Использование микроэмульсий в высокоэффективной жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

ПАШКОВА ЕЛЕНА БОРИСОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОЭМУЛЬСИЙ в ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2010

4843574

Работа выполнена в лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии Химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

Доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Пирогов Андрей Владимирович, Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Яшин Яков Иванович НПЦ «Химавтоматика», г. Москва

к.х.н. Болотов Сергей Леонидович ФГУП «Антидопинговый центр», г. Москва

Ведущая организация:

Саратовский Государственный Университет имени Н.Г. Чернышевского

Защита состоится 22 декабря 2010 года в 15 ч. 00 мин. в аудитории 446 на заседании

диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском

государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический

факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 19 ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной ВЭЖХ актуальной является задача экспрессного одновременного изократического определения веществ, сильно отличающихся по своей полярности. Другой проблемой является определение следовых количеств самых разнообразных соединений в объектах со сложной многокомпонентной матрицей. В большинстве случаев предлагается использование масс-селективных детекторов (что позволяет для ряда объектов отказаться от пробоподготовки), либо проведение хроматографического разделения на колонке с уникальной неподвижной фазой, специально предназначенной для определенного набора веществ. Минусы таких подходов очевидны: они являются сильно специфичными, а также требуют дорогостоящего оборудования и расходных материалов.

В 1992 году было предложено использовать микроэмульсии в качестве подвижной фазы для жидкостной хроматографии. Микроэмульсии используют в вариантах капиллярной электрокинетической хроматографии, но метод микроэмульсионной жидкостной хроматографии (МЭЖХ) должного развития не получил. Представляется интересным изучение поведения микроэмульсий в качестве подвижных фаз в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предполагается, что состав микроэмульсии, используемой в качестве подвижной фазы, можно варьировать в широких пределах и, таким образом, изменять элюирующую силу, что, например, позволит одновременно в изократическом режиме определять гидрофильные и гидрофобные соединения. Кроме того, по-видимому, микроэмульсии могут быть с успехом использованы и в режиме градиентного элюирования. Таким образом, метод микроэмульсионной жидкостной хроматографии может быть успешно применен для решения ряда актуальных задач. Необходимо более детальное изучение основ метода, установление зависимостей поведения аналитов в микроэмульсионной системе, а также решение вопросов совместимости микроэмульсий с различными вариантами хроматографического оборудования.

Цель работы состояла в исследовании особенностей использования микроэмульсий в качестве подвижных фаз в высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

• Оптимизация способа получения микроэмульсий заданного состава.

• Изучение зависимостей между составом микроэмульсии и ее элюирующей силой, давлением в хроматографической системе.

• Исследование совместимости микроэмульсий с различными вариантами детекторов (спектрофотометрический, флуоресцентный, электрохимический и др.).

• Изучение возможностей применения микроэмульсий для пробоподготовки объектов со сложной матрицей (лекарственные средства в кремовой и мазевой формах, биологические жидкости, продукты питания).

• Исследование возможности использования микроэмульсий в качестве реактора для предколоночной дериватизации.

Научная новизна. Предложен экспрессный способ получения микроэмульсий заданного состава. Впервые предложено вводить в микроэмульсию второе поверхностно-активное вещество (ПАВ) для управления селективностью разделения. В качестве второго ПАВ были исследованы восемь неионогенных и два анионных ПАВ. Показано, что в отличие от системы, содержащей только одно ПАВ, зависимость элюирующей силы такой подвижной фазы от концентрации ПАВ носит нелинейный характер и имеет максимум.

На примере алкилзамещенных бензолов установлено, что зависимость удерживания для веществ одного гомологического ряда в режиме МЭЖХ носит линейный характер в координатах время удерживания - число атомов углерода в алкильном радикале.

Показано увеличение чувствительности флуоресцентного и электрохимического детектирования при переходе от ОФ ВЭЖХ к МЭЖХ. В спектрах флуоресценции соединений в среде микроэмульсии наблюдали смещение максимума в длинноволновую

область, для ряда соединений установлено, что в спектрах поглощения и флуоресценции появляется второй максимум. При электрохимическом детектировании максимум вольтамперной характеристики смещается в область более высоких потенциалов. Детектирование в соответствующих условиях позволяет снизить предел обнаружения до 40 раз по сравнению с обращенно-фазовым вариантом.

Продемонстрированы преимущества микроэмульсий для пробоподготовки лекарственных препаратов и биологических жидкостей. Разбавление образца микроэмульсией позволяет экспрессно и количественно извлекать определяемые вещества из анализируемой пробы. Показано, что микроэмульсия позволяет избежать метаболизма определяемых соединений в процессе пробоподготовки.

Предложено использование микроэмульсий в качестве реактора для предколоночной дериватизации. Установлено, что в среде микроэмульсий время протекания реакции сокращается до 5 раз.

Предложено использовать микроэмульсии типа вода в масле для экспрессного определения сильно гидрофобных соединений в сложных матрицах.

Практическая значимость. Предложен способ пробоподготовки лекарственных средств, биологических жидкостей и продуктов питания, позволяющий значительно упростить эту процедуру и повысить ее экспрессность. Процедура пробоподготовки занимает 5 минут и включает в себя одну стадию - разбавление образца микроэмульсией. При анализе образцов с высоким содержанием жира (лекарственные средства в кремовой и мазевой форме) это позволяет избежать длительных и трудоемких стадий очистки и реэкстракции.

За счет многократного увеличения чувствительности флуоресцентного и электрохимического детектирования возможно избежать стадии концентрирования при пробоподготовке биологических образцов. Разработан способ чувствительного (на уровне нг/мл) определения ампициллиновых антибиотиков в продуктах питания и биологических жидкостях. Показана возможность экспрессного определения следовых количеств (до 10 мкг/л) лекарственных препаратов (ципрофлоксацин, глюкозамин) в биологических жидкостях.

С использованием микроэмульсий на основе двух ПАВ предложен экспрессный способ определения УФ-фильтров в косметических препаратах.

На примере дериватизации биогенных аминов нафтапиндиальдегидом показана возможность уменьшения времени протекания реакций предколоночной дериватизации до 5 раз.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспрессный способ получения стабильных микроэмульсий заранее заданного состава.

2. Влияние состава микроэмульсии на ее элюирующую способность.

3. Способ управления селективностью разделения путем введения второго ПАВ в систему.

4. Совместимость микроэмульсионных подвижных фаз с различными типами детекторов. Особенности детектирования в режиме МЭЖХ.

5. Результаты применения микроэмульсий при пробоподготовке реальных объектов для хроматографического анализа.

6. Преимущества использования микроэмульсий в качестве реактора для предколоночной дериватизации.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 12 публикациях. Результаты исследований докладывались на 15th International Congress on Analytical Chemistry Euroanalysis (Инсбрук, Австрия, 2009); Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, 2009); 1 Всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической

продукции» (Москва, 2009); 13й Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society (Тель-Авив, Израиль, 2010); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» (Москва, 2010, 1 премия); 28th International Symposium on Chromatography (Валенсия, Испания, 2010, 1 премия за лучший стендовый доклад); Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 141 странице машинописного текста, содержит 60 рисунков и 21 таблицу, в списке цитируемой литературы 147 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы кратко описываются свойства мицеллообразующих ПАВ, а также специфических подвижных фаз, таких как мицеллярные растворы и микроэмульсии. Рассмотрены основные параметры, которые могут оказывать влияние на элюирующую способность используемых в качестве подвижных фаз микроэмульсий. Показана перспективность применения МЭЖХ для определения различных соединений в лекарственных формах и биологических жидкостях. Описаны способы получения микроэмульсий заданного состава. На примере МЭЭКХ рассмотрена проблема совместимости микроэмульсионных систем с масс-спектрометрическим детектором.

Экспериментальная часть

Эксперименты проводили на следующих хроматографических системах: Цвет Яуза (НПО Химавтоматика, Россия, Москва) с амперометрическим детектором; Agilent 1100, снабженный квартенарным градиентным насосом, онлайн дегазатором подвижной фазы, термостатом колонок, спектрофотометрическим детектором с переменной длинной волны, флуоресцентным детектором, рефрактометром и детектором по светорассеянию.

В работе использовали следующие хроматографические колонки: Grace Smart CIS 150x4,6 мм (Grace Smart™, США), Zorbax SDB 150x4,6 мм (Agilent Technologies, США), Onyx Monolithic 100*3 мм (Phenomenex, США), Synergi Gemini C18 250x4,6 мм (Phenomenex, США), YMC Pack-Pro CI8 150*4,6 мм (YMC Co., LTD, Япония).

Размер частиц микроэмульсии измеряли методом динамического светорассеяния на приборе ZetsSizerNano-ZS (Malvern, Великобритания).

Получение микроэмульсий

Было показано, что оптимальным способом получения микроэмульсий является способ последовательного добавления компонентов. Точную навеску ПАВ растворяли в необходимом количестве бидистиллированной воды или буферного раствора. При необходимости в смесь вводили дополнительные ПАВ и выдерживали на ультразвуковой бане до из полного растворения. К полученному раствору добавляли точно измеренное количество масла и тщательно перемешивали. В полученную макроэмульсию вводили со-ПАВ и помещали смесь на ультразвуковую баню до образования стабильной микроэмульсии. В большинстве случаев ультразвуковое воздействие при повышенной температуре не требовалось - время образования микроэмульсии составляло от 3 до 5 минут. Тем не менее, при растворении неионогенных ПАВ или при получении микроэмульсий с высоким содержанием масла (более 1,5%) повышение температуры с 25 до 50°С позволило уменьшить время, необходимое для приготовления микроэмульсии до 10 минут. В результате получаются оптически прозрачные микроэмульсии со средним размером частиц

25-30 им. Нами было установлено, что в растворе также присутствуют более маленькие частицы диаметром порядка нескольких нанометров (рис. 1). Такой диаметр характерен для мицелл ПАВ.

!

А

/ \

Л V \

10 100 Разм?р частиц, нн

1000

юооо

Рис. 1. Распределение частиц в микроэмульсии по размерам. Состав микроэмульсии: 6% ДДСН, 0,8% н-гептан, 8% н-бутанол.

Влияние концентрации компонентов микроэмульсии на элюирующую силу подвижной

фазы

На данном этапе работы исследовали зависимости элюирующей силы микроэмульсий от их состава. В качестве базовой была выбрана наиболее часто описываемая в литературе микроэмульсия, состоящая из 3,3% додецилсульфата натрия (ДДСН), 0,8% и-гептана, 8% н-бутанола и 0,08% трифторуксусной кислоты (ТФУ). Содержание каждого компонента меняли в определенных пределах, которые определялись границами фазового диапазона. Диапазон изменяемых концентраций составил 3-6%, 0,8-3% и 6-9% для ДДСН, //-гептана и к-бутанола соответственно. Причем как при низком, так и при высоком содержании одного из компонентов (т.е. при приближении к границам фазового диапазона) образование микроэмульсии происходило с трудом, требовалось увеличивать продолжительность ультразвуковой обработки, а в ряде случаев дополнительно нагревать раствор. Необходимо отметить, что уже готовые микроэмульсии были устойчивы в течение месяца при комнатной температуре.

