Изучение пространственной структуры тромбина и особенностей его взаимодействия с фибриногеном путем моделирования и конформационных решений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

РГб од

На правах рукопису

а / коя

КАРАБУТ Леонід Володимирович

ВИВЧЕННЯ ПРОСТОРОВОЇ СТРУКТУРИ ТРОМБІ НУ 1 ОСОБЛИВОСТЕЙ ЙОГО ВЗАЄМОДІЇ З ФІБРИНОГЕНОМ ШЛЯХОМ МОДЕЛЮВАННЯ ТА КОНФОРМАЦІЙНИХ РОЗРАХУНКІВ

02.00.10 - біоорганічна хімія, хімія природних та фізіологічно активних речовин *

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних науіс

Київ - 1993

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі хімії білка Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії АН України.

Наукоииіі керівник ■

Офіційні опоненти -

Проиідиа організація -

доктор біологічних наук, ііроиідниіі науковий ,снінробітшік Єврейська А.О.

доктор хімічних наук, професор Гінодман Л.М.

кандидат біологічних наук Радавський Ю.Л.

Інститут біохімії АН України.

1993 року на засіданні

Захист відбудеться 11 (К? " _______________

спеціалізованої вченої ради Д 016.65.01 із Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії АН України (253660, м. Київ, оул. Мурманська, О-

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії АН України (253660, м. Київ, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий 1993 року.

Вчений секретар /

спеціалізованої вченої ради ^У^Т ФЕДОРЯК Д.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АКТУЛАЬНШГЬ ПРОБЛЕМИ

Тромбін (КФ 3.4.21.5) - ключовий фермент системи зсідання крові, відноситься до класу серинових протеаз трипсиноподібної дії. В організмі тромбін каталізує обмеженні! протеоліз фібриногену, що приводить до утворення фібринового згустку; він також активує тромбоцити і ряд факторів гемостазу, зв'язується з рецепторами ендотелію і виконує інші регуляторні та гормоногюдібні функції.

Основною функціональною особливістю тромбіну, іцо відрізняє ііого від трипсину та інших панкреатичних протеаз, є висока селективність у відборі розщеплюваних зв'язків при гідролізі високомолскулярних субстратів. Визначається ця тонка специфічність тромбіну додатковою ділянкою зв'язування, що розташована поза межами активного центру. До останнього часу додатковий центр залишався структурою гіпотетичною. Реальність його існування була підтверджена рентгеноструктурним аналізом. Однак деталі будони, механізм дії додаткопото центру, зв'язок його з основними елементами молекули і особливості впізнавання субстрату до цього часу не відомі.

З'ясування цих питань важливо не тільки в теоретичному, а і в практичному аспектах, тому що дає можливість ціленаправленого пошуку диференційованого впливу на окремі фізіологічні функції тромбіну, що вельми важливо для профілактики та лікування захворювань серцево-судинної системи. Викладені міркування показують актуальність теми, що присвячена вивченню просторової структури тромбіну та особливостей його взаємодії з фібриногеном шляхом моделювання та конформаціиних розрахунків.

МЕТА ТА ЗАДАЧІ ДОСЛІДЖЕННЯ: •

Метою цього дослідження є з'ясування механізму вузької специфічності. тромбіну за допомогою побудони його моделі і конформаційних розрахунків взаємодії додаткового центру (ДЦ) тромбіну з комплементарним сайтом (КС) фібриногену. В зв'язку з цим вирішувались наступні задачі: .

1. Побудова повної прецизійної атомно-молекулярної моделі тромбіну.

2. Конформаційні розрахунки взаємодії ДЦ тромбіну га КС фібриногену.

3. Моделювання взаємодії тромбіну та фрагменту 1-51 Аа-ланцюга фібриногену людини (впсокомолекулярний субстрат).

4. Конформаціі'ші розрахунки та моделюиания взаємодії низькомолекулярних лігандів То8-1.(ШЛ'а1-Ь-Аі>!-ОСІІз з актишіим центром (АЦ) тромбіну.

5. Аналіз механізму спряження додаткового і активного центрів тромбіну, що витікають и результаті взаємодії з комплементарним сайтом фібриногену.

Впсшс побудовано иоішу прецизійну атомно-молекулярну модель тромбіну. Розроблено методологію і технологію побудови атомно-молекулярних моделей глобулярних білків такого розміру. Виявлено деякі специфічні риси тонкої будоші тромбіну, здатні з'ясувати особливості його взаємодії з писокомолекулирними (ВМ) та низькомолекулярними (НМ) лігандами. ‘

Шляхом коїіформаціііннх розрахунків та моделювання досліджено механізм взаємодії НМ лігаидін типу Т05-Ь(0)-Уа1-Ь-Аі£-0СНз з АЦ тромбіну. На основі цих даних, а також даних по кінетиці інгібіруваїшя, запропоновано механізм взаємодії НМ -лігандів з тромбіном, який в суттєвих рисах відрізняється від притаманого трипсину.

