Разработка способов фиксации ДНК на различных поверхностях и исследование свойств сформированных структур тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

На правах рукописи

Соколов Петр Александрович

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ФИКСАЦИИ ДНК НА РАЗЛИЧНЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СФОРМИРОВАННЫХ СТРУКТУР

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 О ИЮЛ 2014

шкт-Петербург — 2014

005550496

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Университете.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор

Касьяненко Нина Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор, зав. лабораторией биополимеров ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» Тимковский Андрей Леонидович

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией морфологии полимеров Института Высокомолекулярных Соединений РАН

Суханова Татьяна Евгеньевна

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский

государственный политехнический

университет»

Защита диссертации состоится ¿Г _2014 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д212.232.33 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 198504, г. Санкт-Петербург, Петродворец, Ульяновская 1, физический факультет СПбГУ, малый конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте spbu.ru

Автореферат диссертации разослан _2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.232.33 к. ф.-м. н.:

Поляничко А М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Благодаря уникальным свойствам молекулы ДНК, в частности, ее способности к самоорганизации, она стала активно использоваться для создания наноструктур с заранее определенной геометрией, которые можно использовать как составные части электрических наносхем. Перспектива использования ДНК в твердотельной электронике при создании электрических схем и биосенсоров требует тщательного изучения вопросов фиксации макромолекулы на поверхность кремния, который является основой современных электрических микросхем. В частности, фиксация заряженной молекулы ДНК может влиять на электрические свойства приповерхностной области полупроводниковой подложки. С другой стороны, для зондовой микроскопии биологических полимеров и их комплексов необходим способ фиксации, при котором исследуемый объект испытывает минимальные возмущения, а методика фиксации не оказывает влияния на характер комплексообразования. Разработка новых способов фиксации полимеров на подложках различных типов является важной задачей. С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса применительно к исследованию взаимодействия ДНК с различными соединениями в растворе возникла потребность в простом и надежном способе подготовки чипов, содержащих на золотой поверхности ДНК. Сказанное выше свидетельствует об актуальности проводимых в работе исследований. На данный момент электрофизические свойства интерфейса ДНК-кремний практически не изучены, существующие методы фиксации ДНК на различные подожки не всегда можно использовать для корректного отражения изучаемого взаимодействия, а метод плазмонного резонанса, находящий все более широкое применение для решения задач в области физики полимеров и молекулярной биофизики, требует расширения возможностей модификации чипов. Таким образом, выполненные в работе исследования представляют практический интерес для использования в биомедицинских и нанотехнологических разработках. Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы является разработка новых способов фиксации высокомолекулярной ДНК на поверхности слюды, кремния и золота, а также изучение сформированных на подложке структур. В диссертации решаются следующие задачи:

•Подбор оптимального способа фиксации ДНК на поверхности кремния для дальнейшей металлизации.

•Осуществление металлизации зафиксированных молекул ДНК на слюде, стекле, кремнии. •Изучение электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний. •Рассмотрение взаимодействия ДНК в растворе с серосодержащим производным фенантролина, используемым для модификации

з

поверхности подложки.

•Разработка способа фиксации молекул ДНК на модифицированные серосодержащим производным фенантролина поверхности золота, кремния, слюды и стекла.

•Подбор условий для исследования систем ДНК-лиганд методом поверхностного плазмонного резонанса. •Сравнительный анализ различных способов фиксации ДНК на поверхности.

Научная новизна. В работе впервые предложены способы фиксации ДНК на поверхность кремния с использованием облучения. Впервые показана возможность формирования протяженных упорядоченных фибрилл ДНК (несколько параллельно уложенных молекул ДНК) на поверхности кремния и проведена их металлизация. Впервые проведена оценка плотности поверхностных состояний кремния после фиксации ДНК. Предложен новый способ размещения на поверхности золота, кремния, слюды серосодержащего производного фенантролина, обеспечивающего последующую фиксацию ДНК на модифицированные поверхности.

Положения, выносимые на защиту:

•Характер фиксации ДНК из раствора на поверхность кремния зависит от облучения образца.

•Участие ДНК в формировании интерфейса Au-кремний существенно изменяет его электрофизические свойства. •Качество металлизации ДНК на подложке зависит от свойств сформированных на поверхности структур. •Адсорбционные свойства фенантролина на поверхности золота, кремния, слюды могут быть значительно улучшены путем введения серосодержащей группы.

•Модифицированные серосодержащим фенантролином поверхности слюды, золота и кремния способны фиксировать ДНК из раствора. Достоверность полученных результатов подтверждается согласованностью данных, полученных различными методами и их воспроизводимостью. Результаты были апробированы на всероссийских и международных конференциях X International Conference on "Nanostructured Materials", uth Internatioal Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and Nanostructures, 17Ü1 IUPAB International Biophysics Congress, The 8-th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems, 6 Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры — 2014» и опубликованы в 6 статьях в рецензируемых журналах.

Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении всех экспериментов, в обработке и анализе полученных данных, участии в обсуждении результатов, подготовке публикаций по теме диссертации и написании работы. Металлизация ДНК проводилась совместно со

студенткой Пучковой А.О. Вольт-амперные и вольт-фарадные характеристики интерфейса ДНК-кремний получены совместно с инженером Базловым Н. В. Часть исследований выполнена на оборудовании ресурсных центров СПбГУ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и содержит 171 страницу, 113 рисунков, список использованных источников включает 158 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении раскрывается актуальность проведенных исследований, обозначены задачи работы, обоснована практическая значимость результатов, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В главе 1 рассматриваются основные данные о сопряжении ДНК с твердотельной электроникой, описываются способы иммобилизации ДНК на различные поверхности, раскрываются свойства производных фенантролина.

