Изучение путей синтеза гликофосфинголипидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

г.'У

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. Ы.В.ЛОМОНОСОВА Специализированный Совет Д 063.41.01.

ИЗУЧЕНИЕ ПУТЗЯ СИНТЕЗА ГЛИКОИ)С5ЮСФИНГОЛИГЩОВ

02.00.10 - Биоорганическая хюля, химая природных и . физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сокск&ние ученой степени кандидата химических наук

}2а правах рукописи

ЗАМЯТИНА АЛЛА ЮРЬЕВНА

<Жу

Моокв» - 1992

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московского института тонкой химической технологии им. М.ЕЬ Ломоносова

Кучные руководители)

¡:;н ;;.1Еат кимич&ск'их наук, доцент

доктор химических наук, профессор

Буинег А,С. Шаец В.И.

Официальны© оппоненты: доктор химических наук, ведуь^а научный сотрудник доктор химических каук, профессор

Лолотковский О.Г\ Лрздводигемв Д.Л,

Водуи',:..; организация х

Институт органической химии им. Я.Д. Белинского РАН

Защита состоится 25 янеаря 1933 г. в 15 1:асов на заседании специализированного Совета Д 063.41.01 пр:: конском институте тонкой химической технологии и;-л. К.В. Го.-лоносова по адресу: 112831, г. Кэсква, пр. Вернадского86

С ¡шерортацией иогшо' ознакомиться в библиотеке К5ТХТ ;ш. М.Б. Ломоносова (119331, Москва, м. Пироговская, д, I) горефераг разослан $ 1992 г.

Ученый секретарь Специахлэированного Совета кандкдс-т химических наук, стари.;:;. научный сотрудник

Лютик Л.И.

-I- ■

Актуальность проблема. Неослабевающий интерес " изучению биологической роли инозигсодержащих гликофзсфолипидов делает актуальным поиск более эффективных методов их химического ■синтеза. Методы получения наиболее изученных представителей этого класса соединений - диацилфосфагидклакозитов и их аналогов - достаточно хорошо отработаны. Однако существует еще одна группа природных инозигсодержащих фосфолитадов - сфинго- и гникосфингофосфоинозиты, обнаруженные в высших растениях, дрожжах, грибах и некоторых бактериальных культурах. Хотя подробные сведения сб их биосинтезе и внутриклеточном распределении на сегодняшний день отсутствуют, инозитсо-держацие гликсфосфосфинголкпиды (ГФСЛ) признаны серологически актизными веществами, способными стимулировать появление антител диагнортического значения в сыворотке крови больных гистоплазмо-зом, а также веществам!, осудастБЛЯвщиш защиту тканой некоторых высших растгний от некротических повродд-гнкй. Биологическая актив-кость ""диацияфосфгтиднлшозитов и открытие гликозилфосфатидил-инозитидного якоря у эуксриот с одной стороны, и известное для мембранных гликоефинголипидов и ганглиозндов явление клеточного узназания с другой, не могут не предполагать наличие аналогичных функций у инозитсодераацих ГФСЛ, обладающих структурной аналогией как к первым, так и к последним. Поэтому создание надежного синтетического подхода к получению инозитсодерзшщдас ГФСЛ, окончательное выяснение биологической (хли которых сдергивается сложностью выделения из природных источников и отсутствием синтетических представителей этого класса соединений, могло бы стимулировать интенсивные и:.-еледозак1-к их биологических функций.

Одним из БавяеЯпих этапов в синтезе сфингофосфопипидов из входной молекулы церэмвда с завден.чой вторичной гидроксилькой группой является создание фэсфодкзфлрной структуры, что до недав-

него времени было принято осуществлять двумя путями - либо фосфорилированием 3-бензоильных (реже З-ацетильных) производных церамидов моноалкилфосфодихлоридами с последующей модификацией нецерамидного алкивьного остатка, либо реакциями 3-бензоилцерашд-1-фосфатов или соответствующих шрофосфатов с запущенными спиртовыми компонентами в присутствии конденсирующих агентов. Хотя эти методы дают неплохие результаты, их проведение часто осложняется образованием побочных продуктов вследствие соседства в молекуяь исходных защищенных церамидов ашдной и гидроксильной групп, что обусловливает их способность легко превращаться в оксазоликозые производные под действием болыамства фосформирующих и конденсирующих реагентов. По этим причинам актуальным является применение альтернативных методов фосфорилирования соединениями трехвалентного фосфора - Н-фэсфонатного и фосфиттриэфнрного - для синтеза сфингофосфолипидов Солее слошого строения, а также для фосфитилирования ьторлчьух глдроксилышх групп задащанного шо-инозита и его гликопроизводних.

Цекьв-работы являлась разработка методов создайся фосфодизфир-нсй структуры сфингофосфолипидов с использованием Н-фосфонатного и фосфиттриэфирнэго подходов и их нришнение для синтеза инозит-содержащих гликофосфоеЗинголипидов.

Научная новизна. Изучены условия фосфитилирования з-бензоил-цераьадд Н-фосфзкатным и йосфиттризфириым способами и на этой основе с высокими выходами получены сфингомиелин, сфшгоэтанол-амин, >:х-?кон-аналоги, н,н-динетильный аналог с$ингомиалика и цэракжфосфоглюкоза. Разделены и охарактеризованы диастереомэрньш по фосфору компоненты (н,ы-диизо пропиламино)цианоэтилфосфига 3-б^нзоилцерамидБ, являющегося промежуточным соединением в синтезе сфингофосфолипидов по фос$иттриэфкрному методу. Синтезированы церашдфосфоинозит и его тион-аиалог из рацемических предшествен-

кяков , э также природный манноинозитфосфоцерамнд как обп^гй структурный фрагмент этого класса, сфинголишдоз. Дпя создания фосфоди-эфярной структуры инозитсодертапих гликофссфосфинголипидоз использован высокоэффективный фосфиттриэфирный метсд, который позволил получитк'.искомые соединения с максимальными выходами и наименьшим потеря»® обеих составляющих инозит- (или манкозил-шо-инозит-} фэсфоиеракгада. Осуществлено разделение на энантиомеры рацемпчес-кого I (3),4(6),5,6(4)-тетра-0-бензил-вп-дас1-инозита через диасте-рэомерные ментоксиуксусные производные.