В качестве тестовой смеси, используемой при проведении экспериментов, использовали следующий набор компонентов: сорбиновую кислоту, нонилваниламид, никобоксил и диэтоксипропиладипат. Такой выбор был обусловлен следующими факторами: в состав тестовой смеси должны входить компоненты, отличающиеся по полярности, кислотно-основным свойствам, не подверженные гидролизу в водных растворах. В данном случае анализируемая смесь широко распространена в фармацевтической промышленности для приготовления лекарственных средств в кремовой и мазевой формах, обладающих согревающим действием.

Пример хроматограммы тестовой смеси приведен на рис. 2.

VWOl л W«¥»i*n0l^1O nm (D.VSRCHIV-1^V0RKW-1V2& ПИВД&ЮИ.О)

mAU 3000

1750

1500

1250

1000

750

600

250

1

Время анализа, мин

Рис. 2. Хроматограмма модельной смеси (1 - сорбиновая кислота, 2 - нонилваниламид, 3 -никобоксил, 4 - диэтоксипропиладипат). Колонка: Grace Smart С18 (150x4,6 мм; 5 мкм). Подвижная фаза:, 3,3% ДДСН, 0,8% //-гептан 8% н-бутанол, 0,08% ТФУ. Скорость потока 0,5 мл/мин. Термостатирование 40°С. Спектрофотометрическое детектирование при 210 нм.

В качестве примера приведена зависимость элюирующей силы микроэмульсии от концентрации додецилсульфата натрия (рис. 3). Остальные полученные зависимости носят аналогичный монотонно-убывающий характер.

5 12

£

я- ю

2.5

Диэтоксипропиладипат Никобоксил Нонилваниламид Сорбиновая кислота

3,0

3,5 4,0 4,5 5.0 Концентрация ДДСН, %

5,5

6,0

Рис. 3. Зависимость элюирующей силы подвижной фазы от содержания ДДСН в микроэмульсии. Концентрация н-гептана 0,8%, н-бутанола 8%, трифторуксусной кислоты 0,08%. Колонка: Grace Smart CI 8 (150*4,6 мм; 5 мкм). Скорость потока 0,5 мл/мин. Термостатирование 40°С.

Наблюдается рост элюирующей силы подвижной фазы с возрастанием концентрации ПАВ, со-ПАВ или масла в микроэмульсии, что согласуется с большинством литературных данных. При этом, по-видимому, наиболее целесообразно варьировать концентрацию ПАВ, так как изменение именно этого параметра приводит к наибольшему эффекту. При увеличении концентрации какого-либо из компонентов микроэмульсии, разрешение между парами пиков сначала возрастало, затем, начиная с определенного уровня, вновь снижалось и, в конце концов, составляющие тестовой смеси переставали делиться. Степень влияния

7

состава микроэмульсии на удерживание различна для разных компонентов смеси. Для слабоудерживаемых соединений изменение состава подвижной фазы приводит к меньшему изменению времен удерживания, чем для сильноудерживаемых. Можно предположить, что это связано с тем, что для слабоудерживаемых соединений (которые являются наиболее гидрофильными) в процесс удерживания основную роль вкладывают взаимодействия «сорбент-сорбат», а для сильноудерживаемых (гидрофобных) «сорбат-микроэмульсия».

Найдено, что оптимальным растворителем для пробы является подвижная фаза, т.е. микроэмульсия. Необходимо следить за тем, чтобы микроэмульсия, в которой вводится проба, была по своей элюирующей способности такой же, или более слабой по сравнению с подвижной фазой. Также можно вводить пробу в дистиллированной воде. Установлено, что недопустимо использовать для растворения пробы органические растворители (ацетонитрил, метанол).

В режиме микроэмульсионной жидкостной хроматографии управление селективностью разделения удобно осуществлять путем изменения состава подвижной фазы. Нами впервые было предложено вводить в состав микроэмульсии второе ПАВ для дополнительного управления селективностью хроматографического разделения. Поскольку в качестве основного ПАВ использовали ДДСН, то второе ПАВ необходимо было выбирать из класса анионных или неионогенных. В противном случае, при смешивании катионного и анионного ПАВ происходит самопроизвольная агломерация и микроэмульсия не образуется. В работе был исследован ряд поверхностно-активных соединений, перечень и краткое описание которых приведены в табл. 1.

Таблица 1. ПАВ, использованные совместно с ДДСН для приготовления микроэмульсий.

ПАВ, торговая марка Тип ПАВ Описание

Полипропиленгликоль Неионогенные -

Бридж 35 Полиэтиленгликоль, додециловый эфир

Кремофор А Полиэтиленгликоль, стеариновый эфир

ОеЬусМ Ьв 2 Смесь этоксилированных и неэтоксилированны жирных спиртов С12-С14

БеЬуроп 2555 Смесь полигликолевых эфиров жирных спирто и алкилполиглюкозидов (Ся-Сю)

ЬШепзо1 Этоксилированные (~11%) спирты Си (67%) и С15 (33%)

РеЬуроп Ьв 54 Смесь этоксилированных (44%) и пропоксилированных (56%) спиртов С12-С14

Техароп ЕНБ Анионные 2-этилгексилсульфат натрия

Ешр1со1 ЕБВ 2-додецоксиэтилсульфат натрия

Исследуемые ПАВ выбирали таким образом, чтобы в их состав, по возможности, входили различные функциональные группы, которые могут дополнительно влиять на разделение. ПАВ имели различную гидрофобность, ККМ и информацию (для полимеров) в водном растворе. В качестве тестовой смеси был выбрана смесь : бензол, метил-, этил-, пропил- и бутилбензол.

Установлено, что, в отличие от случая, когда в состав микроэмульсии входит одно ПАВ, изменение концентрации второго ПАВ приводит к немонотонному изменению времен удерживания. Все получаемые зависимости имеют четко выраженный минимум, т.е. для каждого определенного значения суммарной концентрации ПАВ в подвижной фазе существует свой максимум элюирующей способности. Например, на рис. 4 показано влияние

концентрации полипропиленгликоля (ППГ) на время удерживания бутилбензола. Представленная зависимость имеет четко выраженный минимум при концентрации ППГ 0,5%.

Следует отметить, что незначительные изменения количества второго ПАВ, вплоть до 0,1% приводят к существенному изменению времен удерживания

компонентов тестовой смеси. Добиться такого же изменения элюирующей способности

подвижной фазы на основе одного ПАВ можно только увеличив его концентрацию на 23%.

Для ряда ПАВ были установлены концентрации, при которых элюирующая

способность подвижной фазы, содержащей ДДСН и второй ПАВ, максимальна. Полученные данные приведены в табл. 2.

Таблица 2. Концентрация ПАВ, при которой достигается максимальная элюирующая способность. (Суммарное содержание ПАВ 3,5%, концентрация н-гептана 0,8%, н-бутанола 8%).

ПАВ Концентрация, %

Полипропиленгликоль 0,5

Бридж 35 0,3

Кремофор А 1,5

ОеЬус1о1 ЬБ2 1,2

ЬШепБо! 1,5

При введении в микроэмульсию на основе 3% ДДСН равных количеств исследуемых ПАВ элюирующая способность подвижной фазы в зависимости от вводимого ПАВ увеличивается в следующем ряду: ДДСН < ППГ < Техароп ЕШ < Етрюо1 ЕвВ < Ьшеп$о1 < РеЬуроп 1-854 < ОеЬу(1а1 Ь32, соответственно, время анализа в этом ряду уменьшилось с 30 до 12 минут. Из исследованных ПАВ наибольшее влияние на элюирующую силу получаемой микроэмульсии оказал ОеЬу<1о1 Эффективность оказалась максимальной в случае

микроэмульсии на основе додецилсульфата натрия без каких-либо добавок. Установлено, что при добавлении в систему второго ПАВ эффективность разделения незначительно ухудшается, но в целом, эффективности в режимах ВЭЖХ и МЭЖХ схожи. Практически во всех случаях наблюдается хорошее разрешение.

Введение в подвижную фазу второго ПАВ было успешно использовано для одновременного определения шести веществ, применяемых в косметической промышленности для защиты кожи от УФ-излучения (далее УФ-фильтров). Согласно сертифицированной методике, широко использующейся в настоящее время на предприятиях (АРАМ 9.975-3), анализ в изократическом режиме занимает более часа, при этом процедура пробоподготовки одного образца также занимает несколько часов. Варьированием состава

ОИЩНЛШГТГ.%

Рис. 4. Зависимость времени удерживания бутилбензола от содержания второго ПАВ (ППГ) в системе. Суммарное содержание ДДСН и ППГ - 3,5%, н-бутанола 8%, н-гептана- 0,8%. Колонка: УМС РаскРго (150«4,6 мм; 5 мкм). Скорость потока 0,5 мл/мин. Термостатирование 40°С.

микроэмульсии, состоящей из ДДСН, гептана и бутанола, не удалось разделить пики октил-и гомоментилсаллицилата при времени анализа менее получаса. Добавка второго ПАВ (полипропиленгликоля) в количестве 0,5% позволила снизить время анализа до 25 минут и добиться полного разделения всех определяемых компонентов. Такая концентрация ППГ соответствует максимальной элюирующей способности для микроэмульсии на основе этих ПАВ (рис. 5)

S*

2?.

А

i " к»

J I'U

* *

f. 5

.6 20 мнп

лЛ

-,2 *

......._А

Рис. 5. Хроматограмма экстракта из образца крема (AVON™). 1 - бензофенон-3; 2 -бутилметоксидибензоилметан; 3 - октокрилен; 4 - этилгексилметоксицинкамат; 5 -октилсалицилат; б - гомоментилсаллицилат. А - разделение в режиме МЭЖХ. Колонка: YMC-Pack Pro С18 4.6*150 мм. Подвижная фаза: 0,05 % ТФУ; 1% н-гептан 8% н-бутанол; 0,5% ППГ; 3% ДДСН. Скорость потока 0,5 мл/мин, температура 45°С. Б - режим ВЭЖХ (методика АРАМ 9.975-3). Колонка: Zorbax SB 4.6x250 мм. Подвижная фаза: 24% метанол, 76% уксусная кислота (4%). Скорость потока 1,5 мл/мин. Термостатирование 40°С. Концентрации компонентов: от 3 до 20 мг/л. Спектрофотометрическое детектирование при 260 нм.

Полученные методом МЭЖХ результаты хорошо согласуются с результатами, полученными по методике АРАМ 9.975-3, а также с паспортными данными исследованных образцов (табл. 3).

