Исследование ацилирования и фосфорилирования дигидрокверцетина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

КРЫМЧАК Марина Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ АЦИЛИРОВАНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА

Специальность 02.00.03 - органическая химия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ДПР 2012

Москва - 2012

005020242

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Московского педагогического государственного университета

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор НИФАНТЬЕВ Эдуард Евгеньевич

Официальные оппоненты:

ОФИЦЕРОВ Евгений Николаевич доктор химических наук, профессор кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева

АНТИПИН Роман Львович кандидат химических наук, ассистент кафедры органической химии Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Ведущая организация - Российский университет дружбы народов

Защита состоится 14 мая 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 212.154.25 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 119021, Москва, Несвижский пер., 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МПГУ по адресу: 119991, Москва, ул. Малая Пироговская, д.1, стр. 1.

Автореферат разослан «?тГ».

2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

£

ПУГАШОВА Нина Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Направленный синтез новых биологически активных веществ, сочетающих в себе высокую эффективность и низкую токсичность, является одним из приоритетных направлений современной органической химии. В связи с этим большой интерес представляют флавоноиды: на их основе можно получать лекарственные средства с комплексом ценных свойств для лечения и профилактики различных заболеваний.

Среди этой группы природных соединений следует отметить дигидрокверцетин, проявляющий особенно высокую антиоксидантную активность среди флавоноидов, который при этом является малотоксичным веществом и не обладает мутагенным свойством. Одними из наиболее удобных способов его модификации являются ацилирование и фосфорилирование.

В литературе широко описаны примеры модификации флавоноидов с использованием производных карбоновых и элементоорганических кислот. Но, к сожалению, во многих работах авторами не приведены убедительные доказательства строения синтезированных ими соединений.

Цель работы. Целью настоящей работы является получение сложных эфиров на основе дигидрокверцетина ацилированием хлорангидридами фармакологически важных карбоновых кислот; изучение особенностей фосфорилирования незащищенного дигидрокверцетина реагентами трех- и пятивалентного фосфора и установление взаимосвязи структуры полученных соединений с их цитотоксической и антиоксидантной активностью.

Научная новизна работы. В работе впервые изучено взаимодействие незащищенного дигидрокверцетина с хлорангидридами карбоновых кислот различного строения; в результате проведенных экспериментов определены оптимальные условия и впервые получен ряд 7-фосфорилированных дигидрокверцетинов действием производных фосфористой, фосфорной и фосфинистой кислот и показано, что строение фосфорилирующих реагентов существенно влияет на региоселективность реакции; найдено, что при гидролизе циклофосфорилированных дигидрокверцетинов образуются соединения, имеющие пространственно затрудненные гидроксильные группы; впервые получены производные дигидрокверцетина, содержащие в своей структуре гидрофосфорильную группу; проведены фармакологические исследования ряда вновь синтезированных соединений дигидрокверцетина и установлены факторы, определяющие их цитотоксические и антиоксидантные свойства.

Практическая значимость. Впервые синтезирован ряд неизвестных ранее производных на основе биологически активного, нетоксичного и относительно доступного флавоноида дигидрокверцетина. Проведен первичный скрининг наличия биологической активности у полученных соединений: исследовано их цитотоксическое и антиоксидантное действие. Найдено, что некоторые из синтезированных веществ могут являться перспективными лекарственными средствами.

Публикации и апробация. По теме диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК. Результаты работы были представлены

и обсуждались на Первом кластере конференций СЬепМазгеСЬет, Конференцш "Химия и полная переработка биомассы леса" (Санкт-Петербург, 2010); Ш Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химическои технологии растительного сырья" (Барнаул, 2007); Всероссийской конференции по органической химии, посвященной 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН (Москва, 2009); ^ XV Международной конференции по химии соединений фосфора, посвященной 100-летию со дня рождения М.И.Кабачника (Санкт-Петербург, 2008); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011).

Диссертационное исследование проводилось на кафедре органической химии химического факультета МПГУ с 2007 по 2011 гг. Работа выполнена при финансовом содействии программы Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ РФ (грант НШ-582.2008.3).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 3 рисунка. Список цитируемой литературы включает 99 наименований.

В обзоре литературы, приведенном в первой главе кратко реферированы литературные источники по методам синтеза ацильных, серо- и фосфорсодержащих производных флавоноидов, а также работы по сшшлированию флавоноидов, использующемся для защиты некоторых гидроксильных групп в молекулах этих соединений. Во второй главе представлены результаты собственных исследований, посвященные особенностям ацилирования и фосфорилирования незащищенного дигидрокверцетина и изучению биологической активности полученных соединений. В третьей главе представлены экспериментальные результаты проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Сведения, посвященные систематическому исследованию химических свойств флавоноидов, в литературе носят отрывочный характер. При этом практически отсутствуют данные о биологической активности полученных соединений. В связи с этим актуальной задачей является дальнейшее целенаправленное изучение модификации данного класса природных веществ, в частности, флавоноида дигидрокверцетина.

Следует отметить, что модификация дигидрокверцетина имеет ряд особенностей, связанных с наличием в молекуле прочных внутримолекулярных водородных связей, которые приводят к различной реакционной способности гидроксильных групп молекулы: 7>4'>3'>5>3.

I. Синтез сложных эфиров дигидрокверцетина действием хлорангидридами карбоновых кислот

Многие биологически активные соединения являются производными карбоновых кислот. Поэтому введение в структуру флавоноидов дополнительных фармакофорных групп является, несомненно, актуальной задачей.

В качестве ацилирующих реагентов были выбраны хлорангидриды бензойной, ацетилсалициловой, никотиновой, п-нитробензойной, фенилуксусной, пальмитиновой и триметилуксусной кислот, которые являются синтетическими предшественниками лекарственных средств.

Взаимодействие эквимолярных количеств дигидрокверцетина и хлорангидрида соответствующей кислоты приводило к образованию смеси продуктов, разделить которые методом колоночной хроматографии оказалось невозможны.

