Исследование минорных тритерпеноидных гликозидов василистника малого (Thralictrum minus L. сем. Ranunculaceae) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИРКУТСКИЙ ИНСТИТУТ ХИМИИ

на правах рукописи

Трофимова Наталья Николаевна

Исследование минорных тритерпеноидных гликозидов василистника малого (Thalictrum minus L. сем. Ranunculaceae)

02.00.03 - органическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

научный руководитель - к.х.н., в.н.с В.И.Луцкий

Иркутск - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................4 с.

ГЛАВА 1. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ (ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ РАСТЕНИЙ РОДА THALICTRUM СЕМ. RANUNCULAСЕАЕ (Литературный обзор).....................................................................7

1.1.Тритерпеноидные гликозиды.......................................................8

1.1.1. Тетрациклические тритерпеноидные гликозиды циклоартанового ряда...................................................................................9

1.1.2. Пентациклические тритерпеноидные гликозиды олеананового

ряда.................................................................................25

1.2. Алкалоиды.............................................................................30

1.2.1. Новые изохинолиновые алкалоиды..........................................32

1.2.2. Дитерпеновый алкалоид.........................................................33

1.3. Флавоноидные соединения.........................................................33

1.4. Высшие жирные кислоты...........................................................36

1.5. Стерины и их гликозиды............................................................38

1.6. Другие продукты вторичного метаболизма, выделенные из растений рода Thalictrum.......................................................................38

1.7. Биологическая активность вторичных метаболитов из растений рода Thalictrum..............................................................................39

1.8. К некоторым вопросам хемотаксономии растений рода

Thalictrum...............................................................................42

ГЛАВА 2. ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ THALICTRUM MINUS L. И

THALICTRUM SIMPLEXL. (Обсуждение результатов)......................44

2.1. Химическое исследование Т.minus L.............................................45

2.1.1. Выделение тритерпеноидных гликозидов...................................45

2.1.2.0леанановый гликозид Т.minus L.............................................47

2.1.2.1. Строение таликозида D......................................................47

2.1.3. Циклоартановые гликозиды T.minusL......................................54

2.1.3.1. Строение таликозида G1...................................................55

2.1.3.1.1. Установление строения полициклического и углеводных

фрагментов таликозида G1...............................................55

2.1.3.1.2. Установление строения боковой цепи таликозида G1............63

2.1.3.2. Строение таликозидов G2 и HI.............................................65

2.1.3.2.1. Строение боковой цепи таликозида G2..............................65

2.1.3.2.2. Строение боковой цепи таликозида HI..............................68

2.1.3.3. Строение таликозидов Н2 и НЗ............................................72

2.1.3.4. Строение таликозида С.....................................................80

2.2. Химическое исследование T.simplex L...........................................88

2.2.1. Идентификация флавоноидного гликозида (линарина)..................88

2.2.2. Гликозиды стеринов............................................................90

2.2.3. Жирные кислоты и углеводороды............................................91

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ............................................93

3.1.Общие методики......................................................................93

3.2. Хроматография........................................................................94

3.3. Изучение Thalictrum minus L.......................................................95

3.3.1. Выделение таликозидов С, D, Gl, G2, HI, Н2, НЗ........................95

3.3.2. Таликозид D...................................................................100

3.3.2.1. Полный кислотный гидролиз таликозида D........................100

3.3.2.2. Щелочной гидролиз таликозида D....................................101

3.3.2.3. Частичный кислотный гидролиз таликозида D.....................101

3.3.3. Таликозиды Gl, G2, HI, Н2 и НЗ..........................................102

3.3.4. Таликозид С......................................................................103

3.3.4.1. Кислотный гидролиз таликозида С....................................104

3.3.4.2. Ферментолиз таликозида С..............................................104

3.3.4.3. Ацетилирование таликозида С..........................................105

3.4. Изучение Thalictrum simplex L..................................................106

3.4.1. Экстракция и первичное разделение экстракта........................106

3.4.2. Линарин.........................................................................106

3.4.3. Гликозиды стеринов..........................................................108

3.4.4. Углеводороды и жирные кислоты..........................................108

