Кинетические закономерности формирования коррозионно активных биопленок и подходы к их элиминированию тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

Азизов Руфат Эйваз оглы

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ КОРРОЗИОННО АКТИВНЫХ БИОПЛЕНОК И ПОДХОДЫ К ИХ ЭЛИМИНИРОВАНИЮ

02 00 15 - катализ 03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003058028

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научные руководители

чл -корр РАН, доктор химических наук, профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич

ведущий научный сотрудник, кандидат технических наук Ефременко Елена Николаевна

Официальные оппоненты

профессор, доктор биологических наук Хочоденко Василий Петрович (ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии) кандидат химических наук Скляр Владимир Ильич (МГУП Мосводоканал)

Ведущая организация

Биологический факультет Московского государственного университета им M В Ломоносова

Защита состоится «27» Февраля 2007 года в 1 б00час на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан «j% » января 2007 i ода

Ученый секретарь диссертационного совета, к х н

Сакодынская И К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биокоррозия металла представляет собой тип коррозии, который развивается под воздействием микроорганизмов, и на сегодняшний день хорошо известно, что около 20-30% всех потерь металла в промышленности происходит за счет биокоррозии

Нефтяная промышленность относится к тем отраслям, основные фонды которых, в наибольшей степени подвергаются воздействию биокоррозии Коррозионно активные клетки микроорганизмов можно обнаруживать в коммуникационных системах с замедленным течением или застаиванием воды, в отстойниках и резервуарах-нефтехранилищах Процессы биокоррозии в нефтяной промышленности часто приводят к авариям с большими экономическими потерями и экологическим ущербом для окружающей среды

Известны научные исследования, направленные на изучение процессов биокоррозии, происходящих на внешних поверхностях металлических конструкций Вопросы, связанные с исследованием процессов биокоррозии внутрикоммуникационных систем при транспортировке промысловых вод, мало изучены, и большинство известных работ посвящены исследованию планктонных клеток, при том, что в этих системах обнаруживаются коррозионно активные биопленки, представляющие собой самоиммобилизующиеся на металлических поверхностях ассоциации клеток преимущественно гетеротрофных (ГБ) и сульфат-восстанавливающих бактерий (СВБ)

Основным методом исследования биопленок является, микробиологический, который заключается в механическом удалении биопленок с металлических поверхностей с последующей их дезинтеграцией ультразвуком и высевом разведений полученных суспензий на селективные среды Поскольку метод является крайне неудобным, так как требует длительного времени культивирования клеток (до 3-х недель) и является крайне не точным, то основные закономерности формирования биопленок остаются мало изученными

В течение нескольких последних десятилетий большое внимание уделяется вопросам ингибирования и элиминирования биокоррозии Поскольку био- и химическая коррозия представляют собой комплексно развивающиеся явления, то скрининг веществ, действие которых одновременно направлено против химического корродирования металла и вызывает гибель микроорганизмов, способствующих протеканию коррозионных процессов, является важной задачей научных исследований, проводимых в данной области

Возможности биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) являются перспективными с точки зрения его применения для фундаментальных исследований особенностей кинетики роста клеток, входящих в состав коррозионно активных биопленок

АТФ является универсальным внутриклеточным метаболитом, содержащимся во всех жизнеспособных клетках любых микро- и макроорганизмов, поэтому его можно рассматривать как универсальный индикатор жизнеспособных клеток в анализируемом образце АТФ можно определять при помощи биолюминесценции с большой точностью даже при ультрамалом содержании вещества в образце - до 1(Г12-1(Г14 М В связи с этим актуальным является разработка новых подходов на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к анализу кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды и грунта, в том числе объектах, загрязненных нефтью, а также к исследованию влияния различных факторов на кинетику формирования коррозионно активных биопленок

Разработка новых экологически безопасных подходов к элиминированию процессов биокоррозии является одной из основных задач промышленности В качестве одного из эффективных средств, позволяющих предотвращать полностью или хотя бы существенно снижать риск развития биокоррозионных процессов, привлекает к себе внимание применение ингибиторов коррозии (ИК) с биоцидной активностью по отношению к планктонным клеткам и биопленкам Скрининг веществ с биоцидным действием среди активно применяющихся на практике ИК представляется крайне актуальной задачей Применение нефтяных сорбентов для удаления нефти из сточных вод с целью уменьшения риска развития коррозионно опасных микроорганизмов, участвующих в формировании биопленок также может быть актуальным, с точки зрения, предотвращения развития процессов биокоррозии

Таким образом, разработка новых подходов к анализу основных факторов, влияющих на кинетику формирования коррозионно активных биопленок, с последующей разработкой экологически безопасных подходов к элиминированию этих факторов является весьма актуальной, и представляет большой научный интерес Проведение таких исследований и разработок крайне важно с экономической и экологической точек зрения применения их на практике

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось установление основных кинетических закономерностей формирования

коррозионЕю активных биопленок, анализ основных факторов, влияющих на их формирование, а также разработка подходов к их элиминированию на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ В ходе работы необходимо было решить следующие основные задачи

- разработать подходы на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к определению численности клеток коррозионных бактерий, а также сравнить полученные результаты с данными микробиологического анализа,

- разработать подходы на основе биолюминесцентного метода определения АТФ к исследованию кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды, грунта, в составе биопленок, формирующихся в том числе объектах, загрязненных нефтью,

- исследовать кинетические закономерности формирования биопленок под влиянием различных факторов, в частности, исследовать влияние микробного состава среды, химического состава сплава, используемого для изготовления металлических конструкции, присутствия нефти в среде и сульфида железа, накапливающегося на поверхности металла, а также типа системы (замкнутые или проточные) на кинетику роста коррозионно активных биопленок,

- разработать подход на основе биолюминесцентного метода определения АТФ к оценке биоцидной активности ИК по отношению к коррозионно активным планктонным клеткам и биопленкам, а также оценитьэффективность применения ИК в качестве биоцидов,

- исследовать возможность применения нефтяных сорбентов для удаления компонентов среды, провоцирующих формирование коррозионно опасных биопленок

Научная новизна работы Разработаны новые подходы на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к исследованию коррозионно активных клеток бактерий Впервые были определены удельные концентрации внутриклеточного АТФ для ряда бактерий, провоцирующих развитие коррозии и относящихся к различным таксономическим группам Показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды, грунта, в составе биопленок, в том числе загрязненных нефтью

Разработан способ дифференцированного определения численности коррозионно активных бактерий в смешанных планктонных культурах и в составе биопленок на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов,

основанные на использовании селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ, а также стандартные математические методы обработки данных по кинетике роста микроорганизмов

С помощью биолюминесцентного метода установлено влияние состава планктонной культуры на кинетику формирования биопленок Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок в средах, различающихся по микробному составу, и установлены кинетические закономерности роста биопленок в зависимости от микробного состава среды

Показано влияние присутствия сульфида железа на поверхности металла на кинетику формирования коррозионно активных биопленок Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок на металлических поверхностях, покрытых различными концентрациями сульфида, и установлена взаимосвязь между процессами накопления сульфида железа, коррозии металла и ростом биопленок

Показано влияние химического состава стали, на которой происходит формирование биопленок, на кинетику этого процесса Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок на металлических поверхностях, отличающихся по химическому составу.

Показано влияние присутствия нефти в среде на кинетику формирования коррозионно активных биопленок Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок в средах с различными концентрациями нефти и выявлены закономерности влияния присутствия нефти в среде на рост клеток в составе биопленок

Показана возможность исследования роста биопленок в проточных системах с помощью биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ Рассчитаны кинетические параметры и установлены закономерности формирования коррозионно активных биопленок в различных по типу системах (проточная и замкнутая)

Разработан подход к оценке биоцидной активности ИК по отношению к различным коррозионно активным планктонным клеткам и биопленкам на основе биолюминесцентного метода анализа Впервые определены минимальные ингибирующие концентрации ряда широко применяемых на практике ИК для планктонных клеток и биопленок с помощью биолюминесцентного метода Установлены закономерности влияния биоцидной активности ИК на планктонные клетки и биопленки Показаны основные преимущества разработанного метода по сравнению с микробиологическим методом определения минимальных ингибирующих концентраций

Показана возможность использования нефтяного сорбента для антибиокоррозионных целей, и установлена эффективность совместного использования нефтяного сорбента Мегасорб и ИК с биоцидными свойствами Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок с применением стадии фильтрации среды с помощью Мегасорба, а также при совместном использовании Мегасорба и ИК

Практическая значимость работы. Основная практическая значимость

результатов, полученных в работе, состоит в том, что

Разработанные подходы на основе биолюминесцентного метода исследования коррозионно акивных клеток и биопленок перспективны с точки зрения эффективной замены традиционно используемых для этих целей микробиологических методов анализа Такая замена может позволить проводить более быстрые и точные анализы коррозионной ситуации in situ,

Разработанный способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, основанного на сочетании биолюминесцентного, микробиологического и кинетического анализа является экспрессным и удобным для анализа экологической ситуации на различных объектах Метод является универсальным и может быть использован не только коррозии в нефтяной промышленности, а также в других отраслях промышленности,

Показаны закономерности формирования биопленок под влиянием различных факторов (микробного состава среды, сульфида железа на поверхности, химического состава сплава, присутствия нефти в среде и типа функционирующей системы), которые необходимо учитывать при конструировании оборудования, а также при разработке стратегии управления процессами коррозии на работающих системах Постоянный контроль этих факторов может существенно продлить время эксплуатации промышленных систем,

Разработанный подход к определению биоцидной активности ИК на основе биолюминесцентного метода определения АТФ может быть применен при определении необходимости использования тех или иных биоцидов на промышленных объектах, подверженных биокоррозии, что представляет собой большой экологический и экономический интерес,

Совместное применение сорбента Мегасорб с ИК может снизить цену антибиокоррозионых программ, а также представляет большой интерес как экологически безопасный подход к элиминированию биокоррозии Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийских и Международных конференциях Междунар конференции "Biocatalysis-2002 Fundamentals and Applications"

(Москва, Россия, 2002), Междуиар конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии» (Тверь, Россия, 2002), 8 и 9-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004, 2005), 2-ом и 3-ем Московских Междунар конгрессах «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2003, 2005), конференции молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда имени ИВ Березина «Инженерная энзимология», посвященной 80-летию ИВ Березина (Москва, Россия, 2003), Всерос симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, Россия, 2004), 4-ой Междунар конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, Россия, 2005), 3-ем Европейском конференции «Bioremediation» (Crete, Greece, 2005), 7-ом Междунар конференции «Physical Chemistry» (Belgrade, Serbia and Montenegro, 2004), 6-ом Междунар Мамедалиевском конференции «Нефтехимия» (Баку, Азербайджан, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 4 статьи в международных журналах, 4 статьи в международных сборниках статей, 10 тезисов докладов в материалах Международных и Всероссийских конференций, симпозиумов и конгрессов Получен 1 Патент РФ на изобретение

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 ссылок Работа изложена на 157 страницах, содержит 61 рисунок и 21 таблицу

