Изучение пространственной организации цитохромоксидазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

1 О 3 9' 41

МОСКОВСКИЙ ОРДЕ®. ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ГЕЖШГШ

тш. и.в. ломоносом

Сн:-!ЦгдяиэпропйтпАЙ совет Д CG3.4I.0I На цракг" рухогмен

• КОТЛОМ НАТАЛЬЯ ГЕОИ'йИт

ИЗУЧЕНИЕ ПРХТРА1ЮТВЕНШ2 ОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОХРОМОКСИДДШ

Специальность 02,00.10 - Бнооргаштческзя химия, химия природных а физиологически активных В6ЩОСТВ

А в г о р 6 $ е р о .1

диссертации на соискание ученой степени кандидата химически наук

Москва - - 19:

Рабата иьтолнска па к&фадрв хюяш а гвхнологсн годяих орга-hqsímvíwA Московского ордена Трудового Крг.с.чщгс Заимки Toifr.oit хпмкчеоксй тахнолегня им. Moli.Ломоносова

На/чиуД руководитель - каадвда* химических наук, доцэнт Кулет И.А.

Офдтмчя ьйыл cwncm я ты :

локгс'р хкм'/чйокях наук, npocteocop МЕрэаяякоь A.¡I.

köh-u. ххиячвеялх наук, старший ааучкнй сотрудник Кр*т H.A.

оргоиз'иоя - !/ох$акудметская проблвмяая яауч:зд~ кссовагелюл-ач даосраторкя молекулярной биологии g Зчсоргчнк«?око2 хамки sas, А..Н„Бвлсшрского, МГУ.

:«:;лгл псеартадач ссс-кяго 1991 г. а 15 часов

на сльцзализкрйаашюго совам Д 003,41.01 г.рн ШИХТ

-,w\. •V.Jj.x.owos&cosü, iL? 571, !£ос«эа, пр. Вэркздового, 86.

С л;щсврга;м?й мскно ознакомиться п <52бдиогвко МИТХТ им. У-.З./юЖ'КЭйова,

. Автореферат разослан

п

•г.

Учйикй сзкретарь

'■''С?;1, # 1

" -^221 I.

/

~~-^Лкт/я,льаость то^ламг». Шгэхвэиочсадазг. (г£даррсчитоу;рпм <у-•кислород оксшюроиуктаэа, КФ 1.9.3.1) прес-о^оЗ шй форк-пт в дета оадолателъЕого ф>сфэр1Шгроаанг:я, к&тячкгзру-эдлй уссстааоьтонио ккслсрода, Шгтохрсмогссхлачя состоят ач нескольких оубгадиииц к содзрзкг б сгозк соггазэ четцра пооотети-таские грулкы: 2 тема з я 2 атома мед.». Ф/гацл? тюркентк состоит в передаче чзтарвх аяажтролов, поступающих: по цеап

Ч'зроэ цатезсром £ к мслокулэ кислорода:

4 (цитохром +• 4Н*" + 02 4 (уитохром с3*" 5 + Л^О

Перекос электронов сопряжен с траноиамйранвцм горэяосои. протонов, формирующих моморанпнй. лотектагал - сснознуо увижущу» силу гпэргагнчаских процессов в аэробных организмах.

Цятолрсмоксидаза язллзтся сложным трансмем^рачнш бели он. У эукврлогов фермент расиояагается во внутрэкаеЗ мэ»«бргша и:т-хоцдрий, у прокариотов - в плазматической мэмЗраяо. В згвизмиоо-ги от исота лслбого организма в' эеодвцкокном процзссэ цитохром-» сксядаза юювт различпу» степень сложносте. Так, у прокариотоЕ дитохромохсяцаза постоят ¡»э 2-3 субьадинкч, у дрояоий - гз ?-9 еубгедиаиц. о фермент, Еадвлг.чный иэ различных тканей гляйкоин-талдздс, содержит 12-13 субъздгниц.

Среда субъэдгниц, ьходшда в сэзтая цксхромокпадаан особый интерес "представляет суйъэдякяца II, сиат^зяр/емая в што-хсггдрулх. В зтой суйъвдщгкцэ находятся двз араотмячпс'мге группы: гам ^ э атом меди, а такав участок, сглвтоаник с щгохрочо» Эти факты стзгдатвльствупт о важном жзацч ой в футдоснао.-вуу актлгяость цитохроглоксвдазк в целом.

Данная работа явллзтся частью пганодап исследована!: по госбюджетной тэт 10-865 "Слнтаз я ввдвдэнзгэ громоирохвкдои, их фрагмолтсв, модвлЕрутгадас саогзиы фотосинтеза, транспорта эльк:?-. ронов, скнгэз цаптадов, порфкриасв к создание на их оснозо биологически активных препаратов" (Л государственной регистрации О- Ш' 001' 331.) и проводилась в соогветегвяж с пау'-пю-тзжпзской программой. ГШ СССР 074.05, . раздел 1Ш1 (Яостачоаябнае ГХНТ СССР, АИ СССР от 3.02.8? * 26/13}.