В главе 2 кратко изложены физические основы методов исследования, использованных в работе: спектрофотометрии (СФ-56, СФ-2000), вискозиметрии, атомной силовой микроскопии (Nanoscope V в режиме ScanAsyst), рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (ESCALAB 250Xi), поверхностного плазмонного резонанса (NanoSPR8) и сведения, касающиеся изучения электрофизических свойств систем ДНК-кремний; охарактеризованы материалы (использовали тимусную ДНК (Sigma) М = 8-ю6, соединения фенантролина, любезно предоставленные д.х.н. В. Н. Демидовым, соли металлов х.ч.). Использовали источник света - светодиод TSHA5200 с длиной волны 890 нм и током 40мА; подложки - слюда (мусковит), монокристаллы кремния п- и р-типа, термически напыленное на стекло золото.

Исследования частично выполнены на оборудовании ресурсных центров СПбГУ «Нанотехнологии», «Физические методы исследования поверхности» и «Центр диагностики функциональных материалов длямедицины, фармакологии и наноэлектроники».

В главе 3 представлены результаты и их обсуждение. В первом разделе рассмотрена светоуправляемая фиксация ДНК на поверхности кремния и металлизация сформированных на поверхности структур. Показано, что фиксация ДНК идёт более эффективно в присутствии ионов Mg2+, чем в его отсутствие (рис. la), что обеспечивает более плотную посадку макромолекул (рис. 16, ib, ir). При иммоблизации в темноте межмолекулярные контакты с помощью ионов магния и гидрофобная поверхность кремния провоцирует формирование структур длиной в десятки микрометров (длина вытянутой молекулы ДНК не превышает 2 мкм) (рис. 16, ir). Предварительно обработав протравленную поверхность кремния раствором MgCl2, можно получить аналогичные структуры (рис. 16). Ионы Mg2+ связываются с

силанольными группами на поверхности кремния, обеспечивая фиксацию ДНК.

(в) (г)

Рис. 1. АСМ изображения ДНК, высаженной из раствора с 5 mM MgClz (в, г) и без него (а, б) на поверхность n-кремния. Подложки очищали в смеси HF:H20 (1:10) и продували воздухом, а для образца (б) подложку перед фиксацией выдерживали в растворе 5 mM MgCl2. Образцы (а), (б) и (г) находились в темноте, а (в) облучался (890 нм). Внизу представлены высотные профили для (в) и (г).

(а)

Рис. 2. Результат металлизации фибрилл ДНК восстановлением серебра на поверхности кремния n-типа: АСМ (а) и сканирующий ионный микроскоп Zeiss ORION (б, показано направление промывки).

Если описанную процедуру проводить, облучая каплю раствора светом, ДНК фиксируется в виде сетки с высотой 2-3 нм, а не фибрилл высотой до ю нм, как показано на рис. 1в и 1г. Вероятно, облучение провоцирует окисление поверхности кремния, уменьшая ее гидрофобность и способствуя фиксации отдельных молекул, тогда как при образовании фибрилл более выгодными являются контакты ДНК-ДНК, стабилизированные ионами М£2+. Описанный способ создания образцов с ориентированными на поверхности кремния фибриллами можно использовать в качестве шаблонов для создания серебряных нанопроволок (рис. 2)._

Равномерно расположенные наночастицы серебра размером порядка 30 нм формируются на фибриллах после связывания ионов серебра (экспозиции сформированных структур в 5 тМ AgNOз) и их восстановления добавлением 4 тМ раствора гидрохинона. Перед и после добавления гидрохинона каплю раствора серебра выдерживали на подложке 15 минут в темноте с последующим промыванием водой и высушиванием. Опыт показал, что наночастицы серебра формируются на фибриллах ДНК и до обработки гидрохиноном, который придает структурам большую однородность. Фибриллы обеспечивают большую плотность посадки ионов серебра. Иммобилизация ДНК на поверхность кремния п-типа приводит к тому, что за счет туннелирования электронов через биополимер из кремния в капле раствора идет процесс восстановления серебра, который окончательно оформляется добавлением гидрохинона. Таким образом, в этом случае восстановление серебра носит электрохимический характер.

Фиксация ДНК на поверхности кремния изменяет его состояние. Об этом свидетельствует следующий эксперимент. На поверхность кремния п-типа с предварительно зафиксированными молекулами ДНК на 15 минут наносили каплю коллоидного раствора с наночастицами

серебра, полученными электроискровым методом. После промывки образца и высушивания получили изображения, свидетельствующие о фиксации наночастиц на поверхность, модифицированную ДНК (рис. з). Без ДНК наночастицы на такой поверхности не фиксируются. Более того, в водном растворе они практически не взаимодействуют с молекулой ДНК. _____

- - - (а) * - i ■ Ш :(б)

Рис. з. Результат фиксации наночастиц серебра из капли коллоидного раствора на поверхность кремния n-типа с предварительно зафиксированными молекулами ДНК. СЭМ Supra 40VP (а, риска 200 нм) и СИМ Zeiss ORION (б, риска юо нм ).

