Изучение сигналузнающих частиц Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae: регуляция экспрессии и взаимодействие с рибосомой тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

КОВАЛЬСКАЯ ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ СИГНАЛУЗНАЮЩИХ ЧАСТИЦ Escherichia coli И Saccharomyces cerevisiae: РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С РИБОСОМОЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: к.х.н., доцент Сергиев Петр Владимирович,

чл.-кор. РАН, д.х.н., профессор Донцова Ольга Анатольевна.

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Прасолов Владимир Сергеевич,

чл.-кор. РАН, д.х.н., профессор Цетлин Виктор Ионович.

Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной

медицины Сибирского отделения РАН

Защита состоится 27 июня 2006 г. в 1700 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 26 мая 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

к.х.н. Смирнова И.Г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сигналузнающая частица (signal recognition particle, SRP) является основным участником котрансляционного транспорта белков в клетке. Ее функция заключается в доставке рибосом, которые синтезируют секреторные или мембранные белки, к мембране эндоплазмати'сского ретикулума (endoplasmic reticulum, ER). На N-конце секреторных и мембранных белков находится специфическая последовательность, которая несет сигнал для присоединения к мембране. SRP взаимодействует с этой последовательностью синтезируемого на рибосоме белка, после выхода ее из рибосомного туннеля, а также с самой рибосомой, что приводит к замедлению синтеза пептидной цепи. Образовавшийся комплекс, состоящий из SRP, растущего пептида и рибосомы, присоединяется к мембране за счет взаимодействия SRP с мембранным SRP-рецептором (SR). После этого SRP теряет сродство к сигнальному пептиду и рибосоме, рибосома связывается с транслокационным участком мембраны ER (так называемым транслоконом), пептид перемещается в транслокон, и котранслянионная транслокация растущего пептида осуществляется через/в мембрану с нормальной скоростью. Вся последовательность описанных здесь событий составляет так называемый SRP-путь транспорта белков. SRP эукариот и прокариот различаются по сложности организации. Так, SRP Saccharomyces cerevisiae состоит из шести белков: Srpl4p, Srp21p, Sec65p, Srp54p, Srp68p и Srp72p и аналога 7SL РНК - молекулы scRl РНК. SR состоит из двух белков - а- и р-субъединицы. В бактерии Escherichia coli SRP содержит только два компонента: белок Ffh и молекулу 4.5S РНК. Они являются структурными и функциональными аналогами белка SRP54 и домена IV молекулы 7SL РНК соответственно. В клетках Е. coli роль SRa выполняет ее структурный и функциональный гомолог — белок FtsY. В данной работе были исследованы места контактов между SRP и рибосомой Е. coli, а также взаимосвязь биосинтеза компонентов SRP-пути в S. cerevisiae ив Е. coli. Цель работы:

1. Определить места контактов SRP и рибосомы Е. coli методом фотохимического сшивания.

2. Изучить, как влияет отсутствие в клетках S. cerevisiae белка SRa на биосинтез компонентов SRP-пути и на взаимодействие SRP с рибосомой.

3. Изучить, как влияет отсутствие бактериального гомолога SRa — белка FtsY - на количество белка Ffh в клетках Е. coli.

Научная новизна и практическая ценность. С помощью фотохимического сшивания были локализованы места контактов 4.5S РНК с рибосомой Е. coli. Для этого в состав 4.5S РНК вместо остатков уридина были статистически введены остатки 4-тио-уридина. Под действием мягкого УФ света остатки 4-тио-уридина способны образовывать сшивки с находящимися в непостредственной близости нуклеотидными или аминокислотными остатками. Были найдены две сшивки с рибосомными РНК (рРНК): первая сшивка была образована нуклсотидным остатком U84 4.5S РНК и нуклеотидными остатками в сегменте 2828-2837 23S рРНК; вторая сшивка была

3

образована З'-концевым участком 16S рРНК и нуклеотидными остатками сегмента 29-50 4.5S РНК. Образование первой сшивки требовало присутствия сигнального пептида и белка Ffli, вторая сшивка была получена при отсутствии белка Ffh и сигнального пептида, а также с отдельными 30S рибосомными субъединицами. Была также обнаружена сшивка с белком S1 малой рибосомной субьединицы. На основании установленного положения контакта 4.5S РНК с 23S рРНК была предложена модель взаимодействия SRPc рибосомой Е coli.

Было исследовано влияние нарушения SRP-пути на биосинтез его компонентов в клетках S. cerevisiae. Было показано, что уменьшение количества SRa приводит не только к уменьшению количества белка Srp72p, но и к уменьшению количества мРНК белков Sipl4p, Srp21p, Sec65p. Количество scRl РНК при этом не изменялось. Уменьшение количества SRa в клетках S. cerevisiae также приводило к уменьшению количества SRP, находящегося в комплексе с рибосомой. Было показано, что в клетках К coli уменьшение количества белка FtsY не влияло на количество белка Ffh. Таким образом, показано, что в клеткахS. cerevisiae существует взаимосвязь между уровнем синтеза белка мембранного рецептора SRP частиц и компонентов собственно SRP; в клетках К coli биосинтез белкового компонента SRP и белка рецептора SRP происходит независимо.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в отечественных и международных журналах. Результаты работы докладывались на международных конференциях: Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов — 2001", Москва, Россия, 2001 г.; Международная конференция, посвященная юбилею A.C. Спирина "Синтез белка", Пущино, Россия, 2001 г.; Международная конференция "The Dynamics ofRibosome Structure and Function", Квинстаун, Новая Зеландия, 2002 г.; Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов — 2005", Москва, Россия, 2005 г.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, материалов и методов, выводов и списка литературы. Содержит 48 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 235 источников.

