Исследование строения и модификация агарозы из красной водоросли Ahnfelia tobuchiensis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. Зелинского

На правах рукописи

Калле Труус

УДК 547.458

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ И МОДИФИКАЦИЯ АГАРОЗЫ ИЗ КРАСНОЙ ВОДОРОСЛИ АИп/еМа ЫисЫеми

02.00.03 - органическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук в форме научного доклада

МОСКВА 1994

Работа выполнена в Институте химии Академии наук Эстонии

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

академик АН Эстонии, профессор | О.ЭЙЗЕн]

доктор химических наук

профессор

А.И.УСОВ

доктор химических наук И.А.ЧЛЕНОВ

Ведущая организация - Институт пищевых веществ

РАН

Защита диссертации состоится 1994 Г.

в .. ,4£е . ч. на заседании Специализированного совета К-002.62.02 до присуждению ученой степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского Российской Академии наук по адресу 117 334 Москва, Ленинский просп., 47.

С текстом доклада и работами диссертанта можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н.Д.Зелинского.

Афтореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

к-оог.62.ог

доктор химических наук

А

1

Григорьева Н.Я.

ОГЛЛВЛЕНИЕ

стр.

Общая характеристика работы ..................................................2

Содержание работы .............................-............б

1. Состав и Физико-химические свойства

агарозных матриц ........................................................................б

1.1. Брутто-дашше ....................................................................6

1.2. Содержание и локализация серы ....................................7

1.3. Неток си -группы..................................................................9

1.4. Никроэлеиентный состав ..................................................11

2. Уровни структуры агарозных матриц ......................................13

2.1. Первичная структура .................................13

2.2. Вторичная структура ........................................................16

3. Модифицирование матрицы агароэы ..........................................18

Выводы .............................................. 2 1

Список публикаций ................................... 22

Список цитируемой литературы ........................ 24

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

Л.*. - А1м£е1Ыа М1>ис111еп§1$

ДМСО - диметилсульфоксид

- тг - показатель эяектроэндосиоса

и.д. - миллионные доли

И.Е. - международная единица {иммунологической активности)

НАА - нейтронно-активационный анализ

ЭЭО - электроэндосмос

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с бурным развитием биохимии и молекулярной биологии, значение многочисленных методик для разделения биополимеров за последние два-три десятилетия существенно возросло. Среди них наиболее широкое применение нашли те методы-принципы жидкостной хроматографии (гель-фильтрация, аффинная хроматография) , электрофоретических и др. методик, в которых используются носители, имеющие сетчатые структуры.

г

В ряду базисных соединений для создания таких сорбентов особо выделяется линейный гелеобразующий полисахарид агароза некоторых красных морских водорослей, примем сетчатость обнаруживается на уровне третичной структуры гелей этого гликана. Главным достоинством углеводного скелета (матрицы) агарозы С1] является наличие макропористой, инертной структуры, обеспечивающей беспрепятственную диффузию для высокомолекулярных веществ и исключающей нежелательное взаимодействие матрицы с разделяемыми веществами. Агарозные гели имеют также высокую срочность при малых концентрациях и отличаются минимальной неспецифической адсорбцией.

Решающим фактором при определении пригодности агарозных сорбентов для разделения как биоактивных веществ (белков, нуклеиновых кислот и др.), так и их конгломератов (вирусов, антител, клеток) является сохранение нативности сепарированных объектов. Это весьма важное свойство (и преимущество) агарозных носителей зависит от индивидуальных структурных особенностей природной матрицы агарозы.

Полимерная цель агарозы является слабым полиэлектролитом, предельная структура которой установлена в результате исследований Араки, Арай, Хирасэ и др.; их основные выводы опубликованы в период с 1937 по 1956 гг. [г]. Согласно этим выводам, агароза является галактаном, линейные молекулы которого состоят из чередующихся З-О-связанных остатков р•Р-галактопираноэы и 4-0-свя-занных остатков 3,6-ангидро-о-Х-галактопиранозы (рис. 1)

й

А

Рис. 1. Элементарное звено предельной структуры агарозы

Эта принципиальная, идеализированная формула ьыражает лишь самые общие закономерности строения молекулы агароэк. Реальная структура рассматриваемого полисахарида всегда несколько отличается от идеализированной в зависимости от Сиологических особенностей используемого сырья (вида водорослл, cpfды обитания, климатических условий), технологии извлечения и очистки. Поэтому важные макроскопические показатели разных препар, тов агарозы (прочность геля, электрофоретические показатели и т.г.), которые интегрально отражают незначительные порой и срагмектарные отклонения в структура, довольно сильно расходятся.

Степень сохранения нативности биополимеров, разделяемых посредством агарозных сорбентов, зависит также от дополнительных заместителей (особенно заряженных), "маскирующих" регулярность предельной структуры (рис. 1), с одной стороны, и, от сложности молекул, подлежащих сепарированию, с другой. Следовательно, окончательным критерием пригодности конкретной агароэной матрицы в основе носителя является возможность ее применения для разделения наиболее чувствительных белков, например таких, которые обладают иммунологической активностью (т.е., применяются в качестве иммуносорбентов).

Коммерческие препараты агара и агарозы, выпускаемые разными Фирмами мира, производят на основе водорослей, относящихся к родам Gel Idlum, Gncllarla, Pterocladia и др. Однако в России и других странах СНГ эти водоросли малодоступны; единственным пригодным видом водоросли, в достаточной мере распространенной в этих странах, является AhnfeitJa tobuchlensls. Разными авторами Г3"5] эмпирически подтверждена пригодность этого вида для производства агара и агарозы. Но физико-химические свойства галактана, получаемого из этого природного источника, кроме реологических, изучены недостаточно. Не выявлены структурные особенности и состав матрицы этого полисахарида (вернее, спектра полисахаридов), имеющего большую практическую ценность. В строгом смысле, не доказана принадлежность экстрагируемых гелеобразующих полисахаридов к истинным агарам и агарозе.

В настоящее время гликаны, получаемые из Ahnfeltla tobu-chlensls, реально используются и для производства некоторых носителей аффинной хроматографии и гель-Фильтрации. Но при этом не исследованы характерные особенности матрицы этих галактанов

(например, содержание и локализация серы) и пределы ее применения.

