Исследование процессов биолюминесценции Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

004607659

Антипина Любовь Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Са2+-РЕ1 УЛИРУЕМОГО ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА

Специальность 01.04.07 - физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

- 2 СЕ И 7010

Красноярск - 2010

004607659

Работа выполнена в Институте физики им. Л.В. Киренского СО РАН

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор, Овчинников Сергей Геннадьевич

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Белобров Петр Иванович

кандидат физико-математических наук Краснов Павел Олегович

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. н.м. Эмануэля РАН, г. Москва

Защита состоится « 2010 г. в с^-^часов на заседании

диссертационного совета Д 003.055.02 в Институте физики им. Л.В. Киренского СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физики им. Л.В. Киренского СО РАН.

Автореферат разослан « 20»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук __/__Втюрин Александр Николаевич

Общее содержание работы

Актуальность: Биолюминесценция - явление, широко представленное в природе. В настоящее время биолюминесцентные белки являются основой многих широко используемых методов анализа. Биолюминесцентные методы широко используются в клеточной биологии и экологии, а также в медицинской диагностике и исследовании онкологических заболеваний.

Значительный прогресс в понимании механизма биолюминесценции и роли отдельных аминокислот белка в этом процессе был достигнут после определения нескольких пространственных структур Са2+-регулируемых фотопротеинов. Однако, пространственная структура белка обеспечивает информацию только о статическом состоянии белковой молекулы и аминокислот активного центра. Какие изменения происходят непосредственно в ходе реакции, остается неизвестным. Восполнить этот пробел позволяют современные квантово-химические методы расчетов, которые в настоящее время широко применяются для решения задач подобного уровня.

Целыо работы являлось исследование строения, электронной структуры и механизмов флуоресценции фотопротеинов методами квантовой химии.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. исследование строения целентерамида (СЬМ) и целентеразина (СЬ2) с учетом эффектов электронных корреляций;

2. изучение влияния ван-дер-ваальсовых взаимодействий на процесс образования 2-гидропероксицелентеразина (НР-СЧ^) и моделирование процесса активации СЬ2 кислородом;

3. построение физической модели флуоресценции фотопротеинов.

При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Учет электронных корреляций дает структуру наиболее близкую к экспериментальной для изомеров молекул С12. и СЬМ и позволяет выбрать форму целентеразина С1.7(1Н) как наиболее вероятную из возможных изомерных форм.

2. Показано, что ван-дер-ваальсово взаимодействие влияет на процесс формирования НР-СЬТ.. Рассчитана энергия активации реакции образования НР-СЦ?, которая находится в согласии с экспериментом.

3. Построена физическая модель флуоресценции фотопротеина обелина с учетом электронных корреляций. Экспериментально наблюдаемая длииа волны излучения 500 нм соответствует «комплексу с переносом протона» между кислородом целентерамида и гистидином I Пя22.

Научная новизна.

В работе обнаружен эффект электронных корреляций на стабилизацию изомерных форм целентеразина.

Были получены объяснения следующим, экспериментально наблюдаемым, явлениям:

1) в белке Obelia Longissima (OL) субстрат находится в форме CLZ(2H), в Renilla Muelleri (RM) — CLZ(IH), поэтому активация CLZ в белке RM не происходит;

2) установлен механизм формирования эмиттера; длина волны флуоресценции определяется положением протона между фенольной группой CLM и атомом азота His22.

На основании результатов квантово-химических расчетов было предсказано следующее:

1) существование субстрата целентеразина в белке в изомерной форме CLZ(2H);

2) учет электронных корреляций дает структуру более близкую к экспериментальной в растворителе и позволяет выбрать форму целентеразина CLZ(IH) как наиболее вероятную из возможных изомерных форм в протонных растворителях.

3) необходимость присутствия гистидииа Hisl75 на формирование CLZ(2H) из CLZ( 1Н) в белке на начальном этапе реакции;

4) влияние полярных групп аминокислотного окружения на процесс образования комплекса CLZ(2H)—02, из которого впоследствии идёт формирование 2-гидропероксицелентеразина (HP-CLZ).

Практическая значимость.

Разработанная модель активного центра фотопротеина позволяет проводить качественные исследования геометрии активного центра и электронной структуры квантово-химическими методами, с учётом электронных корреляций.

Изучено влияние аминокислотного окружения на субстрат в активном центре фотопротеина. Полученная из расчётов информация делает возможным целенаправленный синтез люминесцентных белков с заданными свойствами.

Личный вклад автора.

Моделирование активного центра фотопротеинов. Расчет всех структур с помощью различных квантово-химических методов. Анализ полученных данных. Настоящая работа является итогом исследований, проводимых в 2007-2010 годах.

Апробация работы. Результаты, включенные в диссертацию, были представлены на различных конференциях, в том числе: VIII Всероссийская научно-практическая конференция студентов и аспирантов «Химия и Химическая технология

в XXI веке» (2007, Томск); XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); Luminescence (2008, Beijing и 2010, Lyon); 12-ая и 13-ая международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология в XXI веке (2008 и 2009, Пущино); XX и XXI симпозиум "Современная химическая физика" (2008 и 2009, Туапсе); IV школа-семинар молодых ученых «Квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул» (2009, Иваново). Результаты работы так же обсуждались на научных семинарах в Институте физики им. JI.B. Киренского СО РАН (г. Красноярск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в реферируемых отечественных журналах. Всего опубликовано 14 работ, включая тезисы и материалы конференций.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (07-04-00930-а и 09-04-12022 офи_м), программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», программы Сибирского отделения РАН (проект № 2), а также в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы. Объем работы составляет 103 страницы, включающих 24 рисунка, 17 таблиц и список литературы из 121 наименования.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность проводимых исследований, сформулирована цель работы, указаны научная новизна, практическая значимость полученных результатов и основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава диссертации содержит литературный обзор теоретических и экспериментальных исследований биолюминесцентных белков, их субстратов и различных механизмов реакции. Приводится обзор экспериментальных работ по исследованию обелина.

Схематично схема преобразования субстрата представлена на рис. I, процесс биолюминесценции - на рис. 2.

-оЯс.» .vö™

НО'

НО'

НО'

целентеразин CLZ

2-гидронерокси-целентеразин HP-CLZ

целентерамид CLM

Рис. 1 - Преобразование субстрата в ходе биолюминесцентной реакции

5

Рис. 2 - схема процесса биолюминесценции и флуоресценции обелина

I - Стадия поглощения апо-белком целентеразина в растворе.

II - Стадия образования гидроперекиси целентеразина внутри полости белка с находящимся там кислородом.

III - Биолюминесцентпая реакция декорбаксилирования обелина с ионами кальция с образованием Са2+-разряженного белка обелина, с превращением целентеразина в целснтерамид внутри полости белка.

IV - Флуоресцентная реакция Са2+-разряженного обелина.

При добавлении к апо-белку целентеразина (CLZ) происходит образование активного фотопротеина (рис. 1 и 2, процесс I-II). При этом CLZ вступает в реакцию с молекулой кислорода, образуя внутри белка молекулу 2-гидропероксицелентеразина (IIP-CLZ). Присоединение ионов кальция (рис. 1 и 2, процесс II-III) запускает реакцию окислительного декарбоксилирования, в результате которой образуется Са2+-разряженный фотопротеин, содержащий субстрат в возбужденном состоянии -целентерамид (CLM). Переход CLM из возбужденного состояния в основное сопровождается биолюминесценцией, которая наблюдается в диапазоне 465-495 нм и зависит от организма, из которого фотопротеин выделен. После реакции образующийся разряженный фотопротеин (рис. 2, состояние III), содержащий

целентерамид в основном состоянии, при облучении светом проявляет яркую флуоресценцию.

Немодифицированная форма СЬ2 отвечает формуле- С26Н2103№. Целентеразин может быть выкристаллизован из метанола как желто-оранжевые кристаллы. В метаноле С\-Ъ флуоресцирует в желтой области, и его ультрафиолетовый спектр поглощения имеет максимум на 435 нм В разных растворителях СЬХ может формировать несколько изомерных форм. Однако экспериментально установить какая же именно форма существует в тех или иных условиях практически невозможно. Структуры изомерных форм С12. представлены на рис. 3.