Шльх: таботи являет с 2 иэучэнкэ пространственной организации второй суАгедикида цвдохрошзхсйдаэы методом тритиэвой пла-китрафст,

Научная новизна тбо?н. Цреддозен способ получения нндивп-дуадьиоЗ второй субьедишщн щггогромоксвдазы с помощью ВЖХ.

Разработана чэтодака выделения фратмонтов второй субьэди-нида гитохгюмоксЕцазы, получении* б результате прстсолвзячэско-го и химического расщепления.

С полющьп метода трнткевой планиграфяа опродолопо простран 0ТВЭШШ9 расположение второй субъвдяннци цитохрошкоадазн в нодзкуляряш: кристаллах.

Практическая панпооуь рабстм.Разработаязыа методика очистке второй субъодикацн и ез гидролитических-фрагментов с помощью 32Х могут аайга применение при изучен га других цшбрашшх белков я различиях олггопептидов.

Мссяедозаниз пространственного расположения второй субгоди-ниэд с покодью метода тритиввой плаяитрафиа подтверждает яри-■ ыэнаыость данного подхода прн изучэшш топографии сложных биологических систем,.

иолояэвст. выносимые н^ зашду;

- выделена а азу чека цдтохромоксидаза из ЕпиЬгпусеа таадпим

- разработан ;к$$8ктивнкй метод гыдэланиа второй субшданг-дн цитохроыокецдаэы; •

- определена простраяствэнкшт структура субъадстдаде Е!, дЕтохромоксэдазц о помощью- трдагиавой аяаниграфиа^

. ^птюбаши рабоуц^ Рбэу.гвтаты^ работа- бшгг доложэяы» ее. У Всесоюзном оимиозяума по молекулярной надкостной хроматографии (Рита, 1990 г.).

Цублиаздии. По теме диссертации иш/отоя1 3 публикация«.,

Объэм и структура габоти. Диссертационная работа изложена, на стр. кашиноиасного текста и состоит из введения;, литературного обзора, обоукденгя экспериментального материала,. : э1;опарлм9нтальаой частя, выводов и описка леторатуры, которыф вкллчаат 15Г6 источклхов на русской 2 инсотрашшх язкка*'.. Работа йхлюотрароаана 35 рясукками и содержит Э таСляс.

3.

. ОСНОБШ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ¡1 ИХ ОЬС^ГДЕ1Ж

Втгзлэнне Щ1то*р<жэко:тазц. В настоящей раоото хдагэхроиокоя-даза была ввделгаг из сгрдда бкка по и&тодлхо, разработанной з МИТИ им. №. В. Ломоносова, с чспользоЕаниом ступенчатой зэдябшг а-зацвл идаохондргальшх балков кз частиц Кейлина-Хартра, соаадв-ниок сульфатом шсмоаия в помедукщэй очясткой на октилсебярозэ CL 4В.

Выдэленшб препараты цитохромокскдази из сердца бнка содержали н& I кг Сапка Э-'Л толь тема я, 20-30 м/.г {оостсли'адоз.

Актягность фермента, измаранная полчрогрл$:!Чэг,кл г присутствия твива 80, составила 100-120 моль ictToxpova зДмлъ цктохром-оксэдаак в сохунду.

Спектр поглоцвни.1 препаратов дктокромокездазы ак алогичен

приведенному в ллгорегурз (рис. I). *

о, 8

4оо 5оо йбо^"^' нм Рис. I, Спектр поглощения ввдвленнкх препаратов цятохрок-оксвдази (в О.а$ теине 80)$ «■— окас'лэцвая форма, - -- -» постановленная liopja,

Электрофор« в полиаярялшадком геле а дргсутствчп додесвми--сульфата натрия.ЦСЙ> и м<И9вявд доказал наличча е ирвга^те- 1а «оладвитвдов (рис, 2\. *

большая часть данных по структуре А махааяэму дойсявия ферт, ц&нтвг быда; прлучадд учэкыма с исаользовянкам питохромокеквдзн,, аидэлв!!йо4' вд> сердечной ыысцй бдаа, тогда ¡как оизонные Сиосдч-' тртдческий заедав- * к? иселадоаазлй цдтсхр'лкжсздазд дрожяаЗ Sbeohoiomij^fts- cereviwofe Дрожи* & cer^-AStee ге/адт бодэо tas-кое содцршшв ф&реаента,. пен. сердэчвая капка ,<5ыка. Оявчяо шдо.-. хроуоксидаза из &.cer«maaft' иявзвси^ир-асдолъаувтсц в биосет-та'тачосюсс и генетических зсолсдоЕанхшх» из-ьа, Богкокксет:» кянр-

пудароэаяия матохокдраальней и япвркой генэтичзскЕья скгтомаш!, выстрой способности дрожжей к росту.

Нами была иолучвна вдтохромэксидазг из дрожжей S.cereviaiae а такжэ заделе на к охарактэризонала цитохромоксядаза ess дрожхай Endomyces maonuaii > из которых ране» фермзнт не выделялся.

Здоктрофорэтяческое исследование позволило установить яодв-иаит-вдякй состав пдтохрлмоксвдазы, получанзой из двух видов дрожжей, и прогости сравнгтелькый апаяиэ (рис. 2). Оба препарата си-тохромокоицазч разладекы на 8 cyflbaлинии, семь из которая проявляю? аналогию е злактрофоретической подяиквосхл. Ксключениэ составила 1У суйьедиаяда Сем. рис. 2).