Целью работу было разностороннее физико-химическое исследование матрицы гелеобразующих галактанов из Ahnfeltla tobuchlensls в сравнении с разными коммерческими препаратами агарозы, а также изучение возможностей модифицирования этой матрицы для создания иммуноссрбентов,

Основные задачи:

1. Исследовать состав и Физико-химические свойства галактана из Ahnfeltla tobuchlensls.

г. Охарактеризовать уровни структуры этой матрицы.

3. Модифицировать матрицу и синтезировать иммуносорбенты на ее основе.

Научная новизна, Сравнительный анализ с помощью 13С ЯМР-спектроскопии двух образцов истинной агарозы разного происхождения и очищенного галактана из Ahnfeltla tobuchlen-sls показал, что 12 основных сигналов, принадлежащих атомам углерода повторяющегося звена (рис.1), совпадают (в пределах +0,01 и.д.) во всех пробах. Полученные результаты позволяют устранить расхождения в литературных данных и доказывают принадлежность исследуемого галактана к истинной агарозе по первичной структуре. Установлено, что исследуемая агароза характеризуется содержанием метоксильных групп во втором положениии 3, б-ангидро-Ь-галактозного остатка.

Выработана воспроизводимая методика для ориентирования агарозных пленок, предшествующего рентгенографическому

исследованию. В результате последующего рентген-дифракционного анализа установлено, что периодичность двойной спирали галактана из Ahnfeltla tobuchlensls составляет 19 к. Эта величина совпадает со значениями, характерными для истинных агароз. Тем самым доказана Фундаментальная аналогия на вторичном уровне структур.

В результате применения анализа сульфатной серы, методов ИК-слектроскопии и электрофореза показано, что сульфатные группировки практически не удаляются из матрицы исследуемого галактана при многократной щелочной обработке, что указывает на их локализацию в составе 3, б-ангидроцякла матрицы.

Методами нейтронно-активационного анализа впервые охарактеризован процесс очистки агарозы от микроэлементов.

Налажен масштабируемый процесс модифицирования матрицы агарозы из А1м{е1Иа 1о£ис111епз1з этилсульфоновыми группами. Разработана методика количественного определения этих групп в составе матрицы. Модифицированная матрица оказалась пригодной для создания иммуносорбектов, что подтверждено работами С6,73•

Практическая ценность работы. Исследованная полисаха-рвдная матрица представляет существенный интерес как главная составная часть всех гелеобразуюдия материалов типа истинного агара, выпускаемых промышленностью России. Показано, что эта матрица пригодна для изготовления многих агарозиых сорбентов, закупаемых за границей. На основе полученных результатов автором составлены производственные регламенты, применяемые в опытном производстве агарозных сорбентов.

Агароза с модифицированной матрицей (этиясульфоактивированная агароза) производится в течение ряда лет в Институте химии АН Эстонии и находит применение в институтах иммунологического профиля. Идут испытания по масштабированию процессов с применением этилсульфоактивированной агарозы для

полупромышленного выделения протизостаФилококковых антител из человеческой сыворотки.

Публикации. Результаты исследования по теме диссертации опубликованы в 7 статьях и 9 тезисах докладов на конференциях. По этой теме получено одно авторское свидетельство и составлены Ч производственных регламента. Участие в исследованиях по государственным (целевым) программам отражено в трех Заключительных отчетах (за 1976-1960, 1981-1995 и 1986-1990 гг.).

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзном совещании по сорбентам для хроматографии (Косов, 1956), на VIII Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1967), на I Всесоюзном симпозиуме "Препаративная хроматография Физиологически активных веществ на полимерных сорбентах" (Ленинград, 198Э), на XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1969), на I Международной конференции по морской биотехнологии ТНВС'69 (Токио, 1989), на VII Научной конференции по аналитической химии Прибалтийских республик, БССР и Калининградской области (Рига, 1990) и на VI Европейском симпозиуме по химии углеводов ЕШОСАЕВ VI (Эдинбург, 1991) .

-6-

С0ДЕР1АНИЕ РАБОТЫ

1. Состав и физико-химические свойства агароэных матриц

Для последующего развития темы в главе приводятся физико-химические параметры ряда агарозных матриц и описание их общих свойств. Эти данные важны для сравнительной характеристики агароз разного происхождения как основ гелевых сорбентов. Достаточно хорошо изученные ранее С5] параметры матриц (молекулярные массы, реологические характеристики) не рассматриваются.

1.1. Брутто-данные

Элементной состав. Сравнительный анализ агарозных препаратов провели на анализаторе СНН (Hewlett-PacKard 135, США) . Результаты трех параллельных определений представлены в табл. 1

Таблица 1

Элементный состав образцов агарозы (органогены)

Среднее содержание органогенов № Препарат (в 7.У. от сухого вещества)

С Н О

1 Агароза фирмы LKB, марка L 43, 65 б, 13 49,55

г м 43,бо е, зг 49, гь

3 " SIGUA, ТИП I

(Low ЕЕО) 43,00 6, 25 50,03

4 и ТИП II

(Hedíuro ЕЕО) 42,48 6,20 50,35

5 Агароза из A.t. Опытного завода

Института химии АН Эстонии 43, 31 б, 59 49, 63

6 Агароза фирмы SERVA,

Standard ЕЕО 44,01 6,53 46,65

Удельная теплота ■ сгорания определена на калориметре В-09 НА (з-д "Эталон", Алма-Ата, Казахстан). Высушенные агарозные

преяараты № 5 и б (табл. 1) табпетировали и сжигали в калориметрической бомбе под давлением кислорода (20-40 10® Па);-из результатов серии экспериментов (6 параллельных проб) вычисляли средние значения удельных теплот сгорания (ДНС) и среднеквадратичные погрешности:

Среднеквадратичное Агароза Д Нс отклонение

(Дж/г) Дж/г У.

из AlwfaltJa tobucmensls 15223 310 2,04

фирмы SERVA 16071 202 1,26

Рассчитанные по полуэмпирической формуле [8] значения удельных теплот указанных выше агароз отклоняются от экспериментальных величин на 3, 4 К и б, 3 '/., соответственно.

1.2. Содержание и локализация серы

Для характеристики агарозы в качестве носителя сера является весьма важным элементом: от ее количественного содержания существенно зависит зараженность матрицы, показатель

электроэндосмоса (-тг), прочность геля и другие свойства. Содержание серы в агарозе, полученной даже иэ конкретного природного источника, непостоянно ['].