Л

С(^МН)

НО Яз

дТ

н

сьг(7Н)

ДТ

СЬ2(2Н)

Рис. 3 - Изомерные формы целентеразина.

В отличие от фотопротеина обелина, выделенного из ОЬеНа Ьог^эБта (ОЬ), в Са2+ -связывающем белке (СВР), выделенном из Кеп511а Мие11еп (КМ), активация целентеразина кислородом не происходит. Излучающей структурой фогопротеинов является целентерамид (СЬМ), образующийся в ходе биолюминесцентной реакции. СЬМ может формировать четыре вида возбужденных состояний (рис. 4), Экспериментально установить, какая же форма является излучающей в процессе биолюминесценции или флюоресценции, не удается.

387-409нм

435-45 8нм

480-490нм

неионизированная форма С1..М

Амид-анион С'ЬМ-ашИ

© О

Фснолят-аниом СХМ-рЬе»

535-550нм

N К;

Пираяш-аиион СЬМ-руг

Рис. 4 - Излучающие формы СЬМ

Во второй главе приводиться описание методов расчета электронной и

атомной структуры используемых в данной работе. Рассматриваются метод Хартри-

Фока (ИР), метод функционала плотности (ОРТ). Также рассматривается теория

возмущений Мёллера-Плессета второго порядка (МР2). Для изучения флуоресценции

использовался метод конфигурационного взаимодействия (С1), позволяющий

рассчитывать геометрию структуры в возбужденном состоянии с учетом электронных

корреляций. Для учета ван-дер-ваальсовых взаимодействий использовались

7

полуэмпирические методы РМЗ и РМ6. Все расчеты электронной и атомной структуры проводились с использованием программ GAMESS, МОРАС или HyperChem.

Третья глава посвящена исследованию строения CLZ с учетом аминокислотного окружения и электронных корреляций.

Экспериментально, на данный момент, получена только структура белка обелина содержащая IIP-CLZ и структура целентеразин-связывающего белка (СВР) Renilla Muelleri, содержащая CLZ. При оптимизации геометрии структуры целентеразина, взятой из рентгеноструктурного анализа СВР (CLZ(7H) или CLZ(IH)) в аминокислотном окружении обелина происходит разрушение структуры целентеразина потому что одним из своих заместителей целентеразин, протонированный в положении N(7) или N(1), пересекается с аминокислотным окружением - Hisl75 и Trpl 35 (рис. 5). Если оптимизировать целентеразин в форме CLZ(2H) в тех же условиях, получается стабильная молекула.

В работе [1] проведено исследование немодифицированного CLZ и его аналогов в различных растворителях. Показано, что в растворителях различной полярности наблюдается различный максимум поглощения (в протонных ~ 435 нм, в апротонных - с красным сдвигом ~ 455 нм). Данные максимумы поглощения были приписаны разным изомерным формам - CLZ(7H) и CLZ(2H) соответственно.

атомы азота и кислорода с неподеленными электронными парами. Наличие данных атомов приводит к корреляционным эффектам, поэтому было решено проверить атомную структуру целентерамида с помощью одноэлектронных приближений (метод HF) и с учетом корреляционных поправок (CI, B3LYP, МР2).

.. Trp 135

Формы CLZ(IH) и CLZ(7H)

His 175

Рис. 5 - Положение целентеразина в форме CLZ(7H) в белке обелине.

геометрически очень похожи, и в связи с тем, что рентгеноструктурный анализ не показывает атомов водородов в молекуле, сложно определить, какая именно структура находится в белке. С другой стороны для правильного определения спектральных характеристик необходимо знание точной атомной структуры молекулы. Даже небольшие изменения в атомной структуре приводят к заметным сдвигам в спектрах поглощения. В структуре целентеразина присутствуют

1 Hon К., Anderson J.M., Ward' W.W., Cornier M.J.// Biochemistry, Vol. 14.No. 1 1.- 1975.-P. 2371 -2376 ' Cossi M., Barone V., Cammi R. Tomasi J. // Chem.Phys.Lett., Vol. 255. - 1996. P. 327 - 330

8

В таблице 1 представлены энергии трех изомерных структур целентеразина, полученные различными методами.

При учете корреляции уменьшается энергетическая разница между структурами CLZ(IH) и CLZ(7Ii) (18 кДж/моль без учета корреляции и 6 кДж/моль с учетом). Это происходит из-за того, что структуры CLZ(IH) и CLZ(7H) геометрически различаются мало, в отличие от структуры CLZ(2H), у которой С(2) находится в sp'-гибридизации, и феиольное кольцо отклонено от плоскости пиразинового кольца на 125°. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае первопринципных методов. В случае метода Хартри-Фока наблюдается достаточно большое различие энергий структур CLZ(IH) и CLZ(7H) (59 кДж/моль) и слабое различие между структурами CLZ(7H) и CLZ(2H) (30 кДж/моль).

При расчете методом МР2 разница между структурами CLZ(IH) и CLZ(7H) уменьшается (6 кДж/моль), и сильнее проявляется разница между структурами CLZ(7H) и CLZ(2H) (145 кДж/моль). Метод DFT не показывает разницы между структурами CLZ(7H) и CLZ(2H). При этом следует отметить, что полуэмпирический метод показывает структуру CLZ(IH) более устойчивой, а первопринципные методы -CLZ(7H).

При учете электронной корреляции методом МР2 разница между CLZ(7H) и CLZ(IH) не большая, можно предположить, что они при определённых условиях могут переходить друг в друга в растворителях достаточно легко. Поэтому определить, какая структура существует в том или ином растворителе только из энергетического фактора нельзя. На основании полученных геометрий был выполнен расчет спектров поглощения изомерных форм целентеразина в вакууме, метаноле и DMSO. Расчет спектров поглощения CLZ в растворителях проводился прямым и косвенным методом. Для прямого метода расчетов молекула целентеразина была помещена в окружение из 10 молекул растворителя. Расчет проводился полуэмпирическим методом РМЗ, чтобы учесть электростатическое взаимодействие. Косвенный метод расчета был выполнен с использованием РСМ-модели методом DFT-B3LYP/6-31*. В РСМ модели (Polarizable Continuum Model) растворитель неявно

Табл. 1 - Энергия целентеразина, полученная различными методами кДж/моль

\ Форма \целенте-\мзтм Метод \ расчета \ CLZ(IH) CLZ(7H) CLZ(2H)

РМЗ -461338 -461333 -461348

РМЗ Cl -461338 -461333 -461348

РМ6 -470891 -470873 -470876

РМб CI -470900 -470894 -470885

HF -3635586 -3635645 -3635675

DFT B3LYP -3656046 -3656071 -3656071

МР2 -3647264 -3647270 -3647415

учитывается введением диэлектрической проницаемости среды, и других свойств растворителя [2,3]. Результаты расчетов приведены в таблице 2.

При расчете спектров поглощения в вакууме метод РМб, реализованный в программе МОРЛС, не показал различия в спектрах для изомерных форм CLZ. Метод TD DFT на основе геометрий, полученных методом МР2 показывает максимумы поглощения для всех форм CLZ в тех же приделах что и на основе геометрий, полученных методом DFT B3LYP. Поэтому при рассмотрении спектров в растворителях данные методы можно исключить.

Расчет максимумов поглощения методом B3LYP в рамках РСМ-модели для CLZ(IH) и CLZ(7H) показывает, что разница в максимумах поглощения между структурами минимальна (табл.2 ). В принципе данный расчет показывает хорошее соответствие с предположением, которое было выдвинуто Кормиером [1] о том, что в апротонном растворителе присутствует форма CLZ(2H) (эксперимент - 454 нм, расчет - 444 нм), а в протонном растворителе форма CLZ(7H) (эксперимент - 435 нм, расчет - 435 нм). При этом данный расчет показывает, что структура CLZ(IH) также может присугствовать, т.к. её максимумы поглощения лежат в той же области что и для CLZ(7H). Главной проблемой данных расчётов является то, что метод TD DFT не очень хорошо описывает спектры поглощения биологических объектов [4,5].

Максимум поглощения структуры CLZ(2H), рассчитанный полуэмпирическим методом РМЗ, показывает значение ~ 360 нм. Поэтому структура CLZ(2H) исключена из дальнейшего рассмотрения.