Таблица 3. Результаты анализа солнцезащитного крема на содержание УФ-фильтров (п=3, Р=0,95)._

Вещество Найдено методом МЭЖХ, % Найдено методом ОФ ВЭЖХ, % Паспортные данные, %

Бензофенон-3 2,7±0,1 2,8±0,2 0,1-6,0

Бутилметоксидибензоилметан 1,6±0,1 1,6±0,2 0,2-3,0

Октокрилен н/о* н/о**± в образце отсутствует

Этилгексилметоксициннамат 7,3±0,2 7,4±0,3 0,01-7,5

Октилсаллицилат 4,4±0,1 4,4±0,2 4,0-5,0

Гомоментилсаллицилат 1,2±0,1 1,1±0,1 0,5-2,0

'содержание октокрилена в образце менее 0,0001 % ** содержание октокрилена в образце менее 0,0003 %

Способы устранения давления в хроматографической системе

Основным недостатком используемых микроэмульсионных подвижных фаз является высокое давление в хроматографической системе, обусловленное повышенной вязкостью микроэмульсий. На практике это часто приводит к необходимости понижать скорость потока подвижной фазы, что, в свою очередь приводит к ухудшению эффективности разделения и, несомненно, снижает экспрессность анализа. Чтобы давление в системе не превышало 200 бар (данная величина позиционируется рядом производителей как верхний предел допустимого давления) при работе с 5-микронными сорбентами скорость потока необходимо снижать до 0,3-0,4 мл/мин.

Можно предложить два основных подхода для устранения этого недостатка. Первым способом является увеличение температуры элюента, что способствует снижению вязкости микроэмульсии. При этом необходимо учитывать, что с ростом температуры обычно возрастает уровень шума (табл. 4) и надо искать некоторый компромисс между давлением в системе и соотношением сигнал-шум, которое в конечном итоге и определяет предел обнаружения.

Таблица 4. Влияние температуры элюента на давление в хроматографической системе и соотношение сигнал/шум.

Температура, °С Давление в системе, бар * Соотношение сигнал/шум**

20 170 200

30 160 200

40 150 100

50 140 50

* Состав микроэмульсии: ДЦСН 3,3%, н-гептан 0,8%, н-бутанол 8%. Колонка Zorbax ХИВ-С18 4,6x150 мм. Скорость потока элюента 0,5 мл/мин.

** Проба: водный раствор дексаметазона с концентрацией 5 мг/л. Спектрофотометрическое детектирование при 254 нм.

Как показано в табл. 4, в среднем при повышении температуры элюента на 10°С давление снижается на 10 бар. Вместе с тем, начиная с 40°С наблюдается резкое возрастание уровня фонового сигнала при постоянной величине аналитического. Также, начиная с 50°С, отмечено ухудшение воспроизводимости анализа. В дальнейшем в данной работе большинство экспериментов проводили при температуре 40°С.

По-видимому, наиболее перспективным вариантом снижения давления является использование монолитных неподвижных фаз. Благодаря уникальной макропористой структуре данных сорбентов возможно осуществлять высокоэкспрессное и эффективное разделение широкого круга соединений. При этом скорости потока могут достигать нескольких миллилитров в минуту. На рис. 6 приведена хроматограмма экстракта из препарата «Финалгон». Видно, что на монолитной колонке разделение можно осуществить всего за 2,5 минуты, что более чем в 7 раз экспресснее по сравнению с вариантом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. При этом давление в системе не превышает 50 бар при скорости потока 1,5 мл/мин и 25"С. Для сравнения, в случае МЭЖХ при скорости потока микроэмульсии 0,5 мл/мин и температуре колонки 40°С давление составило 100 бар.

1—1—■-1—1—■—■ 1 ' i " 1 i--—1—'—i—1—'-1—1—

J¡¿_1_li_2_2.S_3

Bw»

Рис. 6. Хроматограмма экстракта из лекарственного средства в мазевой форме «Финалгон» ®. Пики: 1 - сорбиновая кислота, 2 - нонилваниламид, 3 - никобоксил, 4 - диэтоксипропиладипат. Колонка: Onyx Monolithic (100x3 мм). Подвижная фаза: 0.8% ;/-гептан, 3,3% ДДСН, 8% н-бутанол. Скорость потока 1,5 мл/мин. Термостатирование 40°С. Спектрофотометрическое детектирование при 210 нм.

Метиленовая селективность в режиме МЭЖХ

Одним из важнейших параметров, характеризующих разделяющую способность системы, является метиленовая селективность. Для оценки метиленовой селективности в режимах обращенно-фазовой и микроэмульсионной жидкостной хроматографии в рамках данной работы был проведен анализ смеси гомологов бензола и его алкилзамещенных. Хроматограммы приведены на рис. 7.

Рис. 7. Хроматограмма тестовой смеси в режиме микроэмульсионной (А) и обращенно-фазовой (Б) жидкостной хроматографии. Пики: 1 - бензол, 2 - толуол, 3 - этилбензол, 4 — пропилбензол, 5 - бутилбензол. Колонка ZORBAX Eclipse XDB-C18 150x4,6 мм (5 мкм). Подвижная фаза: А - 3,3% ДДСН, 0,8% н-гептан, 10% и-бутанол. Б - 40% ацетонитрил, 60% вода. Скорость потока 0,5 мл/мин. Спектрофотометрическое детектирование при 254 нм.

При изучении метиленовой селективности в режиме МЭЖХ было впервые показано, что зависимость удерживания, которая в обычном случае носит нелинейный характер и спрямляется в логарифмических координатах, в случае микроэмульсионного варианта является линейной изначально (рис. 8). Такой характер она имеет для более чем 20

12

исследованных микроэмульсионных подвижных фаз различного состава, вне зависимости от их качественного и количественного состава.

35

30 у =4,7Бх* 7.8 И* = 0,5991 ,-ш

25 < 20 .Ж' ♦

■ • офвэжх ■ мэжх

10 ♦ ♦ ♦

0

Бензол Толуол Этилбензол Пропидбенэод Бутилбензол

Рис. 8. Зависимость удерживания в гомологическом ряду бензол - бутилбензол.

Полученные зависимости дают возможность предсказать времена удерживания различных соединений по временам удерживания их гомологов. По сравнению с традиционным подходом, когда полученные зависимости спрямляют в логарифмических координатах, данный вариант является более удобным и точным. Как мы предполагаем, полученные зависимости связаны с изменением механизма разделения. Более детально к настоящему моменту причины этого явления не установлены. Тем не менее, данная особенность микроэмульсионных подвижных фаз могут быть успешно использованы на практике.

Совместимость микроэмульсионных подвижных фаз с различными вариантами детектирования

Спектрофотометрическое детектирование

Спектрофотометрический детектор на настоящий момент является одним из самых распространенных в жидкостной хроматографии. Как нами было показано, рабочий диапазон для СФ детектирования в режиме МЭЖХ начинается от 210 нм. В диапазоне 190-210 нм уровень шума был достаточно большим (величина фонового сигнала составляла от 0,05 до 1 у.е.), тем не менее, возможно осуществлять детектирование в этой области при определении соединений в больших концентрациях. Необходимо отметить, что в видимой области для исследованных соединений изменений в спектрах поглощения при переходе от режима ВЭЖХ к МЭЖХ обнаружено не было.

Рефрактометрическое детектировании и детектирование по светорассеянию

Рефрактометрический детектор и детектор по светорассеянию несовместимы с микроэмульсионными элюентами, поскольку уровень шума возрастает в данных случаях более чем на два порядка по сравнению с водно-органическими подвижными фазами. При рефрактометрическом детектировании средний уровень фонового сигнала составляет 2 у.е. (для ОФ ВЭЖХ уровень шума колеблется в диапазоне от 0,2 до 0,5 у.е.).

Электрохимическое детектирование

Электрохимический детектор оказался приемлем для работы с микроэмульсиями, уровень фонового сигнала практически не изменялся. Важно обращать внимание на тип электрода; поскольку микроэмульсия содержит от 10% и более органической фазы, это может негативно отразиться на его функционировании. Обнаружено, что вольтамперные характеристики определяемых соединений при помещении в среду микроэмульсии значительно изменяются. Данный эффект проиллюстрирован на примере глюкозамина (рис. 9).

Рис. 9. Вольтамперограмма глюкозамина на стеклоуглеродном электроде (хлорсеребряный электрод сравнения) в водно-органической и микроэмульсионной средах. Концентрация глюкозамина 2 мкг/мл.

Флуоресцентное детектирование

При помещении вещества в мицеллярную среду, его характеристики, в том числе и спектральные, меняются. При изучении флуоресцентных свойств ряда веществ в водно-органических и микроэмульсионных средах было установлено, что при помещении вещества в микроэмульсионную среду максимум в спектре флуоресценции сдвигается на величину вплоть до нескольких десятков нанометров (рис. 10). На изосечении ЗО спектра поглощения-флуоресценции ципрофлоксацина видно, что изменяется интенсивность максимума в спектре флуоресценции, а также появляется второй, менее интенсивный максимум в длинноволновой области. По осям х и у в данном случае отложены длины волн возбуждения и флуоресценции соответственно. Ось г соответствует интенсивности излучения. Спектры возбуждения и флуоресценции ципрофлоксацина регистрировали он-лайн в режимах ион-парной, мицеллярной и микроэмульсионной хроматографии. При переходе от обращено-фазовой системы к мицеллярной и затем микроэмульсионной изменения в спектре флуоресценции проявляются только при помещении определяемых оединений в среду микроэмульсии. Значительных изменений в спектре поглощения в данном случае обнаружено не было (табл. 5).

Рис. 10. ЗО спектр поглощения-флуоресценции ципрофлоксацина (изосечение). Концентрация вещества в растворе 1 мг/л. А - водно-органическая среда, Б -микроэмульсия.

Найдено, что в большинстве случаев максимум спектра флуоресценции в среде микроэмульсии сдвигается в длинноволновую область. Если изначально в спектре было несколько максимумов, то их соотношение может измениться. Часто максимум, лежащий в коротковолновой области, пропадает. Поскольку в мицеллярной среде никаких изменений не происходит, то можно предположить, что все изменения в спектральных характеристиках веществ вызваны наличием в составе микроэмульсии масла, внедрение в каплю которого приводит к спектральному сдвигу.

Нами найдено, что при изменении концентрации ПАВ в составе микроэмульсии спектры поглощения и флуоресценции не изменяются. Возможно, спектральные свойства аналита определяются только средой масла, в которую переходит вещество. Это подтверждается тем фактом, что при изменении типа масла максимум спектра флуоресценции несколько сдвигается.

Таблица 5. Спектральные характеристики и пределы обнаружения для ципрофлоксацина в различных средах.