Вивчена модельна система, яка складається з двох компонентів: ДЦ тромбіну та КС фібриногену (всього 23 амінокислотних (АК) залишка). Встановлено її топологічні та енергетичні параметри. Кількісні розрахунки підтвердили уявлення про те, що система ДЦ-КС відповідна за додаткове зв'язування тромбіну та фібриногену поза АЦ.

• Занронононако модель взаємодії молекули тромбіну з фрагментом 151 Аа-ланцюга фібриногену людніш. Модель дає змогу проаналізувати взаємодії фібриногену з активним (карман первинного зв'язування, каталітична тріада, аполярний центр) та додатковим центрами тромбіну. Запропоновано механізм спряження ДЦ та АЦ тромбіну при взаємодії його з специфічним субстратом - фібриногеном, що включає етап впізнавання-зв'язування та каталітичний етап.

Оригінальний пакет програм, що використано для вивчення конформації комплексу ДЦ-КС, може бути застосований для вирішення

з

широкого спектру задач, пов'язаних з взаємодією громбіну або його окремих ділянок з різними лігандами.

АТІРРРАШЯ МАТЕРІАЛІЙЛИСЕЕШІІІ

Основні положення роботи доповідались на науковій конференції Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії АН України (1991, 1992), 8-й конференції молодих вчених по органічній та біоорганічній хімії (Рига, 1991), Міжнародній конференції "Моделювання та комп'ютерні методи в молекулярній біології" (Новосибірськ, 1990), Всесоюзному симпозіумі "Хімія білків" (Тбілісі, 1990), І Всесоюзній конференції по теоретичній органічній хімії (Волгоград, 1991), III Симпозіумі "Хімія протеолітичних ферментів" (Москва, 1993).

По матеріалам дисертації опубліковано 7 праць.

СТРУКТУРА ТА ОБ'ЄМ РОКОТИ.

Дисертацію викладено на сторінках машинопису, вона містить малюнків та таблиць. Робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів експериментів, їх обговорення, ВИСНОВКІВ таї списку літератури, що містить джерел.

Літературний огляд присвячено особливостям структури та функції тромбіну.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ.

Безпосередньому конструюванню агомно-молекулярної моделі тромбіну передує створення графічних та скелетно-дротяних моделей. Перші являють собою двомірні проекції молекули тромбіну. Накреслені фронтальна, сагітальне, та горизонтальна проекції молекули тромбіну. Координати атомів нанесено згідно даних РСА тромбіну (Bode et al., 1989): Масштаб 1см = 1 Я. ■

В скелетно-дротяній моделі шлях основного поліпептидного ланцюга зображується за допомогою алюмінієвого дроту (і1=3мм). Згини дроту зображають Са-атоми АК залишків, прямі ділянки - фрагменти поліпептидного ланцюга між сусідніми залишками. При побудові моделі шікорнстовунішся оригінальний фіксуючий станок, система дзеркал з нанесеними на їх поверхню графічними проекціями молекули.

Атомно-молекулярна модель тромбіпу (АММ) була побудована з набору прецизійних моделей (Р.-Х.Н.Мікельсаар, Естонія). Моделі даного типу дозволяють моделювати структуру білка, витримуючи істинні валентні кути і відстані.

АММ побудовано по оригінальній технології. Кольорові пластикові сфери, що імітують різноманітні атоми, встановлювались і фіксувались в просторі кубічної несучої рамки на земних кріпленнях згідно декартових координат РСА тромбіпу. Ключові елементи молекули тромбіну закріплювались на постійних фіксаторах. Напрям збирання моделі тромбіну - від центру молекули до периферії-. В процесі конструювання проводився промір та коректиронка положення в просторі окремих АК залишків та їх кінцева фіксація. На моделі було виділено область ДЦ тромбіну і за допомогою конформаціґіннх розрахунків детально вивчалась його взаємодія з КС фібриногену. Моделювалась система, яка складається з двох компонентів: ділянка- ланцюга Arg67-Lys8l ф-петля) тромбіну і ділянка Asp38-Lys44 фібриногену. Вихідна структура тромбіну (до утворення комплексу) була взята згідно даних РСА тромбіну з НМ інгібітором (Bode et al., 1989). При розрахунках иикористоиувся пакет програм для

конформаційного аналізу І.Щочкіна та В.Хуторського.

Задача побудови комплексу шірішувалась в два егапи: спершу генерувалась структура, в якій пари атомів що розглядались були просторово зближені, і в той же час не було стерично недопустимих контактів між атомами. Для генерації такої структури застосовувалась спеціальна методика "стягуючих" потенціалів. Отримана наближена структура комплексу піддавалась процедурі мінімізації енергії.

Для з’ясування механізму взаємодії лігандів Tos-L-Val-L-Arg-ОСНз (Ij) і Tos-D-Val L-Arg-ОСНз (І2) з громбіном, була розрахована їх конформація і змодельовапо взаємодію з АЦ тромбіпу. та І2 були зібрані з атомно-молекулярних моделей і розміщені и АЦ тромбіну. Мінімізація енергії проводилась програмою PC MODEL (Serena Software) що використовує метод атом-атомних потенціалів Елінджєра. ,

1. СПЕЦИФІЧНІ РИСИ СТРУКТУРИ МОЛЕКУЛИ ТРОМБІНУ ВИЯВЛЕНІ ПРИ МОДЕЛЮВАННІ.