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть Объекты исследования. В работе были использованы следующие бактериальные культуры Rhodococcus erythropohs АС-1514, Rhodococcus ruber АС-1513, Rhodococcus rhodochrous, Pandorea sp, Pseudomonas putida B-1091, Desulfovibrio vulgaris B-1388, Desulfovibrio desulfiricans B-1799, Acidithiobacdlus ferrooxidans B-458 Также в работе использовалась ассоциация коррозионно активных клеток, которая была выделена из нефтяных месторождений Альметьевска (Татарстан) и характеризовалась высокой (106-107 кл/мл) концентрацией СВБ В работе использовались ИК

(Нитро-1, Нитро-2, Каспий-2, Каспий-4, Хазар, ВФИКС-82), широко применяемые в нефтяной промышленности стран СНГ и разрабатываемые в России (Ингибитор 55)

Методы исследования. Культивирование ГБ проводили в колбах Эрленмейера на термостатируемой качалке IRC-1-U (Швецария) (180 об/мин, 28°С) Использовали питательную среду следующего состава (в г/л) триптический гидролизат кильки и хлорида натрия (содержание в г/л 10,05 и 4,95, соответственно), NaCl 5,0, КН2Р04 3,0, Na2C03 - 0,1, К2НР04 - 6,0, NH4C1 - 2,0, MgS04 х 7Н20 - 0,2, СаС12 х 6Н20 - 0,01, MnS04 х 5Н20 - 0,02, FeS04 х 7Н20 - 0,01, pH 6,7 - 7,2 При необходимости биомассу осаждали на центрифуге Beckman J2-21 (США, 15000 об/мин, 15 мин)

Культивирование СВБ проводили в пробирках Хоттингера Для роста клеток использовали среду Постгейта следующего состава, (в г/л) лактат -4,0, дрожжевой экстракт - 1,0, аскорбиновая кислота - 0,1, MgS04 х 7Н20 -0,2, К2НР04 - 0,01, Fe(S04)2(NH4)2 х 6Н20 - 0,2, NaCl - 10,0 Клетки культивировали в термостате при 30°С и 37°С в анаэробных условиях Выращивание биопленок проводилось на поверхности металлических купонов (Стандард-Металл, Россия) в питательных средах в течении 2-х недель

Концентрацию внутриклеточного АТФ определяли люциферин-люциферазным методом с использованием реагента на основе рекомбинантной люциферазы светляков (ООО Люмтек, Россия) Биолюминесценцию измеряли с помощью люминометра Microluminometr 3560 (New horizons diagnostics Co, США) Для экстракции АТФ из планктонных клеток бактерий в жидких инкубационных средах использовали диметилсульфоксид (ДМСО) Для определения удельной концентрации внутриклеточного АТФ в клетках использовали калибровочные графики логарифмической зависимости концентрации клеток от концентрации внутриклеточного АТФ

Пробы грунта, загрязненных нефтью, обрабатывали хлороформом Далее использовали буферные растворы для экстракции АТФ из хлороформных экстрактов

Для определения АТФ в составе биопленок использовали металлические купоны, покрытые биопленками, отмывали их от планктонных клеток физиологическим раствором и обрабатывали ДМСО Экстракцию АТФ проводили в течение 15 мин с периодическим перемешиванием на мешалке Vortex (Biosan, Литва) Металлические купоны перед их использованием во всех экспериментах обрабатывались ацетоном, затем выдерживались в растворе 0,1 М HCl, промывались дистиллированной водой и высушивались при комнатной температуре

Для определения удельной скорости роста (ц) планктонных клеток и биопленок строили кинетические кривые роста в натуральных полулогарифмических координатах При обработке кинетических данных использовали первые 5-8 точек кинетической кривой, входящих в экспоненциальную фазу роста

Определение концентрации сульфида проводили

спектрофотометрически с использованием н,н-диметил-п-финилендиамина

При исследовании коррозионных процессов определяли массовый показатель коррозии (К), представляющий собой отношение изменения массы образца металла в результате коррозии (мг), к площади корродируемой поверхности (см2) Металлические купоны после подготовки к эксперименту взвешивались на аналитических весах В процессе формирования биопленки металл обрабатывали раствором н,н-диметил-п-финилендиамина (2 мл/см2) для удаления биопленки с поверхности, промывали дистиллированной водой, подсушивали на воздухе и взвешивали Для получения металлических поверхностей с различными концентрациями сульфида железа на поверхности купоны экспонировали в среде с природной ассоциацией коррозионно активных клеток в течение различного времени Начальная концентрация клеток в среде составляла (3,5 ± 0,6) х 104 кл/мл. Далее металлические поверхности, покрытые биопленкой, экспонировали в ДМСО в течение 30 мин и промывали дистиллированной водой

Для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) готовили ступенчатые разведения растворов ИК в физиологическом растворе, затем туда вносили суспензии клеток так, чтобы концентрации клеток в образцах составляли 106-107 кл/мл (N0) После выдерживания клеток в физиологическом растворе при 28°С в течение 7 сут в присутствии ИК определялась их остаточная концентрация (К) с использованием биолюминесцентного метода Далее проводилась линеаризация полученных данных с расчетом достоверности аппроксимации Для определения МИК различных ИК по отношению к коррозионно активным биопленкам выдерживали биопленки в физиологическом растворе при 28°С в течение 7 сут в присутствии различных концентраций ИК, после чего определяли остаточную концентрацию клеток в составе биопленок

В работе использовались пробы нефтей из Бакинских месторождений -Балаханы и Сураханы (ИНХП, Азербайджан), а также нефтесорбент Мегасорб (ООО «Инкомцентр», Россия), разработанный для сбора нефти и нефтепродуктов с поверхности воды Мегасорб представляет собой нетканый, волокнистый материал, изготовленный из полимерных волокон

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях

Результаты и обсуждение 1. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста микроорганизмов, участвующих в процессах биокоррозии

Поскольку именно планктонные клетки, присутствующие в сточных водах, участвуют в формировании биопленок, первоначально основное внимание в исследовании было уделено именно им Были установлены биолюминесцентным методом значения удельных концентрации внутриклеточного АТФ, характерные именно для тех клеток, которые являются основными известными участниками биокоррозионных процессов (Габл 1) Исследования СВБ и ГБ проводились в средах, которые далее использовались в работе при культивировании биопленок

Таблица 1 Удельная концентрация внутриклеточного АТФ в клетках микроорганизмов, участвующих в процессах биокоррозии

Микроорганизм Удельная конц АТФ , моль/кл

D vulgaris (5,2±0,3)xl0-"s

D desulfiricans (4,0±0,2)х10"18

D deratrificance (8,7±0,4)xl0"ls

Ac ferrooxidans (2,7±0,4)xl0'"

Ps putida (l,0±0,l)xl0"'v

Rh erythropolis (2,1±0,3) x 10'"

Rh rubber (2,4+0,2) x 10""

Rh rhodochroui (3,1+0,6) x 10""

Полученные данные применялись для исследования кинетики роста этих клеток (Рис 1) Было установлено, что скорость роста железоокисляющих бактерий оказалась существенно ниже, чем у СВБ и ГБ, поэтому именно этим двум типам клеток далее уделялось основное внимание при изучении биокоррозионных процессов

-D vulgaris -»—Ps putida -+-Ac ferrooxidans

Микроорганизм Удельная скорость роста (|i), ч"1

Ps putida 0,20

D vulgaris 0,11

Ac ferrooxidans 0,06

50 100 время, ч

150

Рис. 1. Кинетические кривые и удельные скорости роста клеток

В нефтяной промышленности в транспортных коммуникациях часто грунт присутствует в смеси с нефтью и микробными клетками Определение их численности в таких системах составляет отдельную задачу Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для ее решения позволило установить возможность определения численности клеток в присутствии различных концентраций нефти (до 60% масс) Следует отметить новизну и практическую значимость этих результатов, так как они могут быть использованы не только при исследовании процессов биокоррозии, но и для оценки численности клеток-нефтедеструкторов, которые, в свою очередь, часто используются для биоремедиации почв и воды Точность определения численности клеток составила 80-90% Исследование кинетики роста планктонных клеток в средах с нефтью показало, что их удельная скорость роста зависит от концентрации нефти в исследуемой системе (Рис 2)

0 6 0 5 Н

н

>ч

0 4 0 3

и

á 0 2 0 1 о

0 2 4 6

Нефть в грунте, %

Рис. 2. Удельные скорости роста клеток ГБ в грунте Клетки Ps putida (а), Rh ruber (•), смесь Ps putida и Rh rubber (о)

Также было установлено, что удельная скорость роста планктонных клеток ГБ увеличивается в смешанных культурах, что проводит к ускорению накопления в среде метаболитов, необходимых в качестве субстратов для развития СВБ

В начале работы с коррозионно активными биопленками были оптимизированы условия применения биолюминесцентного метода для их исследования Был проведен выбор экстрагирующего реагента, определено оптимальное соотношение объема реагента и обрабатываемой площади поверхности биопленки, а также минимальное время, достаточное для обеспечения максимальной экстракции АТФ Было, установлено, что ДМСО является самым эффективным экстрагентом, позволяющим в течении 15 мин провести полную экстракцию АТФ из биопленки при ее обработке 0,5 мл ДМСО на 1 см2 поверхности Последующий анализ роста биопленок показал, возможность применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста биопленок Удельная скорость роста клеток в составе биопленки на основе индивидуальной культуры СВБ составила 0,082 ч"1

Известно, что клетки, участвующие в процессах биокоррозии, чаще всего присутствует на объектах, подверженных коррозии, в составе смешанных культур Для выяснения роли представителей отдельных типов клеток, в частности, ГБ и СВБ был разработан способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, предполагающие использование селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа концентрации внутриклеточного АТФ, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных роста микроорганизмов Результаты предложенного дифференцированного определения были подтверждены микробиологическим методом (Табл 2)

Таблица 2 Сравнение результатов дифференцированного анализа различных клеток, проведенного микробиологическим методом и согласно предлагаемому комбинированному подходу_

Анализируемые образцы Концентрация клеток в смеси

Микробиологический метод Используемый метод

Модельная система, (кл/мл) Pseudomonas putida Desulfovibrio vulgaris Acidithiobacillus ferrooxidans (4,3±0,5)х106 105 103 (5,5±0,4)х106 (4,2±0,1)х105 (6,3±0,3)х103

Биоиленка, (кл/см2) Pseudomonas putida Desulfovibrio vulgaris (6,9±0,5^)х103 (7,5±0,3)х103 (2,2±0,2)х107

При этом предложенный подход на основе биолюминесцентного определения АТФ потребовал существенно меньшего времени для проведения анализа и обеспечил его более точный результат Новизна предложенного дифференцированного метода анализа смешанных культур в составе биопленок была подтверждена Патентом РФ на изобретение (№2263148,2005)

2. Исследование закономерностей формирования коррозионно активных биопленок и факторов, влияющих на них

Были проведены исследования кинетических закономерностей формирования биопленок при варьировании ряда факторов, в частности, микробного состава планктонных культур в среде, химического состава корродируемого металла, присутствия и концентрации нефти в среде, присутствия сульфида железа на поверхности металла и типа функционирующей системы, подверженной биокоррозии

