Исследование явления агрегации в твердофазном синтезе пептидов свеллографическим методом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

страницы

• Список нестандартный сокращений

I. ВВЕДЕНИЕ 9 И. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Агрегация в твердофазном пептидном синтезе»

I. Введение

1.1. Принцип ТФПС

1.2. Проблемы ТФПС

1.3. Конформации полипептидных цепей

П. Способы обнаружения и методы изучения агрегации в ТФПС

II. 1. Аналитические методы косвенного обнаружения агрегации пептидилполимера 18 П.2. Неспецифические аналитические методы, косвенно и ретроспективно свидетельствующие о наступлении агрегации

П.З. Физико-химические методы, косвенно регистрирующие агрегацию в реальном масштабе времени

И.4. Физико-химические методы, детектирующие коллапс ПП

II. 5. Физико-химические методы, дающие прямую информацию о структуре агрегатов ПП (идентифицирующие Р-складчатую структуру)

Ш. Методы подавления агрегации пептидилполимера

III. 1. Оптимизация свойств полимерной матрицы 26 Ш.2. Изменение условий протекания реакций деблою. аания и конденсаций

III.2.A. Влияние природы растворителей и их смесей на агрегацию

Ш.2.Б. Хаотропные добавки

111.2.B. Влияние температуры

111.3. Влияние замены стандартных защитных групп боковой цепи аминокислот на альтернативные

111.4. Блокирование H-N« - связей основной полипептидной цепи

III. 5. Оптимизация ключевых химических стадий ТФПС и другие неспецифические для агрегации воздействия на ПП

IV. Прогнозирование априори «трудных» для синтеза участков аминокислотных последовательностей

Таблица I \

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

I. Свеллографический метод

П. Признаки агрегации, регистрируемые свеллографическим методом: 76 Ш. Синтез фрагмента 125-145 а-субъединицы ацетилхолинового рецептора

IV. Синтез фрагмента 65-74 ацилпереносящего белка

V. Свеллографический метод как инструмент исследования разнообразных аспектов явления агрегации

VI. Оценка предрасположенности аминокислот к агрегации с применением подхода «гость-хозяин» 89 VH. Степень агрегации AD как универсальный количественный критерий интенсивности агрегации

Vin. Корреляция значений ADe с другими параметрами, характеризующими предрасположенность аминокислот к образованию

Р-складчатой структуры

IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Приборы и материалы

2. Методики

V. ВЫВОДЫ

Целью белкового и пептидного синтеза является получение чистых соединений хорошо известной структуры. Существует две фундаментальные стратегии для синтеза этих соединений: известный с начала прошлого века синтез в растворе («классический») и пошаговый твердофазный пептидный синтез (ТФПС), появившийся значительно позднее -в 1962 и приобретший большую популярность ввиду своей технологичности и высокой эффективности. Однако как для «классического», ¡ак и для ТФПС однозначный синтез произвольной аминокислотной последовательности до сих пор остается одной из самых главных проблем. Это связано с существованием синтетических сложностей, зависящих от аминокислотной последовательности (так называемые "трудные" пептиды). о

Причиной этих проблем является межмолекулярная ассоциация пептидных цепей (аналогичная проблеме нерастворимости в «классическом» варианте) внутри полимерной матрицы по типу частичной Р-складчатой структуры или агрегация, в результате которой происходит резкое сжатие пептидилполимера и значительное уменьшение выхода реакций на стадии конденсации и деблокирования. Несмотря на неослабевающий интерес к этому явлению в ТФПС со стороны пептидных химиков, ряд проблем в данной области сохраняют свою остроту. Это, в первую очередь, проблема создания универсального неинвазивного метода детектирования агрегации в реальном масштабе времени ТФПС. Вторая фундаментальная проблема - это прогнозирование агрегации реальных пептидов в условиях ТФПС.

Настоящая работа посвящена изучению агрегации пептидилполимера с использованием свеллографического мониторинга. Метод был разработан в Филиале института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова и позволяет регистрировать изменение объема пептидилполимера в ходе синтеза.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Агрегация в твердофазном пептидном синтезе

I. Введение.

1.1. Принцип ТФПС.

Новая эпоха в истории химии пептидов началась с 1962 года, когда В. МегпйеИ предложил принципиально новый подход к синтезу пептидов, получивший название твердофазного пептидного синтеза (ТФПС). Суть метода ТФПС, схема которого представлена ниже (схема 1) заключается в следующем [1,2]: к полимеру с реакционно-способной «якорной» группировкой (X) ковалентно присоединяют С-концевую аминокислоту, а- аминогруппа которой защищена «временной» защитной группой (Ь). Если боковая цепь аминокислоты содержит реакционно-способную функциональную группу, такая группа должна быть блокирована «постоянной» защитной группой (Б). Далее на стадии деблокирования происходит селективное удаление «временной» защитной группы. Каждую последующую аминокислоту присоединяют аналогичным образом до завершения сборки целевой последовательности. После этого пептид отщепляют от полимерной матрицы. Одновременно с этим процессом происходит удаление «постоянных» защитных групп [2,3].