На поверхні молекули тромбіну знаходиться (на відміну під споріднених серинових протеаз) велика кількість різноманітних виступів, западин, петель. В основному воші сформовані ділянками, які по первинній послідовності є останками в порівнянні з трипсином та хімотрипсином. В правій верхній частині молекули ми бачимо пласку, вигнуту Д-нетлю. її складають залишки Аі£б7-СИи81. Вона містить чисельні заряджені та гідрофобні залишки. Модель показує, що бічні радикали деяких заряджених залишків (Агдй7, Ьу570, Аі(>73, ОІи81) зближені в просторі, експоновані і утворюють своєрідний іонний класгер. Трохи нижче, в центрі моделі знаходиться сильно штягнеца горизонтальна у-петля (Оіу 140-ОІПІ56). На її згині знаходиться залишок Тгр148. (З- і 7-петлі складають додатковий центр ііпізпавашш-зв'язуваїшя специфічного ВМ субстрату.

Окрім згаданого іонного кластеру, поверхня тромбіну збагачена іншими зарядженими кластерішми структурами (в основному на верхній частині молекули). На поверхні задньої та нижньої частин молекули

тромбіну можна бачити специфічні спіралевидні структури (Азр125-АІа129С, Ьуз235-01и247, Агв165-ХЬі 172).

В центрі молекули на моделі видно глибоку, чітко виражену

вертикальну западину: Це ущелина активного центру (АЦ). її ширина 9-12 А, довжина біля ЗО Я. Вона тягнеться знизу вгору, розділяючи молекулу тромбіну на два домени: лівий (менший) та правий (більший). В центральній частині знаходяться елементи АЦ: * каталітична тріада та кишеня первинного' зв'язування (КПЗ). Нижня частина ущелини АЦ, розширюючись, утворює замкнену порожнину з гідрофобними стінками -аполярдцй центр (ділянку вторинного зв'язування). '

При вивченні топкої будови АЦ було ■ встановлено, що елементи

каталітичної тріади тромбіну, які утворюють систему переносу заряду,

мають дешо відмінні від оптимальної відстані один від одного (порівнюючи з трипсином та хімотрипсином):

Білок Відстань ЫЕ2 Ніб 57 -Оу Беї 195, X Відстань N01 Ні5 57 -ОШ Авр 102, А

1. Хімотрішсіш 2.8 2.6

2. Трипсин 2.8 2.6

3. Тромбів 2.6 3.4

Також встановлено, що імідазольие кільце залишка НІ557 знаходиться не в оптимальній орієнтації відносно Оу атома Бег195. Воно трохи повернуто навколо осі (-250) ( це компланарнс відносно залишка 8єг195.

КПЗ тромбіну має вигляд досить вузької (біля 4 X), вигнутої,

м О

замкненої ‘'норн". 1Т довжина біля 10 А. Вона тягнеться зверху вниз, маючи загальну стінку з аполярним центром (мал.1). Вхід до КПЗ знаходиться в глибині ущелини АЦ, біля залишка Эег 195 каталітичної тріади. Зверху він прикритий "нависаючим" Б-Б містком (Су542-Суз58). Модель показує, що субцентри 52-Б4 аполярного центру знаходяться нижче і лівіше входу до КПЗ (мал.1). Вони являють собою стсрецспецифічні "ячейки" гідрофобної природи. По нашим оцінкам субцентри Э2 і ЭЗ мають розмір 4-5 X і здатні розмістити гідрофобні залишки невеликих і середніх розмірів (Уаі, Ріо). Б4 трохи більший (6-7 X) і може розмістити більші залишки (Тгр, РЬе).

Аналіз взаємного розміщення вищевказаних структур на моделі дав змогу висунути твердження, що через стерпшії перешкоди зв'язування гуанідннового радикалу Агу (Р1) НМ ліганду в КПЗ і утворення продуктивного комплексу з активним центром тромбіну утруднене. Але при стереоспецифічній відповідності гідрофобних залишків ліганду субцентрам 82-Б4 аполярного центру тромбіну, зв'язування Р1 значно полегшується, якщо рух ліганду в ущелині АЦ відбувається знизу вгору.

2. ВЗАЄМОДІЯ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ ЛІГАНДІВ В АКТИВНОМУ ЦЕНТРІ ТРОМБІНУ.

• Для вивчення механізму взаємодії НМ лігандів (інгібіторів та субстратів пегітидноі природи) з АЦ тромбіну були використані стереоізомери дипептиду То5-Ь-УаІ-Ь-Аі£-ОСНз (Іі) і Тов-П-Уаі Ь-А^-ОСН3 (І2). Цей дипептид містить специфічний для розщеплення

мл/1.1, ем БУДОВИ ФУНЦЦІОНАЛЬНИУ тт ТРОМБІНУ

0=0===<>=0=Ч>='

А0ДАТІМЙ ЦЕНТР ТРОМБІНУ

ТИРCOD

р бал

LEU 99

SER 195

/ВРЮ2

Is’ % \ \

\ Ї е >

иЛТАЛІТИЧНЛ\ qpsssOgiJU 19?. і ■ ТРІАЛЛ \ /ф

£ЕШ %Ы$

Ш 221

'3LУ2щО'1?р 1&3

A3N9&

!LEmQ^n^ у

AEgWsJ

тромбіном складиоефірниіі зв'язок Аг^-ОСНз, а також субсаііти Уаі (Р2) і То.з (РЗ) гідрофобної природи.