Практическая ценность. Так как ичозитсодержакие ГФСЛ были доступны только через трудоемкие и сложные процессы выделения из редких природных источников, церамэдфосфоинозит и его маннопиранозьчьяое производное могут рассматриваться как первые в этой группе сочинений синтетические субстраты для биохимических исследований. Полученные тион-а»ылоги сфингомиелина, сфшгозтаноламина'к церамидфосфоино-зита являются надежны».гл инструментами для выяснения механизма ферментативного действия ефикгэфосфолипаз, а также зондам!! для мембранных исследований методой 31?-ЯМР.

На защиту выносятся сиедуюцие основные по драения.

1. Изучение реакций фосфитилировалия 3-бензоилцерамида з условиях Н-фосфэк'йтного и фосфяттркэ^мрного методов и синтез на этой основе иззестных сфянгофосфолиггадов и их тион-аналогов.

2. Синтез цераиидфосфоинсзлта и «¡го тион-аналога из рацемических предшественников.

3. Раздэчзние рацешческих асимметрично замещенных производите шо-инозита на энанткомс-ри через днастэреомзрныо соединения, с э-маннозой или ь- >йн г оке иу ксу г но!! кислотой.

4. Симез оптически активного ыанксдасзктфосфэцерамида о использованием на стадии создания фосфодиэфэтаой структуры фосфиттркзфгр-ного метода.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Апробация работы. Матёриалы диссертационной работы частично доложены на Четвертом Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Черноголовка, 19В9) и на научном семинаре в лаборатории профессора ван Бума (j.h. van восп) Цээз г., Лейденский Университет, Хорлеус лаборатория, Нидерланды)

Объем работы. Диссертационная работа изложена на "/SO стр. магинописного текста и содержит5S схем, {Ц-таблиц, и^ рисунков. Она состоит из введения, литературного обзора " Со с фит г риэ фпр.чыП и К-фосфонатный методы в синтезе природных фосфодизфлров и их аналогов", обсуадения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы ссылок на литературные источники) и Q приложений.

I

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

i. Создание фосфодиэ^ирной структура ефщгофосфэлншдов с использованием Н-фосфонатяого и фосфлттриэ$ггрного методов.

1.2. Изучение реакций фосфитилирования з-бензоилцоргшида в условиях К-фэсфонатного метода.

Н-фосфонатшй подход, зак."ючаюаийся в использовании на стад:«! создания фосфодиэфирной структуры Н-фосфснатов, привлекает доступностью реагентов, их высокой активностью и простотой экспериментального-'- исполнения . Этим способом, исходя из рацемического 3-бензоилцерашда (I), км осуществили синтезы дигидросфингошэлина (IG) и его ы,н~диметильного аналога (9) (Схема I). ёосфнгилирова-ние рацемического З-бензоилцерамида (I) проводили с использованием гриишдазолилфосфита, получаемого непосредственно перед использованием из трихлорида фосфора и имидазола, или салицилхлорфосфитом (2-хлсро-4Н-1,3,2-бензадиоксафосфорин-4-он) при 0°С с последующи разяоЕ-энием реакционной кассы смесью воды с тркэтид&микоы. В обоих

Схема х

с.,и,»сн-сн-сн,он PhCoA NH

COC17H,s

(1)

о

II .. +

С«.Нэ,СН-СН-СН,0-Р-0 N HElj, 1 I 1

PhCOO

NH H

¿OC17H3S

(2)

С

Ii

С15Н31СН-СИ-СИ20-Р-0СН2СНаХ PhCOO NH H

О II

C15H3iCH-CH-CH20-P-0CH2CHzX II I

phcoj nh oh

¿0C17H3S (3)-(5)

Г

¿oci7has ( 6 ) - ( 8 )

С15Н31СН-СН-СН20-Р-0СН2СН2ЫНвг ¿H NU (!H

C0C17H3S

(9)

О

» +

L'. sH.iCH-CH-CH,0-P-OCH2CH2M Hec I I I -

OH NH О

¿0Ct1H

3S

(10)

(3,6) X = tWe2; (4,7) X = Cl ; (5) X = <а(/ X =

случаях образующийся Н-фэсфонат (2) выделяли в виде кристаллической триэтиламмониевой соли с выходами 80-9054. Данные 3'гр-ЯМР спектроскопии соединения (2) (3 7,2С м.д., Чтга 626 Гц) свидетельствовали о направленности реакции фосфггилирования в выбранных условиях и отсутствии побочнкх продуктов. Последующее преврацзние Н-фссфоната (2) в Н-фосфонатдиэфкры (3)-(5) осуществляли реакция;® с ы.и-диметиламиноэтанолом» р-хлорзтанолом или тозилатон холина в пиридине ^или хлороформе - омлр) в присутствии в качестве конденсирующих рзагентоз sps, pivci или Npci*. Н-фосфонатдиэфиоьг (3)-(5) без выделения в индивидуальном состоянии окисляли иодом е водном пиридине., а образующиеся продукты (6М8! выделяли колоночной хро-ютогр&фкей. и,ы-Диметилькнй аналог сфингомиелина (9) получали

>

^Здесь и далее приняты сокращения: sps - 2,4,6-триизопропилбензол-сульфсхлерид, Pivci - пивалоилхлорид, Npci - 5,5-диметил-к-оксо- ' : 2- хлоро-1, з, 2—диоксафосфоринан § 1)мар - к,ы-диметиламчношрлдин.

дебензоилированием (6), сфкнгомиелин (10) - деблокированием фосфо-Диафира (8) или из соединения С?) по стандартной методике {Звонкова E.H., 1974].

Среди активирующих реагентов наиболее подходящим оказался Йлорфосфат Npci. Реакции конденсации с его использованием протекали быстро и без побочных превращений с выходами соединений (ЗМ5) tO% и выше. При использовании tps значительно увеличивалось время реакции, что приводило в результате к окислительному фосфорллиро-ванию и уыеньвекию выходов до 50-60%. К тому же результату приводило повышение температуры реакции до 50°. Известно, что смешные ангидриды, первоначально образующиеся при взаимодействии активирующих реагентов (yps или pivd) с Н-фосфонггаш, могут либо участ-, возать в реакции конденсации со вторым ОН-коыпонентом (зта стадия является лимитирующей и, ло-видимому, нуклеофкльно катализируо-. мой), либо вступать в, дальнейшее взаимодействие с избытком активирующего' хлорангидрида с образоьаниеи бисавдлфосфита. Pivci, сироко распространенный конденсирующий реагент в олигонуклоотидном сицте-зе, и нашем случае, по-видимому, действовал как ацилируодиЯ агент, в результате чего наблюдалось образование ' значительных количеств по-Зсмных продуктов и уменьшение выходов целевых соединений до зо%.