Результаты многих изученных методик анализа серы (варианты метода Шенигера, разложение агарозы хлорной кислотой в ампулах, каталитическое окисление продуктов сгорания в трубчатой печи и др.) оказались маловоспроиэводимыми из-за того, что малое содержание серы (порядка Ю^-Ю"2"/) маскируется фоном абсорбированных продуктов горения.

Из трубидиметрических методов (исключающих влияние фона) наиболее пригодным оказался метод Додгсона С10). Существенным недостатком метода является продолжительность гидролиза: количественное отщепление сульфатных групп от произвольной агарозной матрицы достигается лишь длительным кипячением в 4М НС1. Применение бидистиллированной воды и высокочистого желатина (Dlfco Bacto Gelatin) обьязательно.

Содержание - серы-з матрице агарозы из A.t. (определенное по этой методике) варьируется в зависимости от колебаний в

технологическом режиме (особенно, от длительности промывания водой) и находится в пределах 0,2-0,3/CS. Поскольку критерием деления полисахаридных фракций на агары и агарозы [9] считается граница сульфатного содержания 0, б У. SO42" (т.е., 0,2XS), лишь лучшие партии исследованной агарозы соответствуют этому определению. В ходе промывания этой агарозы водой содержание серы в остатке постепенно снижается (быстрее удаляются более заряженные компоненты) , но такая элюция связана со значительными потериями денного продукта.

Поскольку обработка щелочью в восстановительной среде С11} не привела к значительному уменьшению содержания серы в этой матрице, то была выдвинута гипотеза, что сера в основном локализирована в 3, 6-акгидроцикле агарозы (рис. 1, G) из A.t. Справедливость этой гипотезы проверяли при помощи ИК-спе к трос х опии.

ИК- спектроскопия. Спектры были сняты на приборе Specord 75 IR (C.Zeiss, Германия) из пленок агарозы толщиной менее 4»10"2 мм; порошковые препараты в виде таблеток (с КВг) оказались малоинформагивными. Из сравнения спектров I и II (рис.2) видно, что в результате щелочной обработки происходит изменение поглощения при в30-в50 см"1, соответствующего колебаниям групп COS в галактопиранозном цикле С*2] • Области при 795-620 см"1, указывающие на положения серы в 3, 6-ангидро-галактопиранозных циклях [13], в двух спектрах практически идентичны. Область спектра при 1240-1260 си"1, соответствующая колебаниям S=0-rpynn [12,13] з матрице, претерпевает лишь незначительные изменения (рис. 2) . Это обстоятельство подтверждает предположение, что сера в основном локализирована в 3, б-ангидроцикле матрицы.

Для дополнительной проверки этой гипотезы использовали метод электрофореза, чувствительный к присутствию заряженных групп — электроэндосмос (ЭЭО).

Показатели ЭЭО <-тг) измеряли, применяя блок для электрофореза 2117 Muítlpnor II с источником питания 2197 Power Supply (оба LXB, Швеция) . В качестве стандартного аниона был взят сывороточный альбумин человека и среды — О, 05 М барбиталовый буфер, рН в,б. Для визуального наблюдения за процессом электрофореза в качестве нейтрального маркера применяли витамин Bj2> а в качестве анионного маркера альбумин (20 мг/мл), окрашенный бромфеноловым синим

II

5 х юо с*-'

Рис. г. ИК-саектры поглощения пленок (толщиной 1- 10"2 мм) агарозы из Л.г.

спектр иэ пленки исходной агарозы

спектр из пленки агарозы после щелочной обработки

Значения -гог оказались следующими: у исходной агарозы О, 23; после ее щелочной обработки О,а 1; после повторной обработки - не менее О, 19 (максимальное уменьшение И V. от исходного) .

1.3. Иетокси-группы

Различие содержания метокси-групп более всего отражается на расхождении в составе (п. 1.1.) и структуре (п. 2.1.) агарозных матриц, поэтому методику их определения изучали досконально.

Аппаратура и нетомика. Сравнительно применяли 1) прибор, используемый в России (С15], рис. З.а) и 2) стандартизированный прибор Американского химического общества ([16], рис. 3,6), оба изготовлены местными стеклодувами. В основном придерживались известных методик [15> 17з, коррективы к которым приведены ниже. Всего провели около 400 анализов.

I

Целыо исследовании было выяснение возможной точности и воспроизводимости микроанализа метоксильных групп в агарах и ага-розах (их особенностью является низкое содержание СН3О) с применением твердого (рис. 3, а) и жидкого (рис, 3,6) сорбентов.

Рис. 3. Приборы для микроопределения метокси-групп

Результаты и выводы. Числовые значения, характеризующие содержание СН3О, использовали при сравнительном исследовании первичной структуры агароэных матриц (п. 2.1.) . Полученные результаты позволили сделать следующие выводы;

1) Для сохранения одинаковых условий параллельных определений нужна строгач стандартизация нагревательного режима и скорости тока газа-носителя.

2) Конструкция нижней части обратных холодильников должна обеспечивать равномерный отбор капель конденсата.

3) При соблюдении вышеназванных условий оба прибора обеспечивают получение практически равноценных результатов.

Прибор на рис. 3, а требует обязательного смачивания шлифов ортофосфорной кислотой, он несколько более удобен в обращении.

4) Вопреки существующему мнению [15' 17], 57Х-ная иодисто-водородная кислота может Сыть легко получена из продажного 45И-ного реактива (содержащего примесь свободного иода). Реактив обрабатывают красным фосфором (Ig -*■ Hî) и перегоняют, собирая Фракцию с температурой кипения 127°С (азеотроп, 57/С HI, d42t = 1, 701) .

5) Точность определения + О, ZV. СН3О, приводимая в литературе С18], относится лишь к его обычному содержанию в соединениях (выше 10'/. СН30) .

6) Точность определения метоксила в агарозах зависит от его количественного содержания в образцах и может быть оценена с помощью следующего ориентировочного правила (указывается число достоверных значащих цифр) : если содержание CH3OIOX*, то точность определения - 2-3; если содержание 1Х<СНзО<10Z, то точность - 2; если содержание СНзО<1Х,то точность -1 и менее. Это правило хорошо соблюдается, если число параллельных определений не превышает б.