Синтез перацилированных производных дигидрокверцетина проводили при действии небольшого избытка соответствующего хлорангидрида карбоновой

О*- (е); С15н31_ (0; (СН3)3С— (8)

Строение всех вновь полученных соединений доказано методом спектроскопии ЯМР 'н и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа.

П. Синтез фосфорсодержащих дигидрокверцетинов

Исследование реакций фосфорилирования дигидрокверцетина помимо научного интереса имеет и практическое значение, так как в результате взаимодействия образуются новые органические соединения, которые могут обладать потенциальной антиоксидантной, противовоспалительной и цитотоксической активностью.

11.1. Стильная защита гидроксильных групп молекулы флавоноида

В рамках нашего исследования важным и интересным представлялось изучение процессов фосфорилирования дигидрокверцетина с использованием силильной защиты более реакционноспособных гидроксильных групп. В качестве защитных нами были использованы триалкилсилильные группы.

В ходе выполнения работы показано, что при действии на флавоноид триметилхлорсилана (соотношение реагентов 1:1) или гексаметилдисилазана (соотношение реагентов 2:1) образовывалась смесь продуктов реакции, попытки разделения которой методом колоночной хроматографии не увенчались успехом, поскольку триметилсилильные эфиры чрезвычайно чувствительны к силикагелю, что привело к разложению веществ во время их хроматографической очистки.

Персилилирование дигидрокверцетина триметилхлорсиланом проводили при небольшом избытке реагента. Методом спектроскопии ЯМР 'Н установлено образование пентасилилированного производного 3: он

Ън НзЧ + 6 Н3С-£!-С1 Н3С

Ру

(НэРзвГ1

•81(СН3)з

'вЦСВДз

И(СН3)3

(НзОзвГ з

Действием на дигидрокверцетин избытка гексаметилдисилазана при 110°С в отсутствии растворителя также получали пентазамещенное производное 3. При уменьшении температуры проведения процесса до 60°С в аналогичных условиях образовывался тетрасилилированный продукт 4:

но.

НэЦ н ЯНз

НзС-в^-Хг-СНз

НзС СН} (НзРзвГ

.51(СН3Ь

8!(СНз)з

Строение полученных соединений доказано физико-химическимим методами. К сожалению, он неустойчивы и легко гидролизовались влагой воздуха.

Наиболее перспективным для проведения регионаправленного замещения являлся пространственно затрудненный силилирующий реагент - трет-бутилдиметилхлорсилан.

Обработкой дигидрокверцетина эквимолярным количеством данного реагента при охлаждении до 5°С было осуществлено селективное силилирование с образованием производного^»:

НзЯ Н3С-£-Я-С1

н3с СН,

НзС <?НЭ НзС-^-а-!

н3с ¿н3

он

Небольшое повышение температуры проведения процесса способствовало дальнейшему силилированию 4'-ОН группы, что существенно снижало выход целевого продукта.

При увеличении концентрации силилирующего реагента вдвое достаточно легко при комнатной температуре образовывался 7,4'-ди-трет-бутилдиметалсилилдигвдрокверцетин 6:

н3Ц ри3

Продукты 5 и 6 выделяли методом колоночной хроматографии. Соединение 5 представляло собой порошок желтого цвета, соединение 6 - маслообразную жидкость, хорошо растворимую в органических растворителях.

Строение веществ доказано методом спектроскопии -ЯМР 'н, 2951 и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа. В спектрах ЯМР 'Н наблюдали все необходимые сигналы протонов заместителей (в области 0.25-1.00 м,д.) и флавоноидной матрицы.

При использовании данного реагента производные с большей степенью замещения не образовывались, вследствие стерических затруднений.

11.2. Фосфорилирование реагентами трехвалентного фосфора П.2.1. Фосфорилирование хлорангидридами Фосфористой кислоты

Изучено взаимодействие свободного дигидрокверцетина с доступными диалкоксихлорфосфитами различного строения.

Фосфорилирование дигидрокверцетина проводили при эквимолярном соотношении реагентов с использованием триэтиламина в качестве акцептора выделяющегося хлороводорода.

После завершения эксперимента наряду с ожидаемым синглетом в области 115.3 м.д. в спектре ЯМР 31Р реакционной смеси наблюдались еще несколько сигналов с химическими сдвигами в области 114-116 м.д. и различным соотношением интегральных интенсивностей, что свидетельствовало о протекании реакции по нескольким фенольным гидроксильным группам молекулы флавоноида и образовании смеси продуктов фосфорилирования. Охлаждение реакционной смеси до 0°С не влияло на направление реакции. Использование двукратного избытка фосфорилирующего реагента, либо повышение температуры процесса до 20°С приводило к появлению в спектре ЯМР 31Р реакционной смеси еще одного сигнала с химическим сдвигом 122.2 м.д., что свидетельствовало о фосфорилировании еще и спиртового гадроксила молекулы флавоноида.

Синтезы перфосфорилированных производных дигидрокверцетина с

участием диалкоксихлорфосфитов проводили при соотношении реагентов 1:5. В спектрах ЯМР 31Р соответствующих реакционных смесей снова наблюдали набор сигналов с различным соотношением интегральных интенсивностей, что свидетельствовало об образовании смеси производных, разделить которую после сульфуризации методом колоночной хроматографии оказалось невозможным.

Таким образом, установлено, что функционализация свободного дигидрокверцетина хлорангидридами фосфористой кислоты является сложной в экспериментальном отношении задачей, приводящей к образованию продуктов сложного строения с неселективно замещенными фенольными и спиртовыми гидроксильными группами.