Существовавший до этого традиционный или «классический» метод синтеза пептидов в растворе, отличался большой трудоемкостью. Проблемы, связанные с необходимостью выделения, очистки, характеризации и растворимостью промежуточных продуктов на каждой стадии процесса, значительно усложняли процесс. В отличие от «классического» ТФС является гораздо более техно.'кл ичным и эффективным способом. Отпадает необходимость очистки промежуточных продуктов на каждой стадии синтеза, а удаление избытков реагентов и растворителей : можно простым фильтрованием. Существенное преимущество метода состоит в возми. , . ¡и автоматизации процесса. Именно благодаря этому, ТФПС сегодня - самый распространенный метод для синтеза пептидов как в аналитических, так и в препаративных количествах.

О V

Peptide — С—О

POLYMER

Н F

Peptide

POLYMER

Схема 1 Принципиальная схема синтеза пептидов на твердой фазе.

Развитие ТФ методологии показало, что использование полимерной подложки действительно упрощает и облегчает синтез, что является неоспоримым преимуществом ТФПС перед «классическим» методом. Однако, достоинства ТФПС имеют и обратную сторону: по мере удлинения полипептидной цепи на полимерной матрице в результате побочных реакций накапливаются пептиды с пропусками («ошибочные», «усеченные» пептиды). Многие из них незначительно отличаются от исходной последовательности, что чрезвычайно затрудняет очистку готового пептида после удаления его с твердой фазы. Таким образом, если говорить об общих, чисто химических проблемах пептидного синтеза, ТФС их обострил, способствовал выявлению ранее скрытых проблем [4-6]. Анализ их происхождения привел к выводу, что ТФС предъявляет более жесткие требования к выходу на каждой индивидуальной химической реакции, устойчивости «якорной» и «постоянных» защитных групп, а также к чистоте используемых реагентов, растворителей и полимерного носителя [2,5-7].

1.2. Проблемы ТФПС.

Побочные реакции в ходе ТФПС можно отнести к трем основным классам:

1) побочные реакции, которые возникают в процессе пошагового ТФПС. Сюда относятся общие побочные реакции, связанные с преждевременным отщеплением «постоянных» защитных групп в процессе Вос-деблокирования, трифторацетилирование, модификации чувствительных функциональных групп боковых цепей аминокислотных остатков;

2) побочные реакции, связанные с отдельными аминокислотными остатками, часто усугубляемые ближайшими соседями по цепи (рацемизация, образование лактамов с участием боковых функциональных групп глутаминовой кислоты и аргинина, образование имидов с участием Asp, Asn, Glu и Gin, образование дикетопиперазинов; образование пептидов с пропусками из-за так называемых «случайных» (в англоязычной литературе-«random») незавершенных конденсаций, протекающих медленно из-за участия пространственно-экранированных аминокислот, таких как Ile, Val, Thr. «Случайные» незавершенные реакции составляют 0.5%-2.0% (по Kent'y [6]) от всех конденсаций и проявляются как «точечные» явления, зависящие от одной или двух находящихся рядом стерически затрудненных аминокислот. Подобная проблема преодолевается повторным аминоацилированием;

3) зависящие от последовательности аминокислот (sequence-dependent) незавершенные реакции конденсации и деблокирования. Анализ большого количества экспериментальных данных, проведенный Kent'oM, свидетельствует о значительном количестве подобных реакций (2%-20% от всех конденсаций)[6], которые называют «нecлyчaйными»-«nonrandom». «Неслучайные» незавершенные конденсации носят не «точечный», а более продолжительный характер: включение трех и более аминокислот протекает с трудностями, причем их завершения невозможно добиться повторным аминоацилированием. Механизм возникновения этого явления связывают со способностью полимерсвязанных пептидных цепей к образованию межмолекулярных водородных связей, приводящему к их агрегации. Получены свидетельства в пользу того, что эти агрегаты имеют строение частичной Р-складчатой структуры (partial P-sheet structure) [4-6].

Все вышеперечисленные проблемы препятствуют выполнению важнейших условий ТФПС для получения гомогенного пептида, регламентирующих протекание реакций деблокирования и конденсации с выходом близким к 100% с минимумом побочных реакций в боковых цепях. Однако, наибольший интерес для нас представляет проблема агрегации пептидилполимера, едва ли не самая серьезная из них. Как зарождается агрегация и что при этом происходит, каковы методы ее исследования и способы разрушения агрегатов пептидилполимеров - все эти вопросы мы попытаемся осветить в нашем обзоре.

ВЫВОДЫ

1. Свеллографический мониторинг является неинвазивным и универсальным прямым методом обнаружения агрегации в реальном масштабе времени ТФПС.

2. Однозначное распознавание ранних стадий агрегации по отклонению от линейности зависимости изменения объема пептидилполимера от прироста массы является значительным преимуществом нашего метода перед существующими ныне, которые обнаруживают агрегацию с запаздыванием на 1-3 шага.

3. Важным качественным признаком наступления агрегации является аномальный профиль изменения объема пептидилполимера в ходе конденсации. Подход легко алгоритмизуется и пригоден для использования в автоматическом режиме и реальном масштабе времени ТФС.

4. В качестве количественного критерия интенсивности агрегации предложена величина «степени агрегации» АО, рассчитываемая как относительное отклонение реального изменения объема пептидилполимера от ожидаемого.

5. Склонность к агрегации 27 аминокислотных остатков X количественно охарактеризована параметрами А1)б, рассчитанными для полимерсвязанных гексапептидов типа: Ртос-А1а-Х-(А1а)з-Муа-(Р8).

6. Обнаружено, что величины АОб обнаруживают значимую взаимосвязь (коэффициент корреляции Б. = 0.8-7-0.9) с двумя родственными наборами характеристик аминокислот, независимо полученными другими исследиьателями.