С использованием Н-фосфонатного катода нами были осуществлены синтезы сфингоэтаноламина (16) и его тион-аналога (17), заключающиеся во введении по мат еду Анейя lAneja к., 1969) ашноэтильного остагка реакцией Н-фосфонага (2) с {цритилазиридином .. (Схош 2) без участия конденсирующих реагентов, Вось.исходный Н-фосфонат (2) превращался, в продукт (II) с большой храыатографическоП подвиа-hoctiu, регистрируемый в 31Р-1Ш?-спектра без развязки от протонов з виде двух пентетов (в 9,во # ю,и м.д.) для каждого из диасте-реомэров по фосфору с характерной для Р-Н связи Н-фосфэнат диэфгров константой сгош - спинового расщепления 1JrH бэе Гц, Окисление

Схема 2.

| ;Н-ТП С1;Н31СН-СН-СН20-Р-0СН2СН:ИНТг1

(2) ЛИ.-> рьсоо МН а --„

"С1ТН,5

К X

II II

С15Нэ1СН-СН-СН20-Р-0СНгСН2МНТг1 С13НЭ1СН-СН-СНг0-Р-0СН1СН1МНг

рисоА ЙН ¿Н _> РИСОО Лн он

¿ос17н„ ¿0С1ТНЭ5

(12,13) (14,15)

X

с*5н31сн-сн-снго-р-осн,сн2мнг

--> ¿Н ¿И ¿Н (12,14,16) X = С;

¿ОС1ТН

35 (16,17) (13,15,17) X = 5

водно - пиридиниевым раствором нода или а8 к последующее двухэтап-нсо деблокирование промежуточных дизфиров (12) к (13) обработкой уксусной кислотой до фосфата (14) и тионфосфата (15), а затем иэтилатом натрия в мзтаноле позволили получить "сфингоэтанолаяин (15) и его тнон-аналог ,(17). Наличие тконфосфатного фрагмента у соединений ;13), (15), (17) подтверждали данными 31Р-КМР спектроскопии с а * 60-65 М.Д.).

Таким образом, Н-фосфонагкый метод привлекателен отсутствием защп У атома фосфора, устойчивостью Н-фосфонатов, что позволяет выделять их в индивидуальной состояния колоночной хроматограф:!:;!, а таксе простотой последувшх превращений в конечные продукт'.!, которые при соответствующей подборе активирующего реагента (?. данном случае ырсх) проходят быстро и селективно.

1.2. Изучение реакцй! фосфугилировапйя з-бензоклцевашда в усяовчях фосфяттрта£ирного метода.

Альтернативный метод получения дчзфнроз фосфорной кислоты -фое$иттриэфир1аЯ (посредством селективного замещения р-н свпэн

-б- ■

амидофосфнта алкок'силькой функцией) - предусматривает' наличие специально синтезируемого фосфитилирующего реагента. Ранее [Bruzi.it к.б., 1986, 1983] были синтезированы ненасыщенные сфингомиелины с использованием хлор(к,н-диизопрогалашно )метилфэсфита. Нами по этому негоду осуществлен синтез сфннгоыиелина, его диметильного и тионового1 аналогов, а также церамидфосфоглюкозы. Для превращения 3-бензоилцерамида (I) в амидофосфиты (20) и (21) ш применили два фосфитилирующих реагента с различными защитными алкоксигруппамк у агома фосфора? хлор(к,г)-диизопропилашно)метилфосф:п (18) и бис(ы,ы-диизопропиламино)-2-цканоэтилфос$мт (19). Перзый является высокоактивным монофункциональным фосфитилируюцим реагентом, однако удаление метильной защиты с фосфотриэфира проводится обычно обработкой сильными нуклеофилаш - тиофенолом или тримзтиламином, что ограничивает его использование. Цианоэтильная защитная группа легко удаляется в мягких основных условиях по механизму о-элиминирования.

Общая схема синтеза заключается в конденсации 3- бензоилцера-йида (I) с фосфнтллирующим реагентом (18) в присутствии третичного амж тч реагентом (19) в присутствии 1н-тетразола или его диизо-Пропгламмониевой соли (Схема з). Продукты рассматриваемых реакций - амидофосфиты (20) и (21) получали в чистом виде после колоночной хроматографии с выходами более 904. Затем их вводили в реакция с и,я-диметиламиноэта.нолом или тозилатом холина в присутствии 1,5-2 эквивалентов тегразола. Единственными побочными продуктами (при наличии в реакционной сизси еледои воды или других протонных примесей) на стадиях фосфитилирования 3-бензоилцерашда и последующей конденсации амидофосфита с гидроксилсодержащим компонентом являлись продукты гидролиза активированных тетразолоы амидофосфнтов (20) и (21) - Н-фосфонатдиэфиры (22) и (23) соответственно. Однако при соблюдения условия сухости реакция амйдофосфцтяой конденсации

обычно проходила с выходами 80-90%, судя по отнопекию сигналов в 31Р-ЯМР спектрах фосфиттриэфиров (24)-(27) (в no-ns к.д.) и продуктов гидролиза - К-фосфонатдиэфиров (22) <5 ю,34 и ю,74 м.д., глри 706 Гц) и (23) (í 8,22 и 9,33 м.д., hpí¡ 718 Гц).

(18) или

^NOPr).

с13нэ1сн-сн-сн,о-р:

(1, х«) (19) , phc0¿ nh 0r -

¿OC17«as

Схема 3.

cishjjCH-ch-ch^-p-or -> II I

phcoo nh h

COC1?H,s

(20,21,21 )

г

phcoc nh

¿0c17h3

МП

сцнэ1сн-сн-сн20-?г ____i I. OR *

(24-27,28 )

(22,23)

_> с18нэ1.сн-сн-сн20-р-0|?