Второй раздел главы 3 посвящен рассмотрению электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний. На образы, представленные на рис. 1в и ir, методом термического напыления наносилось золото толщиной 30 нм, (диаметр — 1.5 мм.) Омические контакты на тыльной стороне создавались втиранием галлия (рис. за). Были измерены вольт-амперные характеристики (ВАХ) диода (рис. 36), полагая, что тока через диод: I = I0-(exp(eU/nkT) - 1), где е - заряд электрона, U - напряжение на контакте, к - постоянная Больцмана, Т -абсолютная температура, 10 - ток насыщения, п — коэффициент неидеальности; n = l + (Cd + e-Dss)/(Ci + e-Dsm) , где C<j, Ci , - емкость области пространственного заряда (ОПЗ) полупроводника и геометрическая емкость интерфейсного слоя в расчете на единицу площади контакта, Dsm, Dss - плотности интерфейсных состояний, обменивающихся носителями заряда с металлом и полупроводником соответственно в расчете на единичный интервал энергий и единичную площадь. Присутствие молекул ДНК на интерфейсе контакта Au-Si заметно изменяло вид ВАХ. Освещение капли раствора на поверхности при экспозиции влияло на характер изменений. Как видно из графика (рис. 36), для прямых напряжений U > зкТ/е ВАХ исходного диода без ДНК, построенная в полулогарифмическом масштабе, представляет собой прямую, наклон которой заметно меньше, чем наклон прямой для идеального диода. Для модельного диода, с учетом окисла толщиной 1 нм, величина коэффициента неидеальносги составляет п0 = 1.03.

ДНК-

Si

Au

<

\

100

200

300

U, mV

(6)

Рис. з. Диод Шоттки с ДНК на интерфейсе (а) и В АХ шотгки-диодов Au-(n-Si) с молекулами ДНК на интерфейсе, зафиксированными в темноте и на свету, а также ВАХ исходного образца (без ДНК) и идеального шоттки-диода для тока насыщения

Is = З-Ю"9 А (б).

Зафиксированные на поверхности кремния в виде сетки макромолекулы уменьшали величину коэффициента неидеалы-юсти на о.2 до значений модельного диода, в то время как фибриллы -увеличивали на 0.3 (рис. 4а). Логично предположить, что «сетка» прозрачна для туннелирования электронов из напыленного золота, она увеличивает количество поверхностных состояний, обменивающихся электронами с металлом. С учетом размера ячейки сетки около юо нм и плотности заряда фосфатных групп одиночной молекулы Qdna=6-io7 см"1, оценка максимальной величины поверхностной плотности заряда, которую могли бы создать закрепленные молекулы, составляет Ndna = l-io13 см"2, что может обеспечить уменьшение коэффициента неидеальности до указанных значений. Представляя фибриллы в виде диэлектрических нитей с толщиной, туннельно непрозрачной для электронов из металла, можно предположить, что в этом случае должны появиться состояния, обменивающиеся носителями заряда с полупроводником. Увеличение суммарной плотности Ds в этом случае должно приводить к возрастанию коэффициента п. Используя толщину фибрилл ю нм и характерную для диэлектриков диэлектрическую проницаемость 2, можно оценить усредненную по поверхности контакта плотность состояний, обусловленную присутствием фибрилл ДНК на интерфейсе Nrs = 3-ю10 см"2. При среднем расстоянии между ними порядка 1 мкм, на единицу длины жгута должно приходиться порядка Qr = 3106 см"1 электронных состояний, перезарядка которых могла бы приводить к наблюдаемым изменениям ВАХ. Это составляет примерно одну двадцатую линейной плотности заряда фосфатных групп одной молекулы ДНК. Фибриллы могут содержать до ю и более молекул, так что наблюдаемые изменения ВАХ могли обуславливаться изменением

заряда менее чем одной сотой части электронных состояний фосфатных групп закрепленных на поверхности молекул.

Dark DNA diode Initial diode Light DNA diode Ideal diode

и. "IV (а) (б)

Рис. 4. Вычисленные из ВАХ значения коэффициента неидеальности (а) и зависимости С"2(и) в расчете на единицу площади контакта (6), рассчитанные из ВФХ образцов с ДНК на интерфейсе при фиксации на свету и в темноте и графики для исходного образца (без ДНК) и идеального шоттки-диода.

Для анализа вольт-фарадных характеристик (ВФХ) диода пользовались оценкой емкости: С"2 = 2(Udo + U)/eee0ND, где Udo — диффузионное напряжение, U - напряжение на контакте, г, г0 -относительные диэлектрические проницаемости полупроводника и интерфейсного слоя соответственно, е - заряд электрона, ND — концентрация доноров. Из рис. 46 видно, что диод с «сеткой» на интерфейсе имеет характеристики, близкие к модельному, а свойства диода с фибриллами сильно меняются. Согласно литературным данным, поведение ВФХ диода с фибриллами характерно для контактов металл-полупроводник с электронными состояниями на интерфейсе, заселенность которых частично или полностью управляется металлом, но скорость изменения заряда которых оказывается меньше скорости изменения тестирующего переменного напряжения. Оценка величины поверхностной плотности состояний, заряд которых приводит к уменьшению барьерной емкости диода при обратных смещениях, будет составлять 2-ю10 см"2 - величина, близкая к значению, полученному из измерений на постоянном токе для прямых смещений. Принимая во внимание «ступеньку» при смещении Ut = - 0.22 V, которая свидетельствует о зарядке поверхностных состояний при наличии ДНК, можно полагать, что эти состояния лежат на 0.77 eV ниже дна зоны проводимости кремния.

