Свеллографический мониторинг твердофазного синтеза пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

российская академия наук институт биоорганической химии

имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

на правах рукописи

Родионов Игорь Леонидович

СВЕЛЛОГРАФИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ

02.00.10- Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой с кандидата химических наук

□□3454327

Пущино - 2008

003454327

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель'.

академик Вадим Тихонович Иванов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор химических наук

Юрий Васильевич Митин Андрей Альфредович Формановский

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 3 декабря 2008 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат диссертации разослан "i. ноября 2008 г.

Ученый секретарь специализированного сове

доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

Актуальность проблемы. Понимание преимуществ и эффективности проведения твердофазного синтеза пептидов в проточном режиме, когда реагенты непрерывно циркулируют через плотный слой пептиднлполнмера, пришло в конце 1970-х годов Однако первые попытки прямой реализации этого подхода принесли скорее разочарование и поставили вопрос о принципиальной совместимости гелевых полимеров, объем набухания которых подвержен значительным колебаниям, и обычных реакторов колоночного типа, объем которых жестко фиксирован Как следствие, в реакторе возникают пустоты или неприемлемо высокое давление в потоке (70 атм и выше) из-за спрессовывания набухающего полимера, что, в совокупности, уничтожает все преимущества проточного режима Актуальность радикального решения этой проблемы, в котором бы учитывалась природа гелевых полимеров, многократно возросла с бурным развитием твердофазной комбинаторной химии, однако все частные ее решения, предлагавшиеся нашими коллегами, носят компромиссный характер и имеют одну общую черту они основаны на маскировании или подавлении гелевон природы полимерного реагента с целью улучшить его совместимость со стандартным проточным реактором

Другая проблема современного твердофазного синтеза пептидов, с которой связана эта работа, -это отсутствие универсальных неннвазивных методов мониторинга, способных распознавать трудные участки сборки полипептидной цепи в реальном времени и независимо от используемой химической методологии От доступности таких методов, дающих основу для своевременной корректировки и оптимизации процесса, серьезным образом зависит надежность и результат автоматического твердофазного синтеза. Важнейшие достижения в этой области демонстрируют синтезаторы MilliGen 9050+, ABI 432А, ABI 433А, в которых реализовано управление с обратной связью в сочетании со спектрофотометрическим и/или кондуктометрическим мониторингом, однако область применимости обоих методов ограничена Fmoc-химией На этом фоне более экономичная и лучше развитая Вос-методологня оказывается в невыгодном положении, что определяет высокую актуальность разработки Вос-совместимых методов мониторинга вообще и неннвазивных автоматизируемых подходов, в особенности

Цель работы. Создание проточного реактора, рабочий объем которого автоматически приводится в соответствие изменяющемуся объему набухания полимерного реагента, использование динамических свойств такого реактора для ведения непрерывной регистрации объема пептиднлполнмера в ходе твердофазного синтеза, детальное изучение фундаментальных аспектов н практического потенциала нового метода мониторинга

Научная новизна н практическая ценность рабшы. В качестве радикального решения упомянутой выше проблемы совместимости предложен проточный реактор оригинальной конст-

L-

рукции, рабочий объем которого автоматически подстраивается при изменении объема набухания пептидилполимера Оснащение такого реактора датчиком, преобразующим эти изменения в электрический сигнал, привело к созданию свелчографа, ставшего инструментальной основой свеллографического метода мониторинга твердофазного синтеза Для прояснения возможных путей использования нового метода мониторинга и границ его применимости были экспериментально изучены общие закономерности изменения объема пептидилполимера в ходе наращивания цепи, а также на уровне индивидуальных химических превращений в реальном времени Предложена физико-химическая интерпретация величины изменения объема набухания полимерного реагента, участвующего в химической реакции, и экспериментально продемонстрированы специфические вклады в наблюдаемую величину.

В самом общем смысле свеллографический метод может быть классифицирован как высокопроизводительный и экономичный инструментальный метод исследования набухания гранулированных поперечно-сшитых гелевых полимеров, открывающий такие новые возможности, как прямое наблюдение кинетики или динамики набухания в реальном времени и быстрая оценка сольватационных требований полимерного реагента путем регистрации «спектра набухаемо-сти» образца в широком наборе растворителей

В рамках твердофазного синтеза пептидов предложенный метод является первым и единственным универсальным неинвазивным методом мониторинга, область применения которого не имеет принципиальных ограничений Использование метода позволяет документировать каждую операцию процесса и существенно (по крайней мере вдвое) снизить расход растворителей относительно общепринятых стандартов Прямое установление момента окончания химической реакции по стабилизации сигнала свеллографа, равно как и кинетическая интерпретация кривой мониторинга, в общем случае не представляются возможными, но следует иметь в виду, что аналогичные ограничения имеют все известные неинвазивные/непрерывные методы. В то же время свеллографический подход имеет следующие серьёзные преимущества как инструмент детектирования агрегации полипептидных цепей, которая остается наиболее серьезной проблемой современного твердофазного синтеза

Особенностью предлагаемого метода является его высокая чувствительность именно к коллапсу пептидилполимера, который считается общим первичным проявлением агрегации на макроскопическом уровне Как следствие, подход с одинаковым успехом работает в рамках Ртос- и Вос-методологии, а также сохраняет адекватность и в сочетании с любой другой защитной группой

Свеллографический метод обнаруживает признаки агрегации непосредственно на стадии конденсации и/или последующих контрольных промывок, когда еще можно внести коррективы в

ход синтеза, тогда как спектрофотометрический и кондуктометрнческпй методы распознают агрегацию с запаздыванием па однп-два синтетических цикла и лишь на стадии Fmoc-деблокировання, когда возможность повторить проблемную конденсацию уже упущена.

Детектирование первых признаков агрегации проводится путем простого сравнения уровней аналогового сигнала свеллографа в двух или трех контрольных состояниях полимера, после чего целесообразно перейти к более строгим количественным критериям, которые ориентированы на компьютеризацию процесса и использование в автоматическом синтезаторе

Начиная с 1990 г в лаборатории химии пептидов Филиала ИБХ с применением свеллографиче-ского метода синтезировано несколько сотен пептидов средней длины, а также два крупных полипептнда длиной 54 и 87 аминокислотных остатков В 1996 г свеллографы были апробированы в Институте органической химии ТЕобингенского университета и на фирме Rapp Polymere (Германия), где была продемонстрирована полная совместимость свеллографа с синтезатором фирмы Millipore MilliGen 9050.

Отдельные этапы работы были проведены при финансовой поддержке программы «Новейшие методы биоинженерии», номер государственной регистрации темы 01 8 80064726 и фонда Фольксваген

Личный вклад автора Концепция «умного» проточного реактора и изготовление простейшей полностью функциональной модели (рис 1), предложение использовать переменный резистор для осуществления свеллографического мониторинга и непосредственное координирование работы по совершенствованию конструкции базовой модели свеллографа и ее предельному упрощению Непосредственное участие в ключевых экспериментах по изучению фундаментальных физико-химических аспектов свеллографического метода н руководство работами по внедрению метода в повседневную практику лаборатории Детальная разработка проекта по исследованию агрегации Выработка подходов к анализу экспериментальных данных и их теоретической интерпретации

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 21 Европейском пептидном симпозиуме (Платха де Аро, Испания, 1990), 2-м и 3-м Международных симпозиумах "Нововведения и перспективы твердофазного синтеза" (Кентербери, 1991, Оксфорд, 1993), 2-м Международном японском симпозиуме по химии пептидов (Шизуока, 1992), 9-м и 10-м Российско-Германских пептидных симпозиумах (Пущино, 1994, Фридрихрода, 2003), 16-м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), 18-м Американском пептидном симпозиуме (Бостон, 2003)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части и списка литературы Диссертация изложена на 156 страницах, содержит 46 рисунков и 5 таблиц Список цитируемой литературы включает 214 ссылок Обзор литературы посвящен проблемам контролирования и мониторинга твердофазного синтеза пептидов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Своим возникновением свеллографический метод обязан нескольким обстоятельствам Главным из них была острая потребность в простом, удобном и эффективном оборудовании для твердофазного синтеза «вручную», которая сложилась в лаборатории химии пептидов в период перестройки Следующим обстоятельством были серьезный интерес к явлению набухания полимера н восприятие набухаемости как неотъемлемого свойства иолимерсвязанного реагента, которые естественным образом возникли у меня в ходе практического освоения твердофазного метода и ознакомления с работами Р Б Меррифилда Однако в среде пептидных химиков набухание полимерной матрицы и, особенно его последствия, воспринимались скорее как досадное препятствие на пути твердофазного синтеза в проточном режиме, которое необходимо преодолеть Попытки просто игнорировать проблему набухаемости приводили к малопривлекательному варианту твердофазного синтеза с применением ВЭЖХ-насоса при давлении в проточном стальном реакторе до 70-700 атм и, по понятным причинам, были оставлены С этого момента усилия сосредоточились на преодолении набухаемости в буквальном смысле, т е. на разработке «жестких» полимерных матриц с максимально ограниченной и стабильной набухаемостыо Весьма остроумное и вполне успешное частное решение проблемы было предложено Шеппардом и Атгертоном, которые получили абсолютно жесткий композит на основе геля сшитого полиднметилакриламида, иммобилизованного в пустотах неорганического каркаса кизельгура. В этом случае, как и в целом, ограниченная совместимость с проточным режимом обеспечивалась в значительной степени за счет снижения концентрации и эффективности сольватации реакционных центров внутри полимерной матрицы. Целесообразность таких жертв представлялась весьма сомнительной, так как они не решали непопулярного вопроса о последствиях неизбежного и существенного прироста массы и объема пептидилполимера при обычных масштабах синтеза - от сотен миллиграммов до граммов конечного пептида Любой жёсткий полимерный носитель мог лишь замаскировать этот прирост, и в этой связи у меня возникло предложение «А что если вместо таких жестких носителей сделать «нежесткий» «умный» проточный реактор9» То есть, приспособить реактор к динамическим свойствам геле-вого полимера, а не наоборот9 Шприц с подпружиненным проточным поршнем, представлялся

\

V

М

г.

т

простейшем реализацией принципа «умного» реактора, которым ещё долгое время просуществовал как абстракция, пока, наконец, не был воплощён и полностью оправдал мои ожидания.