1. Merrifield R.B. Solid phase peptide synthesis. 1. The synthesis of a tetrapeptide.- J. Am. Chem. Soc., 1963, v.85, n.14, pp.2149-2154.

2. Stewart J.M. and Young J.D. Solid phase peptide synthesis., Sec.Ed. Pierce Chemical Co.Pub., Rockford, IL., 1984, pp.53-84.

3. Гершкович A.A., Кибирев B.K. Химический синтез пептидов.- Киев, Наукова думка, 1992.

4. Fankhauser P. and Brenner М. Need for solid phase thinking in solid phase synthesis.- In: The Chemistry of Polypeptides. (Katsoyannis P.G., ed.), New York: Plenum Press, 1973, pp.389-411.

5. Atherton E. and Sheppard R.C. Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Oxford, UK: IRL Press, 1989, pp. 107-130.

6. Larsen В., and Holm A. Incomplete Fmoc deprotection in solid-phase synthesis of peptides.- Int. J. PeptideProtein Res., 1994, v.43, n.l, pp.1-9.

7. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия.- Москва, Просвещение., 1987.

8. Atherton E., Woolley and Sheppard R.C. Internal Association in Solid Phase Peptide Synthesis. Sinthesis of Cytochrome С Residues 66-104 on Polyamide Supports.- J. C. S. Chem. Comm., 1980, pp.970-971.

9. Hyde C., Jonson Т., and Sheppard R.C. Internal Aggregation during Solid Phase Peptide Synthesis. Dimethyl Sulfoxide as a Powerful Dissociating Solvent.- J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1992, n.21, pp.1573-1575.

10. Bedford J., Hyde C., Johnson Т., Jun W., Owen D., Quibell M., and Sheppard R.C. Amino Acid Structure and "Difficult Sequences" in Solid Phase Peptide Synthesis.- Int. J. Peptide Protein Res., 1992, v.40, n.3/4, pp.300-307.

11. Сидорова M.B., Молокоедов A.C., Овчинников M.B., Беспалов Ж.Д., Бушуев В.Н. Твердофазный синтез Р-амилоида-( 1 -42).- Биоорган. Химия, 1997, т.23, №1, с. 46-55.

12. Kent S.B.H. Chemical synthesis of peptides and proteins.- Annu Rev Biochem, 1988, v.57, pp.957-89.

13. Guthrie D.J.S., El-Agnaf O., Harriott P., Irvine G.B. and Walker B. Successful syntheses of beta amyloid-(25-35)-peptide. A difficult sequence by N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) chemistry. -Biochem.Soc.Trans., 1994, v.22, n.4, pp. 1052-1054.

14. Schnolzer M., Alewood P., Jones A., Alewood D. and Kent S.B.H. In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences.-Int.J.Pept.Protein Res., 1992, v.40, n.3-4, pp. 180-193.

15. Krchnak V. and Vagner J. Color-monitored solid-phase multiple peptide synthesis under low-pressure continuous-flow conditions.- Pept. Res., 1990, v.3, n.4, pp.182-193.

16. Krchnak . Flegelova Z. and Vagner J. Aggregation of resin-bound peptides during solid-phase peptide synthesis. Prediction of difficult sequences I ¡¡.J.Pept.Protein Res., 1993, v. 42, n.5, pp.450454.

17. Milton L.R.C., Milton S.C.F. and Adams P. A Prediction of Difficult Sequences in Solid-Phase Peptide Synthesis.- J. Am. Chem. Soc. 1990, v. I! 2, n.16, pp.6039-6046.

18. Kaiser E., Coleskott R.L., Bossinger C.D. anu Cook P.I.- Color test for the detection of amino groups in the solid phase synthesis of peptides.- Anal. Biochem., 1970, v.34, n.2, pp.595-598.

19. Sarin V.K., Kent S.B.H., Tam J.P. and Merri'k-ld R.B. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrine reaction.- Anal. Biochem., 1981, v.117, n.l, pp.147-157.

20. Hancock W.S., Prescott D.J., Vagelos P.R., and Marshall G.R. Solvation of the Polymer Matrix. Source of Truncated and Deletion Sequences in Solid Phase Synthesis.- J. Org. Chem., 1973, v.38, n.4, pp.774-781.

21. Dorman L.C. and Love J. Esterification of neutral and basic dialkyl(arylmethylene)sulfonium resins with N-protected amino acids for use in solid phase peptide synthesis.- J. Org. Chem., 1969, v.34, n.l, pp.158-65.

22. Hodges R.S. and Merrifield R.B. Monitoring of solid phase peptide synthesis by an automated spectrophotometry picrate method.- Anal. Biochem , h)75, v.65, n.1-2, pp.241-72.

23. Стюарт Дж. Синтез и деструкция пептидов на полимерных носителях.-В кн.: Реакции на полимерных подложках в органическом синтезе. (Ред. Ходж П. И Шеррингтон Д.), М: «Мир», 1983, стр.417-497.

24. Beyerman Н.С. and Hindriks Н. Determination of the completeness of coupling in solid phase peptide synthesis by a colour indicator.- In: Peptides 1969. Proc. 10th European Pept. Symp. /ScofFone E., ed.- Amsterdam: North-Holland, 1971, pp.145.