7) Известная * зависимость" температуры гелеобразования от содержания метоксила в агарозах, установленная Гайзли ["], является скорее тенденцией, т.к. матрицы с разным содержанием метокси-групп необязательно должны обладать равными температурами геле образования.

1.1. Микроэлементный состав

В целях более полной характеристики агарозных препаратов изучали также их неорганический состав. Поскольку методы, ранее применяемые для анализа объектов агаровой промышленности, явно малочувствительны (см. С20]), мы использовали метод озоления (с предварительной проверкой на летучесть микрокомпонентов) в комбинации с методами нейтронно-активационного анализа (НАА). Из серии исследований ниже представлено (табл. 2.) изучение динамики микроэлементного состава в технологическом процессе выделения агарозы из A.t..

Этот диапазон не относится к природным матрицам агарозы

Аппаратура и методика НАЛ. Инструментальный НАЛ оэоленных при 500 °С образцов провели на базе исследовательского ядерного реактора (Институт физики АН Латвии, Саласпилс) с применением пневмопочты. Гамма-спектры образовавшихся радиоизотопов регистрировались и исследовались при помощи 4000-канальных анализаторов (ИТА -1024, Венгрия и LP-4900, Финляндия) с Ge(L1)-детекторами.

Для анализа элементов Mg, Al, CI, Ti, V, Мл, Си и I (по короткоживущим нуклидам) облучение провели в горизонтальных каналах реактора в потоке 1, бкЮ13 нсм"гс"1 (время облучения - 30 с, остывания - 4 мин, измерения - 200 с). Остальные элементы (из 30 определенных) анализировали по долгоживущим нуклидам и облучали в вертикальных каналах: с реакторными нейтронами в потоке 1, 4хЮ13 нсм"2с"1 в течение 24 часов и с резонансными нейтронами в потоке 1, ЗхЮ11 нсм'2с"1 в течение 72 часов. В обоих случаях облученные образцы измерялись дважды: через 4 суток и через 3 недели после облучения.

Таблица г

Динамика, никроэленентного состава продуктов в производстве агарозы из водорослей Almfeltla tobuclilensls

Элементный состав, Кратность очистки

м.д, <х10'^ I) на технологическом этапе

Элемент водоросли агар агароза от водорослей до агара , от агара Суммарно до агарозы

Na 2160 16, 5 52, 4 131 0, 315 41,2

Mg 310 39 76, 2 7, 95 0, 512 4, 07

Al 580 33 27, 7 17, 6 1, 19 20, 9

CI 134 г, 85 1, 1 47, 0 2, 59 122

Sc 0, 23 0, 0024 0, 00048 95, 6 5, 0 479

Tl 14 38 1, 85 0, 368 20, 5 7, 57

cr 3, 6 0, 87 0, 48 4, 14 1,61 7, 50

МП 46 0, 975 0, 778 49, 2 . 1, 25 61, 7

Fe 1100 39 13, 2 28 2, 95 83, 3

Co 0, 53 0, 0825 0, 0291 б, 42 2, 84 18, 2

Cu. 180 3, 5 51,4

Zn 19 4. 65 2 3, 5 4, 09 0, 196 0, 809

Br .4100 а, 4 2, 0 463 4, 2 2050

Ag 0, 5 0, 0185 27, 0

Sb 0, 17 0, 204 0, 015 0, 833 13, б 11, 3

I 790 0, 09 0, 059 8780 1, 53 13400

AM 0, Ó0375 0, 034 1, 1

Hg 0, 36 0, 036 0, 0053 10, б б, 79 71, 7

Th 0, 15 0, 00465 0, 002 32, 3 2, 32 75

Зольность,

23, 8 1, 5 0, 27 15, 9 5, 56 88, 1

Обсуждеяие результатов. Согласно данным, приведенным в таблице 2, основную долю минерализации агарозы составляют. некоторые легкие металлы На, А1) *, цинк, железо и др.

В технологическом процессе самыми легкоудаляемыми являются галогены иод и бром; в случае остальных элементов не наблюдается зависимости степени очищения от расположения элемента в Периодической системе. Некоторые легкие металлы (На, Не), а особенно цинк, обладают заметной аффинностью ** в отношении матрицы (происходит обогащение последней этими элементами) и они не могут быть удалены ниже определенного уровня содержания.

НАА оголенных образцов является достаточно чувствительным методом для многоэлементного анализа сырья и продуктов агарозной промышленности. Спектральный анализ (кварцевые спектрографы ИСП-ЗО, ДфС-8) тех же образцов не дал столь надежных результатов,

2. Уровни структуры агарозных матриц

В этой главе приводятся фундаментальные характеристики галактановой матрицы из А. t. в сравнении с другими агарозными матрицами: структура повторяющегося звена (основная первичная структура) и пространственная характеристика макромолекулы (основная вторичная структура) .

2.1. Первичная структура

Структурные исследования галактановых матриц 13С ЯМР-спектроскопией стали возможными благодаря основополагающим работам Усова, Шашкова, Хэмера и др. [21"гз]. Число публикаций,

• В зависимости от технологического режима главным минеральным компонентом может быть кальций. Его содержание может быть понижено на целый порядок элюцией раствором трилона Б, но в этом случае он эквивалентно замещается натрием.

** Дополнительные эксперименты подтверждают это предположение: матрица агарозы склонна в известной степени (порядка 1С>"3-10"гХ) связывать некоторые металлы (Иа, Ие, А1, Са, Ва, 7.п) .

посвященных этим исследованиям, быстро возрастает. При этом наблюдается значительное расхождение в данных об основных сигналах дисахаридного звена (рис. 1) агарозной матрицы, полученных разными авторами [ср. 24-26j, Поэтому наряду с исследованием первичных структур возникает необходимость в унификации соответственных значений.

Материалы, аппаратура, методики. В работе (сравнительно) изучались три образца; 1) агароза фирмы VKB (Швеция) среднего ЭЭО; 2) агароза из A. t. (Институт химии АН Эстонии, Таллинн); 3) агароза фирмы Sigma, тип I (США) .

Содержание метоксильных групп в этих трех образцах определялось по методике, описанной в п. 1.3, и составляло 3,9, 2,2 и 0,9 У. соответственно.

