Use of rapid microbial ATP bioluminescence assay to detect contamination of beef and pork carcasses. Journal of Food Protection, 1995. 58(7): p. 770 775.

161. D.A.Bautista, J.P.Vaillancourt, R.A.Clarke, S.Renwick, M.W.Griffiths, Rapid assessment of the microbial quality of poultry carcasses using ATP bioluminescence. Journal of Food Protection, 1995. 38(5): p. 551 554.

162. D.R.Ward, K.A.LaRocco, D.J.Hopson, Adenosine triphosphate bioluminescent assay to enumerate bacterial number in fresh fish. Journal of Food Protection, 1986. 49(8): p. 647 650.

163. W.W.Nichols, G.D.W.Curtis, H.H.Johnston, Detection of bacteriuria by bioluminescence; effect of pre-analysis centrifugation of specimens. Journal of Applied Bacteriology, 1984. 54: p. 247 257.

164. T.J.Britz, J.J.Bezudenhout, J.M.Dreyer, P.L.Stein, Use of adenosine triphosphate as an indicator of the microbial counts in milk. South African J. Dairy Technology, 1980. 12: p. 89 91.

165. C.J.Stannard, J.M.Wood, The rapid estimation of microbial contamination of raw meat by measurement of adenosine triphosphate (ATP). Journal of Applied Bacteriology, 1983. 55(3): p. 429 438.

166. O.Molin, S.Ansehn, Rapid detection of bacterial growth in blood cultures by bioluminescent assay of bacterial ATP. Journal of Clinical Microbiology, 1983. 18(3): p. 521 525.

167. E.E.Pahuski, L.S.Martin, P.Murphy, Rapid ATP-based microbiological assay for milk samples. Collaborative Study Report. Simposium on ATP Rapid Microbiology for the Food and Beverage Industries. Cambridge, UK, 1992, June 17.

168. M.W.Griffiths, J.D.Phillips, Prediction of the shelf-life of pasteurized milk at different storage temperatures. Journal of Applied Bacteriology, 1988b. 65: p. 269 -277.

169. A.Lundin, M.Hasenson, J.Persson, A.Pousette, Estimation ofbiomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods in Enzymology, 1986. 133: p. 27 42.

170. A.G.Chapman, L.Fall, D.E.Atkinson, Adenylate energy change in Escherichia coli during growth and starvation. J. Bacteriology, 1971.108: p. 1072 1086.

171. D.P.Theron, B.A.Prior, P.M.Lategan, Sensitivity and precision of bioluminescent techniques for enumeration of bacteria in skim milk. Journal of Food Protection, 1986. 49(1): p. 8- 11.

172. J.R.Bishop, C.H.White, R.Firstenberg-Eden, Rapid impedimetric method for detecting the potential shelf life of pasteurized whole milk. Journal of Food Protection, 1984. 47: p. 471 475.

173. G.S.A.B.Stewart, A review. In vivo bioluminescence: new potentials for microbiology. Letters in Applied Microbiology, 1990.10: p. 1 8.

174. N.G.Lay-King, D.E.Taylor, M.E.Stiles, Estimation of Campylobacter spp. in broth culture by bioluminescence assay of ATP. J. Applied and Environmental Microbiology, 1985. 3: p. 730 731.

175. G.J.Sarkis, W.R.Jacobs, Jr & G.F.Hatfull, L5 luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria. Molecular Microbiology, 1995. 15(6): p. 1055 1067.

176. G.S.A.B.Stewart, P.Williams, Review article. Lux genes and the application of bacterial bioluminescence. J. General Microbiology, 1992.138: p. 1289 1300.

177. G.S.A.B.Stewart, S.P.Denyer, J.Lewington, Microbiology illuminated: gene engineering and bioluminescence. Trends in Food Science & Technology, 1991. 2(1): p. 7- 10.

178. J.M.Baker, M.W.Griffiths, D.L.Colin-Thompson, Bacterial bioluminescence: application in food microbiology. Journal of Food Protection, 1992. 55: p. 62 70.

179. M.W.Griffiths, Bioluminescence and the food industry. J. Rapid Methods and Automation in Microbiology, 1995. 4: p. 65 75.

180. M.W.Griffiths, Application of bioluminescence in the dairy industry. J. Dairy Science, 1993. 76(10): p. 3118 3125.

181. M.Szpakowska, K.Lasocki, J.Grzybowski, A.Graczyk, Photodynamic activity of the haematoporphyrin derivative with rutin and arginine substituents (HpD-Rut2

182. Argi) against Staphylococcus aureus and Pseudonomas aeruginosa. Pharmacology Research, 2001. 44(3): p. 243 246.

183. K.S.Gulliya, T.Chanh, J.Newman, S.Pervaiz, J.L.Matthews, Preactivation a novel antitumour and antiviral approach. Eur. J. Cancer, 1990. 26: p. 551 - 553.

184. S.Pervaiz, Reactive oxygen-dependent production of novel photochemotherapeutic agents. Faseb J., 2001. 15: p. 612 617.

185. G.Guihard, H.Benedetti, M.Besnard, L.Letellier, Phosphate efflux through the channels formed by colicins and phage T5 in Escherichia coli cells is responsible for the fall in cytoplasmatic ATP. J. Biologycal Chemistry, 1993. 268(24): p. 17775 17780.

186. M.Kirsch, E.E.Lomonosova, H.-G.Korth, R.Sustmann, H.Groot, Hydrogen peroxide formation by reaction of peroxynitrite with HEPES and related tertiary amines. J. Biologycal Chemistry, 1998. 273(21): p. 12716 12724.

187. J.L.Lepe-Zuniga, Jr. J.S.Zigler, I.Gery, Toxicity of light-exposed HEPES media. Journal of Immunological Methods, 1987. 103: p. 145.

188. G.T.Spierenburg, F.T.J.J.Oerlemans, J.P.R.M. Van Laarhoven, C.H.M.M.DeBruyn, Phototoxicity of N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid-buffered culture media for human leukemic cell lines. Cancer Research, 1984. 44: p. 2253.

189. Е.И.Дементьева, Н.Н.Угарова, П.Х.Кобболд, Измерение ATP в интактных клетках Escherichia coli, содержащих рекомбинантную люциферазу светляков. Биохимия, 1996. 61: С. 1285 1293.

190. R.Pottier, R.Bonneau, J.Joussot-Dubien, рН dependence of singlet oxygen production in aqueous solutions using toluidine blue as a photosensitizer. Photochemistry and Photobiology, 1975. 22: p. 59 61.