Спочатку її та І2 були зібрані із атомно-молекулярних моделей і розміщені в АЦ тромбіну. З числа можліших для них копформацій було обрано таку, що забезпечує стеричіїу сумісність і максимум гідрофобних контактів з субцентрами 52-Б4 тромбіну. Отримані таким чином стартові конформації І] та І2 піддалися процедурі мінімізації енергії. Розрахунки дозволили знайти для кожної досліджуваної молекули конформацію з мінімумом енергії.

Ліганд її має "розвернуту'1 конформацію. Тозильна група (РЗ) розташована перпендикулярно осі молекули і під прямим кутом до бокового радикалу залишка 1_-\'а1 (Р2). Моделювання показало, що група Тов-Ь-Уаі легко займає субцентри Б2-34 аполярного центра тромбіну, даючи задовільні гідрофобні контакти. Така взаємодія "направляє" гуанідин Агб (Р1) в КПЗ з послідуючою його фіксацією і утворенням продуктивного комплексу. В випадку І2 ми спостерігаємо зовсім іншу картину. І2 має "звернуту" форму, фіксовану ішутрішпьомолекулярним водневим зв'язком через молекулу води. Тозильна група і залишок валіну зближені в просторі і утворюють єдиний гідрофобний кластер. Гуаніднноиий радикал Агу (Рі) вигнутий і наближений до гідрофобного кластеру. При моделюванні тозильна група і залишок І)-УаІ (Р2 і РЗ) комплементарно займають субсайти 52-53, утворюючи численні гідрофобні контакти з залишками Ні557., ТгрСОО, ТугбОА, Ьєу99, Тгр215. Але при цьому розщеплюваний зв'язок Агй-ОСНз ліганда стає трохи нижче лінії Ніз57-8ег195 залишків каталітичної тріади, а гуаніднноиий радикал аргініну не може потрапити в КПЗ. Його вигнутий "хвіст" вільно розміщується и глибині ущелини АЦ. Таким чином для І2 реалізуються тільки гідрофобні взаємодії, хоча і досить численні.

Моделювання і копформацііиіі розрахунки взаємодії стереоізомерів дипептиду То5-ЦБ)-Уа1-Ь-Агу-ОСНз з тромбіном показали, що, на відміну від трипсину, исрнинппм і визначальним для тромбіну при утворенні продуктивного комплексу є стерсосіїецифічпс зв'язування гідрофобних залишків ліганду и аполнрному центрі, яке орієнтує гушіідшюну групу Аг£ (Р1) таким чином, що поиадаїочи опісля и КПЗ нона фіксується там найкращим чином. Це погоджується з даними | Пояркопа С.О. та іи., 1987) по кінетиці гідролізу нпніснказаннх дипептиді» тромбіном.

Взаємодія шісокоспспнфічлих НМ лігандів з АЦ тромбіну призводить не тільки до їх ефектнішого зв'язування а аполярному центрі, але і, ймонірі/о, якимось чином може шмипатл на каталітичний етан реакції. За нашим припущенням, щільно розміщуючись н субцентрах S2-S3 відповідні залишки можуть иішшатл на орієнтацію близько розташованого His57 АЦ тромбіну так, що наслідком буде підсилення системи переносу заряду шляхом попороту площини імідалольпого кільця (по пашим даним ИожлипиГі приблизно на 25®). Необхідною умовою правильного розміщення гідрофобного задишка и субцентрах S2-S3 е локалізація Його нід певніш кутом до Р1 субстрати або інгібіторе що займають субцентр S1. Це забезпечується присутністю н Р2 Pro, Gly чи D-Val, які дають вигни пегітндного ланцюга.

3. КОП ФОРМАЦІЙ ІИ РОЗРАХУНКИ І ТОПОЛОГІЯ КОМПЛЕКСУ ДОДАТКОВИЙ ЦЕНТР ТРОМБІНУ - КОМПЛЕМЕНТАРНИЙ САЙТ ФІБРИНОГЕНУ.

Аналізувався фрагмент ArgG7-Lys81 В-лацціога тромбіну (16 АК залишків) що иходнть н ДЦ пгизнавания-зи'язуваїпія, а також ділянка Asp38-Lys44 Аа-лаїщюга фібриногену (7 АК залишкін). Останній належить до КС фібриногену. В результаті копформанійпіїх розрахупкін буц отриманий структурний стан системи ДІД тромбіну - КС фібриногену, який мас значну енергію зв'язку (мал.2, 3, табл.1). В цін системі утворились 4 водневі зв'язки між атомами заряджених груп бокових радикалів АК, ш.о входять в ДЦ і КС (табл.2). Енергія їх взаємодії складає -30.6 ккал/моль. В енергію зв'язку комплексу значний вклад вносить також ирптяжіїшя інших атомів цих груп, так що загальна енергія електростатичного прИтяжішія КС і ДЦ складає -63.5 ккал/моль, вносячи основний вклад п енергію зв'язку. Потрібно відмітити відсутність сгсрнчшіх утруднень у взаємодії фібриноген-тромбін (енергія вап-дер-ііаальсовіїх взаємодії! складає -4.7 кк.іл/моль), що пояснюється великою довжиною бічних ланцюгів взаємодіючих залишкін. Це дозволяє основним ланцюгам молекул цільно розміщунатись па відстані один під одного.