Вода/ацетонитрил/муравьиная кислота

ДЦСН/н-бутанол/муравьиная кислота (мицелляр|н:аясистема)

МЭ (к-гептан, ДДСН, н-бутанол, муравьиная кислота)_

Спектр поглощения

/ \

Спектр флуоресценции

Предел обнаружения, мкг/л

10

0,4

Длины волн возбуждения/ флуоресценции

275/330

270/330

270/450 (270/330)

Применение мнкроэмульсий в пробоподготовке

Распространенной задачей является анализ объектов с высоким содержанием жира в матрице, например, лекарственные препараты в кремовой и мазевой формах, косметические препараты, продукты питания. Отличительной особенностью всех этих объектов анализа является наличие сложной многокомпонентной матрицы, что обуславливает необходимость проведения сложной и многоступенчатой процедуры пробоподготовки. К основным методам пробоподготовки, применяемым в настоящее время относятся твердофазная и жидкостная экстракция, экстракция в аппарате Сокслета, а в ряде случаев - осаждение белков различными реагентами. При этом наблюдаются потери образца, возникает необходимость использования внутреннего стандарта. Соответственно, в каждом конкретном случае нужно подбирать оптимальные условия пробоподготовки. Нами был предложен альтернативный вариант пробоподготовки, заключающийся в разбавлении (либо растворении) образца в микроэмульсии.

Лекарственные препараты

Как уже упоминалось выше, распространенной задачей является определение действующих компонентов в лекарственных препаратах в кремовой и мазевой формах. В препаратах такого рода содержится большое количество жиров и масел, которые часто мешают как при пробоподготовке (затруднительно извлечь из подобной матрицы гидрофобные соединения) так и при анализе (оказывают мешающее влияние).

Вариант микроэмульсионной жидкостной хроматографии был успешно применен при анализе различных объектов и показал наилучшие результаты по сравнению с существующими методами. Результаты по определению как гидрофильных, так и гидрофобных веществ в лекарственных препаратах представлены в табл. 6.

Видно, что наилучшие результаты получены в варианте пробоподготовки с использованием микроэмульсии. При проведении такой пробоподготовки образец целиком растворяется в микроэмульсии, не образуя при этом осадка или нескольких расслаивающихся фаз. В первую очередь, это позволяет минимизировать потери, поскольку все компоненты образца вводятся в хроматограф. Воспроизводимость данного варианта пробоподготовки также превышает воспроизводимость альтернативных способов.

Таблица 6. Сравнение различных методов пробоподготовки при анализе лекарственных средств в мазевой форме (п=3, Р=0.95). Тестовые соединения: капсаицин, коэнзим <2ю.

Метод пробоподготовки Степень извлечения, %

Капсаицин Ою

Экстракция буганолом 86 + 2 10 + 3

Экстракция водой 30+1 -

Экстракция гсксаном с последующим упариванием и перерастворением в подвижной фазе 8±2 44 ±9

Экстракция гексаном в аппарате Сокслета с последующим упариванием и перерастворением 14±6 68 ± 11

Экстракция метанолом в аппарате Сокслета 90 ± 10 17 ±6

Растворение образца в микроэмульсии 100 ±2 97 + 4

Продукты питания

Проблемы, связанные с потерями определяемых соединений и низкой воспроизводимостью результатов, наблюдаются и при анализе продуктов питания. Микроэмульсии были успешно использованы для пробоподготовки и анализа молочных продуктов на содержание флоксациновых антибиотиков (рис. 10).

il

Время анализа, мин

Рис. 10. Хроматограмма модельной смеси ампициллиновых антибиотиков в молоке. Подвижная фаза: 1,8% ДДСН, 1,5% Lutensol, 0,8% к-гептан, 8% н-бутанол.

Пики: 1 - ампициллиновая кислота, 2 - карбенициллин, 3 - ампициллин, 4 - пиперациллин, 5 -оксациллин. Концентрация антибиотиков в образце - 5 мг/л. Пробоподготовка: разбавление образца микроэмульсией в соотношении 1:1.Спектрофотометрическое детектирование при 265 нм.

В случае анализа кисломолочных продуктов перед вводом пробы в хроматограф необходимо было отцентрифугировать смесь и отделить надосадочную жидкость. Несмотря на частичное осаждение белков, извлечение определяемых соединений было количественным (табл. 7).

Таблица 7. Проверка способа определения ампициллиновых антибиотиков в кисломолочных

Соединение Введено, мг/л Найдено, мг/л

Ампициллиновая кислота 0,1 0,08±0,01

1 0,9±0,1

10 11±1

Карбенициллин 0,1 0,13±0,02

I 0,9±0,1

10 10±1

Ампициллин 0,1 0,10±0,01

1 1,2±0,2

10 9±1

Пиперациллин 0,1 0,09±0,02

1 1±0,2

10 9±1

Оксациллин 0,1 0,08±0,01

1 1,4±0,3

10 10±2

Биологические жидкости

Процедура пробоподготовки биологических жидкостей аналогична описанным выше. Она заключается в разбавлении образца микроэмульсией. В ходе экспериментов было установлено, что оптимальным соотношением образец:микроэмульсия является 1:2. В этом случае добавляемой микроэмульсии достаточно, чтобы солюбилизировать белки, входящие в состав пробы, и с другой стороны, не происходит сильного разбавления пробы. Тем не менее, в зависимости от способа отбора цельной крови и се первичной обработки (получение плазмы, сыворотки, наличие или отсутствие разнообразных антикоагулянтов) это соотношение может изменяться. Такой вариант пробоподготовки был реализован при определении гиполипидимического препарата ловастатина в плазме крови. Несмотря на высокую воспроизводимость и количественное извлечение ловастатина из образца, анализ плазы проводили с использованием внутреннего стандарта - симвастатина. Важно, что большинство эндогенных соединений элюируются с мертвым временем и не мешают определению ловастатина (рис. 11).

4о

1

| ю ■

S

о Г" о

Рис. П. Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей 50 нг/мл ловастатина. Колонка: Onyx Monolithic С18 3x100 мм.

Микроэмульсия: 2,5% ДДСН; 0,8% н-гептан; 8% к-бутанол; 20 мМ аммонийно-ацетатный буферный раствор, рН 7,6. Скорость потока 1 мл/мин. Температура колонки 40°С. Спектрофотометрическое детектирование при 238 нм. Пики: 1 - симвастатин (внутренний стандарт), 2 - ловастатин. Пробоподготовка: разбавление образца микроэмульсией в соотношении 2:1.

Пробоподготовка биологических образцов путем разбавления их микроэмульсией имеет ряд дополнительных преимуществ. Все компоненты пробы вводятся в прибор, что, как было указано выше, позволяет избежать потерь, неизбежных на стадии пробоподготовки. Дополнительно микроэмульсия может препятствовать разрушению определяемых компонентов. Так, в случае определения этоксидола в плазме крови стандартные способы пробоподготовки (жидкостная и твердофазная экстракция, осаждение белков органическими растворителями, кислотами, ионами металлов) не привели к необходимому результату. Целевое соединение в образце после пробоподготовки обнаружить не удалось. Тем не менее, в случае

Врем* у.тгркникииа..

разбавления образца микроэмульсией извлечение было количественным. Было высказано предположение, что этоксидол сорбируется на белках и поэтому другие способы пробоподготовки неприемлемы.

V

1

О 5 10 15 2а 25 30

Время, мин

Рис. 12. Изменение концентрации этоксидола в плазме крови во времени, 1 - плазма крови, разбавленная микроэмульсией в соотношении 1:3,2-плазма после осаждения белков. Начальная концентрация внесенного этоксидола составляла 10 мг/л.

Для проверки этой гипотезы раствор этоксидола с известной концентрацией добавляли к образцу плазмы после процедуры пробоподготовки (после осаждения белков и отделения надосадочной жидкости). Но даже в этом случае уже через 5 минут концентрация определяемого соединения в образце упала ниже предела обнаружения. В случае внесения этоксидола в плазму, разбавленную микроэмульсией, его концентрация оставалась постоянной в течение как миниум 15 минут (рис. 12). Это позволяет сделать вывод, что микроэмульсия в данном случае выполняет стабилизирующую

функцию, предотвращая метаболизм этоксидола.

Микроэмульсии типа вода в масле

Основной областью применения микроэмульсий типа «вода в масле» является определение сильно гидрофобных соединений, в том числе в сложных матрицах. В данной работе нами был предложен экспрессный метод одновременного определения окисленной и восстановленной формы коэнзима <5ю в плазме крови (рис.13).

потока 0,5 мл/мин. Состав микроэмульсии 65% н-гептан, 6% ДДСН, 5% вода, 23% и-бутанол. Спектрофотометрическое детектирование при 275 нм. Содержание в образце: ОюНг - 0,6 мг/л; <2ю - 1,2 мг/л. Термостатирование 40°С.

Анализ одного образца плазмы крови занимает в этих условиях менее 7 минут, при этом эффективность разделения выше, чем в обращенно-фазовом режиме, при полном разрешении пиков компонентов.

Хромато графические характеристики окисленной и восстановленной форм коэнзима в режимах МЭЖХ и ВЭЖХ приведены в табл. 8.

Таблица 8. Хроматографические характеристики ()|о и СЬоНг в режимах МЭЖХ и ВЭЖХ.

МЭЖХ ВЭЖХ

R», Qio/QioH2 1,8 2,1

Nqio, TT/m 12000 5600

Nqioiu, TT/m 14000 8000

Предел обнаружения Qm, нг/мл 20 50

Предел обнаружения Q10H2, нг/мл 100 200

Видно, что метод МЭЖХ не уступает варианту ОФ ВЭЖХ, а по чувствительности и эффективности даже его превосходит. Это еще раз показывает перспективность использования подвижных фаз на основе микроэмульсий типа вода в масле для экспрессного определения неполярных гидрофобных соединений.

Проведение реакций он-лайн дериватизации в среде микроэмульсии

В литературе описано явление ускорения протекания реакций при помещении компонентов в структурированную среду, например, в раствор циклодекстринов или фуллеренов. Поскольку мнкроэмульсии представляют собой отдельные домены одной жидкости в среде другой, т.е. тоже могут быть отнесены к классу микроструктурированных сред, интересным представляется изучить возможность их использования в качестве своеобразного реактора для проведения предколоночной дериватизации в режиме он-лайн.

Подробно этот процесс был изучен на примере реакции дериватизации ампициллина нафталиндиальдегидом. Согласно литературным данным эта реакция протекает в щелочном буферном растворе с рН 9,0 в присутствии нуклеофила и при нагревании. Даже в таких условиях время протекания реакции превышает 10 минут. В ходе работы были построены зависимости полноты протекания реакции от времени для процесса дериватизации ампициллина в различных условиях (рис. 14).

20 с 60'С

Микроэмульсия

Время реакции, мин

Рис. 14. Зависимости полноты протекания реакции от времени для реакции дериватизации ампициллина нафталиндиальдегидом.

Видно, что повышение температуры реакционной смеси приводит к несущественному ускорению протекания реакции. При увеличении температуры с 20 до 60°С время завершения реакции сократилось с 30 до 20 минут. При помещении реагентов в среду микроэмульсии реакция протекает со 100% выходом менее чем за 5 минут. Такой эффект может быть вызван двумя факторами. Во-первых, проникновение в каплю микроэмульсии приводит к изменению сольватационных параметров веществ, участвующих в реакции. Во-вторых, продукт реакции согласно коэффициенту распределения между водной и органической фазами, переходит преимущественно в фазу масла и, таким образом смещает равновесие в системе исходные вещества<->продукт реакции в сторону продуктов.