При исследовании влияния микробного состава среды на кинетические

закономерности формирования биопленок, суспензии клеток были

приготовлены с разными концентрациями СВБ и ГБ, при этом тех или иных

клеток в суспензиях было больше или они были в среде в одинаковых

концентрациях (Рис 3) Было показано, что на разных стадиях роста

биопленка имела гетерогенный состав, и независимо от исходного

микробного состава планктонных клеток скорость роста СВБ в составе

биопленок была больше, чем ГБ Именно удельная скорость роста биопленки

в среде с исходно высокой концентрацией СВБ оказалась максимальной (Рис

3) Полученные данные подтвердили определяющую роль СВБ в

формировании коррозионно активных биопленок

Удельные скорости роста

2 4 6 8 10 12 время, сут

Рис. 3. Кинетические кривые роста биопленок в средах с различными составами планктонных культур (♦) СВБ > ГБ, (А) СВБ = ГБ, (и) СВБ<ГБ

В качестве другого фактора, который мог бы влиять на формирование коррозионно активных биопленок, было рассмотрено присутствие сульфида железа на поверхности металла Были подготовлены металлические купоны с исходно разными концентрациями сульфида на поверхности Последующие исследования показали, что процесс формирования биопленок ускоряется на поверхности металла, покрытой сульфидом (Рис 4), при этом его наличие на поверхности в основном влияет на экспоненциальную фазу роста биопленок Удельная скорость роста биопленки возрастает с увеличением исходной концентрации сульфида на поверхности металла (Рис 5) Вероятно, это связано с тем, что присутствие сульфида на поверхности обеспечивает ее гетерогенность и улучшение условий для развития химической коррозии

Рис. 4. Кинетика роста биопленок на металлических поверхностях, покрытых сульфидом железа (мкг/ см2) ♦ - контроль, А- 0,45, □ -0,92, о -1,41, в -2,20

0 12 3 Р^маЛм2 Рис. 5. Удельные скорости роста биопленок от присутствия различных концентраций сульфида железа на металле

Параллельное исследование массового показателя коррозии и кинетики накопления сульфида в составе биопленок показало, что оба явления ускоряются в конце логарифмической фазы роста биопленок (Рис 6) Данный факт свидетельствует о четкой взаимосвязи между формированием биопленки и химической коррозией металла Эти результаты имеют большую практическую значимость, так как подтверждают высокую опасность развития биопленок и необходимость их элиминирования с целью снижения риска коррозионных потерь металла (Рис 6)

В нефтяной промышленности используются металлы с различным химическим составом В частности, из низкоуглеродистой стали состоят части конструкций, используемых в неагрессивных условиях и в отсутствии воды, из углеродистой стали состоят старые трубопроводы, насосы и резервуары, а из нержавеющей стали изготавливаются трубопроводы при добыче нефти со дна морей В связи с этим в работе исследовались

кинетические закономерности формирования биопленок на поверхности мягкой, углеродистой и нержавеющей сталей (Рис. 7).

Рис. 6. Кинетические кривые роста биопленки, накопления сульфида и химической коррозии на поверхности металла, изначально покрытой сульфидной пленкой с концентрацией сульфида 2,2 мкг/смг.

Самая высокая удельная скорость роста биопленок наблюдалась на поверхности мягкой стали. Формирование биопленок сопровождалось накоплением сульфида и химической коррозией мягкой и углеродистой стали, и практически отсутствовали потери металла в случае нержавеющей стали за весь период проведения эксперимента. При этом на поверхности нержавеющей стали рост биопленкй был также незначительным. Таким образом, было установлено, что формирование биопленок на металлической поверхности существенно зависит от химического состава стали, и выбор стали крайне важен с практической точки зрения.

_ Исгзпь-б еасталь-2 0 [П12Х18Н10Т

"I 8 I

. I I I И

4 о [_Ь_ Е I¡L_.iL Ш,

2 5 7 1 1 1 3 1 5

время, сут

Рис. 7. Кинетика роста биопленок на поверхности различных металлов.

Еще одним исследованным фактором, который влиял на развитие биопленок, было присутствие нефти в среде Следует отметить, что в промысловых водах нефтяной промышленности практически всегда присутствует нефть, и даже после первичной очистки ее концентрация в водах составляет 1-5% Анализ удельных скоростей роста биопленок при различных концентрациях нефти в среде показал, что при низких концентрациях нефти (1-3%) наблюдается увеличение удельной скорости роста (Рис 8) Дифференцированный анализ численности клеток в составе биопленок показал, что наличие нефти в среде способствует увеличению численности не только клеток ГБ, но также и СВБ

и о о. о

к <в

X

л с: ш

5

Рис. 8. Удельная скорость роста биопленки в среде с разной концентрацией нефтьи

Необходимо отметить, что до сих пор исследовались процессы формирования биопленок в статичной системе, тогда как в нефтяной промышленности в большинстве случаев функционируют проточные системы В связи с этим далее особое внимание было уделено исследованию закономерностей формирования биопленок в зависимости от типа проточной системы Следует подчеркнуть, что изучение влияния протока на скорость роста биопленок в подобных системах ранее никем не проводилось На практике у нефтяников существует умозрительное представление о том, что при достаточно высоких скоростях протока формирование биопленок вообще не происходит На самом деле при исследовании открытой проточной системы, оказалось, что идет активное формирование биопленок, правда оно имеет различный характер при относительно высоких и низких скоростях протока (Рис 9) Результаты этих исследований являются весьма значимыми с практической точки зрения, так как на их основе могут быть рекомендованы строго определенные скорости протока сточных вод для применения на практике, а именно не менее 0,1 м/с

Сравнение кинетики роста биопленок в системах различного типа показало, что самая высокая удельная скорость роста характерна именно для открытой проточной системы (Рис 10)

скорость протока, м/с

Рис. 9. Влияние скорости протока на удельную скорость роста биопленок в открытой системе

время, ч

Рис. 10. Кинетические кривые роста биопленок в различных системах

В целом следует отметить, что совокупность данных, полученных при исследовании факторов, влияющих на кинетику формирования биопленок, категоричным образом свидетельствуют о необходимости изменения действующих на практике противокоррозионных программ, поскольку требуется другая, отличная от планктонных культур, стратегия борьбы с биопленками

3. Разработка подходов к элиминированию процессов биокоррозии 3.1. Исследование возможности применения ингибиторов коррозии для предотвращения биокоррозии

На практике единственным средством предотвращения коррозии являются ИК, и, очевидно, что, с точки зрения элиминирования биокоррозии,

большой интерес могут представлять ИК, имеющие биоцидную активность Следует отметить, что на практике используются вещества, обладающие биоцидной активностью, для которых определяют МИК по отношению к планктонным клеткам, но не биопленкам

Исследовалась возможность применения биолюминесцентного метода для оценки биоцидной активности ИК, уже широко используемых в нефтяной промышленности стран СНГ и вновь разрабатываемых Было установлено, что ряд ИК ингибируют люциферазу, а отдельные виды ИК, содержащие в своем составе ПАВ, оказывают слабый активирующий эффект (Табл 3 и 4) Вместе с этим анализ констант ингибирования, активации и констант Михаэлиса реакций взаимодействия люциферазы с АТФ в присутствии различных концентраций ИК показал (Табл 5), что концентрации веществ, которые оказывают какое-либо влияние, существенно выше (в 100-300 раз) тех, которые реально применяются на практике

Таблица 3. Константы ингибирования Таблица 4 Константы активации люциферазы различными ИК люциферазы некоторыми ИК

Ингибиторы коррозии Константа ингибирования, К„ г/л

Катон Ингибитор-55 Хазар Нитро-2 Каспий-4 0,81 ±0,08 3,20 ± 0,34 9,05 ± 0,92 10,52 ± 1,20 8,16 ±0,90

Ингибиторы Константа

коррозии активации,

Ка, г/л

Нитро-1 0,32

Каспий-2 0,26

ВФИКС-82 0,16

Таблица 5 Константы Михаэлиса для реакции люциферазы с АТФ в присутствии различных ИК

Конц ИК, г/л К„, мМ

Ингибитор-55 Хазар Нитро-2 Каспий-4

0,1 0,35 0,38 0,36 0,37

0,4 0,49 0,43 0,45 0,43

1,0 0,54 0,55 0,49 0,53

3,0 0,57 0,62 0,54 0,59

В связи с этим стало очевидно, что биолюминесцентный метод может быть использован для определения МИК для различных ИК Значения МИК в отношении планктонных клеток, полученные биолюминесцентным

методом, были выше по сравнению с данными микробиологического анализа (Табл 6) Предположительно, такие результаты были следствием того, что микробиологическим методом определялись только все растущие клетки, а биолюминесцентным методом все жизнеспособные клетки, в том числе и не делящиеся.

Таблица 6 МИК разных ИК, определенные микробиологическим и биолюминесцентным методами, по отношению к разным бактериальными культурами

Микроорганизм МИК, мг/л

Катон ВФИКС 82 Хазар Нитро-1 Каспий-2 Каспий-4

Микробиологический метод

Р риШа 30 75 30 30 75 75

А /еггоохкЗат 50 75 50 50 75 50

О х'и^апя 100 100 75 75 50 40

Биолюминесцентный метод

Р риШа 117 165 55 57 172 160

А /еггоохгсЬт 120 162 133 111 164 114

О т^агк 229 332 174 169 327 230

Понятно, что на практике состав промысловых вод может быть разным, поэтому далее, чтобы определить влияние химического состава вод на действие биоцидного вещества, были взяты различные варианты сред, в частности, питательная среда, физиологический раствор, промысловая вода из нефтяного месторождения и артезианская вода, которую закачивают в скважину (Табл 7) Результаты показали, что действие биоцида, внесенного в образцы воды в концентрации МИК, было не однозначным, согласно данным, полученным микробиологическим и биолюминесцентным методами Очевидно, что с помощью биолюминесцентного метода были определены не только растущие, но и некультивируемые формы бактерий, а также было очевидно, что отдельные образцы исследованной воды, например, Артезианской, вообще не требовали введения биоцида, так как

сами вызывали гибель клеток, в частности, из-за высокой концентрации солей (329 г/л)

Определение МИК в отношении биопленок позволило установить, что биопленки, формирующиеся на основе смешанных культур, более устойчивы к действию биоцидов, поэтому их применение в отношении таких биопленок с целью полного подавления их роста должно быть в больших концентрациях, чем для биопленок, сформировавшихся на основе монокультур и, безусловно больше, чем для планктонных клеток (Табл 8)

Таблица 7 Исследование микробиологическим и биолюминесцентным методами биоцидной активности Катона, введенного в МИК в разные инкубационные среды по отношению к клеткам Р риПс1а_

Среда для инкубации клеток Исходная концентрация клеток, кл/мл Конечная концентрация клеток, кл/мл

Биолюминесцентный метод Микробиологи ческий метод

Питательная среда - без Катона - с Катоном (5,3±0,3) х 107 (5,6±0,2) х 106 (2,1 ±0,2) х 109 (3,8±0,4) х 106 (1,6±0,1) х 109 (2,8±0,8) х 10'

Физиологический рас I вор - без Катона - с Катоном (8,2±0,5) х 106 (7,5±0,6) х 106 (7,7±0,7) х 106 (7,5±0,6) х 105 (3,1 ±0,2) х 106 Нет клеток

КНС 1417 (промысловая вода Сиреньковского нефтяного месторождения «Ямашнефть») - без Катона - с Катоном (5,0±0,7) х 106 (6,9±0,5) х 106 (1,7±0,1) х 105 (5,0±0,3) х 103 Нет клеток Нет клеток