Третий раздел главы 3 посвящен исследованию модификации поверхности золота, слюды и кремния соединением фенантролина (рис. 5 слева) и последующей иммобилизации на таких подложках молекул ДНК.

ю

Рис. 5. Структура соединения (PhenSH) с учетом возможной таутомерии (слева; в некоторых экспериментах использовалось соединение Neo, в котором сера заменена на метильную группу). Установка для измерения ППР (справа) состоит из лазера (l) и фотодитектора (5), призмы (2), золотого чипа (3) и механизма для поворота призмы. На поверхность чипа наносится исследуемый раствор (4).

Изучение адсорбции PhenSH, Neo и ДНК на золотую поверхность проводилось методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Схема прибора приведена на рис. 5 справа. Линейно поляризованный свет лазера (i) проходит через призму (2), отражается от золотой поверхности чипа (3), затем от стенки призмы и попадает на фотодетектор (5). Призма может вращаться, изменяя угол падения луча лазера на золотую поверхность. В процессе эксперимента измеряется зависимость интенсивности отраженного света от угла падения света лазера на золотую поверхность толщиной 45 нм. Зависимость имеет выраженный минимум, обусловленный переходом энергии падающего под определенным углом света в коллективные колебания электронов золотой поверхности, что и носит название ППР. Угол, на котором наблюдается ППР, изменяется при нанесении на золотую поверхность раствора (4). Результат показал, что PhenSH необратимо связывается с чипом, a Neo легко смывается водой, что показывает определяющую роль SH-группы в связывании с поверхностью (рис. 6).

Time, min

Рис. 6. Изменение угла ППР от времени экспозиции золотой поверхности в растворах PhenSH в 5 % DMSO и Neo в воде равной концентрации ю-5 М.

Временные зависимости сигнала ППР при экспозиции золотой поверхности в растворах PhenSH показывают (рис. 7), что скорость роста прочно связанных молекул PhenSH не зависит от концентрации PhenSH (рис. 7, 2), как и количество связанных молекул, смывающихся при промывке DMSO (нар рис. 7 разность 2 и i).

300 250

о

<и

ä2»»

<D

-а

Ü '50

~ 100

©

<1 50 0

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time, min.

Рис. 7- Изменение угла ППР от времени экспозиции золотой поверхностипоследовательно в растворах PhenSH разной концентрации. Каждая точка на графике соответствует последовательной экспозиции поверхности в ю-6, 2-ю'6, 5-ю 6,1-Ю"5, 5-ю"5 и 1-ю 4 М растворах PhenSH в i % DMSO.

В растворе у поверхности золотого чипа накапливается определенное количество PhenSH, не зависящее от его объемной концентрации, а затем молекулы соединения вступают в реакцию с поверхностью, образуя прочную связь. На основе данной модели был проведен численный эксперимент, который качественно совпадает с экспериментальными данными.

Методом фотоэлектронной спектроскопии (XPS) были проведены исследования модифицированной PhenSH золотой поверхности, таблица 1. Результат показал, что рост азота, входящего в состав фенантролиновых соединений, на поверхности золота связан с адсорбцией PhenSH. Показано, что, как и в методе ППР, соединение без атомов серы (Neo) слабо адсорбируется на золотую поверхность. Из сравнения спектров, полученных при изучении поверхностей, находящихся в контакте с раствором PhenSH в течение 6о минут при концентрации соединения io"s М и 30 минут в Ю"6 М было показано, что с увеличением времени экспозиции поверхности в растворе пик азота приобретает еще одну спектральную составляющую. Это может свидетельствовать либо о протекании химической реакции, либо об изменении взаимодействия молекул PhenSH с поверхностью с течением времени.

Таблица 1. Химический состав (в процентах) золотой поверхности в _зависимости от использованной обработки._

1 % DMSO O.OI % DMSO

Исходное 30 мин. 30 30 МИН. в 10 мин. 20 МИН. 30 МИН.

состояние в мин. ю"5М в ю-6 М В Ю"6 М в ю-6 М

золотой ю-5 М Neo PhenSH PhenSH PhenSH

поверхности Neo

Cis 60,76 56,94 52,48 63,38 60,03 56,93 57,69

Au4f 26,14 26,42 33,22 20,92 23,74 24,56 21,57

Ois 10,71 12,98 12 12,85 11,28 12,56 12,9

Nis 2,39 3,66 2,3 2,86 4,95 5,95 7,84

Спектр серы на поверхности (рис. 8) разделяется приблизительно на пять спектральных линий. Пик 161.1 еУ можно соотнести с атомарной серой, 161.9 еУ - с образованием связи Б-Аи, 163.2 еУ относится к свободной -8Н/=8 группе (эта полоса свидетельствует о наличии на поверхности золота молекул РЬеп8Н, связанных лишь по одному из двух атомов серы или связанных без серы). Пики 168.1 еУ и 169.0 еУ отражают наличие серы в окружении кислорода. Таким образом, рассмотренные данные подтверждает образование химической связи РЬепБЫ с золотом через тиольную группу.

S2p

161.05 cV (i.) Kil.87 eVfl.j ¡63.22 cV ill I68.0!>cV(.M I6K.96 cV (L) [it Sum

-100

156 158 160 162 НЙ 166 168 170 172 174 Binding energy. eV

Рис. 8. XPS спектр серы (ар) на золотой поверхности. Показаны спектральные полосы (пояснения в тексте) и модель связывания PhenSH с золотой поверхностью(ш).

