Изучение посттрансляционных модификаций вирусных белков с использованием масс-спектрометрических подходов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Серебрякова Марина Васильевна

ИЗУЧЕНИЕ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫХ МОДИФИКАЦИЙ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена в отделе хроматографии Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, в лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья РАМН и в отделе протеомных исследований Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН.

Научные руководители:

доктор химических наук Баратова Людмила Алексеевна

кандидат биологических наук Брусов Олег Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Вартапетян Андрей Борисович

доктор физико-математических наук Олейников Владимир Александрович

Ведущая организация:

Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится 25 октября 2005 года в 16 на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан сентября 2005 г. Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 501.001.41, кандидат химических наук

2 OD 6 - 9

/32 70

Актуальность проблемы.

Модификация белков в биологических системах приводит к изменению их физико-

посттрансляционные модификации, как гликознлирование, фосфорилирование, присоединение остатков жирных кислот являются не только наиболее распространенными, но и функционально важными для белков.

В последние десятилетия были достигнуты впечатляющие успехи в разработке физико-химических методов выявления посттрансляционных модификаций белков, среди которых важное место заняли методы масс-спектрометрического анализа (Mann et all, 2001). С появлением способов получать ионы белков и пептидов, не разрушая их, и измерять их ^ массы, появилась возможность судить об их модификациях по расхождению значений расчитаниых и измеренных масс. Одним из методов ионизации является MALDI - лазерная десорбция/ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы.

При исследовании структуры белка обычно прибегают к получению масс-спектромегрической пептидной карты - определению набора значений масс пептидов после проведения высокоспецифического гидролиза белка - химического или ферментативного («MS-peptide fingerprint»). Помимо получения значений масс целых молекул в сложных смесях, масс-спектрометрия предоставляет возможность получения спектров фрагментации отдельных пептидов, происходящей непосредственно в масс-спектрометре. Получение пептидных карт белка и/или спектров фрагментации отдельных пептидов позволяет подтвердить первичную структуру, выявить посттрансляционные модификации, включая природу заместителей и места связывания.

В ряде случаев, при получении спектров фрагментации разрушение связи модифицирующей группы с пептидом происходит очень интенсивно и приводит к потере информации об исходной локализации модификации на пептиде. Так, например, при определении точек гликозилирования неустойчивость гликозидных связей в условиях ионизации ведет к первоочередному отщеплению сахара от исследуемого пептида (Harvey, 1996). Поэтому для правильной интерпретации масс-спектров необходимо верно оценивать устойчивость ковалентной связи модифицирующей группы с пептидом и в случае низкой устойчивости искать дополнительные подходы к установлению точки модификации.

Вследствие разной способности у разных пептидов сокристаллизоваться с матрицей (MALDI) и образовывать газофазные ионы, масс-спектрометрия не является количественным методом анализа. Поэтому при изучении степени модифицированное™ требуется либо подбор специальных методов профподготовки, позволяющих нивелировать эти различия,

химических свойств, конформации, стабильности, биологической активности. Такие

либо параллельное применение других метол

юрез etc).

В данной работе при помощи MALDI-времяпролетной-масс-сиектрометрии (Hillenkamp et all, 1991) изучались два типа природных модификаций - О-гликозилирование и ацилирование жирными кислотами цистеиновых остатков природных белков.

Первая часть работы направлена на определение модификаций белка оболочки X вируса картофеля - предстает еля группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Роль белка оболочки не ограничивается формированием защитного белкового чехла. Он также вовлечен в транспорт вирусной РНК по растению, влияет на возникновение \

резистентности растения картофеля к заражению, значим для регуляции трансляции на разных стадиях инфекции (Goulden et all, 1993, Rodionova et all, 2003). В 1994 году был установлен факт О-гликозилирования белка оболочки (Tozzini et all, 1994), но до последнего времени не были изучены ни тип Сахаров, ни их локализация, ни степень гликозилирования белка, ни их биологическая роль. Это делает безусловно актуальным углубленный анализ этой модификации белка оболочки.

Во второй части работы исследовались модификации С-концевого фрагмента легкой цепи гемагглктгинина вируса гриппа типа А. Гемагглютинин - наиболее представленный гликозилированный поверхностный белок вируса (Skehel et all, 2000). Он представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из двух связанных между собой дисульфидным мостиком цепей. Легкая цепь заякорена в мембрану своим С-концевым участком. Основные исследования структурных и функциональных особенностей гемагглютинина связаны с изучением его эктодоменов. Для ряда штаммов получены рентгеноструктурные данные, проливающие свет на пространственную организацию экспонированной на поверхность части белка (Wilson et all, 1981; Bullough et all, 1994; Gamblin et all, 2004). В то же время практически отсутствуют данные о структуре заякоренного в оболочке вириона С-концевого фрагмента. На сегодня существует единственная работа на синтетическом пептиде, встроенном в липосому, направленная на выяснение его свойств и структуры (Tatulian et all, 2000). Фрагмент гемагглютинина, остающийся в вирусной мембране после обработки вириона протеазой бромелаином (Brand et all, 1972), содержит трансмембранный домен и небольшой внутривирионный участок, цистеиновые остатки которого модифицированы высшими жирными кислотами (Schroth-Diez et all, 2000; Veit et all, 1996). Исследование типа и степени ацилирования представляется очень важным, так как жирные кислоты могут обеспечивать определенную ориентацию трансмембранных доменов в лшшдном бислое, способствовать тримеризации гемагглютинина, участвовать в образовании пор слияния в процессе инфицирования клетки-хозяина и во взаимодействии гемагглютинина с внутренними вирусными белками.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена отработке методов применения MALDI-времяпролетной масс-сттектрометрии для изучения двух распостраненных модификаций природных белков - О-гликозилирования и ацилирования цистеиновых остатков высшими жирными кислотами. С этой целью были сформулированны следующие задачи:

1 исследовать возможные посттрансляционные модификации белка оболочки природного штамма UK3 X вируса картофеля и его ST-мутанта, являющегося типичным представителем группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Для этого: получить и проанализировать пептидные карты белка, определить степень глихозилирования и тип присоединенных сахарных остатков, разработать подходы к точному установлению сайтов гликозилирования.

2 исследовать структуру и характер ацилирования высшими жирными кислотами цистеинов С-концевого фрагмента лбпсой цепи гемагглютинина трёх штаммов вируса гриппа типа A: A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для этого: выделить и идентифицировать С-концевые пептиды, определить степень ацилирования трех консервативных цистеиновых остатков этой области белка и тип присоединяемых жирнокислотиых остатков, изучить стабильность тиоэфирной связи в условиях получения масс-спектров и в присутствии восстанавливающих агентов.

Научная новизна и практическая значимость работы сформулированы в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:

1 Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Для них:

- установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетюшровании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц;

- впервые установлен тип и локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы - присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3;

2 Выделены и методами масс-спектрометрии охарактеризованы С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный

домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для них:

- впервые продемонстрировано практически полное адилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривириоииого участка белка остатками жирных кислот;

- впервые установлена возможность модификации гемагглютинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область бежа пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.

- впервые показана неравноценность трех указанных цистеиновых остатков по отношению к ацилировашпо разными жирными кислотами. Для штамма A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.

Практическая значимость работы заключается в разработке методологических подходов к изучению неустойчивых в условиях ионизации модификаций, к выделению и масс-спектрометрическому анализу трансмембранных пептидов. Отдельным результатом работы является определение устойчивости тиоэфирной связи при получении спектров фрагментации ацилированных пептидов и изучение лабильности этой связи под действием восстанавливающих агентов.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 11 работах, в том числе в 5 статьях в отечественных и зарубежных научных журналах и в тезисах 6 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.

Результаты работы доложены на 3"*" международном пептидном симпозиуме (Прага, Чехия, сентябрь 2004), на 2"°" международном семинаре-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологаи» (Звенигород, октябрь 2004), на УП чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, октябрь 2004), на I и II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003; Санкт-Петербург, май 2005) и на 19"0" Американском пептидном симпозиуме (Сан-Диего, США, июнь 2005).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 37 рисунков и 2 приложения. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы, содержащего 121 ссылку.

Содержание работы.

1. Масс-спектрометр ическое определение положения углеводных остатков в белке оболочки Х-вируса картофеля, штамм UK3, и его мутанта. 1.1 Определение возможных модификаций белка оболочки.

Вирусная частица Х-вируса картофеля (ХВК) состоит из одной молекулы рибонуклеиновой кислоты и более тысячи идентичных белковых субъединиц, образующих оболочку вокруг РНК (Tollin et all, 1988). Ген белка оболочки (БО) ХВК штамма UK3 кодирует 236 аминокислотных остатков (Kavanagh et all, 1992). Однако, при проведении денатурирующего электрофореза в ПААГ отмечается аномально замедленная подвижность белка по сравнению с ожидаемой, что часто бывает связано с наличием в белке посттрансляционных модификаций. Для их выявления предпринимались попытки секвенирования белка по Эдману, которые оканчивались неудачей вследствие возможного ацетилирования N-концевой аминокислоты. ^

N-концевая область белка оболочки ХВК локализована на поверхности вирусной частицы, способна отщепляться под действием протеаз клеточного сока и может быть легко удалена при мягкой обработке трипсином без разрушения структуры вириона (Koenig et all, 1978). Поверхностная локализация N-концевой области белка в вирусной частице может указывать на наличие модификации именно в этой области.

В ходе данной работы было проведено сравнительное исследование препаратов ХВК штамма UK3 и его мутанта, в белке оболочки которого все остатки серина и треонина (потенциальные сайты гликозилирования) N-концевой последовательности (1-20) заменены на остатки глицина или аланина:

SAPASTTQPIGSTTSTTTKT.. -> AAPAGGAQPIGAGGAAGАКА..

UK3 ST-мутант

Мутаитный штамм был получен с помощью мутагенеза in vitro и любезно предоставлен нам С.В.Козловским (Козловский и др., 2003).

Белок оболочки ST-мутантного штамма не обладает аномальной подвижностью при проведении денатурирующего электрофореза в полиакриамидном геле.