Я^юда^ыао. ыол&кудя раыа mcsn. (гДа)

Vll.Vta VII'

1

ЗЯ.О

ifi.3 гл.о

iS.i •М.7 •jo.о

so 6

II «I

¡V

V

VI

YU.vtla Viii

Si.o

аг.о 2»,о

НА

Ъ.Ъ А,7

И (ЭД^

•v*

П

V»

■4-5.0 27.5"

гб.о <8.о

Ю.7 «0.6

во

7.3 S.4.

Ал

АЛ АЛ

Рас. 2. Зяектрофорез в 162-ком ПААГе в присутствии ДСН и мочйвяшг: а) цитохромокездаза я» S.cerevisiae; б) цитохрошкеи- ' даэа нэ £. majjnusii; с) дитохроиоксидаэа из сэрлнчяой шлщы быка. Названая субгадяниц шгаохромоксидазы даны яо КадашЗ&ху.

Построения калибровочного графика на осной&ккя ■ электрофоре тяческой подвккностя селков о известной молекулярной массой позволило рассчитать наОлпзаемую молекулярную массу полягтептядоа 1У, У, У1 цятохромокекдазы ка magnusii (12.9, II.8, 9.3 кДа. соответственно) к иа S.cerevisiae (15.3, II.?, 10.0 хДа). '■

Яссле'иоэакия по получение ятшъьоп. алоц?тохрокс.к<:илаэн

Серьезной проблемой в изучении структура шттсхрококсрцаэы является выяснение расположения тема а звутри сложного банкового комплекса. Одаж из подходов к решен .та этой проблемы уодет окъъ получение ааофермэнта, т.э. кигохромохсэдазы, лишенной гама а.

Для работы в этом направлении мы вкйрали дрожжи как объект, яозволякциА быструю наработку значительного количества баомаеси. Среда итаммов в Цущянеко-Гатчвнекой коллекции нами были выбраны мутанты дроялой Saccharomyces cerevisjote о нарушенном функция дыхательной ценя:

876 Р/2-13 МАТ ct. ade .-rut' 87o. P/I6-IÔ МАТ ос adc ale 9, 876 F/20-22 MAT d. ad ö ale 4.

Анализ низкотемпературных дй&форе.чциальяых спектров внгсэ-указанаых типов дро.таэй свидетельству.'? о нарупвкзгя синтеза тема а, т.к. в спектрах отсутствуют его полосы поглощения. Проведенные полярографические исследования по определение дыхательной активности каждого ю трех типов дрожжей подтвердили цззянй спектрального анализа.

Однако оказалось, что пр;т яыраэдзаник в колбах на подчочон-ной среде с 2% глюкозы в качества субстрата мутанты ровэрТЕруог в дикий ата*м S.cereviiiüe. поэтому накопать необходимый дня выделения датохрококсицаоы биоматериал не удалось.

Второй подход к получению апсфермэята из дрежкей состоял з добавлении к питательно!« средо гризеофуяьвота. Анткокотик rp-iseo-фульвян, по литературным данным, ингибарует у головастиков некоторых еилов лягушек форрохелатазу - фермент, хэтаяизарушиЯ встраивание жеяезч в tioptf-иркновоэ келмуэ (::ряечнэя стация гама 5). Это свойство гри?ео(йулъвзна mí использовала на дрожжах. Доя этого бнла вкбрэкы три вида дрожи а, различающихся по тэту обке--на и по чувствительности к дефициту эттохракоксядазы.

Эксперимент показал, что умекыгэния выхода биомассы, снижения скорости дыхания или яврекиячонгя на альтернативны.? путь не происходит. Было сделано прэлгголожег.ко, что грчэеофульвин не проникаэт через клеточныз мембраны дро.кчешх клеток, что яслдсча-ет его кнгкблрукхпее действие.

Лля получения апоцитохроммсвдазы, вадтао, следует искать более устойчлвглэ кууантныэ штата и изменять условия КЕГибсровс-:>ля. либо поднять ноыв подходн.

код ч-:н:1и ксзпагагов христатлоз цктохуюмокоидазн, обработанных титиам-

В состав 'хитохромокоадазк Сйркиа бнка входят 13 полипел-доов. взаимное радполсженяе киторах, а также конформадконнне лзкэнвньл лгра»т гтнуэ pote fi кехалйзмч действия ф?рмэнга.

Обработка ат?.широЕ5ня'й« тритйом препаратов дитохроыокзада-зы в форме йзукерлых кристаллов, имеющих упорядоченную структур!', может дать информацию о топологии вдтсхромоксидазы, Кристалла сосюкг кз молекул цитозфолоквкдпзы, иуевдах статистически ш цлтоплэзматэтеск/ч, или :латр;:кснуг ориентация, ао расгголожвоанх упорядочакко по о'.'яошеняю друг к другу к вззимоцействуЕчих гндро-д'001ымя частямл угх: в лиищком б к злое.