Артезианская вода Ромашкинского нефтяного месторождения («Альметьевскнефть», Девон) - без Катона - с Катоном (5,0±0,3) х 106 (5,4+0,3) х 106 Нет клеток Нет клеток Нет клеток Нет клеток

Таблица 8 МИК разных ИК для планктонных клеток и биопленок

Микроорганизмы МИК, мг/л

Катон вхт-юоз Хазар Нитро-1 Инг №55 ВФИКС-82

Планктонные клетки СВБ 200 200 150 150 300 300

Биопленка на основе СВБ 750 1000 1000 800 800 1000

Биопленка на основе природной ассоциации клеток 800 1000 1100 900 900 1100

При этом было установлено, что введение вещества с биоцидной активностью в среду с планктонными клетками в начале формирования

биопленок приводит к более эффективному снижению их удельной скорости роста, чем при внесении биоцида в среду в экспоненциальной фазе роста биопленок(Табл 9)

Таблица 9 Удельные скорости роста биопленок при внесении Катона на разных стадиях роста_

Конц Снижение И,*' Снижение

ингибитора (при внесении удельной (при внесении ИК в удельной

коррозии, ИК до начала скорости экспоненциальной скорости

мг/л формирования биопленок) роста, % фазе роста биопленок) роста, %

0 0,086 контроль 0,070 контроль

50 0,060 30 0,061 12

100 0,045 48 0,049 29

150 0,031 65 0,038 44

3.2. Использование нефтяного волокнисто-пористого сорбента для снижения скорости биокоррозионных процессов

При анализе факторов, влияющих на формирование биопленок, в частности, присутствия планктонных клеток, нефти и сульфида железа, возникла идея снижения скорости развития биокоррозионных процессов за счет элиминирования этих факторов. В качестве средства такого элиминирования был использован нефтяной сорбент Мегасорб, обладающий колоссальной нефтеемкостью (40 кг нефти/кг сорбента) и уникальной скоростью сорбции (4 кг нефти/кг сорбента/мин) Известно, что Мегасорб может быть использован в 100 рабочих циклах после полной загрузки нефтью и ее удаления отжимом Следует отметить, что нефтяные сорбенты, предназначенные для ликвидации последствий аварий с разливом нефти, ранее никем не применялись для решения проблем, связанных с предотвращением коррозии металла

При прокачивании среды, имитирующей по своему составу промысловые воды, через колонку, заполненную Мегасорбом, было установлено, что в ходе одного фильтрационного цикла из среды удаляется весь сульфид железа (Рис 11) При этом емкость сорбента по сульфиду составляет 1 мг/г сорбента

В отношении планктонных клеток, присутствовавших в той же среде, в концентрациях 106 кл/мл, было установлено, что они могут быть удалены на 90% после однократной фильтрации среды через Мегасорб (Рис 12)

[в2! мг/п

6 I

2 3 4 5

масса сорбента, г

Рис. 11. Зависимость остаточной концентрации сульфида в среде после ее фильтрации (1л) через сорбент

10

15

20

масса сорбента, г

Рис. 12. Эффективность удаления клеток

Мегасорбом из среды объемом 1 л, где N0 и N концентрации клеток в потоке до и после фильтрации

Обработка сточных вод фильтрацией через Мегасорб позволила снизить скорость формирования биопленки в 4 раза Проверка эффективности применения Мегасорба с одновременным введением в систему ИК с биоцидным действием показала, что количество вещества, необходимого для полного удаления биопленок, может быть снижено на 30%

ВЫВОДЫ

1 Определены удельные концентрации внутриклеточного АТФ для ряда клеток бактерий, относящихся к различным таксономическим группам и участвующих в процессах биокоррозии Показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста клеток, участвующих в развитии процессов биокоррозии Оптимизированы условия применения биолюминесцентного анализа для исследования кинетики роста ГБ в пробах, загрязненных нефтью (до 60% масс)

2 Оптимизированы условия применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста коррозионно активных биопленок Разработан способ дифференцированного определения численности бактерий в

смешанных культурах, позволяющий исследовать микробный состав коррозионно активных биопленок

3 Выявлены закономерности формирования коррозионно активных биопленок под влиянием различных факторов Установлено, что основную роль в формировании коррозионно активных биопленок играют СВБ, на всех стадиях роста состав коррозионно опасных биопленок является гетерогенным, присутствие ГБ увеличивает скорость формирования биопленок Показано, что присутствие сульфида железа на металлических поверхностях ускоряет рост на них биопленок Установлено, что химический состав стали, используемой для изготовления металлических конструкций, определяет скорость развития на них коррозионно опасных биопленок Выявлено, что присутствие 1-3 % нефти в среде ускоряет процесс формирования биопленок Показано, что зависимость формирования биопленок от скорости протока имеет различный характер при относительно высоких и низких скоростях протока Установлено различие в удельных скоростях роста биопленок в стационарной, открытой и замкнутой проточной системах

4 Показано, что ИК могут влиять на люциферазную реакцию Вместе с этим анализ кинетических параметров люциферазной реакции в присутствии ИК подтвердил возможность применения биолюминесцентного метода для исследования биоцидной активности этих веществ Разработан подход на основе биолюминесцентного метода к определению биоцидной активности ИК по отношению к различным планктонным культурам и биопленкам Установлено, что значения МИК исследованных ИК по отношению к биопленкам в 3-8 раз больше по сравнению с планктонными культурами Установлено, что именно в начальной стадии формирования биопленок необходимо вводить в функционирующие системы нефтяной промышленности ИК с биоцидным действием

5 Показана возможность использования нефтяного сорбента в антибиокоррозионных целях Применение Мегасорба позволяет снизить МИК разных ИК с биоцидным действием в отношении биопленок на основе СВБ на 30%

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Efremenko Е , Azizov R , Makhhs Т, Krupianko Р , Varfolomeyev S (2002) Bioluminescent method based on luciferase application for enumeration of oil-degrading microorganisms // Proc Petrochem Oil Refining, V 1 (4), p 92-104

2 Efremenko E N, Azizov R.E , Makhhs T A , Varfolomeyev S D , Abbasov V M (2003) Estimation of biocide activity of corrosion inhibitors by bioluminescent method // Pioc Petrochem Oil Refining, V 4(15), p 70-75

3 Ефременко Е Н , Азизов Р.Э , Махлис Т А , Аббасов В М, Варфоломеев С.Д (2005) Определение биолюминесцентным методом минимальных ингибирующих концентраций веществ по отношению к бактериям, участвующим в биокоррозии И Прикл биохимия и микробиол , Т 41 (4), с 429-434

4 Efremenko Е N , Azizov R.E , Raeva А А , Abbasov V М , Varfolomeyev S D (2005) An approach to the rapid control of oil spill bioremediation by biolummescent method of intracellular ATP determination // Intern Biodeterior Biodegr,V 56, p 94-100

5 Efremenko E N , Azizov R.E., Abbasov V M, Varfolomeyev S D (2006) Analysis of bacteria self-immobilized into corrosive biofilms // In Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed Zaikov G E ), Nova Science Publishers Inc , N -Y, p 39-58

6 Азизов P. Э, Махлис T A, Ефременко E H (2002) Определение бактерий, деградирующих углеводороды нефти биолюминесцентным методом II Межд конференция «От фундаментальной науки - к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии», Тверь, Россия, 15 ноября, с 118-120

7 Efremenko Е N, Azizov R.E , Makhlis Т А , Varfolomeyev S D , Abbasov V M (2004) Kinetic parameters of bilummescent reaction for screening of new biocides among corrosion inhibitors // Intern Conference on Physical Chemystry, 21-23 September, Belgrade, Serbia and Montenegro, p 273-275

8 Efremenko E N, Azizov R.E , Abbasov V M (2005) Enzymatic method used to control the efficacy of oil decontamination, dunng the bioremediation processes II III Eur Bioremed Conference, Chania, Crete, Greece, July 4-7, p 142-146

9 Ефременко E H , Азизов Р.Э., Махлис T A , Варфоломеев С Д (2005) Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах// Патент РФ № 2263148, Бюл№30, приоритет от 18 02 2004

10 Azizov R.E.. Krupyanko PV, Kahstratova EA, Makhlis ТА, Efremenko E N Estimation of microbial oil-degradation activity by ATP-bioluminescent method // Intern Conference BIOCATALYSIS-2002 Fundamentals & Applications, June, 22-27, Moscow, Russia, 2002, p. 68

11 Efremenko E N , Azizov R.E., Makhlis T A , Varfolomeyev S D Analysis of environmental situation in the oil fields by the biolummescent method of ATP detection 11 The 2nd Moscow Intern Congress on Biotechnology, November 10-14, Moscow, Russia, 2003, p 227-228

12 Азизов Р.Э., Ефременко E H, Аббасов В M Влияние различных ингибиторов коррозии на кинетические параметры люциферазной реакции //

Конф молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им ИВ Березина «Инженерная этимология» посвящ 80-летию ИВ Березина, Москва, 2003, с 6-7

13 Азизов Р.Э., Ефременко ЕН, Варфоломеев СД, Аббасов ВМ Исследование процессов биокоррозии в нефтяной промышленности биолюминесцентным методом // 8-я Межд Конф "Биология — Наука XXI века", 17-21 мая, Пущино, Россия, 2004, с 250

14 Efremenko EN, Azizov R.E., Varfolomeyev S.D, Abbasov VM Determination of oil-degrading and biocorrosive microorganisms by biochemical method of ATP detection // XVIII National Chemistry Congress, July 5-9, Kars, Turkey, 2004, p 467.

15 Азизов Р.Э., Ефременко E H, Махлис T A , Аббасов В M, Варфоломеев С Д Исследование формирования коррозионных биопленок биолюминесцентным методом // Всерос Симп «Биотехно погия Микробов», Москва, Россия, 19-22 октября, 2004, с 8

16 Azizov R.E.. Efremenko Е N, Makhlis Т А, Varfolomeyev S D Analysis of biocatalytic systems based on cells, self-immobilizing throughout the biocorrosion processes // The 3-rd Moscow Intern Cong on Biotechnology, Moscow, Russia, March 14-18, 2005, p 175 - 176

17 Азизов Р.Э.. Ефременко E H , Варфоломеев С Д, Аббасов В М Новые подходы на основе биолюминесцентного метода к анализу основных факторов, влияющих на формирование коррозионных биопленок // 9-я Межд Конф Биология — Наука XXI века, Пущино, Россия, 18-22 апреля, 2005, с 338

18 Азизов Р.Э., Ефременко Е Н, Варфоломеев С Д , Аббасов В М Влияние различных факторов внешней среды на формирование коррозионных биопленок // VI Межд Конф «Проблемы загрязнения окружающей среды» ICEP - 2005, Пермь, Россия, 20-25 сентября, с 52

19 Азизов Р.Э, Ефременко Е Н, Варфоломеев С.Д, Аббасов В М Исследование антибиокоррозионной эффективности пористых сорбентов в нефтяной промышленности // 6-я Бакинская Межд Мамедалиевская Конф Нефтехим , Баку, Азербайджан, 27-30 сентября, 2005, с 8

БЛАГОДАРНОСТЬ

Я выражаю искреннюю благодарность чл -корр НАН Азерб , проф , д х н Вагифу Магеррам оглы Аббасову за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку при выполнении моей работы

Подписано в печать 19 01 2007 Формат 60x88 1/16 Объем 1 75 п л Тираж 100 экз Заказ № 597 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биокоррозия.