Результаты и обсуждение 1. Взаимодействие SRP с рибосомой Е. coli

Одним из методов определения контактов между РНК и белками или между двумя молекулами РНК является метод сшивания под действием мягкого УФ облучения при длине волны 350 нм. При этой длине волны 4-тио-уридиновый остаток, находящийся в цепи РНК на месте остатка уридина, способен образовывать сшивку с находящимися в непосредственной

близости молекулой РНК или аминокислотными остатками. Данный подход был ранее успешно применен в нашей лаборатории при изучении мРНК и 5S рРНК в составе рибосомы. При этом введение 4-тио-уридиновых остатков проводилось с помощью транскрипции РНК-полимеразой бактериофага Т7. В результате остатки фотоаффинного аналога случайным образом замещали остатки уридина в нуклеотидной последовательности.

1.1. Влияние остатков 4-tiio-U в составе 4.5S РНК* на образование комплекса Ffh-6His/4.5S РНК*.

На первом этапе работы была исследована способность модифицированной 4.5S РНК* образовывать комплекс с белком Ffh-6His. Ген белка Ffh был клонирован в экспрессирующий вектор рЕТЗЗЬ+ так, что к С-концу аминокислотной последовательности Ffh были добавлены шесть остатков гистидина. После экспрессии в штамме BL21 DE3 белок Ffh-6His был выделен из клеточного экстракта с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. Модифицированная 4.5S РНК* была транскрибирована с ПЦР-фрагмента, содержащего кодирующую часть 4.5S РНК под контролем Т7-промотора, с помощью in vitro транскрипции РНК-полимеразой Т7. Транскрипционная смесь содержала 4-тио-ЦТР и UTP в различном соотношении. В транскрипционной смеси также присутствовал [a-32P]UTP, и, таким образом, синтезируемая 4.5S РНК* оказывалась радиоактивной. Образование комплекса между Ffh-6His и 4.5S РНК* детектировали с помощью электрофореза в неденатурирующем ПААГ. На рис. 1 представлены результаты образования комплекса Ffli-6His с 4.5S РНК*, в которой доля остатков 4-тио-уридина постепенно возрастает. Замена остатков уридина на остатки 4-тио-уридина влияет на образование комплекса: чем больше содержание 4-тио-уридина в 4.5S РНК*, тем хуже протекает образование комплекса. В последующих экспериментах использовали 4.5S РНК*, которая была транскрибирована при соотношении 4-tho-UTP:UIP как 5:1.

Рис. 1. Образование комплекса между РШ-бШБ и 4.53 РНК* при повышении содержания 4-тио-и в 4.55 РНК*. Дорожки 1—4 — соотношение 4-тио-ШТ:ШР в транскрипционной смеси составляло 3,3:1, 4,3:1, 7,3:1 и 9,0:1 соответственно. Дорожка 5 - 4.53 РНК* без РЙ1.

4-Тио-ЦТР, как известно, встраивается при транскрипции в молекулу РНК хуже, чем иТР. Было определено соотношение 4-тио-иТР:ЦТР в 4.5Э РНК*. Для этого 4.5$ РНК* была обработана рибонуклеазой Т2, и образовавшиеся фрагменты были разделены с помощью

12 3 4 5

комплекс—«- f§ || «#

4.5S РНК*-

двумерной тонкослойной хроматографии. Как известно, рибонуклеаза 12 гвдролизует связь между фосфатом и 5'-ОН группой рибозы. Таким образом, радиоактивный фосфат, изначально принадлежавший [cc-33P]UTP, оказывался связанным с нуклеотидом, расположенным в нуклеотидной последовательности перед остатком уридина (рис. 4, А). Поскольку в молекуле 4.5S РНК* присутствуют два и более остатков U подряд, то становится возможным определить соотношение между входящими в состав РНК U[32P] и 4-tho-U[32P]. При соотношении в транскрипционной смеси 4-tho-UTP:UTP 5:1 в молекуле 4.5S РНК* содержание 4-tho-U составляет -30%

1.2. Образование комплекса рибосомa/Ffh-6His/4.5S РНК*, фотохимическое сшивание.

Для исследования контактов SRP с рибосомой в in vitro системе нужно было подобрать условия, максимально приближенные к условиям формирования функционального комплекса SRP/рибосома в клетке. Необходимо было получить рибосомы, транслирующие мРНК секреторного белка, такого, как ß-лактамаза. Для этого использовался метод трансляции in vitro. В качестве м РНК использовали Т7-транскрипг, кодирующий первые 69 аминокислотных остатков ß-лактамазы (включая сигнальный пептид). мРНК не содержала стоп-кодон, поэтому по окончании трансляции растущий пептид оставался связанным с рибосомой. Как известно, трансляция in vitro с использованием бактериального экстракта протекает с небольшим выходом. Присутствие в трансляционной смеси [353]-метионина позволило провести детекцию пептида, синтезированного при считывании фрагмента м РНК ß-лакгамазы. Масса синтезированного пептида соответствовала рассчитанной, и - 7% рибосом содержали пептид (данные не представлены).