При ограниченном триптическом гидролизе ХВК от белка оболочки происходит отщепление N-концевого пептида. Электрофорез по Лэмли (рис.1) белковых препаратов обоих вирусных штаммов - интактных и после ограниченного трипсинолиза вирусных частиц - показал, что подвижности БО штамма UK3 и мутанта отличаются, и это различие в подвижностях исчезает после мягкой обработки трипсином. Вид и положение полос свидетельствует о том, что проходит полный гидролиз по одинаковой для обоих штаммов точке БО. Изначально большую подвижность БО мутаятного штамма можно объяснить отсутствием у него посттрансляционных модификаций в отщепляемом фрагменте.

Рис 1 Электрофореграммы белков оболочки двух штаммов до и после проведения ограниченного гидролиза трипсином:

1 - БО штамма 1!КЗ

2 - БО штамма 11КЗ после трипсинолиза

3 - БО мутанта

4 - БО мутанта после трипсинолиза

Для определения возможных модификаций БО был проведен гидролиз его трипсином непосредственно в ПААГ с последующим масс-спектрометрическим анализом образующихся триптических пептидов для всех четырех белковых полос (Табл.1).

Таблица 1 Значения экспериментально полученных и теоретически расчитанных моноизотопных масс пептидов БО природного и мутантного штаммов Приведена нумерация аминокислотных остатков последовательности белка

Наблюдаемые значения МН]+ Расчетные значения [МН]+ для пептида №-№

полоса1 полоса2 полосаЗ полоса4

409.17 409.21 409.27 409.17 409.18 67-69 Met окислен

656.33 656.36 656.48 656.32 656.28 124-128

672.30 672.37 672.44 672.32 672.28 124-128 Met окислен

720.42 720.39 720.50 720.39 720.37 118-123

759.44 759.52 759.59 759.46 759.44 61-66

791.45 791.49 791.57 791.42 791.41 118-123 Cys-пропионамид

1149.62 1149.68 1149.70 1149.61 1149.60 61-69 Met окислен

1287.79 1287.84 1287.92 1287.77 1287.75 112-123

1358.80 1358.88 1358.92 1358.79 1357.64 112-123 Cys-пропионамид

1534.95 1534.80 N-конец ацетил.

1565.75 1565.82 1565.93 1565.74 1565.76 204-218

1602.78 1602.88 1602.85 1602.80 1602.83 45-60

1673.77 1673.89 1673.99 1673.81 1673.83 70-84

1689.75 1689.89 1689.98 1689.78 1689.83 70-84 Met окислен

1780.91 1781.02 1781.12 1780.94 1780.98 219-236

1792.83 1792.95 1793.03 1792.85 1792.89 202-218

2024.92 2024.97 N-конец ацетил.+дезоксигексоза

2040.92 2040.98 N-конец ацетил.+гексоза

2057.91 2058.03 2058.12 2057.93 2058.02 158-176

2073.89 2074.05 2074.08 2073.92 2074.02 158-176 Met окислен

2330.13 2330.24 2330.31 2330.13 2330.18 177-198

2346.14 2346.25 2346.30 2346.14 2346.18 177-198 Met окислен

2442.35 2442.16 2442.19 20-44

2472.20 2472.31 2472.20 20-44

2596.15 2596.23 2596.31 2596.13 2596.14 85-109

2612.11 2612.19 2612.28 2612.09 2612.14 85-109 Met окислен

3410.65 3410.93 3410.74 3410.51 3410.65 129-157

3426.62 3426.72 3426.76 3426.53 3426.65 129-157 Met окислен

Таким образом, анализ масс-спектров гидролизатов подтверждает практически всю аминокислотную последовательность природпого (рис.2) и мутантного белков, причем для белка штамма UK3 вместо пика, соответствующего немодифицированному N-концевому пептиду, наблюдались два пика, соответствующие N-концевому пептиду с присоединенным единственным остатком гексозы либо дезоксигексозы, которые, как и следовало ожидать, исчезали после мягкой тршггаческой обработки вирионов. При этом значения масс первых триптических пептидов обоих штаммов соответствуют ацетилированию их N-концевых остатков. В спектрах также присутствовали пики, соответствующие пептидам с окисленными остатками метионина и с остатками цистеинов, модифицированными акриламидом геля (алкилирование SH-групп цистеинов). Данные модификации происходят за время проведения электрофореза и манипуляций с гелем, и отнести их к происходящим in vivo и функционально значимым нельзя. Таким образом, ацетилирование и гликозилирование первого триптичсского пептида, по-видимому, являются единственными модификациями белка оболочки природного штамма.

Рис. 2 Аминокислотная последовательность природного штамма UK3. Подчеркнуты триптические пептиды, пики которых присутствуют на масс-спектрах и точно совпадают с расчитанными. SAPASTTQPI SSTTSTTTKT AGATPATASG LFTIPDGDgF STARAXVASN AVATMBDLSK IEAXWKDMKV PTDTMAQAAW DLVRHCADVG SSAQTEMIDT GPYSNGISRA RIAAAIKEVC TLRQFCMKYA PWWMWMLTH NSPPAKWQAQ GFKPEHKgAA FDFFNGVTNP AAIMPKEGLI RPPSEAEMNA AQTAAFVKIT KARAQSNDFA SLDAAVTRGR ITGTTTAEAV VTLPPP

Опцепляемые во время проведения ограниченного трипсинолиза Ы-концевые пептиды БО природного штамма и КЗ были выделены обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис.3). Значения масс пептидов в собранных и рехроматографированных фракциях 1 и 2 совпадают с полученными при анализе белковых полос в геле. Углеводный анализ материала хроматографических фракций 1 и 2 показал наличие остатка галактозы во фракции 1 и фукозы во фракции 2.

Рис. 3 Хроматографический профиль БО природного штамма после проведения ограниченного гидролиза трипсином

12 1* 20 24

Таким образом установлено , что модификации БО сосредоточены в их М-концевой области. Совокупность хроматографических данных и вид электофореграмм после проведения ограниченного протеолиза позволяет утвеждать, что ^концевые гриптические пептиды всех молекул БО природного штамма ТЖЗ модифицированы единственным остатком - галактозы либо фукозы.

1.2 Определение точного положения сахарных остатков.

М-концевой триптический пептид белка штамма и КЗ имеет 11 потенциальных сайтов О-гликозилирования - Э А РАЭТТО Р X ЗЭТТЗТТТК.

Для уточнения положения углеводных остатков, на тандемном времяпролетном МА1ЛЭ1-масс-спектрометре были получены спектры фрагментации пептидов из хроматографических фракций 1 и 2 (рис. 4).

|T|T|S |G| I |P|Q |Т |Т |S|А Р |А^5) »11

у5 ** У7У*

i-.L.. ,[.Л.

у10

é lnLii>ilni

Gai |

»11

» в

у9 »6 у7 »« у10

исходные пептиды

Рис. 4 Масс-спектры фрагментации пептидов хроматографических фракций

1 (верхний) и 2 (нижний).

Наиболее интенсивный пик в обоих случаях соответствует разрыву связи сахара с гидроксилом аминокислотного остатка, далее в спектре присутствуют только сигналы С-концевых фрагментов данных пептидов, претерпевших разрыв по пептидной связи (у-ионы), массы которых соответствуют отсутствию на них сахарного остатка, причем начиная с первого N-ацетил-серина. В принципе, это предполагает наличие углеводного остатка непосредственно на первом серине. К сожалению, при MALDl-фрагментации наиболее эффективно идет дегликозилирование, поэтому при отсутствии в спектре пиков N-концевых фрагментов (а,é-ионов) с наличествующими сахарзми, остается место для спекуляций насчет механизмов и многостадийности фрагментации исследуемых гликопептидов.

Структура И-концевого триптйческого пептида белка оболочки ХВК штамма 11КЗ такова, что доминирующим местом протонирования является С-концевой лизин (Ьу819), и после его отщепления резко уменьшается возможность образования положительных ионов оставшейся части. Это и объясняет отсутствие пиков М-концевых ионов в спектрах фрагментов, получаемых в режиме положительных ионов.

Такой результат при'определении сайтов гликозилирования путем получения масс-спектров фрагментации не стал неожиданным и потребовал дополнительных исследований.

При подборе условий проведения ограниченного протеолиза вирусных частиц штамма 1ЖЗ, в ряде экспериментов повышение концентрации белка и трипсина приводило к образованию трех побочных продуктов 1*, 2* и 3* (рис. 5), которые элюировались раньше основных пиков, обозначенных нами ранее 1 и 2 на рис. 3. Их появление связывали с действием растительных претеаз.

0.5

..И4дш 280 шп

**

JJL

12

Рис. 5 Хроматографический профиль БО природного штамма после проведения ограниченного гидролиза трипсином при увеличении концентраций вирусных частиц и фермента.

Все указанные фракции были подвегнуты масс-спектрометрическому анализу. Значения масс, наблюдавшиеся для фракций 1*, 2* и 3*, позволили предположительно соотнести их с фрагментами К-концевого триптического пептида (Табл.2).

Таблица 2. Соотнесение расчетных и экспериментальных значений масс пептидов хроматографических фракций. Д -увеличение массы пептида вследствие гликозилирования.

фракция Молекулярная масса иона (моноизотопная)

измеренная расчетная для немодифицированного пептида A

1 2 2040.9 2024.8 acSAPASTTQPIGSTTSTTTK 1878.9 [МН]+ acSAP ASTTQP1GSTTSTTTK 1878.9 [МН]+ Gal Fue

1* 674.3 acSAPAS 474.2 [МН]+ acSAPAS 496.2 [MNa]+ acSAPAS 512.2 [MK]+ Gal

2* 642.3 658.3 Fue Fue

3* 1423.6 TTQPIGSTTSTTTK 1423.7 [MH]+

Для подтверждения этого соотнесения была получена серия спектров после обработки указанных пептидов карбоксипептидазой У.

На рис. 6 приведен масс-спектр (режим отрицательных ионов) смеси пептидных фракций 3*, 1 и 2 после проведения частичного гидролиза этой смеси карбоксипептидазой У. Наблюдаемые значения масс фрагментов, образующихся при последовательном ферментативном отщеплении С-концевых аминокислотных остатков от гликозилированных триптических пептидов фракций 1 и 2, соответствуют сохранению в продуктах частичного гидролиза ковалентно связанных остатков галактозы или фукозы как минимум до 01уц _ свидетельствуя о локализации углеводных остатков в >}-концевой части. Одновременно, значения масс пиков, соответствующих пептиду фракции 3* подтверждают отсутствие гликозилирования в части ТЪГб-Ьувш пептида ас8АРА5ТТОРЮ8ТТ5ТТТК (подчёркнуто). Эти факты однозначно доказывают, что углеводные остатки локализуются в Г^-концевой части триптического пептида, фрагменте асЯАРАв-, т.е. на одном из двух первых остатков серина.