Аналогичный эффект был получен нами и при изучении реакции дериватизации глкжозамина флюоренметоксикарбонилом. Проведение реакции в микроэмульсионной среде позволило сократить время реакции в три раза (с 20 до 6 минут).

Таки образом, нами было показано, что помещение реагентов в микроэмульсию значительно ускоряет протекание реакции, что может быть использовано в хроматографическом анализе.

Выводы

1. Изучены свойства микроэмульсий в качестве подвижных фаз в жидкостной хроматографии. Показано, что в режиме МЭЖХ возможно экспрессное изократическое разделение веществ, сильно отличающихся по гидрофобности.

2. Продемонстрировано изменение ряда селективности в режиме МЭЖХ по сравнению с вариантом ОФ ВЭЖХ. Для дополнительного управления селективностью впервые предложено вводить в систему второе ПАВ. Для восьми неионогенных и двух анионых ПАВ получены зависимости элюирующей силы подвижной фазы от их концентрации, показано, что данная зависимость всегда имеет максимум, в отличие от системы, содержащей только одно поверхностно-активное вещество.

3. На примере алкилзамещенных бензолов в режиме МЭЖХ установлено, что зависимость удерживания для гомологов имеет линейный характер в координатах время удерживания-число атомов углерода в алкильном радикале. Показана возможность предсказания времен удерживания соединений в гомологическом ряду алкилзамещенных иминов и 2,4-диншрофенилгидразонов алифатических альдегидов.

4. Установлена возможность применения микроэмульсионных подвижных фаз при различных вариантах детектирования (спектрофотометрическое, электрохимическое, флуоресцентное). Для флуоресцентного и электрохимического детектирования обнаружено многократное увеличение чувствительности определения (для электрохимического варианта — до 5 раз, для флуоресцентного - до 40). Показана невозможность применения рефрактометрического детектора и детектора по светорассеянию.

5. Продемонстрировано значительное упрощение процедуры пробоподготовки для объектов со сложной матрицей, в том числе с большим содержанием жира. По сравнению с традиционными вариантами (твердофазная, жидкостная экстракция, экстракция в аппарате Сокслета), растворение образца в микроэмульсии позволяет количественно извлечь определяемые соединения из матрицы менее чем за 5 минут. Данный подход был успешно применен при анализе лекарственных средств в кремовой и мазевой форме, продуктов питания, биологических жидкостей. На примере определения этоксидола в плазме крови показано, что микроэмульсия позволяет избежать разложения неустойчивых соединений в процессе пробоподготовки.

6. Показано ускорение протекания реакций предколоночной дериватизации в микроэмульсионной среде. Для процесса дериватизации биогенных аминов нафталицдиальдегидом отмечено пятикратное уменьшение времени протекания реакции.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Pashkova Е. Determination of underivatized glucosamine in human plasma by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection: Application to pharmacokinetic study / E. Pashkova, A. Pirogov, A. Bendryshev, E. Ivanaynen, O. Shpigun // J. Pharm. Biomed. Anal. 2009. V. 50. № 4. P. 671-674.

2. Свидрицкий E. П. Одновременное определение жиро- и водорастворимых витаминов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии / Е.П. Свидрицкий, Е. Б. Пашкова, А. В. Пирогов, О. А. Шпигун // Журн. аналит. химии. 2010. Т. 65. № 3. Стр. 292-297.

3. Пашкова Е.Б. Определение капсаицина в лекарственных средствах в мазевой форме методом микроэмульсионной жидкостной хроматографии /Е.Б. Пашкова, А. В. Пирогов, А. А. Бендрышев, О. А. Шпигун // Вестник Московского Университета, сер. 2 (химия). 2011. Т. 52. №4. Стр. 315-321.

4. Пашкова Е. Б. Определение ловастатина в плазме крови методом микроэмульсионной жидкостной хроматографии / Е. Б. Пашкова, А. В. Пирогов, О. А. Шпигун. // Заводская лаборатория. 2010. № 12. Стр. 25-29.

5. Pashkova Е. Determination of capsaicin in pharmaceuticals by oil-in-water microemulsion liquid chromatography / E. Pashkova, A. Pirogov, O. Shpigun // 15,h international congress on analytical chemistry Euroanalysis 2009, Innsbruck, Austria.

6. Пирогов A.B. Экспрессное определение консервантов в косметических продуктах методом микроэмульсионной жидкостной хроматографии / А.В. Пирогов, Е. Б. Пашкова, О. А. Шпигун / Тез. докладов Всероссийской конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии". 6-10 июля 2009 г. Самара 2009.

7. Пашкова Е.Б. Экспрессное определение ловастатина в плазме крови методом микроэмульсионной жидкостной хроматографии / Е.Б. Пашкова, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун // Тез. докладов I всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции». Москва, 2009. стр. 94.

8. Pirogov A. Rapid determination of preservatives in cosmetic products by microemulsion liquid chromatography / A. Pirogov, E. Pashkova, O. Shpigun // The 13,h Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, 19-20 January 2010, Tel-Aviv, Israel.

9. Пашкова Е.Б. Синтез и применение наноэмульсий в качестве подвижных фаз в жидкостной хроматографии / Е.Б. Пашкова, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун // Тез. докладов международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010". 12-15 апреля 2010, Москва, Россия.

10. Pirogov A. Determination of ethoxydol in plasma by microemulsion liquid chromatography / A. Pirogov, E. Pashkova, O. Shpigun // 28th international Symposium on Chromatography (ISC 2010). 12-18 September 2010, Valencia, Spain.

U.Pashkova E. Advantages of microemulsions as mobile phases in high performance liquid chromatography / E. Pashkova, A. Pirogov, O. Shpigun // 28th international Symposium on Chromatography (ISC 2010). 12-18 September 2010, Valencia, Spain.

12. Пашкова Е.Б. Синтез и применение наноэмульсий в качестве подвижных фаз в жидкостной хроматографии / Е.Б. Пашкова, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун // Тез. докладов Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». 26 сентября -1 октября 2010. Краснодар, Россия.

Подписано в печать: 17.11.10 Объем: 1,5усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 7697366 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Микроэмульсии: строение и классификация

1.1.1. Поверхностно-активные вещества: классификация и свойства

1.1.2. Поведение смесей ПАВ в растворе

1.2. Получение микроэмульсий

1.3. Специфические подвижные фазы в хроматографии

1.3.1. Мицеллярные подвижные фазы

1.3.2. Микроэмульсионные подвижные фазы

1.3.2.1. Микроэмульсии типа X/ — масло в воде

1.3.2.2. Варьируемые параметры в микроэмульсиях типа масло в воде

1.3.2.3. Режим изократического и градиентного элюирования в микроэмульсионной жидкостной хроматографити

1.3.2.4. Микроэмульсии типа Ь2 — вода в масле

1.3.3. Микроэмульсии на основе фторсодержащих компонентов

Глава 2. Аппаратура, материалы и техника эксперимента

2.1. Используемые реактивы

2.2. Аппаратура

2.3. Методика приготовления микроэмульсий

2.4. Методика пробоподготовки лекарственных препаратов

2.5. Методика пробоподготовки плазмы крови 60 Результаты и их обсуждение

Глава 3. Способы получения микроэмульсий

Глава 4. Характеристика микроэмульсий как подвижных фаз в жидкостной хроатографии

4.1. Влияние концентрации копонентов микроэмульсии на элюирующую силу подвижной фазы

4.2. Способы устранения высокого давления в хроматографической системе

4.3. Влияние второго поверхностно-активного вещества на селективность разделения

4.4. Метиленовая селективность в режиме микроэмульсионной жидкостной хроматографии

Глава 5. Совместимость микроэмульсионных подвижных фаз с различными вариантами детектирования

5.1. Спектрофотометрическое детектирование

5.2. Рефрактометрическое деткктирование. Детектирование по светорассеянию

5.3. Электрохимическое детектирование

5.4. Флуоресцентное детектирование

Глава 6. Применение микроэмульсий в пробоподготовке

6.1. Пробоподготовка лекарственных препаратов

6.2. Пробоподготовка продуктов питания

6.3. Пробоподготовка биологических жидкостей

Глава 7. Применение микроэмульсий типа вода в масле

Глава 8. Проведение реакций он-лайн дериватизации в среде микроэмульсии

Выводы

Актуальность темы. В современной ВЭЖХ актуальной является задача экспрессного одновременного изократического определения веществ, сильно отличающихся по своей полярности. Другой проблемой является определение следовых количеств самых разнообразных соединений в объектах со сложной многокомпонентной матрицей. В большинстве случаев предлагается использование масс-селективных детекторов (что позволяет для ряда объектов отказаться от пробоподгоговки), либо проведение хроматографического разделения на колонке с уникальной неподвижной фазой, специально предназначенной для определенного набора веществ. Минусы таких подходов очевидны: они являются сильно специфичными, а также требуют дорогостоящего оборудования и расходных материалов.

В 1992 году было предложено использовать микроэмульсии в качестве подвижной фазы для жидкостной хроматографии. Микроэмульсии используют в вариантах капиллярной электрокинетической хроматографии, но метод микроэмульсионной жидкостной хроматографии (МЭЖХ) должного развития не получил. Представляется интересным изучение поведения микроэмульсий в качестве подвижных фаз в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предполагается, что состав микроэмульсии, используемой в качестве подвижной фазы, можно варьировать в широких пределах и, таким образом, изменять элюирующую силу, что, например, позволит одновременно в изократическом режиме определять гидрофильные и гидрофобные соединения. Кроме того, по-видимому, микроэмульсии могут быть с успехом использованы и в режиме градиентного элюирования. Таким образом, метод микроэмульсионной жидкостной хроматографии может быть успешно применен для решения ряда актуальных задач. Необходимо более детальное изучение основ метода, установление зависимостей поведения аналитов в микроэмульсионной системе, а также решение вопросов совместимости микроэмульсий с различными вариантами хроматографического оборудования.

Цель работы состояла в исследовании особенностей использования микроэмульсий в качестве подвижных фаз в высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

• Оптимизация способа получения микроэмульсий заданного состава.

• Изучение зависимостей между составом микроэмульсии и ее элюирующей силой, давлением в хроматографической системе.

• Исследование совместимости микроэмульсий с различными вариантами детекторов (спектрофотометрический, флуоресцентный, электрохимический и др.).

• Изучение возможностей применения микроэмульсий для пробоподготовки объектов со сложной матрицей (лекарственные средства в кремовой и мазевой формах, биологические жидкости, продукты питания).

• Исследование возможности использования микроэмульсий в качестве реактора для предколоночной дериватизации.

Научная новизна. Предложен экспрессный способ получения микроэмульсий заданного состава. Впервые предложено вводить в микроэмульсию второе поверхностно-активное вещество (ПАВ) для управления селективностью разделения. В качестве второго ПАВ были исследованы восемь неионогенных и два анионных поверхностно-активных веществ. Показано, что в отличие от системы, содержащей только одно ПАВ, зависимость элюирующей силы такой подвижной фазы от концентрации ПАВ носит нелинейный характер и имеет максимум.