25. Krchnak . Vagner J. and Lebl M. Noninvasive continuous monitoring of solid-phase peptide synthesis by acid-base indicator letter.- Int. J. Pept. Prot. Res., 1988, v.32, n.5, pp.415-6.

26. Krchnak . Vagner J., Safar P. and Lebl M. Noninvasive continuous monitoring of solid-phase peptide synthesis by acid-base indicator.- Collect. Czech. Chem. Commun., 1988, v.53, n.llA, pp.2542-2548.

27. Merrifield R.B., Singer J., and Chait B.T. Mass Spectrometry Evaluation of Synthetic Peptides for Deletions and Insertions.- Anal. Biochem., 1988, v. 174, pp.399-414.

28. Thaler A., Seebach, D. and Cardinaux F. Improvement of Degree of Resin Swelling and Efficiency of Coupling in Solid-Phase Synthesis.- Helvetica Chimica Acta, 1991, v.74, pp.628-643.

29. Atherton E., Brown E., Sheppard R.C. and Rosevear A. A physically supported gel polymer for low pressure, continuous flow solid phase reactions. Application to solid phase peptide synthesis.-J.Chem.Soc., Chem.Comm., 1981, n.21, pp.1151-1152.

30. Dryland A. and Sheppard R.S.- Peptide Synthesis. Part 8. A system for solid-phase synthesis under low pressure continuous flow conditions.- J.Chem.Soc.Perkin Trans. 1, 1986, n. 1, pp. 125-137.

31. Dryland A. and Sheppard R.S.- Peptide Synthesis. Part 11. A system for continuous flow solid phase peptide synthesis using fluorenylmethoxycarbonil-amino acid pentafluorophenyl esters.-Tetrahedron, 1988, v.44, n.3, pp.859-876.

32. Schafer-Nielsen C., Hansen P.H., Lihme A. and Heegaard P.M.H. Real time monitoring of acylations during solid phase peptide synthesis: a method based on electrochemical detection.- J. Biochem. Biophys. Methods, 1989, v.20, pp.69-80.

33. Milton S.C.F., and Milton L.R.C.« An improved solid-phase synthesis of a difficult-sequence peptide using hexafluoro-2-propanol.- Int.J. Pept. Prot. Res., 1990, v.36, n.2, pp. 193-196.

34. Mohanraj S. and Ford W.T. Analysis of cross-linking of poly(chloromethyl)styrene. by highresolution 13C NMR spectroscopy.- Macromolecules, 1985, v.18, n.3, pp.351-356.

35. Stover H.D.H. and Frechet J.M.J. NMR characterization of cross-linked polystyrene gels.-Macromolecules, 1991, v.24, n.4, pp.883-888.

36. Mazure M., Calas B., Cave A., Parello J. Solid phase peptide synthesis. Structural characterisation by *H NMR of a peptide immobilized on a polyacrylic resin.- C.R. Acad. Sei. Paris, 1986, t.303, Ser.II, n.7, pp.553-556.

37. Deber C.M., Lutek M.K., Heimer E.P. and Felix A.M. Conformational Origin of a Difficult Coupling in a Human Growth Hormone Releasing Factor Analog.- Peptide Research, 1989, v.2, n.2, pp.184-188.

38. Egner B.J. and Bradley M. Analytical techniques for solid-phase organic and combinatorial synthesis.-DDT, 1997, v.2, n.3, pp. 102-109.

39. Ludwick A.G., Jelinski L.W., Live D., Kintanar A. and Dumais J.J. Association of Peptide Chains during Merrifield Solid-Phase Peptide Synthesis. A Deuterium NMR Study.- J. Am. Chem. Soc. 1986, v.108, n.21, pp.6493-6496.

40. Chou P. and Fasman G.D. Empirical predictions of protein conformation.- Ann. Rev. Biochem., 1978, v.47, pp.251-276.

41. Ford W.T. and Yacoub S.A. A C-13 NMR method to determine the origin of cross-linked chloromethyl polystyrenes used in polymer-supported synthesis.- J. Org. Chem., 1981, v.46, n.4, pp.819-821.

42. Cilli E.M., Marchetto R., Schreier S. and Nakaie C.R. Use of spin label EPR spectra to monitor peptide chain aggregation inside resin beads.- Tetrahedron Lett., 1997, v.38, n.4, pp.517-520.

43. Guyot A. Some problems in the physical and chemical chracterization of functionalized supports.-React. Polymers, 1989, v. 10, pp.113-129.

44. Regen S.L. Influence of Solvent on the Motion of Molecules "Immobilized" on Polystyrene Matrices and on Glass Surfaces.- J.Am.Chem.Soc., 1975, v.97, pp.3108-3112.

45. Kenneth J.S. Characterization of network polymers by fluorescence techniques.- React. Polymers, 1989, v.10, pp.302.

46. Narita M., Umeyama H. and Yoshida T. The Easy Disruption of the -Sheet Structure of Resin-Bound Human Proinsulin C-Peptide Fragments by Strong Elektron-Donor Solvents.-Bull.Chem.Soc.Jpn., 1989, v.62, n.ll, pp.3582-3586.

47. Henkel B. and Bayer E. Monitoring of solid phase peptide synthesis by FT-IR spectroscopy.- J. Peptide Sei., 1998, v.4, pp.461-470.

48. Okuyama K., Nakanishi S., Saga Y., Umeyama H. and Narita M. The 3/10-helical conformation of Aib-containing oligopeptide, Boc-(L-Leu-Aib2)2-OBzl.- Bull.Chem.Soc.Jpn., 1990, v.63, n.ll, pp.3149-3155.