ТЛКЛНЦЯ І. ЗМІНА І-ІітіП ПРИ УТР >і>і-ііііі комплексу ДЦТРОМВШУ -кс ФПіімніогепу.

1. Енергія іиаоюдії -1-х пар атомів обраних груп, що утворюють подисчіі знаки однії а одним -30.8 ккал/моль

2. Загальна енергія електростатичного притягування ДЦ - КС -63.5 ккал/моль

3. Енергія ван-ді'р-нааліїсоїшх взаємодій ДЦ-КС - 4.7 кал/моль

4. Загальна енергія взаємодії між частинами комплексу ДЦ-КС -68.2 ккал/моль

5. Внутрішня енергія ДЦ її комплексі + 10.2 ккал/моль

6. Внутрішня енергія КС п комплексі ( + 13.0 ккал / моль

7. Зміна енергії системи фібриногеп-тромбін після зв'язування -45.0 ккал/моль

ТАБЛИЦЯ 2. ВІДСТАНІ МІЖ АТОМАМИ, ІЦО УЇПОІ'ЮЮТІ. ПОДІІЬНІ ЗВ’ЯЗКИ В КОМПЛЕКСІ дц-кс. '

ПАРИ АТОМІ» ВІДСТАНЬ, X

01)1 /\sp38 ФГ-КН1 Агй73 ТР 2.0

ОЕ1 віиЗЗ ФГ - N2 Іл’хТО ТР 2.2

ОП1 А*р40 ФГ - ЫН1 Агц67 ТР 2.1

Ьу«44 ФГ - ОЕ1 ОІийОТР 2.2

При об'єднанні и комплекс внутрішні снргії чистіш, ЩО ЙОГС складають, збільшуються, так як її цьому иішадку на кожну з частіш накладаються додаткові обмеження. В нашому випадку енергія ДЦ и комплексі збільшилась на 10.2 ккал/моль, а енергія КС - на 13.С ккал/моль. При цьому збільшення снргії и обох молекулах відбувається за рахунок збільшення всіх компоненті» енергії. Таким чином зменшення енергії комплексу фібриноген- тромбіп при зв'язуванні складає 45.С ' ккал/моль. Таке значення енергії зв’язку .скоріш за псе, надто велике.

Одначе слід взяти до уваги, то це число отримане без врахування: по-перше - можливої взаємодії між ДЦ і осиоиною глобулою тромбі і1 у (енергія якої скоріш за псе збільшиться мри деформації ДЦ); ію-другс - можливості існування більш енергетично вигідних станін вільної молекули фібрипоісну, і по-третє - вплину гідратації молекул.

Утіюрення комплексу супроводжувалось зміною початкової структурі! як КС фібриногену, так і ДЦ тромбіиу. Структура ДЦ тро.чбіму (його р-пстлі) зазнала значних змін. Інтактний ДЦ мар вигляд вигнутої иеглі (мал.2). її верхня та нижня гілки розміщуиались одна під одною, а чинш буй направлений вперед. В результаті взаємодії з фібриногеном, петля розігнулась і понернулась приблизно на 90^ навколо горизонтальної осі (мал.З). Найбільші зміни торкнулися положення атомін, що знаходяться на згині нетлі (Аг^73-01и77). Найменших змін зазнала геометрія залпшкіп, іш» знаходяться біля "оснопи" петлі (Аг^б7-ОІу69, ІІо79-і.ух8Т) (мал.2, 3). Ііі'на група атомі», що отримала значне простороне зміщення, підноситься до атомів бічних радикалі» АК залишків, иаиколо Си-атоміп яких відбувалося обертання при розптанні і повороті петлі Атй67-Ьу$81 (табл.З, пп. 1,3,5,1і)). Заряджені атоми бічних радикалів АК залишків ДЦ, що утворюють іоішніі кластер і зав'язують згідно наших розрахунків водневі зв'язки з залишками КС фібриногену (Аг}>67, Lys70, Аі>»73, С1и80), не зазнали значного просторового зміщення (мал.2, 3, табл.З, пп 2,4).

ТЛ'УШЦЯ 3. ВІДСТАНЬ МІЖ ОСНОВНИМИ ЗАРЯДЖЕНИМИ ГРУПАМИ ДЦ ТРОМВІІІУДО І ПІСЛЯ ВЗАЄМОДІЇ З КС ФІБРИНОГЕНУ.