Для проведения фотохимического сшивания рибосомы в комплексе с фрагментом ß-лакгамазы выделяли из трансляционной смеси с помощью ультрацентрифугирования через сахарозную подушку. Затем к выделенным рибосомам добавляли комплекс Ffli-6His/4.5S РНК* и подвергали УФ облучению при длине волны 350 нм. Продукт сшивания выделяли с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. В первом центрифугировании отделяли несвязавшиеся Fíh-6His и 4.5S РНК* or рибосом. Во втором центрифугировании при низкой концентрации ионов магния проводили диссоциацию рибосом на отдельные 30S и 50S субьединииы. В третьем центрифугировании в присутствии SDS осуществляли разделение 30S или 50S субъединиц на рибосомные белки и рРНК. В контрольных экспериментах проводили либо трансляцию в бактериальном экстракте без добавления мРНК ß-лактамазы, либо добавляли 4.5S РНК* без Ffli-6His, либо вместо транслирующих рибосом использовали вакантные 70S рибосомы или отдельно 30S субъединины.

1.3. Iii учение взаимодействия 4.SS РНК* с рибосомными белками.

После проведения фотохимического сшивания SRP с рибосомой и выделения рибосомных белков проводили связывание рибосомных белков с индивидуальными антителами. Каждое антитело было иммобилизовано на агарозе посредством взаимодействия с вторичными

6

антителами, которые были сшиты с агарозой. Далее измеряли радиоактивность, которая была ассоциирована с отдельными рибосомными белками. Высокая радиоактивность свидетельствует об образовании фотоаддукта с 4.5S РНК*. Таким образом было определено, что сшивка 4.5S РНК* происходит с белком 30S рибосомной субъсдипидн S1 (рис. 2). Более низкий выход имела сшивка с белком S21. Применение данного метода анализа к белкам 50S рибосомной субъединицы не дало положительных результатов.

Рис. 2. Анализ сшивок между белками 305 рибосомной субъединицы (от 81 до 821) и 4.58 РНК* с помощью специфических антител к отдельным белкам. Гистограмма отображает количество радиоактивности (ерш/мин), которое остается связанным с иммобилизированными на агарозе антителами.

2 j ti я ■ г .-i -.я эс

Антитела к белкам 30S рибосомной субъсдиницы

1.4. Изучение взаимодействия 4.58 РНК* с 235 и рРНК.

Место сшивания между рРНК и 4.5Э РНК* было локализовано с помощью обработки рРНК рибонуклеазой Н в присутствии пар олигодезоксирибонуклеотидов (праймеров), которые были комплементарны выбранным участкам 168 или 235 рРНК. Как известно, рибонуклеаза Н способна узнавать ДНК-РНК спаренные участки и производить гидролиз РНК в такой гибридной спирали. Таким образом можно вырезать любые внутренние фрагменты РНК, и с помощь гель-электрофореза в денатурирующих условиях с последующей радиоавтографией определять место сшивания 4.58 РНК* с рРНК. На рис. 3 представлены результаты разрезания рРНК в присутствии различных комбинаций праймеров. Для 238 рРНК было показано, что сшивка между 4.53 РНК* и 23Б рРНК находится в промежутке между нуклеотидными остатками 2822 и 2841 235 рРНК (рис. 3, 23Э рРНК, дорожки 1-6). Более детальное изучение позволило сузить этот интервал до нуклеотидных остатков 2828-2837 (рис. 3, 238 рРНК, дорожки 7-10). Образование этой сшивки строго зависело от присутствия белка Р&-6Ни. Сшивка между 4.58 РНК* и 165 рРНК находится в З'-концевой области 165 рРНК, однако точное положение сшивки определить не удалось (рис. 3, 168 рРНК). Как видно на рис. 3, разрезание в дорожках 5 и 6 было неполным. Это свидетельствует о том, что участок 16Э рР11К, участвующий в образовании сшивки, несколько гетерогенный или

23Э

1 г 3 4 5 в 7 8 9 «

16§

2 э 4 5 <1

Г«! 1 ■:.>

Рис. 3. Результаты разрезания с помощью рибонуклеазы Н фотоаддуктов 4.58 РНК* с 238 и 165 рРНК. Обработка фотоаддуктов рибонуклеазой Н проводили в присутствии одного или двух праймеров длиной 10-17 нуклеотидных остатков, комплементарным выбранным районам рРНК.

Полученные фрагменты разделяли в 6% ПААГ и с помощью фотопленки детектировали фрагменты рРНК, фотохимически сшитые с 4.58 РНК*. На диаграмме под радиоавтографами изображены центральный нуклеотид в ДНК-РНК спаренном участке и приблизительная длина фрагментов рРНК. Стрелками со сплошной линией показаны фрагменты рРНК, которые образуют фотоаддукт с 4.58 РНК* и дают сигнал на радиоавтографе. Стрелками с пунктирной линией показаны фрагменты рРНК, не участвующие в образовании фотоаддукта и не дающие сигнал на радиоавтографе. 23Б рРНК: дорожка 1 - центральные нуклеотидные остатки праймеров, комплементарные нуклеотидным остаткам 2281 (на диаграмме не отмечен) и 2442 23Б рРНК; дорожка2 - 2442 и 2628; дорожка 3 - 2572 и 2822; дорожка 4 - 2739 и 2857; дорожка 5 - 2739 и 2841; дорожка 6 - 2822 и 2841; дорожка 7 - 2628 и 2822; дорожка 8 - 2628 и 2828; дорожка 9 -2628и 2837; дорожка 10 — 2628 и 2841. 165 рНЖ: дорожка 1 —центральные нуклеотидные остатки праймеров, комплементарные нуклеотидным остаткам 846 и 1055 168 рРНК (на диаграмме не отмечены); дорожка 2 -972 и 1139; дорожка 3 - 1139 и 1399; дорожка 4 - 1399 и 1499; дорожка 51513; дорожка 6- 1525.

