Исследование влияния больших ионных сил на конформацию молекулы ДНК в растворе и разработка метода ее ковалентной фиксации на поверхности твердого носителя тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.14 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РГ6 од

- з НОЯ 1ЧЯ7

КАРЫМОВ

Михаил Александров^!

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БОЛЬШИХ ИОННЫХ СИЛ НА КОНФОРМАЦИЮ МОЛЕКУЛЫ ДНК В РАСТВОРЕ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЕЁ КОВАЛЕНТНОЙ ФИКСАЦИИ НА ПОВЕРХНОСТИ ТВЁРДОГО НОСИТЕЛЯ.

Специальность: 01.04.14. - молекулярная физика и теплофизика

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

АВТОРЕФЕРАТ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1997

Работа выполнена в НИИ Физики Санкт-Петербургского государственного университета.

Научные руководители:

Э.В. ФРИСМАН

Кандидат физико-математических наук, доцент

Н.А. КАСЬЯНЕНКО

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук

А .Л. ТИМКОВСКИЙ

Доктор физико-математических наук

А.Г. БЕЗРУКОВА

Ведущая организация:

ИБС РАН, г. Санкт-Петербург

¡аседашш диссертационного совета Д.063.57.32 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора физико-математических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан "........"......................................... 1997 г.

Доктор физико-математических наук, профессор

состоится

1997

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук, профессор

В.А. СОЛОВЬЁВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Молекула ДНК является сильно заряженным полиионом, поэтому ее конформация в значительной степени определяется природой и концентрацией экранирующих противоионов в растворе. Несмотря на огромный экспериментальный материал и значительное развитие теоретических представлений о поведении полиэлектролитов, до настоящего времени остаётся много неясного во влиянии ионной силы раствора на конформа-цшо полиионов. Обобщение экспериментальных данных позволило объяснить причину полиэлектролитного набухания ДНК в разбавленных растворах с помощью представлений об электростатическом дальнодействии в полимерной цепи, а при малых концентрациях поддерживающего электролита, сравнимых с концентрацией собственных противоионов макромолекулы, ещё и вкладом электростатического близкодействия, приводящего к возрастанию пер-систенгной длины Цепи. Отметим, что конформация молекулы ДНК в области больших ионных сил хгзучена существенно меньше. Было показано, что при достаточно высокой концентрации низкомолекулярного электролита электростатические взаимодействия в макромолекуле перестают оказывать влияние на её конформащпо, и объём молекулы ДНК сохраняет постоянное значение. При этом одновалентные противоионы даже при их предельных концентрациях в растворе не вызывают высаливания нативной ДНК, за исключением иона лития, который, нарушая гидратную оболочку макромолекулы, способствует её денатурации. Сравнение экспериментальных данных, полученных разными методами при исследовании ДНК в области умеренных и больших ионных сил, свидетельствует о существовании некоторых особенностей конформаци-онных свойств макромолекулы при больших концентрациях поддерживающего электролита. Ранее в лаборатории было обнаружено изменение оптической анизотропии тимусной ДНК при увеличении концентрации NaCl в растворе выше 2,4 М. Отметим, что для двунитевых синтетических полинуклеотидов с определённой нуклеотидной последовательностью при достижении 2,5 M NaCl или 0,7 M MgCk многие авторы наблюдали B->Z конформацион-ный переход из право- в левозакрученную спираль. Известно, что B-»Z-nepexofl не характерен для природных ДНК, однако ранее, при использовании больших концентраций противоионов, отмечали некоторые особенности в их поведении, в частности, аномально узкую ширину перехода спираль-клубок. Исследованию характера изменения оптической анизотропии ДНК в области больших концентраций ионов различной природы и посвящена первая часть диссертации.

Молекула ДНК является природным полимером, выполняющим самые важные функции в биологических системах. Тем не менее, многие её свойства могут быть объяснены в рамках общих представлений о конформационных изменениях полиионов различной природы. В связи с этим интересно сопоставить поведение биологических и синтетических полимеров, а также использовать последние в качестве модельных систем для проверки полученных результатов и при апробации новых методик. В диссертационной работе проводится разработка метода ковалентной фиксации ДНК на поверхности твёрдых носителей. Этот метод был апробирован также для фиксации мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты. Актуальность таких экспериментов обусловлена развитием микроэлектронных технологий, в которых широкое распространение получили биосенсоры - микроэлектронные приборы, преобразующие физико-химические изменения чувствительной мембраны, обладающей биологической избирательностью, в электрический сигнал. Отклик регистрируется по изменению массы, показателя преломления, а также зарядовых свойств поверхности с фиксированными макромолекулами. Биосенсор на основе ДНК-зоцда может быть применён в биотехнологиях, связанных с молекулярным узнаванием специфических: участков последовательности ДНК.