1.1.1. Объекты, подверженные биокоррозии.

1.1.2. Участие сульфат-восстанавливающих бактерий в процессах биокоррозии.

1.1.3. Другие бактерии, участвующие в процессах биокоррозии.

1.2. Коррозионно активные биопленки.

1.2.1.Формирование коррозионно активных биопленок: состав и взаимосвязь с коррозионными процессами.

1.2.2. Факторы, влияющие на формирование коррозионно активных биопленок.

1.2.2.1. Влияние кислорода на развитие биопленок.,.

1.2.2.2. Влияние протока на формирование коррозионно активных биопленок.

1.2.2.3. Влияние химических свойств металла, на поверхности которого формируются биопленки.

1.3. Методы исследования биокоррозии.

1.3.1. Методы дифференцированного исследования планктонных культур.

1.3.1.1. Микробиологические методы.

1.3.1.2. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.3.1.3. Косвенные методы определения клеток.

1.3.1.4. Флуоресцентные и иммунологические методы.

1.3.2. Методы исследования коррозионно активных биопленок.

1.4. Подходы к предотвращению процессов биокоррозии.

1.4.1. Применение ингибиторов коррозии с биоцидной активностью.

1.4.2. Биоцидные вещества в нефтяной промышленности.

1.4.3. Ингибирущая роль биопленок в развитии коррозии.

1.4.4. Применение лигированных сталей.

1.4.5. Удаление накапливающихся загрязнений, нефтяные сорбенты.

1.5. Биолюминесцентный метод определения внутриклеточного АТФ.

1.5.1. Каталитические реакции, лежащие в основе биолюминесцентного метода.

1.5.2. Практическое применение биолюминесцентного метода определения АТФ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы

2.1.1. Химические реактивы

2.1.2. Ингибиторы коррозии.

2.1.3. Пробы нефти.

2.1.4. Нефтесорбент.

2.1.5. Металлические купоны.

2.1.6. Приборы.

2.1.7. Микроорганизмы.

2.2. Методы.

2.2.1. Хранение и культивирование бактерий.

2.2.2. Микробиологическое определение численности бактерий.

2.2.3. Определение концентрации внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом.

2.2.4. Определение с помощью биолюминесцентного метода концентрации клеток в грунте, загрязненном нефтью

2.2.5. Экстракция внутриклеточного АТФ из клеток в составе биопленок.

2.2.6. Определение удельной скорости роста клеток.

2.2.7. Определение концентрации сульфида в среде и в составе биопленок.

2.2.8. Определение концентрации сульфата в среде.

2.2.9. Определение концентрации фосфат-ионов в среде.

2.2.10. Определение концентрации железа в среде.

2.2.11. Определение массового показателя коррозии.

2.2.12. Покрытие металлической поверхности сульфидной пленкой.

2.2.13. Определение минимальных ингибирующих концентраций ингибиторов коррозии по отношению к планктонным клеткам и биопленкам.

2.2.14. Подготовка проб грунта/песка для экспериментов.

2.2.15. Определение концентрации растворенного кислорода в среде.

2.2.16. Ультразвуковая дезинтеграция клеток для определения полноты экстракции АТФ.

2.2.17. Определение органических кислот в сточных водах.

2.2.18. Проточная система.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста и численности микроорганизмов, участвующих в процессах биокоррозии.

3.1.1. Определение удельной концентрации внутриклеточного АТФ в клетках, участвующих в процессах биокоррозии.

3.1.2. Применение биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста планктонных клеток, участвующих в процессах биокоррозии.

3.1.3. Оптимизация условий применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста гетеротрофных бактерий в загрязненных нефтью пробах песка и грунта.

3.1.3.1. Исследование удельной концентрации АТФ в клетках бактерий с использованием хлороформа в качестве экстрагирующего агента.

3.1.3.2. Определение численности бактерий в модельных системах на основе грунта, загрязненного нефтью.

3.1.3.3. Исследование кинетики роста бактерий в грунте, загрязненном нефтью.

3.1.4. Оптимизация условий применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики формирования коррозионно активных биопленок.

3.1.5. Разработка дифференцированного метода анализа состава смешанных бактериальных планктонных клеток и коррозионно активных биопленок.

3.1.6. Применение разработанных методик для анализа численности коррозионно активных клеток в пробах из реальных объектов.

3.2. Исследования закономерностей формирования и факторов, влияющих на формирование коррозионно активных биопленок.

3.2.1. Кинетические закономерности формирования биопленок в зависимости от микробного состава среды.

3.2.2. Исследование кинетики накопления сульфида железа и анализ его роли в формировании биопленок.

3.2.3. Кинетические закономерности химической коррозии различных металлов в процессе формирования биопленок.

3.2.4. Влияние присутствия нефти в среде на кинетику формирования биопленок.

3.2.5. Влияние скорости протока и типа системы на кинетику формирования биопленок.

3.3. Разработка подходов к подавлению процессов биокоррозии.

3.3.1. Исследование возможности применения ингибиторов коррозии для предотвращения биокоррозии.

3.3.1.1. Исследование влияния различных ингибиторов коррозии на кинетические параметры люциферазной реакции.

3.3.1.2. Определение биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к планктонным клеткам биолюминесцентным методом.

3.3.1.3. Определение биолюминесцентным методом биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к биопленкам.

3.3.2. Использование нефтяных волокнисто-пористых сорбентов для снижения скорости биокоррозионных процессов.

3.3.2.1. Исследование способности сорбента «Мегасорб» удалять сульфид железа из среды.

3.3.2.2. Исследование возможности удаления бактериальных клеток из среды Мегасорбом.

3.3.2.3. Исследование влияния фильтрации модельных сточных вод Мегасорбом на кинетику формирования биопленок.

3.3.2.4. Совместное использование Мегасорба и ингибиторов коррозии для элиминирования факторов, приводящих к развитию коррозионно активных биопленок.

В настоящее время наличие биоактивности, проявляемой микроорганизмами, может быть обнаружено практически везде на различных объектах, подверженных коррозии и биодеградации под воздействием ферментов, каталитически активных в отношении различных материалов (металла, пластика и др.) Коррозию металла, возникающую под воздействием микроорганизмов, принято называть биокоррозией.

Исследования показали, что коррозия под воздействием микроорганизмов представляет собой проблему большой экономической важности. Установлено, что 20% потерь от коррозии приходится именно на долю биокоррозии [1]. Нефтяная промышленность относится к тем отраслям, основные фонды которых в наибольшей степени подвергаются воздействию биокоррозии [2-4].

Коррозионно активные планктонные культуры могут существовать в сточных водах, грунте, загрязненном нефтью и в других объектах нефтяной промышленности. Микроорганизмы могут изменять характер коррозии, создавая на поверхности металлов условия для появления концентрационных электрохимических элементов, либо влиять на изменение агрессивности среды или непосредственно на кинетику электродных реакций [5].

Биопленки, представляющие собой самоиммобилизующиеся бактериальные ассоциации сложного состава, играют важную роль в развитии процессов биокоррозии [6,7]. Биопленки практически всегда состоят из различных видов бактерий, которые взаимодействуют друг с другом и окружающей их средой.

Несмотря на важность проблем, связанных с формированием коррозионно активных биопленок, из-за недостатка высокочувствительных, экспрессных и удобных для исследования биокоррозии методов, до сих пор остаются мало изученным ряд вопросов, касающихся выявления основных факторов, влияющих на формирование и состав биопленок. В частности, открытыми остаются вопросы, связанные с изучением влияния скорости протока, химической природы металла, микробного состава планктонной культуры, присутствия нефти и сульфида железа в среде на кинетические закономерности формирования коррозионно опасных биопленок. Изучение этих факторов может существенно влиять на стратегию эксплуатации промышленных систем, обработки загрязненных нефтью вод и контроля коррозионно активных культур.

В течение нескольких последних десятилетий большое внимание уделяется вопросам ингибирования и подавления процессов биокоррозии. Очевидно, что биокоррозия и процессы химической коррозии действуют в комплексе, поэтому скрининг веществ, действие которых одновременно направлено против химического корродирования и вызывает подавление роста и метаболизма микроорганизмов, способствующих развитию коррозионных процессов, является важной задачей исследований.

Основные характеристики биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ (высокая чувствительность, специфичность и экспрессность) представляют большой интерес [8-11] с точки зрения их применения для фундаментальных исследований особенностей кинетики роста планктонных клеток в различных объектах коррозии и клеток, входящих в состав биопленок.

АТФ является универсальным внутриклеточным метаболитом, который содержится во всех жизнеспособных клетках любых микро- и макроорганизмов, поэтому может рассматриваться как универсальный индикатор живых клеток в анализируемых образцах. АТФ можно определять с помощью биолюминесценции с высокой точностьюй даже при ультрамалом содержании вещества в образце - до Ю-12—Ю-14 М [152].

В связи с этим актуальной является разработка новых подходов на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к анализу кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды и грунта, в том числе объектах, загрязненных нефтью, а также к исследованию влияния различных факторов на кинетику формирования коррозионно опасных биопленок.

Биолюминесцентный метод позволяет определить как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет определять численность всех живых клеток в анализируемых образцах. В связи с этим актуальным является разработка подходов на основе биолюминесцентного метода анализа к определению биоцидной активности ингибиторов коррозии (ИК) по отношению к коррозионно активным клеткам и биопленкам, а также выяснение возможности применения ИК в качестве биоцидов.

Разработка новых экологически безопасных технологий, предотвращяющих или снижающих скорости развития биокоррозии, является одним из основных требований промышленности. С этой точки зрения удаление основных компонентов среды, влияющих на формирование биопленок, является важной задачей. Применение нефтяных сорбентов для удаления нефти из сточных вод с целью уменьшения риска развития коррозионно опасных микроорганизмов, участвующих в формировании биопленок, также может быть актуальным с точки зрения предотвращения развития процессов биокоррозии.

Таким образом, разработка новых подходов на основе ферментативного биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к анализу основных факторов, влияющих на кинетику формирования коррозионно опасных биопленок, с последующей разработкой экологически безопасных методов элиминирования этих факторов является весьма актуальной и представляет большой интерес с научной, а также с экономической и экологической точек зрения.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биокоррозия

выводы

1. Определены удельные концентрации внутриклеточного АТФ для ряда клеток бактерий, относящихся к различным таксономическим группам и участвующих в процессах биокоррозии. Показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста клеток, участвующих в развитии процессов биокоррозии. Оптимизированы условия применения биолюминесцентного анализа для исследования кинетики роста ГБ в пробах, загрязненных нефтью (до 60% масс.).

2. Оптимизированы условия применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста коррозионно активных биопленок. Разработан способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, позволяющий исследовать микробный состав коррозионно активных биопленок.