Проверка адсорбции ДНК на модифицированную PhenSH поверхность проводилась методом ППР. Характер временных зависимостей показал что ДНК фиксируется на модифицированной и не фиксируется на исходной поверхности золота. Иммобилизация ДНК на поверхность модифицированной PhenSH слюды была подтверждена при помощи АСМ (рис. 9а), причем количество адсорбированных из

раствора молекул ДНК зависит как от концентрации биополимера, так и от концентрации РЬепБН в растворе, которым предварительно обрабатывались подложки, при отсутствии зависимости от времени экспозиции подложек в растворе ДНК. Последующее промывание подложек приводит к вытягиванию макромолекул в одном направлении, что говорит об их слабом сцеплении с подложкой. Фиксация полимера сильнее (вытягивание макромолекул не столь значительно) при его высаживании из раствора, содержащего РЬепБН (рис. 96).

0.0 Height 3.0 (jm (д) Height 200.0 nm

Рис. 9. АСМ-снимки свежесколотой слюды после экспозиции в растворе PhenSH концентрации ю-6 М в течение 24 часов с последующей экспозицией в растворе ю-3 % ДНК в течение ю минут (а) и выдержанной i час в растворе 5-КГ5 М PhenSH в 0.5 % DMSO, содержащего ю"3 % ДНК (б).

XPS анализ подложек из кремния также показывает слабую адсорбцию Neo, в отличие от PhenSH. Отчетливо наблюдается рост слоев толщиной около 2 нм на образцах, предварительно очищенных от SiOx. Так как поверхность такого типа не представляет интерес для использования ее в качестве подложки для исследования ДНК, то для опытов с биополимером травление в HF:H20 не проводилось. Была показана возможность фиксации ДНК на исходные подложки п- и р-кремния и дополнительно окисленные.

В работе было проведены исследование способа фиксации ДНК на поверхность, модифицированную PhenSH. Наиболее вероятным способом является связывание зафиксированного на поверхности фенантролина с ДНК интеркаляционным способом. В связи с этим изучали комплексообразование соединения PhenSH с молекулой ДНК в растворе. Для соединения была определена рК = 4.8+/-0.1. Спектральные изменения при добавлении к раствору PhenSH ДНК, а также рост приведенной вязкости растворов ДНК с увеличением концентрации фенантролина (рис. ю) дают основание полагать, что используемое соединение взаимодействует с молекулой ДНК в растворе, интеркалируя между парами оснований. Такой способ связывания хорошо согласуется с рассмотренными ранее данными по фиксации

ДНК на поверхности после ее модификации соединением фенантролина.

60-

50 Л---1-.-1-

0;0 0Л 0 2

Г

Рис. ю. Относительное изменение приведенной вязкости раствора ДНК с фенантролином от г в 5 тМ ЫаС1 (г = МрЬепЯП/МЬрВМА).

В заключении сформулированы выводы:

•Разработан новый способ светоуправляемый фиксации ДНК на поверхность кремния п-/р-типа в присутсвии ионов магния.

• Развит способ металлизации зафиксированных на кремнии в виде фибрилл молекул ДНК.

• Исследованы электрофизические свойства интерфейса ДНК-кремний (получены вольт-амперные и вольт-фарадные характеристики).

• Проведена оценка поверхностной плотности состояний при различных способах фиксации ДНК.

•Показано, что электрофизические свойства модифицированного макромолекулами ДНК приповерхностного слоя кремния зависят от способа иммобилизации биополимера.

•Подобраны оптимальные условия для исследования систем ДНК-лиганд методом плазмонного резонанса.

•Проведен сравнительный анализ формирования слоев РЬепвН на поверхностях золота, слюды и кремния. Показана принципиальная роль -8Н/=8 групп 1,1 при адсорбции соединения.

•Разработан новый способ фиксации тимусной ДНК на модифицированные РЬепБН поверхности золота, слюды и кремния.

• Показано, что соединение РЬепБН образует комплекс с молекулой ДНК в растворе малой ионной силы, взаимодействуя с макромолекулой интеркаляционным способом.

Основные результаты диссертации опубликованы в статьях:

•N.V. Bazlov, O.F. Vyvenko, P.A Sokolov, N.A. Kas'yanenko, Yu V. Petrov Charge-controlled fixation of DNA molecules on silicon surface and electro-physical properties of Au-DNA-Si interface // Applied Surface Science. 2013. Volume 267. PP. 224-228. •V. N. Demidov, N. A. Kas'yanenko, V. S. Antonov, I. L. Volkov, P. A. Sokolov, Т. B. Pakhomova, S. A. Simanova Reaction with DNA and pharmacologic activity of i,io-phenanthroline and electron-rich 1,10-phenanthrocyanine complexes of d-elements // Russian Journal of General Chemistry. 2012. Volume 82, Issue 3. PP. 602-620.

•P. A. Sokolov, N. V. Bazlov, A. O.Puchkova, O. F. Vyvenko, and N.A. Kasyanenko DNA Immobilization on n-Type Silicon Surface and Electrophysical Properties of Au/DNA/(n-Si) Structures // Protection of metals and physical chemistry of surfaces. 2011. Volume 47. Issue 5. PP. 566-571.

•Puchkova A. O., Sokolov P. A, Kasyanenko N. A Metallization of DNA on the surface // Journal of Structural Chemistry. 2011. Volume 52. Issue 6. PP. 1195-1201.