11011 3 II Т II Т ИЗ II Т II Т II Т II К II

I Т I Т I Т I К I

«¡И ' 13М ' ММ ' 1И» ' «91 ' »'(0 тЬ

Рис б Спектр после гидролиза пептидов фракций 1, 2 и 3* карбоксипептидазой У

На рис. 7 приведены масс-спектры смеси фракций 1* и 2* до и после обработки карбоксипептидазой У, полученные в режиме детекции положительных ионов. Значения масс в верхней части рисунка соответствуют N8+ и К+ аддуктам гликозилиро ванного пептида асБАРАБ. У данного пептида отсутствуют места возможного протонирования, и ионообразующим становится комплекс катиона щелочного металла с сахарным остатком.

Под действием карбоксипегггидазы У от этого гликопептида отщепляется не несущий сахарного остатка С-концевой серии. Так как гликозилирование пептида асБАРАБ

возможно только по Seri или Sers, то подтверждается гипотеза, выдвинутая ранее при анализе спектров фрагментации: углевод присоединяется к ацетилированному N-концевому остатку серина белка оболочки ХВК.

Рис. 7 Спектр пептидов фракций 1* и 2* до (верхний) и после (нижний) гидролиза карбоксипептидазой У.

Итак, экспонированная на поверхность вириона N1- концевая область белка оболочки X вируса картофеля природного штамма ЦКЗ О-гликозилирована и содержит один остаток галактозы или фукозы, присоединенный к первому ацетилированному остатку серина, и эта модификация характерна для всех молекул белка вириона.

Для выявления физико-химических свойств привносимых гликозилированием белка оболочки X вируса картофеля были получены инфракрасные спектры поглощения пленок из суспензий вирусных частиц природного штамма и его вТ-мутанта, как интактных так и подвергнутых удалению >?-концевых пептидов белка оболочки. Только для нативного вируса природного штамма в ИК спектре отмечалась интенсивная полоса поглощения ОН-групп, соответствующая наличию прочно связывающейся с вирусными частицами воды. Таким образом, структура К-конца белка оболочки влияет на свойства вириона: высокое содержание остатков серинов и треонинов вкупе с гликозилированием способствует формированию гидрагной оболочки вокруг вирусных частиц природного штамма. И хотя функциональная значимость гликозилирования БО ХВК еще не вполне ясна, наличие структурированной воды на поверхности вириона может играть важную биологическую роль.

2. Изучение ацилирования цистеивов С-коицевой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34 жирными кислотами.

Одновременно с описаным выше анализом мест гликозилирования БО ХВК нами проводилось исследование структуры и характера ацилирования жирными кислотами С-концевой области легкой цепи гемагглютинина трех подтипов вируса гриппа А: HI - штамм гриппа человека A/Puerto Rico/8/34, НЗ - лабораторный штамм гриппа человека А/Х-31 и Н7 - штамм вируса чумы птиц A/FPV/Weybridge/34. В данном случае, интересовавший нас участок белка находится не на поверхности вирусной частицы, а в составе лшшдной оболочки вириона. Участок содержит три остатка цистеина, способных к образованию тиоэфирной связи.

Общая схема проведения эксперимента, которая формировалась по мере получения новых экспериментальных данных, выглядела следующим образом:

1. С-концевые участки легкой цепи гемагглютинина трех штаммов были выделены и соотнесены с пиками на масс-спектрах. Показано, что цистеиновые остатки этой области могут быть ацилированы двумя типами жирных кислот - пальмитиновой и стеариновой.

2. В процессе выделения пептидов нами было отмечено расщепление тиоэфирной связи под действием SH-восстанавливающих агентов, связанное, очевидно, с переносом ацильной группы на реагент. Таким образом, для выделения целевых пептидов в химически не измененном виде потребовалось более детальное исследование этой реакции и отказ от применения SH-содержащих реагентов на протяжении всей процедуры работы с исследуемым материалом.

3. Соотношение количеств ацилирующих С-концевой участок лепсой цепи гемагглютинина пальмитиновых и стеариновых остатков для трех штаммов оказались существенно различными, были проведены соответствующие расчеты.

4. Три цистеияовых остатка оказались неравноценны с точки зрения ацилирования разными жирными кислотами. Для штамма A/FPV/Weybridge/34, в котором эта асимметрия проявилась наиболее ярко, были определены направления преимущественного стеарилирования и пальмитилирования.

2.1 Выделение и идентификация С-концевых фрагментов

Для получения С-концевых фрагментов гемагглютинина сначала действием тиоловой протеазы бромелаина удалялась вся надмембранная часть белка. Гидролиз проводился в стандартных для бромелаина условиях, в присутствии р-меркаптоэтанола. Пептид, который остается в вирусной мембране после обработки вириона бромелаином, содержит трансмембранный домен и небольшой внутривирионный участок, три

цистеиновых остатка которого согласно литературным данным могут быть пальмитилированы (Fischer et all, 1998, Sakai et all, 2002) (рис. 8).

шг-,

176178 трансмембранный домен-

■....DG^^LESMGIYQILAmTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRIC^OO»

бромелаин триптичеекая | )

активность

176 180 транемембранный домен-

NH2-....KG^VELI^SGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGnMWAÇQRGNIRÇNIÇI-COO» бромелаин триптичеекая j j j

178 трингмамйранный домен—т

3^-....DPVI^SGGyKDVILWFSFGASCFLLLAIAMGLVnCVKMGNMRÇTICW3iW» триптичеекая f J |

Рис. 8. Строение С-концевых участков белка гемагглютинина трех штаммов: A/Puerto Rico/8/34 (а), А/Х-31 (Ь) и A/FPV/Weybridge/34 (с).

После осаждения центрифугированием субвирусных частиц проводилось разделение их компонентов в системе хлороформ/метанол/вода. Когда происходит расслоение на водно-метанольную и органическую фазы, белки, как правило, оказываются на границе раздела. Был проведен масс-спектрометрический анализ всех фаз, но только на масс-спектрах^ органической фазы присутствовала серия пиков, по расчету соответствовавших С-концевым фрагментам гемагглютинина, если принять условие неполного ацилирования трех цистеинов остатками пальмитиновой либо стеариновой кислот (рис. 9, Табл. 3). Для гемагглютинина вируса гриппа типа А возможность модификации цистеиновых остатков стеаратами ранее в литературе не описана.

Ж

С-концевые фрагменты

N-концевые фрагменты

kJL

&

iJtiWfc

3000 4000 6000 я/1

Рис. 9 Масс-спектр органической фазы после разделения по Фолчу обработанных бромелаином вирусных частиц штамма A/Puerto Rico/8/34.

Наряду с серией пиков С-концевых участков гемагглютинина в спектрах органического экстракта присутствовали пики липидов вирусных мембран и М-концевых трансмембранных фрагментов белка нейраминидазы.

Помимо пиков пептидов, образованных действием бромелаина по известному сайту (ЛорЬе1с1е е1 а1., 1981Хсм. рис. 8), в спектре наблюдались пики фрагментов, образованных действием трипсиноподобных протеаз, причем их интенсивность свидетельствует о более эффективном гидролизе гемагглютинина именно по триптическим сайтам. Подобные протеазы присутствуют в среде выращивания вируса - аллантоисе; они участвуют в процессинге гемагглютинина и могут совыделяться с вирусными частицами. Предположительно, мы наблюдаем действие именно этих протеаз, так как даже без проведения гидролиза бромелаином па масс-спектрах органического экстракта целых вирусов иногда регистрируются пики соответствующих пептидов.

Таблица 3 Соотнесение измеренных средних значений масс с С-концевыми пептидами белка гемагглютинина трех штаммов вируса гриппа. Ошибка измерения

не превышает 0.05%, ж.к. - жирная кислота, С- стеарат, П - пальмитат.

A/Puerto Rico/8/34 А/Х-31 A/FPV/Weybridj >?е/34

m/z пептид ж.к. m/z пептид ж. к. m/z пептид ж. к.

4855 178-222 0 4870 180-221 0 4790 178-221 0

5080 176-222 0 5109 180-221 1П 5028 178-221 1П

5095 178-222 1П 5137 180-221 1С 5057 178-221 1С

5123 178-222 1С 5340 176-221 0 5266 178-221 2П

5322 176-222 1П 5348 180-221 2П 5295 178-221 1П1С

5334 178-222 2П 5375 180-221 1II1C 5506 178-221 ЗП

5341 176-222 1С 5578 176-221 1П 5534 178-221 2П1С

5362 178-222 1П1С 5587 180-221 ЗП

5561 176-222 2П 5606 176-221 1С

5573 178-222 ЗП 5615 180-221 2П1С

5589 176-222 1П1С 5640 180-221 1П2С

5602 178-222 2П1С 5816 176-221 2П

5801 176-222 ЗП 5844 176-221 1П1С

5828 176-222 2111С 6054 176-221 311

5855 176-222 1П2С 6083 176-221 2П1С

Выводы о природе пиков на масс-спектре основывались только на совпадении их значений с теоретическими, и требовались дополнительные экспериментальные данные, подтверждающие это утверждение. С этой целью, на тандемном времяпролетном масс-спектрометре были получены спектры фрагментации ионов пептидов из штамма A/Puerto Rico/8/34 массой 4855 и 5573 (рис.10)

а

211

RlCl Q I L SG 21»

¡m/z: 48551 211 — NSCIMi W I F I3i I IAIQ L ISIVi L IL IVI L IS ISlAi VI TlSI Y I IA ILI

187

УиУц уи У"У«упу^»У»у/яуауиу/»Уяу/»у»УяУ* У» У„У* " iiilUnliiti lull mil I ........tliliUnlHilllillMlllll*'!!»!^*!

1000 1500 2000 2(00 9000 3M0 m/Z

m/z: 5573

tie 211

№ c+238 IQILISQNISI C+238 IM I W I F ISI I IAG L ISIVI LIL IVI L ISIS |A[ VIT IS I

Ив U1

У.

У а У в . ."у у I J У21У22У23У* I J J2* [

yJL

1000 1900 2000 2600 3000 3H0 ffl/Z

Рис. 10. Масс-спектры фрагментации ионов С-концевого пептида гемаггпютинина штамма A/Puerto Rico/8/34, не содержащего ни одной модификации остатками жирных кислот (верхний) и содержащего три пальмитата (нижний). Ошибка определения масс фрагментов не превышает 0.1%.