3. Выявлены закономерности формирования коррозионно активных биопленок под влиянием различных факторов. Установлено, что основную роль в формировании коррозионно активных биопленок играют СВБ, на всех стадиях роста состав коррозионно опасных биопленок является гетерогенным, присутствие ГБ увеличивает скорость формирования биопленок. Показано, что присутствие сульфида железа на металлических поверхностях ускоряет рост на них биопленок. Установлено, что химический состав стали, используемой для изготовления металлических конструкций, определяет скорость развития на них коррозионно опасных биопленок. Выявлено, что присутствие 1-3 % нефти в среде ускоряет процесс формирования биопленок. Показано, что зависимость формирования биопленок от скорости протока имеет различный характер при относительно высоких и низких скоростях протока. Установлено различие в удельных скоростях роста биопленок в стационарной, открытой и замкнутой проточной системах.

4. Показано, что ИК могут влиять на люциферазную реакцию. Вместе с этим анализ кинетических параметров люциферазной реакции в присутствии ИК подтвердил возможность применения биолюминесцентного метода для исследования биоцидной активности этих веществ. Разработан подход на основе биолюминесцентного метода к определению биоцидной активности ИК по отношению к различным планктонным культурам и биопленкам. Установлено, что значения МИК исследованных ИК по отношению к биопленкам в 3-8 раз больше по сравнению с планктонными культурами. Установлено, что именно в начальной стадии формирования биопленок необходимо вводить в функционирующие системы нефтяной промышленности ИК с биоцидным действием.

5. Показана возможность использования нефтяного сорбента антибиокоррозионных целях. Применение Мегасорба позволяет снизить МИК разных с биоцидным действием в отношении биопленок на основе СВБ на 30%.

1. Flemming Н.С. Economical and technical overview. In: Heitz E., Flemming H.C., Sand W., editors. Microbially influenced corrosion of materials. //Springer. Berlin. 1996. P.5.

2. Neria-Gonzalez I., Wang E.T., Ramirez F., Romero J.M., Hernandez-Rodriguez C. Characterization of bacterial community associated to biofilms of corroded oil pipeline from the southeast of Mexico. //Anaerobe, 2006. V.12. P.122-133.

3. Lopez M.A., Serna F.J., Jan-Roblero J., Romero J.M., Hernandez-Rodriguez C. Phylogenetic analysis of a biofilm bacterial population in a water pipeline in the Gulf of Mexico. //FEMS Microbiol. Ecol. 2006. V.58. P.145-154.

4. Tributsch H., Rojas-Chapana J.A. Metal sulfide semiconductor electrochemical mechanisms induced by bacterial activity. //Electrochim. Acta. 2000. V.45. P.4705-4716.

5. Beech I.W., Sunner J. Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals. //Current Opinion in Biotech. 2004. V. 15. P. 181-186.

6. Lee A.K., Buehler M.G., Newman D.K. Influence of dual-species biofilm on the corrosion of mild steel. //Corrosion Science. 2006. V.48. P.165-178.

7. Фрунджян В.Г. Биолюминесцентная АТФ-метрия в клинической и санитарной микробиологии. // Дисс. на соиск. степени к.х.н. 1999. Москва. 152с.

8. Фрунджян В.Г., Бровко Л.Ю., Карабасова М.А., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определение антибиотикочувствительности микробных клеток в септической крови. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.ЗЗ, №4, С.455-460.

9. Dexter S.J., Camara М., Davies М., Shakesheff К.М. Development of bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. //Biomaterials. 2003. V.24. P.27-34.

10. Ukuku D.O., Sapers G.M., Fett W.F. ATP bioluminescence assay for estimation of microbial populations of fresh-cut melon. //J. Food Prot. 2005. V.68. P.2427-2432.

11. Дементьева, Е.И., Кутузова, Г.Д., Люндовщих, И.А., Угарова, Н.Н. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата. // Патент РФ на изобретение № 2164241. 2001.

12. Shifler D.A. Understanding material interactions in marine environments to promote extended structural life. //Corrosion Sci. 2005. V.47. P.2335-2352.

13. Videla H.A., Herrera L.K. Microbiologically influenced corrosion: looking to the future. //Int. Microbiol. 2005. V.8. P. 169-180.

14. U.S. Federal Highway Administration. Corrosion costs and preventive strategies in the United States, Report FHWA-RD-01-156.// Nat. Tech. Info. Serv., 5285 Port Royal Road. Springfield. 2002. VA 22161.

15. Jones D.A, Amy P.S. A thermodynamic interpretation of microbiologically influenced corrosion. //Corrosion. 2002. V58. P.638-645.

16. Perez-Jimenez J.R., Kerkhof L.J. Phylogeography of sulfate-reducing bacteria among disturbed sediments, disclosed by analysis of the dissimilatory sulfite. //Appl. Environ. Microbiol. 2005. V.71. P. 1004-1011.

17. Morton S.C., Zhang Y., Edwards M.A. Implications of nutrient release from iron metal for microbial regrowth in water distribution systems. //Water res. 2005. V.39. P.2883-2892.

18. Nielsen A.H., Yongsiri C., Hvitved-Jacobsen Т., Vollertsen J. Simulation of sulfide buildup in wastewater and atmosphere of sewer networks. //Water Sci. Technol. 2005. V.52. P.201-208.

19. Jensen A.B., Webb C. Ferrous sulphate oxidation using Thiobacillus ferrooxidans. II Proc. Biochem. 1995. V.30. P.225-236.

20. Linhardt P. MIC of stainless steel in freshwater and the cathodic behaviour of biomineralized Mn-oxides. //Electrochim. Acta. 2006. V.51. P.6081-6084.

21. Rubio C., Ott C., Amiel C., Dupont-Moral I., Travert J., Mariey L. Sulfato/thiosulfato reducing bacteria characterization by FT-IR spectroscopy: a new approach to biocorrosion control. //J. Microbiol. Methods. 2006. V.64. P.287-296.

22. Raskin L., Rirrman B.E., Stahl D.A. Competition and coexistence of sulfate-reducing and methanogenic populations in anaerobic biofilms. //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.3847-3857.

23. Митяшина С.Ю., Давыдова M.H. Энергетические параметры клеток D.desulfuricans, растущих в среде с лактатом и сульфатом в атмосфере аргона или аргона плюс окись углерода. // Микробиол. 1998. Т.67. №4. С.471-475.

24. Hamilton W.A., Lee W. Biocorrosion. In: Barton L.L. (ed). Sulfate Reducing Bacteria. // New York: Plenum Press. 1995. P.243-264.

25. Hamilton W.A. Microbially influenced corrosion as a model system for the study of metal microbe interactions: a unifying electron transfer hypothesis. // Biofouling. 2003. V.19. P.65-76.

26. Семенова И.В., Флорианович Г.М., Хорошилов A.B. Коррозия и защита от коррозии. //Москва: Изд. Физматлит. 2002. 333с.

27. Da Silva S., Basseguy R., Bergel A. The role of hydrogenases in the anaerobic microbiologically influenced corrosion of steels. //Bioelectrochem. 2002. V.56. P.77-79.

28. Matias P.M., Pereira I.A.C., Soares C.M., Carrondo M.A. Sulphate respiration from hydrogen in Desulfovibrio bacteria: a structural biology overview. //Prog. Biophys. Molecular Biol. 2005. V.89. P.292-329.

29. Daumas S., Magot M., Crolet J.L. Measurement of the net production of acidity by a sulphate-reducing bacterium: experimental checking of theoretical models of microbially influenced corrosion. // Res. Microbiol. 1993.V.144. P.327-332.

30. Lee W., Lewandowski Z., Okabe S., Characklis W.G., Avci R. Corrosion of mild steel underneath aerobic biofilms containing sulfate-reducing bacteria. Part I: at low dissolved oxygen concentration. //Biofouling. 1993. V.7. P.l97-216.

31. Hamilton W.A. Microbially influenced corrosion in the context of metal microbe interactions. In: Evans L.V. (ed). Biofilms: recent advances in their study and control. // Amsterdam: Harwood Academic Publishers. 2000. P.419-434.

32. Hamilton W.A. Microbially influenced corrosion in the context of metal microbe interactions. In: Sequira C.A.C (ed). Microbial corrosion. // London: European Federation of Corrosion. IOM Communications. 2000. P.3-17.

33. Nielsen P.H., Lee W., Lewandowski Z., Morrison M., Characklis W.G. Corrosion of mild steel in an alternating oxic and anoxic biofilm system. // Biofouling. 1993. V.7. P.267-284.

34. Lee W., Lewandowski Z., Okabe S., Characklis W.G., Avci R., Nielsen P.H. Corrosion of mild steel underneath aerobic biofilms containing sulfate-reducing bacteria. Part II: at high bulk oxygen concentration. // Biofouling. 1993. V.7. P.217-239.

35. Sharma S.L., Pant A. Biodegradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp.// Biodegradation. 2000. V. 11. P. 289-294.

36. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами. //Успехи современной биологии. 2006. Т.126. № 3. С. 285296.

37. Tadashi F., Tatsuya N., Koji Т., Junichi К. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. V.68. N. 10. P.2171.

38. Haak B, Fetzner S., Lingens F. Cloning, nucleotide sequence, and expression of the plasmid-encoded genes for the two-component 2-halobenzoate 1,2-dioxygenase from Pseudomonas cepacia2CBS. //J. Bacterid. 1995. V.177. P.667-675.

39. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: "Мир". 1982. 310 с.

40. Nakatsu C.H., Wyndham R.C. Cloning and expression of the transposable chlorobenzoate-3,4-dioxygenase genes of Alcaligenes sp. strain BR60. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P.3625-3633.

41. Кондратьева E.H. Автотрофные прокариоты. // Москва: Изд. Московского Университета. 1996. С.237-274.

42. Okabe S., Ito Т., Sugita К., Satoh Н. Succession of internal sulphur cycles and sulphur-oxidizing bacterial communities in microaerophilic wastewater biofilms. //Appl. Environ. Microbiol. 2005. V.71. P. 2520-2529.

43. Холоденко В.П., Жиглецова C.K., Чугунов B.A., Родин В.Б., Кобелев B.C., Карпов С.В. Химико-микробиологическая диагностика стресс-коррозионных повреждений магистральных трубопроводов. // Прикл. Биохим. Микробиол. 2000. Т.36. №6. С.685-693.

44. Philippot L., Hojberg О. Dissimilatory nitrate reductases in bacteria. //Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1446. P.l-23.

45. Beech I.B., Sunner J.A., Hiraoka K. Microbe-surface interactions in biofouling and biocorrosion processes. //Int. Microbiol. 2005. V.8. P.157-168.

46. Coester S.E., Cloete Т.Е. Biofouling and biocorrosion in industrial water systems. //Crit.Rev. Microbiol. 2005. V.31. P.213-232.

47. Beech I.B., Sunner J.A., Arciola C.R., Cristiani P. Microbially-influenced corrosion: damage to prostheses, delight for bacteria. //Int. J. Artif. Organs. 2006. V.29. P.443-452.

48. Cutter L.A., Schie P.M., Fletcher M. Adhesion of anaerobic microorganisms to solid surfaces and the effect of sequential attachment on adhesion characteristics. //Biofouling. 2003. V.19. P.9-18.

49. Davey E.N., O'toole G.A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V.64. №4. P. 1-46.

50. Danese P.N., Pratt L.A., Kolter R. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture. //J. Bacterid. 2000. V.182. P.3593-3596.