П.2.2. Фосфорилирование дигидрокверпетина амидами фосфористой

кислоты

А) Фосфорилирование триамидами фосфористой кислота

При использовании гексаметшггриамида фосфористой кислоты (соотношение реагентов 1:1) в спектре ЯМР 31Р реакционной смеси наблюдали несколько синглетов с химическими сдвигами в области 149-151 и 133 - 134 м.д. Согласно этим данным фосфорилирование проходило неселективно по нескольким гидроксилам.

Процессы фосфорилирования дигидрокверцетина менее активными гексаэтилтриамидом и трипиперидидом фосфористой кислоты также проводили при эквимолярном соотношении реагентов. После окончания реакции в фосфорном спектре соответствующей реакционной смеси помимо синглетов 7-замещенных дигидрокверцетинов с соответствующими химическими сдвигами (132.3 м.д. (7а) и 126.9 м.д. (7Ь)), наблюдали синглеты либо в области 147-149 м.д., либо в области 150-152 м.д. Эти сигналы, исходя из справочных данных, могут соответствовать как сигналу от атома фосфора в циклическом фрагменте, так и моноамиду фосфористой кислоты.

Присутствие моноамидоэфиров фосфористой кислоты на основе дигидрокверцетина можно объяснить тем, что образующиеся в первый момент реакции диамидофосфиты сами являлись активными фосфорилирующими агентами и, в свою очередь, атаковали свободный и наиболее активный гидроксил молекулы незащищенного дигидрокверцетина в положении 7 с образованием соединений 8а и 8Ь, соответственно.

И хотя их присутствие носило следовой характер, они имели схожие

.он

он

физико-химические характеристики с целевыми соединениями, что серьезно затрудняло выделение и существенно снижало выход последних.

Для дополнительного подтверждения структуры моноамидоэфиров фосфористой кислоты 8а-Ь был проведен синтез этих соединений с использованием двух эквивалентов дигидрокверцетина и одного эквивалента соответствующего триамида фосфористой кислоты.

После сульфуризации соединения 9а и 9Ь были выделены методом колоночной хроматографии, их строение доказано методом спектроскопии ЯМР Н и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа и масс-спектрометрии МАЪИ-ТОР.

Провести взаимодействие с образованием только 7-фосфорилированных производных удалось только при охлаждении до 10°С и сильном разбавлении реакционной смеси. После окисления серой (селеном) соединения Юа-Ь и Иа-Ь были выделены методом колоночной хроматографии и их строение доказано физико-химическими методами.

10а-Ь: Ж-в; Иа-Ь:

Обработка силильного производного 5 соответствующим триамидом фосфористой кислоты сопровождалась десилилированием с образованием соединений 7а-Ь:

Очевидно, это происходило из-за наличия прочной внутримолекулярной связи между атомами водорода гидроксильных и карбонильной групп молекулы флавоноида.

Б) Фосфорилирование диамидоэфирами фосфористой кислоты

Были подобраны оптимальные условия для более эффективного проведения фосфорилирования дигидрокверцетина тетраэтил-, тетрабутил- и тетраизопропилдиамидоэтилфосфитами.

13а-с: Z=S;

14а-с: Z=Se

Синтезы проводили при комнатной температуре в течение двух часов и сильном разбавлении реакционной смеси (СдГк 0.01М). В спектре ЯМР 31Р соответствующей реакционной смеси наблюдали синглеты с химическими сдвигами 144.9 м.д. (12а), 146.4 м.д. (12Ь) и 145.3 м.д. (12с).

Образующиеся производные трехвалентного фосфора на основе дигидрокверцетина 12 а-с без выделения из реакционной смеси переводили в соответствующие тион- и селенонфосфаты 13 а-с и 14 а-с выделяли методом колоночной хроматографии. Их состав и строение подтверждены физико-химическими методами.

В) Фосфорилирование моноамидодиэфирами фосфористой кислоты

Выдерживанием смеси дигидрокверцетина и эквимолярного количества неопентилендиэтиламидофосфита при 40°С в течение 7 часов было получено соединение 15. В спектре ЯМР 31Р наблюдали синглет с химическим сдвигом 115.4 м.д.

16а: ¡И;

1бЬ: г-5е

Подобраны оптимальные условия фосфорилирования дигидроквердетина другими моноамидодиэфирами фосфористой кислоты. Взаимодействие дигидроквердетина с К-метил,№фенилнеопентилен- и Ы-метил^-фенилдиэтиламидофосфитами проводили при эквимолярном соотношении реагентов и нагревании до 50°С в течение 9 часов.

18:

После окисления строение образовавшихся тион- и селенонфосфатов 16а и 18 доказано методом спектроскопии ЯМР 'Н, а состав подтвержден данными элементного анализа.

Н.2.3. Синтез пиклофосфатов на основе дигидроквердетина и реакции раскрытия диоксафосфоланового никла

Изучение этих процессов необходимо проводить с использованием защиты более активного 7-го гидроксила. Из анализа литературных данных и проведенных экспериментов следовало, что единственно устойчивыми соединениями в условиях циклофосфорилирования являлись 7-0-фосфорилированные

производные дигидрокверцетина.

Установлено, что синтезы с участием эквимолярных количеств алкоксидихлорфосфитов протекали неселективно. Но при применении дихлордиалкиламидофосфитов в аналогичных условиях образовывались производные дигидрокверцетина, содержащие фосфолановый цикл.

В спектре ЯМР 31Р соответствующей реакционной смеси наблюдали всего два синглета с химическими сдвигами 144 и 151 м.д. (соединение 19а) и 144 и 147

Фосфорилирование диамидофосфитов дигидрокверцетина 7а-Ь (без выделения из реакционной смеси) вторым эквивалентом соответствующего триамида фосфористой кислоты также позволило получить циклофосфорилированные продукты.

22a-b: Z=S; 23a-b: Z=Sc; 24а: Z=0

При этом в спектре ЯМР 31Р наблюдали появление новых синглетов с химическими сдвигами 152.1 м.д. (21 а) и 147.8 м.д. (21 Ь).