Пари заряджених атомів бічних раднкалін амінокислотних залишків ДЦ тромбіиу Інтактний тромбі II (відстань, Я) Тромбі н в комплексі (відстані), X)

1. N111 Аг«67 - № 1^70 5.6 11.4

2. № 1^70 - ЇШ1Аг«73 10.4 10.0

3. МН1 Лгц73 - МН1 Агц67 10.9 14.9

4. N111 Агй67 - ОЕ1 С1и80 5.9 7.9

5. N2 1^70 - ОЕ1 вІибО 3.3 16.8

6. Ш1 Атй73 - ОЕ1 СІи80 12.5 20.1

М.М.2. БУАОВЛ ji-ПЕТЛІ ЛОДЛТНОВОГО ЦЕНТРУ ТР0М6ІНУ

МШ. иОМГИЕЦС ДЦ, ТРОМБІИУ—UC ФІБРИНОГЕНУ-

4. МОДЕЛЬ ВЗАЄМОДІЇ МОЛЕКУЛИ ТРОМБІНУ ТА ЙОГО СПЕЦИФІЧНОГО ВИСОКОМОЛЕКУЛЯРИОГО СУБСТРАТУ ФШІ’ИІ ІОГЕІ1У.

Опісля розрахунків структури комплексу рскогніції ДЦ-КС він буй "вбудований” у нссь фермепт-субстратпнії комплекс фібрипоген-тромбін. Спираючись па коцформацііпн розрахунки та літературні дані, нами було проведено моделювання на атомно-молекулярних моделях взаємодії фрагмента 1-51 Аа-лгіинюга фібриногену з молекулою тромбіну. Модель фрагменту фібриногену була зібрана з атомно-молекулярних моделей і. "покладена" на мод ель молекули тромбіну (докіпг). Вона містить слідуючі функціональні ділянки: Ргс34-Меі5і - .омплементаршпі саііт, АіуІб-ОІу 17 -розщеплюваний зв'язок, РЬе8-УаІ15, Рго18-Аг^23 - с аііти вторинного зв'язування.

На моделі видно, що зв'язування ДЦ тромбіну та КС фібриногену и комплекс рскогніції направляє вниз частину молекули фібриногену що розташована лі нішо КС так, що нона вкладається п горизонтальну борозенку уторену ^'-петлею тромбіну. На моделі ішдііо, що таке нкладання иріізіюдцть до утворення гідр<к|)обної парі: ТірЗЗ фібриногену - Тгр148 тромбіну і зміщення останнього ішриіш і вверх Сію даним РСА Тгр14Н „закриває вкід в ущелину АЦ). Потім, ймовірно, фібриноген зцерху вниз входить в ущелину АЦ тромбіну і заповнює її. Спочатку він взаємодіє з Б'-зп'лзуїочою зоною тромбіну яка розташована вище АЦ. Далі, переломившись через Б-З місток, молекула фібриногену зверху входить в АІІ, при цьому гуапідіпіовші радикал Аг£ розщеплюваного зв'язку легко потрапляє » КПЗ. І нарешті відбувається розміщення гідрофобних залишків фібриногену, розташованих зліва від розщеплюваного зв’язку, в анолярному центрі тромбіну. Залпшшшш шшляршій центр, поліпептндпніі ланцюг фібриногену робить нетлю і, поиериушипсь, ароматичним кільцем фенілаланіну (Р1іс8) підсилює гідрофобні взаємодії в анолярному центрі.

Таким чнном . ми сконструювали атомно-молекулярну модель комплексу В-ланцюга тромбіну людини (259 АІ< залншка) та N-кінцевого фрагменту Аи-лапціога фіб|шногену людини (51 залишок), що є специфічним ВМ субстратом тромбіну. Моделювання і копформацііпп розрахунки дозволили припустити слідуючий порядок взаємодії тромбін-фіорнопген: 1) утворення комплексу рскогніції ДЦ тромбіпу-КС

фібриногену; 2) укладка (фрагменту 8ег37-Ьув29 фібриногену в

горизонтальну борозенку, що тягнеться від ДЦ до ущелини АЦ тромбіну, з відтягуванням залишка Тгр148 і звільненням входу в ущелину АЦ; 3) вкладання поліпептндного ланцюга фібриногену зверху вниз в ущелину АЦ. ГІрн цьому відбуваєься послідовне зв'язування в S'-зоні, ущелині АЦ, аполярному центрі тромбіну; 4) поворот ланцюга фібриногену після виходу з аполярного центру і розміщення залишка Fhe8 в S3 субцентрі тромбіну. При цьому кожен попередній етап взаємодії обумовлює послі дуючий.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТА ТІ Б