¿H'

PhCO¿ NH

¿OCt

7нэ

(29-31,32 )

~>ClsMJtCH-CH-CH,0-f>-0H ¿R'

¿0ctthss

phcol! hh

(6,33,3* )

-> C1SH31CH-CH-CH10--P--CH H¿ NH A

H35C17¿0

(35*)

(28*,32*,34*) r' =

(9,10) (18) « IPr2M-P(0Me)Cl (Ю) = (IPrjNJ^POCKjCHiCN (20,22,21,25,29) R = hn

(21,21*,23,26,27,28*,30,31,.12*) R = CH,CHjCN (6,24,20,29,30) N1 = CKjCHjNMe, (25,27,31) П' = СН2СН2М+Ив,Т»~ (33) Я' «! CHíCHjN^Msa

^^^ / JJ

Ae

AcO

Знаком * с настоящем разделе отмечены соединения, цзрамидная составляющая которых имеет >эритро конфигурацию, остальниэ соединения - dl-эритро.

Последующие реакции окисления фосфиттриэфиров <24)-(27) трет-бутилгидроперекисью или элементарной.серой (Схема. 4) проводили без выделения их в индивидуальном состоянии, в результате чего были получены фосфаттриэфиры (29)-(31) и тионфосфаттриэфиры (36) и (37) соответственно. Последние достаточно было обработать трет-бутил-шш триэтиламином для удаления могильной и цианэтилькой защитных групп с тионфосфата. В аналогичных условиях были деблокированы фосфаттриэфиры (30) и (31). Фосфорильное соединение (29) бслео устойчиво и требовало применения либо более сильного нуклеофияа, либо повышенной температуры и более долгого реакционного вреыани для снятия метильной защитной группы с фосфата. Следует иметь в пиду, что' удаление защитных групп проводится с соединзюй, представляющих собой лабильные фосфот риэфпры з-бекзоилцэраглада, способные к легкому замыкания оксазолииоього цикла. Б связи с этим такие операции нужно проводить в достаточно мягких условиях. Поэтому применение в данном случае фосфитилируюцого реагента (19) с цианэгильной защитной группой у атома фосфора признано наки наиболее удачным.

Схеца 4,

г

и .

О С15На1СН-СН-СНг0-Р-ОСН2СИ2Н Н®, Т»

(25,.:?)--!!—> РЬСОО г;н ¿я

¿ОС17Н,5 (36) Й > №

(37) Й = СН2СН,СН

2 «;

ii 4 i! .

с-1. ИзхСН-СН-СН20-Р-0СН,СН2Н Н», С15Н91СК-СН-СН20-Р-0СН2СН2К Н*э

—> 1'ьсоА ¿н ¿" --> ¿н т ¿_

¿ос17нг, ¿ос17н3,

(38) (39)

¿-Бензоильные производные сфингомиелина (33) и тион-сфннгсьиеяина (38) превращали в искомые продукты (10) и (39) стандартной обработкой 0,1 н раствором метилата натрия в метаноле.

Чистоту и химическую индивидуальность промежуточных и конечных соединений подтверждали данными JH-, 31Р-ЯМР, ИК спектроскопии. Так как интерпретация ХН-ЯМР спектров тионфосфатных производных рацемического эритро-з-бензоилцерамида осложняется наличием дополнительного хирального центра - атома фосфора, для тион-сфингомиелнна (39) и его з-бензоильного производного (38) записывали также спектры 13С-ЯМР и двумерные протонные спектры корреляции химических сдвигов ^^Н - ЯМР (cosy).

Имея задачей расширение круга субстратов, вводимых г реакцию фосфя'илирования по фосфиттриэфирному методу, мы предприняли также синтез одного из возмсюшх структурных аналогов сфингофосфоглико-яипидов, выделенных, из грибка яааасХа tiava. Синтез 6-0-(2-N-cTe-ароил-о-эритро-сфингаидаьг-фосфэЬр-в-гяюкозы (35*) был осуществлен, исходя из оптически чистого о-эритро-з-бензоилг-к-стеароил-сфинганина (I*). Схема 1в-тетразол - катализируемой конденсации амидсфосфита (21*) с используемой в качестве второго гидрокснльно-го компонента 1,г,з,4-тетраацетил-р- г>-глюкозой аналогична ранее обсуаденной (Схема з). Тризфирфосфит (36*) без выделения из реакционной массы переводили в фосфат (32*), затем двухстадийным удалением защитных групп - иианэтильной с фосфатного центра до фосфодизфнра (34*) и бензильной и ацетильных, группировок традиционной обработкой мгтилатом натрия в метаноле получали конечный продукт - церашдфосфоглюкозу (35*).

Таким образом, мы пришли к заключении, что для создания фосфо-диэМирной структуры сложных с£ингофосфолипмдов из исходной молекулы 3-бензсилцерамида более эффективным является фосфиттриэфирний метод как вследствие высокой реакционной способности фосфигилирую-цчх реагентов (в нашем случае (18) и (19)) и промежуточных амидо-фосфетов (20) и (21), так и по причине отсутствия побочных превращений ч быстрого протекания реакций фосфитилирования и.конденсации

с участием нецерамидксго гидроксилсодержащего компонента.

Особого внимания, на наш взгляд/ заслуживает изомерия по атому фосфора. Известная для фэсфолипаз стереохимическая субстратная специфичность к хиральному фосфорному центру делает актуальным использование изомерно чистых фосфорных аналогов для выяснения биологических функций фермзнтов, а также для мембранных исследований ка хиральных фосфолипидных бислойных матриксах. В связи с гтим встает"задача разделения изоморных по фосфору смесей как тиок-аналогов, так и промежуточных в их синтезе соединений, имеющих трехвалентный хиральный атом фосфора.

Из всего набора синтезированных хиральных по фосфору производных достаточной: для препаративного хроматографяческого разделения райн'яцей в подвиетоста обладали только (Rp)- и (Sp)- дластереомзрц (ы,1;-диизог1роп!5ламтю');Щ1аноэтилфосфита (21*),, которые разделяли жидкостной koijtetioWoft хроматографией. На основе анализа ХН-Й!.Р спектров (Табл. 1) бь!ло сделано предположение, что причиной неодинаковой хроматографЯЧеСйой подвижности диастереоморов является различие в пространственной организации колекул около фосфорного центра. Поэтому для обоих диастереоазров были построены компьютерные изображения (здесь не приведены) и оптимизированы геометрии ыодсу.ул по отнокению к энергии путем расчета на ;'вм рс по программам ALCHEMY-IX (TRIPOS Associates) И FCMODEL (SERENA Software).