После окисления строение выделенных соединений 22-24а и 22-23Ь подтверждено физико-химическими методами.

С целью изучения реакций, сопровождающихся раскрытием фосфоланового

цикла, был осуществлен гидролиз соединений 22а-24а эвимолярным количеством воды.

22а: Х= в; 23а: Х= ве; 24а: Х-О

25а: Х= в; 25Ь:Х=8;

26а: Х= ве; 26Ь:Х=ве;

27а: Х=0 27Ь: Х=0

Строение продуктов реакции, выпавших в осадок, доказано методом спектроскопии ЯМР на ядрах и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа.

В спектрах ЯМР 'Н присутствовали синглеты протонов гидроксильных групп в положениях 3' и 4' с общей величиной интегральной интенсивности, соответствующей одному протону, что свидетельствовало об образовании двух структурных изомеров. Физико-химические характеристики этих веществ практически идентичны, поэтому разделить их, к сожалению, оказалось невозможным.

II. 3. Фосфорилирование реагентами пятивалентного фосфора

Как показали многочисленные эксперименты, получение фосфатов дигидрокверцетина путем окисления трехвалентных производных данного флавоноида с хорошими выходами являлось трудноосуществимой задачей, поэтому мы исследовали фосфорилирование свободного полифенола непосредственно хлорангидридами кислот пятивалентного фосфора.

При обработке дигидрокверцетина в течение 48-96 часов соответствующим хлорангидридом фосфорной кислоты получались производные 28а-с:

28 Ь: Н=СгН5;

28 с: Я- ^

В спектрах ЯМР 31Р соответствующей реакционной смеси наблюдали синтлеты с химическими сдвигами -9.4 м.д., -12.6 м.д. и -20 м.д., соответственно.

Увеличение температуры проведения процесса приводило к накоплению побочных продуктов. Однако использование микроволнового излучения позволило сократить время реакции до 3-4 часов, практически на влияя на выход продукта.

Взаимодействие дигидрокверцетина с хлорангидридом дифенилфосфонистой кислоты проводили в течение 6 часов при соотношении

Строение синтезированных производных 28а-с и 29 было доказано методом спектроскопии ЯМР на ядрах Н и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа.

11.4. Получение гидрофосфоршьных производных дигидрокверцетина

Гидрофосфорильные соединения могут использоваться в качестве полупродуктов для синтеза производных кислот пятивалентного фосфора, представляющих интерес как аналоги природных биологически активных соединений. Это побудило нас исследовать возможность синтеза гидрофосфорильных соединений на основе дигидрокверцетина.

Синтез кислых фосфитов возможно осуществить двумя путями. Первое направление заключается в фосфорилировании дигидрокверцетина тетраалкилдиамидами фосфористой кислоты, изначально содержащим в своей структуре гидрофосфорильную группу; второе - в фосфорилировании субстрата производными фосфористой кислоты с последующим гидролизом полученных соединений.

При проведении реакции по первому направлению флавоноид вводили в реакцию с эквимолярным количеством тетраэтилдиамида фосфористой кислоты.

По окончании процесса в спектре ЯМР 31Р реакционной смеси присутствовал дублет с химическим сдвигом 19.6 м.д. ('Урн 572.1 Гц). К сожалению, продукт реакции, выпавший в осадок, склонен к гидролизу влагой воздуха.

Второе направление синтеза гидрофосфорильных производных заключалось в гидролизе соединений 12а-с без выделения последних из реакционной смеси эквимолярным количеством воды.

£^N 0.

лсГ

12а-с

31»: И=Е1; 31Ъ: Л=/-Рг; 31с: К=Ва

В спектре ЯМР 31Р реакционной смеси регистрировали дублеты с химическими сдвигами 2.89 м.д., 647 Гц, (31а), 2.14 м.д., 'УРн 619.6 Гц, (31Ь) и 1.39 м.д., 'У рц 589.6 Гц, (31с). Строение всех вновь полученных фосфитов доказано методом спектроскопии ЯМР на ядрах *Н и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа.

Таким образом, впервые, показана возможность получения производных флавоноидов, содержащих в своем составе гидрофосфорильную группу. При этом продукты реакций получены с удовлетворительными выходами.

Дополнительно исследовали химические свойства полученных кислых фосфитов дигидрокверцетина. Были проведены хорошо известные реакции -Пудовика, Абрамова, Кабачника-Филдса. Методом ЯМР 31Р установлено наличие в реакционной смеси исходных соединений.

Вероятно, низкая реакционная способность кислых фосфитов являлась следствием наличия объемного заместителя ароматической природы около атома фосфора, что приводило к дополнительной делокализации электронной плотности и вследствие этого к большей стабилизации молекулы.

Также можно предположить, что связь фосфор-углерод очень неустойчива и её расщепление шло настолько легко, что теплота, выделяющаяся при реакции образования их, совершала и обратный процесс.

Ш. Биологическая активность модифицированных

дигидрокверцетинов

На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета (г.Москва) изучали влияние пентабензоата 2а, пента-п-нитробензоата 2d, пентаацетилсалицилата 2Ь и пентаникотината 2с дигидрокверцетина на жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток на культуре фибропластов кожи новорожденных крысят и культуре клеток MCF-7 (рак молочной железы человека). Показано наличие зависимости цитотоксического эффекта от концентрации исследуемого соединения и его химического строения. Наибольшей активностью обладали пента-О-п-нитробензоат, пентаацетилсалицилат и пентаникотинат дигидрокверцетина. Наиболее выраженное цитостатическое действие в концентрации 1 мг/мл проявлял пентаникотинат дигидрокверцетина.