На примере алкилзамещенных бензолов установлено, что зависимость удерживания для веществ одного гомологического ряда в режиме МЭЖХ носит линейный характер в координатах время удерживания - число атомов углерода в алкильном радикале.

Показано увеличение чувствительности флуоресцентного и электрохимического детектирования при переходе от ОФ ВЭЖХ к МЭЖХ. В спектрах флуоресценции соединений в среде микроэмульсии наблюдали смещение 7 максимума в длинноволновую область, для ряда соединений было обнаружено появление второго максимума в спектрах поглощения и флуоресценции. При электрохимическом детектировании максимум вольтамперной характеристики смещается в область более высоких потенциалов. Детектирование в соответствующих условиях позволяет снизить предел обнаружения до 40 раз по сравнению с обращенно-фазовым вариантом.

Продемонстрированы преимущества микроэмульсий для пробоподготовки. Разбавление образца микроэмульсией позволяет экспрессно и количественно извлекать необходимые вещества из анализируемой пробы. Показано, что микроэмульсия позволяет избежать метаболизма определяемых соединений в процессе пробоподготовки.

Предложено использование микроэмульсий в качестве реактора для предколоночной деривагизации. Установлено, что в среде микроэмульсий время протекания реакции сокращается до 5 раз.

Предложено использовать микроэмульсии типа вода в масле для экспрессного определения сильно гидрофобных соединений в сложных матрицах.

Практическая значимость. Предложен способ пробоподготовки лекарственных средств, биологических жидкостей и продуктов питания, позволяющий значительно упростить эту процедуру и повысить ее экспрессность. Процедура пробоподготовки занимает 5 минут и включает в себя одну стадию — разбавление образца микроэмульсией. При анализе образцов с высоким содержанием жира (лекарственные средства в кремовой и мазевой форме) это позволяет избежать длительных и трудоемких стадий очистки и реэкстракции.

За счет многократного увеличения чувствительности флуоресцентного и электрохимического детектирования возможно избежать стадии концентрирования при пробоподготовке биологических образцов. Разработан способ чувствительного (на уровне нг/мл) определения ампициллиновых антибиотиков в продуктах питания и биологических жидкостях. Показана возможность экспрессного определения следовых количеств лекарственных препаратов (ципрофлоксацин, глюкозамин) в биологических жидкостях.

С использованием микроэмульсий на основе двух ПАВ предложен экспрессный способ определения УФ-фильтров в косметических препаратах.

На примере дериватизации биогенных аминов нафталиндиальдегидом показана возможность уменьшения времени протекания реакций предколоночной дериватизации до 5 раз.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспрессный способ получения стабильных микроэмульсий заранее заданного состава.

2. Влияние состава микроэмульсии на ее элюирующую способность.

3. Способ управления селективностью разделения путем введения второго ПАВ в систему.

4. Совместимость микроэмульсионных подвижных фаз с различными типами детекторов. Особенности детектирования в режиме МЭЖХ.

5. Результаты применения микроэмульсий при пробоподготовке реальных объектов для хроматографического анализа.

6. Преимущества использования микроэмульсий в качестве реактора для предколоночной дериватизации.

Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 12 iL публикациях. Результаты исследований докладывались на 15 International Congress on Analytical Chemistry Euroanalysis (Инсбрук, Австрия, 2009); Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, 2009); I Всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009); 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society (Тель-Авив, Израиль, 2010); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» (Москва, 2010, 1 премия); 28th International Symposium on Chromatography (Валенсия, Испания, 2010, 1 премия за лучший стендовый доклад); Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов докладов.

Выводы

1. Изучены свойства микроэмульсий в качестве подвижных фаз в жидкостной хроматографии. Показано, что в режиме микроэмульсионной жидкостной хроматографии возможно экспрессное изократическое разделение веществ, сильно отличающихся по гидрофобности.

2. Продемонстрировано изменение ряда селективности в режиме МЭЖХ по сравнению с вариантом ОФ ВЭЖХ. Для дополнительного управления селективностью впервые предложено вводить в систему второе ПАВ. Для восьми неионогенных и двух анионых ПАВ получены зависимости элюирующей силы подвижной фазы от их концентрации, показано, что данная зависимость всегда имеет максимум, в отличие от системы, содержащей только одно поверхностно-активное вещество.

3. На примере алкилзамещенных бензолов в режиме МЭЖХ установлено, что зависимость удерживания для гомологов имеет линейный характер в координатах время удерживания-число атомов углерода в алкильном радикале. Показана возможность предсказания времен удерживания соединений в гомологическом ряду алкилзамещенных имипов и 2,4-динитрофенилгидразонов алифатических альдегидов.

4. Установлена возможность применения микроэмульсионных подвижных фаз при различных вариантах детектирования (спектрофотометрическое, электрохимическое, флуоресцентное). Для флуоресцентного и электрохимического детектирования обнаружено многократное увеличение чувствительности определения (для электрохимического варианта - до 5 раз, для флуоресцентного — до 40). Показана невозможность применения рефрактометрического детектора и детектора по светорассеянию.

5. Продемонстрировано значительное упрощение процедуры пробоподготовки для объектов со сложной матрицей, в т.ч. с большим содержанием жира. По сравнению с традиционными вариантами (твердофазная, жидкостная экстракция, экстракция в аппарате Сокслета), растворение образца в микроэмульсии позволяет количественно извлечь определяемые соединения из матрицы менее чем за 5 минут. Данный подход был успешно применен при анализе лекарственных средств в кремовой и мазевой форме, продуктов питания, биологических жидкостей. На примере определения этоксидола в плазме крови показано, что микроэмульсия позволяет избежать разложения неустойчивых соединений в процессе пробоподготовки.

6. Показано ускорение протекания реакций предколоночной дериватизации в микроэмульсионной среде. Для процесса дериватизации биогенных аминов нафталиндиальдегидом отмечено пятикратное уменьшение времени протекания реакции.

1. Холмберг К., Йёнссон Б., Кромберг Б., Линдман Б. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2007. 528 с.

2. Ash М., Ash I. Handbook of industrial surfactants. Gower, Aldershot, UK, 1993. 2129 p.

3. Schramm L. Emulsions, foams and suspensions: fundamentals and applications. Wiley, 2005. 448 p.

4. Kumar P. Handbook of microemulsion science and technology. Marcel Dekker, New York, 1999. 842 p.

5. Holmberg K. Handbook of applied surface and colloid chemistry. Wiley, 2002. 591 p.

6. Zemb Th. Flexibility, persistence length and bicontinuous microstructures in microemulsions // Chimie. 2008. V. 4. P. 1-7.

7. Rodriguez-Abreu C. Emulsions with structured continious phase / C. Rodriguez-Abreu, M. Lazzari // Curr. Opinion Colloid Interface Sci. 2008. V. 13. № 4. P. 198-205.

8. Garti N. Double emulsions: progress and applications / N. Garti, C. Bispernik // Curr. Opinion Colloid Interface Sci. 1998. V. 3. № 6. P. 657-667.

9. Benita S. Microencapsulation. Methods and industrial application. 2nd edition. Taylor and Francis, 2006. 756 p.

10. Choi S. Impact of iron encapsulation wiyhin the interior aqueous phase of water-in-oil emulsions on lipid oxidation / S. Choi, A. Decker, D. McClements // Food Chem. 2009. V. 116.№ l.P. 271-276.

11. Van Os N., Haak J., Rupert A. Physico-chemical properties of selected anionic, cationic and nonionic surfactants. Elsevier, Amsterdam, 1999. 425 p.

12. Myers D. Surfaces, interface and colloids. Wiley, 1999. 519 p.

13. Pashley R., Karaman M. Applied colloid and surface chemistry. Wiley, 2004. 188 p.

14. Verwey E., Overbeek J. Theory of the stability of the liophobic colloids. Elsevier Pub. Inc. 1948.215 р.

15. Wennerstrom H. Interfacial tension in microemulsions / H. Wennerstrom, J. Balogh, U. Olsson // Colloids and Surfaces. 2006. V. 291. № 1. P. 69-77.

16. Tchakalova V. Solubilization and interfacial curvature in microemulsions I. Interfacial expansion and co-extraction of oil / V. Tchakalova, F. Testard, K. Wong, A. Parker, D. Benczedi, Th. Zemb // Colloid and Surfaces A. 2008. V. 331. № 1. P. 31-39.

17. Leodidis E. Amino acids in AOT reversed micelles. Determination of interfacial partition coefficients using the phase-transfer method / E. Leodidis, A. Hatton // J. Phys. Chem. 1990. V. 94. № 16. P. 6400-6411.

18. Friberg S., Lindman B. Organized solutions. Marcel Dekker, New York. 1992. 383 p.

19. Shinodo K. Organized surfactant systems: microemulsions // Langmuir. 1987. V. 3. № 2. P. 135-149.

20. Ланге К. Поверхностно-активные вещества: синтез, свойства, анализ, применение. СПб.: Профессия. 2004. 240 с.

21. Aldrich. Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment. Germany. 2003-2004. P. 804.

22. Поверхностно-активные вещества. Справочник. Под ред. Абрамзона А. и Гаевого Г. Л.: Химия. 1979. 376 с.

23. Loginova L. Micellar liquid chromatography retention model based on mass-action concept of micelle formation / L. Loginova, L. Samokhina, A. Boichenko, A. Kulikov // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1104. № 2. P. 190 197.

24. Berthod A., Garcia-Alvarez C. Micellar liquid chromatography. Marcel Dekker. New York. 2000. 632 p.

25. Rafati A. Investigation of the aggregation number, degree of alcohol attachment and premicellar aggregation of sodium dodecyl sulfate in alcohol-water mixtures / A. Rafati, H. Gharibi, M. Rezaie-Sameti M // J. Mol. Liq. 2004. V. 111. № 2. P. 109-116.

26. Логинова Л.П. Влияние некторорых алифатических кислот и спиртов на мицеллярные свойства додецилсульфата натрия / Л.П. Логинова, М.Н. Галат, Е.Ю. Яковлева // Вестник Харьковского национального университета. 2007. Т. 15 (38). №70. С. 100-117.

27. Shukla D. Anionic Gemini Surfactants: A Distinct Class of Surfactants / D. Shukla, V. Tyagi // J. Colloid. Sci. 2006. V. 55. № 5. P. 215-226.

28. Shukla D. Synthesis and properties of geminis with two alkyl and two phosphate headgroups / D. Shukla, V. Tyagi // Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 2008. V. 110. № 6. P. 576-580.

29. Shukla D. Anionic Gemini surfactants: synthesis and surface active properties / D. Shukla, V. Tyagi // Surface Review and Letters. 2007. V. 14. № 5. P. 991-997.

30. Zhu S. Anionic Gemini surfactants: synthesis and aggregation properties in aqueous solutions / S. Zhu, F. Cheng, J. Wang, J. Yu // Colloids and surfaces A. 2006. V. 281. № 1. P. 35-39.