•Puchkova A. O., Sokolov P. A, Petrov. Y. V., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on silicon surface // Journal of Nanoparticle Research. 2011. Volume 13. Issue 9. PP. 3633-3641.

•Пучкова А О., Соколов П. А, Лопатько К. Г., Касьяненко Н. А. Фиксация ДНК на поверхности кремния для создания матрицы при формировании нанопроволок // Труды МФТИ. 2011. Том 3. № 2. стр. 43-47-

Подписано в печать 27.06.2014 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ 282

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра молекулярной биофизики

04201460970

СОКОЛОВ Петр Александрович

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ФИКСАЦИИ ДНК НА РАЗЛИЧНЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СФОРМИРОВАННЫХ СТРУКТУР.

02.00.об - высокомолекулярные соединения Диссертация иа соискание ученой степени кандидата фи:шко-математических наук

Научный руководитель: д.ф.-м.н, профессор Касьяненко Н.А.

Санкт-Петербург - 2014

Оглавление

Введение............................................................................................................................................4

ГЛАВА 1..............................................................................................................................................9

1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой.......................................................ю

1.1.1. Подготовка поверхности кремния............................................................................ю

1.1.2. Взаимодействие протравленной поверхности кремния с компонентами раствора...................................................................................................................................15

1.1.3. Поверхностные электронные состояния монокристаллов кремния................23

1.1.4. Исследования электронных свойств интерфейса ДНК-кремний с помощью контактов металл-полупроводник....................................................................................27

1.2. Соединения фенантролина и их свойства.....................................................................32

1.2.1. Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений.....................32

1.2.2. Хемосенсоры на основе фенантролина..................................................................37

1.2.3. Потенциальное применение соединений фенантролина..................................40

1.2.4. Взаимодействие фенантролиновых соединений с различными поверхностями......................................................................................................................46

1.3. Иммобилизация ДНК на различных поверхностях....................................................54

1.3.1. Иммобилизация ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов магния

..................................................................................................................................................54

1.3.2. Фиксация ДНК на поверхность слюды...................................................................57

1.3.3. Ориентация ДНК на поверхности подложки........................................................61

1.3.4. Фиксация ДНК на поверхность золота...................................................................64

ГЛАВА 2...........................................................................................................................................68

2.1. Материалы...........................................................................................................................69

2.2. Методика фиксации ДНК на подложки........................................................................70

2.3. Создание диодов Шоттки..................................................................................................71

2.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса..........................................................72

2.5. Метод атомной силовой микроскопии..........................................................................75

2.6. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний.................77

2.6.1. Обоснование методики эксперимента....................................................................77

2.6.2. Идеальный шоттки-контакт....................................................................................78

2.6.3. Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки..............................................82

2.6.4. Вольт-фарадная характеристика барьера Шоттки..............................................84

2.7. Вискозиметрия...................................................................................................................86

2.8. Программное обеспечение..............................................................................................88

ГЛАВА з...........................................................................................................................................89

3.1. Светоуправляемая фиксация ДНК на поверхность кремния....................................90

3.2. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний...............101

3.2.1. Результаты измерений вольт-амперных характеристик (ВАХ)......................102

3.2.2. Результаты измерений вольт-фарадных характеристики (ВФХ)...................105

3.3. Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного фенантролина.. .109

3.3.1. Фиксация на золотую поверхность........................................................................но

3.3.2. Фиксация на поверхность слюды..........................................................................134

3.3.3. Фиксация на поверхность кремния.......................................................................141

3.3.4. Взаимодействие соединения фенантролина с молекулой ДНК в растворе..148

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................................158

Список литературы......................................................................................................................159

Введение

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Уменьшение размеров электрических схем до нанометрового масштаба ставит перед исследователями задачу по поиску новых способов создания их различных элементов. В частности, для производства миниатюрных контактов некоторое время назад было предложено использовать ДНК [1, 2]. Благодаря способности этой макромолекулы к самоорганизации, стало возможным создавать наноструктуры с заранее определенной геометрией и разрешением до 6 нм, которые можно использовать как составные части электрических наносхем [3]. Исследование проводимости ДНК проводится достаточно широко [4], хотя в этом вопросе остается еще много неясного. Возможность сопряжения ДНК с твердотельной электроникой позволяет создавать различные полупроводниковые устройства, в том числе биодатчики [5-7]. Перспектива использования ДНК для нужд твердотельной электроники при создании электрических схем и биосенсоров требует более тщательного изучения вопросов фиксации макромолекулы на поверхность кремния, который является основой современных электрических микросхем. В частности, необходимо найти способы размещения ДНК в определенном месте наносхемы [8] и установить условия, при которых полимер образует различные упорядоченные структуры на поверхности полупроводника.

Одной из важных задач является изучение влияния заряженной молекулы ДНК при ее фиксации на электрические свойства приповерхностной области полупроводниковой подложки [9, ю]. Это позволит создавать воспроизводимые элементы схем, а также управлять их электрическими свойствами. Собственный заряд биополимера и захват носителей из полупроводника на поверхностные состояния, обусловленные присутствием молекулы, будут менять потенциал поверхности полупроводника, что приведёт к изменению проводимости приповерхностного слоя кристалла кремния. Это может повлечь за собой нарушение работы электронных компонентов (транзисторов и диодов), которые были включены в схему посредством ДНК. С другой сторон, с помощью изменения заряда молекулы, являющейся соединительным проводником, может быть осуществлено управление режимом работы

активных компонентов схемы. В связи с этим возникает задача исследований как электронных свойств собственно молекулы, зафиксированной на поверхности, так и свойств интерфейса структуры ДНК-кремний.