Для изучения антиоксидатной активности производных использовали метод хемшпоминесценции на модели гомогената мозга крысы. Установлено, что наибольшей ингибирующей активностью обладал пентаникотинат дигидрокверцетина, который уменьшал амплитуду медленной вспышки на 60%. Установлено, что определяющим для антиоксидантной активности фактором в структуре фенолов являлось строение О-ацильных радикалов, а также характер пара-заместителя. Введение в пара-положение пространственно затрудненных фенолов электронодонорных заместителей увеличивало их антиоксидантную активность, в то время как введение электроноакцепторных заместителей -уменьшало.

В РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (г. Москва) проведен анализ цитотоксического эффекта ряда фосфорсодержащих производных дигидрокверцетина: 7-неопентилентионфосфата 1ба, 7-неопентилен-селенонфосфата 16Ь, 7-диэтиламидоэтилтионфосфат 13а, 7-диэтиламидо-этилселенонфосфата 14а, 7-тетраэтилдиамидотионфосфата 10а, 7-тетра-этилдиамидоселенонфосфата 11а, 7-дипиперидилгионфосфата 10Ь, 7-дипипе-ридилселенонфосфата lib, 7-неопентиленфосфата 28с, 7-дифенилфосфината 29 и 7-этилфосфита 31а дигидрокверцетина.

Активность по отношению к клеткам рака яичников (CaOv) и Т-лимфомы (Jurkat) человека проявили тионфосфаты, содержащие в своем составе связь P-N; цитотоксическое действие селенонфосфатов аналогичного строения немного меньше (при этом их HKi0 гораздо выше), либо вообще отсутствует. При замене атомов азота, серы (селена) на атомы кислорода, а также атомов азота на атомы углерода, цитотоксическая активность соединений, к сожалению, не проявлялась.

При изучении противоопухолевой активности 7-

тетраэтилдиамидоэтилтионфосфата дигидрокверцетина установлено, что это вещество является новым оригинальным соединением с противоопухолевым эффектом по отношению к некоторым перевиваемым солидным опухолям мышей при низкой токсичности, а также обладает антиметастатическим действием.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые изучены процессы ацилирования и фосфорилирования незащищенного дигидрокверцетина производными карбоновых кислот и кислот трех- и пятивалентного фосфора.

2. Подобраны оптимальные условия регионаправленного фосфорилирования дигидрокверцетина по положению 7 молекулы флавоноида.

3. Установлено, что единственно устойчивыми в реакциях циклофосфорилирования являются 7-фосфорилированные производные дигидрокверцетина

4. При гидролизе циклофосфорилированных дигидрокверцнтинов образуются оригинальные тиофосфатные системы, представляющие интерес для регулирования свободнорадикальных процессов.

5. Впервые получены гидрофосфорильные производные дигидрокверцетина.

6. Изучена цитотоксическая активность ряда полученных в работе моно- и перзамещенных производных дигидрокверцетина. Показано, что тион- и селенонфосфаты дигидрокверцетина, содержащие в своей структуре P-N связь, обладают ингибирующим действием на процесс деления злокачественных клеток.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. М.С. Крымчак, Э.Е. Нифантьев, Т.С. Кухарева, Л.К. Васянина, М.В.Турбина / Дигидрокверцетин в реакциях с гексаэтилтриамидом фосфористой кислоты // Журнал общей химии. 2010. Т.80. Вып.З. Стр. 398-402.0,58 п.л., авторских 25%.

2. М.С.Крымчак, Э.Е.Нифантьев, М.П.Коротеев, А.М.Коротеев, Т.СКухарева / Полное ацилирование дигидрокверцетина // Журнал общей химии. 2011. Т.81. Вып.1. Стр 106-109. 0,46 п.л., авторских 20%.

3. М.С.Крымчак, Э.Е. Нифантьев, Т.С. Кухарева, Л.К. Васянина Фосфаты, фосфинат и гидрофосфорнльное соединение флавоноида дигидрокверцетина //Доклады РАН. 2011. Т.441. №2. С. 201-204.0,46 п.л., авторский вклад не распределен

4. М.С.Крымчак, Т.С.Кухарева, М.П.Коротеев, А.М.Коротеев, Е.С.Ганушевич, Э.Е.Нифантьев / Исследование ацилирования дигидрокверцетина // Первый кластер конференций СЬет\Уаз1еСЬет, Конференция "Химия и полная переработка биомассы леса", Санкт-Петербург, 14-18 июня 2010 г. С. 153-154. 0,07 п.л.,. авторский вклад не распределен.

5. М.Крымчак, Т.С.Кухарева, Ю.Князькова, В.Карасева, Э.Е.Нифантьев / Некоторые представители модифицированного дигидрокверцетина, обладающие биологической активностью II Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы Ш Всероссийской

конференции. 23-27 апреля 2007 г.: в 3 кн / под ред. Н.Г.Базарновой, В.И.Маркина. Барнаул: Изд-во Алтайского ун-та, 2007. - кн.2. С.346-347. 0,06 п.л., авторский вклад не распределен.

6. М.С.Крымчак, Э.Е.Нифантьев, М.П.Коротеев, Г.З.Казиев, Т.С.Кухарева, А.М.Коротеев / Прогресс в химии флавоноида дигидрокверцетина // «Сборник тезисов докладов Всероссийской конференции по органической химии», посвященной 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН (25-30 октября 2009г.) - М.: 2009. С.61.0,11 п.л., авторский вклад не распределен.

7. Крымчак М.С., Князькова ЮЛ., Кухарева Т.С., Коротеев М.П., Нифангьев Э.Е. / Особенности селективного фосфорилирования дигидрокверцетина // Сборник тезисов XV Международной конференции по химии соединений фосфора, посвященной 100-летию со дня рождения М.И.Кабачника -ICCPC-XV, Санкт-Петербург, 25-30 мая 2008 г. Изд-во «Теза», 2008. С.374. 0,11 п.л., авторский вклад не распределен.

8. Крымчак М.С., Кухарева Т.С., Нифантьев Э.Е. / Исследование селективного ацилирования дигидрокверцетина II XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. В 4 т. Т.1: тез. докл. - Волгоград: ИУНЛ ВолгГТУ, 2011. С. 257.0,06 пл., авторский вклад не распределен.