Ковалентная фиксация синтетических и биологических макромолекул из раствора на поверхности твёрдого носителя может быть также использована для изучения их пространственной организации методами сканирующей микроскопии. Она обладает рядом преимуществ при приготовлении образцов по сравнению с физической сорбцией с использованием лиофильной сушки, а именно, значительно упрощает процедуру, а также затрудняет возможность формирования дополнительных агрегатов полимера в процессе высушивания на поверхности.

Метод ковалентной фиксации может быть полезен также при исследовании конденсированных форм ДНК, которые формируются, как принято считать, после экранировки около 90% ионо-генных групп на макромолекуле многозарядными катионами. Известно также, что такие ионы металлов, как Со(ЫНз)б3+ и даже Mg2+ в смеси метанол-вода также способны вызывать конденсацию ДНК. В связи с этим, исследование поведения ДНК в области больших ионных сил, создаваемых ионами металлов различной природы и валентности представляет значительный интерес. Сравнительный анализ таких систем может дать представления о конформационных возможностях молекулы ДНК. Таким образом, разработка новых способов фиксации биологических и синтетических макромолекул имеет большое научно-практическое значение.

Целыо работы явилось: изучение оптической анизотропии и гидродинамических свойств молекулы ДНК в растворах больших концентраций N¡101, 1лС1, ЫШО и М^СЬ, разработка метода ко-валентной фиксации молекул ДНК на поверхности оксида и нитрида кремния, а также апробация метода фиксации для изучения размеров и формы мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты в смеси диоксан-вода микроскопическими методами.

Научная новизна. Впервые методами двойного лучепреломления в потоке и вискозиметрии была подробно изучена конфор-мация молекулы ДНК в области больших концентраций ИаС1, 1лС1, МШС! и Ъ^СЬ. Установлено, что при увеличении концентрации ИаС1 в растворе происходит резкое увеличение оптической анизотропии в области 2,4 М ЫаС1.

Обнаружено изменение оптической анизотропии ДНК при увеличении концентрации соли ]У^СЬ более 0,5 М.

Впервые в целях фиксации биологических макромолекул была химически модифицирована бифункциональными реагентами поверхности нитрида кремния - материала, широко используемого в микроэлектронных технологиях.

Предложен новый метод ковалентной фиксации молекул ДНК на поверхности нитрида кремния.

Впервые была надежно осуществлена ковалентная фиксация мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты, на поверхности твердого носителя из раствора с сохранением их пространственной организации.

Теоретическая и практическая ценность. Во всех сферах использования полиэлектролитов существенную роль играют их конформационные свойства, которые определяются составом и структурой макромолекул, а также свойствами растворителя. Молекула ДНК зашмает особое место вследствие своей чрезвычайно большой жёсткости и огромной плотности заряда. Поэтому исследование её конформации при различных ионных условиях может способствовать развитию представлений о полиэлектролитных свойствах макромолекул. Эти данные могут быть полезны для сопоставления с выводами теоретических работ, посвящённых кон-формационным свойствам полиионов.

Ковалентная фиксация биологических макромолекул на твердые поверхности имеет большое практическое значение в молекулярной биологии, медицине, пищевой промышленности, инженерной энзимологии и биотехнологии для создания биосенсоров и для осуществления покрытия ферментных реакторов многократного применения. Фиксация может быть также полезна для исследо-

вания полимерных систем методами сканирующей электронной микроскопии.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международных конференциях Eurosensors V (1995) в Риме, 2nd European Conference on Optical Chem. Sensors and Biosensors (Europt(r)ode II (1994) во Флоренции, 2nd International Symposium Molecular order and mobility in polymer systems (1996) в Санкт-Петербурге, Фундаментальные проблемы науки о полимерах (1997) в Москве.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ в научных журналах и сборниках.

Структура диссертации. Диссертация состоит из 5 глав, оглавления, введения, и выводов. Она содержит 61 рисунок и 11 таблиц. Диссертация написана на 224 страницах. Список цитированной литературы, содержит 232 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении сформулирована актуальность темы исследования, поставлена цель работы, изложена теоретическая и практическая ценность.

Первая глава представляет собой обзор литературы о влиянии ионных условий на конформацию молекулы ДНК в растворе, фиксации макромолекул на твёрдые носители и изучении мицелл, формируемых блок-сополимерами. Рассмотренный материал показывает, что, несмотря на разнообразие теоретических подходов и обилие экспериментальных данных, в настоящее время отсутствует полная картина поведения полиэлектролитов в широкой области И01шых сил. Так как конформация молекулы ДНК в области больших ионных сил изучена мало, то является актуальным изучение её поведения при больших концентрациях противоионов различной природы.