На масс-спектрах обоих пептидов присутствуют серии С-концевых фрагментов данных пептидов, претерпевших разрыв по пептидным связям (у-ионы). Значения масс фрагментов однозначно указывают на принадлежность заявленных пиков иследуемому участку гемагглютинина этого штамма и позволяют подтвердить большую часть его аминокислотной последовательности. Важно, что на спектрах трижды пальмитилированного пептида отсутствуют пики, соответствующие отщеплению пальмитатов, так как это позволяет утверждать, что тиоэфирные связи стабильны в условиях МАЬШ ионизации.

Для подтверждения природы интересующих пиков на масс-спектрах штаммов А/Х-31 и АуТРУЛУеуЬпс^е/34 были получены аналогичные спектры фрагментации этих пептидов, основные пики в которых совпадали с расчитанными исходя из их первичных структур.

Таким образом, можно утверждать, что указанные серии пиков на масс-спектрах действительно соответствуют С-концевым пептидам легкой цепи гемагглютинина всех трёх изучаемых штаммов вируса гриппа.

2.2 Изучение лабильности тиоэфирной связи под действием восстанавливающих агентов.

Большой интерес представила гетерогенность по степени ацилирования пептидов (рис. 11). Она могла отражать природное состояние вирусного белка, но также могла возникнуть в процессе выделения и анализа С-концевых фрагментов гемагтлютинина.

во

и о

ЯЁ gs

II II

0 52 55 ggg

1 II II III

5- S§ Sg

II II II

1-1-174-222—1 176^222 '-1-1*0-221-1 176-221 I-1-174-221—I

-174-221—I

Рис. 11. Характерный вид масс-спектров органического экстракта после обработки вирусных частиц A/Puerto Rico/8/34 (а), А/Х-31 (Ь) и A/FPV/Weybridge/34 (с) бромелаином в присутствии p-меркаптоэтанола (фрагмент). С- стеарат, П- пальмитат.

Так как одной из возможных причин могло быть разрушение тиоэфирных связей под действием восстанавливающего агента, мы решили отказаться от присутствия р-меркаптоэтанола при проведении гидролиза бромелаином. По данным электрофореза и электронной микроскопии эффективность гидролиза несколько понизилась, но зато произошли существенные изменения в соотношениях интенсивностей пиков пептидов различной степени ацилирования (рис. 12).

si ВЯ

II II II

1-174-222 ' 176-222

Я5 R!39

II II III

JkJ

-180-421-

w w

RH

III

1761221

u о

52 85 gg

II I! II

I-174-221—I

Рис. 12. Вид масс-спектров органического экстракта после обработки вирусных частиц трех штаммов бромелаином без р-мерксттоэтанола. Сравните с рис. 11.

В этом случае пики наибольшей интенсивности относятся к пептидам, содержащим жирнокислотные остатки на всех трех цистеинах, что свидетельствует о практически полном ацилирований С-концевого фрагмента гемагглютшшна пальмитиновыми и/или стеариновыми кислотами.

Таким образом, первоначально наблюдавшийся разброс в степени ацилирования объяснился условиями обработки вирусных частиц бромелаином в присутствии 50мМ Р-меркаптоэтанола (37°С, 15-20 часов, рН=7.5).

Этот факт заставил обратить внимание на условия и скорости разрушения тиоэфирной связи под действием восстанавливающих агентов и провести ряд дополнительных экспериментов. Были получены серии спектров, демонстрирующие полное отщепление пальмитатов и стеарагтов от исследуемого пептида в присутствии дитиотреита (рис. 13).

Штамм А/РшяЮ Шсо/8/34 Штамм А/Х-31

0123 0123

Рис. 13. Скорости отщепления остатков жирных кислот от С-концевых пептидов гемаггяютинина двух штаммоввируса гриппа в присутствии ЮмМ дитиотреита. Реакция проводилась при 50°С (рН=7.5).

Надо отметить, то» ввиду разной способности у разных пептидов «кристаллизоваться с магрицей, а также образовывать однозаряженные ионы, МА1Ю1-масс-спектрометрия не является количественным методом. В случае одинаковых пептидов, несущих разное количество жирнокислотных остатков, наибольшую ошибку должны вносить именно различия в процессе образования кристаллов с матрицей. Нами были разработаны приемы сокристаллизации в присутствии п-октилглюкопиранозида, позволяющие получать более гомогенные кристаллы и нивелировать указанные различия.

Чтобы проверить, действительно ли эффективность образования газофазных ионов модифицированных и немодифицированных пептидов в этих условиях сопоставима, были получены спектры от смешивания первых и последних точек в экспериментах по деацилированию. Интенсивности пиков трижды ацилированного пептида и пептида, не несущего ни одного жирнокислотного остатка, оказались практически одинаковы, и это дало основание считать, что приведенные на рисунке 13 серии масс-спектров с достаточной точностью отражают количественную сторону реакции отщепления.

Условия разрушения тиоэфирной связи оказались неожиданно мягкими в сопоставлении с данными литературы. Для прояснения этого феномена были проведены сходные эксперименты но удалению различных заместителей (остатков уксусной, янтарной и пальмитиновой кислот) с цистеиновых остатков модельных пептидов (рис.14).

100V.

• palMWACQRC pal

„YGFVFMCL ас

■ YGFVFMCL «не

Рис. 14. Скорости разрушения тиоэфирных связей при добавлении ЮмМ дитиотреита в модельных пептидах. Реакция проводилась при 2СРС (рН=7.5) (Пептиды любезно предоставлены М.Н. Жмаком и Б.В. Васьковским, ИБХРЛН.)

Скорости расщепления тиоэфирных связей под действием дитиотреита в модельных пептидах независимо от модифицирующей группы оказались много выше, а условия еще мягче, чем для С-концевого фрагмента гемагтлютинина. Это говорит о том, что скорости разрушения тиоэфирной связи могут определяться в первую очередь стерическими факторами, то есть доступностью определенной связи для восстановительного агента.

2.3. Определение соотношения количеств остатков пальмитиновых и стеариновых кислот в С-концевой области гемагглютининов разных штаммов вируса гриппа.

На масс-спектрах изучаемых пептидов видно (рис. 11, 12, 13), что присутствующие в белках разных штаммов вируса гриппа два типа жирных кислот представлены в разных пропорциях. Поскольку интенсивности пиков ацилированных и неацшшрованных пептидов в подобранных условиях получения масс-спектров оказались сопоставимы, то, допуская, что интенсивности пиков пальмитилированных и стеарилированных пептидов, в свою очередь, указывают на их относительные количества, были сделаны соответствующие вычисления для гемагглютининов трех штаммов вируса гриппа.

В таблице 4 приведены средние значения распределения интенсивностей пиков ацилированных пептидов, имеющих разный жирнокислотный состав. Суммарную интенсивность группы пиков пептидов одинаковой степени ацилирования полагали равной 100%. Исходя из приведенных интенсивностей соответствующих пиков в группе трижды-апилированных пептидов было расчитано процентное содержание пальмитатов и стеаратов (Рп и Рс), присутствующих в С-концевой области гемагглютининов разных штаммов вируса гриппа А исходно. Вычисления проведены по формулам:

Рп=(1зп'100%+Г2шс-66.6%++1|тс,33.3%У(1зп+12п1с+1ш2с), Рс+Рп=100%.

Таблица 4. Взаимные соотношения пальмитилированных и стеарилированных

С-концевых фрагментов гемаггпютинина трех вирусных штаммов (%).

Штамм Наблюдаемое распределение интенсивностей пиков Процентное содержание а пильных групп

ЗП 2П1С 1П2С ЗС 1П 1С Рп Рс

A/Puerto Rico/8/34 61 34 5 - 82 18 86 14

А/Х-31 34 53 13 - 62 38 74 26

A/FPV/Weybridge/34 15 74 11 - 5 95 68 32

Количественные измерения проводились на основании большого количества

спектров пептидов, полученных из вирусов, неоднократно выращенных в куриных

эмбрионах по стандартной методике, с последующим гидролизом бромелаином, который

для каждой партии вирусных частиц проводился несколько раз:

Штамм Количество Обработка Количество Ошибка

образцов вируса бромелаином масс-спектров определения

A/Puerto Rico/8/34 4 9 14 <2%

А/Х-31 9 19 25 <1%

A/FPV/Weybridge/34 1 2 6 <5%

Разброс значений взаимных интенсивностей для одного образца в разных спектрах мог достигать 10%, однако среднеквадратичное отклонение приведенных в таблице 4 величин не превышает указанных выше величин.

2.4 Изучение направленности ацилнрования трех цистеиновых остатков С-концевой области гемагглютинина разными жирными кислотами.

Выше были рассчитаны относительные количества присоединенных к С-концевому фрагменту гемагглютинина трех вирусных штаммов остатков пальмитиновой и стеариновых кислот. Однако величина процентного содержания определенных жирных кислот не содержит информации об их распределении среди пула пептидов. Так, одно и то же значение процентного содержания может соответствовать и случаю статистически равномерного распределения двух разных жирных кислот среди всех белковых молекул всех выделенных вирусных частиц данного штамма и случаю существования двух отдельных семейств белков (или вирусных частиц): только трижды пальмитилированных либо только трижды стеарилированных. Масс-спектрометрия позволяет наблюдать именно распределение модифицирующих групп среди пептидов. Представленное в таблице 4 распределение интенсивностей пиков отражает представленность трипальмитатов, дипальмитатов-моностеаратов и монопальмитатов-дистеаратов среди всего пула трижды ацилированных пептидов.

В случае статистически равномерного ацилирования разными жирными кислотами трех цистеиновых остатков любого пептида определенного вирусного штамма, для трижды ацилированных пептидов должно наблюдаться следующее распределение интенсивностей пиков: Р„3: ЗРп2Рс : ЗРпРс2 : Рс3, значения Рп и Рс взяш из таблицы 4.

Однако, сравнивая экспериментально полученные распределения интенсивностей с теоретическими, можно заметить отклонение наблюдаемого в эксперименте распределения в сторону присутствия на каждом пептиде одного остатка стеариновой и двух остатков пальмитиновой кислоты (рис. 15).