Таблица 3

Основные сигналы в 13С ЯМР-спектрах препаратов агарозы, м.д. (относительно тетраметилсилана)

Атом углерода Агароза Фирмы Агароза Опытного Агароза фирмы повторяющегося LKB завода Института Sigma

звена* химии АН Эстонии

G1 G2 G3 G4 G5 G6

102, 06 69, 98 81, 93 ее, 52 75, 10 61, 20

А1 А2 A3 А4 А5 А6

98, 06 69, 55 79, 77 77, 04 75, 25 69, Об

102, 07 69, 98 81,92 6в, 52 75, 09 61, £0

102, 07 69, 99 81, 93 68, 53 75, 10 61, 20

98, 05 69, 55 79, 77 77, 04 75, 25 69, 05

98, 05 69, 56 79,77 77, 04 75, 25 69, 07

Обозначения согласно рис.1

13С ЯНР-спектры снимали на спектрометре АН-500 (БгиКег, Германия) в режиме полной развязки протонов при 125,76 НГц. Образцы исследовали в виде 4 И-них жидких растворов в воде (с примесью DgO) при температуре 50 °С. Длительность измерительного импульса 8 мкс (33 °), время ожидания между импульсами 2с. Результаты представлены на рис. 4 и в табл. 3.

Обсуждение результатов. Сравнение спектров (табл. 4.) свидетельствует о хорошем совпадении (в пределах * 0,01 м.д.) основных 12 сигналов, принадлежащих атомам углерода повторяющегося звена разных матриц, спектр галактана из A. t. (рис.4) относится к структуре истинной агарозы (к полисахаридам агарового типа) .

—✓ t ujl-uj 1

jj jlJ

• j Uj t.J J .1- . -

100 95 • 90 85 ~ 80 75 70 65 60 « д.

Рис. i. Спектры 13С ЯНР препаратов агарозы . фирмы LXB (1), Опытного завода Института химии АН Эстонии (2), фирмы Sigma (3). Рядом со спектром приведено число сканирований.

Характерные особенности первичной структуры исследованных галактанов заключаются в следующем:

1. Агароза фирмы LKB отличается содержанием метоксильных групп в шестом положении Р-галактозного остатка (сигналы

5а,ао, 71,53 и 73,27 м.д.) и малым содержанием метоксилов во втором положении 3, 6-ангидро->£-галактозного остатка (сигналы при 78, 16 и 70, 36 м.д.) .

2. Агароза из A.t. отличается содержанием метоксильных групп во втором положении 3, 6-ангидро-L-галактозного остатка (сигналы 58,93, 76,17 и 70, 14 м.д.), остальные положения практически не метоксидированы.

3. Структура агарозы фирны Sigma наиболее близка к "идеальной": все положения углерода не метоксилированы (в пределах чувствительности метода).

2.2. Вторичная структура

Перед рентгенографическим исследованием агарозы как аморфного вещества необходимо предварительное ориентирование ее пленок.

Техника ориентирования. Параллельно изучались агарозные препараты из A. t. и фирмы LXB (Среднего ЭЭО).

Высушенную (в течение 6 часов при 60°С над CaCig) агарозу растворяли до концентрации 2Kb очищенном и обезвоженном (обработкой ЫаОН и CaHj и двойной вакуумной перегонкой) ДНСО. Раствор нагревали до 60°С, удаляли пузырки растворенного воздуха и выливали (по 23 ил) на строго горизонтально установленные ванночки с той же температурой. Ванночки были изготовлены из монолитного тефлона толщиной £0 мм и размерами 60x98 мм, они имели симметрично выфре зе£>ованные отверстия 40x70 им, глубиной 12 мм, с отшлифованном дном.

Растворитель удаляли при 60°С в циркуляционном воздушном термостате (WS 200, Германия); образовавшиеся гладкие пленки тщательао промывали абсолютным метанолом для удаления следов дисо.

Оптимальная толщина пленок для дальнейшего - ориентирования составляет о, 17-0, 20 мн; для этой цели из них вырезали контуры определенной формы (рис.5, а) и растягивали их (в течение нескольких часов) при помощи специального устройства (рис. 5,6) .

17©

щщ

форма пленки агарозы (а) и прибор для ее растягивания (б). 1 микровинт; 2 рукоятка; Зкорпус; 4 уровень жидкости; 5 зажимы; б пленка агарозы

Рис. б. Дифрактограмма агарозы

В среде этанол-вода (3:1, в среднем) достигали удлинения пленки в 3-5 раз. Ориентированные пленки захватывали перед разрывом специальными щипцами, позволяющими высушивать ее в фиксированном положении.

Альтернативные способы ориентирования *, а также аналогичные вышеописанному, проведенные "под тяжестью груза" [г7]. не дали желаемых результатов.

Получение дифрактогранн. Ориентированные пленки агарозы облучали узким (О, 4 мм) пучком рентгеновских лучей (излучение меди, профильтрованное никелем). Применяли рентгеновскую трубку УРС-60 (при напряжении 25-30 кВ) и камеру РКВ-66; экспозиция 20-25 часов. Для регистрации дифракционной картины применяли рентгенографическую пленку РИ-1. Типичная дифрактограмма ориентированной агарозы представлена на рис.- б.

Результаты и обсуждение. Периодичность матрицы агарозы, вычисленная по расположению возникающих дифракционных максимумов (уравнение Вульфа-Брегга) , составляла для всех образцов 19 А. Эта

. Степень

величина

характерна

для

истинном

агарозы

С£

* Эксперименты с применением высокого давления проводились нами на кафедре высокомолекулярных соединений МГУ им. М.В.Ломоносова в ноябре-декабре 1987 года.

ориентации не влияет на расположение, а только на четкость максимумов. Дифрактограмма образца агарозы ЬХВ, применяемой с целью сравнения (первичные структуры см.п. 2.1.), обладала расположением максимумов, практически идентичным их расположению в дифрактограмме агарозы из л.Ь.

На основе определенной Фундаментальной константы — периода двойной спирали агарозы — вычисляли координаты атомов в матрице (используя значения связевых углов в мономере [г0,29] и программу БРНОЬ -4) . Построена модель фрагмента матрицы агарозы (в масштабе х108) , пригодная для стерических калькуляций.