¡ípo:!(',yi9CT?f¿ ^гтода третгрвой шгапктрафга пэред мотодамп, ьспеяъэупдал'а моли^.-пвгру&аде втачтн илл антитела, очэвщцш. Во-пзрвух, ?рпт."й' сб "гадает нышоньмей спосифэтросгъв по отшиешш к разла'гчшк ам:Фо.<ясло7ным остаткам. Еотеэ reí о, эту специфичность wj.tho учесть введением для каждого аминокислотного остатка коэффициента, характеризующего способность его лроговов замелать-c;i. h.í аноии трития. Во -вторых, благодаря, малым размерам тритий оиазиБаат надаеньсео иозмущаадзэ дейотваз на структуру объзкТа по сразишь с дру:<тл<и моди^ьдяруииями средс+аайй* что повышает достоверность яолуча&мой инфсрм&2йи> Метод в'слйчйэ? Ь csúaf: обработку вхпшарзваяням тркгйэм молекулярных кристаллов аатохром-окешазы, даосоцйадао фйрме'аа-а-, выделэяге меченых суС^едиЕиц в частое в ице, ах послздукадез раещедя&ниэ л получение якдивздуадь-ныдгептидов. ото позволяет установить фрагменты, имепкиэ сравнительно болъеую радиоактивность я, следовательно, .расположенные на гмвьрхкоэтк молекула фермэатз. Этот метод оправдал себя при исследовании пространственной организации лззохщуа я б-лстер'.го-родоисияа - белхсв, для которых хздашс результаты рентгено-сгруктурнсго анализа, а так-хз при изучении топографии вдТохром £ - интохрококсяда^яого комплекса, проведенного в МЙТХТ ям. . M.B./iOiíOtjoooBa.

Предварительно препараты шггохромоксэдазы освобокдаля от тритона Х-100 на колонке с амберлагом ХАЛ-2, ураэновйшэнпой буфером, содержащим 1,5? хо..:ата натрия. Крясталлн цигохро^охездази, полученное э результата медленного удалангл холага на?сия с пс-мощью длатаза и псследуадзго заморатсивааяя при -10 С, глатчлыю промывали дистиллированной водой. Затек! облучали ахтизяронакнам (при 1 2000 К) тритием два раза по 20 сок. Общая моло.чуллрная активность препарата [^К.} -дятохромсксидазь! составила 35-40 Ка> толь. Далаа препарат освобождали от лабильного трягая. Мзтол многократного иромывааая кристаллов водой л осазданая с яомодыи центрифугирования бил затем заменяя чэтар&хкратпой ляофшмзяциеЙ радроактивных препаратов, растаэрэиннх в буг^ара, содэржацэм 3% ДОН. При радиоактивность после первой ляояшшэацяи уменьшилась и затем существенно аз изменяла«.. Коночная акузвность ]-цитохрошксвдазЬ составила 20-25 Жя/тюль.

Препарат пнтохро'моксидазн после обработки додапмсульфатом затрая (ДСН) и р -мэркаптоэтанолом делали на Уяьтрэгзла А.еА-34 на 7 фракций (рис. 3).

Тяс. 3. Разделение- ыэчеяюй гритявн цлтолромоксидазы на Улдаратело АсА-54 (колонка 2.6 х 90 см), урагноэемэяяом 9.05 М гряс -Н2О0д - буферок (рН 8.2}, со тряхнем 3% ДОН, С. 01.5 яэйяа аатрля, I мй ?ДТА. Скорость элшнл 5 мл/Ч. Обраадц пррпзаритэль-но ;)Нк.уСлроБЗЛ» и твчаклэ 16 часоз прх t 20°С з приоусткл ДСН С5 1лг/кг бвлкаУ я ^-»/йскаптоэташлч.

о

• о

Субъедишгчный состав &тях*фракций исслздовалз злекл'рофоретичаски в поляакриламадном геле (ПЛАТ) в-1прлсутзтьиз ДСЕ (рко. 4).

и »I

Vg

== И?ь

L_

о 1 г ь + е £ 7

•с" VIII

цктохшм-окскдаза

Ркс. 4. Эяэктро|ю;в1'ИЧ8ский анализ фракций, полученных нри хроматографии цитохромоксидази. Предварительно образку янкубиро-ваки з О.ОЫг трио - HCl -буфере (pH f.Q), содержал ем 4% ДСЕ ъ 8М '«/.очевшш* в течения 14 ч при 20°С. Электрофорез вели в 18.5% ПААГ. Нумерация трэксв аоотвзтотвуот номерам фракций аа рис. ? - •алехтрофореграша суСИьздйнпцк П, очищенной с помощью В2Й<

кЕараил§льно нами была проведена авторадиография получении* «я&ктрофзреграмм на радиографической шшнка типа РМ-В (произвол- . стао'"Свет"). На радиографической планке отчетливо квдны Еса шзвднеся в составе молекулы субъединетии Однако наблюдаются -.умоньиэ.чда интенсивности полос в области I, Ш, 1У субьэданйц » •наличие полосы, соотватотвуэщай полипаптиду с молекулярной массой" •шт, чем у субьедингцы I, На основании этого эксперимента можно оцалать сладуоцте выводы. Во-шрвих, все субьединяцн доступны актиЕ/рованноуу тритию, сладсватальяо, как и предполагалось', мо-лнкулы з крлстаявах ш./атл как згатрвксяуи, так и дитошгазматачес^ пуп ораангашш. Во-вторых. вероятно; образуются ьысокс.молекуляр«-ннэ агрегаты, видюшэ верхней полосой на радаогра$ическоЗ пленке. В~тр*п'ьях, субьодкнши I, Й. 17, но всей видимости, расположены зруеъь крзсталла цнтохромоделдаэы а поэтому слабее яодзергайтся облучению.