Расчеты с использованием конфигурационного взаимодействия в рамках метода РМЗ, который хорошо параметризован для биологических объектов, показывают сильный красный сдвиг для структуры CLZ(7H) при любых условиях. Таким образом,

2 Cossi M., Barone V., Cammi R. Tomasi J. // Chem.Phys.Lett., Vol. 255. - 1996. - P. 327 - 330

3 Barone V., Cossi M„ Tomasi J. //J.Chem.Phys„ Vol. 107. - 1997. -P. 3210-3217 Nakatani N„ Hasegawa J„ Nakatsuji H. // JACS. Vol. 129. - 2007. - P. 8756-8765

5 Casida M.E., Salahub D R. //J. Chem. Phys., Vol. 113. - 2000. - P. 8918 - 8935

Табл. 2 - Максимумы поглощения структур CLZ в растворителях, нм.

\ Метод расчета Формах целен-теразина TD DFT B3LYP PM3 CI

Вакуум

CLZ(IH) 470 440

CLZ(7H) 450 475

CLZ(2H) | 441 363

СНЗОН

CLZ(IH) 435 433

C.LZ(7H) 435 499

Г CLZ(2H) 1 442 362

DMSO

CLZ(IH) 434 430

CLZ(7H) 437 540

CLZ(2H) 444 369

на основании полуэмнирических расчетов с учетом электронных корреляций методом конфигурационного взаимодействия можно сделать следующее заключение: в апротонном растворителе существует в форме СЬ7(7П), а в протонном -СЬ2(1Н), в отличие оттого, что считалось ранее [1].

Для того, чтобы определить, какая же структура является более предпочтительной в тех или иных условиях, было проведено сравнение длин связей для структур СЬ7(1П) и СГ.7(711) (табл. 3). В таблице также приведено а — среднеквадратическое отклонение. Структура С1_^(2П) не принималась во внимание при сравнении геометрических параметров, т.к. ее образование в растворителе маловероятно. Следует отметить, что метод Хартри-Фока дает ошибку при расчете длин связей азота и кислорода. Полуэмпирический метод РМ6 (также как и РМЗ) немного лучше описывает эти связи. Из сравнения геометрий видно, что наиболее близкая к Экспериментальным данным структура - СЬ7(1Н). Все методы расчета показали отклонение для данной структуры меньше, чем для структуры 7Н.

Табл. 3 - Сравнение атомных структур двух таутомерных форм целентеразина, отклонение от экспериментальных данных, А. Номера связи соответствуют рис. 2

Метод РМб С1 да ОРТ МР2

\ Форма Целентеразина Номер \ связи \ сьг(Ш) СЬ2(7Н) 1 съгпн) сьг(7Н) СЬ7.(1Н) сьг(7Н) X N О сьг(7Н)

1-2 0,03 -0,03 0,03 -0,09 0,03 -0,04 0,01 -0,01

2-3 -0,02 0,04 -0,08 0,04 -0,05 0,01 -0,03 -0,01

3-4 0,14 0,10 0,10 0,02 0,12 0,06 0,09 0,07

4-5 0,05 0,06 0,01 0,05 0,02 0,04 0,02 0,03

5-6 -0,02 -0,04 -0,05 -0,07 -0,02 -0,04 -0,02 -0,03

6-7 0,06 0,09 0,02 0,05 0,03 0,06 0,03 0,05

7-8 -0,03 0,04 -0,07 0,04 -0,03 0,03 -0,01 0,02

8-9 -0,04 -0,11 -0,06 -0,15 -0,07 -0,12 -0,09 -0,11

9-1 0,00 0,04 -0,05 0,01 -0,02 -0,01 -0,01 -0,02

4-9 0,08 0,12 -0,01 0,06 0,03 0,07 0,05 0,06

а 0,058 0,070 0,058 0,073 0,054 0,060 0,050 0,053

Исходя из сравнения атомной структуры при учете электронных корреляций, можно сделать вывод, что начальной структурой процесса будет являться структура СЬг(1Н), а не С1^(7Н), как считалось ранее.

П

Однако, как было показано выше, в аминокислотном окружении обелина может существовать только структура С 1^(211). Следовательно, образование 2-гидропероксицелентеразина может начинаться только из целентеразина в форме СЬ2(2\1). На рисунке 6 представлена схема и энергетическая диаграмма данного процесса. Процесс происходит в одну стадию. Для того чтобы запустить активацию, необходимо затратить 68 кДж/моль. Рассчитанная энтальпия реакции составляет порядка 60 кДж/моль. Энергия активации, полученная из квантово-химических расчетов, хорошо согласуется с экспериментальными данными, из которых энергия активации составила 57,4 кДж/моль, энтальпия при 20 градусах - 55 кДж/моль.

Полученные результаты поднимают вопрос о том, каким образом может образовываться структура СЦ2(2Н) из структур С1.7.(7П) или СЬ7.( (П).

Еакт= 68 кДж/моль

Переходное Путь состояние реакции

1-CLZ <-> CLZ+ft

2-CLZ+His" "CLZ~+His

3-CLZ+OH"« CLZ"+H.O

Переходное Путь состояние реакции

Рис. 7 - Энергетические схемы реакции депротонирования целентеразина

Рис. 6 - Механизм образования 2-гидропероксицелентеразина и энергетическая диаграмма данного процесса

Образование CLZ(2H) может проходить по анионному механизму из структуры CLZ(IH) или CLZ(7H). Первым шагом данной реакции является депротонирование целентеразина в положении N(7) или N(1) (рис. 7). Из энергетической схемы реакции (рис. 7) видно, что депротонирование CLZ может происходить в присутствии Ofl(-) или аниона аминокислоты. Далее происходит переход заряда с положения N(7) или N(1) в положение С(2).

В работе [6] предполагалось, что образование HP-CLZ может происходить через образование аниона CLZ. Согласно данной схеме проводилось моделирование процесса присоединения молекулы кислорода к аниону. В соответствии с квантово-химическими расчетами, если молекулярный кислород находится вблизи атома С(2), на котором находится заряд -1, то при оптимизации геометрии данного кластера происходит циклизация, с последующим образованием структуры соответствующей конечным продуктам реакции — CLM и С02. Следовательно, образование гидроперекиси HP-CLZ может происходить только из незаряженной формы.

6 Kondo. Н.; Igarashi. Т.; Maki, S.: №wa. Н.; Ikeda, Н.; Hirano. Т. //Tetrahedron Lett., Vol. 46, N. 45. - 2005. - P. 7701 -7704

Соответственно, следующая стадия - присоединение протона в положение С(2). Энергетическая схема данного процесса представлена на рисунке 8. Для образования CLZ(2H) из аниона необходимо присутствие аминокислоты, которая может отдать протон. Тогда реакция идет или с более низким барьером (в случае присутствия воды) или безбарьерно (в случае присутствия His(+)).

г; ьг

■340 ;

I 1

I | « »

I I

..............;..2\

265 а \ \

...........ы

120,7/ \\

1-CLZ"+His « CLZ(2H)+His~

2-CLZ~+H+~CLZ(2H)

3-CLZ>H20" CLZ(2H)+OH"

4-CLZ~+His+ « CLZ(2H)+His

ДН

Переходное Путь состояние реакции

Рис. 8 - Энергетические схемы процесса протонирования аниона целентеразина

Таким образом, можно сделать вывод, что

формирование целентеразина в форме С1^(2Н) происходит через образование аниона (рис. 9). Первым шагом реакции идет депротонирование целентеразина аминокислотным окружением. Роль «основания» может играть аминокислота НЫ75, которая лежит в области пиразиноновых колец.

V-T

И J *

H

Rf

i

II J / \ \

\His7

I

il J -

V

К

н н

2 3 4 5

Рис. 9 - Схема анионного механизма образования целентеразина в форме CLZ(2H).

Из структуры белка видно, что рядом с His 175 находится аминокислота, содержащая ионизированную -СОО* ' группу, которая она может отобрать у His 175 водород, переводя его в заряженную форму, которая, в свою очередь, забирает водород у целентеразина (рис. 9.1). На депротонирование целентеразина необходимо затратить 11 кДж/моль (рис. 7). Далее происходит перход заряда с атома азотаN(7) на атом углерода С(2) (Е^ ~ 1,5 кДж/моль). Затем анион целентеразина CLZ(2-) протонируется аминокислотным окружением (рис. 9.5). Данный процесс происходит без затрат энергии (рис. 8). Данный результат хорошо согласуется с экспериментом, согласно которому замена аминокислоты His 175 приводит к резкому падению активности фотопротеина.