49. Toniolo C., Bonora G.M., Salardi S. and Mutter M. Linear Oligopeptides. A Circular Dichroism Study of -Helix and -Structure Formation in Solution by Homooligo-L-methionines.-Macromolecules, 1979, v. 12, n.4, pp.620-625.

50. Toniolo C., Bonora G.M., Heimer E.P. and Felix A.M. Structure, Solubility and Reactivity of Peptides.- Int. J. Pept. Protein Res., 1987, v.30, n.2, pp.232-239.

51. Narita M. and Kojima Y. The beta-sheet structure-stabilizing potential of twenty kinds of amino acid residues in protected peptides.-Bull. Chem. Soc. Jpn., 1989, v.62, n.ll, pp.3572-3576.

52. Narita M., Honda S. and Obana S. The ß-Sheet Structure-Disrupting Potential of Electron-Donor and -Acceptor Solvents and Role of Mixed Solvents in Solvation of Peptides.- Bull. Chem. Soc. Jpn., 1989, v.62, n. 1, pp.342-344.

53. Larsen B.D., Chistensen D.H., Holm A., Zillmer R., and Faurskov Nielsen 0. The Merrifield peptide synthesis studied by near-infrared foun ransform raman spectroscopy.- J. Am. Chem. Soc., 1993, v.115, n.14, pp.6247-6253.

54. Erickson B.W., Merrifield R.B.-In: The Protc (By Neurath H., Hill R.L., eds.), 3rd ed., v.2, Academic Press, New York, 1976, pp.255.

55. Sheppard R.C. (1973) Solid phase peptide uthesis-an assessment of the present position, in Peptides 1971 (Nesvadba, H.,ed.), North-hollars ¡blishers, Amsterdam, pp.111-125.

56. Benz H. The role of solid-phase fragment condensation in peptide synthesis.- Synthesis, 1994, pp.337-358.

57. Sarin V.K., Kent S.B.H. and Merrifield R.B. Properties of Swollen Polymer Networks. Solvation and Swelling of Peptide-Containing Resins in Solid-Phase Peptide Synthesis.- J.Am.Chem.Soc., 1980, v.102, n.17, pp.5463-5470.

58. Merrifield R.B. The role of the support in solid phase peptide synthesis.-Brit.Polym.J., 1984, v. 16, n.2, pp. 173-178.

59. Epton R, Wellings D. A. and Williams A. Perspectives in ultra-high load solid (gel) phase peptide synthesis.- React. Polym., 1987, n.2, pp.143-157.

60. Pugh K.C., York E.J., and Stewart J.- Effects of Resin Swelling and Substitution on Solid Phase Synthesis.- Int. J. Peptide Protein Res., 1992, v.40, n.3/4, pp.208-213.

61. Atherton E., Gait M.J., Shappard RC., Williams B.J. The polyamide method of solid phase peptide and oligonucleotide synthesis.- Bioorganic Chem., 1979, v.8, n.2, pp.351-370.

62. Arshady R., Atherton E., Clive D.L.J, and Sheppard R.C. Peptide synthesis. 1. Preparation and use of polar supports based on poly(dimethylacrylamide).- J. Chem. Soc. Perkin 1., 1981, pp.52937.

63. Bayer E., Dengler M. and Hemmasi B. Peptide synthesis on the new polyoxyethylene-polystyrene graft copolymer, synthesis of insulin B(21-30).- Int.J.Pept.Protein Res., 1985, v.25, pp.178-186.

64. Kempe M. and Barany G. CLEAR. A novel family of highly cross-linked polymeric supports for solid-phase peptide synthesis.- J.Am.Chem.Soc., 1996, v.118, n.30, pp.7083-7093.

65. Gausepohl H., Rapp W., Bayer E., Frank R. Synthesis optimisation using continuous flow UF-monitoring: effect of secondary formation on different supports.- 22th European Pept. Symp. (Roger Epton, eds.), Canterbury, 1992, pp. 1-5.°

66. Otteson K.M., Noble R.L. and Harrison J.L. Comparison of peptide sequences with deprotection problems in Fmoc solid phase peptide synthesis.- In: Peptides 1994. Proc. 23d Europ. Pept. Symp. (Maia H.L.S., ed.), ESCOM III: Leiden, 1994.

67. Cilli E.M., de Oliveira E., Marchetto R., Paiva A.C.M. and Nakaie C.R. Solvation Approach to the Synthesis of Aggregating Sequences in High-Loaded Resins.- Peptides, 1992, pp.425-426.

68. Atherton E., Clive D.L. and Sheppard RC. Polyamide supports for polypeptide synthesis.-J.Am.Chem.Soc., 1975, v.97, n.22, pp.6584-6585.

69. Frank R. and Doring R. Simultaneous multiply peptide synthesis under continuous flow conditions on cellulose paper discs as segmental solid supports.- Tetrahedron, 1988, v.44, n.19, pp.6031-6040.

70. Meldal M., Auzanneau F.-I., Hindsgaul O. and Palcic M.M. A PEGA resin for use in the solidphase chemical-enzymatic synthesis of glycopeptides.- J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1994, v. 16, pp.1849-1850.

71. Auzanneau F.I., Meldal M. and Bock K. Synthesis, characterization and biocompatibility of PEGA resins.- J. Pept. Sci., 1995, v.l, n.l, pp.31-44.