находится в месте связывания праймера, который направляет разрезание 16Э рРНК рибонуклеазой Н в позициях, близких к нуклеотидному остатку 1525. Данная сшивка не зависела от присутствия белка РЛ-бНкч, а также наблюдалась при использовании вакантных рибосом или 308 рибосомных субъединиц вместо транслирующих рибосом.

1.5. Определение остатков 4-тио-и в 4.58 РНК*, участвующих в образован™ сшивок

Для определения участвующих в образовании сшивок остатков 4-тио-уридина в составе 4.5Э РНК* необходимо было удалить большую часть 16Э и 238 рРНК, поскольку работа с полноразмерными рРНК сильно затруднена. После фотохимического сшивания и последующего выделения рибосомных РНК проводили расцепление 168 и 234 рРНК с помощью рибонуклеазы Н в присутствии соответствующих праймеров. После элюции из геля были получены фотоаддукты 4.58 РНК* с фрагментами 168 и 23Э рРНК длиной 80 и 85 нуклеотидных остатков соответственно, которые использовали в дальнейших экспериментах.

Поиск остатков 4-тио-и в составе 4.5Э РНК*, принимающих участие в образовании сшивок, был также проведен путем разрезания 4.5Б РНК* в составе фотоаддукта с помощью рибонуклеазы Н. На рис. 4, А показана первичная структура 4.5Э РНК и показаны участки праймеров I—1V, которые использовали для разрезашя 4.5Э РНК* рибонуклеазой Н.

На рис. 4, Б представлены результаты обработки 4.58 РНК* рибонуклеазой Н. В дорожке 2 приведены результаты контрольного эксперимента: при обработке 4.58 РНК* рибонуклеазой Н в присутствии праймера III образуются олигорибонуклеотиды длиной 40 и 70 остатков. Вначале анализу был подвергнут фотоаддукт 4.58 РНК* с фрагментом 238 рРНК длиной 80 нуклеотидных остатков (рис. 4, Б, дорожка 3, фрагмент а). Сравнение дорожек 2 и 3 с дорожкой 4 демонстрирует, что в образовании сшивки с 238 рРНК принимает участие З'-конец 4.58 РНК*. Обработка фотоаддукта 4.58 РНК* с 23Э рРНК рибонуклеазой Н в присутствии праймера IV показала, что в образовании сшивки принимают участие нуклеотидные остатки, находящиеся в сегменте 75-98 4.5Э РНК* (рис. 4, Б, дорожки 3 и 4, фрагменты Ь и с).

^ 10 20 30 40 SO

. . i . ___I . I. .... I . . 1

Э5 23 oi за 3« 3a oi oi

it

CO 70 10 90 104 110

» > >. . «... 1 1 лло. cas. ccaafi. e.cj^.fc^-^e-ffi.sffi-^-cce.a.e-äaauaa-öäa-c-cäs-e.g.cccccxccc 13 02 Ii 13 13

iii vr

Б В

1 г 3 4 5 В 7 .......

Ik

ЩР*

в .

ь

и

4.SS РНК*

' -40

• ( фотовддукг. ^

.....'^'"Ю 4.SS РНК* Ль

с 23S рРПК 4P

Рис. 4. Локализация остатков 4-тио-и в составе 4.5S РНК*, которые принимают участие в образовании сшивок с 23S и 16S рРНК. А - первичная структура 4.5S РНК. Точками отмечены места разрезания 4.5S РНК* рибонуклеазой Т1. Арабскими цифрами обозначены содержащие радиоактивный фосфат или остаток урвдина рибонуклеотиды и олигорибонуклеотиды, которые образуются в результате обработки 4.5S РНК* рибонуклеазой Т1. Звездочками отмечены нуклеотидные остатки, которые оказываются связанными с радиоактивным фосфатом после обработки 4.5S РНК* рибонуклеазой Т2. Римскими цифрами обозначены праймеры, комплеметарные выделенным участкам, которые использовали при аналюе фотоаддукгов 4.5S РНК* с 23S и 16S рРНК с помощью рибонуклеазы Н. Б - аналш фотоаддукгов 4.5S РНК* с 23S и 16S рРНК с помощью рибонуклеазы Н. Дорожка 1 - полноразмерная 4.5S РНК*; дорожка 2 - 4.5S РНК*, обработанная рибонуклеазой Н в присутствии праймера Ш (на рисунке также отмечены получающиеся фрагменты 4.5S РНК* длиной 40 и 70 нуклеотидных остатков); дорожка 3 -фотоаддукт 4.5S РНК* с фрагментом 23S рРНК; дорожка 4 -фотоаддукт 4.5S РНК* с фрагментом 23S рРНК, обработанный рибонуклеазой Н в присутствии праймера III; дорожка 5 - в присутствии праймеров III и IV; дорожка 6 - 4.5S РНК*, обработанная рибонуклеазой Н в присутствии праймеров I и III (на рисунке также отмечены получающиеся фрагменты 4.5S РНК* длиной 10, 40 и 60 нуклеотидных остатков); дорожка 7 - фотоаддукт 4.5S РНК* с фрагментом 16S рРНК, обработанный рибонуклеазой Н в присутствии праймеров I и III В — фингерпршггы с использованием рибонуклеазы Т1 свободной 4.5S РНК* (верхняя часть рисунка) и фотоаддукта 4.5S РНК* с 23S рРНК (нижняя часть рисунка). Рибонуклеотиды и олигорибонуклеотиды