ВЫВОДЫ............................................................................................109

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................112

Приложение. Спектры ЯМР *Н и 13С новых соединений (I,VII-XII)............... 122

ВВЕДЕНИЕ

На пороге третьего тысячелетия в эру всеобщего научного прогресса, интенсивного развития новейших технологий, позволяющих получать современные синтетические материалы и продукты, человечество все чаще обращает внимание на натуральные вещества, и особенно в вопросах, касающихся здоровья. Сырье

растительного и животного происхождения способно в полной мере удовлетворить

%

его запросы в качестве экологически чистого, возобновляемого и достаточно дешевого источника для получения новых эффективных лекарств. В современной медицинской практике на долю фитопрепаратов приходится около четверти всего лекарственного арсенала. По сравнению с синтетическими препаратами фитопрепараты обладают мягким воздействием на организм, практически не вызывают побочных эффектов. Поэтому, усилия химиков в поиске новых источников для создания таких терапевтических средств достаточно актуальны и интересны.

Определенную ценность в рассматриваемом аспекте представляют растения некоторых видов рода Thalictrum L. (василистник) сем. Ranunculaceae (лютиковые), в частности Thalictrum minus L. (василистник малый) и Thalictrum simplex L. (василистник простой). В народной медицине эти растения используются как кровоостанавливающие средства при женских болезнях, при носовых кровотечениях, при заболеваниях органов пищеварения, простуде, лихорадке, туберкулезе, эпилепсии, малярии, ревматических болях и ряде других заболеваний [1,2]. Применяются они и в тибетской медицине [3].

Установлено, что химический состав Thalictrum minus L. зависит от его эколого-географического местообитания. Растения среднеазиатского, европейского и североамериканского ареалов произрастания являются алкалоидоносными видами [4], а растения этого же вида в Восточной Сибири содержат тритерпеноидные гликозиды (сапонины).

Изучение тритерпеноидных гликозидов из растений рода Thalictrum было начато более 15 лет назад. Актуальность этих исследований обусловлена, во-первых, разнообразным спектром физиологической активности сапонинов и поиском путей их практического использования в медицине и в сельском хозяйстве; а во-вторых, самостоятельным фундаментальным интересом, заключающимся в изучении химического и пространственного строения новых тритерпеноидных соединений. Эти

природные вещества являются достаточно сложными и интересными для выделения и /

химического познания, для изучения их роли в растениях и в решении некоторых)

\ .

вопросов хемосистематики.

Сапониновая фракция надземной части в.малого содержит не менее 10 тритерпеновых гликозидов, один из которых в количественном отношении значительно преобладает над остальными. Этот сапонин был назван таликозидом А [5].

Биологические испытания в Казахском НИИ онкологии и радиологии (г.Алма-Ата) таликозида А выявили его высокую противоопухолевую активность [6]. Испытания в НИИ акушерства и гинекологии (НИИАГ) РАМН (г.С.-Петербург) фракции сапонинов (с преобладанием таликозида А) показали ее заметное влияние на фертильность подопытных животных [7]. Дальнейшие исследования специфической активности индивидуального таликозида А позволили сделать заключение, что это соединение может стать перспективным негормональным средством для регулирования рождаемости (с областью применения: посткоитальная контрацепция [8]).

На основании вышеперечисленных данных с 1990 г. в лаборатории природных соединений ИрИХ СО РАН совместно с НИИАГ РАМН при поддержке Минмедздравпрома России началась разработка препарата для регулирования рождаемости из растения в.малый на основе таликозида А. Согласно одному из требований Фармкомитета России к фитопрепаратам - химическое изучение используемых растений - стало необходимым более глубокое изучение состава тритерпеноидов надземной части в. малого.

Растение Т. simplex L. (в.простой), так же как и Т.minus L. повсеместно распространено на территории сибирского региона. Ранее изучался состав этого вида среднеазиатского и европейского местообитаний [9]. Предполагалось, что Т. simplex L., произрастающий в Восточной Сибири может служить источником выделения тритерпеноидных сапонинов [10].

Таким образом, целью настоящей работы явилось:

- выделение и исследование минорных тритерпеноидных гликозидов надземной части Т.minus L., установление структуры и пространственной

организации молекул новых соединений, изучение их физико-химических и спектральных характеристик;

- исследование химического состава растения Т. simplex L., произрастающего в Восточной Сибири.