В обзоре рассмотрены работы по фиксации макромолекул на твёрдые носители. Показано, что фиксация успешно применяется для создания биосенсоров на основе ДНК-зонда. Для этой цели может быть использован разработанный автором метод ковалент-ной фиксации ДНК на поверхности твёрдого носителя, который был успешно апробирован при исследовании мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты.

Во второй главе рассмотрены теоретические основы методов исследования, которые были использованы в диссертационной работе: низкоградиентной вискозиметрии, динамического двойного лучепреломления, статического и динамического рассеяния света, электронной и атомной силовой сканирующей микроскопии.

В третьи! главе изложены результаты изучения конформа-ции ДНК в растворах большой ионной силы ц. Опыт показал, что в области больших ионных схш (более 1 М) величина характеристической вязкости [т|] ДНК, пропорциональная удельному объёму макромолекулы, не зависит от природы одновалентного противо-иона и сохраняет постоянное значение (рис.1).

В отличие от гидродинамических параметров, которые в обсуждаемой области ионных схш нечувствительны к природе катиона, поведение оптической анизотропии молекулы ДНК зависит от типа используемого противоиона. На рисунке 2 представлена зависимость динамооптической постоянной _ ( д„ Л от ион-

*->о 1«Сг|0/

ной силы раствора при больших концентрациях соли. Из рисунка видно, что в области ц > 2,4 М №1С1 величина [п] претерпевает резкое изменение. Поскольку известно, что [п] пропорциональна [г|], а характеристическая вязкость в исследуемой области ц. сохраняет постоянное значение, это изменение можно целиком отнести за счёт увеличения оптической анизотропии макромолекулы.

Рис. 1. Зави-

ГпЬ ял ■

-ДОА-

М-

-1

-2 -3

симость характеристической вязкости [г|] ДНК (М = 8,5-10« Да) от

концентрации

солей ЫаС1(1), ЫС1(2) и

N№01(3) в растворе.

ц,М

Опыт показал, что величина (Ая/г^о , определённая при конечных

(л, -1>По

концентрациях раствора, совпадает с отношением характеристических величин [п]/[г|], что свидетельствует об отсутствии эффекта формы (рис. 3). Заметим, что показатель преломления п, и вязкость растворителя г|о в рассматриваемой области ионных сил изменяются незначительно и никаких аномалий в их поведении не наблюдается.

16 14 12 10 в 6

г -[п]хЮ4

<§Го О

: о

о<з § дЬ

Рис. 2. Зависимость динамооптической постоянной [п] ДНК с молекулярной массой М= 8,5-106 Да от концентрации ЫаС1 в растворе.

И. м

- —хЮ8,см-сек -г'ЧИ [111

-X 10',см-секв-г"1(2)

35

30

25

20

15

10

-8-

-0-

с

о о

X

-16

- 1а

-26

- 2 в

Рис.3. Зависимости [п]/[ц] (1) и _ (Ч^о (2) ДНК

от К01щешрации МаС1 в растворе. Молекулярная масса ДНК М = 2,3 МДа (а), М = 8,5 МДа (б), М = 11,0 МДа (в).

Следовательно, [и] _ 4л ("/ +2)

ЩМ

соотношения

исходя из соотношешш Куна (где к - постоянная Больцмана, Т - абсо-

(а, -а,) [Л] 45 КГ п, ^ 1

лютная температура) можно утверждать, что наблюдаемое увеличение [п]/[х\] связано с изменением оптической анизотропии статистического сегмента (а] - а2), которая равна произведению разности поляризуемостей мономерного остатка в параллельном и перпендикулярном направлениях относительно оси спирали (РгРг) -АР на число мономерных звеньев в статистическом сегменте Б. Постоянство характеристической вязкости свидетельствует о неизменности термодинамической жёсткости ДНК. Кроме того, известно, что дополнительная экранировка зарядов макромолекул не мо-

2

3

О

1

жет привести к пзменепгао ближних электростатических взаимодействий, а следовательно, величины Б, в области умеренных и больших Известно также, что в случае В-формы ДНК, реализуемой в растворе, величина А/3 имеет максимальное значение и любое изменение структуры макромолекулы может принести только к её уменьшению. Отсутствие изменений во вторичной структуре ДНК подтверждает также неизменность спектров кругового дихроизма (КД) в районе 2,5 М ИаС1. Таким образом, наблюдаемое увеличение оптической анизотропии не связано со структурными изменениями макромолекулы.