Тромбі)і ефективно каталізує обмежений протеоліз фібриногену. В той же час, порівняння тромбіну з трипсином in vitro по гідролізу специфічних моно та дипептидних похідних Arg, Lys показало, що власне каталітичний потенціал тромбіну не вельми високий (Cole, 1974]. До такого ж висновку привело нас моделювання взаємодії АЦ тромбіну з НМ лігандами. На АММ тромбіну видно, що входження і зв’язування лігандів в АЦ утруднене. Одначе у відношенні гідролізу ряду більш продовжених (трипептидних) субстратів тромбін виявився потужним каталізатором, більш ефективним ніж по підношенню до фібриногену. Іншими словами, при взаємодії з субстратами певних типів (як з НМ, так і з ВМ), утворюються певні умови (чи з'являються фактори) які підсилюють каталітичний процес. Це пов'язане з тим, що на відміну від трипсину тромбін належить до ферментів, для яких дуже важливі численні контакти з субстратом. Вочевидь, багатоцентропе зв'язування з субстратом полегшує утворення продуктивного фермент-субстратного комплексу, підвищує вірогідність найбільш сприятливої для каталізу орієнтації розщеплюваного зв’язку в каталітичній щілині і шляхом тонких конформаційних змін підвищує ефективність роботи каталітичного апарату. Це може бути досягнене двома шляхами:

1. Вплив через ділянку вторинного зв'язування показаний нами при моделюванні і конформаційних розрахунках взаємодії, стереоізомерів дипептиду Tos-L(D)-Val-L-Arg-OCH3 з АЦ та аполярннм центром тромбіну. Стереоспецифічне зв’язупапня гідрофобних залишків в аполярному центрі направляє рух ліганду в ущелині АЦ таким чином, що гуанідинова група Arg потрапляє в КПЗ і фіксується там найкращим чином. Це погоджується з даними (Пояркона С.О. та ін., 19871 по кінетиці

гідролізу вищевказаних дипептидів тромбіном. Але цей засіб штучний і в природі, вочевидь, не використовується. У фібриногену в Р2 стоїть Ь-Уа\, який не може дати потрібний вигин, отже не можуть утворитись хороші гідрофобні взаємодії. '

2-й спосіб - фізіологічний (вплив через додатковий центр). Проведений нами аналіз літератури виявив прямий зв'язок між участю ДЦ і ефективністю каталітичного етапу. При різноманітних порушеннях ДЦ погіршується не тільки зв'язування з субстратом (збільшується Код), але і зменшується каталітична константа кса(;. Отже вірогідне спряження між ними, свого роду алостеричшій вплив додаткового центру на каталітичний.

Моделювання та конформаційпий аналіз ДЦ тромбіну та КС фібриногену показали, що утворення комплексу супроводжується конформаційними змінами направленими в сторону активного центру. Укладка субстрату йде не з лівої сторони від розщеплюваного зв'язку, а від комплексу рекошіції. ДЦ-КС. Нами розраховано структуру і енергетичні параметри процесу утворення комплексу.

Утворення комплексу має наслідком зміну конформації гнучкої р-петлі ДЦ, котра дає водневі зв'язки з КС фібриногену. Потім, як по пружній кулі, конформаційні зміни можуть розповсюджуватись далі. Скажімо па у-ііетлю, а опісля і па активний центр. Утворення комплексу ДЦ-КС ініціює зв'язування молекули фібриногену на тромбіні. При цьому, внаслідок гідрофобного контакту з ТгрЗЗ фібриногену, Тгр148 зміщується, дозволяючи фібриногену увійти в ущелину АЦ. Показано [Серейська А.О., Смирнова І.В., 1991], що розщеплення зв'язку Тгр33-Рш34 фібриногену призводить до драматичних наслідків у відношенні його субстратних властивостей.

Слідуючим кроком є зв'язування фібриногену в Б'-зоні тромбіну яка розташована над АЦ. На моделі чітко видно, що тромбін складається з 2-х доменів. А по гіпотезі ІіиЛоп для трипсииоподібиих серинових протеаз характерний рух цих двох доменів однії відносно одного. Він викликає алостсричні зміни конформації, що призводять до прискорення (полегшення) розщеплення чутливого зв'язку. Моделювання показує, що ноліпентидіпій ланцюг фібриногену взаємодіє з протилежними стінками ущсміши АЦ і наче ".ніпшае" домени молекули тромбіну. Будучи зафіксований таким чином, поліпе»підпий ланцюг фібриногену зверху потрапляє в щілину АЦ. При цьому гуанідин Аі'йІб (Р1) зверху потрапляє

в кишеню перлинного зв'язунання І утворює там зв'язок з Л.чр 189 тромбіну.

І, нарешті, кінцева фіксація субстрату і утворення продуктивного комплексу відбувається після гідрофобного зв'язування Рі субсантів фібриногену в аполярному центрі тромбіну. Ь-УаІ стає в субцентр Б2 тромбіну. Це призводить до "пакування" (заповнення) субдентріи 82-БЗ гідрофобними залишками фібриногену (подібно НМ специфічним лігандам, але ймовірно менш ефективно). Таким чином зв'язування фібриногену в Б'-зоні і аполярному центрі тромбіну, по нашому уявленню, може впливати на каталітичний етап реакції гідролізу шляхом зсуву (зближення) доменів тромбіну (елементи каталітичної тріади знаходяться в різних доменах: Ніз57 і А$р102 в лівому, 5егі95 - в правому), а також шляхом повороту площини імідазольїюго кільця• Нія57 приблизно па 25^. Ці конформаційпі' зміни, вочевидь, призводять до оптимізації просторової структури АЦ і підвищенню ефективності системи переносу протона. Літературні дані на користь припущення про вплив взаємодії ДЦ-КС на каталітичний потенціал реакції: модифікації тромбіну, що вибірково знижують його зсідаючу активність чи відщеплення фібринопептиду А, інакше які руйнують його ДЦ, набагато сильніше знижують його ксаі, ніж І/Код. Показано, що при перетворенні альфа тромбіну в бета форму кса£ знижується в 40.5 раз, а 1/Км в 2.5 відповідно.