У

Уъучулу.ч пространственного располокзния бтотой рубъадинидч ритохррмокснлазн методом тздтиезоР °

Среди 13 суйъоллкиц щпгохрокохо.идагн субгадинииа ГГ энки'яаот в Аерадэнтэ особое меото. Учитывая HiW4y.fi в субгздингцэ нескольких лроитетическ/.х rp/пп, а такте места связывания с датохромсм г, некоторые ученые отводят этой субгеаиннцэ роль минтаалуйоЗ Функциональной единиц фзркента. Лля второй еусчо пняччи известна полная аминокислотная последовательность, и преложена модель вероятного расположения части полкпэпгида 2 липшгкои бпслие { in vivo ), полученнзя с помощью модиф-.лглрущих агенгон,

Для выделения и очистки субъздинитш ¡T дитс.чроиопеидаяи Трагедии 1-3 (рис. 3, 4) подвергли дапькойшег/у хро'/атограпэтесксцу разделению. Иерноначально мы лепользоз&аи колонку TSK G-- 3000 UV/ ( LK3, Швеция), Разделе низ проводили в 0,54 трко.НСЕ буфере (рК 7.2), содержащем O.SM LíCL и 2%о.-юрости потока 0.2 1ЛЛ/МИВ. Недостаток этого метода сссточл в необходимости последующего уда-тения солей я детергента из ^ракдии, содержащей субъедянпцу П. Обессоливаяие проводили на Бяогела ?--4, соперники? ДСП контролировала еаектрсфэтомагрнческим методом, иснольку-юмпм мэтилзновый синий.

0 цельа дальнейшего улучшения метода очистки суй-ьоллиитд •.! проводили обрашекно-фазоЕув 3¿QL на следующих, колонкам: Aquapore Satijl • (2.1x220 vja) , ¡ЛПС-300 (4x500 мм), SSX. ГТ*й (4.6х2ЬС w), Beckman C-I8 (.4.1x220 !я<). Для алюировааяя исяользовата

IM муравьиную кислоту, апетонитрчл, изопропакол. Путем подбора градиента удалось получать сходные профили эляции, опии иа ликоз в которых соответствовал кшд.чаилуачькой субьепинппэ. Однако наилучшее разрешение пиков было получзно. на колоше Uítrasphür-e XL C-I8 (4.6x75 им;, feeckman) (рис, 5), Гомогенность полипоптч-да Я проверяли с ломощью алоятро'Торрэа (рис. 4).

1 1-1 рис. 5 пик 2 соответствует субъедкнице ÍI, пж 3 - субгеаи-нипв I (согласно данник электрофореза). Пик 4 содержит высоко-;лол9куляэныс .гапыллы ДСН, частично содержащие бел он.

Йз 40 ;/г из-иного препарата цитохрококездазк удалось вида-лить 3 мг еубъзгйнпцы ¡1 с радиоактивность» 1.5-2.0 Кл/ммоль, что

Риг. 5. KCL фракций, ссязр^злых субъедйнмш I к П. Колонка bcckman UJtraspberc XL С—IS (4,6x75; Змкм ).Скорооть потока I мл/мик. Буфор А: I мМ фосфат (pH 3.0); буфер Б: смэсь шдото-нлтрлла -л муравьиной кислоты (1:1 v/v ), солераащая Ъ% хлористого м&тйлзйй; гргс^оиг 0-6 мзш 100?! бу&ера А, 6-30 мкн 100^ öy.japa Ev

ЛОЗ£ОЛМО ПрОДОЛШ1ТЬ ЙССЛЗЦОезд1ыя по оярэдэлвяию уровня радиоактивности участков полипеu-тидной цепи субъэдшшш П.

Субъгдикицу П подвергли рэсщэпленки трипсином при с00тн0п8-нил дюриект-белок 1:50 и 37°С в течение 4 час. в ОЛЯ-ном гэдро-кзрбокатаом йуфор« (рК 6.0), содзркаизм 0,1% ДСК, Описанное в лятэратура добавление окгилглвкозкда на приводило к улучшена» расшэшхзнш к поэтому в даяьнййшем не использовалось. Комическое расщвчл-зивв субъедкниш К бромгааяом проводили на стеклянном фильтре б газовой фазе 70$-ной ТФУ в течэниэ 25 часов пря со-отномэиии бэлок-раагенг 1:1500 (при IOO-хратном избытке бром-циана на каждый остаток матиокиаа).

Фрагменты выделяли методом ВКХ. на колонке Aquapore Phenyl (2.1x220 км; 300 X; 7 мкм).

Путем подбора подвижкой фазы удалось выделить Э триптичэс-хих фрагментов (рис. 6).