Исходя из существования ближнего ориентационного порядка растворителя вблизи полимера, можно допустить, что возрастание оптической анизотропии макромолекулы может быть связано с изменением свойств ближайшего к ДНК гидратного слоя. В работе проводили дополнительную очистку ДНК с использованием фермента проназы Е, что исключает влияние остаточных белков на исследуемые параметры. Известно, что гидратация ДНК сопровождается возникновением слоя упорядоченной'воды вблизи макромолекулы. По оценкам ряда авторов, первый гидратный слой включает в себя около 20 молекул воды па нуклеотид. Однако, некоторая ориентация может наблюдаться и во втором гидратном слое. Полагая, что упорядоченные молекулы растворителя вносят некоторый вклад в измеряемую оптическую анизотропию,,можно понять, что в случае нарушения такой ориентации регистрируемая на опыте величина [п]/[т|] должна изменяться. Можно предположить, что при рассматриваемой концентрации соли присутствие большого количества Ыа+ нарушает ориентацию молекул воды в гидратном слое ДНК. Это приводит к изменению оптической анизотропии ДНК. Легко понять, что спровоцировать такое нарушение может переориентация нескольких молекул воды в стопке. Оценка показала, что наблюдаемое изменение оптической анизотропии соответствует вкладу -10 молекул воды на нуклеотид. При этом гидратный слой не нарушается, а лишь несколько разупоря-дочивается структура воды.

Увеличение оптической анизотропии при повышении Скасл > 2,4 М №С1 наблюдали для ДНК различной молекулярной массы, и концентрация соли, вызывающая изменение оптической анизотропии, при этом не менялась. Наблюдаемое изменение оптической анизотропии ДНК обратимо и носит кооперативный характер.

Увеличение концентрации ЫС1 в растворе хотя и вызывает сильный разброс измеряемой оптической анизотропии ДНК, однако при этом не происходит её отчётливого увеличения, как в случае ИаС1 (рис. 4).

По-видимому, характер поведения оптической анизотропии ДНК при больших концентрациях 1лС1 свидетельствует о существовании двух или нескольких факторов, по-разному влияющих на эту величину.

_ х см.сек2. г-1 (1) _[«]/ х 10»,см- сек2• г"1,(2)

(Л, - 1)П. ЛЦ1

30

20

ка. ЛЗГЯЗа'сР ^Ь п Fig- 4. Зависимо-

И -в-□ -5-ста (Mg)^o (1) и

(Л,-1)т1о

М(2) Днк (м =

п

о;' 8,5 МДа) от

концентр ащш LiCl в растворе.

1 2 3 4 5 П.М

Как известно, ион 1л+ сильно гидратирован. Поэтому, если мы объясняем наблюдаемые изменения оптической аншотопии нарушением ориентации воды вблизи ДНК, можно предположить, что гидратированный ион 1л+, характеризующийся большими размерами и наличием второго и, возможно третьего слоя гидратной воды, оказывает меньшее влияние на ближний ориентационный порядок молекул воды вблизи ДНК, чем Ка+. С другой стороны, ярко выраженная способность иона лития отшшать воду может привести при увеличении Си+ не только к переориентации воды в гидратном слое ДНК, как это возможно наблюдается в случае натрия, но и к нарушению гидратной оболочки, что снижает стабильность вторичной структуры ДНК и приводит к её локальной денатурации. Действительно, увеличение концентрации ЫС1 приводит к дестабилизации и высаливанию ДНК, в отличие от ЫаС1, когда нативность и растворимость ДНК сохраняется и при предельных концентрациях соли. Известно, что ион 1л+, в отличие от Ыа+, сдвигает равновесие В<-»А в сторону В-формы в условиях пониженной влажности. В случае иона >Ш4+ следует отметить, что его гидратация меньше, а кристаллографический радиус больше, чем у иона Вследствие этого естественно ожидать меньшее

дезориентирующее влияние иона ИН4+ на первую гидратную оболочку ДНК. И действительно, увеличение концентрации ЙШО в растворе не приводит к существенному изменению оптической ани-

зотропии, хотя разброс данных в области 2-3 М МНдС! также достаточно велик (рис.5).

Интересно отметить, что из всех используемых в работе одновалентных противоионов именно Иа+ вызывает отчётливый В->2 копформацнонный переход синтетических полинуклеотидов в области больших ионных сил. Хотя для природных ДНК В—>2-переход не наблюдается, возможно, обнаруженное нами различие во влиянии этих солен на оптическую анизотропию природной ДНК в области больших ионных сил, а также точное совпадение концентрации №С1, при которой происходит увеличение оптической анизотропии макромолекулы и В->2-ко1гформационный переход синтетических полинуклеотидов, в какой-то мере свидетельствует об обших чертах этих явлений. Например, это может быть некоторое изменение свойств гидратной оболочки ДНК, которое при наличии характерных особенностей структуры (определённый порядок чередования иуклеотидов) приводит к серьёзным конфор-мационным изменениям макромолекулы. Природная же ДНК, отличающаяся гетерогенностью, не способна к такому конформаци-ошюму переходу.