51. Watnick P.I., Kolter R. Steps in the development of a Vibroi cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 1999. V.34. P.586-595.

52. Costerton J.W. Overview of microbial biofilms. //J. Ind. Microbiol. 1995. V.15. P.137-140.

53. Raskin L., Rirrman B.E., Stahl D.A. Competition and coexistence of sulfate-reducing and methanogenic populations in anaerobic biofilms. //Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.3847-3857.

54. Lewis K. Riddle of biofilm resistance. //Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V.45. №4. P.999-1007.

55. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. //Science. 1999. V.284. P. 1318-1322.

56. Kinzler K., Gehrke Т., Telegdi J., Sand W. Bioleaching a result of interfacial processes caused by extracellular polymeric substances (EPS). //Hydrometal. 2003. V.71. P.83-88.

57. Sand W., Tilman G. Extracellular polymeric substances mediate bioleaching/biocorrosion via interfacial processes involving iron(III) ions and acidophilic bacteria. //Research in Microbiol. 2006. V.157. P.49-56.

58. Rohwerder Т., Gehrke Т., Kinzler K., Sand W. Bioleaching review part A: Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulphide oxidation. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.63. P. 239-248.

59. Santegoeds C.M., Ferdelman T.G., Muyzer G., De Beer D. Structural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms. //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. №10. P.3731-3739.

60. Lens P.N., De Poorter M.P., Cronenberg C.C., Verstraete. Sulfate reducing and methane producing bacteria in aerobic wastewater treatment systems. //Water Res. 1995. V.29. P.871-880.

61. Ito Т., Okabe S., Satoh H., Watanabe Y. Successional development of sulphate-reducing bacterial populations and their activities in a wastewater biofilm growing under microaerophilic conditions. //Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.68. №3. P.1392-1402.

62. Acuna N., Ortega-Morales B.O., Valadez-Gonzales A. Biofilm colonization dynamics and its influence on the corrosion resistance of austenitic UNS S31603 stainless steel exposed to Gulf of Mexico seawater. //Mar. Biotechnol. 2006. V.8. P.62-70.

63. Okabe S., Yasuda Т., Watanabe Y. Uptake and release of inert fluorescence paticles by mixed population biofilms. //Biotechnol. Bioeng. 1997. V.53. P.459-469.

64. Pitonzo, B.J., Castro, P., Amy, P.S., Southam. G., Jones, D.A., Ringelberg, D. Microbiologically influenced corrosion capability of bacteria isolated from Yucca Mountain. //Corrosion. 2004. V.60. P.64-74.

65. Valencia-Cantero E., Pena-Cabriales J.J., Martinez-Romero E. The corrosion effects of sulphate- and ferric-reducing bacterial consortia on steel. //Geomicrobiol. J. 2003. V.20. P. 157-169.

66. Da Silva S., Basseguy R., Bergel A. Electron transfer between hydrogenase and 316L stainless steel: identification of a hydrogenase-catalyzed cathodic reaction in anaerobic MIC. //J. Electroanal. Chem. 2004. V.561. P. 93-102.

67. L'Hostis V., Dagbert C., Feron D. Electrochemical behavior of metallic materials used in seawater interactions between glucose oxidase and passive layers. //Electrochim Acta. 2003. V.48. P.1451-1458.

68. Wang W., Wang J., Li X., Xu H., Wu J. Influence of biofilms growth on corrosion potential of metals immersed in seawater. //Materials Corrosion-Werkstoffe Korrosion. 2004. V.55. P.30-35.

69. Beech I.B. Biocorrosion: role of sulphate-reducing bacteria. In Encyclopaedia of Environmental Microbiology. Edited by Bitton G. //John Wiley. 2002. P.465-475.

70. Чернов Б.Б., Харченко У.В. Модельные представления о концентрационных изменениях в биопленке на инертной подложке. //Исследовано в России. 2003. С.2304-2309.

71. Stewart P.S. Diffusion in biofilms. //J. Bacteriol. 2003. V.185. №5. P.1485-1491.

72. Lewandowski Z., Walser G., Characklis W.G. Reaction kinetics in biofilms / Biotech. Bioeng. 1991. V. 38, №8. P. 877-882.

73. Xu K., Dexter S.C., Luther G.W. Voltammetric microelectrodes for biocorrosion stud-ies / Corrosion. 1998. V. 54. P. 814-823.

74. Madsen B.W., Cramer S.D., Collins W.K., Watson S.W, Higdem D., Perkins W. Corrosion in a phosphate slurry pipelines. //Mater. Perform. 1995. V.32. P. 19-26.

75. Stoodley P., Lewandowski D.J., Boyle J.D., Lappin-Scott H.M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. //Environ. Microbiol. 1999. V.l. P.447-455.

76. Stoodley P., Hall-Stoodley L., Lappin-Scott H.M. Detachment, surface migration and other dynamic behaviour in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. //Methods Enzymol. V.337. P.306-319.

77. George R.P., Muralledharan P., Sreekumari, K.R., Khatak H.S. Influence of surface characteristics and microstructure on adhesion of bacterial cells onto a type 304 stainless steel. //Biofoul. 2003. V.19. P.l-8.

78. Mueller R.F., Charackilis W.G., Jones W.L., Sears J.T. Characterization of initial events in bacterial surface colonization by two Pseudomonas species using image analysis. //Biotechnol. Bioeng. 1992. V.39. P.l 161-1170.

79. Camper A.K., Hayes J.T., Sturman P.J., Jones W.L., Cunningham, A.B. Effects of motility and absorption rate coefficient on transport of bacteria through saturated porous media. //Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P.3455-3462.

80. Borenstein S.W. Microbiologically Influenced Corrosion Handbook. //Woodhead publishing limited. Cambridge. England. 1994. 305p.

81. Ruppel D.T., Dexter S.C., Luther G.W. Role of manganese dioxide in corrosion in the presence of natural biofilms. //Corrosion. 2001. V.57. P. 863-873.

82. Shi X., Avci R., Lewandowski Z. Microbially deposited manganese and iron oxides on passive metals-their chemistry and consequences for materials performance. //Corrosion. 2002. V.58. P. 728-738.

83. Lopes F.A., Morin P., Oliveira R., Melo L.F. The influence of nickel on the adhesion ability of Desulfovibrio desulfiricans. //Colloids Surf. В Biointerfaces. 2005. V.46. P. 127-133.

84. Lloyd J.R., Mabbett A.N., Williams D.R., Macaskie L.E. Metal reduction by sulphate-reducing bacteria: physiological diversity and metal specificity. //Hydrometallurgy. 2001. V.59. P.327-337.

85. Lloyd J.R., Yong P., Macaskie L.E. Enzymatic recovery of elemental palladium by using sulphate-reducing bacteria. //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.4607-4609.

86. Smith W.L. Hexavalent chromium reduction and precipitation by sulphate-reducing bacterial biofilms. //Environ. Geochem. Health. 2001. V.23. P.297-300.

87. Dubey R.S., Upadhyay S.N. Microbial corrosion monitoring by an amperometric microbial biosensor developed using whole cell of Pseudomonas sp. //Biosenors Bioelect. 2001. V.16. P.995-1000.

88. Жиглецова C.K., Родин В.Б., Кобелев B.C., Александрова H.B., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. Исследование начальных этапов биокоррозии стали. //Прикл. Биохим. Микробиол. 2000. Т.36. №6. С.637-641.

89. Wrenn В.А., Venosa A.D. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number procedure.//Can. J. Microbiol. 1996. V.42. P.252-258.

90. Заварзин Г.А., Колотилова H.H. Введение в природоведческую микробиологию. //Изд.: Москва. 2001. С.71-74.

91. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология принципы и применения. //Изд.: Мир. 2002. С. 94-103.

92. Jan-Roblero J., Romero J.M., Amaya M., Borgne S.Le. Phylogenetic characterization of a corrosive consortium isolated from a sour gas pipeline. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V.64. P.862-867.

93. Padmanabhan P., Shanker R., Khanna P. A method for extraction of DNA and PCR-based detection of polycyclic hydrocarbon-degrading bacteria in soil contaminated with oil and grease. //World J. Microbiol. Biotech. 1998. V.14. P.925-926.

94. Tanaka Y., Sogabe M., Okumura K., Kurane R. A highly selective direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. //Lett. Appl. Microbiol. 2002. V.35. P.242-246.

95. Tanaka Y., Sogabe M., Okumura K., Kurane R. A highly selective direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. //Lett. Appl. Microbiol. 2002. V.35. P.242-246.

96. Xu L.C., Chan K.Y., Fang H.P. Application of atomic force microscopy in the study of microbiologically influenced corrosion. //Materials Characterization. 2002. V.48. P. 195-203.

97. Johansson L.S., Saastamoinen T. Investigating early stages of biocorrosion with XPS: AISI 304 stainless steel exposed to Burkholderia species. //Appl. Surface Sci. 1999. V.144-145. P.244-248.

98. Vinnichenko M., Chevolleau Th., Pham M.T., Poperenko L., Maitz M.F. Spectroellipsometric, AFM and XPS probing of stainless steel surfaces subjected to biological influences. //Appl. Surface. Sci. 2002. V.201. P.41-50.

99. O.Nielsen P.H., Aquino de Muro M., Nielsen J.L. Studies on the in situ physiology of Thiothrix spp. in activated sludge. //Environ. Microbiol. 2000. V.2. P.389-398.

100. Videla H.A. Prevention and control of biocorrosion. //Int. Biodeterior. Biodegrad. 2002. V.49. P.259-270.

101. Смолянец Е.Ф., Рагулин B.B. Анализ микробиологической зараженности поверхностного оборудования месторождений западной Сибири. //Отечественный опыт. 1996. №10. С.17-23.

102. Ramesh S., Rajeswari S., Maruthamuthu S. Effects of inhibitors and biocide on corrosion control of mild steel in natural aqueous environment. //Materials letters. 2003. V.57. P.4547-4554.

103. Ramesh S., Rajeswari S. Corrosion inhibition of mild steel in neutral aqueous solution by new triazole derivatives. //Electrochim. Acta. 2004. V.49. P.811-820.

104. Ramesh S., Rajeswari S. Evaluation of inhibitors and biocide on the corrosion control of copper in neutral aqueous environment. //Corrosion science. 2005. V.47. P.151-169.

105. Иб.Самедов A.M. Применение алифатических аминов в качестве ингибиторов бактериальной и кислотной коррозии в нефтяной промышленности. //Процессы Нефтехимии и Нефтепереработки. 2000. №2. С.35-39.

106. И7.Кузнецов Ю.И. Физико-химические аспекты ингибирования коррозии металлов в водных растворах. //Успехи химии. 2004. Т.73. №1. С.79-93.

107. Жиглецова С.К., Родин, В.Б. Повышение экологической безопасности при использовании биоцидов для борьбы с коррозией, индуцируемого микроорганизмами. //Прикл. Биохим. Микробиол. 2000. Т.36. №6. С.694-700.

108. Абдуллаев Е.Ш. Ингибитор «Азери» и его применение в нефтедобывающей промышленности стран СНГ. //Процессы Нефтехимии и Нефтепереработки. 2000. №3. С.18-25.

109. Paulus W. Development in Microbicides for the Protection of materials. //Biodeteriation: Proceedings of 7th IBS. London. 1987. P. 1-19.