«Умный» проточный реактор н его превращение в свеллограф

На рис.1 показаны простейшие полностью функциональные проточные реакторы, в которых были успешно синтезированы десятки пептидов с использованием Вое- и Ртос-химии па стандартном сополимере стирола с 1% дивинилбензола в качестве подложки (Значок ® символизирует в дальнейшем именно этот пит поперечно-сшитого полистирола и пептидилполимеры на его основе). Слой полимера находится между фторопластовыми адаптерами, которые снабжены фильтрующими дисками из пористого стекла и стянуты внешним» пружинками, а реагенты и растворители подаются химически стойким плунжерным насосом. При всей своей простоте такой реактор обнаруживал свойства простейшей саморегулирующейся системы и вполне заслуживал название «умный»: в процессе синтеза подвижный адаптер незамедлительно реагировал как на набухание полимера, так и, благодаря пружинам, на падение его объёма. Как следствие, в

реакторе поддерживался идеальный проточный режим с плотным слоем полимерного реагента и нулевым мёртвым объёмом, а давление жидкости при скоростях потока 1-3 мл/мин не превышало 1 атм.

Но «умный» реактор оказался не только искомым решением выше обозначенной проблемы совместимости: наблюдение за его работой не оставляло сомнений, что перемещения подвижного адаптера, достигающие нескольких сантиметров, можно легко регистрировать, даже в буквальном смысле, как это показано на рис. 2. Метод мониторинга объема набухания полимера, принцип действия которого иллюстрирует рис.2, получил название свеллографический, а реактор с датчиком и регистрируемые с его помощью кривые -свеллограф и свеллограммы. Прямая запись свеллограммы продемонстрировала работу принципа, но для практического использования она была не пригодна; возникла идея «электрифицировать» свеллограф на основе простейшего делителя напряжения, механически соединив подвижный адаптер со скользящим средним контактом подходящего переменного резистора. Профессиональным решением этой задачи стал измерительный элемент на основе прецизионного многооборотного

Рис.1. «Умные» проточные реакторы

КЗ

Рис. 2. Принцип действия свел-лографа

переменного резистора, связанного зубчатой рейкой с подвижным адаптером реактора. Это устройство было успешно использовано в комбинации с вышеупомянутой первой моделью пружинного свеллографа, а также послужило основой датчика базовой модели и всех её предшественников. На рис.3, представлен внешний вид базовой модели. Все принципиальные изменения конструкции, сделанные по моей инициативе, были призваны взять под контроль или свести к минимуму влияние чисто физических факторов на результаты мониторинга. Это относится, в первую очередь, к непопулярному у дизайнеров решению категорически отказаться от использования пружин, электродвигателей и других непостоянных и/или неоднозначных источников внешней силы в пользу простого составного груза. Работа датчика перемещения существенно улучшилась после реализации моих предложений заменить рейку зубчатым цилиндром и оснастить подвижный адаптер поворотным замком для облегчения разборки. Позднее мне удалось добиться дальнейшего повышения стабильности работы базовой модели благодаря снижению сопротивления реактора потоку за счёт устранения малофункционального пробоотборника и возврата к адаптерам облегчённой конструкции с более мягким уплотнением и максимальной площадью фильтрующей поверхности. Это единственные отличия современного свеллографа от базовой модели, которой была оснащена лаборатория химии пептидов в 1990 году, и, которая с тех пор является основным средством производства пептидов.

Рис.3. Вазовая модель свеллографа

Основные характеристики базовой модели свеллографа. Большая часть работы выполнена на модели с рабочим объёмом реактора 10 мл (рис.3), изготовленным из стеклянного цилиндра от медицинского шприца фирмы СЫгапа (Чехия) с внутренним диаметром 15.6 мм, вмещающим до 1.5 г Стандартный вес груза - 1.2 кг обеспечивает устойчивый проточный режим при скоростях потока 1-3 мл/мин и давлении в реакторе до 62 кПа (0.6 атм.). В качестве датчика используется делитель стабилизированного напряжения с регулятором баланса и чувствительностью, устанавливаемой в пределах 0.1-1 в/мл. В сочетании со стандартным потенциометрическим самописцем свеллограф обеспечивает измерения относительных объёмов набухания в диапазоне 200-2000 мкл с воспроизводимостью ±6% (среднеквадратичная погрешность).

Общие характеристики свелпографического метода. Применение свеллографа для измерения абсолютных объёмов набухания гелевых полимеров в строгом смысле требует учёта всех физических факторов, определяющих систематическую погрешность метода, и предполагает существование общепринятых стандартных полимеров, на-бухаемость которых охарактеризована с высокой точностью общепризнанными стандартными методами. Но в этой области до сих пор

В ОС-цикл

Рнс. 4. Реальная свеллограмма: Вос-Туг(ОсЬ)-ОСН2-конденсаца» - 4 же. Вос-Туг(ОсЬ)-ОВ1; 1 - СРЬСЬ; 2 - ОМИ 3 - 5% 01ЕА-СН3СЬ; - 33% ОМРмРгОН;

О

Ртос-цикл

А

20% пиперидин в ОМР

Е

^ т

Рис. 5. Реальная свеллограмма: /-ОМРчРЮН (1:3); 1 - ЭМР; 2 - СЬЬСЬ; Н-[Туг(ОсЬ)-ЪОСНг®;

конденсации: 4 же. Fmoc-Lys(Z)-OБt.

стандартного ооъекта не появилось, а немногочисленные методы, в лучшем случае, охарактеризованы на уровне воспроизводимости измерений. Причём как взаимная сходимость этих методов, так и свойственные каждому из них систематические ошибки, ни разу не анализировались. При использовании в качестве стандартов Сефадексов ЬН-20 и ЬН-60 было показано, что объёмы набухания, измеренные свеллографическим методом, обнаруживают хорошую линейную корреляцию

(г=0.99-н0.98) с независимыми литературными данными по удельным набухаемостям этих полимеров. Очевидно, однако, что высота и объём столба набухшего полимера, измеряемые свеллографическим методом, несколько занижены по сравнению с истинными значениями благодаря выжиманию растворителя из пустот плотной шаровой упаковки полимерных частиц, которые претерпевают деформацию сдвига. Степень деформации определяется равнодействующей силы тяжести груза и подвижного адаптера за вычетом силы трения и силы избыточного давления жидкости в реакторе, причём каждая из них может быть строго учтена. Так, экстраполяция к нулю экспериментально полученной зависимости наблюдаемого объёма полимера от веса груза показала, что систематическое отклонение в стандартных условиях не превышает 5-10% от абсолютной величины объёма полимера в реакторе.

Перевод полимера из одного растворителя в другой отражается на свеллограммах (рис.4-5)

в виде достаточно резкого скачка с быстрой стабилизацией сигнала на новом уровне, который при продолжении процесса уже не меняется часами, что позволяет связать момент выхода на новое плато с достижением нового стационарного состояния. На такой интерпретации плато основаны многие простые приложения метода. Этот принцип позволяет получать на одном образце полимера «спектр» набухаемости в большом наборе растворителей и их смесей со скоростью один растворитель в несколько минут, причём этот процесс можно автоматизировать. Однако принципиально новой возможностью был мониторинг динамики набухания гелевых полимеров именно в ходе химических превращений и, в первую очередь, в твердофазном синтезе пептидов.

Первые свеллограммы продемонстрировали важные достоинства нового подхода, который следует классифицировать как непрерывный неинвазивный метод мониторинга. Серьёзным преимуществом является его универсальность: он работает в рамках как Fmoc-, так и Вос-методологии, а также отмечает все операции синтеза, включая смену растворителей, и хорошо сочетается с «контрастными» протоколами, в которых применяются растворители, сжимающие полимер (на рис.4-5 они обозначены »). Таким образом, ход синтеза автоматически документируется, а использование момента выхода на плато как сигнала для перехода к следующей операции синтеза приводит к экономии растворителей и некоторых реагентов, по меньшей мере, вдвое, по сравнению с существующими нормами. Эти положительные качества и невысокая себестоимостью прибора уже вполне оправдывали использование свеллографического мониторинга, но гораздо более интересным и серьезным был вопрос о применимости метода для контролирования реакций конденсации и деблокирования, свеллограммы которых нередко имеют вид кинетических кривых (рис. 6а). По мере накопления информации (рис. 6b-d), однако, всё более остро вставала проблема интерпретации свеллографического профиля химической реакции в общем случае.

ОБЪЁМ НАБУХАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО РЕАГЕНТА И ХИМИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ

Общие закономерности изменения объёма пептидияполимеров. Отправной точкой этой части работы послужили экспериментальные данные в формате «объём набухания-масса полимера» для олигомеров Boc-(Leu-Ala-Gly-Val-OCH2C6H4CH2CO)„-NHCH2-®, которые были получены в лаборатории Меррифилда (Sarin et al., 1980) с целью показать, что подложка не создаёт каких-либо ограничений для роста цепей в ходе синтеза. Проведённый нами регрессионный анализ этих данных выявил высокие коэфициенты корреляции объёмов сухого ® (г=0.98) и набухшего в DMF (г=0.99) с его массой, а для CH2CI2 корреляция была уже намного слабее

Рис. 6. «Аномальные» профили реакций конденсации. Стрелки отмечают момент подачи реагента в реактор с аминополи-мером в ОМР"; итоговое плато достигалось в режиме рецикла.

(г=0.89). Для получения аналогичных ДУ-Дт данных для гомодетного полипептида свеллогра-фическим методом идеально подошла реакция полимеризации карбокеиангидрида е-2-лизина, инициируемаяаминоацилполимером:

п Ьув(г)^СА + Н-А1а-ОСП2-® П-[Ьук(Х)|„-А1а-ОСП2-® + пС02ф

Раствор карбокеиангидрида пропускали через свеллограф в режиме рецикла до достижения устойчивого плато (рис.7) и определяли привес ® с учётом непрореагнровав-шей части навески и выделившегося С02. Анализ данных, полученных в ходе 19 последовательных идентичных циклов полимеризации, показал коэффициенты корреляции ДУ-Дт - r=0.98 (TI1F) и г=0.99 (DMF). Обобщать эти закономерности на любые пептиды представлялось преждевременным до проведения анализа свелло-графических данных, которые быстро накапливались в результате рутинного синтеза разнообразных пептидных последовательностей. Проблема заключалась в том, что они не могли быть проанализированы в ДУ-Дт формате из-за отсутствия экспериментальных данных по постадийным приростам масс ®. Единственным выходом было - использовать теоретические величины ДтТСор, которые легко рассчитываются исходя из мольного количества полимерсвязанных групп в реакторе N=moLo, где тц(г) - масса,

Рис.7. Зависимость ДУ-Дт для полимеризации карбокеиангидрида Lys(Z) на H-Ala-OCHi-® • На вставке - свелограмма отдельной стадии.