хЮ8,см-сек2-г.-',(1) -^х108,сМ-сек2т-\(2)

(гъ-Ол. м

а Д Ад Рис. 5. Зависимости

1 д A (Ак/g)^ ИМ

Д-1 А-2

ДНК (М = 8,5 МДа) от концентрации NH4CI в

V-M

Известно, что повышение концентрации соли MgCh более 0,7 М также приводит к B-^Z-ясреходу в случае синтетических двуспиральных полинуклеотидов определённого состава. В связи с этим в работе изучали оптическую анизотропию молекулы ДНК при больших концентрациях MgCh (рис.7)

Опыт показал, что объём молекулы ДНК при больпгах ионных силах не зависит от природы одновалентного противоиона и не меняется при использовании в качестве противоиона двухвалентного иона магния (рис.6).

Из рисунка 7 видно, что характер изменения оптической анизотропии ДНК аналогичен рассмотренному выше для NaCl. При этом увеличение оптической анизотропии молекулы ДНК наблюдается при концентрациях MgCh более 0,5 М, что также близко к Сш,,2, вызывающей B-^Z-переход.

[Т1],дл- г"1

Ss-g-о-

Рис. 6. Зависимость характеристической вязкости fa] молекулы ДНК (М = 4,6 10<5 Да) от концентрации MgCh (1) и NaCl (2) в растворе.

0 1 г s

(ànfg)^ „ х1()8?сы-сек2 . r-lf(1 _МХ ю'.см-сек1 • г"\(2) (П, -1)По [Щ

О

о^

о -1 О -2

-Q-

О

Рис. 7. Зависи--мость

(п, - 1)По

И и (2) ДНК (М h]

= 4,6-10б Да) от концентрации MgCh в растворе.

О О,S 1 1.S 2 2,5 ^f-igCI2 > M

Таким образом, исследование гидродинамических и оптических свойств молекулы ДНК в растворах NaCl, LiCl, NH4CI, MgCh показало, что эти соли по-разному влияют на оптическую анизотропию макромолекулы, в то время как гидродинамические параметры ДНК нечувствительны к изменению их концентрации в области больших ионных сил. Мы полагаем, что наблюдаемое различие в их влиянии на измеряемую оптическую анизотропию свя-

В

В

□

зано с разным воздействием ионов на гидратнуго оболочку молекулы ДНК.

В четвёртой главе описан метод иммобилизации ДНК на твёрдые носители и представлены результаты проверки её фиксации на лен-гмгоровские плёнки, способные фотополимеризоваться под действием ультрафиолетового света. Монослои были сформированы амфифильными 7,9-докозадшшовой саН,,С = С-С = С-(СЯг)5С0011 и

3,5-октадекадшшовой сан„С = С-С=С-(СНг\СООН диацетилено-

выми кислотами и их смесью, при этом в качестве субфазы использовался водный раствор НС1 с рН = 1,6. Иммобилизацию ДНК на ленгмюровские плёнки проводили карбодиимщдаым методом и путём формирования спейсерных структур. Первый метод состоит в формировании амидной связи между аминогруппой основания ДНК и карбоксильной группой на поверхности. При этом меченую денатурированную ДНК фага М13 в БТЕ буфере (0,1 М КаС1, 10 мМ ТпхНС1 рН 8,0, 1 мМ ЭДТА рН 8,0) наносили на поверхность с последующим высушиванием при 80°С. Фиксацию осуществляли в безводном диметилформамиде (ДМФА) с добавлением дициклогек-силкарбодиимида в качестве катализатора при 65°С в течение 32 часов.

Образцы отмывали стандартным образом: дважды в двукратном цитратном буфере (2х85С) (ББС: 0,15 М КаС1, 0,15 М цитрат натрия) с добавлением 0,5% додецилсульфата натрия (БОБ) при 65°С в течение 15 мин и затем 5 минут при комнатной температуре в ОДхББС. После ополаскивания дистиллированной водой и сушки образцы помещались во флаконы сцинтилляционного счётчика Ь8 Весктап 100С. После такой жёсткой отмывки на поверхности оставались только ковалентно пришитые молекулы.

Во втором методе фиксации аминогруппа основания ДНК связывается с поверхностью ленгмюровской пленки посредством гибкой спейсерной структуры, состоящей из диамина и диальдеги-да (рис.8).