В четверти главе рассматривается влияние ван-дер-ваальсового взаимодействия на процесс активации молекулой кислорода CLZ. Для того чтобы

13

выяснить, что является движущей силой образования НР-С1^£ и какая среда является оптимальной для активации целентеразина кислородом, мы провели оптимизацию геометрии кластера, включающего целентеразин, кислород, воду и несколько аминокислот ШэШ, Н1э64, Туг138 и Туг190 (код РОВ - К^УО). Ван-дер-ваальсовы силы могут играть ключевую роль в процессе активации целентеразина. Поэтому для расчетов были использованы полуэмпирические квантово-химические методы, включающие ван-дер-ваальсово взаимодействие и водородные связи.

В качестве отправной точки расчетов были взяты молекулы целентеразина и на различном удалении от атома С(2) молекула кислорода в основном триплетном состоянии. Данные расчёты (табл. 4) показывают, что целентеразин в присутствии 02 не формирует стабильного комплекса. Более того, в процессе оптимизации геометрии молекула кислорода всегда удалялась от С(2) атома целентеразина на 3,6 А и более (рис. 10).

Табл. 4 - Энергетические характеристики образования кластера и расстояние до молекул кислорода и воды

Кластер ЛЕ, кДж/моль Расстояние до 02, A Расстояние до H20, А

CLZ-02-H20-Tyrl38-Hisl75 -93,82 2,33'' 3,01

CLZ-02-Tyrl38-Hisl75 -37,44 2,39 —

CLZ -H20 -Tyrl38 -Hisl75 -84,67 — 1,98

CLZ—02—H20—Tyrl38 -64,97 2,33 2,86

CLZ-02-Tyrl38 -24,90 2,44 —

CLZ—H20—Tyrl38 -66,19 — 2,87

CLZ-02 0,38 3,60 —

CLZ-H20 -20,05 __ 3,10

clz-o2-h2o -21,49 2,94 2,33

Далее к данной модели добавлялись различные молекулы: гистидин, тирозин и вода в различных позициях и комбинациях. Аминокислоты были выбраны и расположены в кластере в соответствии с аминокислотными остатками в кристаллической структуре обелина - Hisl75, His64, Туг138 и Tyrl90. Оптимизация геометрии молекул при различных положениях полярных молекул (Туг или вода) и кислорода относительно молекулы целентеразина приводит к тому, что все структуры попадают в одно положение на поверхности потенциальной энергии, в которой кислород располагается напротив с С(2)-Н, а полярная молекула - напротив N(1) атома. Расстояние между молекулой кислорода и целентеразином равно 2,ЗА, выигрыш энергии при этом достигает 20 кДж/моль.

Рис. 10. Образование комплекса целентеразина с молекулой кислорода при различном окружении.

Была проведена оптимизация кластера, содержащего целентеразин, кислород и воду. При последовательном расположении молекулы воды на различные расстояния от N(1) азота целентеразина (3-10 Â), при фиксированном расстоянии до кислорода 2,4 À, оптимизация приводит к тому, что молекула воды приближается к N(1) азоту целентеразина на 3 Â когда она находиться на расстоянии до 5 Â. В результате близкого положения молекулы воды N(1) азот целентеразина поляризуется и формируется стабильный комплекс между гделентеразином и кислородом.

Для проверки влияния полярных молекул на стабилизацию кластера «CLZ—Ог» была проведена замена тирозина около N(1) азота на фенилаланин. В ходе оптимизации молекула кислорода отошла от С(2)-Н связи на достаточно большое расстояние (>5 к). Из данных расчётов видно, что для формирования устойчивого комплекса между водородом С(2)-Н и молекулой кислорода необходимо наличие полярной молекулы у атома N(1). Полярная молекула влияет на атом N(1) который в свою очередь, с помощью индукционного эффекта перераспределяет заряд в пиразиновом кольце. Данный эффект вызывает появление мгновенного диполя на молекуле кислорода, что приводит к ее приближению к С(2)-Н связи.

В пятой главе проводится изучение физико-химических процессов, происходящих при флуоресценции фотопротеинов.

Так как конечная структура CLM (рис. 11) является эммитером флуоресцентной реакции, то знание точной геометрии структуры становится особенно важным. Даже небольшие изменения в атомной структуре приводят к достаточно большим Рис. 11 - Строение целентерамида сдвигам в спектрах поглощения.

'а

I-V

14

Поэтому, необходимо выяснить насколько сильно в данной структуре проявляются корреляционные эффекты и нужно ли в дальнейшем их учитывать или можно использовать только одноэлектронные приближения. В таблице 5

15

представлено сравнение длин связей рассчитанных структур относительно эксперимента.

Табл. 5 - Сравнение геометрии, полученной различными методами, для незараженной формы целентерамида, А. Номера связи соответствуют рис. 11

Метод расчета Номер связи РМЗ РМ6 HF DFT МР2

- CI - CI

2-3 0,02 0,02 0,03 0,03 0,00 0,02 0,03

3-4 -0,01 -0,01 0,00 0,00 -0,02 -0,01 -0,01

4-5 -0,02 Г^оГ"1 -0,02 1 -0,02 -0,03 -0,02 -0,02

5-6 0,01 0,01 0,02 0,02 0,01 0,02 0,02

6-7 -0,04 -0,04 -0,03 -0,03 -0,02 -0,02 -0,03

7-8 0,00 0,00 "одю 0,00 -0,04 -0,02 -0,01

8-9 0,01 0,01 0,01 0,01 -0,03 -0,01 0,00

9-10 0,01 0,01 0,03 1 0,03 0,00 0,01 0,01

10-11 0,02 0,02 0,02 0,02 -0,03 0,00 0,00

11-12 -0,01 -0,01 -0,01 -0,01 -0,04 -0,03 -0,02

12-7 0,03 0,03 0,04 0,04 0,00 0,02 0,02

10-13 0,09 0,07 0,07 0,07 0,05 0,05 0,05

13-16 0,09 0,10 0,07 0,08 0,02 0,03 0,03

<т* 0,038 0,037 0,031 0,032 0,026 0,024 0,024

В системе связей с N(1) полуэмпирический метод показывает сильное отклонение от экспериментальной структуры. Но при расчете данной связи достаточно сильное отклонение от эксперимента (0,05 А и более) показывают все методы. Вероятно, это связано с тем, что атом кислорода 0(3) оттягивает на себя электронную плотность, приводя, тем самым, к искажению структуры. Метод Хартри-Фока сильно ошибается при расчете длин связей азота и кислорода. Полуэмпирический метод немного улучшает результаты, но тоже допускает ошибки в связях с азотом. Но полуэмпирические расчеты учитывают водородные связи и ван-дер-ваальсово взаимодействие, что дает им преимущество перед ab-initio методами.

При сравнении длин связи структур CLM, рассчитанных в возбужденном (¥*) и основном (%) состоянии (рис. 12) видно, что значения сильно меняются на фенольном и пиразиновом кольцах. Этими изменениями в геометрии можно объяснить большой Стоксов сдвиг в спектре флуоресценции 140 нм), они показывают участие атомов этих колец в перераспределении полученной энергии

возбуждения. Стоит отметить, что при оптимизации геометрии полуэмпирическими методами с учетом электронных корреляций данная область молекулы СЬМ описывается достаточно хорошо (табл. 5). 1.6

2 1.5

1.4

Li

1.2

1.1

0.9

—основное состояние СХМ Д ■ (ипоужлеииое сосюннне С1.М

аДа А

|Г:

1LN "О NsJ4

ifl Л1> Н

Стоксок сдвмг~ 140 им ,4-ы.

0 I 2 3 4 5 6 7 8 Ч 10 1112 13 14 15 16 Номер химической сои»!

Лзбс=360 им Л«*т=500 лм Б

Рис. 12. А - Сравнение длин связей структур СЬМ в основном и возбужденном состояниях, рассчитанных методом КВ РМЗ.