Зондовая микроскопия дает возможность визуализации и изучения конформации, механических и электрических свойств, упругости [н, 12], проводимости [4] отдельных молекул ДНК и ее комплексов с разными лигандами. В связи с этим актуален вопрос о степени возмущения, которое претерпевает макромолекула в процессе иммобилизации на поверхности при проведении измерений [13]. Ответ на данный вопрос позволит экстраполировать данные эксперимента на случай невозмущенной конформации макромолекулы в растворе, что имеет особое значение для биофизических исследований. Поиск способа фиксации, при котором биологический полимер испытывает минимальные возмущения, является важной задачей зондовой микроскопии.

С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) применительно к исследованию взаимодействия ДНК с белками [14, 15] и различными лигандами [16, 17] возникла потребность в простом и надежном способе подготовки чипов, содержащих на золотой поверхности ДНК. Зафиксировать ДНК на золотой поверхности было предложено с помощью и-меркаптоундекановой кислоты в присутствии двухвалентных ионов [18], которые, однако, затрудняют интерпретацию данных об интеркаляции [19]. Альтернативный способ - фиксация путем химической модификации олигонуклеотидов различными группами [20]. Вместе с тем, такой способ не годится для решения целого ряда задач. Кроме того, это удорожает и усложняет эксперимент, в то время как методы фиксации высокомолекулярной ДНК на золотую поверхность практически не развиты. Похожие затруднения возникают при создании биочипов [21, 22] и подготовке образцов ДНК для микроскопии на поверхности слюды, стекла, кремния [23]. При этом исследования позволили бы осознанно подойти к созданию и проектированию новых биосенсоров [24, 25] и управляемых супрамолекулярных структур на основе ДНК-оригами [26, 27] в будущем.

Сказанное выше свидетельствует об актуальности проведенных в работе исследований и практической значимости полученных результатов.

Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы является разработка новых способов фиксации высокомолекулярной ДНК на поверхности слюды, кремния и золота, а также изучение сформированных на подложке структур.

В диссертации решаются следующие задачи:

1. Подбор оптимального способа фиксации ДНК на поверхности кремния для дальнейшей металлизации.

2. Осуществление металлизации зафиксированных молекул ДНК на слюде, стекле, кремнии.

3. Изучение электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний (вольт-амперные и амплитудно-частотные характеристики).

4. Рассмотрение взаимодействия ДНК с серосодержащим производным фенантролина.

5. Исследование процесса адсорбции серосодержащего производного фенантролина на поверхность золота, кремния, слюды и стекла.

6. Разработка способа фиксации молекул ДНК на модифицированные серосодержащим производным фенантролина поверхности золота, кремния, слюды и стекла.

7. Подобор условий для исследования формируемых систем методом плазмонного резонанса.

8. Сравнительный анализ различных способов фиксации ДНК на поверхности.

Научная новизна. В работе впервые предложены способы фиксации ДНК на поверхность кремния в зависимости от облучения. Впервые показана возможность формирования протяженных упорядоченных фибрилл ДНК на поверхности кремния и проведена их металлизация. Впервые проведена оценка плотности поверхностных состояний кремния после фиксации ДНК. Предложен новый способ размещения на поверхности золота, кремния, слюды серосодержащего производного фенантролина, обеспечивающий последующую фиксацию ДНК на модифицированные поверхности.

Положения, выносимые на защиту:

• Характер фиксации ДНК из раствора на поверхность кремния в присутствии ионов магния зависит от облучения образца.

• Участие ДНК в формировании интерфейса Аи-кремний существенно изменяет его электрофизические свойства.

• Качество металлизации ДНК на подложке зависит от свойств сформированных биополимером структур.

• Адсорбционные свойства фенантролина на поверхности золота, кремния, слюды могут быть значительно улучшены путем введения серосодержащей группы.

• Модифицированные серосодержащим фенантролином поверхности слюды, золота и кремния способны фиксировать ДНК.

Степень достоверности и апробацию результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается согласованностью данных, полученных различными методами и воспроизводимостью результатов.

Результаты работы были доложены на всероссийских и международных конференциях:

• X International Conference on "Nanostructured Materials", 2011.

• 11th Intematioal Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and Nanostructures, 2009.

• 17th IUPAB International Biophysics Congress, 2013.

• The 8-th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems", 2014.

• 6 Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры — 2014», 2014.

Основные результаты диссертации опубликованы в статьях:

• N.V. Bazlov, O.F. Vyvenko, Р.А. Sokolov, NA. Kas'yanenko, Yu V. Petrov Charge-controlled fixation of DNA molecules on silicon surface and electro-physical properties of Au-DNA-Si interface // Applied Surface Science. 2013. Volume 267. PP. 224-228.

• V. N. Demidov, N. A. Kas'yanenko, V. S. Antonov, I. L. Volkov, P. A. Sokolov, Т. B. Pakhomova, S. A. Simanova Reaction with DNA and pharmacologic activity of 1,10-phenanthroline and electron-rich l,io-phenanthrocyanine complexes of d-elements // Russian Journal of General Chemistry. 2012. Volume 82, Issue 3. PP. 602-620.