Выполнение данной работы привело к установлению строения 7 неописанных в литературе тритерпеноидных гликозидов, выделенных из Т. minus L. и относящихся к циклоартановым и олеанановым рядам. В основе 6 циклоартановых сапонинов лежат новые генины, являющиеся структурными и стереоизомерами по отношению друг к другу. Генином гликозида олеананового ряда является олеаноловая кислота. Шесть гликозидов оказались бисдесмозидами, один трисдесмозидом. Гликозиды содержат от 2-х до 5-ти углеводных остатков.

Строение новых соединений установлено, в основном, спектральными методами (ИК-, одно- и двумерная ЯМР спектроскопия, FAB-масс-, SIMS-масс- и FAB-масс-спектрометрия высокого разрешения) с применением в необходимых случаях химических превращений (кислотный гидролиз - полный и частичный, щелочной гидролиз, ферментолиз, ацетилирование, метилирование), что дало возможность определить полную химическую структуру и, в большинстве своем, относительную и абсолютную конфигурацию хиральных центров.

Кроме фундаментального значения данная работа имеет и прикладной интерес: выявлен состав всей фракции сапонинов, и тем самым показан состав субстанции, из которой выделяется целевой продукт - таликозид А.

Нами была исследована надземная часть растения Т. simplex L. В ходе выполнения этой работы впервые из данного вида выделен и идентифицирован флавоноидный биозид - линарин. Кроме этого определен состав фракции гликозидов стеринов, жирных кислот и углеводородов. Показано, что сапонины в данном растении практически не содержатся.

ГЛАВА 1. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РАСТЕНИЙ РОДА THALICTRUM (СЕМ.

RANUNCULA СЕЛЕ)

(Литературный обзор)

Родовое название thalictrum вероятно произошло от древнегреческого thallo и переводится как «расти зеленым». Полный объем рода составляет около 150 видов [11]. На территории СНГ произрастает около 40 видов василистников, в том числе в сибирском регионе -12 видов [12], на территории Дальнего Востока -14 видов [13].

Началом систематического химического изучения василистников следует считать работы школы Орехова А.П., начавшиеся в 40-х годах нашего столетия [14]. Было показано, что среднеазиатские василистники продуцируют в качестве вторичных метаболитов алкалоиды изохинолинового ряда. В дальнейшем, химия алкалоидов василистников нашла свое продолжение и развитие в исследованиях таких крупных школ, как школа Юнусова С.Ю. (Узбекистан), Лазурьевского Г.В. (Молдавия), Dutschewska Н., Mollov N.M. (Болгария), Tomimatsu Т. (Япония), Shiff P.L., Doskotch A.R. (США), которыми был значительно расширен как видовой состав исследованных василистников, так и количество выделенных алкалоидов из растений этого рода.

Для состава экстрактивных веществ растений рода василистник, кроме алкалоидов, характерно присутствие тритерпеноидных сапонинов, фенольных соединений, высших жирных кислот, стеринов, кумаринов, органических кислот, дубильных веществ и некоторых других вторичных метаболитов.

Наличие тритерпеновых сапонинов, выявленное качественными реакциями, отмечено в нескольких видах василистников [9], но структурного изучения этих сапонинов не проводилось. В начале 80-х годов группой ученых Иркутского института химии СО РАН были начаты исследования сибирских видов василистников и в трех из шести изученных видов было обнаружено высокое содержание тритерпеновых сапонинов [10]. Эти работы явились первыми структурными исследованиям сапонинов из рода василистник, уже вслед за которыми последовали серия сообщений японских авторов (начало 90-х годов), а в последнее время и сообщения корейских и китайских исследователей о выделении сапонинов из еще трех видов василистников.

Таким образом, за последние 17 лет в литературе накоплены сведения по выделению и установлению строения сапонинов из шести видов василистников. Все эти сапонины обладают оригинальным строением, часть из них проявляет высокую (до 100%) контрацептивную [8], довольно высокую (до 90%) противоопухолевую [6] и умеренную гипохолестеринемическую активность [16].