Б - Схема процессов, происходящих в процессе флуоресценции

В работе [7] при исследовании флуоресценции целентерамида и его аналогов в различных растворителях было установлено, что в зависимости от растворителя возбужденный целентерамид может образовывать несколько ионных форм (рис. 4). В таблице б представлены результаты расчетов длин волн флуоресценции для всех возможных форм целентерамида в вакууме и в аминокислотном окружении.

Табл - 6. Длина волны люминесценции целентерамида и его форм

Центральная молекула PM3 нм

Без окружения, нм В присутствии окружения Храсч, HM

CLM 329 343 387-409

CLM-Pyr 483 520 530-565

CLM-Amid 379 430 435-458

7 Shimomura О., Teranishi К. Light-emitters involved in the luminescence ofcoelenterazine // Luminescence. Vol. 15. -2000. - P. 51-58

Данные расчетов длины волны излучения целентерамида в вакууме без окружения значительно расходится с экспериментально полученными значениями для структур СЬМ, СЬМ-руг и СЬМ-апнё. Поэтому была построена кластерная модель белка (рис. 13).

В модель было включено ближайшее аминокислотное окружение полости, в которой находится целентерамид, в предположении, что оно может сильно влиять на возбужденное состояния СЬМ. При моделировании системы аминокислотное окружение было зафиксированным и играло роль электростатического поля. Рассчитывалась молекула целентерамида (около 50 атомов) в ее ближайшем аминокислотном окружении на расстоянии 4-5 А от атомов целентерамида, всего около 500 атомов. Из данных таблицы 6 видно, что длины волн для данных форм близки к экспериментальным значениям, полученным для этих форм в различных растворителях, но не подходят под экспериментальное значение флуоресценции обелина (максимум 495-510 нм). Таким образом, эти формы не подходят на роль эмиттера.

При моделировании фенолят-аниона в результате отрыва протона образуется анион с отрицательным зарядом на фенолыюм кислороде. Кислород образует двойную связь с образованием «хинонной» группы, что приводит к перестройке структуры с образованием пиразин-аниона. В этой связи структуру фенолят-аниона невозможно рассчитать. Поэтому была построена модель, основанная на следующих приближениях: полученная энергия в ходе флуоресценции (3,5 эВ), идет на перемещение протона. Моделирование проводилось следующим образом. Протон помещали в различные положения между двумя крайними позициями, расстояние между которыми составляло 2,8 А (рис. 14).

у--/

Рис. 13 - Построение кластера фотопротеина

ЕаьГ3.6 еУ л~360 nm

Ел~2.5 eV /,=480-530 nm

hv-ЗбОшп hvfl~500nm

Рис. 14 - Моделирование процесса переноса водорода между эмиттером и His22.

Табл. 7 - Длины волны флуоресценции в зависимости от положения протона

Расстояние CLM — Н, А F эВ 1. • нм

0,92 3,62 343

1,3! 3,62 343

1,36 3,62 343

1,40 3,65 340

1,47 3,42 363

1,50 3,27 380

1,56 2,97 ^417

1,60 2,79 445

1,63 12,65 469

1,64 2,53 492

1,78 1,63 763

1,85 1,96 633

1,90 2,00 620

1,96 2,02 615

2,02 2,04 610

В каждом положении отдельно проводился расчет основного и возбужденного состояния (табл. 7). Данная схема позволяет смоделировать процесс образования комплекса с переносом протона, который получил название "Ion-pair proton transfer" и который образуется при биолюминесценции Са2+-регулируемых

фотопротеинов. Расстояние 0,92 А между кислородом и протоном соответствует равновесной геометрии основного состояния нейтральной формы целентерамида. Энергия перехода в данном состоянии 3,6 эВ (340 нм). Полученная энергия тратится на перемещение протона и возбуждение системы. Экспериментально излучение системы происходит в районе 2,5 эВ (-500 нм), что в наших расчетах соответствует положению протона посередине между целентерамидом и гистидином (-1,65 А). Нахождение протона на расстоянии большем, чем 1,8 А, показывает энергию перехода в районе 1,52,0 эВ (-600-700 нм).

В спектре флуоресценции данные длины волн не наблюдаются, это связанно с тем, что перемещение на расстояние более 1,8 А требует дополнительных затрат энергии.

Таким образом, процесс флуоресценции Са2+-разряженного обелина хорошо моделируется перемещением протона от кислорода фенольной группы СЬМ до азота аминокислоты Шз22. Вероятнее всего, что аналогичный процесс имеет место и при биолюминесцентной реакции фотопротеинов. По-видимому, спектр биолюминесценции также определяется положением протона между атомом кислорода фенольной группы СЬМ в возбужденном состоянии и атомом азота 111522. С помощью квантово-химических методов было проанализировано влияние ближайшего аминокислотного окружения на длину волны излучения нейтральной формы целентерамида. При расчете СЬ2 без окружения длина волны излучения составляет 375 им. Присутствие аминокислотного окружения сдвигает длину волны на 6 нм (381 нм). Особенно сильное влияние наблюдается от молекул воды, 111522, Тгр92. Каждая из этих аминокислот по отдельности сдвигает длину волны на 1-2 нм (376-377 нм), а при совместном присутствии - на 4 нм (379 нм). Можно сделать вывод, что, хотя аминокислотное окружение не связано с центральной молекулой целентерамида, оно электростатически действует на него, сдвигая длину волны.

выводы

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. Проведены расчеты различных изомерных форм цслентеразина методами одиоэлектронного приближения и с учетом электронных корреляций. Показано, что учет электронных корреляций дает структуру более близкую к экспериментальной и позволяет выбрать форму целентеразина С1^(1Н) как наиболее вероятную из возможных изомерных форм. Цслентеразин в протонных растворителях находится в изомерной форме (Х2(Ш), в апротонпьтх - в форме (Х2(7Н). Образование формы СЬХ(2Н) в растворителях не происходит. В отличие от растворителей, а белке обелине целеитеразин находится в форме СЬ2(2Н). Активация целентеразина молекулой кислорода с образованием молекулы НР-СЬ2 возможна только для структуры СЦ£(2Н). Изомерная форма ССЩН) может образовываться только при захвате целентеразина белковым окружением.

2. Показано, что ван-дер-ваальсово взаимодействие влияет на процесс формирования НР-СЬг. Присутствие полярной молекулы, которая благодаря индукционному эффекту перераспределяет заряды в молекуле целентеразина, приводит к стабилизации комплекса «С1^£-02». Рассчитана энергия активации реакции образования НР-СЬг. Барьер для реакции составляет 68 кДж/моль, ДН = 60 кДж/моль, что хорошо согласуется с экспериментальными данными: Еакт = 57,4 кДж/моль, ДН = 55 кДж/моль.

3. Построена физическая модель флуоресценции фотопротеина обелина, в которой рассчитаны электронные структуры молекул (ХМ в основном и возбужденном состояниях с учетом электронных корреляций методом конфигурационного взаимодействия. Рассмотрено пять возможных вариантов возбужденных состояний (ХМ в процессе флуоресценции. Показано, что экспериментально наблюдаемая длина волны излучения 500 нм соответствует «комплексу с переносом протона» между кислородом целентерамида и гистидином Шз22.

Список публикаций:

1. Tomilin F.N., Antipina L.Yu., Vysotski E.S., Ovchinnikov S.G., Gitelzon I.I. Fluorescence of Calcium-Discharged Obelin: The Structure and Molecular Mechanism of Emitter Formation. // Doklady Biochemistry and Biophysics, Vol. 422. - 2008. - P. 279— 284.

2. Томилип Ф. H., Антипина Л.Ю., Высоцкий Е.С., Овчинников С.Г., Гительзон И.И. Механизм формирования эммитера флуоресценции кальций-разряженного обелина. // Биофизика, том 54, вып. 4. - 2009. - С. 630-637.

3. Овчинников С. Г., Антипина Л. Ю., Томилин Ф. Н., Кузубов А. А. Влияние электронных корреляций на структуру субстратов фотопротеинов // Письма в ЖЭТФ, Т. 91, № 9. - 2010. - С. 536 - 540.