нт

40%

агеь

Рис. 15. Теоретические (белые столбики) и экспериментальные (черные столбики) распределения интенсивностей пиков трижды-ацилированных С-концевых пептидов геамгглютинина штаммов A/Puerto Rico/8/34 (а), А/Х-31 (Ь) и A/FPV/Weybridge/34 (с).

Эта тенденция проявляется в различной степени для пептидов разных штаммов вируса - чем больше относительное количество остатков стеарата, тем заметнее отклонение.

Это наводит на мысль о существовании одного цистеинового остатка, который легче модифицируется стеаратами, чем остальные. Разница между штаммами, в таком случае, должна заключаться в способности данного остатка цистеина модифицироваться одной из двух жирных кислот.

О существовании места приоритетного стеарилирования говорит и тот факт, что вычисление процентного содержания стеариновой кислоты исходя из интенсивностей пиков для моноацилированных пептидов, образующихся в процессе обработки вирусных частиц в присутствии Р-меркаптоэтанола, в случае всех трех штаммов приводит к завышенному значению этой величины.

Наиболее ярко эта асимметрия выражена в гемагтлютинине штамма А/РР\7№еуЬп<%е/34. При обработке вирусных частиц бромелаином в присутствии Р-меркаптоэтанола от С-концевого фрагмента гемагглютинина, находящегося в составе субвирусной частицы, наиболее эффективно идет отщепление двух пальмитатов (рис. 12с).

Если скорость удаления жирных кислот зависит от доступности определенных тиоэфирных связей для восстанавливающего агента, то затрудненное отщепление стеаратов от С-концевых пептидов гемагглютинина этого штамма, находящихся в составе субвирусной частицы, могло бы помочь в определении места ковалентного присоединения этого жирнокислотного остатка.

Для установления сайта приорететного стеарилирования (наименее доступного восстанавливающему агенту остатка цистеина) был проведен гидролиз трипсином пептидов органического экстракта вирусного штамма А/РРУ/№еуЬпс^е/34 после обработки вирусных частиц бромелаином в присутствии Р-меркаптоэтанола (рис.16).

Рис. 16. Масс-спектры С-концевого фрагмента гемагглютинина после обработки вирусных частиц бромелаином с добавлением Р-меркаптоэтанола до (а) и после (б) трипсинолиза.

В результате гидролиза трипсином от исходного пептида отщепляется С-концевой пентапептид, содержащий два цистеина. Тот факт, что в оставшемся фрагменте содержание стеариновой кислоты такое же, что и в исходном, свидетельствует о преобладающей локализации стеаратов на цистеине именно этого фрагмента (Сувгм).

Таким образом для гемагглкггинина вируса чумы птиц удалось показать преимущественное направление ацютирования разными высшими жирными кислотами его С-концевого фрагмента:

т|'""гин

178 209 4 221

m2-LSGGYK3)VILWFSFGASCFLLLAIAMGLVngVKNGNMRCTICl-CX)OH

В двух других штаммах содержание стеаратов ниже и картина распределения жирных кислот гораздо менее контрастна. Это не позволило получить экспериментальное подтверждение аналогичной структуры ацилирования. Однако, наблюдавшиеся общие закономерности позволяют предположить схожесть характера ацилирования для всех трех штаммов.

Итак, по крайней мере для одного штамма, показана неравноценность трех консервативных цистенновых остатков внутривирионного участка гемагтлютипина с точки зрения ацилирования разными жирными кислотами. В то время как два С-концевых цистенновых остатка пальмитилированы, приближенный к трансмембранному домену белка цистеин может быть модифицирован стеаратами. Тип жирнокислотного остатка на указанном цистеине зависит от штамма вируса. В вирусном штамме A/Puerto Rico/8/34 данный цистеин гемагглютинина в основном пальмитирован, в штамме A/FPV/Weybridge/34 - стеарирован.

Это может свидетельствовать и о функциональной неравнозначности ацилирования этих цистеинов - пальмитаты, модифицирующие два С-концевых цистенновых остатка могут в большей степени участвовать в дестабилизации мембран на последних этапах слияния с инфицируемой клеткой. В тоже время остаток жирной кислоты, располагающийся на цистеине, приближенном к трансмембранному участку белка, может бьпъ более значим для правильного заякоревания тримера белка в мембране вирусной частицы.

Выводы:

1. Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетилировании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц.

2. Впервые установлен тип и точная локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы -присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3.

3. Выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютшшна вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Продемонстрировано практически полное ацилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривирионного участка белка остатками жирных кислот.

4. Впервые установлена возможность модификации гемагглкггинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.

5. Впервые показана неравноценность трех цистеиновых остатков внутривирионного участка гемагглютшшна вируса гриппа А по отношению к ацилированию разными жирными кислотами. Для белка из штамма гриппа A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.

Автор выражает глубокую признательность за обсуждение работы доктору химических наук Ольге Александровне Миргородской (Институт цитологии РАН, г.Санкт-Петербург) и кандидату химических наук Сергею Александровичу Грачеву (Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г.Москва).

Работа поддержана грантами РФФИ № 02-04-48651 и МНТЦ № 2816р

Основные результаты работы изложены в публикапях:

1 Baralova L.A., Fedorova N.V., Dobrov E.N., Lukashina E.V., Kharlanov A.N., Nasonov V.V., Serebryakova M.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Rodionova N.P. N-terminal segment of potato virus X coat protein subunits is glycosylated and mediates formation of a bound water shell on the virion surface. //Eur. J. Biochem. (2004), 271(15), 3136-3145.

2 Серебрякова M.B., Лукашина E.B., Федорова H.B., Грачев С.А., Добров Е.Н., Баратова Л.А. Масс-спектрометрическое определение положения углеводных остатков в белке оболочки X вируса картофеля, // Масс- спектрометрия (2004), 1(3), 191-198.

3 Серебрякова М.В., Лукашина Е.В., Баратова Л.А. Определение строения N-концевого участка гликозилированного белка оболочки X вируса картофеля при помощи MALDI масс-спектрометрии. // Тезисы докладов 2 международного семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 4-7 октября 2004, с.247.

4 Арбатский Н.П., Лихошерстов Л.М., Серебрякова М.В., Брусов О.С., Шибаев В.Н., Деревицкая В.А., Кочетков Н.К. Полный гидролиз 1ликопротеинов в присутствии боргидрида лития Выделение и анализ О-гликозилированных гликопептидов с восстановленными С-концами. // Биоорганическая химия (2000), 26(1), 51-60.

5 Кордюкова Л.В., Ксенофонтов А.Л., Федорова Н.В., Серебрякова М.В., Овчинникова Т.В., Баратова Л.А. Выделение и структурные исследования С-концевого фрагмента гемагглютинина вируса гриппа А. // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, Москва, 17-19 ноября 2003, с.28.

6 Kordyukova L.V., Ksenofontov A.L., Serebryakova M.V., Ovchinnikova T.V., Fedorova N.V., Ivanova V.T., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin C-terminal anchoring peptide: identification and mass spectrometric study. // Protein Pept T^ett. (2004), 11, 385-391.

7 Kordyukova L.V., Ksenofontov A.L., Serebryakova M.V., Ovchinnikova T.V., Fedorova N.V., Ivanova V.T., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin. Influenza A hemagglutinin C-terminal anchoring peptide. MS identification and approach to structural study. // J. Peptide Sci. (2004), 10, 165; /3,d International and 28ft European Peptide Symposium, September 5-10,2004, Prague, Czech Republic, PI 74/.

8 Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Ovchinnikova T.V., Ivanova V.T., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin. Influenza A hemagglutinin C-terminal anchoring peptide. MS identification and approach to structural study. Proc. 3rd IPS and 28th EPS Prague, Czech Rep., M.Flegel, M.Fridkin, C.Gilon, J.Slaninova (Eds.) Kenes International, Tel-Aviv, Israel, 2005, p.435-436.

9 Кордюкова Л.В., Серебрякова M.B., Овчинникова T.B., Радюхип В.А. //Протеомные исследования заякоренного в мембране С-концевого участка гемагглютинина вируса гриппа.// Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова Москва, 4-7 октября 2004 г., с.46-47. ,

10 Радюхин В.А., Серебрякова М.В., Ксенофонтов А.Л. Выделение и анализ фрагмента гемагглютинина вируса гриппа, содержащего трансмембранный домен, ферментативными и масс-спектрометрическими методами. // П Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. СПб., 25-27 Мая 2005 г., с. 104.

11 Serebryakova M.V., Kordyukova L.V., Vaskovsky B.V., Baratova L.A. Thioester Bond Liability: Study on Natural Influenza and Model Acylpeptides. // Biopolymers (2005), 80(4), p.545-546; /19th American Peptide Symposium, San Diego, USA, June 18-23 2005, Р141/.

Принято к исполнению 13/09/2005 Исполнено 14/09/2005

Заказ №1034 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoteferat.ru

*16669

РНБ Русский фонд

2006-4 13270

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.9

2.1 Использование масс-спектрометрии при изучении белков.

2.2 Основы MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов.

2.2.1 MALDI - получение газофазных ионов биополимеров.

2.2.2 Фрагментация пептидов, индуцированная MALDI.

2.2.3 Изучение природных модификаций белков.

2.2.4 Времяпролетная система разделения ионов и их детекция.

2.2.5 Разрешение и точность MALDI-времяпролетных масс-спектрометров.

2.2.6 Получение масс-спектров фрагментации.

2.3 Белок оболочки X вируса картофеля.

2.3.1 Строение белка оболочки X вируса картофеля.

2.3.2 Возможные модификации белка оболочки X вируса картофеля.

2.4 Гемагглютинин вируса гриппа типа А.

2.4.1 Строение вирусных частиц гриппа типа А.

2.4.2 Строение гемагглютинина и его участие в слияниис клеткой хозяина.

2.4.3 Ацилирование С-концевого участка гемагглютинина жирными кислотами и возможная роль этой модификации белка.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.41

Препараты X вируса картофеля.

Препараты вируса гриппа типа А.

Модельные пептиды.

Масс-спектрометрия.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.48

4.1 Масс-спектрометрическое определение положения углеводных остатков в белке оболочки Х-вируса картофеля, штамм UK3, и его мутанта.

4.1.1 Определение возможных модификаций белка оболочки.

4.1.2 Определение точного положения сахарных остатков.

4.2 Изучение ацилирования цистеинов С-концевой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34 жирными кислотами.

4.2.1 Выделение и идентификация С-концевых фрагментов.