обозначены также, как на рис. 4, А. Разделение смеси рибонуклеотидов и олигорибонуклеотидов проводили в направлении справа налево, затем снизу вверх. Маленькой стрелкой обозначено место нанесения образца, большой стрелкой обозначено место отсутствующего дирибонуклеотида 12.

Результаты обработки рибонуклеазой Н фотоаддукта 4.5S РНК* с 16S рРНК представлены на рис. 4, Б, дорожки 6-7. Фотоаддукт содержал 4.5S РНК* и фрагмент 16S рНК длиной 85 нуклеотидных остатков (рис. 4, Б, дорожка 7, фрагмент d). В дорожке 6 представлены результаты контрольного эксперимента, когда проводили обработку свободной 4.5S РНК* рибонуклеазой Н в присутствии праймеров I и III; при этом 4.5S РНК* разрезается на 3 фрагмента. Аналогичная обработка фотоаддукта 4.5S РНК* с 16S рРНК показала, что сшивку образуют остатки 4-тио-и, находящиеся в центральной части 4.5S РНК* (рис. 4, Б, дорожка 7, фрагмент е). Использование праймера II вместо праймера I не привело к каким-либо существенным изменениям в поведении фрагментов 4.5S РНК*, но позволило сузить область 4.5S РНК*, которая принимает участие в сшивке: от 29-го до 50-го остатков.

Более точное место сшивки 4.5S РНК* с 23S рРНК удалось найти с помощью метода фингерпринтов. На рис. 4, А цифрами 01, 02 и т.д. отмечены олигорибонуклеотиды, получающиеся в результате обработки 4.5S РНК* рибонуклеазой Т1, которая гидролизует РНК после каждого остатка гуанозина. Эти олигорибонуклеотиды и рибонуклеотиды пронумерованы в соответствии с содержанием в них остатков U и длины олигорибонуклеотидов; например, «38» представляет собой октарибонуклеотид, в состав которого входят 3 остатка U. Эти два параметра определяют подвижность олигорибонуклеотидов и рибонуклеотидов при их разделении двумерной тонкослойной хроматографигй. На рис. 4, В представлены результаты разделения олигорибонуклеотидов и рибонуклеотидов после обработки 4.5S РНК* рибонуклеазой Т1. По сравнению с необлученной 4.5S РНК*, в фотоаддукге 4.5S РНК* с 23S рРНК отсутствует дирибонуклеотид 12 (нуклеотидные остатки 82-83). Это свидетельствует о том, что в тех молекулах 4.5S РНК*, которые образовали сшивку, остаток 83G не содержит радиоактивного фосфата, и, следовательно, U84 содержит только 4-тио-и и образует сшивку. Остаток U82 не может участвовать в образовании сшивки, поскольку дирибонуклеотид 02 (нуклеотидные остатки 80-81) в составе фотоаддукта сохраняет радиоактивный фосфат.

К сожалению, исследование фотоаддукта 4.5S РНК* с 16S рРНК с помощью метода фингерпринтов провести не удалось, т.к. при расщеплении 4.5S РНК* рибонуклеазой Т1 образуются по три идентичных по подвижности рибонуклеотида и олигорибонуклеотида типа 01 и 38, причем по два из них находятся в месте контакта 4.5S РНК* с 16S рРНК. 1.6. Модель расположения 4.SS РНК на рибосоме.

Пространственная структура молекулы 4.5S РНК была построена на основе кристаллической структуры комплекса М-домена белка Ffh с фрагментом 4.5S РНК (нуклеотидные остатки 33-74) путем экстраполяции ее на всю молекулу. При этом

11

' . (

предполагалось, что эта структура имеет спиральную А-конформацию. Следует отметить, что в экстраполированном районе 4.5Э РНК присутствуют внутренние петли, благодаря которым реальная структура может иметь не прямую, а согнутую форму.