4. Tomilin F. N., Antipina L. U., Eremeeva E.V., Ovchinnikov S. G., Vysotski E. S. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation // Luminescence, Vol. 25, No. 2.-2010. - P. 210-211

5. Tomilin F.N., Antipina L.U., Ovchinnikov S.G., Vysotski E.S. The theoretical studies of light emitters in bioluminescence of Ca2+-regulated photoprothin obelin // Luminescence, March-April 2008, V.23, Issue № 2, P. 96.

6. Томилин Ф.Н., Антипина Л.Ю., Высоцкий E.C., Овчинников С.Г. Исследование реакции образования гидроперекиси целентеразина Са2+-регулируемого фотопротеина Obelia Longissima // Сборник материалов IV школы-семинара молодых ученых «Квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул», Иваново, 20-22 мая 2009, стр. 166-169.

7. Антипина JI.IO., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г. Теоретическое изучение люминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина обелина // НКСФ-XXXVI (2007), тезисы докладов научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых физиков. Красноярск, 13-14 апреля 2007 г. КГУ. Стр. 77.

8. Антипина Л.Ю., Качин C.B., Томилин Ф.Н. Квантово-химическое изучение биолюминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина обелина // Тезисы VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и Химическая технология в XXI веке», 14-15 мая 2007г., Томск, ТПУ. С. 251-252.

9. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г. Теоретическое изучение флуоресценции в Са2+-регулируемом фотопротеине обелине Н Тезисы XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2008г. С. 64

10. Томилин Ф., Антипина Л., Высоцкий Е., Овчинников С. Квантово-химическое моделирование процесса флуоресценции кальций-разряженного

обелина // Тезисы V съезда Российского фотобиологического общества, международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 8-13 июня 2008г. С. 115

11. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Изменение структуры субстратов белков, выделенных из ОЬеНа Ьли^эта и НепШа Мие11еп // Тезисы 12-ой международной пущенской школы-конференции молодых ученых «Биология в XXI веке, Пущино, 10 - 14 ноября 2008, стр. 258

12. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Исследование механизма получения субстрата белков ОЬеНа Ьогщ1'з51'та и КетНа Мие11еп // Тезисы XX Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 1526 сентября 2008, стр. 92

13. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Теоретическое изучение процесса активации кислородом субстрата фотопротеина обелина // Тезисы XXI Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 25 сентября - 06 октября 2009, стр. 313.

14. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Влияние аминокислотного окружения па длину волны целентеразина, выделенного из ОЬеНа Ьо[Ш5Х1та // Тезисы 13-ой международной пущенской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 28 сентября - 02 октября 2009, стр. 258

Подписано в печать 09.06.2010 Формат 60x84x16. Усл.печ.л. 1. Тираж 60 экз. Заказ № 19 Отпечатано в типографии Института физики СО РАН 660036, Красноярск, Академгородок 50, стр. 38, ИФ СО РАН

Основные результаты опубликованы в работах [108-121] и заключаются в следующем:

1. Проведены расчеты различных изомерных форм целентеразина методами одноэлектронного приближения и с учетом электронных корреляций. Показано, что учет электронных корреляций дает структуру более близкую к экспериментальной и позволяет выбрать форму целентеразина СЬ2(1Н) как наиболее вероятную из возможных изомерных

I 4 форм. Целентеразин в протонных растворителях находится в изомерной форме СЬ2(1Н), в апротонных - в форме СЬ7(7Н). В отличие от растворителей, в белке целентеразин находится в форме СЬ2(2Н). Активация целентеразина молекулой кислорода с образованием молекулы НР-СЬ2 возможна только для структуры СЬг(2Н).

2. Показано, что ван-дер-ваальсово взаимодействие влияет на процесс формирования НР-С1^. Присутствие полярной молекулы, которая благодаря индукционному эффекту перераспределяет заряды в молекуле целентеразина, приводит к стабилизации комплекса «С1^-02». Рассчитана энергия активации реакции образования НР-СЬ2. Барьер для реакции составляет 68 кДж/моль, АН = 60 кДж/моль, что хорошо согласуется с экспериментальными данными: Еакт = 57,4 кДж/моль, АН = 55 кДж/моль.

3. Построена физическая модель флуоресценции фотопротеина обелина, в которой рассчитаны электронные структуры молекул СЬМ в основном и возбужденном состояниях с учетом электронных корреляций^ методом конфигурационного взаимодействия. Рассмотрено пять возможных вариантов возбужденных состояний СЬМ в процессе флуоресценции. Показано, что экспериментально наблюдаемая длина волны излучения 500 нм соответствует «комплексу с переносом протона» между кислородом целентерамида и гистидином Н1б22.

1. Лабзовский Л.Н. Влияние электронной корреляции на структуру и свойства ДНК // Теоретическая и экспериментальная химия, Т. 5, вып. 2. -1969.-С. 260-263

2. Лабзовский Л.Н. Влияние электронной корреляции на реакционную способность сопряженных молекул // Теоретическая и экспериментальная химия, Т. 4, вып. 4. 1968. - С. 545 — 548

3. Лабас Ю. Белки, которые потрясли мир // Газета «Биология», №30 (608), 2001.

4. Shimomura О. The discovery of aequorin and green fluorescent protein // Journal of Microscopy, Vol. 217. 2005. - P. 3 - 15

5. Grosvenor A.L., Crofcheck C.L., Anderson K.W., Scott D.L., Daunert S. Calibration of micropipets using the bioluminescent protein aequorin // Anal. Chem., Vol. 69.- 1997.-P. 3115-3118

6. Лабас Ю.А., Гордеева A.B., Фрадков А.Ф. Флуоресцирующие и цветные белки // Природа, № 3.- 2003. С. 34 - 43

7. Photoproteins in bioanalysis. Edited by S. Daunert, S.K. Deo. John Wiley & Sons Inc. - 2006. - P. 25

8. Predergast F.G. Structural biology: Bioluminescence illuminated // Nature, No. 405. 2000. - P. 291 - 293

9. Head J.F., Inouye S., Teranishi K., Shimomura O. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution // Nature, Vol. 405. 2000. - P. 372-376

10. Usami, K., Izobe M. Low-temperature Photooxygenation of Coelenterate Luciferin Analog Synthesis and Proof of 1,2-Dioxetanone as Luminescence Intermediate // Tetrahedron, Vol. 52, № 37 1996. - P. 12061— 12090

11. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. Photoprotein Obelin Ca2+-activated photoproteins // Nucleic Acids Research, Vol. 28. 2000. - P. 235-242

12. Campbell A.K. Save those molecules! Molecular biodiversity and life // J. of Applied Ecology, Vol. 40. 2003. - P. 193 - 203 '

13. Johnson P.C., Ware A., Cliveden P.B., Smith M., Dvorak A.M., Salzman E.W. Measurement of ionized calcium in blood plateles with the photoprotein aequorin // J. of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 4. — 1985. P. 2069-2076

14. Knight M.R., Read N.D., Campbell A.K., Trewavas A J. Imaging calcium dynamics in living plants using semi-synthetic recombinant aequorins // The Journal of Cell Biology, Vol. 121, No. 1. 1993. - P. 83-90

15. Rudolf R., Mongillo M., Rizzuto R., Pozzan T. Looking forward to seeing calcium // Nature Reviews. Molecular cell biology, Vol. 4. 2003. - P. 579 -586

16. Shimomura O. Bioluminescence. Chemical Principles and Methods. -World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 2006. - P. 470

17. Nakai S., Yasui M., Nakazato M., Iwasaki F., Maki S., Niwa H., Ohashi M., Hirano T. Fundamental studies on the structure and spectroscopic properties of imidazol,2-a.pyrazin-3(7H)-one derivatives // Bull.Chem.Soc.Jpn., Vol. 76. 2003. - P. 2361 - 2387

18. Hori К., Anderson J.M., Ward W.W., Cormier M.J. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsin // Biochemistry, Vol. 14, No. 11. 1975.-P. 2371-2376

19. Vysotski, E.S., Lee J. Ca2+-Regulated Photoproteins: Structural Insight into the Bioluminescence Mechanism // Accounts of Chemical Research, Vol. 37, No. 6.-2004.-P. 405-415

20. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са2+-связывающие белки. Часть 1. • Классификация и структура // Соросовский образовательный журнал, №5. -1998.-С. 2-9