Сложной проблемой сказалось отнесение Еыцэленньгх пептидов к определенному участку полипептядной нет суЛздиниш П. Невозможность использования для каждого фрагмента сбквенлровапия

д

_'S80

от

30

50 80

от

Рис. 6. .BSC пептидов, полуденных в результате расщетшэнкя трипсино» субъедингадн П щггохромоксидазк, на колонке Мдизроге Phenyi (2. 1x2.40 мм; 300 А, 7 wxm). Подвижная .?аза: 10 мМ три' этклещмоняя-фосфапгнЛ 6yf?p (рН 2,1.) , содержащий'ОЛ Ml/CIO^,

0 градиенте Q-6CW ацетокитрила за 60.мин. Скорость потока

1 МЛ/М'ЛН.

ат

IZ.

O ODQ

xil

.Л.А.....

iQ

SO

OOiO

Рис. 7, BüOC пептидов, гхолученних в результате расцепления брсмцчансм субьадюмцн П цмтохромоксидазы, на колонке Aquapaes Phenyl ( 2.1*220 »ш; 300 А, 7 икы). Подэиянак фаза: 1С мМ триэ*иямшоний-Фоефат!шй <5уфер (рН 2.1), содержащий 0.1 Ч LL CIO s градиенте 0-60Я ацетоничрила за 80 мкн. Скорость потока4 I мл/мин.

ввиду его трудоемкости заставало лас исвольэоза'/ь другие подходы,

В связи о ?тт т рассчитав: Тборэигеее.'.ие коэффициенты эксгюкцил при 2S0 и 214 км для пептидов, возможных прп трлнеаьо-лизе субъединивд П, используя коэффициента экстяяхции отдельных аминокислот при этих длинах волк (табл. I). Такж образом, йШ! определен фрагмент 2 (табл. I), имеющий наибольшее значение S^q, равное 17900 и. следовательно, наиболыаую высоту на хрсматограм-ио (рпс. о). Второй по высоте пш: на хрсматэграчмз бчл определен как фрагмент I, акещий §£qq яехтось вияллоъяэ

пиков 5 и S, ровных ¡тз высоте, а гакяэ никои 3, 4, 6, о?сутству-щих на хроматограшо, полученной при 260 нм, и пмэ^пих равную высоту на- хроматограмме с 214 т.

Для решения этих спорных зопросов ками быч погашен другой прием. Проведений анализа змеей шпткдшх стандартов на колонке Aquopore Phenyl. позззлило скорректировать результаты разделения гидролазатов с результатами чсолздоьаний №ка (Меех, 1080), определявшего на коленке 6io Rad время выхода пептидов з зэвясшос-тн от их аминокислотного состава, и рассчятач'ь теорзъгаэоков нречя выхода фрагментов для подонки Aquafore РЬегуНтябл. I). Бш:о зашчепо, однако, что зто правило справедливо для пчптидоэ нэ Sones 30 шшюкяслот,

Таблица!

Характеристика пеатлдэя. порученных в пе^улътатв трипсинолиза суогеДийАца 1Г иитухромогссидазы я ввделеншх с шякадо НИ

ÜöCTO Нел-Ж илда-д по-л/пслэдова-

■¡Коллче-

■icfao

}<амино-

t 11 » 1 " ""■»»' ..........

jТеоретический коэА^йгйчй?

ЭЕСТ1ШЙЙ (М-1 *= «Г%- -ф£

[зрепия выход« • w

йубъедянг- }НЫ {эстатков 280 ем* - у*. 1» retJp.- факт1*

I .1-98 98' 9600*- I424ÖO Sir.r1 7&:ой

2 99^134 Ж 73»6' 73 Л fr'

3 155-Г4Г <7 » '0 4Ш 5,2' 5Ж

4 I42-151 40 ■б 63Э0 Ч&Л 43.

5 I52-171 20 •5700 зеьоо ■'6L.2 'SO.OV

6 172-178 7 0 4200 ПМ.О '9/М

7 179-217 39 . 2600 539QÜ . S2.'8 75.27

8 218-221 4 1300 >Ш00 "8.5

а 222-227 6 5700 ЯШ- 2S.0 23.13

Сходимость значений теоретических КГ фрагментов 3, 4, 5, 6, 8, S со значениями RT полученных пиков (таЛи. I) подтвердила прежние иредоолая.е:-;>;я к дозволила идентифицировать неизвестна фрагмепти, Выборочное сзхвонкрование фрагментов 7, 8 и S доказало правоту нянях предположения.'

Следует учитывать, что связи K(49)-L(50>, R(02)-I(83), K(T!J9)-PII3G), R(I88)-?(I8S) не подвергаются раедепленяю трипсином (см. ркс. 7). Эту результаты совпадают о другими работами, в которых выделили фрагменты трипсинолиэа субъедантш Р,,

4 I * |зо

11 й V Р М в L О D А Т 5 Р I Н Е Е L L Н f И D Н Т L И I .

| i АО

I' F L I a S L П ( 1 1 S L Mi. Т Т KAL THTSTMOAQE

f Н

VET I » U L Р A I II_Tl.TAi.Pet_ rA* L У M M D F I

4 ? >»

N N P В L. T V K.T MBHCWWSYSYKTDYEDLEFDS

II г в l. i v p.. i п 13 м u w w а т в тс. i uituucru

* * 4 1

« т d *■ « г - и в n : i i i? if n ii с t, i> ■ о м'с uw-r

ISO

и и V и ч

1 Т Т 180

Н.П LVBSEDVl.H8WAVPSl.eL КАТ Г) А I Р 13 N

4 1 Т ■ II 2Ю

г 1 т и п с в ЯдР (и у г в а с в е г с б & к н з р мтр I V : 4=27

I £ I V Р I. к^У Р Е К^И С А 8 К I

Рис. 7. Аминокислотная цоследотагелъкость субьединглщ П цхтохро^оксидаэы: ♦ •■ наста фактического расцепления псд двйст-■ внеи тр;;пскка; | - мсста теоретического расщепления под действием трипсина; 4 - места бромдлакового расщепления.