Плотность покрытия образцов при фиксации ДНК двумя методами составила 10-20 пг/мм2, что в среднем в 2-3 раза выше, чем при использовании стандартного метода физической сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах.

соон

н9=о («Уз сн й

(СН^з

ГЧН

I

с=о

Рис. 8. Иммобилизация ДНК посредством формирования линкерных (спейсерных)

Г-1АС1С|

сн

и

(СН^э

ЙН I

с=о

йегмюую ■п.т! Ш а, с

Плёнки обрабатывали 50% раствором пропилендиамина в безводном диметилформамиде при 80°С в течение 10 минут, а затем 25% водным раствором глутарового диальдегида при 65°С в течение 20 минут.',После нанесения раствора меченой ДНК на поверхность плёнки, образцы выдерживали при 65°С в течение 2 часов в парах воды для предотвращения испарения.

Фиксация одноцепочечной ДНК на поверхности твёрдых носителей изучается с целью создания биосенсора на основе ДНК-зонда. При этом иммобилизованная ДНК должна сохранять способность к гибридизации с комплементарными участками ДНК-мишени из раствора. Эффективность гибридизации ДНК, иммобилизованной двумя описанными выше методами, с меченой денатурированной ДНК-мишеныо определялась согласно стандартной методике и была достаточно высока (около 100%). Таким образом, учитывая весьма большую физико-химическую устойчивость по-лимеризованных ленгмюровских плёнок, данный метод фиксации показал свою пригодность для создания биосенсора.

При создании оптического биосенсора на основе ДНК-зонда необходима фиксация ДНК непосредственно на поверхности твёрдого носителя, так как ожидаемое изменение показателя преломления вблизи поверхности имеет малое значение. В связи с этим, разработан новый способ ковалентной фиксации молекул ДНК на поверхности нитрида кремния без использования промежуточных полимерных слоев (рис.9).

Рис. 9. Иммобилизация ДНК на поверхности нитрида кремния. Поверхность обрабатывали 5% раствором дигалогеи-производного углеводорода в бензоле при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Фиксация ДНК (2 мкг/мл) осуществлялась из водного буферного (рН = 8,0) раствора при температуре 65°С в течение 2 часов.

Плотность покрытия поверхности оксида кремния составила 10-20 пг/мм2, а поверхности нитрида кремния - 100-200 пг/мм2. После обработки поверхности нитрида кремния 0,01 М раствором НЯ в воде в течение 5 минут плотность покрытия увеличивалась до 200-300 пг/мм2. Эффективность гибридизации для таких образцов также очень высока (более 100% по массе).

В пятой главе представлены результаты апробации разработанного метода для ковалентнон фиксации мицелл, сформированных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты, на поверхности нитрида кремния. В таблице 1 приведены данные, характеризующие эти мицеллы.

Таблица 1. Характеристики мицеллярных систем.

Система МгааРРхЮ-7 В.г(нм) Яь(пм)

81ЮОХ-У/ 7.4+0.2 22 + 2 27 + 2

8.3 ±0.2 25 + 3 48 + 3

Б2 ЮОХ-\У 11.4 + 0.5 29 ± 3 42 + 3

ООХ-ЭД' - смесь 1,4-диоксана с водой в объёмном отношении 60/40;

- слабощелочной водный буфер, рН = 8,6, I = 0,02; Мю3рр - молекулярный вес мицелл, измеренный при помощи статического рассеяния света; - радиус инерции, измеренный методом статического светорассеяния; Яь - гидродинамический радиус, измеренный методом динамического светорассеяния.

Была исследована зависимость гндродшгамнческого радиуса мицелл от рН н ионной силы среды (рис. 10).

-о

Rf,/nm

2

Рис. 10. Зависимость Иь мицелл 81 от рН водного буфера при разных р: 0,02 М (1), 0,15 М (2), 0,5 М (3).

-А

Л7 3

15

3

5

7

9

Мицеллы фиксировали на поверхности нитрида кремния методом, который является модификацией описанного выше. При этом поверхность нитрида кремния обрабатывали 0,01 М раствором HF в воде в течение 3 минут для удаления плёнки оксида кремния с последующим отмыванием водой, метанолом и высушиванием. Образцы выдерживали в 20% растворе 1-бромо-З-хлорпропана в толуоле, -СШВг группа которого связывалась с Nbb-rpyimaMU поверхности, формируя активные -СНгС1 группы. Последующая обработка 5% раствором этилендиамина в метаноле в течение 5 минут формировала активные ТЧШ-группы на концах спейсеров. Образцы отмывали метанолом и сушили. Карбоксильные группы мицелл активировали добавлением в раствор 0,5 мМ 1-(3-диметиламино)про1Шл)-3-этилкарбодиимид метиодида

(ДМПЭКМ). Все манипуляции проводили при комнатной температуре. На рис. 11 приведена схема иммобилизации мицелл.