' А V, мл

СРзСОСИМз-формы в TFA-CH2CI2,. ИНг-формы в DMF Вос-формы в DMF

ДМ, г/моль

0.2 0-

ДV, МЛ

Мг-формы в DMF Fmoc-формы в DMF

ДМ, г/моль

слева: справа:

Рис. 8. Типичные линейные ДУ-ДМ зависимости (везде г>0.99)

CEKDKFEWSNTDNNRRDE (Вос-метод); KKYKYKYPYGYKYPYGYKYKY (Fmoc-Memod)

а Ьо (ммол/г) - загрузка исходного полимера, и постадийных изменений молекулярной

Рис. 9. Проявление линейной ДУ-ДМ зависимости в синтезе димера АСР65'74 для 50% ТРА-СН2С12 (г>0.98) и для ОМ/7 - для пяти первых остатков; на вставке слева: «треугольник форм ® отдельного Вос-цикла».

массы ДМ : ДтТСор=МДМ. В рассматриваемом приближении N как постоянный множитель, не-влияющии на коэффициент корреляции можно опустить и анализировать в формате ДУ-ДМ. Такой способ представления и анализа свеллографических измерений (рис.8-9) оказался исключительно удобным, продуктивным и быстро приобрёл в лаборатории статус стандарта. Результаты его систематического использования могут быть резюмированы следующим образом:

У Хорошо выраженная линейная зависимость ДУ-ДМ (г > 0.97) всегда наблюдается для солевых форм СРзСОО"+1ЧНз-® в 50% ТРА-СН2СЬ (рис.4, плато В) на стадии Вос-деблокирования (рис. 8) и сохраняется даже в случае сильноагрегирующих последовательностей, включая АСР65"74 (рис.9) и олигоаланин, что связано с уникальными хаатропными и сольватирующнми свойствами этой смеси; аналогичным образом ведут себя Ртос-, Вое- и №Ь-® формы в 20% ТРЕ-СРЬСЬ подавляющего большинства исследованных нами пептидов, за исключением оли-гоаланинов и фрагмента АСР65*74.

► Очень хорошо ложатся на прямую (г > 0.97) точки, соответствующие Ртос-, Вое- и ЫН2-® формам четырёх-пяти С-концевых остатков (рис.9), т.е. когда агрегация коротких цепей невозможна. Более 60% пептидов изученной выборки характеризуются хорошей линейной корреляцией ДУ-ДМ (0.94<г<0.99) для Ртос-, Вое- и ЫН2-® форм в ОМР (рис.9, 10), а при переходе к СН2С12, СНС13 или ТНР коэффициент корреляции заметно падает: 0.5<г<0.8.

> СвеллографическшТ мониторинг синтеза известных "трудных" пептидов продемонстрировал ярко выраженные отклонения от линейности ДУ-ДМ зависимости для РМР (рис 9,10) и ей полное отсутствие для ТНР, СНгСЬ и т д , что следует расценивать как результат десольватации ® вследствие агрегации пептидных цепей

Таким образом, линейная зависимость объема набухания ® от прироста массы является основной тенденцией, сопровождающей наращивание пептидной цепи в условиях беспрепятственной сольватации, а также дает основу для анализа профилей реакций п потенциальною применения свеллографического мониторинга как количественного метода По-видимому, продемонстрированная нами закономерность имеет общий характер и описывает соотношения равновесных объемов набухания широкого круга химических производных одного и того же полимера-предшественника, в первую очередь гомологов и иных молекул со схожими сольва-тационными требованиями

Особенности изменения объема набухания ® в формате отдельной химической реакции

При переходе на этот уровень необходимо было ответить на вопрос, как проявляется и чем осложняется глобальная линейная закономерность ДУ-Дт в масштабах отдельных реакций конденсации и деблокирования, которые характеризуются следующими изменениями молекулярной массы ДМ

Вос-Хаа-ЫН-® 4- Ш2-® "> Ртос-Хаа-ЫН-®

плато «Е» плато «Э» (рис 4)

плато «А» плато «В» (рис 5)

ДМ = +(157-700) г/моль

Вос-ЫН-® [СИ2С12] -» СР,СОО*+ЫНз-® [50%ТРА-СН2С12] плато «А» плато «В» (рис 4)

ДМ = +14 г/моль

Ртос-ЫН-® [ОА№] -» Ш2-® [20% пиперидин в ОКИ^

плато «С» плато «й» (рис 5)

ДМ = -222 г/моль

В проточном реакторе эти реакции осуществляются в процессе вытеснения чистого растворителя концентрированным раствором реагента вышеуказанными деблокирующими смесями или 0 1-0 5М раствором активированного производного, в котором исходный растворитель может составлять менее 60% по массе По ходу реакции в режиме рецикла происходит постепенное выравнивание состава циркулирующей жидкой фазы, а ® переходит в новое стационарное состояние, которому соответствует новый уровень плато на свеллограмме В какой степени этот уровень может быть связан с ходом реакции, показывает анализ соотношений объе-

Туг Лзр Пе йЦ

Ы-концевой остаток -

мов © в трёх стационарных состояниях, которые для каждой реакции обозначены на свеллограмах (рис.4,5) и схемах большими латинскими буквами. Это уровни набухания ® до реакции

и после, измеренные в одном и том же растворителе, и уровень плато, достигнутый непосредственно в ходе реакции. Простейшая обработка этих данных позволяет сравнить наблюдаемое изменение объёма ® в ходе реакции, ДУВабд и его нормализованную величину ДУМОрМ, приведённую к исходному растворителю и отражающую результат реакции в чистом виде. Для реакций конденсации ДУ„абл - это разность уровней плато Е-Э (рис.4) и В-А (рис.5), а ДУ„орм - разность Р-0 и С-А, соответственно. На рис. 10 приведены гистограммы, демонстрирующие динамику ДУтбл (черные столбики) и ДУ„орм для синтеза двух пептидов. Основной вывод, который позволяют сделать эти вполне типичные данные, таков: влияние растворимых компонентов реакционной смеси, количественной мерой которого является Д1;гальв=ДУнабЛ-ДУнорм, имеет в целом нерегулярный характер, но вклад его существенен и нередко превышает ДУ„орм. На основании анализа выборки из более 160 свеллограмм реакций конденсации можно говорить о преобладании негативных сольватационных эффектов, которые, в частности, обуславливают аномальные профили с минимумом (рис.4Ь) и временное подавление набухания в ходе повторных конденсаций (профиль рис.4с). Что касается профилей с начальным максимумом (рис.4с1), то их причину нам удалось связать с быстрым обратимым связыванием гидроксибензотриазола (НОВ!) или других слабокислых компонентов реакционной смеси аминогруппами полимера. Модельные эксперименты показали, что увеличение объёма ® при связывании НОВ! превышает прирост за счёт ковалентного присоединения более тяжёлого остатка Вос-аминокислоты.

Анализ свеллографических профилей реакции Ртос-деблокирования был проведён аналогично; сопоставление ДУМбЛ=0-С с приведёнными значениями ДУ„орм=Е-С (рис.5) наглядно продемонстрировало устойчивый положительный сольватационный вклад пиперидина Ду/^, ко-

Рис. 10, Динамика приведённого и наблюдаемого изменений объёма ® в реакциях конденсацни для Ьеи-МеЬ Аэр-Ьуз-Азр-РЬе-Туг-Ьуз-Азр Вое -методом (слева) и фрагмента АСР64"75 Итос методом (справа).

N-концевой остаток -

ДЧ

|| | ш тя Д\/набл £223 Д\/Н0рм А 1/Ьольв _____1 1 1

I ' 1 Е 11] ш ^ ■ « Р ■ Р |Ц

торып маскирует и даже перекрывает уменьшение объёма, сопровождающее отщепление тяжёлой Ртос-группы (рис.11). Необходимо подчеркнуть, что заметный прирост объёма на этой

Если в реакции Рптос-деблокирования мы наблюдаем тонкий баланс близких по абсолютной величине вкладов изменения массы и сольватации, то реакция деблокирования Вос-группы являет собой пример яркого доминирования сольватационных эффектов, связанных с уникальными свойствами 50% ТРА-СНгС'Ь. Оценка сольватацпонного вклада Утра, которая проводилась анало-

гично сопоставлением ДУ„,

-А

и ДУ„ор>,=С-А (рис.4), проиллюстрирована на рис. 12. Положительный вклад деблокирующей смеси однозначно проявляется, начиная со второго аминокислотного остатка, и по абсолютной величине обычно превосходит в 2+10 раз приведённую величину ДУнорДСНгСЬ), причём, для агрегирующих и длинных пептидов это соотношение поднимается до 30+70, что, отчасти, объясняет-

V, мл

Рис. 11. Проявление сольватационных эффектов на стадии Ртос-дебпокирования. верх: синтез ККУКУКУРУОУКУРУСУКУКУ с деблокированием 20% пиперидина^и-ЭМИ; низ: синтез КОРУ1_,ЕНКЛРЕВО с деблокированием смесью пиперидин-ОМР-толуол- (6:7:7)

Рис. 12. Анализ сольватационных вкладов в динамику изменения объёма реакции Вое деблокирования в синтезе обычного пептида УРЕСОЕОЫ (слева) и агрегирующего олигоала-нина (справа).

ся отсчётом приростов от объёмов набухания в чистом СН2О2, который особенно плохо соль-ватирует заряженные полипептидные цепи в трифторацетатной форме. Это приводит к отрицательным ДУцорДСЬЬСЬ) при слабо выраженном положительном балансе массы процесса. На основании проведённого анализа можно с определённостью заключить, что для каждой из рассмотренных реакций выявленные вклады сольватационных эффектов в наблюдаемое изменение объёма набухания настолько велики, что достоверное отделение от них значимой составляющей, которая линейно связана с изменением массы ® и несёт информацию о ходе химического процесса, не представляется возможным. Следует заметить, что и два других неинвазив-ных метода мониторинга, спектрофотометрический и кондуктометрическпй, не удалось адаптировать для прямого контролирования степени завершённости реакций в твердофазном синтезе. Специфические проблемы каждого метода, обуславливающие эти ограничения, в конечном счете, сводятся к трудностям извлечения значимой информации от высоких фоновых значений параметра.