31. Fontell K. Some aspects on the cubic phases in surfactant and surfactant-like systems // Adv. Colloid Interface Sci. 1992. V. 41. № 3. P. 127-147.

32. Qun X. Adsorption of Anionic-Nonionic and Cationic-Nonionic Surfactant Mixtures / X. Qun, T. Vasudevan, P. Somasundaran // J. Colloid. Interface Sci. 1991. V. 142. № 2. P. 528-534.

33. Elworthy P., Florence A., Macfarlane C. Solubilization by surface-active agents. Chapman and Hall. London. 1968. 335 p.

34. Sadowski Z. Effect on polymer-surfactant interaction onto the spherical agglomeration / Z. Sadowski, I. Polowczyk, E. Jazdzyk, A. Szubert // Physicochemical Problems of Mineral Processing. 2004. V. 38. P. 351-358.

35. Madgassi S. Microemulsions based on anionic Gemini surfactants / S. Madgassi, M. Moshe, Y. Talmon, D. Danino // Colloids and Surf. A. 2003. V. 212. № 1. P. 1-7.

36. Goddard E., Ananthapadhmanabhan P. Interactions of Surfactants with Polymer and Proteins. CRC Press, Boca Raton, FL. 1993. 448 p.

37. Kartsev V. Thermodynamic stability of microemulsion based on sodium dodecyl sulfate / V. Kartsev, S. Shtykov, I. Bogomolova, I. Ryzhov // J. Molecular Liquids. 2009. V. 145. №3. P. 173-176.

38. Salenting S. Preparation of highly concentrated nanostructured dispersions of controlled size / S. Salenting, A. Yaghmur, S. Guillot, O. Glatter // J. Colloid Interface Sci. 2008. V. 326. № 1. P. 211-220.

39. Bognolo G. The use of surface-active agents in the preparation and assembly of quantum-sized nanoparticles // Advances in Colloid and Interface Sci. 2003. V. 106. P. 169-181.

40. Capek I. Radical polymerization of polar unsaturated monomers in direct microemulsion systems // Advances in Colloid and Interface Sci. 1999. V. 80. № 2. P. 85-149.

41. Muller M. Modification of a reverse microemulsion with a fluorinated triblock copolymer / M. Muller, B. Stuhn, K. Brusse, J. Kressler // J. Colloid Interface Sci. 2008. V. 335. №2. P. 228-233.

42. Fernandez P. Nano-emulsion formation by emulsion phase inversion / P. Fernandez, V. Andre, J. Rieger, A. Kuhnle // Colloids and Surf. A. 2004. V. 251. № 1. P. 53-58.

43. Bouchama F. On the mechanism of catastrophic phase inversion in emulsions / F. Bouchama, G. Aken, A. Autin, G. Koper // Colloids and Surf. A. 2003. V.231. № 1. P. 11-17.

44. Spernath L. Phase transitions in O/W lauryl acrylate emulsions during phase inversion, studied by light microscopy and cryo-TEM / L. Spernath, O. Regev, Y. Levi-Kalisman, Sh. Magdassi // Colloids and Surf. A. 2009. V. 332. № 1. P. 19-25.

45. Georges J. Microemulsion studies: correlation between viscosity, electrical conductivity and electrochemical and fluorescent probe measurements / J. Georges, J. Chen // Colloid and Polymer Sci. 1986. V. 264. № io. P. 896-902.

46. Graca M. Nanotribology, standart friction and bulk rheology properties compared for a Brij microemulsion / M. Graca, H. Bongaerts, J. Stokes, S. Granick // J. Colloid. Interf. Sci. 2009. V. 333. № 2. P. 628-634.

47. Ruiz-Angel M. Retention mechanisms in micellar liquid chromatography / M. Ruiz-Angel, S. Carda-Broch, J. Torrez-Lapasio, M. Garcia-Alvarez-Couge // J. Chromatogr. A. 2009. V. 1216. № 10. P. 1798-1814.

48. Штыков C.H. Мицеллярная тонкослойная хроматография: особенности и аналитические возможности / С.Н. Штыков, Е.Г. Сумина, Н.В. Тюрина // Рос. хим. ж. 2003. т. XLVIII. № 1. С. 119-126.

49. Ruiz-Angel М. Micellar liquid chromatography: suitable technique for screening analysis / M. Ruiz-Angel, R. Caballero, E. Simo-Alfonso, M. Garcia-Alvarez-Coque // J. Chromatogr. A. 2002. V. 947. № 1. P. 31-45.

50. Mallols J. Determination of Catecholamines in Urine by Micellar Liquid Chromatography with Coulometric Detection / J. Mallols, J. Torres, R. Camafias, G. Ramis-Ramos // Chromatographia. 1994. V. 39. № 9. P. 591-596.

51. Martn-Bioscaa Y. DETERMINATION OF PENTOBARBITAL IN BIOLOGICAL SAMPLES BY MICELLAR LIQUID CHROMATOGRAPHY / Y. Martn-Bioscaa, S. Sagradoa, R. Villanueva-Camaasa, M. Medina-Hernnde // J. Liq. Chromatogr. & Related Technol. 1999. V. 22. № 19. P. 2895 2905.

52. Штыков C.H. Микроокружение и свойства органических реагентов в растворах ПАВ / С.Н. Штыков. Е.Г. Сумина // Журн. аналит. химии. 1997. Т. 52. № 7. С. 697-702.

53. Бурмистрова Н.А. Влияние ПАВ на кислотно-основные и окислительно-восстановительные свойства реагентов ряда дифениламина / Н.А. Бурмистрова, С.П. Муштакова, С.Н. Штыков // Известия РАН. Сер. хим. 2000. Т. 49. № 8. С. 1386-188.

54. Штыков С.H. Свойства пленки Ленгмюра-Блоджетт па основе метилового оранжевого и полиамидокислоты / С.Н. Штыков. Е.В. Паршина / Журн. физич. химии. 1994. Т. 68. № 1.С. 114-118.

55. Штыков С.Н. Таутомерное равновесие сульфопроизводных 4-(фенилазо)-1-нафтолов в мицеллярных растворах неионных ПАВ / С.Н. Штыков, A.B. Окунев, М.И. Сафарова // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 58. № 11. С. 1154-1160.

56. Бурмистрова H.A. Физико-химические и аналитические свойства систем на основе редокс-реагентов ряда дифениламина, модифицированных ПАВ / H.A. Бурмистрова, С.П. Муштакова, С.Н. Штыков // Журн. аналит. химии. 2001. Т. 56. №7. С. 732-738.

57. Штыков С.Н. Кето-енольная таутомерия в растворах поверхностно-активных веществ / С.Н. Штыков, В.Г. Амелин, H. Н. Сорокин, Р.К. Чернова // Журн. физич. химии. 1986. Т. 60. № 2. С. 345-349.

58. Штыков С.Н. Организованные средства как альтернатива традиционным растворителям в химическом анализе / С.Н. Штыков // Известия саратовского университета. 2005. Т. 5. С. 47-52.

59. Штыкова Л.С. Органические реагенты в организованных средах / Л.С. Штыкова, И.В. Богомолова // Межвуз. сб. науч. статей. 2003. С. 128-135.

60. Pithapurwala Y. Solubilization and fluorescence behavior of petroleum sulphate containing microemulsion / Y. Pithapurwala, D. Shah // JAOCS. 1984. V. 61. № 8. P. 1399-1404.

61. Ramos-Lledo P. Determination of vitamins A and E in milk samples by fluorescence in micellar media / P. Ramos-Lledo, V. Soledad, M. Paz San // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. V. 369. № 1. P. 91-95.

62. Куликов А.Ю. Мицеллярная хроматография в фармацевтическом анализе и других областях анализа / А.Ю. Куликов, Л.П. Логинова, Л.В. Самохина // Фармаком. 2004. № 1. С. 22-52.

63. Khaledi М. Micelles as separation media in high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. V. 780. № 1. P. 3-40.

64. McCormick T. The effect of stationary-phase pore size on retention behavior in micellar liquid chromatography / T. McCormick, J. Foley, C. Riley, D. Lloyd // Anal. Chem. 2000. V. 72. № 2. P. 294-301.

65. Dorsey J. Efficiency enhancement in micellar liquid chromatography / J. Dorsey, M. DeEtchegaray, J. Landy// Anal. Chem. 1983. V.55. № 6. P. 924-928.

66. Lopez-Grio S. Effect of a Variety of Organic Additives on Retention and Efficiency in Micellar Liquid Chromatography / S. Lopez-Grio, C. Garcia-Alvarez, W. Hinze, F. Quina, A. Berthod // Anal.Chem. 2000. V. 72. № 20. P. 4826 -4835.

67. Шинода К., Накагава Т., Тамамуси Б., Исемура Т. Коллоидные поверхностноактивные вещества. М.: Мир. 1966. 319 с.

68. Rao I. Micellization behavior in the presence of alcohols / I. Rao, E. Ruckenstein // J. Colloid Interface Sci. 1986. Vol. 113. № 2. P. 375-387.

69. Candau S. Effect of alcohols on the properties of micellar systems : III. Elastic and quasielastic light scattering study / S. Candau, R. Zana // J. Colloid Interface Sci. 1981. Vol. 84. № 1. P. 207-219.

70. Guveli D. Hydrodynamic studies of micellar systems of alkyltrimethylammonium bromides and the effect of added 1-alkanols / D. Guveli, J. Kayes, S. Davis // J. Colloid Interface Sci. 1979. V. 72. № 1. P. 130 139.

71. Gonzalo-Lumbreras R. Method development for corticosteroids and anabolic steroids by micellar liquid chromatography / R. Gonzalo-Lumbreras, R. Izquierdo-Hornillos // J. Chromatogr. B. 2003. V. 794. № 2. P. 215-225.

72. Kulikov A. Influence of various factors on the chromatographic behavior of cytostatic antibiotics of rubomicin derivatives in micellar liquid chromatography / A. Kulikov, L. Loginova, L. Samokhina // Chromatographia. 2003. V. 57. № 7. P. 463469.

73. Bolliet D. Mixture-design approach to retention prediction using the solvation parameter model and ternary solvent systems in liquid chromatography / D. Bolliet, F. Colin // Anal. Comm. 1998. V. 35. № 8. P. 253-256.

74. Nishi R. Pharmaceutical application of micelles in chromatography and electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1997. V. 780. № 2. P. 243-264.

75. Thomas D. Stationary-phase effects on efficiency in micellar liquid chromatography / D. Thomas, J. Foley // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1060. № 2. P. 195203.

76. Schiewe J. Application of capillary zone electrophoresis for analyzing biotin in pharmaceutical formulations—a comparative study / J. Schiewe, S. Gobel, M. Schwarz, R. Neubert // J. Pharm. Biomed. Anal. 1996. V. 14. № 4. P. 435-439.

77. Thomas D. Improved efficiency in micellar liquid chromatography using triethylamine and 1-butanole as mobile phase additives to reduce surfactant adsorbtion / D. Thomas, J. Foley // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1205. № 1. P. 36-45.