При фиксации использовали концентрации карбодошмнда менее 1 мМ, не влияющие на размеры и полидисперсность мицелл. Размеры и полидисперсность фиксированных мицелл изучали методом сканирующей электронной (СЭМ) и атомной силовой микроскопии (АСМ). Перед исследованием СЭМ образцы покрывались золотом.

На рисунке 12 показал результат влияния используемого при фиксации ДМПЭКМ на размеры мицелл.

ГШ

С1

(СН^ь

I

С1

ГШ N11

.......

Рис. 11. Фиксация мицелл, сформи-рованных блок-сополимерами поли-стирола н поли-мехакриловой кислоты, на поверх-ности нитрида крем-ния.

С1 (СН^

мн ын,

ын2

N14

<фЬ>з гчн

с=о гчн (¿НАг ын

NN ЫИ,

С1 - • 1чн

70.

й^/пт 60

50

30

Рис. 12. График зависимости размера мицелл от концентрации ДМПЭКМ в смесях 1,4-диоксан -вода: 80/20 - (1), 70/30 - (2), 60/40 - (3).

СсагЬ

Фотографии, полученные при помощи электронного микроскопа, позволяют построить функцию распределения мицелл по размерам /п(я) = лу^дг, (рис. 13).

Рис. 13. /П(Ю для мицелл (кривая 1) и Б2 (кривая 2), фиксированных из смеси 60/40.

0.25.

R, HM

Б то время как покрытие золотом при получении электронно-микроскопического изображения приводит к отображению только сердцевины мицелл, АСМ позволяет получить их полное изображение. Среднечисленные функции распределения мицелл по размерам представлены на рис. 14(1).

035-г-__. Рис. 14. Функции распределения мицелл по размерам: (1) -f„(R) мицелл S2, фиксированных из смеси 60/40 диок-сан/вода, из АСМ; (3)

/г(к)=аду5>Л5 получеи-

пая га результатов исследования мицелл методом динамического светорассеяния, (2) -соответствующая функция распределения fz(R), полученная на основе АРМ из f„(R) в предположении сферичности и однородности частиц.

R, нм

Как и предполагали, функция распределения (1) смещена в сторону больших размеров по сравнению с кривой распределения (2) на рисунке 13. Второй максимум, только намечающийся в распределении fn(R) (рис. 13 и 14), для fz(R) играет весьма существенную роль.

На рис. 15 приведены аналогичные данные для мицелл S1, фиксированных из водного буфера. Больший средний размер мицелл в водном буфере по отношению к смеси 60/40 диоксан/вода обусловлен набуханием полиметакриловых блоков короны мицелл в данных условиях.

0.15

0.05

Рис. 15. Функции распределения мицелл S1, фиксированных из водного буфера (рН 8,8, ц = 0,02 М), по размерам.

(1) - fn(R) из AFM,

(2) - fz(R), рассчитанная из AFM и (3) -fz(R) полученая из динамического светорассеяния.

R, им

Динамическое рассеяние света позволяет вычислить размеры мицелл в растворе, микроскопические же технологии дают непосредственные изображения химически обработанных и высушенных мицелл на поверхности с некоторой погрешностью, определяемой разрешающей способностью методов и способом подготовки образцов. Несмотря на это размеры мицелл, полученные разными методами, хорошо согласуются друг с другом. На основании этого можно сделать вывод, что изучение поверхностен с фиксированными мицеллами при помощи электронного микроскопа или AFM даёт достаточно надёжную информацию о распределении мицелл по размерам.

ВЫВОДЫ.

1. Изучено гидродинамическое поведение ДНК в области больших концентраций NaCl, LiCl, NH4CI и MgCh. Показано, что в условиях ц > 1 М, независимо от сорта и валентности противоио-на, эффективный объём макромолекулы сохраняет постоянное значение.

2. Сравнительный анализ оптической анизотропии ДНК в области больших концентраций NaCl, LiCl, NH4CI показал, что увеличение концентрации NaCl в растворе выше 2,4 M вызывает увеличение оптической анизотропии макромолекулы. Увеличение концентрации LiCl в растворе приводит к большому разбросу данных в области 2 -3 M, а соль NH4CI существенно меньше влияет ira изменение разности поляризуемостей молекулярного клубка. Показано, что наблюдаемое изменение оптической анизотропии ДНК при увеличении концентрации NaCl в растворе обратимо и носит кооперативный характер.