Поскольку в литературе отсутствуют работы, обобщающие этот материал, в данной главе основное внимание уделено тритерпеноидным гликозидам василистников: структурным особенностям, методам выделения, подходам и приемам, использованным для установления их строения. В литературный обзор также включены сведения о других вторичных метаболитах, найденных в растениях рода. В конце главы рассмотрены биологическая активность вторичных метаболитов василистников и некоторые вопросы хемотаксономии василистниковых.

1.1. Тритерпеноидные гликозиды

Раздел посвящен рассмотрению работ, опубликованных в печати с 1981 (с первой публикации по данному вопросу) по 1998 годы.

Анализ литературных данных показывает, что в растениях синтезируются тритерпеноидные гликозиды, генинами которых являются как тетрациклические (ряд циклоартана), так и пентациклические (ряд олеанана) тритерпеноиды.

Ряд циклоартановых соединений принято рассматривать как подгруппу ланостановых тетрациклических тритерпеноидов, производных 9,19-цикло-5а,9(3-ланостана. Таким образом, в основе циклоартана лежит скелет ланостана с транссочленением колец С Я), с сохранением стереохимии С-17 и С-20 асимметрических центров, но при этом в циклоартановых производных происходит замыкание 9,19 трехчленного цикла.

Ланостан Циклоартан

Ряд олеанана объединяет группу соединений, несущих в своей основе скелет насыщенного углеводорода олеанана.

29 30

Олеанан

1.1.1. Тетрациклические тритерпеноидные гликозиды циклоартанового ряда

К настоящему времени из 150 видов василистников в шести видах: T.minus L., T.foetidum L., T.squarrosum St.ex Willd., T.thunbergii D.C., T.foeniculaceum Nakai, T.uchiyamai обнаружены тритерпеноидные гликозиды циклоартанового ряда.

Thalictrum minus L.- один из типичных представителей сибирских биоценозов, стал первым объектом из растений рода Thalictrum, из которого Громовой A.C., Луцким В.И. и Семеновым A.A. были индивидуализированы тритерпеноидные гликозиды [5]. Использованная авторами схема выделения сапонинов, включает в себя этапы исчерпывающей метанольно-водной экстракции, последовательного фракционирования экстракта хлороформом и бутанолом и позволяет сосредоточить

большую часть сапонинов в бутанольной фракции [5]. При растворении этой фракции в метаноле, нагретом до 50°С и выдерживании ее в холодильнике происходит осаждение неполярных веществ, которые удаляются из экстракта путем фильтрования. Обработка метанольного экстракта ацетоном позволяет обогатить сапониновую фракцию, дальнейшая очистка которой включает стадию избавления от низкомолекулярных углеводов и фенольных компонентов на молекулярных ситах и окиси алюминия. Многократная колоночная хроматография на силикагеле сапониновой фракции позволила получить сапонин А (1) - один из двух преобладающих компонентов сапониновой фракции. Его содержание в растении по данным количественного ВЭЖХ-анализа составляет 0.4-0.8 % от веса воздушно-сухого сырья (в.с.с.) [17].

1. К=р-П-(5а1р, ^р-Б-Окр, 3. К=Р-Б-Оа1р, Я^р-Б-Окр

Кислотный гидролиз сапонина А 5%-ной Н2804 приводит к образованию смеси соединений с преобладанием соединения 1а [5]. Сравнение спектров ЯМР !Н исходного сапонина 1 и продукта 1а показало различие в строении агликонового фрагмента, поэтому было сделано заключение о том, что полученное соединение является артефактом сапонина А. Структура и стереохимия 1а были установлены методом рентгеноструктурного анализа (РСА) как Зр,1бр,29-тригидрокси-22(.5),25-эпоксиланост-9( 11 )-ена [18].

Нативный генин, названный таликогенином (2) был получен периодатным окислением сапонина А с последующей щелочной деструкцией продуктов реакции [19]. Ряд химических превращений таликогенина с детальным разбором спектральных характеристик выделенных продуктов реакций, позволил авторам установить качественный и количественный состав заместителей в молекуле исследуемого соединения {схема 1).

Гидрирование соединения 2 в мягких условиях привело к образованию продукта 2а с насыщенной боковой цепью, что подтвердило наличие тризамещенной двойной связи в боковой цепи 2. Нагревание таликогенина с 10%-ной ^804 привело к циклизации боковой цепи и образованию двойной связи в 9,11-пол