Действительно, в силу особенностей пространственного расположения, н-изопропильная и цианоэтильная группы (sp)- диастереомэра прете-рпеЕазт, по-видимому, более сильное влияние со стороны I-OGHj- молекулы церамида, в то время как то ¡со группы (кр) -диас'тереомера испытывает мэньвзе возмущение, со стороны цера-кндиой- части молзкулы. При сравнении расчетных данных (Табл. 2) видно, что (sp)- диастереомер, обладая больсим по сравнению с (Кр)- даастереомером дипольным моментом, имеет также большую

плоцадь полярной поверхности. По--видимо><7, это определяет различия в хро мат о г ра фич е с к ом поведении соединений, менее подвижным из •которых в выбранных нами условиях хрсматографирования является диастереомер с (8)- конфигурацией фосфорного центра.

,„ „ , Таблица г.

Лагиые [а]£, Р- и •'Н-ЯНР спектроскопии

(Нр)- и (Бр)- диастереомеров ашдофосфата (21*)

п£ г™ 120 31р. ЯНР, 8 ,М.д Ч^ЯМГ, 8, М.Д. (СГС1,)

4*СН3, 180-РГ 2*СН, ,1во-Рг 1-сн2, Сег а-сн2, СЕ Ш

0,55 +10,3° 147,6 1,06 2Д 3,50 М 3,72 ХВ '1.2 3 ГЦ 3,87, 2Т '1,2 12 ГЦ 6,12 Д

0,64 +44,5° 14В,4 1,10 Т 3,54 М 3,77-3,90 М 3,77-3,90 К 6,16 Д

ТСХ - в система гоксан - зтилацэтат - тризтиламхн, ю-.2-.о,5

спектры записаны в сос1, при 200 >Тц (нэь-200, втког).

Таблица 2.

Расчетные дшпшэ шпшмизацга! анергии молекул (Яр)- и (бр)- диастереог^роз амздофосфита (21*)

конфигурация диастереомера (21*) 'V <у

Площадь неполярной поверхности (КВ. ЛИГ) 71В,8 699,2

Площадь полярной поверхности (КВ. /НР). 75,5 82,3

Площадь общей поверхности (КВ. АНТ) 794 781

Диполытй момент 7,43 9,14

Минимальная потенциальная энергия ; 25,18 .30,66

Энергия напряжения (ККАЛ/МОЛЬ) 3,774 9,250

Таким образом, на основании анализа ^-ЯМР спектров и оценки энергетически выгодных конформацка диастереомеров по фосфору амидофосфита (21*) оказалось возможным предварительное спекулятивное отнесение абсолютной конфигурации хирального Р(иг)-центра.

-142. Синтез инозитсодерхашх гдикофосфэс$ингояипидов.

Основными структурными единицами природных икозктсодержащцх гликофосфосфинголишдев являются церамидная (обычно 4-гидрокси-сфинганин, ы-ацилированный гидрокси- или дегидроксижирныыи кислотами) и углеводная (шо- инозит с присоединенной по 2 и/или 6 гидроксилам олигосахаридной цепью). Церамидная и углеводная составляющие соединены через i-ОН обоих компонентов фосфодиэфырной СВЯЗЬЮ [Laine R.A., 1586; Lhomae О., 1990; Barr К., 1984].

Имеются данные, что гликофосфосфинголипиды, являясь компонентаm клеточной мембраны, выполняют роль церамидно - гликанового якоря для гликопротешов [Ledarkremer я.м., 1990). Обнаружено близкой структурное сходство якорной части церамидсодержащего лкпопептидополчгликана из Tripanosoma ccuzt к гликозилфосфатидил-инозитному мембранному якоро клеток эукариот, что предполагает их функциональную аналогию iLederkreoer R.M., 19901. В связи с отсутствием синтетических представителей этого класса соединений, что, несомненно, .сдергивает окончательное выяснение их биологических функций* мы предприняли синтезы церамидфосфоинозига, его тион-аналопа ш ^шзганескк активного маккоккозитфэсфоцерамада как потен-даальных .лувбгграхйв для биохимических исследований.

ал. Фшсеа дерамвдфэсфошюаита и «го тион-аналога.

Шарвыи лоетнэсадм »капом к синтезу более сложных структур являлась ¡проверка .дейстьия катода (в нашем случае способа создания фэсфозфиргах связей мзад 2-ОН цорамида н вторичной гадроксильной .группой 'Аио-икозкткого (комаонента) на примере более простых гродственных соединения, £ ¡именно, церамкдфосфэ инозит а и его хион-салалога■ сжаохьзоьънлеи¡фосфит триэфирного метода.

¿Скнтез,.о<;уЕест£лащ, ¿исходя .из амидофосфита (21). Это с-оодине-гние являетсл.сыееъю '.четырех ¡дидстереомеров (две пары .рацематов.) из-за наличиядаух асаьз^рических .Фрагментов -молекулы - ,р&цеми-

Чггского эритро-церамида и хирального атома фосфора, благодаря чему оно дает дублет в спектре 31Р-Я№ и обнаруживается в гиде двух пятен с д 0,10-0,12 на ЧСХ. Конденсацией амидофосфита (21) с I(3),2,4(6),5,6(4)-пента-0-ацетил-ял-лдао-1шозитом в присутствии 1Н-тетрязола получали с выходом во-9о% фосфиттриэфир (40) (Схема 5). Последний представляет собой еще более сложную смесь ' восьми диастереомэров (четыре пары рацематов) вследствие присоединения рацемической молекулы то- инозита. Существование нового асимметрического фрагмента, пространственно сближенного с атомом фосфора и на него' злияюдего, фиксируется появлением в. спектре ПР-ЯКР четы-рэх сигналов (двух дублетов) в области, характерной для фосфиттри-офиров. Для последующего превращения в продукты пятивалентного фосфора_фосф1ттр:»эфф, (40) без выделения из реакционной массы обрабатывали трет-бугилгндроперекисыэ или элементарной серой.

(21) Схема 5.

I

Г.'ССИаСИаС1

ОЛо

ОЛо

-01я-сн-ен-с1вна1

n4

________П=0-Р-0-СНя-СН-СН-С1аНэ:1

■'•■■ ¿серь -> С!?1 1 Лн ¿Я"1

(40)

N>1

¿ОС,,Из

(41-43)

Я-О-Р-П-СНа-СН-СН-С^Нз!