3. Модифицирование матрицы агарозы

Разные иммуносорбенты (ИС) известны в течение нескольких десятков лет. С начала 1970-х годов агарозные ИС применяются в аналитическом насштабе £30]. Основные трудности конкретного препаративного применения ИС в обеспечении нативности разделяемых белков связаны 1) с выбором наиболее подходящих матриц, лигандов и условий синтеза и 2) с масштабированием процессов. Есть как технологические, так и аналитические проблемы.

Оригинальный ароматический этилсульФоновый лиганд (структуру см, ниже) применялся Кузовлевой с сотр. (обзор см. в [7]) первоначально в целлюлозных сорбентах. Возможность применения агарозы из А. £. (в виде гранулята, производство Института химии АН Эстонии) в масштабируемых иммунохимических процессах показана на примере результатов наших совместных работ с указанными авторами. Химическая часть по модифицированию матрицы в них выполнена в Институте химии АН Эстонии.

Обзор проведенных работ. 1} Активация винилсульфоновыми группами. Сернокислый эфир 4-(р-оксиэтилсульфонил)-2-аминоани-зола (технический продукт очищали двойной перекристаллизацией из воды и обработкой с активированным углем) присоединяли к агарозной матрице инкубацией в слабощелочной среде (рН в, 04, карбонатный буфер) при постоянной температуре (до 40 °С, термостат ТС 60, СНГ). Исследовали динамику реакции модифицирования (рис. 7).

0,5 Л 1,5

6ре«я инку ¿а ни«, * Ю1 Ь

Рис. Т. Динамика реакции модифицирования матрицы агарозы винил-супьфоновыми группами при 37°С (карбонатный буфер, рН 8, 04) . Графики а. б, в — ход реакции в зависимости от скорости испарения воды (убывающий ряд) .

Установлены оптимальные условия, необходимые для смещения

равновесия реакции нухлеофильного присоединения [31] вправо*:

¡у—-у-

Агароза —ОН + СН2 = СН-50г-Е

ОН'

Агароза-о-снг-снг-зог-к,

где -I?

осн3

Процесс достигает плато при активности 20 мкмолей лиганда на 1 мл геля (рис. 7). Ввиду умеренной скорости, реакция протекает практически равномерно во всей массе. Между матрицей и лигандом образуется прочная ковалентная связь, не разрывающаяся в сильнокислых средах.** Периодический аналитический контроль обеспечивает получение модифицированной матрицы заданной активности.

2) Определение содержания связанных групп. Выработанная нами методика основывается на цветной реакции аминогруппы модифицирующего лиганда с 2, 4, б-тринитробензол-сульфокислотой. Образующуюся хромофорную группировку отделяют от матрицы гидролизом последней муравьиной кислотой. Реагент выбран ввиду его высокой чувствительности к аминогруппам С32], а методика —

» поскольку параллельно протекает конкурентная реакция реагента с ОН-группами воды.

«« кратковременно выдерживает рН 0,75.

из-за удобства выполнения: гидролизат модифицированной натрицы в муравьиной кислоте является непосредственно фотометрируемым при

390 нм (максимум матрицы агарозы света (рис.6).

поглощения), поскольку гидролизат природной в этом диапазоне волн практически не поглощает

Рис.в Поглощение света гидролизатами в муравьиной кислоте а) природной натрицы агарозы б) хромофорной группы

5»о Длина ы>лл,мм

3) Иммобилизация белков и синтез иммуносорбеита. Модифицированная этилсульфоновыми группами матрица способна после диазотирования концевых аминогрупп лиганда присоединять многие белки. При помощи реакции азосочетания связывается также иммуногенный белок из стафилококкового анатоксина (производство НИИЭМ им. Н.ф. Гамалеи, Москва); получают высокоспецифичный антигенный иммуносорбент:

модифицирующий лиганд

Матрица агарозы

иммобилизованный белок| (антиген) Ц-...

Я

специфичное присоединение антител

Антигенный иммуносорбент способен специфически извлекать противостафилококковые антитела из человеческой сыворотки, включая отходы промышленного фракционирования плацентарной крови. Возможно также побочное извлечение антител из сыворотки в ходе производства гамма-глобулина без нарушения температурных условий режима. Отличающийся малой плотностью заряда, углеводный скелет агарозы оказывает минимально вредное влияние на структуру разделяемых белков. Антитела элюируются глициновым буфером (рН 2,3-2,4) в концентрации 20 Н.Е./мл и более, обрабатываемый объем сыворотки на 2 порядка превышает необходимый объем суспензии иммуносорбеита. Нативность элюированных антител, определенная

иммунохимически, составляет 85/ от их исходной нативности [33]. Иммуносорбент регенерируется и применяется многократно.

Выводы

1. Исследован состав и физико-химические свойства галактано-вой матрицы из водоросли А1т{еИ1а 1оЬис1Иепз1з (Л.<.) (Японское море, Россия) . Этот галактан обладает свойственными для агароэных Фракций элементным составом, теплотой сгорания и содержанием мегоксильных групп. Для матрицы характерно низкое содержание золы (О, 27У.) и сравнительно высокое содержание сульфатных групп (0,2-0, ЗХ) , которые локализированы преимущественно в составе 3,6-ангидроцикла. Щелочная обработка не приводит к существенному уменьшению содержания серы (не более 14И) в матрице.

2. Минеральный компонент полисахарида из Л^. состоит главным образом из легких металлов и цинка, проявляющих заметную аффинность к матрице. Содержание брома и иода, которыми богато природное сырье, весьма значительно (порядка 103 и ю* раз соответственно) уменьшается в ходе технологического процесса.

3. Нетокси-группы (2, 2Х СН3О) галактана из А.4. практически полностью локализированы во втором положении 3, б-ангидро-а-1,-галактопиранозных циклов матрицы. На основе спектров 13С ЯИР, эта матрица обладает первичной структурой истинной агарозы.

4. Вторичная структура матрицы исследованного галактана характеризуется периодом 19 А , свойственным для истинной агарозы.

5. Модифицированная этилсульфоновыми группами матрица агарозы из пригодна для синтеза иммуносорбентов, применяемых для разделения антител в нативном виде.

Основные результаты диссертации изложены в публикациях:

1. Truus, К,, Гаиге, J., Eglite, a., Llmberg, И., Ivask, Г., Vaher, И. Hicro- and trace elements content of commercial agaroses and their raw material.// Proc. Estonian Acad. Scl. Chem.-1993.-V.42.-No.£-P.87-96.