Свеллографический метод как сенсор агрегации и инструмент исследования тонких сольватационных эффектов

Fmoc~NH-(g) Fm о с-Ala -NH- ®

+40 мкл

Главной проблемой современного твердофазного синтеза продолжает оставаться агрегация пептидных цепей, серьёзным образом осложняющая синтез, в среднем, каждого пятого пептида. Так как задача количественного аппаратного контролирования реакции конденсации и деблокирования строгого решения, по-видимому, не имеет, то именно распознавание агрегации в реальном времени синтеза стало главной задачей систем мониторинга и единственным ресурсом повышения эффективности в режиме обратной связи современных автоматических синтезаторов (стр. 1). Все найденные до сих пор решения ограничены рамками Fmoc-методологии и основаны на результатах полуколнчествен-ного мониторинга реакций деблокирования, т.е. на детектировании весьма отдалённых последствий агрегации. В то же время самыми ранними первичными проявлениями агрегации, как известно, являются именно нарушения нормальной сольватации и на-бухаемости и в этой связи

, О ¿ ~ .. Г ,\г упомянутый выше главный

Рис. 1J. вариабельность изменения ооъема наоухания ДУди

при включении 0.12 ммоль Ala в зависимости от природы недостаток свеллографическо-

Fmoc-AIa„-Xaa-Ala3-Nva-® и положения в цепи. г0 подхода - высокая чувстви-

-190 мкл

АТ^ йТ7 Тгр Ы-концевой остаток—

тельность к сольватационным эффектам - неожиданно оборачивался его сильной стороной. Хорошей характеристикой метода в этом ракурсе служит рис. 13,

где представлено распределение 70 приведённых величин изменения объёма набухания которые соответствуют включению одного и того же мольного количества остатка аланина, в разные положения цепи серии родственных пептидов. Как видно, отрицательные значения, связанные с агрегацией и де-сольватацией в среднем в несколько раз превосходят ожидаемый, но слабо выраженный положительный

Рис.14. Сравнение количественных критериев агрегации для вклад прироста массы, кото-синтеза Ртос-А1а-А1а-А1а-Тгр-А1а-А1а-А1а-Ыуа-® (низ) и характеризует 70% вы-фрагмента 125-145 ацетилхолинового рецептора (верх)

борки. Анализ свеллограмм синтезов известных трудных

пептидов в полной мере подтвердил адекватность и преимущества метода, главным из которых является его общий характер и химическая универсальность. Это первый и единственный пока неинвазивный метод мониторинга, работающий не только в рамках Ртос-, но и Вос-метода. Очевидно, что он будет совместим и с любой другой химической методологией. Возможность детектирования агрегации на стадии конденсации является вторым неоспоримым достоинством свеллографического мониторинга по сравнению с двумя упомянутыми выше методами. Ниже перечислены устойчивые и специфические признаки агрегации, обобщающие опыт, накопленный в лаборатории, и несколько формальных критериев, которые могут быть реализованы в системе обратной связи автоматического синтезатора.

I. Прямое визуальное распознавание на качественном уровне. На свеллограмме реакции конденсации изменения объёма отсутствуют, или он монотонно падает по типу аномальною профиля рис.бс (к повторным конденсациям эти признаки не применимы).

2 Косвенное сравнение уровней на свеллограмме, критерий пригоден для первичного автоматического детектирования. Наблюдаемое в реальном времени изменение объема в реакции конденсации ДУ„абл ¿0 Если одновременно и приведенная величина AV„opM<0, то это указывает на сильную агрегацию В противном случае - агрегация слабая Этот критерий для фрагмента АСР1""74 (рис 9,10) срабатывает уже на стадии присоединения Не64, а в случае олигоаланина - на стадии пентапептида В самом лучшем случае (в проточном режиме) спектрофотометрический метод улавливает признаки агрегации для первого пептида на два остатка позднее и лишь на стадии деблокирования Ala68 и отстает на один цикл в случае олигоаланина

3 Ас=ДУ'т„/ Vm„-Vo В случаях, когда агрегация принимает затяжной характер, надежность критерия 2 снижается, так как коллапс ® имеет свои пределы Для обеспечения надежности именно автоматического распознавания необходимо перейти к отсчету от максимального объема набухания, достигнутого в ходе синтеза У,,,«, и использованию критерия AV'max= VVmoc-Vmax (рис 14) С той же целью представляется целесообразным перейти от относительных объемов ДУ к безразмерному критерию Ас, который будет меньше зависеть от масштабов синтеза, благодаря внутренней нормировке' AG=AV'max/ V,mx-Vo, где Vo - начальный объем ®, причем -0 3<АС<0 - указывает на слабую агрегацию, a AG <-0 3 - на сильную

4 Несколько критериев агрегации, таких как степень агрегации AD, основанные на экстраполяции линейного участка AV-ДМ графика, были нами предложены в ходе фундаментальных исследований агрегации, однако с практической точки зрения, они не имеют преимуществ по сравнению с более простым и близким по смыслу А°

ВЫВОДЫ

• Использование реактора предложенной конструкции обеспечивает функционирование гелевых полимеров в полноценном проточном режиме и позволяет организовать непрерывную регистрацию изменений объема набухания полимерного реагента, положенную в основу разработки светографического мониторинга

• Свеллографический мониторинг является новым инструментальным методом исследования набухания гранулированных поперечно-сшитых гелевых полимеров, который делает возможными прямое наблюдение динамики набухания в реальном времени и быструю регистрацию «спектра набухаемости» образца полимера в широком наборе растворителей

• В контексте твердофазного синтеза пептидов, свеллографический подход можно охарактеризовать как совместимый с любой химической методологией неинвазивный метод мониторинга Он позволяет легко документировать каждую операцию протокола и снизить расход растворителей, как минимум вдвое, относительно существующих стандартов.

• Установлено, что динамика изменения объема набухания пептидилполимера в ходе наращивания цепи «в норме» характеризуется линейной зависимостью от прироста массы, а отклонения от линейности указывают на наступление агрегации Предложена теоретическая интерпретация этих явлений на молекулярном уровне.

• Извлечение информации о кинетике реакций конденсации и деблокирования из свелло-графического профиля не представляется возможными, равно как и прямое использование в качестве критерия завершенности этих реакций момента стабилизации объема па-бухания Это связано с исключительно высокой чувствительностью последнего к соль-ватационным эффектам

• Высокая чувствительность свеллографического метода к изменению сольватации пептидилполимера определяет и его главное достоинство - возможность детектирования ранних признаков агрегации на стадии конденсации независимо от используемой химической методологии Этот процесс может быть легко автоматизирован и использован в управляющей программе синтезатора для существенной оптимизации синтеза «трудных» пептидов

Основные результаты диссертационном работы изложены в следующих публикациях:

1 Rodionov, I L , Peshenko, I А , Baidakova, L К , and Ivanov, V T Swellograplnc study of peptide resm swelling behavior during solid phase peptide synthesis hit J Pept Res Ther 2007, 13(1-2), 161-71

2 Baidakova, L К , Rodionov, I L , Kostanyan, I A , Lipkin, V M , and Ivanov, V T Total solidphase synthesis of differentiating factor from HL-60 cells and related peptide fragments In M Chorev and T К Sawyer (Eds), Peptide Revolution Genomes, Proteomies & Therapeutics Proc IS'1' Am Pept Symp, San Diego American Peptide Society 2004, p 55-6, abstract published in Biopolymers 2003, 71(3), 361

3 Rodionov, I L , Peshenko, I A., and Ivanov, V.T Study of aggregation m solid-phase peptide synthesis by the use of swellographic technique In S Reissmann (Ed), Abstiacts of 10''' German-Russian Peptide Symposium, Friedrichroda, Germany. 2003, p 12

4 Пешенко И A , Родионов И Л , Иванов В Т. Агрегация в твердофазном синтезе природных и модельных полипептидных последовательностей XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Химия Живого. Рефераты докладов и сообщений, №4, с 112-13, Москва, 1998

5 Родионова, Л Н , Заграничный, В Е , Родионов, И JI, Липкин, В М., Иванов, В Т Полный твердофазный синтез у-субъединицы фосфодиэстеразы cGMP сетчатки глаз быка и некоторые физико-химические свойства синтетического белка. Биоорган химия 1997, 23(12), 93348

6 Bydakova, LK„ Peshenko, IA, Rodionova, LN, Rodionov, IL, and Ivanov, VT. Swellographic monitoring chemical reactions in solid phase peptide synthesis the basis for quantitation and intrinsic limitations In 14th American Peptide Symposium Program and Abstracts Book, Columbus, OH American Peptide Society 1995, p P107,

7 Rodionova, L N , Peshenko, I A , Romashko, A M , Rodionov, I L , and Ivanov, V T Quantitative estimation of aggregation degree in solid phase peptide synthesis using swellographic technique In 14th American Peptide Symposium Program and Abstracts Book, Columbus, OH American Peptide Society 1995, pP104

8 Rodionov, I.L , Peshenko, I A., Bydakova, L К , Rodionova, L N , Romashko, A M., Shaloyko, L A , Mustaeva, L G , and Ivanov, V.T Swellographic monitoring of solid phase peptide synthesis A critical appraisal. In• 9th Symposium on Chemistry of Peptides and Proteins Russia-Germany Abstracts , Moscow Pushchino Publ Center 1994, p 25

9 Rodionov, I L , Peshenko, I A , Mustaeva, L G , and Ivanov, V T. Real-time detection of aggregation in the course of SPPS by a swellographic method In R. Epton (Ed), Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis Proc 3rd hit Symp, Birmingham, UK Mayflower Worldwide 1994,p 665-8

10 Baru, M.B , Peshenko, 1 A , Rodionova, L.N , and Rodionov, I L A comparative study of swellographic and spectrophotometnc approaches to monitoring of continuous-flow Fmoc-SPPS In N Yanaihara (Ed), Peptide Chemistry 1992 Proc 2'"1 Int Japan Symp , Leiden: ESCOM Science Publishers В V 1993, p 116-8.

11 Ваш, M В and Rodionov, I.L New generation of continuous flow technique for efficient Sl'PS on gel-type supports In N Yanaihara (Ed), Peptide Chemistry 1992. Proc 2'"' hit Japan Symp , Leiden ESCOM Science Publishers В V 1993, p 119-21.