4.2.2 Изучение лабильности тиоэфирной связи под действием восстанавливающих агентов.

4.2.3 Определение соотношения количеств пальмитиновых и стеариновых остатков в С-концевой области гемагглютининов разных штаммов.

4.2.4 Изучение направленности ацилирования трех цистеиновых остатков С-концевой области гемагглютинина разными жирными кислотами.

5. ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы.

Модификация белков в биологических системах приводит к изменению их физико-химических свойств, конформации, стабильности, биологической активности. Такие посттрансляционные модификации, как гликозилирование, фосфорилирование, присоединение остатков жирных кислот являются не только наиболее распостраненными, но и функционально важными для обретения белковой молекулой новых свойств, влияющих на их биологическую функцию.

В последние десятилетия были достигнуты впечатляющие успехи в разработке физико-химических подходов к выявлению посттрансляционных модификаций белков, среди которых наиболее важное место заняли методы масс-спектрометрического анализа. С появлением способов получать ионы белков и пептидов, не разрушая их, и измерять их точные массы, появилась возможность судить об их модификациях по расхождению значений расчитанных и измеренных масс. Одним из таких способов ионизации является MALDI - лазерная десорбция/ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы.

При исследовании структуры белка обычно прибегают к получению масс-спектрометрической пептидной карты - определению набора значений масс пептидов после проведения высокоспецифического гидролиза белка - химического или ферментативного («MS-peptide fingerprint»). Помимо получения значений масс целых молекул в сложных смесях, масс-спектрометрия предоставляет и возможность получения спектров фрагментации отдельных пептидов, происходящей непосредственно в масс-спектрометре. Как MS-пептидный фингерпринт характеристичен для данной молекулы белка, так и спектр фрагментации характеристичен для пептида. Получение пептидных карт белка и/или спектров фрагментации отдельных пептидов позволяет подтвердить первичную структуру, выявить посттрансляционные модификации, включая природу заместителей и места их ковалентного связывания.

В ряде случаев, при получении спектров фрагментации оказывается, что энергия связи модифицирующей группы с пептидом низка, поэтому её разрушение происходит наиболее интенсивно и приводит к потере информации об исходной локализации данной группы. Так, например, при определении точек гликозилирования неустойчивость гликозидных связей в условиях ионизации ведет к первоочередному отщеплению сахара от исследуемого пептида. Поэтому для правильной интерпретации масс-спектров необходимо правильно оценивать устойчивость ковалентной связи модифицирующей группы с пептидом и в случае её низкой устойчивости искать комплементарные подходы к установлению точки модификации.

Вследствие разной способности у разных пептидов сокристаллизоваться с матрицей (при использовании метода MALDI), а также образовывать газофазные ионы, масс-спектрометрию нельзя отнести к количественным методам физико-химического анализа. Поэтому, при изучении степени модифицированное™ белка требуется либо применение специальных методов пробоподготовки, либо параллельное использование других методов (хроматография, электрофорез etc.).

В данной работе при помощи MALDI-времяпролетной-масс-спектрометрии (MALDI-TOF) исследованы два типа природных модификаций - О-гликозилирование остатков серина и треонина и ацилирование жирными кислотами SH-групп цистеиновых остатков природных белков.

Первая часть работы направлена на определение модификаций белка оболочки X вируса картофеля - представителя группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Роль белка оболочки не ограничивается формированием защитного белкового чехла. Он также вовлечен в транспорт вирусной РНК по растению, влияет на возникновение резистентности растения картофеля к заражению, значим для регуляции трансляции на разных стадиях инфекции. Факт О-гликозилирования белка оболочки был установлен в 1994 году, но до последнего времени не были изучены ни тип Сахаров, ни их локализация, ни степень гликозилирования белка, ни их возможная значимость. Это делает углубленный анализ этой модификации белка оболочки безусловно актуальным.

Во второй части работы изучались модификации С-концевого участка малой субъединицы гемагглютинина вируса гриппа А. Гемагглютинин - гликозилированный поверхностный белок вируса. Он представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из двух цепей, связанных между собой дисульфидным мостиком. Легкая цепь заякорена в мембрану своим С-концевым участком. Основные исследования структурных и функциональных особенностей гемагглютинина связаны с изучением его эктодоменов. Для ряда штаммов получены рентгеноструктурные данные, проливающие свет на пространственную организацию экспонированной на поверхность части белка. В то же время, практически отсутствуют данные о структуре заякоренного в оболочке вириона С-концевого гидрофобного пептида. На сегодня опубликована единственная работа на искусственно синтезированном пептиде, встроенном в липосому, направленная на выяснение его свойств и структуры. Фрагмент гемагглютинина, остающийся в вирусной мембране после обработки вириона протеазой бромелаином, содержит трансмембранный домен и небольшой внутривирионный участок. В нём присутствуют три консервативных цистеиновых остатка, которые способны к ацилированию высшими жирными кислотами. Исследование типа и степени ацилирования представляется очень важным, так как остатки жирных кислот могут служить для ориентации трансмембранных доменов в липидном бислое, способствовать тримеризации гемагглютинина, участвовать в образовании пор слияния в процессе инфицирования клетки-хозяина или во взаимодействии гемагглютинина с внутренными вирусными белками.

Цель и задачи исследования.

Работа посвящена отработке методов применения MALDI-TOF для изучения двух из распостраненных модификаций природных белков - О-гликозилирования и ацилирования цистеиновых остатков высшими жирными кислотами. С этой целью были сформулированны следующие задачи:

1 исследовать возможные постгрансляционные модификации белка оболочки природного штамма UK3 Х-вируса картофеля, являющегося типичным представителем группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Для этого: получить и проанализировать пептидные карты белка, определить степень гликозилирования и тип присоединенных сахарных остатков, разработать подходы к точному установлению сайтов гликозилирования.

2 исследовать структуру и характер ацилирования высшими жирными кислотами цистеинов С-концевого фрагмента лёгкой цепи гемагглютинина трёх штаммов вируса гриппа A: A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для этого: выделить и идентифицировать С-концевые пептиды, определить степень ацилирования трех консервативных цистеиновых остатков этой области белка и тип присоединяемых жирнокислотных остатков, изучить стабильность тиоэфирной связи в условиях получения масс-спектров и в присутствии восстанавливающих агентов в процессе выделения белка.

Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:

1 Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK.3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Для них:

- установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетилировании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц;

- впервые установлен тип и локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы -присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3;

2 Выделены и методами масс-спектрометрии охарактеризованы С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для них:

- впервые продемонстрировано практически полное ацилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривирионного участка белка остатками жирных кислот;

- впервые установлена возможность модификации гемагглютинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.

- впервые показана неравноценность трех указанных цистеиновых остатков по отношению к ацилированию разными жирными кислотами. Для штамма A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.

Практическая значимость работы заключается в разработке методологических подходов к изучению неустойчивых при проведении масс-спектрометрического анализа модификаций белков, в разработке способов выделения и MS-детекции трансмембранных пептидов. В ходе исследования также показана достаточная для получения масс-спектров фрагментации устойчивость тиоэфирной связи и исследована лабильность этой связи под действием известных восстанавливающих агентов.

Публикации и апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 11 работах, в том числе в 5 статьях в отечественных и зарубежных научных журналах, и в тезисах 6 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.

Результаты работы доложены на З"6* международном пептидном симпозиуме (Прага, Чехия, сентябрь 2004), на 2"°м международном семинаре-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, октябрь 2004), на VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, октябрь 2004), на I и II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003; Санкт-Петербург, май 2005) и на 19"°м Американском пептидном симпозиуме (Сан-Диего, США, июнь 2005).

Вклад автора в разработку проблемы.

Автором проведены все исследования данных вирусных белков в части применения MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, в том числе получения и интерпретации спектров фрагментации. Предложены оригинальные схемы проведения экспериментов для получения масс-спектрометрических результатов. Установлена точка гликозилирования белка оболочки Х-вируса картофеля. Идентифицированы С-концевые фрагменты легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А трех штаммов и определена степень их ацилирования жирными кислотами, получены соотношения пальмитатов и стеаратов, установлена направленность ацилирования трех цистеиновых остатков внутривирионного участка гамагглютинина разными жирнокислотными остатками. Изучены условия разрушения тиоэфирной связи в присутствии восстанавливающих агентов.

Работа выполнена в отделе хроматографии Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, в лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья РАМН и в отделе протеомных исследований Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 37 рисунков и 2 приложения. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы, содержащего 121 ссылку.

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетилировании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц.

2. Впервые установлен тип и точная локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы — присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3.

3. Выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Продемонстрировано практически полное ацилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривирионного участка белка остатками жирных кислот.

4. Впервые установлена возможность модификации гемагглютинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.

5. Впервые показана неравноценность трех цистеиновых остатков внутривирионного участка гемагглютинина вируса гриппа А по отношению к ацилированию разными жирными кислотами. Для белка из штамма гриппа A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.