Оба описанных вше приема бшш использованы при иденти^ика^-дпл 13-ти фрагментов, полученных в результате химического' расщепления суогэдаышы П бромпиаксм. Данные о теоретических- ¿^УС я & 214 отдельных фрагментов и, соответственно,, их теоретических КГ, рассчитанных для хроматогра-Хнчосгого разделения фрагментов в такой жэ подвижной Лазе, приведены в табл. 2.- Аналитическое определение 4-5 гаагсв аминокислотной исгледовате.пьностк з-рагмен-тое 3, ?, 2, 8, 13 лодгьордало теоретические предположения.

Пссле ждвк-ги'ий-гаиаз Зрагмектов расдеааения («к переа-ли к определении кх радкобкмднзат»!. 'Лэлсерен.^ радиоактивности ;прово-

с помольхз проточного радиоипотояного детектора Ьескпвп 171 и^А.'; Б тагл. -3 ь -1 приведены значения £рги/еатов зэ вочетеч уроанл ра.цка1з:о;:ного .

Т а <1 л и а а 2

Характэрястяка йэдтйдов, полученных в результата расщепления бромп/акой еубъздинжы Г глтсхрсуокоцдаза п ва'дэлвйеы!!. с помогаю 321'

^/ии^л ■*х- ^ ^

зкстинкцив

¡Мосто нэп-;Колйчёст-Т^бсрэтичзскиЯ коэЭДацдаят Й ¡тид*л в по-{во а«кно-|

•сладона- ¡кислотных* т п/а;тельностл ¡остатков. (1 ж )

пои

¿озмд выхода аэптаса (глин)

(Суоьедкна-; 5 ни | | -280 т 1 км | теор. |~факт.

I 2-5 4 1300 югоо Г'."?"'

2 6-17 12 0 шоо 43.1 42.53

О О 18-29 12 0 18700 40.7 40.43

4 30-45; 16 1300 23У00 ЙЗ.О 7b.II

5. 46-56 II 0 • 0000 27.7 27.57

6 57-66 30 7000 53000 103.', 76, !Г5

7 88-100 13 0 9800 16.'' 15.^)4

В 101-122 22 17900 110400 62.?. 60 ЛЬ

9 123-146 24 0 16800 54,5 52Л Й

10 149-152 4 0 2800 11.2 11,52

II 153-185; 33 5700 49ЯС0 ГЛ., 7 06,31

12 186-207 22 2500 34600 33.3 32.11

13 208-226 18 7000 40900 06.7 С5Л7

Т а б л у ц а , 3

Абсолютная а относительная радиоактявность чспт.чдов, полученных в результате тгапспневого р&станлегля суйъедлкицч й цйтохремохездазн

Номер; фрагмента} Участок з субъедикице | й/олекулявнай 1 масса (Да) 1 _ Радиоактивность

"абсолютная ; относительная Цпмп /глет * «о )

I 1-Э8 ' 11137 67Э87 6.03

2 99-134 4440 72108 Т6.24

э 135-141 ' 858 14421 16.81

4 142-151 1183 ■20602 17.34

5 • 152-171 ' 2168 18542 Й. 50

6. * 172-178 729 14422 1.9,78

7 ■ Т.79-217 ' 4122 47385 11.50

8 218-221 586 В240 14.06

9 . 222-227 693 13361 17.81

Li.

Таблица 4

Абоолатма/г л относительная радиоактивность пептидов, получениях б рэзультате химического ъ&сщэпябнич бромдианом оубъйдянада II цигохромоксидаза

^Ру^огок в 1 Молекулярная. I ~~ Радиоактииость ¿r-w'- ! масса (Да) ¡аЗсодютнг.я относительная '"" ' ,с~!_______!____Кш/ш) ! (имп/мип«моль)

i c: 481 8240 17.13

2 6-1? 1307 24722 18.91

3 IÔ-2S 1522 I030I 6.77

liO-45 1822 - -

0 1234 4120 3.34

fi 57 -oo 3400 18542 5.45

7 86-1CC 1462 - -

S 10Г-122 2886 . 45325 15.71

q 2719 4Э445 13.18

i0 145-152 520 8210 15.73

¿i. 153-185 3550 47385 13.35

ISñ-207 2216 13542 8.3S

le- ¿C6-226 2251 • 30903 13.73

С ¡тз.моаьм полученных данных радиоактивности фрагментов я ;)ь.сс;члгаш)ь:х величин относительной радиоактивности были построены rncr-'orp.4i„v:i; раякоактивностЕ отдельных участков полипепглдной цепи,-полученных ь результате прогеолитичэского и химического расщеплений (pjiü. 9), lía основании двух гистограмм сЗмла построена совмещенная гистограмма (рис. 9), дакздая представление о доступности стлэкнс участков полизепгида атомам трятяя и, соответственно, об их поверхностном расположении в таяокулярних кристаллах. Анализ совмзшзнкой гистограмм* показал, что наиболее доступными для оомбаодирозкя атомов трития, яаматся 4 участка яолкпоптида П: с I по 17. с 101 по 152, с 17?. по 185, с 208 по 22.7 аминокислоту.