12 Ac SU 1787989. Синтезатор биополимеров / Бару МБ, Родионов ИЛ., Дерябин СМ, Шестаковский Л Я , Макаров НА, опубл 1501 1993

13. А с SIJ 1787988 Синтезатор биополимеров. / Макаров НА, Бару М.Б., Родионов ИЛ., Шестаковский Л Я , опубл 15 01 1993

14 Rodionov, 1 L , Ваш, М В , and Ivanov, V Т. Continuous monitoring of the swelling behavior of gel-type reactive polymers and chromatographic media - some practical applications of the technique. Reactive Polymers 1992, 16(3), 31 1-9

15 Rodionov, I L , Baru, M В , and Ivanov, VTA swellograplnc approach to monitoring continuous-flow solid-phase peptide synthesis Peptide Res 1992, 5(2), 119-25

16 Rodionov, I L , Baru, M В , and Ivanov, V T Quantitative aspects of swellograplnc approach (o monitoring solid phase processes In. R Epton (Ed), Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis Pioc 2nd Int Symp, Andover, UK. Intercept Ltd 1992, p 455-9

17 Rodionov, 1 L , Ваш, M В , and Ivanov, VTA swellograplnc approach to studying swelling behaviour of gel-type reactive polymers In R Epton (Ed), Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis Proc 2nd Int Symp , Andover, UK Intercept Ltd 1992, p 449-53

18 Ac SU 1744087 Способ управления процессом твердофазного синтеза биополимеров / Бару М Б , Родионов И Л , Шестаковский Л Я , Ларин В Т, опубл 29 06 1992

19 Baru, М В , Ivanov, V Т, and Rodionov, I L A new feedback control principle in continuous flow solid phase synthesis Direct monitoring of peptide-resin swelling behaviour In E Giralt and D Andreu (Eds), Peptides 1990 Proc UstEurop Pept Symp, Leiden ESCOM Science Publishcis B.V 1991, p 198-9

20. Golovkina, I A , Abakumov, V Y , Mustaeva, L G., Baidakova, L К , Baru, M В , and Rodionov, IL. Swellograplnc monitoring of continuous flow Fmoc-solid phase peptide synthesis In A. Kalnins (Ed), 8th Conference of Young Scientists on Oigamc and Btoorganic Chemistry Abstracts, Riga Institute of Organic Synthesis, Latvian Academy of Sciences 1991, p 125-6

21 Ac SU 1650240 Проточный реактор для твердофашого синтеза биополимеров / Бару М Б , Родионов И Л , Шестаковский Л Я , Ларин В Т , опубл 23.05 1991

22. Патентная заявка №4875911 Проточный реактор для твердофазного синтеза биополимеров / Бару М Б , Родионов И Л , Иванов В В , Иванов В Т, решение о выдаче а с от 28 11 1991

23 Патентная заявка №4844267. Установка для осуществления физико-химических процессов с участием полимерных носителей / Бару М Б , Родионов И Л , Ларин В Т., решение о выдаче а с от 24 06 1991

24 Int Patent WO 90/01493 Method for controlling solid-phase synthesis of biopolymers / Ваш, M В., Rodionov, I L , Shestakovsky, L Ya , and Larin, V.T., published 22 02 1990, also published as EP0380672, HU202130 and PCT/SU1988/000156

25 Int. Patent WO 90/00932 Reactor for solid-phase synthesis of biopolymers / Baru, M В , Rodionov, I L„ Shestakovsky, L.Ya , Larin, V Т., and Deryabin, S M , published 08 02 1990, also published as EP0386238 and PCT/SU 1988/000142

26 Патентная заявка №4293280 Способ синтеза пептидилполимеров на нежестком полимерном носителе / Бару М Б , Родионов И Л , Шестаковский Л Я , Ларин В Т , Дерябин С М., положительное решение о выдаче ас от 16 09 1988.

Заказ № 54/11/08 Подписано в печать 31 102008 Тираж 100 экз Уел пл 1,25

/, ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20

' ч ^ ' 1 \v\vw с/г ш ; е-таИ. info@cfr.ni

• • Список нестандартных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ПРОБЛЕМЫ МОНИТОРИНГА ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ

1. Специфика предмета и классификация методов мониторинга

2. Методологические проблемы и пути их решения на примере 14 развития спектрофотометрического метода

3. Хронология возникновения и развития известных методов 37 мониторинга

4. Серийные синтезаторы пептидов, оснащённые средствами 53 мониторинга

5. Структуры и спектральные характеристики важнейших 60 хромофоров, имеющих прикладное значение

П. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

РАЗРАБОТКА И ВАЖНЕЙШИЕ АСПЕКТЫ СВЕЛЛОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА

1. КОНСТРУИРОВАНИЕ СВЕЛЛОГРАФА И ПРАКТИЧЕСКОЕ 80 ПРИМЕНЕНИЕ СВЕЛЛОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА

2. ОБЪЁМ НАБУХАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО РЕАГЕНТА И ХИМИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ

2.1. Общие закономерности изменения объёма набухания в 92 процессе наращивания пептидной цепи

2.2. Теоретическая модель изменения объёма набухания в 97 химической реакции

2.3. Проявление и маскирование общих закономерностей на 107 уровне отдельных химических реакций

3. ОСНОВНОЕ ПРЕИМУЩЕСТВО СВЕЛЛОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА - 113 РАСПОЗНАВАНИЕ РАННИХ ПРОЯВЛЕНИЙ АГРЕГАЦИИ

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Приборы и реактивы

2. Синтез модельных пептидов. Протоколы твердофазного 119 синтеза, оптимизированные для использования свеллографического метода.

Понимание преимуществ и эффективности проведения твердофазного синтеза пептидов в проточном режиме, когда реагенты непрерывно циркулируют через плотный слой пептидилполимера, пришло в конце 1970-х годов. Однако первые попытки прямой реализации этого подхода принесли скорее разочарование и поставили вопрос о принципиальной совместимости гелевых полимеров, объём набухания которых подвержен значительным колебаниям, и обычных реакторов колоночного типа, объём которых жёстко фиксирован. Как следствие, в реакторе возникают пустоты или неприемлемо высокое давление в потоке (70 атм. и выше) [1-4] из-за спрессовывания набухающего полимера, что, в совокупности, уничтожает все преимущества проточного режима. Актуальность радикального решения этой проблемы, в котором бы учитывалась природа гелевых полимеров, многократно возросла с бурным развитием твердофазной комбинаторной химии, однако все частные её решения, предлагавшиеся нашими коллегами, носят компромиссный характер и имеют одну общую черту: они основаны на маскировании или подавлении гелевой природы полимерного реагента [5,6] с целью улучшить его совместимость со стандартным проточным реактором.

Другая проблема современного твердофазного синтеза пептидов, с которой связана эта работа, - это отсутствие универсальных неинвазивных методов мониторинга, способных распознавать трудные участки сборки полипептидной цепи в реальном времени и независимо от используемой химической методологии. От доступности таких методов, дающих основу для своевременной корректировки и оптимизации процесса, серьёзным образом зависит надёжность и результат автоматического твердофазного синтеза. Важнейшие достижения в этой области демонстрируют синтезаторы MilliGen 9050+, ABI 432А, ABI 433А [7], в которых реализовано управление с обратной связью в сочетании со спектрофотометрическим [8] и/или кондуктометрическим [9] мониторингом, однако область применимости обоих методов ограничена Fmoc-химией. На этом фоне более экономичная и лучше развитая Вос-методология оказывается в невыгодном положении, что определяет высокую актуальность разработки Вос-совместимых методов мониторинга вообще и неинвазивных автоматизируемых подходов, в особенности.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ПРОБЛЕМЫ МОНИТОРИНГА ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ

Большая часть собранной информации представлена в таблицах 1 и 2. В первой таблице краткая информация об известных методах организована на двух уровнях: все работы по каждому методу расположены в подразделах таблицы в хронологическом порядке, причем такие подразделы также представлены в порядке, который отражает дату выхода пионерской публикации по данному подходу. Этим я также хотел воздать должное первопроходцам, имена которых, увы, выпадают из поля зрения современных деятелей твердофазной органической химии. Во второй таблице собрана вся доступная мне информация об особенностях функционирования серийных синтезаторов пептидов, имеющих системы мониторинга. Наконец, во вспомогательной таблице 3 собраны УФ-спектральные характеристики молекул, имеющих отношение к теме обзора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование реактора предложенной конструкции обеспечиваете функционирование гелевых полимеров в полноценном проточном режиме кс позволяет осуществлять непрерывную регистрацию изменений объёма, набухания полимерного реагента, положенную в основу разработкой: свеллографического мониторинга.

Свеллографический мониторинг является новым инструментальных^ методом исследования набухания гранулированных поперечно-сшитых гелевых! полимеров, который делает возможными прямое наблюдение динамики^ набухания в реальном времени и быструю регистрацию «спектра набухаемости» образца полимера в широком наборе растворителей.

В контексте твердофазного синтеза пептидов, свеллографический подходх можно охарактеризовать как совместимый с любой химической методологией^ неинвазивный метод мониторинга. Он позволяет легко документировать каждую операцию протокола и снизить расход растворителей, как MHHHMyivx вдвое, относительно существующих стандартов.

Установлено, что динамика изменения объёма набухания: пептидилполимера в ходе наращивания цепи «в норме» характеризуется линейной зависимостью от прироста массы, а отклонения от линейносттз: указывают на наступление агрегации. Предложена теоретическая интерпретация этих явлений на молекулярном уровне.

Извлечение информации о кинетике реакций конденсации и: деблокирования из свеллографического профиля не представляется возможными, равно как и прямое использование в качестве критерия; завершённости этих реакций момента стабилизации объёма набухания. Это связано с исключительно высокой чувствительностью последнего :ес сольватационным эффектам.

• Высокая чувствительность свеллографического метода к изменению сольватации пептидилполимера определяет и его главное достоинство -возможность детектирования ранних признаков агрегации на стадии конденсации независимо от используемой химической методологии. Этот процесс может быть легко автоматизирован и использован в управляющей программе синтезатора для существенной оптимизации синтеза «трудных» пептидов.

1. Verlander, M.S., Fuller, W.D., Goodman, M. (1982). Solid-phase peptide synthesis using pressurised continuous flow reactor. W08203077-A.

2. Lukas, T.J., Prystowsky, M.B., Erickson, B.W. (1981). Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78(5), 2791-5.

3. Scott, R.P.W., Chan, K.K., Kucera, P., Zolty, S. (1971). Use of resin-coated glass beads in form of a packed bed for solid phase synthesis of peptides. J.Chromatogr.Sci. 9, 557-91.

4. Atherton, E., Brown, E., Sheppard, R.C., Rosevear, A. (1981). A physically supported gel polymer for low-pressure, continuous-flow solid-phase reactions -application to solid-phase peptide synthesis. J. Chem.Soc. Chem. Commun. (21), 1151-2.

5. ABI 43 ЗА Peptide Synthesizer and Series 200 UV Detector. UV Monitoring Guide (2004), Applied Biosystems Inc.: Foster City, CA.

6. Feedback Monitoring Kit for Model 431A Peptide Synthesizers. Product Bidletin 2/94 (1994), PE Applied Biosystems: Foster City, CA.

7. Marti, R.E., Yan, В., Jarosinski, M.A. (1997). Solid-phase synthesis via 5-oxazolidinones. Ring-opening reactions with amines and reaction monitoring by single-bead FT-IR microspectroscopy. J.Org.Chem. 62(16), 5615-8.

8. Lacey, M.E., Sweedler, J.V., Larive, C.K., Pipe, A.J., Farrant, R.D. (2001). H-l' NMR characterization of the product from single solid-phase resin beads using capillary NMR flow probes. J.Magn.Reson. 153(2), 215-22.