1. Yamashita М., Fenn J. В. Electrospray ion source: Another variation of the free-jet theme. // J. Phys. Chem.1984, v.88, p.4451-4459

2. Александров M.JI., Галль Л.Н., Краснов H.B., Николаев В.И., Павленко В.А., Шкуров В.А. //Докл. АН СССР 1984, т.277, с.379-383

3. Fenn J.B., Mann М„ Meng С.К., Wong S.F., Whitehouse C.M. Electrospray ionization-principles and practice. // Mass Spectrom. Rev. 1990, v.9 (1), p.37-70

4. Karas M., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. // Anal Chem. 1988, v.60 (20), p.2299-2301

5. Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S„ Yoshida Y, Yoshida Т. II Rapid Commun. Mass. Spectrom. 1988, v.2, p.151

6. Mann M., Hojrup P., Roepstorrf P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. // Biol. Mass Spectrom. 1993, v.22(6), p.338-345

7. Tang C., Zhang W., Fenyo D., Chait В. T. Assessing the Performance of Different Protein Identification Algorithms. // ProteoMetrics, LLC, New York, 48-th ASMS Conference, June 11 15,2000, Long Beach, California

8. Jensen O.N., Wilm M., Shevchenko A, Mann M. Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels. // Methods Mol. Biol. 1999, v.112, p.513-530

9. Patterson S. D., Thomas D., Bradshow R. A. Application of combined mass spectrometry and partial amino acid sequence to the identification of gel-separated proteins. // Elecrophoresis 1996, v.17 (5), p.877-891

10. Jates IIIJ.R., EngJ.K., McCormack A.L., Schieltz D.M. Method to correlate tandem mass spectra of modified peptides to amino acid sequences in the protein database. // Anal. Chem. 1995, v.67 (8), p.1426-1436

11. McCormack A.L., Schieltz D.M., Goode В., Yang S„ Barnes G„ Drubin D„ Yates J. R. Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level. II Anal. Chem. 1997, v.69 (4), p.467-476

12. Siuzdak G. Mass Spectrometry For Biotechnology. // Academic press Inc., San Diego, CA, 1996, p. 161

13. Snyder A. P. Interpreting Protein Mass Specra: A Comprehensive Resource Global View Publishing. // Pittsburg, PA, 2000, p.48

14. Арчаков А. К, Говорун B.M. Протеомные технологии в современной биомедицине\ской науке. // Биохимия 2000, т.67 (10), с. 1109-1123

15. Hillenkamp F., Karas М., Beavis R.C., Chait В.Т. Matrix-assisted laser desorption / ionization mass-spectrometry of biopolymers. // Anal. Chem. 1991, v.63 (24), p. 1193A-1203A

16. Kussmann M„ Roepstorff P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS // Methods Mol Biol. 2000, v.146, p.405-24

17. Staudenmann W., Halt P.D., Hoving S., Lehmann A., Kertesz M., James P. Sample Preparation. Sample handling for proteome analysis. I I Electrophoresis 2005, v. 19(6), p.901-908

18. Kruger R., Karas M. Formation and fate of ion pairs during MALDI analysis: anion adduct generation as an indicative tool to determine ionization processes. // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2002, v.13 (10), p.1218-1226

19. Sechi S. A method to identify and simultaneously determine the relative quantities of proteins isolated by gel electrophoresis. // Rapid Commun Mass Spectrom. 2002, v. 16(15), p.1416-1424

20. Parker K.C., Patterson D., Williamson В., Marchese J., Graber A., He F„ Jacobson A., Juhasz P., Martin S. Depth of proteome issues: a yeast isotope-coded affinity tag reagent study. // Mol Cell Proteomics. 2004, v.3 (7), p.625-659

21. Roepstorff P. MALDI-TOF mass spectrometry in protein chemistry. // EXS 2000, v.88, p.81-97

22. Karas M., Gluckmann M„ Schafer J. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors. // J.Mass.Spectrom. 2000, v.35, p.1-12

23. Knochenmuss R, Stortelder A, Breuker K, Zenobi R. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization. // J Mass Spectrom. 2000, v.35 (11), p.1237-1245

24. Zhigilei L. V., Leveugle Е. Computer simulations of laser ablation of molecularsubstrats. // Chem.Rev. 2003, v. 103, p.321-347

25. Zhang J, Zenobi R. Matrix-dependent cationization in MALDI mass spectrometry. // J Mass Spectrom. 2004, v.39 (7), p.808-816

26. Бродский А.И. Физическая химия. // Москва, Госхимиздат, 1948, т.2, с.942

27. Papayannopoulos I.A. The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides. // Mass Spectrom. Rev. 1995, v. 14 (1), p.49-73

28. Brown R.S., Lennon J.J. Sequence-specific fragmentation of matrix-assisted Iaser-desorbed protein/peptide ions. // Anal Chem. 1995, v.67 (21), p.3990-3999

29. Andersen J.S., Mann M. Functional genomics by mass spectrometry. // FEBS Lett. 2000, v.480 (1), p.25-31

30. Lottspeich F. Proteome Analysis: A Pathway to the Functional Analysis of Proteins. // Angew Chem Int Ed Engl. 1999, v.38 (17), p.2476-2492

31. Person M.D., Monks T.J., Lau S.S. An integrated approach to identifying chemically induced posttranslational modifications using comparative MALDI-MS and targeted HPLC-ESI-MS/MS. // Chem. Res. Toxicol. 2003, v.16 (5), p.598-608

32. Герасимов Я.И. Курс физической химии. // Москва, Госхимиздат, 1968, с. 69

33. Kinumi Т., Niwa H„ Matsumoto H. Phosphopeptide sequencing by in-source decay spectrum in delayed extraction matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. // Anal Biochem. 2000, v.277(2), p. 177-186

34. Talbo G.H., Suckau D„ Malkoski M„ Reynolds E.C. MALDI-PSD-MS analysis of the phosphorylation sites of caseinomacropeptide. // Peptides 2001, v.22 (7), p.l093-1098

35. Hanisch F.G., Jovanovic M., Peter-Katalinic J. Glycoprotein identification and localization of O-glycosylation sites by mass spectrometric analysis of deglycosylated/alkylaminylated peptide fragments. // Anal Biochem.2001, v.290 (1), p.47- 59

36. Wells L., Vosseller K„ Cole R.N., Cronshaw J.M., Matunis M.J., Hart G. W. Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. // Mol Cell Proteomics. 2002, v.l (10), p.791-804

37. Mirgorodskaya E., Hassan H., Clausen H, Roepstorff P. Mass spectrometric determination of O-glycosylation sites using beta-elimination and partial acid hydrolysis. // Anal Chem. 2001, v.73 (6), p. 1263-1269

38. Kuster В., Krogh T.N., Mortz £., Harvey D.J. Glycosylation analysis of gel-separated proteins. // Proteomics 2001, v.l, p.350-361

39. Liang X., Lu Y., Neubert T.A., Resh M.D. Mass spectrometric analysis of GAP-43/neuromodulin reveals the presence of a variety of fatty acylated species. // J Biol Chem. 2002, v.277 (36), p.33032-33040

40. Bizzozero O.A., Malkoski S.P., Mobarak C., Bixler H.A., Evans J.E. Mass-spectrometric analysis of myelin proteolipids reveals new features of this family of palmitoylated membrane proteins. // J Neurochem. 2002, v.81(3), p.636-645

41. Jagannadham M. V., Nagaraj R. Detection of peptides covalently modified with multiple fatty acids by MALDI-TOF mass spectrometry. // J Pept Res. 2005, v.66 (2), p.94-100 (2

42. Brown R.S., Gil/rich N.L. Ion detection limitations to mass resolution in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. // Rapid Commun Mass Spectrom. 1992, v.6 (11), p.690-696

43. Doroshenko V.M., Cotter R.J. Ideal velocity focusing in a reflectron time-of-flight mass spectrometer. //J Am Soc Mass Spectrom. 1999, v. 10(10), p.992-999

44. Guilhaus M. Principles and instrumentation in time-of-flight mass-spectrometry. Physical and instrumental concepts. // J.Mass.Spectrom. 1995, v.30, p. 1519-1532

45. Brown R.S., Lennon J.J. Mass resolution improvement by incorporation of pulsed ion extraction in a matrix-assisted laser desorption/ionization linear time-of-flight mass spectrometer. // Anal Chem. 1995, v.67(13), p.1998-2003

46. Gabelica V, Schulz E, Karas M. Internal energy build-up in matrix-assisted laser desorption/ionization. // J Mass Spectrom. 2004, v.39 (6), p.579-593

47. Kocher Т., Engstrom A., Zubarev R.A. Fragmentation of peptides in MALDI in-source decay mediated by hydrogen radicals. // Anal.Chem. 2005, v.7, p. 172-177

48. Chaurand P., Luetzenkirchen F„ Spengler B. Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectrometry. // J Am Soc Mass Spectrom. 1999, v. 10 (2), p.91 -103

49. Spengler B. Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. // J. Mass Spectrom. 1997, v.32 (10), p.1019-1036

50. Cordero M.M., Cornish T.J., Cotter R.J., Lys LA. Sequencing peptides without scanning the reflectron: post-source decay with a curved-field reflectron time-of-flight mass spectrometer. // Rapid Commun Mass Spectrom. 1995, v.9 (14), p.1356-1361

51. Tollin P., Wilson H.R. Particle structure. // The Plant Viruses: The Filamentous Plant Viruses (Ed. R.C.Milne), Plenum Press, New-York, 1988, v.4, p.51-83

52. Koenig R„ Tremaine J.H., Shepard J.F. In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini. // J. Gen. Virol. 1978, v.38, p.329-337

53. Goulden M.G., Kohm B.A., Santa Cruz S., Kavanagh T.A., Baulcombe D.C. A feature of the coat protein of potato virus X affects both induced virus resistance in potato and viral fitness. // Virology 1993, v.197, p.293-302

54. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G, Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. // J. Mol. Biol. 2003, v.333, p.565-572

55. Kavanagh Т., Goulden M., Santa Cruz S., Chapman S., Barker L, Baulcombe D. Molecular analysis of a resistance-breaking strain of potato virus X. // Virology 1992, v. 189, p.609-617

56. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Poljakov V.Y. The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. // Virology 2000, v.271 (2), p.259-263

57. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova О. V., Kozlovsky S. V., Novikov V.K, Arkhipenko M.V. Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. // Virology 2001, v.286 (2), p.466-474 (2001)

58. Miki Т., Knight C.A. The protein subunit of potato virus X. // Virology 1968, v.36, p. 168173

59. Tozzini A.C., Ek В., Palva E.T., Hopp HE. Potato virus X coat protein: a glycoprotein. // Virology 1994, v.202, p.651-658

60. Козловский C.B., Карпова O.B., Архипенко M.B., Заякина О.В., Родионова Н.П., Атабеков ИГ. Влияние N-концевого фрагмента белка оболочки X вируса картофеля на структуру вирусных частиц. // Докл. АН 2003, т.391, с.117-119

61. Garoff Н, Hewson R., Opstelten D.J. Virus maturation by budding. // Mol. Biol. Rev. 1998, v.62, p.l 171-1190

62. Cox N.J., Bender C.A. The molecular epidemiology of influenza viruses. // Semin. Virol. 1995, v.6, p.359-370

63. Nobusawa E., Aoyama Т., Kato H„ Suzuki Y., Tateno Y., Nakajima K. Comparison of amino acid sequences and receptor binding properties among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses. // Virilogy 1991, v. 182, p.475-485

64. Lamb R.A. Genes and proteins of the influenza viruses. // In: The Influenza viruses (R.M. Krug, Ed.), Plenum Press, New York/London, 1989, p. 1-87