2. Vaher, H., Koljak, R., Truus, K. Activation of agarose matrix with 1,1'-carbonyldlImidazole in various conditions.// Proc. Estonian Acad, Scl. Chem.- 1993.-V.42.-Ho.2-P.104-106.

3. Aabloo, A., Haav, A., Tlpp, H., Truus, X., Agaroosl rGntgenograafillsest uurlmlsest.// Eestl FUtlslka Seltsl Aasta-raamat 1989/90. Koost. P.XuusK, A.HalJaste.-Tartu: Eestl FQQslKa Selts, 1991, IK. 89-97 .

(Рентгенографичечкое исследование агарозы.// Ежегодник Эстонского физического общества 1989/90. (На эстонском языке с резюме на англ. и русском языках.)-Тарту, 1991, С.89-97.).

4. Kolllst, А.P., Vaher, М.Е., Truus, К.Е., Paris, J.P., Ptissa, Т.О. Characterization and utilization of polysaccharides isolated from agar-containing algae.// Current Topics In Marine Biotechnol ogy/ Ed. S.Hlyachl,. I.Karube, Г. Ishlda.-Tokyo: The Japanese Society for Marine Biotechnology, 1989, p.245-248.

5. Кузовлева О.Б., Пенарт Э.П., КоллистА.П., Труус К.Э. Свойства аффинных носителей одигозы и одифила (этилсульфоактнвированной агарозы)//Прикд. биохим. и микробиол.- 1989.-Т.25.-ВЫП. 3.-С.417-424.

6. Кузовлева О.Б., Ведищева И.Б., Труус К.Э. Сохранение удельной активности мышечной альдолазы после ее иммобилизации на одигозе и одифиле (этилсульфоактивированной агарозе )// Прикл. биохим и микробиол.-1989.-Т.25.-вып.2.-С.179-163.

7. Труус К., Вялимяэ Т., Вахер и., Коллист А, Выделение, характеристика и использование полисахаридов агароносных водорослей. 9. 13С ЯНР-спектроскопия агарозных носителей. //Изв. АН ЭССР. Химия,- 1988.-Т.37.-ШЗ.-С.190-194.

8.Кузовлева О,Б., Ратгауз Г.Л., Акатов А.К., Михайлова Н.А., Кудашева Г.Б., Осипенко А.И., КоллистА.П., Рийкоя Я.Х., Труус К.Э., Ченцова О.И. Способ получения противостафилококкового гамма-глобулина.-Авт. свид. СССР № 1363563 (для служебного пользования) от 1 сентября 1987 г.

-239. Truus, К., vailmae, Г., Aabloo, A., Taure, I., Kollist, A. Agarose matrix from Ahnfeltla tobuctilensis: structure levels and microelements contents.// 6th. European Symposium on Carbohydrate Chemistry,- Edinburgh, Scotland. 1991.- Abstracts, A59.

10. Tpyyc К.Э., Taype И.Я.. Эглите Г.Я., Лимберг H.P., Коллист А.П. Изучение динамики миграции микроэлементов' методами нейтронно-активационного анализа в технологическом процессе получения агарозы.// Тез. докл. VI Научн. конф. по анал. химии Прибалт, республ., БССР и Калинингр. обл.- Рига, 1990.-С.189.

11. Kolllst, А.P., Vaber, H.Е., Truus, К.Е., Paris, J.P. Fûssa, Т.О. characterization and utillzatIon of polysaccharides Isolated from agar-contalnlng algae.// First Intern. Marine Blo-technol. Conf. IMBC'89, Abstracts,- Tokyo, Japan, 1989.- P.33.

12. Tpyyc К.Э., Коллист А.П., Михайлова H.A., Кудашева Г.В., Кузовлева O.E. Масштабируемое иммонохимическое выделение антител на отечественных агароэных сорбентах.// XIV Менделеевский съезд по общ. и прикл. химии (Ташкент, 1989 г.). Рефераты докл. и сообщ. № 1.-Москва, 1989.-С.500.

13. Труус К.Э., Коллист А.П., Вахер Н.Э., Кузовлева О.Б. Отечественные агарозные носители: структура и применение для иммуноаффинных разделений// Тез. докл. 1-го Всесоюзн. симп. "Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах."-Ленинград,1988.-С.38.

14. Труус К.Э., Вялимяэ Т.К., Вахер Н.Э.,' Коллист А.П. 13С ЯНР-спектроскопия агарозной матрицы из разных коммерческих препаратов носителей// Тез. докл. Всесоюзн. конф. "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1987г.-Пущино, 1987.-С.105-106.

15. Кузовлева О.Б., Шабалина C.B., Коллист A.n., Труус К.Э., Кубатбекова Д.А. Синтез и применение в медицинской практике иммуносорбентов на основе новых аффинных носителей: одифила и одигозы.// Тез. докл, V съезда гигиенистов, сан. врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Узбекистана-т.2.-Ташкент, 1987.-С.52-54.

16. Кузовлева О.В., Труус К.Э., Коллист А.П. Активация гранулированной агарозы присоединением дивинилсульфоновых групп.// Тез. докл. Всесоюзн. совещ, по сорбентам для хроматографии (Косов, 1986) .-Москва, 1986.-С.140.

17. Кузовлева О.В., Труус К.Э., Коллист А.П. Возможности применения новых гранулированных агароэных сорбентов в

медицинских целях.// хроматографии (Косов,

Тез. докл. Всесоюзн. 1966) -Косква. 1966.

совещ. -С.141.

по сорбентам для

Список цитируемой литературы

С1] The Agarose Monograph [Ed. Womer, M.C.J. Rockland, HE(USA): FMC Corp., Marine Colloids Division, 1982. - P. 1-25.

[2] AraKl, C. Structure of tlie agarose constituent of agar-agar// Bull. Chem. Soc. Japan. - 1956. - v. 29. - P. 543-544.

[3J Кизеветтер И.В., Грюнер B.C., Евтушенко В.А. Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений. - И.: Пищ, промышл., 1967. - 416 с.

Возжинская В.Б., Цапко А.С., Блинова Е.И., Калугина А.А., Петров ЕО.Е. Промысловые водоросли СССР (Справочник). - Н. : Пищ. промышл., 1971. - С. 104.