СП1 ¿ Ан ¿я3 СП1 (44-47)

Г?1 й3

41 ,44 Ас скаснясп РИСО

42,45 Ао н РЬСО

46 Н и риса

43,47 Н и н

Реакция окисления фосфнттрнофлра (40) трет-бутилгидроперекисью проходит-быстро (20-30 мин, 20°), тогда как реакция окисления серой идет медленно и в более ¡гостких условиях (б ч при 50°С). Интересно, что (нр)- и (8 )- диастереомеры тионфосфаттриэфира (44)

Таблица з.

Данные 31Р-ЯйР спектроскопии соединений (40)-(47).

Соедин. 8, м.д. Соединение 8, М.Д.

(21) (40) 147,6, 148,4 (1:1) 142,63, 142,83, 143,22, 144,03 (1:1:1:1) (44) смесь диасте-реомеров но фэофору (45) менее подвижный диаотэреоыер €8,51, 69,32, 70,33, 71,02 (1x1:0,6(0,6) 5«,31

(41) 0,49, 0.'79, 1,10 (45) более подвшкаый 60,0

(42) (43) 1,72, 1,89 1,44 диастерэсшр (.46) (47) 60,38 57,14 58,13

образуются в неравных количествах с преобладанием одного из них, вероятно,,из-за стерического влияния объемистого . атот серы. Об • этом свидетельствует наличие в спектре 31Р-ЯМР (Табл. 3) тион-фосфаттриэфира (44) четырех сигналов, соответствующих четырем парам диастереомэров б соотношении 1:1;0,б:0,б, и то, что после обработки тркэфкра (44) триэтиламином дня удаления цианоэтильной защиты образующийся диэфир (45) проявляется на ТСХ двумя пятнами с соотношением интексивюстей з»2. Для получения интерпретируемых спектральных данных диастереомеры по фосфору тионфосфата (45) разделяли колоночной хроматографией. Удаление цианоэтильной защитной группы с атома фосфора промежуточного фосфаттриэфира (41) проведай тризтид- ихи трет-бутидамином с получением пентаацзтиль-нсто тод{:з в одного 3-бекзсидцерашдфзсфоинозита - фосфодиэфгоа (42). Окончател«ноо удаленна защитных групп с фосфодиэфироЕ (42) и (45) осущйстагяни традиционной обработкой нет плат ом натрия в метаноле и получали йскокыо церамидфосфоинозит <43) и его тион-акалог (47) соотегтстеенш. Химическая чгстста и строение искомых и промежуточных соединений были подтверждены спектральными 31Р-, . - давдадка.

-.172.2. Сгаггез mnicинозитфосфоцера).адаJ.

Следующим этапом исследований, направленных на получение инозит-содеркащих гликофосфосфинголит'дов, явился синтез 1--о-(2-к-стеарсил-р«^ритро-с4ннганш)-1-о-фосфо-2-о-(а-о-кпннопиранозил)-зпч15;с>-иноз:1та рак общего структурного фрагмента этого класса соединений. Схема дагеоа манноикозитфесфоцераинда (48) лключает два основных этапа: получение оптически активного манкозил-шо-инозита с незащищенной Гидроксильной группой в пэр-зом положении цкклитной части молекулы и эго конденсация с амидофосфитным производным о-эритро- з- бензоияцерамида в условиях фосфиприэ^арн ого гятода с последующи удалзни-ом заг5!тних групп.

В работе использовано два подхода для получения хирально активного маннсзил-шр-инозита. Один из них заключается в первоначальном глнкоэшшроватш рацемических производил: icio- инозита соединениями р-маннозы с получением диастереомгрной смеси гликозидов, которую затем разделяот на индивидуальные дкастереомеры [Степанов А.Е., 1976J. Такая схема привлекательна сокращением числа стадий синтеза за счет одновременного введения углеводного звена и оптического расселения. По другому способу расцепление рацемического асимметрично законного производного пю- инозита на энантиомеры осуществляли через диастореомгрные эфира >.:энтокс:гуксусшй кислоты с последующим глхкозклировагшам нужного экантиомера.

$ Основная часть настоящего раздела работы была выполнена диссертантом в лаборатории проф. Ван Бумд (J.n. van Boon, Gorlaeua laboratories, Лейденский Университет, Нидерланды).

ВпО Ч4

ВШУ 1

Di

nO^V^-!0

X

(49) R = Д1 I = -CH2-CH=CHa (51) X—Ft К*=Аа

(50) Я = Cr в -CH2 - СН=СН - СН3 (52) X=SEL# Й3=Эх

Синтез маннозил-лда-инозита по первому способу осуществляли, исходя рацемических пентазамещенных производных .wo-инозита со свободными гидроксильными группами при С-2 - (49) и (50). Для блоки- ' рсвания положения КЗ) мы воспользовались алкильными защитами двух типов - аллильной (г. * all. (49)) и кротильной (r » cr, (50)), кото-, рые в настоящее время широко применяются в химии фосфорных эфиров то-инозита. Поскольку ранее было описано получение и разделение диастереомерных маннозидных производных моноаллилтетрабензилового эфира дао-инозита [Eile c.j.j., 1989), представляло определенный интерес изучить возможность использования кротильного аналога (50) для синтеза оптически активных маннозидов на его основе.

Гяикозилированием аксиальной гидроксильной группы при С-2 рацо-" мических пентазамещенных шо-инозитов <49) или (50) a/p-D-raraonnpa-ноаилфторидом (51) з присутствии затрата трехфтористого бора получали неразделяемые смеси диастереомеров [(53 а) к (54 а> J или [(55 а) и (56 а)) соответственно. Их последующее деацетилировыгоэ привело к диастереомсрам со свободными гвдроксильным! группами при С-2 мажо-пираногилькой части молекулы ((53 б; и (54 б)], успешно ра?деленным колоночной' хроматографнеЯ иг. кнцязадусльниз (53 <5) п (54 6) или 1(55 б) и (56 б)], не прояпквшм различий кк' в яроматографаческоД подзижкосги при тсу, ип б химических сдвиг&х резонансных сигналов в гзС-ЯМР спектре.