Подп. к печ. 13.03.2012 Объем 1 п.л. Зак. № 73 Тир. 100 экз.

Типография МПГУ

61 12-2/415

МОСКОВСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КРЫМЧАК Марина Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ АЦИЛИРОВАНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА

Специальность 02.00.03 - органическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

Москва 2012

чл.-корр. РАН, д.х.н., профессор

Нифантьев Э.Е. /

Содержание:

I. Введение.................................................................................3

II. Модификация флавоноидов с использованием производных карбоновых и элементоорганических кислот (Литературный обзор).....................................................................................5

И. 1. Триалкилсилильные защиты гидроксильных групп молекул флавоноидов..............................................................................6

11.2. Ацилирование флавоноидов.....................................................9

11.3. Получение серосодержащих флавоноидов..................................25

11.4. Получение фосфорсодержащих флавоноидов..............................29

III. Исследование ацилирования и фосфорилирования дигидрокверцетина (Обсуждение результатов).............................42

III. 1. Синтез сложных эфиров дигидрокверцетина действием хлорангидридами карбоновых кислот...............................................43

111.2. Синтез фосфорсодержащих дигидрокверцетинов.........................47

III. 2.1. Стильная защита гидроксильных групп молекулы

флавоноида........................................................................47

III.2.2. Фосфорилированиереагентами трехвалентного фосфора...52 III. 2.3. Фосфорилирование реагентами пятивалентного

фосфора...................................................................................................68

III.2.4. Получение гидрофосфорильных производных дигидрокверцетина..............................................................71

111.3. Биологическая активность модифицированных

дигидрокверцетинов............................................................78

IV. Экспериментальная часть.........................................................86

V. Выводы...............................................................................117

VI. Список литературы...............................................................118

I. Введение

Флавоноиды находят самое широкое применение в различных областях химии и медицины. Повышенный интерес к флавоноидам обусловлен, в первую очередь, их высокой антиоксидантной активностью. Среди других достоинств флавоноидов следует отметить их нетоксичность, биоразлагаемость и относительную доступность.

Из-за особенностей строения флавоноидов их функционализация все еще является трудной в экспериментальном отношении задачей, успешно решенной лишь для отдельных, конкретных случаев.

Данная работа является первым систематическим исследованием, посвященным особенностям синтеза производных флавоноида дигидрокверцетина действием хлорангидридами карбоновых кислот различного строения, производными кислот трех- и пятивалентного фосфора.

Целью настоящей работы являлось получение сложных эфиров на основе дигидрокверцетина ацилированием хлорангидридами карбоновых кислот; изучение особенностей фосфорилирования незащищенного дигидрокверцетина реагентами трех- и пятивалентного фосфора и установление взаимосвязи структуры полученных соединений с их цитотоксической и антиоксидантной активностью.

Синтезированные соединения послужили объектами совместного исследования автора работы и сотрудников РГМУ и РОНЦ им. Н.Н.Блохина.

Диссертация изложена в трех главах. В первой главе представлен обзор литературных источников по методам синтеза ацильных, серо- и фосфорсодержащих производных флавоноидов. Также кратко реферированы работы по силилированию флавоноидов, использующемся для защиты некоторых гидроксильных групп. Особое внимание уделено работам, имеющим своей целью синтез и изучение биологической активности полученных соединений.

Вторая глава диссертации посвящена обсуждению результатов взаимодействия дигидрокверцетина с хлорангидридами карбоновых кислот различного строения и изучению фосфорилирования этого флавоноида. В ней рассматриваются особенности этих процессов, строения полученных

31 1

соединений, доказываемого на основании данных спектроскопии ЯМР Р, Ни 13С. В конце второй главы представлены результаты изучения биологической активности синтезированных соединений.

Третья глава содержит описание методик проведения эксперимента и полных спектральных характеристик всех синтезированных соединений, а также данные элементного анализа и, в некоторых случаях, масс-спектрометрии МАЫ)1-Т(Ж

Автор считает приятным долгом поблагодарить своих научных руководителей - чл.-корр. РАН Э.Е.Нифантьева и к.х.н. доц. Т.С.Кухареву за постоянную поддержку и внимание; д.х.н. проф. М.П.Коротеева и к.х.н. доц. А.М.Коротеева за участие и научные консультации; к.х.н. вед.н.с.

1 13

Л.К.Васянину за регистрацию и помощь в интерпретации спектров ЯМР Н, С и31Р.

II. Модификация флавоноидов с использованием производных кароновых и элементоорганических кислот (Литературный обзор)

Термин «флавоноиды» обычно используется для описания большого класса природных соединений, включающих Сб-Сз-Сб углеродный фрагмент. На сегодняшний день выделено и идентифицировано более 6500 флавоноидных соединений [1]. Анализ литературных источников обнаруживает, что накоплен большой фактический материал по их биологической активности и лечебным свойствам. Так, они обладают низкой токсичностью [2-4], проявляют широкий спектр антиоксидантной [5-7], противоаллергической [8,9], антибактериальной [10,11],

противовоспалительной [12-14] и противоопухолевой [15-19] активности, поэтому широко используются в медицине [20,21], пищевой промышленности [22,23] и др.

В то же время имеющийся библиографический материал показывает, что химические свойства флавоноидов практически не изучались. Этим объясняется ограниченное число литературных данных о химических свойствах флавоноидов, в частности, об их ацилировании.

Ацилирование спиртов и фенолов является одним из наиболее распространенных процессов в синтезе лекарственных веществ и витаминов. В организме по мере деацилирования полученных соединений обычно образуются вещества с большей биологической активностью, которые не могут быть введены в организм одномоментно в больших дозах вследствие их токсичности.

В настоящем обзоре обобщены данные о возможности модификации флавоноидов по гидроксильным группам. Обзор разделен на части, которые посвящены методам синтеза их ацильных, серо- и фосфорсодержащих производных.