78. Boso R. Microemulsion electrokinetic chromatography with different organic modifiers: separation of water- and lipid-soluble vitamins / R. Boso, M. Bellini, I. Miksik, J. Deyl // J. Chromatogr. A. 1995. V. 709. № 1. P. 11-19.

79. Boyce M. Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweeteners permitted as additives in food by mixed micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 1999. V. 847. № 2. P. 369-375.

80. Pant I. The determination of sorbic acid and benzoic acid in a variety of beverages and foods by micellar electrokinetic capillary chromatography / I. Pant, V. Trenerry // Food Chem. 1995. V. 53. № 2. P. 219-226.

81. Ryan R. Microemulsion HPLC / R. Ryan, Sh. Donegan, J. Power, E. McEvoy, K. Altria // LC-GC Europe. 2008. V. 10. P. 502-513.

82. Berthod A. Oil-In-Water Microemulsions as Mobile Phases for Rapid Screening of Illegal Drugs in Sports / A. Berthod, J. Laserna, I. Carretero // J. Liq. Chromatogr. 1992. V. 15. № 17. P. 3115-3127.

83. Willhite G. Study of Oil Displacement by Microemulsion Systems Mechanisms and Phase Behavior / G. Willhite, D. Green, D. Okoye, M. Looney // SPE Journal. 1980. V. 20. № 6. P. 459-472.

84. Spernath A. Microemulsion as carriers for drugs and nutraceuticals / A. Spernath, A. Aserin // Advances in colloid and interface science. 2006. V. 128. P. 47-64.

85. Marsh A. Oil-in-water microemulsion high performance liquid chromatographic analysis of pharmaceuticals / A. Marsh, B. Clark, K. Altria // Chromatographia. 2004. V. 59. № 10. P. 531-542.

86. Malenovic A. Microemulsion liquid chromatographic screening of simvastatin and its active metabolite in human plasma / A. Malenovic, B. Janic-Stojanovic, M. Medenica, D. Ivanovic // Acta Chromatographica. 2008. V. 20. № 4. P. 595-607.

87. El-Sherbiny D. Simultaneous determination of loratadine and desloratadine in pharmaceutical preparations using liquid chromatography with a microemulsion as eluent

88. El-Sherbiny D„ El-Eanay N., Belal F., Hansen S. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2007. V. 43. №4. P. 1236-1242.

89. Sherbiny M. Evaluation of the use of microemulsions as eluents in highperformance liquid chromatography / M. Sherbiny, S. El-Ashry // J. Sep Sci. 2003. V. 26. № 6. P. 503-509.

90. Jancic B. Microemulsion liquid chromatographic method for characterisation of fosinopril sodium and fosinoprilat separation with chemometrical support / B. Jancic, M. Medenica, D. Ivanovic // Anal. Bioanal. Chem. 2005. V. 383. № 4. P. 687-694.

91. Janic B. Development of liquid chromatographic method for fosinoprilat determination in human plasma using microemulsion as an eluent / B. Janic, D. Ivanovic, M. Medenica, A. Malenovic, N. Dimkovic // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1088. № 2. P. 187-192.

92. Lawrence D. Microemulsion-based media as novel drug delivery systems / D. Lawrence, G. Rees // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. V. 45. № 1. P. 89-93.

93. Pretorius V. Open-pore silica foams: A new support for chromatography / V. Pretorius, J. Davidtz, D. Desty // J High. Resolut. Chromatogr. 1979. V. 2. № 9. P.583-584.

94. Ballesta J. Analysis of parabens in cosmetics by low pressure liquid chromatography with monolithic column and chemiluminescent detection / J. Ballesta, M. Valencia, L. Capitán-Vallvey // Talanta. 2009. V. 79. № 2. P. 499-506.

95. Malenovic A. Retention modeling in liquid chromatographic separation of simvastatin and six impurities using microemulsion as an eluent / A. Malenovic, D. Ivanovic, M. Medenica // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. № 13. P. 1087-1092.

96. Altria K. High-performance liquid chromatographic analysis of pharmaceuticals using oil-in-water microemulsion eluent and monolithic column / K. Altria, A. Marsh, B. Clark// Chromatographia. 2006. V. 63. № 7. P. 309-314.

97. McEvoy E. Application of MEECK and MELC for the analysis of paracetamol and related impurities in suppositories / E. McEvoy, Sh. Donegan, J. Power, K. Altria // Chromatographia. 2008. V. 68. № 1. P. 49-56.

98. Marsh A. Oil-in-water microemulsion LC determination of pharmaceuticals using gradient elution / A. Marsh, B. Clark, K. Altria // Chromatographia. 2005. V. 61. № 11. P. 539-547.

99. Marsh A. A review of the background, operating parameters and applications of microemulsion liquid chromatography (MELC) / A. Marsh, B. Clark, K. Altria // J. Sep. Sci. 2005. V. 28. № 15. P. 2023-2032.

100. Liu J. Predicting blood-brain barrier penetration of drugs by microemulsion liquid chromatography with corrected retention factor / J. Liu, J. Sun, X. Sui, Y. Wang, Y. Hou, Zh. He//J. Chromatogr. A. 2008. V. 1198.№ l.P. 164-172.

101. Altria K. Preliminary study on the use of water-in-oil microemulsion eluents in HPLC / K. Altria, M. Broderick, S. Donegan, J. Power // Chromatographia. 2005. V. 62. № 7. P. 341-348.

102. Ozaki H. On-line micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry with a high-molecular-mass surfactant / H. Ozaki, S. Terabe // J. Chromatogr. A. 1998. V. 794. №2. P. 317-325.

103. Shamsi S. Micellar Electrokinetic Chromatography-Mass Spectrometry Using a Polymerized Chiral Surfactant//Anal. Chem. 2001. V. 73. № 21. P. 5103-5108.

104. Lamoree M. On-line coupling of micellar electrokinetic chromatography to electrospray mass spectrometry / M. Lamoree, U. Tjaden, J. Van der Greef // J. Chromatogr. A. 1995. V. 712. № 1. P. 219-225.

105. Takada Y. On-line combination of micellar electrokinetic chromatography and mass spectrometry using an electrospray-chemical ionization interface / Y. Takada, M. Sakairi, H. Koizumi // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1995. V. 9. № 6. P. 488-490.

106. Nelson W. On-line partial filling micelllar electrokinetic chromatography-electrospray ionization mass spectrometry / W. Nelson, Q. Tang, A. Harrata, C. Lee // J. Chromatogr. A. 1996. V. 749. № 2. P. 219-226.

107. Muijselaar P. On-line coupling of partial-filling micellar electrokinetic chromatography with mass spectrometry / P. Muijselaar, K. Otsuka, S. Terabe // J. Chromatogr. A. 1998. V. 802. № 1. P. 3-15.

108. Quirino J. Neutral analyte focusing by micelle collapse in partial-filling MEKC with UV and ESI-MS detection / J. Quirino, P. Haddad // Electrophoresis. 2009. V. 30. № 10. P. 1670-1674.

109. Mol R. Micellar electrokinetic chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for the identification of drug impurities / R. Mol, E. Kragt, I. Jimidar, G. De Jong, G. Somsen // J. Chromatogr. B. 2006. V. 843. № 2. P. 283-288.

110. Yang L. On-Line Micellar Electrokinetic Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry Using Anodically Migrating Micelles / L. Yang, A. Harrata, C. Lee//Anal. Chem. 1997. V. 69. № 10. P. 1820-1831.

111. Mol R., De Jong G., Somsen G. Atmospheric Pressure Photoionization for Enhanced Compatibility in On-Line Micellar Electrokinetic Chromatography-Mass Spectrometry / R. Mol, G. De Jong, G. Somsen // Anal. Chem. 2005. V.77. № 16. P. 5277-5282.

112. Somsen G. Micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry: combining the supposedly incompatible / G. Somsen, R. Mol, G. De Jong // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V. 384. № l. P. 31-40.

113. Himmelsbach M. Microemulsion Electrokinetic Chromatography with On-Line Atmospheric Pressure Photoionization Mass Spectrometric Detection / M. Himmelsbach, M. Haunschmidt, W. Buchberger, C. Klampfl // Anal. Chem. 2007. V. 79. № 4. P. 15641568.

114. Veuthey J. Capillary electrophoresis in pharmaceutical and biomedical analysis // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2005. V. 381. № 1. P. 93-95.

115. McClements D. Emulsion-Based Delivery Systems for lipophilic bioactive components / D. McClements, E. Decker, J. Weiss // Journal of food Science 2007. V. 72. № 8. P. 20-36.

116. Van Biessen G. Ammonium perfluorooctanoate as a volatile surfactant for the analysis of N-methylcarbamates by MEKC-ESI-MS / G. Van Biessen, Ch. Bottaro // Electrophoresis. 2006. V. 27. № 22. P. 4456-4468.

117. Peng Ch. Formation of perfluoroearbon microemulsion by fluorinated polyethylene glycol / Ch. Peng, F. Huang // J. Dispersion science and Technology. 2008. V. 29. № l.P. 46-51.

118. Kantarci G. Comparison of different Water/Oil microemulsions containing diclofenac sodium: preparation, characterization, release rate and skin irritation studies /

119. G. Kantarci, I. Ozguney, H. Karasulu, S. Arzik, T. Guneri // AAPS Pharm. Sci. Tech. 2007. V. 8. №4. P. 1-7.

120. Rogers S. Fluorocarbon-hydrocarbon incompatibility in micellar polymerizations / S. Rogers, J. Eastoe, L. Hudson, S. Gold, R. Heenan, I. Grillo // J. Colloid Interface Science. 2009. V. 320. № 2. P. 437-442.

121. Nasseri A. Lecitin-Stabilized microemulsions based organogels for topical application of ketorolac tromethamine. In vitro release study / A. Nasseri, R. Aboofazeli,

122. H. Zia, T. Needham // Iranian Journal of pharmaceutical research. 2003. V. 2. P. 117-123.

123. Debbabi K. Reverse water-in-fluorocarbon microemulsions stabilized by new polyhydroxylated nonionic fluorinated surfactants. / K. Debbabi, F. Guittard, J. Eastoe, S. Rogers, S. Geribaldi // Langmuir. 2009 V. 25. № 16. P. 8919-8926.

124. Nostra P. Fluorinated Microemulsions: A Study of the Phase Behavior and Structure / P. Nostra, Ch. Sung-Min, K. Chwen-Yuan, Ch. Sow-Hsin // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. № 25. P. 5347-5352.

125. Tondrel C. Kinetics of phase transformations in a fluorinated micro-emulsion system / C. Tondrel, C. Burger-Guerrisi // Dispersed Systems. 1988. V. 177. P. 120-122.

126. Larson R. The structure and reology of complex fluids. Oxford University press, New York. 1999. 688 p.

127. Дейнека В.И. Метиленовая селективность в условиях обращенно-фазовой хроматографии одного ряда гомологов // Сорбционные и хроматографическис процессы. 2007. Т. 7. № 2. С. 236-243.