72. Small P.W. and Sherrington D.C°. Design and application of a new rigid support for high efficiency continuous-flow peptide synthesis.- J.Chem.Soc., Chem.Comun., 1989, v.21, pp.15891591.

73. Eichler J., Bienert M., Stierandova A. and Lebl M. Evaluation of cotton as a carrier for solidphase peptide synthesis.- Peptide Res., 1991, v.4, n.5, pp.296-307.

74. Westall F.C. and Robinson A.B. Solvent modification in Merrifield solid-phase peptide synthesis.- J.Org.Chem., 1970, v.35, n.8, pp.2842-2844.

75. Toniolo C. and Bonora G.M. The Effect of the Insertion of a Proline Residue on the Solution Conformation of Host Peptides.- Makromol. Clu 1981, v.182, n.7, pp.2007-2014.

76. Narita M., Honda S., Umeyama H. and Obana S. The Solubility of Peptide Intermediates in Organic Solvents. Solubilizing Potential of Hexafluoro-2-propanol.-Bull.Chem.Soc.Jpn., 1988, v.61, n.l, pp.281-284.

77. Narita M., Lee J., Hayashi S. and Hitomi M. The estimation of the beta-sheet-structure stability of protected peptides in organic solvents.- Bull.Chem.Soc.Jpn., 1993, v.66, n.2, pp.489-493.

78. Narita M., Umeyama H., Isokawa S., Honda S., Sasaki C. and Kakei H. The electron donor-acceptor interaction between mixed solvents and its influence on their beta-sheet structure-disrupting potential.- Bull.Chem.Soc.Jpn., 1989, v.62, n.3, pp.780-785.

79. Лупи А., Чубар Б. Солевые эффекты в органической и металлоорганической химии,-Пер. с франц. (под ред. Шилова А.Е.), Москва, Мир, 1991.

80. Narita M., Umeyama H. and Sasaki C. Weak dependence of octapeptide solubility in organic solvents on the amino acid sequence.- Int.J.Pept.Protein Res., 1989, v.33, pp.340-344.

81. Geiser T., Beilan H., Bergot B.J. and Otteson K.M. Automation of solid-phase peptide synthesis.- In: Macromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications./ Schlesinger D.H. eds., Alan R.Liss, Inc., New York, 1988, pp.199-218.

82. Fields G.B. and Fields C.G. Solvation effects in solid-phase peptide synthesis.-J.Am.Chem.Soc., 1991, v. 113, pp.4202-4207.

83. Fields C.G. and Fields G.B. Solvents for solid-phase peptide synthesis.- Methods Mol.Biol., 1994, v.35, pp.29-40.

84. Bayer E. and Goldammer C. Conformation dependent coupling and deprotection: diagnosis and cure.-In: Peptides: Chemistry and Biology. Proc. 12th Amer. Pept. Symp. (Smith J.A. and Rivier J.E., eds.), 1992, Escom, Leiden, pp.589-590.

85. Rapp W. and Bayer E. Peptide screening and optimization by using monosized 25-|im tentacle microspferes.- In: Peptide Chemistry 1992. Proc. of the 2nd Japan Symposium on Peptides

86. Chemistry. (N.Yanaihuva, eds.), ESCOM Science Publishers B.V.: Leiden, 1993, pp.7-10.

87. Morii H. and Ichimura K. Solubility and coupling reactivity of protected peptides in highly polar solvents.- Bull.Chem.Soc.Jpn., 1989, v.62, pp.2730-2732.

88. Stewart J.M., Klis W.A. Polystyrene-based solid phase peptide synthesis: the state of art.- In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis: Peptides, Proteins and Nucleic Acids

89. Biological and Biomedical Applications. Proc. 1st. Int. Symp. (Epton R, ed.), SPSS(UK) Ltd: Birmingham, UK, 1990, pp. 1-11.

90. Larsen B.D., Larsen C. and Holm A. Incomplete Fmoc-deprotection in solid phase peptide synthesis.- In: Peptides 1990. Proc. 21st Europ.Pept.Symp. (Giralt E., Andreu D., eds.), ESCOM Science Publishers B.V.: Leiden, 1990, pp.183-185.

91. Hendrix J.C., Halverson K.J., Jarrett J.T. and Lansbury R.P.T. A Novel Solvent System for Solid-Phase Synthesis of Protected Peptides: The Disaggregation of Resin-Bound Antiparallel -Sheet.- J.Org.Chem., 1990, v.55, pp.4517-4518.

92. Thaler A., Seebach D. and Cardinaux F. Conditions for the Use of Lithium-Salts in Coupling Reactions.- Helv. Chim. Acta., 1991, v.74, pp.617-627.

93. Hendrix J.C., Jarrett J.T., Anisfeld S.T. and Lansbury R.P.T. Studies related to a convergentfragment-coupling approach to peptide synthesis using the Kaiser oxime resin.- J.Org.Chem., 1992, v.57, pp.3414-3420.

94. Kaplan B.E., Hefta L.J., Blake II R.C., Svuuerek K.M., Shively J.E. Solid-phase synthesis and characterization of carcinoembryonic antigen (CEA) domains.- J.Peptide Res., 1998, v.52, pp.249260.

95. Yu H.M., Chen S.T. and Wang K.T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation.- J.Org.Chem., 1992, v.57, pp.4781-4785.