11.1. Триалкилсилильные защиты гидроксильных групп молекул флавоноидов

В синтезе труднодоступных производных флавоноидов в качестве защитных групп используются трилкилсилильные производные, которые легко вводятся в исходные соединения, а затем легко удаляются из конечных продуктов. Но, к сожалению, в литературе имеются ограниченные сведения о получении этих производных флавоноидов.

Известно, что силилирование природных полифенолов осуществляется только при полном или частичном удалении выделяющегося хлороводорода, а с таким органическим акцептором, как пиридин, достигаются количественные выходы синтезируемых соединений.

Силилирование замещенного 5,7-ди-О-метилапигенина I было проведено корейскими исследователями [24] взаимодействием флавоноида с трет-бутилдиметилсилил- и гарет-бутилдипропилсилилхлоридами в безводном пиридине с добавлением 4-диметиламинопиридина. Путь протекания реакции по гидроксильной группе в положении 3 молекулы был однозначен, поскольку исходное соединение обладает только одной свободной гидроксильной группой:

Образовавшиеся З-О-силил-ди-О-алкилапигенины Ila-b были выделены в

В продолжение обсуждения силилилрования интересной с точки зрения региоселективности синтеза представляется работа по синтезу трет-бутилдиметилсилильных эфиров даидзеина из его моно- и дифенолятов, соответственно [25].

ОМе О

I

ОМе О

II a:R=/-Bu; II b:R=/-Pr

Для получения монофенолята к раствору даидзеина добавили эквимолярное количество 2,6-лутидина. После 15 мин перемешивания в реакционную смесь ввели трет-бутилдиметилсилиловый эфир трифторметансульфоновой кислоты. Процесс полностью завершался за 8 часов:

При получении дифенолята, в котором 4'-гидроксильная группа более нуклеофильна по сравнению с гидроксогруппой в положении 7, смесь флавоноида и избытка трет-бутилата калия выдерживали в течение 2 часов. Затем в реакционную массу добавляли треш-бутилдиметилхлорсилан и выдерживали еще 10 часов:

Соединения V и VI выделены с хорошими выходами методом колоночной хроматографии на силикагеле. Их строение доказано и подтверждено физико-химическими методами.

Однако кажется сомнительным получение соединения VI с удовлетворительным выходом, поскольку трет-бутилдиметилхлорсилан является активным ацилирующим реагентом, а разница в нуклеофильности гидроксильных групп не столь велика, что, по всей видимости, должно приводить к образованию побочных продуктов и снижению выхода целевого продукта реакции.

В исследовании Хенглея и Крамера (1953 год) установлено, что катехин VII реагировал с триметилхлорсиланом в отсутствие растворителя с

образованием частично замещенных производных [26], среди которых

преобладало соединение VIII:

-OH

HCk /<Х / .___ ... --------Me3Si(X

ОН

3Me3SiCl

ОН

08}Ме3

Для сравнения авторы провели этот же процесс с использованием в качестве растворителя смеси пиридина и 1Ч,М-диметилформамида. При этом образовывался 3,5,7,3',4'-пентатриметилсилилфлаван, который представлял собой белые кристаллы.

В этой же работе исследовалось силилирование кверцетина IX, который реагировал с триметилхлорсиланом в дикетоформе только в смеси растворителей пиридин/И,И-диметилформамид с образованием 3,7,3',4'-тетратриметилсилил-3,4-диоксофлавана X. Конечный продукт представлял собой вязкое масло желтого цвета с температурой разложения 490-510 °С.

-он ^^.ОБте*

ЖК /О^ / V______Ме^КХ.

он

4Me3SiCI

РУ

ОН О

Me3SiO

OSiMe3

Однако в качестве доказательства получения этих соединений приведены только данные элементного анализа.

С образованием соединения XII возможно избирательно по 7-ОН группе провести силилирование тре/тг-бутилдиметилхлорсиланом флавоноида нарингенина [27]:

.ОН Л)Н

но

?-BuMe2SiCI ^-BuMe2SiO-

OH О

ОН О

XII

К сожалению, данные, подтверждающие строение образующегося соединения, авторами работы также не приведены.

Суммируя сказанное, отметим, что информация о способах и особенностях получения кремнийсодержащих производных флавоноидов носит отрывочный характер, при этом в некоторых работах нет четкой информации о доказательствах сторения синтезированных веществ. Поэтому проблема силилирования флавоноидов нуждается в дополнительном исследовании.

П.2. Ацилирование флавоноидов

Химическая модификация флавоноидов представляет теоретический и практический интерес, поскольку как исходные соединения, так и полученные на их основе модифицированные производные часто обладают биологической активностью. В практическом отношении среди способов модификации флавоноидов особое место занимает их ацилирование производными карбоновых кислот, прежде всего, из-за относительной легкости синтеза сложных эфиров флавоноидов и доступности ацилирующих реагентов.

II. 1.1. Взаимодействие с ангидридами карбоновых кислот

Ангидриды карбоновых кислот являются активными ацилирующими агентами, которые взаимодействуют с фенолами необратимо. Наиболее доступным, эффективным и потому широко используемым реагентом среди ангидридов является ангидрид уксусной кислоты.

Домбаевой с сотр. [28] с целью поиска новых биологически активных веществ в ряду метоксилированных флавоноидов было проведено ацилирование бромпроизводного 5-гидрокси-6,7,4'-триметоксифлавона XIII большим избытком уксусного ангидрида в присутствии каталитического

количества п-толуолсульфокислоты. Ацилирование защищенного флавоноида XIII протекало с образованием его 5-ацетокси-8-бромпроизводного XIV:

ОМе

Ас20

ТяОН

ОМе

ОН О XIII ОАс ° XIV

Соединение выделяли методом колоночной хроматографии. Его строение доказано методом рентгеноструктурного анализа и подтверждено данными масс-спектрометрии.