Расположение полноразмерной 4.5Б РНК на поверхности ЗОБ рибосомной субъединицы ТИегтиз ¡ИегторИПиз с помощью компьютерной программы «Н1ШЛ-ЗП» моделировали так, чтобы нуклеотиды, участвующие в образовании сшивки между 4.58 РНК* и 16Э рРНК, были максимально сближены (рис. 6). Следует учитывать, что это лишь один из нескольких возможных способов расположения 4.5Б РНК, не противоречащих образованию сшивки. Принимая во внимание тот факт, что данная сшивка не требует присутствия белка РЙ1 и сигнальной последовательности, вполне возможно, что она отражает дополнительную неизвестную функцию 4.5Э РНК. В сегменте 4.58 РНК, который принимает участие в образовании сшивки, присутствует последовательность, гомологичная последовательности Шайна-Дальгарно (рис. 5). Наличие этой последовательности может увеличивать неспецифическое взаимодействие 4.5Б РНК с З'-концевым

■ 51В

Н. marismortui Е. coli

Рис. 5. Локализация во вторичной структуре фрагментов 4.5S РНК, 16S и 23S рРНК, участвующих в образовании сшивок. Желтым цветом показаны места сшивок между 4.5S РНК* и 16S рРНК, розовым цветом показаны места сшивок между 4.5S РНК* и 23S рРНК. Зеленым цветом обведен фрагмент 4.5S РНК, кристаллическая структура которого в комплексе с М-доменом белка Ffh была определена.

в

Рис. 6. Моделирование положения 4.5S РНК на рибосоме в соответствии в полученными сшивками. А, Б - модель расположения комплекса 4.5S PHK/FfhM на 50S рибосомной субъединице Н. marismortui в двух проекциях. Черным цветом показаны 23S и 5S рРНК, синим цветом показаны рибосомные белки. Часть 4.5S РНК, показанная розовым цветом, соответствует участку 4.5S РНК в кристаллической структуре комплекса 4.5S PHK(33-74)/FfhM. Зеленым цветом показана предполагаемая структура остальной части 4.5S РНК. Оранжевым цветом показан М-домен белка Ffh. Участвующие в сшивке U84 и участок 23S рРНК показаны желтый точкой и красной спиралью соответственно. Красной точкой отмечен нуклеотидный остаток, эквивалентный нуклеотидному остатку 91 в 23S рРНК Е. coli. Стрелкой показан выход из рибосомного туннеля. В — модель расположения 4.5S РНК на 30S рибосомной субъдинице Т. thermophilus. Обозначения 4.SS РНК, 16S рРНК и рибосомных белков такие же, как для А и Б. Желтой и красной спиралями обозначены участвующие в образовании сшивки участки 4.5S РНК и 16S рРНК соответственно.

участком 168 рРНК. С другой стороны, отсутствие в клетке 4.58 РНК может быть супрессировано мутациями в спиралях Ь23а и Ь34 16в рРНК, которые в пространстве находятся достаточно близко к участвующей в образовании сшивки спирали Ь45. Рибосомный белок Э1 также находится в непосредственной близости от места сшивки 4.58 РНК* с 168 рРНК. К сожалению, в

кристаллической структуре 30S рибосомной субъединицы белок S1 отсутствует, поэтому моделирование положения 4.5S РНК на 30S субъединицы с учетом всех обнаруженных контактов пока невозможно.

Моделирование положения 4.5S РНК на 50S рибосомной субъединице осуществляли на базе кристаллической структуры 50S рибосомной субъединицы Haloarcula marismortui. Следует заметить, что вторичная структура 23S рРНК Н. marismortui и Е. coli в районе места сшивки (Н99-Н101) несколько различается (рис. 5).

При моделировании расположения 4.5S РНК на поверхности 50S субъединицы с учетом близости нуклеотидных остатков, участвующих в сшивке, М-домен белка Ffh оказывается в непосредственной близости от рибосомного туннеля (рис. 6). Рядом с М-доменом также находится нуклеотидный остаток, эквивалентный нуклеотидному остатку 91 в 23S рРНК Е. coli, который образует сшивку с растущим пептидом длиной около 30 аминокислотных остатков. В таком положении белок Ffh способен узнавать сигнальную последовательность, как только она выйдет из туннеля. Таким образом, сшивка 4.5S РНК* с 23S рРНК в присутствии Ffh-6His и сигнального пептида полностью согласуется с известной ролью SRP в котрансляционном транспорте белков, точнее с функцией SRP в узнавании сигнального пептида.

2. Влияние нарушения синтеза SRa на биосинтез компонентов SRP-nymu

и на взаимодействие SRP с рибосомой в клетках S. cerevisiae

Эукариотическая SRP представляет собой сложный рибонуклеопротеид. Обнаружение SRP в дрожжах позволило оценить важность SRP-зависимого транспорта белков для клетки. Нарушение гена любого компонента SRP-пути ¿1 cerevisiae, в том числе и SRa, не летально, но приводит к дефекту транспорта некоторых секреторных и мембранных белков в ER и уменьшению скорости деления клетки. Однако, что происходит в таких условиях собственно с SRP, оставалось неизвестным. Неизвестно, как отсутствие в клетке белка SRa скажется на экспрессии остальных компонентов SRP-пути и взаимодействии SRP с рибосомой. 2.1. Создание штамма дрокжей с регулируемой экспрессией SRa.