9. Hirt, J., de Leer, E.W.B., Beyerman, H.C. (1973). Monitoring in solid-phase peptide synthesis. In: The Chemistry of Polypeptides (Katsoyannis, P.G., ed.), Plenum Press: New York, pp.363-87.

10. Hodges, R.S., Merrifield, R.B. (1975). Monitoring of solid phase peptide synthesis by an automated spectrophotometric picrate method. Anal.Biochem. 65(1-2), 241-72.

11. Kalejs, U., Gibiete, I., Aukone, G. (1992). Qualitative control of t-butoxycarbonyl group removal in SPPS. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis. Proc. 2nd Int. Symp. (Epton, R., ed.), Intercept Ltd.: Andover, UK, pp.415-7.

12. Flegel, M., Sheppard, R.C. (1990). A sensitive, general-method for quantitative monitoring of continuous-flow solid-phase peptide synthesis. J.Chem.Soc.Chem.Commun.il), 536-8.

13. Krchnak, V., Vagner, J., Lebl, M. (1988). Noninvasive continuous monitoring of solid-phase peptide synthesis by acid-base indicator letter. Int.J.Pept.Protein Res. 32(5), 415-6.

14. Krchnak, V., Vagner, J., Safar, P., Lebl, M. (1988). Noninvasive continuous monitoring of solid-phase peptide synthesis by acid-base indicator. Collect.Czech.Chem.Commun. 53(11 A), 2542-8.

15. Bodanszky, M., Sheehan, J.T. (1966). Active esters and resins in peptide synthesis. Chem Ind 38, 1597-8.

16. Gut, V., Rudinger, J. (1967). Discussion. In: Peptides (1966). Proc. 8th Eur. Pept. Symp. (Beyerman, H.C., van de Linde, A., and Maassen van den Brink, W., eds.), North-Holland Publishing Co.: Amsterdam, pp.89-90.

17. Birr, C. (1978). Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer: Berlin, New York.

18. Dryland, A., Sheppard, R.C. (1986). Peptide synthesis. 8. A system for. solid-phase synthesis under low-pressure continuous-flow conditions. J.Chem.Soc.Perkin Trans. 1(1), 125-37.

19. Merrifield, B. (1984). The role of the support in solid-phase peptide synthesis. Br.Polym.J. 16(4), 173-8.

20. Beyerman, H.C. (1972). Some fundamental experiments in solid-phase peptide synthesis. In: Progress in Peptide Research. Vol.11. Proc. 2nd Am. Pept. Symp. (Lande, S., ed.), Gordon and Breach: New York, pp.25-34.

21. Gut, V., Rudinger, J. (1968). Rate measurement in solid phase peptide synthesis. In: Peptides 1968. Proc. 9th Eur. Pept. Symp. (Bricas, E., ed.), North-Holland Publishing Co.: Amsterdam, pp. 185-8.

22. Rudinger, J., Buetzer, P. (1975). Some rate measurements in solid phase synthesis. In: Peptides 1974. Proc. 13th Eur. Pept. Symp. (Wolman, Y., ed.), John Wiley & Sons, Halsted Press: New York, pp.211-9.

23. Gut, V. (1975). Continuous monitoring in solid-phase peptide synthesis. Collect.Czech.Chem.Commun. 40(1), 129-36.

24. Dryland, A., Sheppard, R.C. (1986). Peptide synthesis. 8. A system for solid-phase synthesis under low-pressure continuous-flow conditions. J.Chem.Soc., Perkin Trans. 1(1), 125-37.

25. Chang, C.D., Felix, A.M., Jimenez, M.H., Meienhofer, J. (1980). Solid-phase peptide synthesis of somatostatin using mild base cleavage of N-alpha-9-fluorenylmethyloxycarbonylamino acids. Int.J.Pept.Protein Res. 15(5), 485-94.

26. Atherton, E., Sheppard, R.C. (1989). Analytical and monitoring techniques. In: Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach Using Fmoc-Polyamide Technique, IRL Press: Oxford, UK, pp. 107-30.

27. Dryland, A., Sheppard, R.C. (1988). Peptide synthesis. 11. A system for continuous-flow solid-phase peptide synthesis using fluorenylmethoxycarbonyl-amino acid pentafluorophenyl esters. Tetrahedron 44(3), 859-76.

28. Bayer, E. (1991). Towards the chemical synthesis of proteins. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 30(2), 113-29.

29. Diamond, R. (1986). On the analysis of solute uptake in circulating diffusing systems by a curve fitting procedure. J.Chem.Soc., Perkin Trans.7(1), 139-43.

30. Carlquist, M. (1987). Solid-phase synthesis of a 31-residue fragment of human glucose-dependent insulinotropic polypeptide (Gip) By the continuous-flow polyamide method. Acta Chem.Scand. 41(7), 494-8.

31. Bedford, J., Hyde, C., Johnson, Т., Jun, W., Owen, D., Quibell, M., Sheppard, R.C. (1992). Amino acid structure and "difficult sequences" in solid phase peptide synthesis. Int.J.Pept.Protein Res. 40(3-4), 300-7.

32. Bedford, J., Johnson, Т., Jun, W., Sheppard, R.C. (1992). Rate-slowing effects and side rections in the solid phase peptide-resin matrix. In: Innovation and

33. Perspectives in Solid Phase Synthesis. Proc. 2nd Int. Symp. (Epton, R., ed.), Intercept Ltd.: Andover, UK, pp.381-5.

34. Frank, R., Gausepohl, H. (1988). Continuous flow peptide synthesis. In: Modern Methods in Protein Chemistry, Vol.3 (Tschesche, H., ed.), W. de Gruyter: Berlin, N.Y., pp.41-60.

35. Shai, Y., Jacobson, K.A., Patchornik, A. (1985). 'Mediator methodology' for the synthesis of peptides in a two-polymeric system. J.Am.Chem.Soc. 107(14), 4249-52.

36. Atherton, E., Cameron, L.R., Sheppard, R.C. (1988). Peptide synthesis. 10. Use of pentafluorophenyl esters of fluorenyl methoxycarbonylamino acids in solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron 44(3), 843-57.

37. Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D., Cook, P.I. (1970). Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal.Biochem. 34, 595-8.

38. Hancock, W.S., Battersby, J.E. (1976). A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal Biochem 71(1), 260-4.

39. Dimarchi, R.D., Tam, J.P., Kent, S.B., Merrifield, R.B. (1982). Weak acid-catalyzed pyrrolidone carboxylic acid formation from glutamine during solidphase peptide synthesis. Minimization by rapid coupling. Int.J.Pept.Protein Res. 19(1), 88-93.

40. Gisin, B.F., Merrifield, R.B. (1972). Carboxyl-catalyzed intramolecular aminolysis. A side reaction in solid- phase peptide synthesis. J.Am.Chem.Soc. 94(9), 3102-6.

41. Dorman, L.C. (1969). A non-destructive method for the determination of completeness of coupling reactions in solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 10(28), 2319-21.

42. Horn, M., Novak, C. (1988). A monitoring and control chemistry for solid-phase peptide synthesis. Intl.Biotech.Lab.{April), 30-7.

43. Horn, M.J., Recchia, J. (1989). Method and apparatus for monitoring and automated solid phase synthesis of peptides. US 4800166.

44. Salisbury, S.A., Tremeer, E.J., Davies, J.W., Owen, D.E.I.A. (1990). Acylation monitoring in solid-phase peptide synthesis by the equilibrium distribution of colored ions. J.Chem.Soc.Chem.Commun.(7), 538-40.

45. Salisbury, S., Tremeer, E., Owen, D., Davies, J. (1993). Method for monitoring in peptide synthesis. US5262331.

46. McFerran, N.V., Walker, В., McGurk, C.D., Scott, F.C. (1991). Conductance measurements in solid phase peptide synthesis. I. Monitoring coupling and deprotection in Fmoc chemistry. Int. J.Pept.Protein Res. 37(5), 382-7.

47. McFerran, N.V., Walker, В., Elmore, D.T. (1995). Conductance measurements in organic solvents. US5472880.

48. Lloyd, D.H., DeFranco, R.J., Ladd, C.S. (1995). Biopolymer synthesis apparatus and method. US5462748.

49. Schafer-Nielsen, C., Hansen, P.H., Lihme, A., Heegaard, P.M. (1989). Real time monitoring of acylations during solid phase peptide synthesis: a method based on electrochemical detection. JBiochem Biophys Methods 20(1), 69-79.

50. Schafer-Nielsen, C. (1990). Monitoring reactions in solid phase peptide synthesis by conductivity measurements. W09011291.

51. Fox, J.E. (1990). A new detector for fully automatic peptide synthesis. Biochem Soc Trans 18(6), 1308-10.

52. Fox, J.E., Newton, R., Stroud, C.H. (1991). A new detector for fully automatic peptide synthesis. Int. J.Pept.Protein Res. 38(1), 62-5.

53. Viewing Detector Traces on the 9050Plus PepSynthesizer. Technical Notes. 3/99 (1999), PE Biosystems: Foster City, С A.

54. Pioneer™ Peptide Synthesis System. Monitoring Peptide Synthesis. Technical Bulletin (2000), PE Biosystems: Framingham.

55. Model 431A Peptide Synthesizer Users Manual. Version 1.12 (1989), PE Biosystems: Foster City, CA.

56. ABI 433A Peptide Synthesizer and Series 200 UV Detector. UV Monitoring Guide (2004), Applied Biosystems Inc.: Foster City, С A.

57. Applied Biosystems (2002). Use of the Ninhydrin Reaction to Monitor Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis. In: Peptide Synthesizer User Bidletin No. 29, July 1989, updated: 09/, pp. 1-7.

58. Merrifield, R.B. (1962). Peptide synthesis on a solid polymer. Fed.Proc. 21, 412.

59. Merrifield, R.B. (1963). Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J.Am.Chem.Soc. 85, 2149-54.

60. Merrifield, R.B., Stewart, J.M. (1965). Automated peptide synthesis. Nature 207(996), 522-3.

61. Merrifield, R.B., Stewart, J.M., Jernberg, N. (1970). Apparatus for automated synthesis of peptides. US3531258.

62. Schwarz BioResearch. Peptide synthesizer (1969). Science 17 October, 309.

63. Carpino, L.A., Han, G.Y. (1970). The 9-FIuorcnyImethoxycarbonyl Function, a New Base-Sensitive Amino-Protecting Group. J.Am.Chem.Soc. 92, 5748-9. •

64. Birr, C., Lochinger, W., Stahnke, G., Land, P. (1972). Der alpha,alpha-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl(Ddz)-Rest, eine photo- und saeurelabile Stickstoff-Schutzgruppe flier die Peptidchemie. Justus Liebigs Ann.Chem. 763, 162-72.