96. Vagner J., Kocna P. and Krchnak V. Continuous-flow synthesis of alpha-gliadin peptides in an ultrasonic field and assay of their inhibition of intestinal sucrase activity.- Pept.Res., 1991, v.4, n.5, pp.284-288.

97. Drijfhout J.W. and Bloemhoff W. The use of Fmoc-Thr-OH in the synthesis of difficult peptides.- In: Peptides 1992. Proc. 22nd Europ. Peptide Symp. (Schneider C.H., Eberle A.N. eds.), ESCOM Science Publishers B.V.: Leiden, 1993, pp.275-277.

98. Barlos K., Gatos D. and Kutsogianni S. Fmoc/Trt-amino acids: comparison to Fmoc/tBu-amino acids in peptide synthesis.- J.Peptide Res., 1998, v.51, pp. 194-200.

99. McCaldon P. and Argos P. Oligopeptide biases in protein sequences and their use in predicting prorein coding region in nucleotide sequences.- Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1988, v.4, n.2, pp.99-122.

100. Toniolo C. and Bonora G.M. The Effect of the Insertion of a Proline Residue on the Solution Conformation of Host Peptides.- Makromol. Chem., 1981, v.182, n.7, pp.2007-2014.

101. Weygand F., Steglich W., Bjarnason J., Akhtar R. und Khan N.M. Leicht Abspaltbare Schutzgruppen fur Saureamidfunktionen.- Tetrahedron Lett., 1966, v.29, pp.3483-3487.

102. Weygand F., Steglich W., Bjarnason J., Akhtar R. und Chytil N. Vergleichende Untersuchungen zur Abspaltung substit. Benzylreste vom Amidstickstoff und deren Kombinationsmoglichkeiten mit Urethanschutzgruppen.- Chem.Ber., 1968, v.101, pp.3623-3641.

103. Weygand F., Steglich W. und Bjarnason J. Derivate des Asparagins und Glutamins mit 2.4-dimethoxy-benzyl- und 2.4.6-trimethoxy-benzyl-geschutzten Amidgruppen.- Chem.Ber., 1968, v.101, pp.3642-3648.

104. Narita M., Isokawa S., Doi M. and Wakita R. The ability of the proline residue to promote successive-intramolecular hydrogen bonds in oligopeptides.- Bull.Chem.Soc.Jpn., 1986, v.59, n.ll, pp.3547-3552.

105. Bartl R., Kloppel K.D. and Frank R. Towards elimination of segment insolubility during SPPS.-In: Peptides: Chemistry and Biology. Proc. 12th Amer. Pept. Symp. (Smith J.A. and Rivier J.E., eds.), Escom Leiden, 1992, pp.505-506'.

106. Johnson T., Quibell M., Owen D. and Sheppard R.C. A reversible protecting group for the amide bond in peptides. Use in the synthesis of "difficult sequence".- J.Chem.Soc.,Chem.Commun., 1993, pp.369-372.

107. Johnson T., Owen D., Quibell M. and Sheppard R.C. Peptide bound formation throigh acyl transfer: a possible solution to the "difficult sequence" problem.- In: Peptides 1992. Proc. 22nd

108. Europ. Peptide Symp. (Schneider C.H., Eberle A.N. eds.), ESCOM Science Publishers B.V.: Leiden,1993, pp.23-24.

109. Hyde C., Johnson Т., Owen D., Quibell M. and Sheppard R.C. Some 'difficult sequences' made easy. A study of interchain association in solid-phase peptide synthesis.- Int.J.Pept.Protein Res.,1994, v.43, n.5, pp.431-440.

110. Johnson Т., Quibell M. and Sheppard R.C. N,0-bisFmoc derivatives of N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)-amino acids: useful intermediates in peptide synthesis.- J.Pept.Sci., 1995, v.l, n.l, pp. 11-25.

111. Johnson Т., Packman L.C., Hyde C.B., Owen D. and Quibell M. Backbone protection and its application to the synthesis of a difficult phosphopeptide sequence.- J.Chem.Soc.Perkin Trans. 1, 1996, v.7, pp.719-728.

112. Ede N.J., Ang K.H., James I.W. and Bray A.M. Incorporation of 2-hydroxy-4-methoxybenzyl protection during peptide synthesis via reductive alkylation on the solid phase.- Tetrahedron Lett., 1996, v.37, n.50, pp.9097-9100.

113. Каталог NO VABIOCHEM. Improved synthesis of difficult sequences.-1996, n.3.

114. Zeng W., Regamey P., Rose K., Wang Y. and Bayer E. Use of fmoc-N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)amino acids in peptide synthesis.- J.Pept.Res., 1997, v.49, n.3, pp.273-279.

115. Nicolas E., Pujades M., Bacardit J., Giralt E. and Albericio F. A new approach to Hmb-backbone protection of peptides. Synthesis and reactivity of Nalpha-Fmoc-Nalpha-(Hmb)amino acids.- Tetrahedron Lett., 1997, v.38, n.13, pp.2317-2320.

116. Clippingdale A.B., Macris M., Wade J.D., Barrow C.J. Synthesis and secondary structural stuies of penta(acetyl-Hmb)A-betta(l-40).- J.Peptide Res., 1999, v.53, pp.665-672.

117. Quibell M., Turnell W. and Johnson T Improved preparation of P-amyloid(l-43): structural insights leading to optimised positioning of N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl) (Hmb) backbone amide protection- J.Chem.Soc.Perkin Trans., 1995, v.l, pp.2019-2024.