• P. A. Sokolov, N. V. Bazlov, A. O.Puchkova, O. F. Vyvenko, and N.A. Kasyanenko DNA Immobilization on n-Type Silicon Surface and Electrophysical Properties of Au/DNA/ (n-Si) Structures // Protection of metals and physical chemistry of surfaces. 2011. Volume 47. Issue 5. PP. 566-571.

• Puchkova А. О., Sokolov P. A., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on the surface // Journal of Structural Chemistry. 2011. Volume 52. Issue 6. PP. 1195-1201.

• Puchkova A. O., Sokolov P. A., Petrov. Y. V., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on silicon surface // Journal of Nanoparticle Research. 2011. Volume 13. Issue 9. PP.

3633-3641-

• Пучкова А. О., Соколов П. А., Лопатько К. Г., Касьяненко Н. А. Фиксация ДНК на поверхности кремния для создания матрицы при формировании нанопроволок // Труды МФТИ. 2011. Том 3. № 2. стр. 43-47-

ГЛАВА i

1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой

1.1.1. Подготовка поверхности кремния

Перед использованием кремния в качестве подложки для зондовой микроскопии или электроники его поверхность необходимо очистить, чтобы убрать как образовавшийся в процессе хранения оксид кремния, так и адсорбировавшиеся из окружающей среды соединения. Таким образом можно исключить появление артефактов. В работе [28] описан процесс травления кремния в плавиковой кислоте. Контроль поверхности проводили с помощью методов фотоэлектронной спектроскопии и дифракции электронов низкой энергии (LEED). Авторы использовали пластины кремния р- и n-типа проводимости с ориентаций (юо), (111) и (211). Сопротивление образцов варьировалось от 0.005 до 35 Ом-см. В работе отмечается, что после травления проводить сушку образцов не требуется, так как их поверхность становится абсолютно гидрофобной. Независимо от конкретных условий травления в HF и типа образцов, формируется Н-терминированная поверхность. Как видно из рис. 1.1.1, после травления образцов с естественным слоем окисла образуется Н-терминированная поверхность с примесями углерода, фтора и кислорода. Авторы отмечают, что фтор быстро замещается на ОН-группу, последующие превращения которой приводят к образованию оксида. Количество кислорода можно уменьшить, если использовать смесь плавиковой кислоты с этанолом. С течением времени при выдержке на воздухе или в воде, как следует из рис. 1.1.2, поверхность окисляется до нескольких монослоев оксида кремния. При окислении в воде также образуется слой субоксида, которой впоследствии переходит непосредственно в оксид.

Etas csrcentraiicn •% H FI

Рис. l.i.i. Изменение уровня загрязнения подложки кислородом, углеродом и фтором от концентрации HF [28].

£*рй$иг« •:»>) Рис. 1.1.2. Увеличение толщины оксида от времени выдержки протравленной поверхности на воздухе и в бидистиллированной воде [28].

Авторы работы [29] предлагают новый способ измерения концентрации силанольных групп (Si-OH) на поверхности кремния при помощи вещества tridecafluoro-i,i,2,2,-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane (FOCS), растворенного в хлороформе. Этим соединением обрабатывали образцы перед проведением рентгеноструктурного анализа, при помощи которого определяли концентрацию фтора на поверхности, которая, по мнению авторов, пропорциональна концентрации Si-OH (рис. 1.1.3).

3-20 1*

9£ «

0

1 ю

с

й>

О с

С о

о и

и- о

Рис. 1.1.3. Концентрация фтора на соответствующих подложках кремния, содержащих Н, Н/ОН и ОН группы на поверхности [29].

Для приготовления Н-терминированной поверхности пластинки кремния с ориентацией (юо) были протравлены в 0.5% водном растворе HF. В дальнейшем эти образцы использовали для создания Н/ОН-терминированной поверхности путем непродолжительной выдержки в воде и ОН-терминированной поверхности при травлении в H2S04:H202 (1:4)» ПРИ этом обеспечивается высокая степень окисления. Надо отметить, что авторы [29] не приводят данных о температуре, при которой осуществляли подготовку поверхности. Так, например, в работе [30] показано, что при температуре выше 200° С происходит полное замещение ОН групп на используемый в работе реагент (характерное время замещения порядка 20 минут).

На реактивность поверхности кремния можно влиять светом подходящей длины волны. Авторы работы [31] использовали образцы кремния n-типа проводимости с ориентацией (т) и сопротивлением порядка 30 Ом-см. Подложки были предварительно очищены и протравлены в течение 15 минут в 40% NH4F для получения Н-терминированной поверхности. Образцы облучали светом с длиной волны 8оо нм. Измерение скорости роста оксида проводили при помощи метода генерации второй гармоники - Second harmonic generation-RA (RA-SHG). Было показано (рис. 1.1.4), что скорость окисления изменялась на порядок при облучении. Авторы отмечают, что в воде оксид растёт быстрее, чем на воздухе. В работе предполагается, что изменение скорости роста оксида связано с генерацией светом электрон-дырочных пар. Под действием поля в ОПЗ электроны попадают на поверхность полупроводника, где реагируют с кислородом или водой, катализируя рост оксида.

Рис. 1.1.4. Зависимость начальной скорости окисления от освещения (в количестве фотонов на квадратный сантиметр в сек) [31].

В работе [32] использовали кремний п-типа проводимости с ориентацией (111) и (юо) с сопротивлением от 1 до ю Ом-см. Изнача