110. Paulus W. Biocides. //Biodeteriation: Proceedings of 4th IBS. London. 1980. P.307-314.

111. Williams T.W., Levy R., Hegarty B. Control of SRB biofouling and MIC by chloromethyl-methylisothiazolone. //NACE Int. Corrosion. Houston. TX. 2001. Paper No. 01273.

112. Prasad R. Assessment and control of MIC in the oil industry in the 20th century. //NACE Int. Corrosion. Houston. TX. 2000. Paper No. 00390.

113. Коррозионная стойкость оборудования химических производств. //Справочное издание. Химия. 1990.400 с.

114. De Beer D., Srinivasan R., Stewart P.S. Direct measurement of chlorine penetration into biofilms during disinfection. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. V.60. P.4334-4339.

115. Kramer J.F. Biofilm control with bromo-chloro-dimethyl-hydantoin. //NACE Int. Corrosion. Houston. TX. 2001. Paper No. 1277.

116. Viera M.R., Guiamet P.S., Mele M.F.L., Videla H.A. Use of dissolved ozone for controlling planktonic and sessile bacteria in industrial cooling systems. //Int. Biodeterior. Biodegrad. V.44. P.201-207.

117. Videla H.A., Saravia G.S.G., Guiamet P.S., Allegreti P., Furlong J. Microbial degradation of film-forming inhibitors and its possible effects on corrosion inhibition performance. //NACE Int. Corrosion. Houston. TX. 2000. Paper No. 00386.

118. Gomez В., Likhanova N.V., Dominguez Aguilar M.A., Olivares O., Hallen J.M., Martinez-Magadan J.M. Theoretical study of a new group of corrosion inhibitors. //J. Phys. Chem. Mol. Spectrosc. Kinet. Environ. Gen. Theory. 2005. V.109. P.8950-8957.

119. Berchmans L.J., Sivan V., Iyer S.V.K. Studies on triazole derivatives as inhibitors for the corrosion of muntz metal in acidic and neutral solutions. //Mat. Chem. Phys. 2006. V.98. P.395-400.

120. Weiss S., Reemtsma T. Determination of benzotriazole corrosion inhibitors from aqueous environmental samples by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry. //Anal. Chem. 2005. V.77. P.7415-7420.

121. Ramesh S., Rajeswari S., Maruthamuthu S. Corrosion inhibition of copper by new triazole phosphonate derivatives. //Appl. Surf. Sci. 2004. V.229. P.214-225.

122. Duda Y., Govea-Rueda R., Galicia M., Beltran H.I., Zamudio-Rivera L.S. Corrosion inhibitors: design, performance and computer simulations. //J. Phys. Chem. В Condens. Matter. Mater. Surf. Interfaces. Biophys. 2005. V.109. P.22674-22684.

123. Samardzija B.K., Lupu C., Hackerman N., Barron A.R., Luttge A. Inhibitive properties and surface morphology of group of heterocyclic diazoles as inhibitors for acidic iron corrosion. //Langmuir. 2005. V.21. РЛ 2187-12196.

124. Классификация буровых растворов. //Нефть, газ и энергетика. 2005. №6. С.28-63.

125. Rajasekar A., Babu T.G., Maruthamuthu S., Pandian S.T.K., Mohanan S., Palaniswamy N. Role of Serratia marcescens on corrosion inhibitor degradation and its influence on corrosion. //Int. Biodeterior. Biodegrad. 2006, doi: 10.1018/ibbj.2006.06.012.

126. Rajasekar A., Maruthamuthu S., Palaniswamy N., Rajendran A. Biodegradation of corrosion inhibitors and their influence on petroleum product pipeline. //Microbiol. Res. 2006, doi: 10.1016/j .micres.2006.02.002.

127. Лецкий Д.В., Вурзель С.В. Биоциды для лакокрасочных материалов. //Лакокрасочные материалы. 2005. №12. С.20-23.

128. Dubiel М., Hsu С.Н., Chien С.С., Mansfeld F., Newman D.K. Environmental microbiology and biodegradation: microbial iron respiration can protect steel from corrosion. //Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.68. P.1440-1445.

129. HO.Chongdar S., Gunasekaran G., Kumar P. Corrosion inhibition of mild steel by aerobic biofilm. //Electrochim. Acta. 2005. V.50. P.4655-4665.

130. Zuo R., Kus E., Mansfeld F., Wood Т.К. The importance of live biofilms in corrosion protection. //Corrosion Sci. 2005. V.47. P.279-287.

131. Теплинский Ю.А., Конакова M.A. Аварийные запасы труб. // Коррозия: материалы, защита. 2005. № 3. С. 23-28.

132. Denny A.J. Principles and prevention of corrosion. //Prentice Hall, Upper Saddle River. NY. 1996. 572p.

133. Шоль H.P., Коптяева Г.Б., Коптяев A.B. Термическая обработка и микролегирование стали //Новые технологии в машиностроении, металлургии, материаловедении. Межвуз. сб. науч. Тр. / Н.Новгород; НГТУ. 2001. С.237-240.

134. Borenstein S.W. Microbiologically Influenced Corrosion Handbook. //Industrial Press Inc. NY. 1994. 288p.

135. Banerjee S.S., Joshi M. V., Jayaram R.V. Treatment of oil spill by sorption technique using fatty acid grafted sawdust. //Chemosphere. 2006. V.64. P. 1026-1031.

136. Lim T.T., Huang X. Evaluation of kapok (Ceiba pentandra (L.) Gaertn.) as a natural hollow hydrophobic-oleophilic fibrous sorbent for oil spill cleanup. //Chemosphere. 2006, doi: 10.1016/j.chemosphere.2006.05.062.

137. Wei Q.F., Mather R.R., Fotheringham A.F., Yang R.D. Evaluation of nonwoven polypropylene oil sorbents in marine oil-spill recovery. //Marine Pollution. Bull. 2003. V.46. P.780-783.

138. Каменщиков Ф.А., Богомольный Е.И. Нефтяные сорбенты. //Москва. Ижевск. 2005. 268 с.

139. Cambiella A., Ortea Е., Rios G., Benito J.M., Pazos С., Coca J. Treatment of oil-in-water emulsions: performance of a sawdust bed filter. //J. Haz. Mat. B. 2006. V.131. P.195-199.

140. Annunciado T.R., Sydenstricker T.H.D., Amico S.C. Experimental investigation of various vegetable fibers as sorbent materials for oil spills. //Marine Pollution Bull. 2005. V.50. P. 1340-1346.

141. Haussard M., Gaballah I., Kanari N., Donato P., Barres O., Villieras F. Separation of hydrocarbons and lipid from water using treated bark. //Wat. Res. 2003. V.37. P.362-374.

142. Смирнов А.Д. Сорбционная очистка воды. //Ленинград. Химия. 1982. 168 С.

143. Арене В.Ж., Гридин О.М., Гридин А.О. Проблема нефтяных разливов и роль сорбентов в ее решении. //Нефть, газ и бизнес. 2000. №5.

144. Хлесткин Р.Н., Самойлов Н.А., Шеметова А.В. Ликвидация разливов нефти при помощи синтетических органических сорбентов. //Нефтяное хозяйство. 1999. №2. С.46-49.

145. Арене В.Ж., Гридин О.М., Гридин А.О. Семь раз отмерь. //Нефтегазовая вертикаль. 2000. №2.

146. Угарова H.H., Фрунджян В.Г. Применение биолюминесцентной АТФ-метрии в биоаналитических целях. // Метод, разработка к спецкурсу "Прикладная энзимология". М.: Изд. МГУ, Хим. факультет. 2003. 45с.

147. Rodionova N.S., Petushkov V.N. Effect of different salts and detergents on luciferin-luciferase luminescence of the enchyraeid Fridericia heliota. //J. Photochem. Photobiol. B. 2006. V.83. P.123-128.

148. Sakakibara Т., Murakami S., Imai K. Enumeration of bacterial cell numbers by amplified firely bioluminescence without cultivation. //Anal. Biochem. 2003. V.312. P.48-56.

149. Assessment of photodynamic destruction of Escherichia coli 0157: H7 and Listeria monocytogenes by using ATP bioluminescence. //Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. P.6393-6398.

150. Aycicek H., Oguz U., Karci K. Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination surface cleanliness at a hospital kitchen. //Int. J. Hyg. Environ. Health. 2006. V.209. P.203-206.

151. Watarai M., Yamato Y., Murakata K., Kim S., Omata Y., Furuoka H. Detection of Lawsonia intracellularis using immunomagnetic beads and ATP bioluminescence. //J. Vet. Med. Sci. 2005. V.67. P.449-451.

152. Bell C., Stallard, P.A., Brown S.E., Standley J.T.E. ATP-bioluminescent techniques for assessing hygienic condition of milk transport tankers. //Int. Dairy J. 1994. V.4. P.629-640.

153. Douillet C.D., Suy S., Zarzaur B.L., Robinson W.P., Milano P.M., Boucher R.C., Rich P.B. Measurement of free and bound fractions of extracellular ATP in biological solutions using bioluminescence. //Luminescence. 2005. V.20. P.435-441.

154. Tian H.M., Shi X.Y., Fu J., Chao D.Y., Zhang K., Wu L.Y., Wang J.W., Zhang W. Correlation between ATP bioluminescence tumor chemosensitivity assay and clinical response in ovarian cancer. //Zhonghua Zhong. Liu. Za. Zhi. 2005. V.27. P.296-298.

155. Спиричева O.B. Биокаталитические системы на основе иммобилизованных клеток гриба Rhizopus oryzae: способы получения и свойства. // Дисс. на соиск. степени к.х.н. 2006. Москва. 160с.

156. Abbasov V.M., Isayeva G.A., Abbasov М.М., Aliyev B.M. Results of studies of medicinal nafitalan oil from different wells. //Proc. Petrochem. Oil Refining. 2002. V. 2. P.26-29.

157. Abbasov V.M., Samedova F.I., Aliyev B.M., Isayeva G.A. Composition and structure of 50-degree fractions of Surakhany white oil from different wells. //Proc. Petrochem. Oil Refining. 2003. V. 15.P.17-19.

158. Варфоломеев С.Д., Калюжный C.B. Биотехнология: «Высшая школа». 1990, С.52-78.

159. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М: «Химия». 1984, С.303-315.

160. Gilbert T.W., Behymer T.D., Castaneda Н.В. Determination of dissolved oxygen in natural and wastewaters. //American Laboratory. 1982. №3. P. 119-134.

161. Скляр В. И. Биокаталитические системы получения водорода и метана: Дис. канд. хим. наук. Фрунзе, 1987. - 154 с.

162. Шлегель Г. Общая микробиология. //Мир. 1987. 567с.

163. Murzakov В., Akopova G., Kruglova N. The technology of bioremediation of oil polluted objects by biopreparations (project "biodestructor"). //Comm. Agricul. Appl. Biolog. Sci. 2003. V.68. P.181-184.

164. Щукин Е.Д., Перцов A.B, Амелина E.А. Коллоидная химия. //Высшая школа. 1992. С.64-89.

165. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. //Высшая школа. 1986. С.369-374.

166. Ronald L., Crawford L. Bioremediation: Principles and Applications. //Springier. 1996. P.100-125.