В результаті аналізу даних конформаційних розрахунків і моделювання взаємодії фібриногеп-тромбін можна запропонувати слідуючий механізм спряження ДЦ і АЦ тромбіну внаслідок взаємодії з специфічним ВМ субстратом, що складається з трьох етапів:

1. Утворення комплексу рекогиіції фібриногеп-тромбін. Відбувається внаслідок специфічної взаємодії КС фібриногену та ДЦ тромбіну за допомогою 4-х водневих, гідрофобних та вап-дер-ваальсових взаємодій. Призводить до зв'язування та укладки молекули фібриногену на тромбіні.

2. Така укладка призводить до гідрофобної взаємодії ТгрЗЗ фібриногену -Тгр148 тромбіну і, внаслідок зміщення останнього, молекула фібриногену може ввійти і зв'язатись в мілині АЦ тромбіну.

3. Зв'язування молекули фібриногену в аполярному центрі і Б'-зоні тромбіну призводить до позитивних змін геометрії АЦ і підсилення каталітичного стану реакції- На нашу думку, це може відбутись завдяки зсуву (зближенню) доменів Промбіпу і повороту площини імідазольного

а

кільця Ніз57 (воно стае компланарно по відношенню до задишка Бег195 каталітичної тріади).

ВИСНОВКИ

/. Побудована повна прецизійна атошю-молекулярна модель тромбіну. Виявлені специфічні риси просторової структури молекули тромбіну: двудоменність, характерні петлі, ускладнений активний центр, кластери заряджених залишків на поверхні молекули.

2. Для тромбіну проаналізовано взаємодію НМ лігандів в області АЦ і

показано, що на відміну від трипсину визначальними в зв'язуванні ліганду є контакти по ділянці вторинного зв'язування тромбіну, котрі передують зв’язуванню в КПЗ. .

3. Розрахована конформація комплексу ДЦ тромбіну - КС фібриногену. Показано, що між компонентами системи утворюються чотири водневі зв'язки (Аг#73-А$р38, Ьуз70 (31и39, Аг£б7-Азр40, 01и80-Ьу$44).

4. Показано, що зменшення енергії системи фібриноген-тромбін при зв'язуванні складає 45.0 ккал/моль, відсутні також стеричні утруднення. Таким чином доведено, що ця система може бути відповідна за додаткове зв'язування тромбіну і фібриногену.

5. Запропоновано механізм спряження (впливу) додаткового і активного центрів тромбіну, суть якого в тому, що в результаті утворення комплексу ДЦ-КС відбуваються послідовні копформаційні зміни, які направлені до активного центру і призводять до оптималыюго зв'язування молекули фібриногену і підсилення каталітичного етапу реакції.

СПИСОК ПРАЦЬ ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. СереПская А.А., Пехник И.В.,Чикурова Е.В., Карабут Л.В. Действие нативного и модифицированного тромбина на N-концевые фрагменты фибриногена быка // Химия белков: Тез. докл.Всесоюз. симп. -Тбилиси, 1990. -С. 151.

2. СереПская А.А., Карабут Л.В., Смирнова И.В., Щечкин И.Е. О взаимодействии дополнительного центра тромбина с комплементарным сайтом фибриногена // Док. АН УССР. -1991. -N11. -С. 140-143.

3. СереПская А.А., Смирнова И.В., Карабут Л.В. и др. Моделирование взаимодействия дополнительного центра тромбина с комплементарным сайтом фибриногена // Тез.. докл. I Всесогоз. конф. по теор. орган, химии. -Волгоград, 1991. -С. 472.

4. Karabut L.V., Pechnic I. V., Sereyskaya A. A. Modelling of thrombin-fibrinogen interactions connected with a specific recognition // Modelling and computer methods in molrcular biology and genetics / Eds! A.KoIchanov.P. Rapner: Abst. Int. conf. -Novosibirsk, 1990. -P.78.

5. Karabut L.V.,Smirnova I.V.,Shchoechkin I.E. Some aspects of interaction between thrombin anion-binding exosite and fibrinogen // 8th Conf of young scientists on organic and bioorganic chemistry. -Riga, 1991. -P. 263.

6. Карабут Л.В., Щечкпн H.E., Серспская А.А., Четыркина C.H. Особенности взаимодействия тромбина с фибриногеном и специфическими низкомолекулярными субстратами / / Химия протеолитических ферментов: Тез. докл. III симпозиума. -Москва, 1993. -

7. Карабут Л.В., СереЯская А.А. Особенности строения контактной зоны тромбина. Возможные механизмы взаимодействия его с низко- и высокомолекулярными субстратами.

С. 77.

Пошукувач

Л. В. Карабут