3. Показано, что в рассматриваемой области ионных сил влияние MgCh на оптическую анизотропию ДНК сходно с рассмотренным выше действием NaCl. Однако, обнаруженное возрастание оптической анизотропии происходит при этом в области концентраций более 0,5 М MgCh-. Анализ совокупности данных, полученных разными методами, показал, что наблюдаемое изменение оптической анизотропии не связано с изменением кон-формации ДНК. Исходя из существования ближнего ориента-ционного порядка в растворах полимеров и литературных данных об упорядоченности воды в первом гидратном слое ДНК, полученные данные свидетельствуют о воздействии ионов Na+ и Mg2+ на ориентацию молекул воды вблизи ДНК, проявляющемся в области больших ионных сил.

4. Изучена фиксация ДНК на поверхности ленгмюровских плёнок. Показано, что фотополимеризующиеся ленгмюровские плёнки характеризуются высокой механической прочностью и фиксация ДНК на их поверхности отличается высокой стабильностью.

5. Молекулы ДНК впервые иммобилизованы на поверхности нитрида кремния - материала, широко используемого в микроэлектронных технологиях. Была достигнута весьма высокая плотность покрытия поверхности макромолекулами - более 200 пг/мм2, которая на два порядка выше, чем на нитроцеллюлоз -ных фильтрах.

6. Показано, что молекулы ДНК сохраняют способность к гибридизации при фиксации на ленгмюровские плёнки и поверхности оксида и нитрида кремния, что позволяет использовать разработанные методы иммобилизации в производстве биосенсоров.

7. Изучено влияние рН раствора на размеры мицелл полистирола и полиметакриловой кислоты в водных буферах. Показано, что размеры мицелл растут с повышением степени ионизации карбоксильных групп полиметакриловой кислоты в диапазоне рН от 5 до 7 единиц.

8. Впервые мицеллы полистирола и полиметакриловой кислоты были ковалентно зафиксированы на поверхности нитрида кремния. Эффективность покрытая поверхности мицеллами оказалась весьма значительной. Проведён сравнительный анализ размеров мицелл в растворе и после пх фиксации на поверхности нитрида кремния. Получено хорошее соответствие данных разных методов (динамическое и статическое светорассея-inie, сканирующая электронная и атомная силовая микроскопия). Это свидетельствует о том, что ковалентная фиксация является достаточно перспективным способом иммобилизации

макромолекул и надмолекулярных структур для их последующего изучения микроскопическими и другими методами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Karymov М.А., Kruchinin А.А., Tarantov Yu.A., Balova I.A., Remisova L.A., Sukhodolov N.G., Yanklovich A.I., Yorkin A.M. Langmuir-Blodjett film based membrane for DNA-probe biosensor. // Eurosensors V, Rome, 1991, Italy.

2. Karymov M.A., Kruchinin A.A., Tarantov Yu.A., Balova I.A., Remisova L.A., Sukhodolov N.G., Yanklovich A.I., Yorkin A.M. Langmuir-Blodjett film based membrane for DNA-probe biosensor. // Sensors and Actuators В (1992), v.6, p.208-210.

3. Karymov M.A., Kruchinin A.A., Tarantov Yu.A., Balova I.A., Remisova L.A., Vlasov Yu.G. Fixation of DNA directly on optical waveguide surfaces for molecular probe biosensor. // 2nd European Conference on Optical Chemical Sensors and Biosensors (EUROPT(R)ODE II), Firenze, April 19-21, 1994.

4. Karymov M.A., Kruchinin A.A., Tarantov Yu.A., Balova I.A., Remisova L.A., Vlasov Yu.G. Fixation of DNA directly on optical waveguide surfaces for molecular probe biosensor. И Sensors and Actuators В (1995), v.29, p.324-327.

5. Касьяненко H.A., Карымов M.A., Дьяченко C.A., Сморыго Н.А., Фрисман Э.В. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины. II Влияние лигандов, локализованных в первой коордииациошюй сфере. // Молекул, биол. (1995), т.29, вып.З, р.585-596.

6. Kasyanenko N.A., Karymov М.А., Prokhorova S.A., Frisman E.V. DNA interaction with metal ions and complexes of Pt(II). // 2nd International Symposium on Molecular Order and Mobility in Polymer systems, Saint-Petersburg, May 21-24, 1996.

7. Karymov M.A., Prochazka K-, Mendenhall J.M., Martin T.J., Munk P., Webber S.E. Chemical attachment of polystyrene-block-poly(methacrylic acid) micelles on a silicon nitride surface. // Langmuir (1996), v. 12, No.20, p.4748-4753.

8. Касьяненко H.A., Карымов M.A., Фрисман Э.В. Влияние ионов металлов различной природы и валентности на конформацшо молекулы ДНК в растворе. И Фундаментальные проблемы науки о полимерах, Москва, 21-23 января 1997.