Яа предположили, чго такое, рагаюцзе исход разделения отличие в хроматографическом поведении двух пар диастереокоров с различны/« защитными группами при C-I ш?-инозита [(53 б) и (54. б)] (к1 = All),

Вп

^-ОВп \ ОД1

ВоО ?

Вп1

13п

(53) а) я*=дп,

(54) а) |, к*=Дс

б) Я»=Д| I , я»=н

б) гс*=д| |, гг*=н а) йа=А1I, я'-Вп

г) й^н, па=вп

ши

(55) а) к2=Ас

или

(56) а) К^Сг, Ка=Ае

б) п'-сег, гг3-н

в) п'-сг, г) в*=н, п^вп

б) Й^С", и3=н

в) к^сг. па-вп г) п1=н, пя=вп

и 1(55 б), (56 б)) (Н1 » сг) связано с различия».« в пространственном строснкн молокул гликозидов. Поэтому для названных пар диастереоме-ров, а тахгз для пар (.(53 а) и (54 а)], [(55 а) к (56 а)), [(55 г) и (-55 г)] были построены компьютерные изображения и проведена итерационная оптимизация геометрии молекул путем расчета на твм рс по программе льсненг-и (тагроз азвос1а1еа). Наложением изображений манно-зидов одного оптического ряда [(53 б) на (55 б) и (54 б) на (56 б)] показано, что, при сохранении конформации тотрагидропиранового цикла, замена алдильной группировки на кротияьную ведет к существенному пзмэненко пространственного расположения бензильных групп. Такое изменение геометрии молекул долото приводить к перераспределению полярных н-пеполярных областей поверхности (расчет ведется с учетом ван-дор-Ваальсовых взаимодейстьий), а, следовательно, к изменению дшгаяыюго момзнта, что реоавдим образом сказывается на хроматогра-фическом поведении диастереомэрных соединений.

Далзе, Зе-ггилиосванкем свободных 2'-0К групп маннозида (53 б), содержащее нужный знант помер, или диасгереомерной смеси [(55 б) и 156 6)] и последующим удалением с 1-ОН то-инозигной компоненты аллильной ю соединения (53 в)) или лабильной к основаниям кротидь-ной (со смеси (55 в), и, (56 в)) защитных группировок получали желаемый маннозим.5лз~инозит (53 г) или смесь маннозидов [(55 г) и (55 г)]. Для смеси дмагтереоыероь (55 г) и (56 г) в выбранных условиях хроматографирования не удалось добиться эффективного разделения из-га незначительной разницы з подвижностях.

В то :ке время га обратились к удобному методу оптического разделения произзодных ьзю- инозита до его введения в состав гликозидое с 1>-маннозой. Для зтого оацемический диол (57) превращали в диастерео-марные эфиры менюксиуксусной кислоты (58) и (59) реакцией с (-)-ь~ментоксиацетилхлоридом (Схема 6).

ВпС ™

в ыг-Т^Н

ВпС/

(57)

йпО °Н

ЪпО^Т^^у <— Впс/

ВпО 9й

МгЛАс

(53)

БпО ™ ЪгХУ^Т^Н

БпСУ

Схема 6.

АсМпЮ 9й

ВпОч^^ч^ОВп

ВпО-

(59)

(62) (60) тыс = ¿-иентоксиацет.чл, Злоие

(61)

4-метохсибекзнл

Диаотереомер ¡53) был Еыделен в чистом виде многократной кристаллизацией из смеси этидацетат - петролеЧнай ьфир, оптический антипод (59; выделяла из маточника тем на способом. Независимое удаление с обоих соединений щелочелабильной ментоксиацетильной группы привело к. энантиомерно чистым диолам - известным з,4,5,б-тетра-С- (50) и

1,4,5,5-тетра-О- (61) бензиловым зфирам -ял-лш-инозита сс значениями специфического оптического вращения lal^0 -2i,7° и t<x]|° соответственно, что удовлетворительно коррелируется с литературным! данными [shvet3 v.l., 1973]. Последующее опосредуемое оксидом дибу-тилолова региосалекгивное алкилирование соединения ¡60) 4-ме?окси-бензилхлоридом в присутствии фторида цезия и иодзда натрия привело к производному то- инозита (62), имеющему свободную для макнозилирова-ния ка последующих стадиях гидроксильн^ю функцию при С-2.

Для образования глихозидной связи между 1-0-(4- метоксибе.чзил)--з,4,5,6-тетра-0-бензил-япчзю-инозитом (62) и тиозтилманнозидом (52) примэнял:Гдругую активируюяую систему - н-иодсукцинимид и каталитическое количество трифгорметансульфоновоя кислоты (Схема 7). Анализ продуктов реакции маннозилкрования с помощью 13С-ЯМР спектрсскогши показал присутствие двух продуктов конденсации (два резонансных сигнала 90,49 и 99,22 м.д., соответствующе гликозиднкм С-11, и удвоенное количество сигналов от остальных атомов С). Наиболее вероятным объяснением являлось образованно не только ожидаемого 1,2-гране- (63 а) но и 1,2-щю- (64 а.) гликозида. Возможность такого стерического

Схема 7.

(52) + (62)

(63) а) ,11=Пг, n3=DnOU» 5) ггА=н, к2=!Дпон» В) R1=Ds, Па-Я

(64) а) Ra=BnOHe

б) R»-=H, Ra=BnOMo В) R*=D=, Ra=H

выхоца катализируемо? исками иода реакции глькозилирсваяии упоминается з литературе [Elle c.j.j., 1991]. Для подтверждения полученного результата смесь аномеров подвергали деблокированию бензоильных групп при С-2 маякопирсксзильной части молекулы и, после разделения колоночной хроматографией, получали i,2-rpdHc- (63 б) и 1,2-тс- (64 0) гликозидч с выходом si% и 25% соответственно. Структурную идентичность аномеров подтверждали 1ЭС-ЯМР спектроскопией, конфигурация гликозидной связи была определена на основании изучения данных 1Н-ЯМР спектроскопии (Табл. 4). Сигнал гликозидного протона н-1" а-свяганкого шнкоэил-мго-инозита (63 б) сЗС_1. ico,в м.д.) проявлялся при s,4i м.д. чтс находится на о,б м.д. в более слабом поло по сравнению с соответствуювим сигналом гликозидиого протона ^-связанного производного (64 б) (й^, 98,8 м.д.).