[5] Коллист А.П. Исследование желирующих полисахаридов некоторых красных водорослей. - Дис. канд. хим. наук. - Таллинн, 1960. - 191 С.

Г6) Кузовлева О.Б., Ведгацева И,Б., Труус К.Э. Сохранение удельной активности мышечной альдолазы после ее иммобилизации на одигозе и одифиле (этилсульфоактивированной агарозе)// Прикл. биохиМ. И микробиол. - 1969. - Т. 25, - Вып. 2. - С. 179-163.

[71 Кузовлева О.Б., Пенарт Э.П., Коллист А.П., Труус К.Э. Свойства аффинных носителей одипозы и одифила (этилсульфоактивированной агарозы) .// Прикл. биохим. и микробиол.- 1989.-Т.25. -Вып.3.-С.417-424.

[8] Карапетьянц И.Х. Химическая термодинамика. Иэд 3-е.-М.: Химия, 1975. -С. 44.

[9] DucKworth, М., Yaphe, W. The structure of agar. Part I. Fractionation of a complex mixture of polysaccharides// Carbo-hydr. Res.-1971.-V. 16.-P. 198- 197.

[10] Dodgson, K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymlc and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters// Blochem. J.- 1961.-V.76.-F.312-319.

LOnnerdal, В., Ll.ds, T. Improved agarose for Immunoelectrophoresis// Anal. Blochem.-1976.-V.72.-P.527-532.

[12] Lloyd, A.G., Dodgson, K.S., Price, R.G., Rose, F.A. Infrared studies on sulphate esters. I. Polysaccharide sul-

phates//Blochlm. Blophys. Acta.-1961.-V.46.-P.106-115.

[13] Anderson, U.S., Dolan, T.C.S., Penman, A., Rees, D.A., Mueller, G.P., Standoff, D.J., Stanley, N.F. Carrageenans. Part IV. Variations In the structure and gel properties of se-carra-geenan, and the characterisation of sulphate esters by Infrared spectroscopy// J.Chem.Soc., C.- 1968.-Ho.5.-P.602-606.

["] Wleme, R.J. Agar gel electrophoresis. Amsterdam: Elsevier, 1965.

t15] Климова В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений. Изд. 2-е.-Н.:Химия,1975.-С.150-157.

[16] SteyermarK, A. Report on recommended specifications for mlcrochemlcal apparatus. AlKoxyl// Anal. Chem.- 1956.-V.28.-P.112 -115.

[17] Черонис Н.Д., Ha Т.е. Микро- и полумикрометоды органического функционального анализа.-М.:Химия 1973.-С.120-134, 517-521.

[18] Каррер П. Курс органической химии. Изд. 2-е.-Ленинград: Госхимиздат 1962.-С.10.

[15] Guiseley, К.В. ТЬе relationship between methoxyl content and gelling temperature of agarose//Carbohydr. Res.- 1970.-V.13.-P.247-256.

[20] саенко Г.И,, Корякова М.Д., Добросмыслова И.Г., Настерова Р.В. О комплекном использовании агаровой водоросли Ahn-feltla tobuchlensls// Использование неорганических ресурсов океанической воды. Вып. I.-Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1975.-С.106-110.

[21J Яроцкий С.В., Пашков А.С., Усов А.И. Анализ спектров 13С-ЯМР некоторых галактанов красных водорослей// Биоорган. ХИМИЯ.- 1977.-Т.З.-И8.-С.1135-1137.

[22] Шашков А.е., Усов А.И., Яроцкий С.В. Полисахариды водорослей. XXIV. Применение спектроскопии 13С-ЯМР для анализа структуры полисахаридов группы агара// Биоорган, химия.- 1978.-

Т.4-№1.-С.74-61.

[23] Hamer, G.K., Bhattacharjee, S.S., Yaphe, W. Analysis of the enzymlc hydrolysis products of agarose by 13C-n.m.r. spectroscopy// Carbohydr. Res.-1977.-V.54,-C7-C10.

[24] Nlcolalsen, F.M., Heyland, I., Schaumburg, K. 13C NMR spectra at 67.9 MHz of aqueous solutions of agarose and partly 6-O-methylated agarose at 95 °C// Acta Chem. Scand.-1960.-

V.B34.-No.2.-P.103-107.

[25] Brasch, D.I., Chaw-Teo Chuan, Helton,L.D. A 13C H.M.R. study of some agar-related polysaccharides from New Zealand seaweeds// Austral. J.Chem. - 1961.- V.34.-No.5.-P.1095- 1105.

[26j usov, A. I., Ivanova, E.G., ShashKov, A.S. Polysaccharides of algae. XXXIII. Isolation and 13C-NHR spectral study of some new gel-forming polysaccharides from Japan Sea red seaweeds// Bot. marina.- 1963,- V.26.Ho.6.-P.285-294.

[27] Arnott, S., Fulmer, A., Scott, W.E., Dea, I.C.M., Moor-house, R., Rees, D.A. The agarose double helix and Its function In agarose gel structure// J.Hoi,Biol.-1974.-V.90.-P.269-284.

[28] Arnott, S., Scott, W.E. Accurate X-ray diffraction analysis of fibrous polysaccharides containing pyranose rings. Part I. The linKed-atom approach// J.Chem.Soc., Perkln II.-1972,-

P.324-335.

[29J Campbell, J.W. , Harding, H.H. Crystal structure of methyl 3, 6-anhydro-a-D-galactoside// J.Chem. Soc., PerKln II,-1972.-P.1721-1723.

[30] HJelm, H., HJelm, K., SJOqulst, J. Protein A from Staphylococcus aureus. Its Isolation by affinity chromatography and Its use as an lmiminosnrbent for isolation of Immunoglobulins// FEBS Lett.-1972.-V.-28 -No.1.-P.73-76.

[31J Bohnert, E. The Remazol llnKage// J.Soc. Dyers Col.-1959.- V.75.-No.12.-P.581-585.

[зг] Habeeb, A.F.S.A. Determination of free amino groups in proteins by trinltrobenzenesulfonic acid// Anal. Biochem.-1966.-V. 14.-P.328-336.

f33j куэовлева О.Б. Неопубликованные данные. Москва, 1993.

Соискатель

К.Труус