65. Barany, G., Merrifield, R.B. (1979). Solid phase peptide synthesis. In: The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2 (Gross, E. and Meienhofer, J., eds.), Academic Press: New York, pp.3-285.

66. Vazquez, J.V., Qushair, G., Albericio, F. (2003). Qualitative colorimetric tests for solid phase synthesis. Methods Enzymol. 369, 21-35.

67. Sabatino, G., Chelli, M., Brandi, A., Papini, A.M. (2004). Analytical methods for solid phase peptide synthesis. Current Organic Chemistry 8(4), 291-301.

68. Wolters, E.T., Tesser, G.I., Nivard, R.J. (1974). Synthesis of the A 14-21 sequence of ovine insulin by the solid-phase technique. J Org Chem 39(23), 3388-92.

69. Esko, K., Karlsson, S., Porath, J. (1968). A method for determining free amino groups in polymers with particular reference to the Merrifleld synthesis. Acta Chem.Scand. 22(10), 3342-4.

70. Losse, G., Klengel, H. (1971). Synthese des depsipeptides valinomycin nach der festphasemethode. Tetrahedron 27, 1423-34.

71. Sheppard, R.C. (1983). Continuous-flow methods in organic-synthesis. Chem.Br. 19(5), 402-13.

72. Baru, M.B., Mustaeva, L.G., Gorbunova, E.Y., Vagenina, I.V., Kitaeva, M.A., Cherskii, V.V. (1999). Spectrophotometry monitoring in continuous-flow Boc-based solid-phase peptide synthesis. J.Pept.Res. 54(4), 263-9.

73. Brunfeldt, K., Roepstorff, P., Thomsen, J. (1969). Process control in the solid phase peptide synthesis by titration of free amino groups. Acta Chem.Scand. 23, 2906-7.

74. Brunfeldt, К., Christensen, Т., Villemoes, P. (1972). Automatic monitoring of solid phase synthesis of a decapeptide. FEBS Lett. 22, 238-44.

75. Brunfeldt, K. (1977). Reflections on control of peptide synthesis. Acta Physica et Chemica 23(4), 499-514.

76. Villemoes, P., Christensen, Т., Brunfeldt, K. (1978). Computerized peptide synthesizer with feed back control. Acta Chem.Scand. 32(10), 703-13.

77. Villemoes, P., Christensen, Т., Brunfeldt, K. (1976). Computer-controlled peptide synthesizer. Hoppe-Seylers Z.Physiol. Chem. 357(5), 713-9.

78. Brunfeldt, K., Christensen, Т., Roepstorff, P. (1972). Acetylation an artefact in solid phase peptide synthesis. A mass spectrometrical investigation. FEBS Lett. 25, 184-8.

79. Patek, M., Bildstein, S., Flegelova, Z. (1998). Monitoring solid phase reactions with ion-selective electrode. Tetrahedron Lett. 39(8), 753-6.

80. Schou, O., Brunfeldt, K., Rubin, I., Hansen, L. (1975). Coupling of histidine in solid-phase synthesis monitored by titration. Hoppe-Seylers Z.Physiol.Chem. 356(9), 1451-4.

81. Losse, G., Ulbrich, R. (1971). Kontrolle des Umstatzgrades bei der Merrifield Synthese. Z.Chem. 11(9), 346-7.

82. Hancock, W.S., Prescott, D.J., Vagelos, P.R., Marshall, G.R. (1973). Solvation of the polymer matrix. Source of truncated and deletion sequences in solid phase synthesis. J Org Chem 38(4), 774-81.

83. Sheppard, R., Meldahl, M. (1987). Solid phase synthesis of peptides from linear amino acid residues in reaction system including 3-hydroxy-1,2,3-benzo-triazine-4-(3H)-one with monitoring of colour photometrically. US5126273.

84. Felix, A.M., Merrifield, R.B. (1970). Azide solid phase peptide synthesis. J.Am.Chem.Soc. 92(5), 1385-91.

85. Wang, S.S., Merrifield, R.B. (1972). A solid phase fragment approach to peptide synthesis. The application of a t-alkyloxycarbonylhydrazide resin and a t-alkyl alcohol resin. Int. J.Pept.Protein Res. 4(5), 309-18.

86. Mitchell, A.R., Kent, S.B.H., Erickson, B.W., Merrifield, R.B. (1976). Preparation of aminomethyl-polystyrene resin by direct amidomethylation. Tetrahedron Lett.(42), 3795-8.

87. Henkel, В., Bayer, E. (1998). Monitoring of solid phase peptide synthesis by FT-IR spectroscopy. J Pept Sci 4(8), 461-70.

88. Larsen, B.D., Christensen, D.H., Holm, A., Zillmer, R., Nielsen, O.F. (1993). The Merrifield peptide synthesis studied by near-infrared Fourier-transform Raman spectroscopy. J.Am.Chem.Soc. 115(14), 6247-53.

89. Yan, В., Fell, J.B., Kumaravel, G. (1996). Progression of organic reactions on resin supports monitored by single bead FTIR microspectroscopy. J. Org. Chem. 61(21), 7467-72.

90. Sarin, V.K., Kent, S.B., Tam, J.P., Merrifield, R.B. (1981). Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction. Anal.Biochem. 117(1), 147-57.

91. Vilaseca, L., Bardaji, E. (1995). Microscale ninhydrin test applied to solid-phase peptide synthesis. J.Chem.Educ. 72(5), A99-A100.

92. Bayer, E., Jung, G., Halasz, I., Sebestian, I. (1970). A new support for polypeptide synthesis in columns. Tetrahedron Lett. 51, 4503-5.

93. Lapluye, G., Poisson, R. (1995). Process and apparatus for heterogeneous phase synthesis of macromolecules such as peptides, polynucleotides or oligosaccharides. US5,446,608.

94. Sternlicht, H., Kenyon, G.L., Packer, E.L., Sinclair, J. (1971). Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies of heterogeneous systems. Amino acids bound to cationic exchange resins. J.Am.Chem.Soc. 93(1), 199-208.

95. Pudelko, M., Kihlberg, J., Elofsson, M. (2007). Application of gel-phase F-19 NMR spectroscopy for optimization of solid-phase synthesis of a hydrophobic peptide from the signal sequence of the mucin MUC1. J.Pept.Sci 13(5), 354-61.

96. Wallner, F.K., Elofsson, M. (2006). NMR tube filter reactor for solid-phase synthesis and gel-phase F-19 NMR spectroscopy. J.Comb.Chem. 8(2), 150-2.

97. Pinnell, R.P., Khune, G.D., Khatri, N.A., Manatt, S.L. (1984). Concerning the chloromethylation of alkylbenzenes and polystyrenes by chloromethyl methyl-ether. Tetrahedron Lett. 25(33), 3511-4.

98. Epton, R., Goddard, P., Ivin, K.J. (1980). C13 NMR spectroscopy as an analytical method in solid (gel) phase peptide synthesis. Polymer 21(12), 136771.

99. Giralt, E., Rizo, J., Pedroso, E. (1984). Application of gel-phase C-13 NMR to monitor solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron 40(20), 4141-52.

100. Ramadhar, T.R., Amador, F., Ditty, M.J.T., Power, W.P. (2008). Inverse H-C ex situ HRMAS NMR experiments for solid-phase peptide synthesis. Magn.Reson.Chem. 46(1), 30-5.

101. Hany, R., Rentsch, D., Dhanapal, В., Obrecht, D. (2001). Quantitative determination of resin loading in solid-phase organic synthesis using C-13 MAS NMR. J.Comb.Chem. 3(1), 85-9.

102. Pursch, M., Schlotterbeck, G., Tseng, L.H., Albert, K. (1996). Monitoring the reaction progress in combinatorial Chemistry: H-l MAS NMR investigations on single macro beads in the suspended state. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 35(23-24), 2867-9.

103. Gotfredsen, C.H., Grotli, M., Willert, M., Meldal, M., Duus, J.O. (2000). Single-bead structure elucidation. Requirements for analysis of combinatorial solid-phase libraries by Nanoprobe MAS-NMR spectroscopy. J.Chem.Soc., Perkin Trans. 1 7, 1167-71.

104. Valente, A.P., Almeida, F.C.L., Nakaie, C.R., Schreier, S., Crusca, E., Cilli, E.M. (2005). Study of the effect of the peptide loading and solvent system in SPPS by HRMAS-NMR. J.Pept.Sci 11(9), 556-63.

105. Lippens, G., Chessari, G., Wieruszeski, J.M. (2002). Resin dynamics contributes to the NMR line broadening of organic molecules grafted onto a polystyrene resin. J.Magn.Reson. 156(2), 242-8.

106. Sarkar, S.K., Garigipati, R.S., Adams, J.L., Keifer, P.A. (1996). An NMR method to identify nondestructively chemical compounds bound to a single solid-phase-synthesis bead for combinatorial chemistry applications. J.Am. Chem.Soc. 118(9), 2305-6.

107. Deber, C.M., Lutek, M.K., Heimer, E.P., Felix, A.M. (1989). Conformational origin of a difficult coupling in a human growth hormone releasing factor analog. Pept.Res. 2(2), 184-8.

108. Bayer, E., Albert, K., Willisch, H., Rapp, W., Hemmasi, B. (1990). C-13 NMR relaxation-times of a tripeptide methyl-ester and its polymer-bound analogs. Macromolecules 23(7), 1937-40.

109. Dhalluin, C., Boutillon, C., Tartar, A., Lippens, G. (1997). Magic angle spinning nuclear magnetic resonance in solid-phase peptide synthesis. J.Am.Chem.Soc. 119(43), 10494-500.

110. Gisin, B.F. (1972). The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal.Chim.Acta 58, 248-9.

111. Hancock, W.S., Battersby, J.E., Harding, D.R.K. (1975). Use of picric acid as a simple monitoring procedure for automated peptide synthesis. Anal.Biochem. 69(2), 497-503.

112. Arad, O., Houghten, R.A. (1990). An evaluation of the advantages and effectiveness of picric acid monitoring during solid phase peptide synthesis. Pept.Res. 3(1).

113. Cilli, E.M., Jubilut, G.N., Ribeiro, S.C.F., Oliveira, E., Nakaie, C.R. (2000). Importance of the solvation degree of peptide-resin beads for amine groups determination by the picric acid method. J.Brazil.Chem.Soc. 11(5), 474-8.

114. Билибин, А.Ю., Власов, Г.П. (1973). Получение аминоацил-сефадексов и использование п-толуолсульфокислоты для определения их емкостей. Журнал Общей Химии 43(8), 1844-8.

115. Felix, A.M., Jimenez, М.Н. (1973). Rapid fluorometric detection for completeness in solid phase coupling reactions. Anal Biochem 52, 377-81.