Снижение радиоактивности на участках: I) 26-54, Л) 88-100, ¡Í1) 152-171, 1У) 179-20'/ может свидетельствовать об экранировании пслкиапгхдной цепи пои обработке тритием кристаллов гдтохромокся-дазы.

Расположение пэрвьх двух участков согласуется с предыдущими структурным;: работа;«; по определению пространственной организации

гая ЕЕИ/ИКЛ

суоъеджвдк Ш( Öioson R., 1982).

О наличка sue двух экракировайнах участков равее ив сообца-лос!. Однако, обработка с помочь к ЭВМ дзднцх атсннокиолотасй по-слыоватвлькостк субъодйшщы с лспольаовавдву программы (Carmenes R. Ü., X9SS), показывающей: I) гэдрофзбдце» Д> подвидныэ, Ш) доступные поверхности участки полипэптвдеой цепи, а, такда 1У) возможные Ы. -сдяранязовакные, р -слладчдтыз и неупорядоченные звенья аминокислотной последовательное??, указывают да щадич^е пяти малодоступшвс участков: 25-42. 59-74ц 3)| Д63-гД7|, 4) I9S-2G4, 5-) 207-213,

Кроме тог.,, участцг суб^еДЕцацц Ö в связнванвд о простатическими гру сдана, в, частности, с атомами мзди* дчгаздади, которые чвляэток Н Ш, С 195, К 204, Q 200, предполагает дазщчвд оаредаяевдо? цростракстзэнкоК уклздия полдаштида.

Вероятно, С-зоццевой остаток полясеитзда G ,шиноа а 12< аминокислот сохраняет свое оцредэдояянм образом свериугу» структуру в кристаллах нодо^р.о той, которая существует в ватшшм белке,

Тзиш образом, дэр^дад» радиоактивности в "хвостовой* час-тк подвшдтвда, начиная с 9в-оЙ аминокислоты, можно использовать для построения модели пространственного: расположения шлипаптя-да 2 (рко. 10).

Ряс. 10. З'илотатаческан модель прос?рачотвенуого расположения су^ьедикиш П цктохрококсидази в яатщзд&я б.елге; § -атом леди, г ---i - -еппрадазовалаиц участку дэод, --

В предполагаемой модели нояапептид С двавды пронизывает липццаыЛ йкслой, образуя на участках 22-52 и 65-95 -спираль. С-К0Ш19В0Й "хвост" поляпэптвда (с 96-ой аиинокислсгы) те от свернутую в глубок структуру. Пря этой участки вблизи аминокислот 161, 197, 200, 204, двлявдрэся лигавдама атома шди, окагквают-ся внутри "клубка", а сама чростетическая группа сильно экранирована,

ВЫВОДЫ

1. Вп&рвна ввдолена идтсхромоксвдаза из дролжэй Ел^о/пуса^ твдпизИ.

2. Разработана методика выделения субъединящи 1! оттохрои-оксадазн, содернадая радлоактивнуц ыогау.

3. Разработала ко то дика получения [3Р]-фраг«эигоз трлптячэе-хого и бремцяанового гидролиза субьвдияиш П цитохроиокевдазы.

4. Дзучэна степень вкиэч&ния трития б рязлкчпыз участки субьединкцы 3 цитохрсмоксидазы,

5. Ка основании данных радиоактивности фрагментов расщеплен:«. и компьвтеркой обработки аминокислотной последовательности субъединшш Я построена модель пространственного расположения

в молекуле цитохромокепдази.

рсновныа результаты работы наложены в следующих

публикациях: •

2. Коадоэа Н.Г., ¡Зуравлева. Л.В. Влияние гризеофульвика на дрожкавуа. вдгеохронокевдаэу.// Материалы плтой конференции молодых ученых* го сшецкалиеяев йосковсаоро института жонкоЯ химической1 мшелотяг..- ¡й.„ 1936.- С. 10-11.'—Дер. 9 СйИИТЭХИМ 5.10.Й7, К» 1243>хп~ег^

2. КЪтяоэа Кули» Mi.Uu.„ »тронов А. 5. Выделении ыэчекном гритиеи субгединща П1 цктожромокевдазы»// Биоор*. шия.- 1968.-Т. 14, Вып. 12.-С. 1695-169?.

3. котловаН. Г., Кулиш К.А,, Ру^цо» К. С1- Использование ВИС для счастии еуб-зддшяцы II цигохроиексидаои».// Теэкск докладов пятого Всесоюзного симпозиума по молекулярной жкдаосткой хроматографии.- Рига, 1990,.- С. ЮТ,