65. Stegman Т., Helenius A. II In: Viral Fusion Mechanisms, ed. Bentz J. (CRC, Boca Raton, FL), 1993, p.89-111

66. Skehel J. Influenza hemagglutinin structure and antigenicity. // Experientia 1986, v.46, p.89

67. Zebedee S.L., Lamb R.A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. // J. Virol. 1988, v.62, p.2762-2772

68. Ruigrok R.W., Barge A., Durrer P., Brunner J., Ma K., Whittaker G.R. Membrane interaction of influenza virus Ml protein. II Virology 2000, v.267, p.289-298 (2000)

69. Hernandez L.D., Hoffman L.R., Wolfsberg T.G., White J.M. Virus-cell and cell-cell fusion. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996, v. 12, p.627-661

70. Chernomordik L.V., Kozlov MM. Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes. // Annu.Rev.Biochem. 2003, v.72, p. 175-207

71. White J., Kielian M., Helenius A. Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses. II Q. Rev. Biophys. 1983, v.16, p.151-195

72. Eckert D.M., Kim P.S. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. II Annu. Rev. Biochem. 2001, v.70, p.777-810

73. White J.M., Wilson I.A. Anti-peptide antibodies detect steps in a protein conformational change: low-pH activation of the influenza virus hemagglutinin. // J. Cell Biol. 1987, v. 105, p.2887-2896

74. Tsurudome M., Gluck R., Graf R., Falchetto R„ Schaller U., Brunner J. Lipid interactions of the hemagglutinin HA2 NH2-terminal segment during influenza virus-induced membrane fusion. // J. Biol. Chem. 1992, v.267, p.20225-20232

75. Weber Т., Paesold G., Galli C., Mischler R., Semenza G., Brunner J. Evidence for H(+)-induced insertion of influenza hemagglutinin HA2 N-terminal segment into viral membrane. //J. Biol. Chem. 1994, v.269, p.18353-18358

76. Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. // Annu. Rev. Biochem.2000, v.69, p.531-569

77. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. // Nature 1981, v.289, p.366-373

78. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. // Nature 1994, v.371, p.37-43

79. Chen J., Skehel J.J., Wiley D.C. N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subunit to form an N cap that terminates the triple-stranded coiled coil. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, v.96, p.8967-8972

80. Brand C.M., Skehel J.J. Crystalline antigen from the influenza virus envelope. // Nat. New Biol. 1972, v.238, p.145-147

81. Tamm L.K., Han X. Viral fusion peptides: a tool set to disrupt and connect biological membranes. // Biosci. Rep. 2000, v.20, p.501-518

82. Han X, Bushweller J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Membrane structure and fusion-triggering conformational change of the fusion domain from influenza hemagglutinin. // Nat. Struct. Biol. 2001, v,8, p.715-720

83. Cross K.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Wiley D.C., Steinhauer D.A. Studies on influenza haemagglutinin fusion peptide mutants generated by reverse genetics. // EMBO J. 2001, v.20, p.4432-4442

84. Armstrong R.T., Kushnir A.S., White J.M. The transmembrane domain of influenza hemagglutinin exhibits a stringent length requirement to support the hemifiision to fusion transition. // J. Cell Biol. 2000, v.151, p.425-437

85. Melikyan G.B., Jin H., Lamb R.A., Cohen F.S. The role of the cytoplasmic tail region of influenza virus hemagglutinin in formation and growth of fusion pores. // Virology 1997, v.235, p. 118-128

86. Ohuchi M., Fischer C., Ohuchi R„ Herwig A., Klenk H.-D. Elongation of the cytoplasmic tail interferes with the fusion activity of influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 1998, v.72, p.3554-3559

87. Tatulian S.A., Tamm L.K. Secondary structure, orientation, oligomerization, and lipid interactions of the transmembrane domain of influenza hemagglutinin. // Biochemistry 2000, v.39, p.496-507

88. Zurcher Т., Luo G., Palese P. Mutations at palmitoylation sites of the influenza virus hemagglutinin affect virus formation. // J. Virol. 1994, v.68, p.5748-5754

89. Jin H., Subbarao K., Bagai S„ Leser G.P., Murphy B.R., Lamb R.A. Palmitoylation of the influenza virus hemagglutinin (H3) is not essential for virus assembly or infectivity. // J. Virol. 1996, v.70, p.1406-1414

90. Ujike M„ Nakajima К., Nobusawa E. Influence of additional actlation site(s) on influenza В virus hemagglutinin on syncytium formation. // Microbiol. Immunol. 2005, v.49 (4), p.355-359

91. Schroth-Diez В., Ludwig K„ Baljinnyam В., Kozerski C., Huang Q„ Herrmann A. The role of the transmembrane and of the intraviral domain of glycoproteins in membrane fusion of enveloped viruses. // Biosci. Rep. 2000, v.20, p.571-595

92. Fischer C., Schroth-Diez В., Herrmann A., Garten W., Klenk H.-D. Acylation of the influenza hemagglutinin modulates fusion activity. // Virology 1998, v.248, p.284-294

93. Nairn H.Y., Amarneh В., Kristakis N.T., Roth M.G. Effects of altering palmitoilation sites on biosynthesis and function of the influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 1992, v.66, p.7585-7588

94. Veit M., Reverey H., Schmidt M. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. // Biochem. J. 1996, v.318, p. 163-172

95. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature 1970, v.227, p.680-685

96. Thiede В., Wittmann-Liebold В., Bienert М., Krause Е. MALDI-MS for C-terminal sequence determination of peptides and proteins degraded by carboxypeptidase Y and P. // FEBS Lett. 1995, v.357, p.65-69

97. Zhirnov O.P., Ovcharenko A.V., Bukrinskaya A.G. Myxovirus replication in chicken embryos can be suppressed by aprotinin due to the blockage of viral glycoprotein cleavage. // J Gen Virol. 1985, v.66 (7), p.1633-1638

98. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. // Anal Biochem 1977, v.83, p.346-356

99. Lebaron F.N., Folch J. The effect of pH and salt concentration on aqueous extraction of brain proteins and lipoproteins. // J Neurochem. 1959, v.4 (1), p.1-8

100. Cho Y.-P., Chrispeels M.J. Synthesis and secretion of hydroxyproline-containing proteins in carrots. 9. Serine-Ogalactosyl linkages in glycopeptides from carrot cell-walls. // Phytochemistry 1976, v. 15, p. 165-169

101. Fernandez-Fernandez M., Camafeita E. Bonay P., Mendez E., Albar J.-P., Garcia J.A. The capsid protein of a plant single-stranded RNA virus is modified by O-linked N-acetylglucosamine. // JBC 2002, v.277 (1), p.135-140

102. Liu F., Iqbal K„ Grundke-Iqbal /., Hart G.W., Gong C.X. O-GlcNAcylation regulates phosphorylation of tau: a mechanism involved in Alzheimer's disease. // Proc Natl Acad Sci U S A 2004, v. 101 (29), p. 10804-10809

103. Dopheide T.A., Ward C.W The location of the bromelain cleavage site in a Hong Kong influenza virus Haemagglutinin. // J Gen Virol. 1981, v.52 (2), p.367-370

104. Торчинский Ю.М. Сера в белках. // Москва, Наука, 1977, с. 17-19

105. Philipp Н.С., Schroth В., Veil М, Krumbiegel M, Herrmann A., Schmidt M.F. Assessment of fusogenic properties of influenza virus hemagglutinin deacylated by site-directed mutagenesis and hydroxylamine treatment. // Virology 1995, v.210 (1), p.20-28

106. Bizzozero O.A., Fridal K„ Pastuszyn A. Identification of the palmitoylation site in rat myelin P0 glycoprotein. // J Neurochem. 1994, v.62 (3), p. 1163-71

107. Bijlmakers M.J., Marsh M. The on-off story of protein palmitoylation. // Trends of Cell Biol. 2003, v.13(1), p.32-42

108. Метионин c5h9n101s1 131.19861. Пролин c5h7n101 97.11671. Серии c3h5n102 87.07821. Тирозин c9h9n102 163.17601. Треонин c4h7n102 101.1051

109. Триптофан c11h10n201 186.2132

110. Фенил ал анин c9h9n101 147.1766

111. Цистеин (sh) c3h5n101s1 103.1448

112. Расчет моноизотопной массы однозарядного иона пептида (протонированная форма):1. МН.+=1а.о. + Н20 + Н+

113. Расчет естественного изотопного распределения:

114. Вероятность того, что среди п атомов углерода окажется ровно m атомов |3С, определяется уравнением Бернулли:

115. Pm''c=Cnm.pra.(l-pfm,XPm'>c=lгде C„m =п!/(п-т)!т! сочетание возможных расположений ш атомов ,3С в наборе из п атомов углерода, р=0.011 - частота встречаемости ,3С в природе. Для остальных элементов можно провести аналогичные расчеты.

116. Основной вклад в естественное изотопное распределение пептидов вносит включение в состав 13С и 34S, поэтому интенсивность сигнала k-ого пика на масс-спектре будет определяться суперпозицией указанных распределений:

117. Р|<= 2 (Pml3c* PlMs)> суммирование ведется по всем m и 1: m +21= к

118. С-концевые области геммаглютининов вируса гриппа типа А разных подтипов:1. Н1

119. KLEENTTYKILSIYSTVAASLCLAILIAGGLILGMQNGSCRCMFCI A/Turkey/Ontario/6118/68 H9

120. VKLSSGYKDIILWFSFGESCFVLLAWMGLVFFCLKNGNMRCTICI A/Mink/Sweden/84 Hll

121. KLDSSGNVYKILSIYSCIASSLVLAALIMGFMFWACSNGSCRCTICI A/Duck/England/1/56 RLDSSGNVYKILSIYSCIASSLVLAALIMGFILWACSNGSCRCTICI A/mallard/Netherlands/7/99 H12

122. KLEENSTYKILSIYSSVASSLVLLLMIIGGFIFGCQNGNVRCTFCI A/Duck/Alberta/60/76 H13

123. KLKSEDNVYKVLSIYSCIASSIVLVGLILAFIMWACSNGNCRFNVCI A/black-headed gull/Sweden/5/99 H14

124. VTLTMGYKDIILWISFSMSCFVFVALILGFVLWACQNGNIRCQICI A/Mallard/Astrakhan/263/82 H15

125. VKLSGGYKDVILWFSFGASCVMLLAIAMGLIFMCVKNGNLRCTICI A/duck/Australia/341/83 VKLSSGYKDVILWFSFGASCVMLLAIAMGLIFMCVKNGNLRCTICI A/shearwater/West Australia/2576