Таблица 4.

Данные спектроскопии соединений (63) и (64),

5, м.д. (cdcí-), 2со ЬГц

Соед. Конфиг. a-i1 Man Н-2' Man

ьз aj £4 aj а Р 5,39 Д,J^ 2 2,сГЦ В области 4.-33-4,95 5,77 T,J„ ч 2,2 ГЦ, с ».3 5,96 М, 0 1Н ,ЗН

G3 б СЛ б и Р 5,41 Д, J 1,Ь' ГЦ В Области 4,35-4,97 В области 3,81-4.92 В области 4,35-4,97

63 в f 4 в а Р 5,41 Д, J1 g 2,0ГЦ В области 4,38-4,9 4 5,68 Т, J2>3 2,5 ГЦ 5..9S Д, J . 3,1 ГЦ

После удаления пара-ыетоксибэнзильяоЯ группы со смеси маштидов (63 а) и (64,а), аномеры (63 в) и (54 в> разделяли жидкостной колоночной хро^агографияй.' «-Конфигурация гликозидеой связи былг приписана относительно более нсдшинсму поодукту (63 е; 99.4 м.д.;, сигнал гликозидного протсна которого находился на о,с-о,7 м.д. ъ более слабом поле по сравнению с сигналом р-сзязаккогэ конформэра (64 в) (8С_Х, ээ,1 м.д.). Соотношение а/д аномеров, обра-

зующихся в ргакции гликозилирования, составляло 3:1. В результате расчета энергетически выгодных состояний молекул гликозидоз по стандартной программе были обнаружена отличия в конформациях Сахаров: теист для й-гликозидов (63 а, б, в) и кресло С1 для р-конйормзров (64 а, б, в).

. Для создания фосфодиэ£крной структуры был выбран мягкий и эффективный фосфиттриэфирный метод, который хорошо себя зарекомендовал в фосфихилировании как вторичны;: гидроксильных групп то- инозита так и 1-он з-защищекных церамидов. 1н-Тетразол - катализируемая конденсация амидофосфита (21*) с маннозил-лио-инозитами (53 г) или (63 в), имеющими свободные гидроксильнке группы при С-1 циклитной части, молекулы и различные защитные группы (сензильную или бензоильную соответственно) при С-2 маннопиранозильного остатка, привела к образованию прокезуточних фосфиттриэфиров (65) и (66), которые без выделения окисляли трет-бугилшдропарекисью до соответствующих фоофат-триэфиров (67 а) и (68а) (Схема з). Так как фосфаттриэфиры 3-бензоилцерамида довольно неустойчивы при хроматографировамш, вышеуказанные соединения без выделения в индивидуальном состоянии обрабатывали триэткламином для удаления цианоэтильной защитной группы с фосфорного центра, в результате чего были получены фосфодиэфиры (67 б) и (68 6) с 50* выходом каждый, в расчете на (21*). Для завершения синтеза проводили двухстадийное удаление з'агдатных групп. • Традиционной обработкой метилатом натрия в метаноле получали церамидфосфо-инозиты (67 в) и (68 в). После тщательной хроматографической очистки зба фосфата переводили в натриевые соли и осуществляли удаление 5ензильных защитных групп гидрогенолизом над ра/с в смеси трет-¡утанол - вода, получая кристаллический фосфодиэфяр (48) с выходом (3%. Чистота и структурная индивидуальность соединений (48), (67), 68) были достоверно подтверждены данными записанных при 300 МГц 3С-, 31Р- и 1Н~ЯМР - спектров.

V П|>1

У ОЙ1 ВпО-^М0,.

В пХУ

(53 Г) Е*=Вп

или (63 В) В1=Вз

А: н

ксснаснасг «Вх

(21*)

^-ОВп \ ш'

КССН2СН2!

(65)

(66)

СЕз

^СЙ2

Я си1

|?*0 ?

оя3

(67) а) я-=а7=Вп,

я"=-снасн2сы б) к1=иа=вп,

B) Р*=(?а=Ог>,

(68) В)

Й"=-СН2СНгСМ

C) я^'-вх, и'=вп, а-=н е) к1=(г3=й'»=н, *я=а->

(48) и^а^з^и^

Таким образом, разработанные б касгояпэй работе способы построения фосфодиэфирной структуры сфичгофосфолипедов - Н-фосфонагный и ф-'сфкттризфирный - являются надежными и эффективными методам:: их хиютескогс синтеза на. основе З-бензошщерамидов, а также получения тз.'онфоофагных аналогов. '®осфигтриэ$ирнкй подход признан нами наиболее? удачным, для синтеза глнкофссфссфннголтэдов.

-25-B Li В О Д Ы.

1. Изучены реакции формулирования з-бензэилцерамида з условиях Н-фосфонатного и фосфиттризфнрного методов, с их использованием синтезирован набор сфннгофосфолипидоз и их ткон-аналогов.

2. Впервые синтезированы простеЯимй представитель инозитсодержаизга гликофосфосфинголиподов - церамидфосфоинозит и его тион-аналог из рацемических.предшественников.

л. Осуществлено разделение на знантиомеры рацемических асимметрично замененных производных /сто- инозита через дкастероомерные ментскси-уксусныэ производные.

4. Впервые получен . синтетическим путем оптически активный мэлшопнозптфосфзцорагглд.

Оспозпчз"рззудьтати рзботн шлогетш в следуют публикациях:

1. vpaiiTosa A.D.J, Бугаев А.С., Звонкова Е.Н., Швец В.И. Н-фосфопатчий к фосфиттриэфирный методы получения- сфикгофосфо-липидоз.,'/Биоорган. химия - 1991 - Т. 17, н и - С. 1562-1573.

я

2. Frantova A.Yu. , Stepanov Л.К., Bushnev A.S., Zvonkova E.N., Chvats V.I. The synthenls of cereraida phosphoinofiltol. //Tetrahedron Lett - 1'9Э2 - V. 33, M 24 - Р.3з39-3542.

3. Замятина Л.»., Буше в А.С., Степанов А..Е., Ззонкова Е.Н., Шзец В.И. Синтез цорамидфосфоинозита и его тион-аналога. .//Еиоорган. ХИМИЯ - 199J - Т. 16, из.

Зэк.615 sap.Sj экз.Рстспршп- ИГГХХ

* Оамилия диссертанта до замужества.