Необходимо было создать дрожжевой штамм, обладающий регулируемой экспрессией а-субъединицы SR и содержащий аффинный эпитоп в составе одного из белковых компонентов SRP. В качестве исходного штамма мы использовали штамм SOY46, в котором хромосомная копия гена, кодирующего a-субъединицу SR (ген srpIOl), была удалена, а ген белка SRa экспрессировался с плазмиды pS0400 под контролем GAL 1-промотора. При переносе культуры клеток на синтетическую среду, содержавшую в качестве источника углерода глюкозу вместо галактозы, происходили выключение GAL 1-промотора и остановка экспрессии гена, кодирующего SRa. На С-конец белка Srp72p был введен аффинный эпитоп, который представлял собой 4,5 повтора Z-домена белка А оболочки золотистого стафилококка. Присутствие в геномной ДНК

14

вставки, которая кодирует аффинный эпигоп, было подтверждено с помощью ПЦР с геномной ДНК. Как видно на рис. 7, А колонии ОЫАП, (ЖА14, ОЫА15, ОЫА18 и СЖА19 содержат ген белка 5гр72р, удлиненный на последовательность, кодирующую аффинный эпигоп. Помимо ПЦР с геномной ДНК дрожжей, наличие аффинного эпигопа на С-конце белка Эф72р было подтверждено с помощью иммунодетекции 4,57-доменов (рис. 7, Б). Как швестно, ^домен взаимодействует с константной частью иммуноглобулинов, поэтому специфичность антител не была важна для детекции.

—200 кДа

- I [ h кЛ н,

---------Srp72p-4.5/.

—66 кДя lnOjvLU.

-45 кДя

, . — -т» *-GST, 26 кДа

Рнс. 7. Аиалщ полученных штаммов S. cerevisiae. А - результаты ПЦР с геномной ДНК. В исходном штамме SOY46 длит ПЦР-фрагмепга составляет около 400 нукл. ост. Присутствие в геномной ДНК вставки, которая кодирует аффинный эшпоп, увеличивает длину ПЦР-продукта до 2500 нукл. ост. Б - результаты иммупо-блотгинга дрожжевых клеточных экстрактов колоний ONAll, ONA14, ONA15, ONA18, ONA19 и клеточного экстракта штамма SOY46. Были пспользованы иммуноглобулины кролика к белку GST, копыогпрованные с перокендазон хрена. Аналогичные результаты были получены в независимом эксперименте с использованием вторичных иммуноглобулинов кролика против иммуноглобулинов овцы, коныогированных с пероксидазой хрена; данные антитела были использованы в последующих экспериментах.

Для контрольных экспериментов необходимо было проводить детекцию белка Бгр72р в штамме, который содержит ген белка 5Яа под контролем природного промотора. Был сконструирован штамм, содержавший хромосомную копию гена белка Жа и тагнрованный белок 8ф72р-4,5г (штамм ОЫА72).

2.2. Зависимость количества компонентов вКР-путн от количества вНа в клетке.

В штамме ЭОУ46 количество белка Жа примерно в 50 раз больше, чем в клетках дикого типа, н оно снижается до уровня «дикого типа» приблизительно через 16 ч после пересева клеток на синтетическую среду с глюкозой. После 16 ч роста на среде с глюкозой наблюдается дальнейшее уменьшение количества Жа, что ведет к постепенному увеличению времени деления клетки. Через 20-25 часов после пересева клеток время деления клетки достигает своего максимального значения и составляет ~ 10 ч, при этом количество а-субьединиц БЯ становится ниже уровня, детектируемого с помощью иммуно-блеггтинга. Полученный штамм ОМА 11, который использовали в дальнейших экелгрименгах, ведет себя аналогично штамму БОУ46.

Клетки штамма ОЫА11 пересевали с жидкой синтетической среды, содержавшей галактозу, на синтетическую среду с глюкозой. Затем в течение 0-40 ч образцы клеток отбирали,

15

лизировали и определяли количество мРНК компонентов 8КР-пути. Клетки контрольного штамма ОЫА72 растили на среде с глюкозой. На рис. 8, А представлены результаты детекции мРНК БЯа с помощью специфического ДНК-зонда. Из рисунка видно, что уже через 2 ч после пересева клеток на среду с глюкозой происходит резкое снижение количества мРНК ЭЛа. Дальнейшая инкубация клеток на среде с глюкозой приводит к постепенному уменьшению количества мРНК ЭКа. Такое снижение количества мРНК БЯа в штамме (ЖА11 коррелирует с уменьшением количества белка а-субъединицы ЭК в штамме 50У46 при переносе клеток на среду с глюкозой.

Л мРНК а-субт»едииицы БК

очлп_оча72

В 8гр72р-4,5г оллп

ч г0 2 5 10 25 ли1 к

Е зсШ РНК

<>N4 4

Г мРНК белка 5гр14р оиллг о\а1 I_

о 2 5 10 16 25 40 к

Д мРНК белка $гр21р о\.уи_

о 2 5 i» 16 25 40 к

- ^ »

£ мРНК ислка вес65р

очл11_ 0?<а72

ч г0 2 5 ¡0 16 25 4(г

Ж мРНК карбокопкчп'ндазм V

ол'лп о.мл72

ч "о 2 5 ¡0 Г« 25 40* 'к1

Рис. 8. Изменение содержания компонентов 5КР-пути в клетках сегеушае. А — результаты нозерн-блотгинга мРНК а-субъединицы 811. Дорожки 0-40 — результаты анализа суммарной клеточной РНК, выделенной из клеток штамма ОМАН, отобранных через 0, 2, 5, 10, 16, 25 и 40 ч после пересева клеток на синтетическую среду с глюкозой. К — анализ суммарной клеточной РНК, выделенной из клеток контрольного штамма СЖА72. Количество суммарной РНК в каждой дорожке эквивалентно количеству суммарной РЖ, выделенной из 20 (А, Г-Е) и 5 (Б, Ж) СЮ клеток. Б - результаты нозерн-блоттинга бсШ РНК. Обозначения такие же, как на рис. 1, А. В -результаты иммунодетекции белка 8гр72р-4,57., Порядок нанесения образцов клеточных экстрактов, полученных из клеток штаммов ОЫА11 и ОИА72, совпадает с порядком нанесения суммарной клеточной РНК при детекции мРНК а-субъединицы БЯ. Г-Ж — результаты нозерн-блоттинга мРНК белков ЭгрМр, 8гр21р, 8сс65р и карбоксипептидазы У соответственно.