118. Mutter M., Nefzi A., Sato Т., Sun X., Wahl F. and Wohr T. Pseudo-prolines (psi Pro) for accessing "inaccessible" peptides.-Pept.Res., 1995, v.8, n.3, pp. 145-153.

119. Dumy P., Keller M., Ryan D.E., Rohwedder В., Wohr T. and Mutter M. Pseudo-prolines as a molecular hinge: reversible induction of cis amide bonds into peptide backbones.- J.Am.Chem.Soc., 1997, v.l 19, pp.918-925.

120. Каталог NOVABIOCHEM.-An appraisal of the effectiveness of oxazolidine dipeptides in preventing aggregation during the Fmoc solid phase synthesis of difficult peptides., 1996.

121. Eichler J., Houghten R.A. and Lebl M. Inclusion volume solid-phase synthesis.- J.Pept.Sci., 1996, v.2, n.4, pp.240-244.

122. Wade J.D., Bedford J., Sheppard R.C. and Tregear G.W. DBU as an N alpha-deprotecting reagent for the fluorenylmethoxycarbonyl group in continuous flow solid-phase peptide synthesis.-Pept.Res., 1991, v.4, n.3, pp. 194-199.

123. Dettin M., Pegoraro S., Rovero P., Bicciato S., Bagno A. and Bello C.D. SPPS of difficult sequences. A comparison of chemical conditions, synthetic strategies and on-line monitorl45.ing.-J.Pept.Res., 1997, v.49, n.l, pp. 103-111.

124. Hoffmann R., Rawer S., Berger R.G. and Zeppezauer M. C-terminal peptides of human histone HI subtypes: a synthetic problem.- In: Peptides 1994. Proc. 23d Europ. Pept. Symp. (Maia H.L.S., ed.), ESCOM III: Leiden, 1994.

125. Schnolzer M., Alewood P., Jones A., Alewood D. and Kent S.B.H. In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences.-Int.J.Pept.ProteinRes., 1992, v.40, n.3/4, pp. 180-93.a

126. Beyermann M. and Bienert M. Synthesis of difficult peptide sequences: a comparison of Fmoc-and Boc- technique.- Tetrahedron Lett., 1992, v.33. n.26, pp.3745-3748.

127. Miranda L.P. and Alewood P.F. Rapid chem 1 synthesis of polypeptides & protein domains: a new paradigm in solid phase peptide synthesis.- Peptides 1998. Proc. 24d Europ. Pept. Symp., ESCOM III: Leiden, 1998, v.4, pp.26.

128. Narita M., Ishikawa K., Chen J.-Y. and KimY. Prediction and improvement of protected peptide solubility in organic solvents.- Int J.Pept.Protein Res., 1984, v.24, n.6, pp.580-587.

129. Wimley W.C., Creamer T.P. and White S.H. Solvation energies of amino acid side chains and backbone in a family of host-guest pentapeptides.- Biochem., 1996, v.35, pp.5109-5124,

130. Minor D.L. and Kim P. Measurement of the betta-sheet-forming propensities of amino acids.-Nature, 1994, v.367, pp.660-663.

131. Smith C.K., Withka J.M. and Regan L. A thermodynamic scale for the betta-sheet forming tendecies of the amino acids.- Biochem., 1994, v.33, pp.5510-5517.

132. Kim C.A., Berg J.M. Thermodynamic betta-sheet propensities measured using a zinc-finger host peptide.- Nature, 1993, v.362, pp.267-270.

133. Creamer T.P. and Rose G.D. Side-chain entropy opposes alfa-helix formation but rationalizes experimentally determined helix-forming propensities.- Proc.Natl.Acad.Sci., 1992, v.89, pp.59375941.

134. Woerkom W.J. and Nispen J.W.V. Difficult coupling in stepwise solid phase peptide synthesis: predictable or just a guess?- Int.J.Pept.Prot.Res., 1991, v.38, pp.103-113.

135. Rodionov I.L., Baru M.B. and Ivanov V.T. A swellographic approach to monitoring continuous flow solid phase peptide synthesis.- Peptide Res., 1992, v.5, n.2, pp.119-125.

136. Rodionov I.L., Baru M.B. and Ivanov V.T. Continuous monitoring of the swelling behaviour of gel-type reactive polymers and chromatographic media. Some practical applications of the technique.- Reactive Polymers, 1992, v.'16, n.3, pp.311-319.

137. Тейлор Дж. Введение в теорию ошибок,- Пер. с англ., Москва, Мир, 1985.о

138. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. Пер. с нем. (под ред. Адлера Ю.П.), Москва, Мир, 1994.

139. Perrin D.D. and Armarego W.L.F., Perrin D.R. Purification of laboratory chemicals.- Pergamon Press: Oxford, UK, 1980.

140. Gisin B.F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid.-Anal.Chim.Acta., 1972, v.58, n.l, pp.248-249.

141. Barany G. and Merrifield R.B. Solid phase peptide synthesis.- In: The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2. (Meienhoffer, J. and Gross, E., eds.), Academic Press: New York, 1980, pp. 159-284.

142. Reid G.E. and Simpson R.J. Automated solid-phase peptide synthesis: use of 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate for coupling of tert-butyloxycarbonyl amino acids.- Anal.Biochem., 1992, v.200, n.2, pp.301-309.о тШ-оо