Если соединения XV и XVI нагревать на водяной бане с уксусным ангидридом в присутствии пиридина в течение 30 мин, а затем каталитическим гидрированием в присутствии соляной кислоты удалить защитные бензильные группы, то образуются моноацетаты XVb и XVIb [29]. Соединения выделяли методом колоночной хроматографии. Их строение также доказано методами спектроскопии ЯМР ]Н и 13С, а также масс-спектрометрии.

.ОМе /ОМе

Ас20 К(Х

Ж)

(Ж

Ру

он о

XV: К=Вп; XVI: 11=СН2ОМе

ОИ О

XVa; ХМа

Н2, Р(1/С

НО

ОН О

XV Ь; XVIb

Таким образом, ацилирование флавоноидов только с одной свободной гидроксильной группой протекало однозначно по этой группе.

Интересным представляется ацилирование флавоноидов с несколькими свободными гидроксильными группами.

Одной из первых работ в этом направлении является работа Юрда и Ролле [30], проведенная в 1958 г. Авторы ацилированием рамнетина (7-0-метилкверцетина) XVII уксусным ангидридом в растворе пиридина в течение 10 минут при комнатной температуре с хорошим выходом получали 3,3',4'-триацетат рамнетина XVIII:

Процессы ацилирования других незащищенных флавоноидов XIX, XX, XXI с целью создания потенциальных биоантиоксидантов из природных полифенолов проводил Симокорияма [31] в отсутствии растворителя при соотношении реагентов флавоноид/уксусный ангидрид 1:10 и использовании каталитических количеств пиридина. Реакции завершались за 1-6 минут:

Особенностью данных реакций является то, что гидроксильная группа в положении 5 остается незатронутой.

К сожалению, в данных работах [30,31] авторами не представлены доказательства строения синтезированных соединений.

В продолжение исследований было проведено перацилирование флавоноидов. При этом оказалось необходимым ужесточить условия реакции, в

XIX: 4'-ОН; XX: 3',4'-ОН; XXI: 3',4',5'-ОН

Х1Ха: 4'-ОАс; ХХа: 3',4'-ОАс; ХХ1а: 3',4',5'-ОАс

частности, увеличить время реакции (как в случае дигидрокверцетина), температуру проведения процесса или использовать избыток реагента [32].

Таким образом с целью изучения процессов частичного ферментативного гидролиза перацилированных флавоноидов были получены перацетаты лютеолина, кемпферола и кверцетина ацилированием соответствующего соединения уксусным ангидридом в пиридине ХХПа, ХХШа, ХХ1Уа:

но

ОН Ас20

АсО

РУ

он О

XXII: 4'-ОН; XXIII: 3',4'-ОН

ОАс

ОАс О

ХХПа: 4'-ОАс; ХХШа: 3',4'-ОАс

НО

Ас20

АсО

РУ

ОН О

XXIV

ОАс

ОАс О ХХГУа

Строение вновь полученных соединений было доказано методом спектроскопии ЯМР 'Н, а состав подтвержден данными элементного анализа.

При обработке лейкоцианидина XXV уксусным ангидридом реакционную смесь выдерживали в течение 10 часов при 50°С [33]:

-ОН ^ ^ОАс

НО

ОН

АсО

Ас20

ОАс

ОН у у ОАс

ОН ОН ОАс ОАс

XXV XXVI

Конечным продуктом являлся перацилированный 3,4,5,7,3',4'-гексаацетоксифлаван XXVI.

Клейманом в 1997г. установлено [34], что при взаимодействии с уксусным ангидридом дигидрокверцетина образовывался его пентаацетат, о котором ранее сообщалось, что он не способен к кристаллизации [35-37]. Кроме того, определено, что данное соединение плавится в точке (в пределах 1-

2°С). Однако в работах [38-46] приведены существенно отличающиеся друг от друга значения температур плавления (в интервале от 82 и до 148°С). Количественное определение ацильных групп [40] и метод спектроскопии ЯМР [44, 46, 47] выявило структуру данного производного как (+)-(2Я,ЗК)-3,3',4',5,7- пентаацетоксидигидрофлавонол. Результаты измерения оптической активности пентаацетата полностью подтверждали абсолютную конфигурацию хиральных центров молекулы [44, 45].

Автором было подробно изучено влияние природы растворителя и используемого катализатора на количественный выход, состав и строение продуктов реакции.

Сначала синтезы проводили в отсутствие растворителя.

При соотношении реагентов дигидрокверцетин/уксусный ангидрид 1:10 и добавлении каталитических количеств пиридина в течение 30 мин в качестве основных продуктов образовывались 3,3'4',7-тетра- ХХа и 3,3',4',5,7-пента-XXVIII ацетаты дигидрокверцетина:

•ОАс

ОН О

ОАс

ОАс О

Сокращение времени реакции до двух минут приводило к образованию 26% 3'4',7-триацетата XVII и 54% 3,3'4',7-тетраацетата ХХа дигидрокверцетина, которые были разделены хроматографически.

При катализе ацетатом калия в качестве основного продукта образовывался 3'4',7-триацетат дигидрокверцетина XXVII (выход 56%) и 3,3'4',7-тетраацетат дигидрокверцетина ХХа как сопутствующий (выход 28%).

Соединения выделены в индивидуальном виде методом ТСХ на незакрепленном слое силикагеля. Их строение доказано методом спектроскопии ЯМР и подтверждено данными элементного анализа и масс-спектрометрии.

Затем автором было изучено ацилирование дигидрокверцетина уксусным ангидридом в растворе водного метанола.

При соотношении реагентов дигидрокверцетин/уксусный ангидрид 1:3 и добавлении в качестве катализатора ацетата калия образовывалась смесь, содержащая приблизительно эквимолярные количества 3,3',4'-тетраацетата, 3',4'-диацетата