116. Regen, S.L. (1975). Influence of solvent on motion of molecules immobilized on polystyrene matrices and on glass surfaces. J.Am.Chem.Soc. 97(11), 3108-12.

117. Vaino, A.R., Goodin, D.B., Janda, K.D. (2000). Investigating resins for solid phase organic synthesis: The relationship between swelling and microenvironment as probed by EPR and fluorescence spectroscopy. J.Comb.Chem. 2(4), 330-6.

118. Oliveira, E., Cilli, E.M., Miranda, A., Jubilut, G.N., Albericio, F., Andreu, D., Paiva, A.C.M., Schreier, S., Tominaga, M., Nakaie, C.R. (2002). Monitoring the chemical assembly of a transmembrane bradykinin receptor fragment:

119. Correlation between resin solvation, peptide chain mobility, and rate of coupling. Eur.J.Org.Chem.(21), 3686-94.

120. Nakaie, C.R., Malavolta, L., Schreier, S., Trovatti, E., Marchetto, R. (2006). Direct electron paramagnetic resonance monitoring of the peptide synthesis coupling reaction in polymeric support. Polymer 47(13), 4531-6.

121. Cilli, E.M., Vicente, E.F., Crusca, E., Nakaie, C.R. (2007). EPR investigation of the influence of side chain protecting groups on peptide-resin solvation of the Asx and Glx model containing peptides. Tetrahedron Lett. 48(31), 5521-4.

122. Christensen, T. (1979). Qualitative test for monitoring coupling completeness in solid-phase peptide synthesis using chloranil. Acta Chem.Scand. 33(10), 763-6.

123. Vojkovsky, T. (1995). Detection of Secondary-Amines on Solid-Phase. Pept.Res. 8(4), 236-7.

124. Marik, J., Song, A., Lam, K.S. (2003). Detection of primary aromatic amines on solid phase. Tetrahedron Lett. 44(23), 4319-20.

125. Kaiser, E., Bossinger, C.D., Colescott, R.L., Olsen, D.B. (1980). Color test for terminal prolyl residues in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Chim.Acta 118(1), 149-51.

126. Бару, М.Б., Родионов, И.Л., Шестаковский, Л.Я., Ларин, В.Т. (1991). Проточный реактор для твердофазного синтеза биополимеров. А.С. №1650240 (СССР); приоритет от 10.09.1986.

127. Бару, М.Б., Родионов, И.Л., Шестаковский, Л.Я., Ларин, В.Т. (1992). Способ управления процессом твердофазного синтеза биополимеров. А.С. №1744087 (СССР); приоритет от 10.09.1986.

128. Horn, М., Novak, С. (1987). A monitoring and control chemistry for solid-phase peptide synthesis. Am.Biotech.Lab. 5(5), 12-21.

129. Reddy, M.P., Voelker, P.J. (1988). Novel method for monitoring the coupling efficiency in solid phase peptide synthesis. Int. J.Pept.Protein Res. 31(3), 345-8.

130. Packman, L.C., Quibell, M., Johnson, T. (1994). Roles of electrospray mass spectrometry, counterion distribution monitoring and N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl) backbone protection in peptide synthesis. Pept.Res. 7(3), 12531.

131. Kinsman, R.G., Olivier, G.W.J. (1994). Counter-ion distribution monitoring: a critical appraisal. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis. Proc. 3rd Int. Symp. (Epton, R., ed.), Mayflower Worldwide: Birmingham, UK, pp.571-4.

132. Dettin, M., Pegoraro, S., Rovero, P., Bicciato, S., Bagno, A., Di Bello, C. (1997). SPPS of difficult sequences. A comparison of chemical conditions, synthetic strategies and on-line monitoring. J Pept Res 49(1), 103-11.

133. Медведкин, В.Н., Пермяков, Е.А., Уверский, В.Н., Грипась, А.Ф., Митин, Ю.В. (1994). Флуоресцентный контроль твердофазного синтеза пептидов с применением кварцевого реактора-кюветы. Биоорган.химия 20(6), 635-42.

134. Baru, М.В., Mustaeva, L.G., Vagenina, I.V., Gorbunova, E.Y., Cherskii, V.V.2001). Pressure monitoring of continuous-flow solid-phase peptide synthesis. J.Pept.Res. 57(3), 193-202.

135. Haake, H.M., Tuennemann, R., Brecht, A., Austel, V., Jung, G., Gauglitz, G.2002). Online monitoring of solid-phase peptide syntheses on glass-type surfaces using white light interference. Anal.Biochem. 300(2), 107-12.

136. Hutton, R.S., Adams, J.P., Trivedi, H.S. (2003). Monitoring solid phase synthesis reactions with electrochemical impedance spectroscopy (EIS). Analyst 128(1), 103-8.

137. Brunfeldt, K., Roepstorff, P., Halstroem, J. (1971). Reactions System. US3557077.

138. Brunfeldt, K., Halstrom, J., Roepstorff, P. (1969). A punched tape controlled peptide synthesizer. Acta Chem.Scand. 23, 2830-8.

139. Merrifield, R.B., Stewart, J.M., Jernberg, N. (1966). Instrument for automated synthesis of peptides. Anal.Chem. 38(13), 1905-14.

140. Bridgham, J., Geiser, T.G., Hunkapiller, M.W., Kent, S.B.H., Marriott, M.P., Ramstad, P.O., Nordman, E.S. (1985). Fully automated solid phase peptide synthesis and appts., consisting of separate reaction and amino acid activation vessels. US592638.

141. Model 4S0A Peptide Synthesizer Users Manual. Version 1.3B (1988), Applied Biosystems Inc.: Foster City, CA.

142. Otteson, K.M., MacDonald, R.L., Noble, R.L., Hoeprich, P.D. (1991). Research News, Applied Biosystems Inc.: Foster City, CA.

143. Synergy™ Personal Peptide Synthesizer. Users Manual. Rev. С (2002), Applied Biosystems Group: Foster City, С A.

144. MilliGen 9050 Plus PepSynthesizer. User's Guide (1992), Millipore Corporation: Bedford, MA.

145. Cammish, L.E., Kates, S.A. (2000). Instrumentation for automated solid phase peptide synthesis. In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D., eds.), Oxford University Press: Oxford, UK, pp.277-302.

146. ABI 43ЗА Peptide Synthesizer Users Manual. Version 1.0 (1993), Applied Biosystems Inc.: Foster City, CA.

147. ABI 43ЗА Peptide Synthesizer and Series 200 UV Detector. UV Monitoring Guide (2004), Applied Biosystems Inc.: Foster City, CA.

148. Pioneer Peptide System. Users Guide (1996), PerSeptive Biosystems, Inc.: Framingham.

149. TechniKrom Inc. (2008). Oligonucleotide and Peptide Synthesizers. In: TKOligon-PeptideSynthBroch5-08Web.pdf, www.technikrom.com: Glenview, IL.

150. Daniels, S.B. (1999). Instrumentation. In: Solid-Phase Synthesis. A Practical Guide (Kates, S.A. and Albericio, F., eds.), Marcel Dekker: N.Y., pp.705-33.

151. Ваш, M.B., Rodionov, I.L., Shestakovsky, L.Ya., Larin, V.T. (1990). Method for controlling solid-phase synthesis of biopolymers. EP0380672.

152. Baru, M.B., Rodionov, I.L., Shestakovsky, L.Ya., Larin, V.T., Deryabin, S.M. (1990). Reactor for solid-phase synthesis of biopolymers. EP0386238.

153. Бару, М.Б., Родионов, И.Л., Шестаковский, Л.Я., Ларин, В.Т., Дерябин, С.М. (1988). Способ синтеза пептидилполимеров на нежестком полимерном носителе. Решение о выдаче а.с. по №4293280.

154. Бару, М.Б., Родионов, И.Л., Иванов, В.В., Иванов, В.Т. (1991). Проточный реактор для твердофазного синтеза биополимеров. А.С. №4875911 (СССР).

155. Бару, М.Б., Родионов, И.Л., Ларин, В.Т. (1991). Установка для осуществления физико-химических процессов с участием полимерных носителей. Решение о выдаче а.с. по №4844267.

156. Rodionov, I.L., Ваш, М.В., Ivanov, V.T. (1992). A swellographic approach to monitoring continuous-flow solid-phase peptide synthesis. Pept.Res. 5(2), 11925.

157. Rodionov, I.L., Ваш, M.B., Ivanov, V.T. (1992). Continuous monitoring of the swelling behavior of gel-type reactive polymers and chromatographic media -some practical applications of the technique. React.Polym. 16(3), 311-9.

158. Sarin, V.K., Kent, S.B.H., Merrifield, R.B. (1980). Properties of swollen polymer networks solvation and swelling of peptide-containing resins in solid-phase peptide synthesis. J.Am.Chem.Soc. 102(17), 5463-70.

159. Fields, G.B., Fields, C.G. (1991). Solvation effects in solid-phase peptide synthesis. J.Am.Chem.Soc. 113(11), 4202-7.

160. Stahl, G.L., Smith, C.W., Walter, R. (1980). Superior swelling properties of resins of poly-N-acrylyldialkylamines over polystyrene in solvents for peptide synthesis .Int.J.Pept.Protein Res. 15(4), 331-4.

161. Errede, L.A. (1991). Molecular interpretations of sorption in polymers. 1. Introduction. Adv.Polym.Sci. 99, 1-115.

162. Laursen, R.A. (1971). Solid-phase Edman degradation. An automatic peptide sequencer. Eur.J Biochem. 20, 89-102.

163. Rodionov, I.L., Peshenko, I.A., Baidakova, L.K., Ivanov, V.T. (2007). Swellographic study of peptide resin swelling behavior during solid phase peptide synthesis. Int.J.Pept.Res.Ther. 13(1-2), 161-71.

164. Fields, G.B., Otteson, K.M., Fields, C.G., Noble, R.L. (1990). The versatility of solid phase peptide synthesis. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis. Proc. 1st Int. Symp. (Epton, R., ed.), SPCC(UK) Ltd.: Birmingham, UK, pp.241-59.

165. Errede, L.A. (1989). Polymer swelling. 7. A molecular interpretation of polymer swelling. J.Phys.Chem. 93(6), 2668-71.

166. Peshenko, I.A., Rodionov, I.L., Ivanov, V.T. (1998). Aggregation in the course of solid phase synthesis of native and model polypeptide sequences. In: Life Chemistry. Proc. XVI Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry. Vol.4 Moscow, p.81.

167. Stewart, J.M., Young, J.D. (1984). Experimental procedures. In: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co.: Rockford, IL, pp.76-111.

168. Chan, W.C., White, P.D. (2000). Basic procedures. In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D., eds.), Oxford University Press: Oxford, UK, pp.41-76.