21. Goto, T. Chemistry of bioluminescence // Pure Appl. Chem., Vol. 17. -1968.-P. 421-441

22. Goto Т., Inoue S., Sugiura S. Cypridina bioluminescence. IV. Synthesis and chemiluminescence of 3,7-dihydroimidazol,2-a.pyrazin-3-one and its 2-methyl derivative. // Tetrahedron Lett. 1968. - P. 3873-3876

23. Shimomura O., Teranishi K. Light-emitters involved in theluminescence of coelenterazine // Luminescence, Vol. 15. 2000. - P. 51-5882

24. Белогурова Н.В., Кудряшева HlC., Сизых А.Г. Спектральный и кинетический анализ биолюминесцентной реакции обелина // Вестник КГУ, №4.-2005. С. 99-104

25. McCapra F., Chang Y.C. The Chemiluminescence of a Cypridina Luciferin Analogue // Chemical Communications, Vol. 19. 1967. - P. 1011-1012

26. Tricore L., Tsuzuki K., Courjean O., Gibelin N., Bourout G., Rossier J., Lambolez B. Calcium dependence of aequorin bioluminescence dissected by random mutagenesis // PNAS, Vol. 103, No. 25. 2006. - P. 9500 - 950

27. Bondar V.S., Frank L.A. Bioluminescent activity of the recombinant obelin after chemical modification of histidine and cysteine residues. // Bioluminescence and chemiluminescence: Perspectives for the 21st century. -1999.-P. 400-403

28. Ohmiya Y., Tsuji F. Bioluminescence of the Ca(2+)-binding photoprotein, aequorin, after histidine modification // FEBS, Vol. 320. 1993. - P. 270-297

29. Liu Z.-J., Vysotski E.S., Chen C.-J., Rose J.P., Lee J., Wang B.-C. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 Â resolution- determined directly from its sulfur substructure // Protein Science, Vol. 9. 2000. - P. 2085 -2093

30. Stepanyuk G.A., Marcova S.V., Liu Z.J., Frank L.A., Lee J., Wang B.C. Coelenterazine-binding protein or Renilla muelleri: cloning and determination of three-dimensional structure // Luminescence, Vol. 21. 2006. - P. 292

31. Hori, K., Charbonneau H., Hart R.C., Cormier M.J. Structure of native Renilla reniformis luciferin // Proc.Natl.Acad.Sct.USA, Vol. 74, N. 10. 1997. -P., 4285-4287

32. Фларри P. Квантовая химия. M.: Мир. - 1985. - 472 с.

33. Мелешина A.M. Курс квантовой механики для химиков. Изд-во ВГУ, Воронеж. - 1974. - 380 с

34. Мелешина A.M. Курс квантовой химии. Учебное пособие. -Воронеж: Изд-во ВГУ. 1974. - 200 с

35. Минкин В.И., Симкин Б.Я., Миняев P.M. Теория строения молекул. Ростов-на-Дону: Феникс. - 1997. - 560 с

36. Сизова О.В., Панин А.И., Барановский В.И. Практика неэмпирических расчетов. СПб.: НИИХ СПбГУ. - 2000. - 115 с

37. Сизова О.В., Барановский В.И. Компьютерное моделирование молекулярной структуры. СПб.: НИИХ СпбГУ. - 2000. - 127 с

38. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика: Учеб. Пособие для вузов. В 10 т. Т. III. Квантовая механика (нерелятивистская теория). 4-е изд., испр. - М.: Наука. - 1989. - 768 с

39. Аврамов П.В., Овчинников С.Г. Квантово-химическое и молекулярно-динамическое моделирование структуры и свойств углеродных наноструктур. Мультимедийное издание. Изд-во СО РАН, Новосибирск. -2000, 15 печ. листов.

40. Фудзинага С. Метод молекулярных орбиталей: Пер. с японск. -М.: Мир.-1983-461 с.

41. Эпштейн С. Вариационный метод в квантовой химии. — М.: Мир. -1977.-362 с.

42. Жоголев Д.А., Волков В.Б. Методы, алгоритмы и программы для квантовохимических расчетов молекул. Киев: Наукова думка. - 1976. -212 с.

43. Кларк Т. Компьютерная химия: Пер. с англ. М.: Мир. - 1990.383 с

44. Knight M.R., Read N.D., Campbell А.К., Trewavas А.Т. Imaging calcium dynamics in living plants using semi-synthetic recombinant aequorins // The Journal of Cell Biology, Vol. 121, No. 1. 1993. - P. 83 - 9

45. Kallies В., Mitzner R. The Ability of the Semiempirical PM3 Method to Model Proton Transfer Reactions in Symmetric Hydrogen Bonded Systems // J. Mol. Model, Vol. 1.-1995.-P. 68-78

46. Monecke P., Friedemann R., Naumann S., Csuk R. Molecular Modelling Studies on the Catalytic Mechanism of Candida Rugosa Lipase // J. Mol. Model, Vol. 4. 1998. - P. 395 - 404

47. Murray-Rust P., Rzepa H. S., Stewart J.J.P., Zhang Y. A global resource for computational chemistry // J Mol Model, Vol. 11. 2005. - P. 532541

48. Holzwarth A.R., Schaffner K. On the structure of bacteriochlorophyll molecular aggregates chlorosomes of green bacteria. A molecular modelling study // Photosynthesis Research, Vol. 41. 1994. - P. 225-233

49. Harb W., Bernal-Uruchurtu M. I., Ruiz-Lopez M. F. An improved semiempirical method for hydrated systems // Theor Chem Acc, Vol. 112. — 2004. -P. 204-216

50. Gedeck P., Schindler Т., Alex A., Clark T. New Multicentre Point Charge Models for Molecular Electrostatic Potentials from Semiempirical MO-Calculations // J. Mol. Model, Vol. 6. 2000. - P. 452 - 466

51. Balcioglu N., Sevin F. A Comparative Semiempirical, Ab initio and DFT Study of Decarbonylation of Cyclic Ketones Part 1: Thermal Fragmentation of Cyclopropanone // J. Mol. Model, Vol. 6. 2000. - P. 48 - 54

52. Полуэмпирические методы расчета электронной структуры. Т.1 / Перевод E.JI. Розенберга, A.M. Бродского. Изд-во «Мир» Москва. - 1980. -327 с

53. Zerner М.С., Loew G.H., Kirchner R.F., Mueller-Westerhoff U.T. An intermediate neglect of differential overlap technique for spectroscopy of transition-metal complexes. Ferrocene // J. Am. Chem. Soc., Vol. 102, No. 2. -1980. — P.589-599

54. Stewart J. J .P. Optimization of parameters for semiempirical methods I // J. Сотр. Chem., Vol. 10, No. 2. 1991. - P. 209-220

55. Stewart J.J.P. Optimization of parameters for semiempirical methods II //J. Сотр. Chem., Vol. 10, No. 2. 1991.-P. 221-264

56. Stewart J.J.P. Comparison of the, accuracy of semiempirical and some DFT methods for predicting heats of formation // J. Сотр. Chem., Vol. 10. 2004. -P. 6-12

57. Dewar M.J.S., Zoebisch E.G., Healy F.F., Stewart J.J.P. AMI: A new general purpose quantum mechanical molecular model // J. Am. Chem. Soc., Vol. 107, No. 13. 1985. - P. 3902-3909.

58. Murphy R.B., Philipp D.M., Friesner R.A. Frozen orbital QM/MM methods for density functional theory // Chem. Phys. Lett., Vol. 321, No. 2 2000. -P. 113-120

59. Stuart J.J.P. Optimization of parameters for semiempirical methods V: Modification of NDDO approximations and application to 70 elements // J.Mol.Model., Vol. 13.-2007.-P. 1172-1213

60. Уилсон С. Электронные корреляции в молекулах: Пер. с англ. -М.: Мир.-1987.-304 с.

61. Hohenberg P., Kohn W. Inhomogeneous Electron Gas // Phys. Rev. Lett., Vol. 136. 1964. - P. B864-B887

62. Kohn W. Sham L. Self-Consistent Equations Including Exchange and Correlation Effects // Phys. Rev. Lett., Vol. 140. 1965. - P. A1133-A1138

63. Кон В. Электронная структура вещества волновые функции и функционал плотности // Успехи физических наук., Т. 172, №3. - 2002. — С. 336-348

64. Perdew J.P., Wang Y. Accurate and simple analytic representation of the electron-gas correlation energy // Phys. Rev. В., Vol 45. 1992. - P. 1324413249

65. Vosko S.J., Wilk L., Nusair M. Accurate spin-dependent electron liquid correlation energies for local spin density calculations: a critical analysis // Can. J. Phys., Vol. 58.- 1980.-P. 1200-1211

66. Becke A.D. Density-functional exchange-energy approximation with correct asymptotic behavior// Phys. Rev. A., Vol. 38. 1988. - P. 3098-3100

67. Lee C., Yang W., Parr R.G. Development of the Colle-Salvetti correlation-energy formula into a functional of the electron density // Phys. Rev. В., Vol. 37. 1988. - P. 785-789

68. Becke A.D. A new inhomogeneity parameter in density-functional theory // J. Chem. Phys., Vol. 109, No. 6. 1998. - P. 2093-2098

69. Moller C., Plesset M.S. "Note on an Approximation Treatment for Many-Electron Systems" // Phys. Rev., Vol. 46. 1934. - P. 618-622

70. Jensen F. Introduction to Computational Chemistry. 2nd ed. John Wiley & Sons Ltd. - 2007. - P. 599

71. Becke A.D. Density Functional Thermochemistry. III. The Role of Exact Exchange // J. Chem. Phys., Vol. 98. 1993. - P. 5648-5652

72. Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A. et al. J.A. Montgomery

73. GAMESS»//J.Comp.Chem., Vol. 14. 1993.-P. 1347 - 136387

74. Kresse G. Ab initio molecular dynamics for liquid metals / G. Kresse, J. Hafner // Phys. Rev. B, Vol. 47, No. 1. -1993. P. 558 - 561.

75. Kresse G. Ab initio molecular-dynamics simulation of the liquid-metal-amorphous-semiconductor transition in germanium / G. Kresse, J. Hafner // Phys. Rev. B, Vol. 49, No. 20. 1994. - P. 14251 - 14269.

76. Kresse G. Efficient iterative schemes for ab initio total-energy calculations using a plane-wave basis set / G. Kresse, J. Furthmüller // Phys. Rev. B, Vol. 54,No. 16,- 1996. -P. 11169-11186.

77. Baker J. An Algorithm for the Location of Transition States // J. Comp. Chem, Vol. 7, No. 4. 1986. - P. 385 - 395

78. Peng C., Schlegel H.B. Combining Synchronous Transit and QuasiNewton Methods to Find Transition States // Israel Journal of Chemistry, Vol. 33. 1993.-P. 449-454

79. Ward W.W., Cormier M.J. Extraction of Renilla-type luciferin from the calcium-activated photoproteins aequorin, mnemiopsin, and berovin // Proc.Nat.Acad.Sct. USA, Vol. 72, No. 7. 1975. - P. 2530-2534

80. Cossi M., Barone V., Cammi R. Tomasi J. Ab initio study of solvated molecules: a new implementation of the polarizable continuum model // Chem.Phys.Lett., Vol. 255. 1996. - P. 327 - 330.

81. Barone V., Cossi M., Tomasi J. A new definition of cavities for the computation of solvation free energies by the polarizable continuum model // J.Chem.Phys., Vol. 107. 1997. - P. 3210 - 3217

82. Nakatani N., Hasegawa J., Nakatsuji H. Red Light in

83. Chemiluminescence and Yellow-Green Light in Bioluminescence: Color-Tuning

84. Mechanism of Firefly, Photinus pyralis, Studied by the Symmetry-Adapted88

85. Cluster-Configuration Interaction Method'// JAGS, Vol. 129; 2007. - P. 8756-8765

86. Casida M.E., Salahub D.R. Asymptotic correction approach to improving-approximate exchange-correlation potentials: Time-dependent density-functional theory calculations of molecular excitation spectra // J. Chem. Phys., Vol. 113.-2000.- P. 8918-8935

87. Appel F., Gross E.K.U., Burke K. Excitations in Time-Dependent Density-Functional Theory // Phys. ReV. Lett., Vol: 90. 2003. - P. 043005 -043009

88. Hsu, C.-P.; Hirata, S.; Head-Gordon, M. Excitation Energies from Time-Dependent Density Functional Theor/ for Linear Polyene Oligomers: Butadiene to Decapentaene// J. Phys. Chem. A, Vol. 105.-2001.-P. 451-458

89. Dreuw A., Weisman J.L., Head-Gordon M. Long-range charge-transfer excited states in time-dependent density functional theory require non-local exchange // J. Chem. Phys., Vol. 119. 2003. - P. 2943 - 2946

90. Milet A., Korona T., Moszynski R., Kochanski E. Anisotropic intermolecular interactions in van der Waals and hydrogen-bonded complexes: What can we get from density functional,calculations? // J. Chem. Phys., Vol. 111. -1999.-P. 7727-7735

91. Fujimoto K., Hayash S., Hasegawa J., Nakatsuji H. Theoretical Studies on the Color-Tuning Mechanism in Retinal Proteins // J. Chem. Theory Comput., Vol. 3.-2007.-P. 605-618

92. Minkin V.I., Olekhnovich L.P., Zhdanov Yu.A. Molecular Design of Tautomeric Compounds. D.Reidel Publ. Dordrecht-Boston-Tokyo-Toronto. -1987.-P. 280

93. Morrison' R., Boyd R. Organic Chemistry. A Paramount Communication Company, Englewood Cliffs, New Jersey. - 1992. - P. 547

94. Реутов О.А., Курд А.Л., Бутин К.П. Органическая химия. 4.1. Учебник М.: Изд-во МГУ. - 1999. - 560 с.

95. Roberts J.D., Caserio М.С. Basic Principles of Organic Chemistry, second edition. W.A., Benjamin, Inc., Menlo Park, CA. - 1977. - P. 1617

96. Deng L., Markova S.V., Vysotski E.S., Liu Z.-J., Lee J., Rose J., Wang B.-C. Crystal structure of a Ca2+-discharged photoprotein // The Journal of Biological Chemistry, Vol. 279, No. 32. 2004. - P. 33647-33652

97. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. — М.: Высшая школа. 1989. — 200 стр.

98. Кондон Э.Ю. Принцип Франка-Кондона и смежные вопросы // Успехи физических наук, Т. XXXV, вып: 1. 1948. — С. 35 - 51

99. Tomilin F.N., Antipina L.Yu., Vysotski E.S., Ovchinnikov S.G., Gitelzon I.I. Fluorescence of Calcium-Discharged Obelin: The Structure and Molecular Mechanism of Emitter Formation. // Doklady Biochemistry and Biophysics, Vol. 422. 2008. - P. 279-284.

100. Томилин Ф. H., Антипина Л.Ю., Высоцкий E.C., Овчинников С.Г., Гительзон И.И. Механизм формирования эммитера флуоресценции кальцийразряженного обелина. // Биофизика, том 54, вып. 4. 2009. - С. 630-637.90

101. Овчинников С. Г., Антипина JI. Ю., Томилин Ф. Н., Кузубов А. А. Влияние электронных корреляций на структуру субстратов фотопротеинов // Письма в ЖЭТФ, Т. 91, № 9. 2010. - С. 536 - 540.

102. Tomilin F. N., Antipina L. U., Eremeeva E.V., Ovchinnikov S. G., Vysotski E. S. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation // Luminescence, Vol. 25, No. 2. 2010. - P. 210-211

103. Tomilin F.N., Antipina L.U., Ovchinnikov S.G., Vysotski E.S. The theoretical studies of light emitters in bioluminescence of Ca2+-regulated photoprothin obelin // Luminescence, March-April 2008, V.23, Issue № 2, P. 96.

104. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г. Теоретическоеизучение флуоресценции в Са2+-регулируемом фотопротеине обелине //

105. Тезисы XX зимней международной молодежной научной школы

106. Перспективные направления физико-химической биологии ибиотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2008г. С. 6491

107. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Исследование механизма получения субстрата белков Obelia Longissima и Renilla Muelleri // Тезисы XX Симпозиума "Современная химическая физика", Туапсе, 15-26 сентября 2008, стр. 92

108. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Теоретическое изучение процесса активации кислородом субстрата фотопротеина обелина // Тезисы XXI Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 25 сентября 06 октября 2009, стр. 313.