Для оценки количества компонентов вШ* в условиях уменьшения концентрации в клетке 8Яа измеряли количество мРНК белковых компонентов БИР, бсШ РНК и тегированного белка Бгр72р. На рис. 8, Б представлены результаты нозерн-блоттинга бсЮ РНК, выделенной из клеток штамма ОЫА11 с разным содержанием БЫа. Из рисунка видно, что количество бсИ РНК никак не связано с количеством мРНК а-субъединицы ЗЯ.

Как видно на рис. 8, В, при высокой концентрации в клетке вЯа количество белка 8гр72р-4,5Z в штамме ОИА11 приблизительно в 2-3 раза превышает его содержание в штамме ОМА72.

После пересева клеток на среду с глюкозой наблюдается резкое снижение количества белка 5ф72р^,52 (приблизительно в 2 раза через 2 ч). При дальнейшей инкубации клеток на синтетической среде с глюкозой происходит постепенное уменьшение количества белка 5гр72р-4,57, и в точке «40 ч» его приблизительно в 5 раз меньше, чем в точке «0 ч». Таким образом, повышенное содержание в клетке а-субъединицы Ж приводит к увеличению количества белка 8гр72р-4,57. При исчезновении БЯа количество белка 5ф72р^,ЪЪтакже уменьшается, хотя белок Згр72р-4,52 не исчезает полностью: в клетках штамма (ЖАН его становится в 2-3 раза меньше, чем в клетках контрольного штамма (ЖА72.

При снижении количества ЭЯа в клетках штамма ОЫА11 наблюдается постепенное снижение концентрации мРНК, кодирующих белки ЭгрИр, 5гр21р и 5ес65р (рис. 8, Г-Е соответственно). Между 10 и 16 ч инкубации клеток на питательной синтетической среде с глюкозой количество мРНК данных белков снижается до уровня мРНК в контрольном штамме (ЖА72. При дальнейшей инкубации клеток штамма (ЖА11 на среде с глюкозой количество мРНК данных белков продолжает снижаться и в точке «40 ч» достигает значения в 10-12 раз меньшего, чем в точке «0 ч».

Также интересно было изучить, как щменяется концентрация мРНК р-субъединицы Ж при постепенном уменьшении в клетке количества а-субьединицы Оказалось, что при

постепенном снижении количества а-субьединииы Ж уменьшалось и количество мРНК Р-субьединицы Ж (результаты не представлгны).

В качестве контроля при проведении нозерн-блот-анализа мы использовали мРНК белка карбоксипептидазы У, поскольку известно, что нарушение функции БЯР не влияет на транспорт данного белка в эвдоплазматический ретикулум. Как видно на рис. 8, Ж, количество мШК карбоксипептидазы У не изменяется как при шбытке сс-субьединицы ЗК. в клетке (дорожки 0 и К), так и при ее недостатке (дорожки 40 и К^

Из полученных нами данных следует, что отсутствие в клетке 8Яа приводит к уменьшению количества мРНК Р-субъединицы БЯ, а также к уменьшению количества белка 8гр72р и мРНК белков 8гр 14р, Эф21р и Бесббр. Это уменьшение, вероятно, вызвано снижением уровня транскрипции генов, кодирующих БКР-белки. Количество всЮ РНК в данных условиях не изменяется. Это можно объяснить тем, что ген, кодирующий зсРИ РНК, в отличие от генов белковых компонентов БКР, транскрибируется РНК-полимеразой III и, скорее всего, регулируется иначе. Кроме того, бсЮ РНК сильно структурирована и, по-видимому, более стабильна, чем мРНК.

Наличие, хотя и в меньшей концентрации, в клетке белка 5ф72р-4,5г через 40 ч после переноса клеток штамма ОЫА11 на среду с глюкозой позволяет предположить, что полноценные ЖР все же присутствуют в клетке в течение всего периода измерений. Возможно, ЖР выполняет

и другие функции в клетке, например участвует не только в ко-, но и в постгрансляционном транспорте белков или выступает в качестве шаперона, взаимодействуя с полноразмерным белком и под держивая связанный сигнальный пептид в состоянии, пригодном для транспорта.

Каким же образом координируется синтез компонентов SRP и ее рецептора? Можно предположить, что а-субьединица рецептора в норме играет роль активатора транскрипции генов белков, образующих SRP. Однако этот белок встроен в мембрану, и трудно себе представить, каким образом он может быть транспортирован в клеточное ядро. Более вероятным нам представляется механизм, основанный на том, что нарушение образования полноценного SR вызывает накопление в цитоплазме белков, которые в норме транспортируются в эндоплазматичгский ретикулум по SRP-пути. Вследствие изменения характера фолдинга и процессинга один или несколько из этих белков приобретают способность попадать в ядро и подавлять транскрипцию определенных генов, в частности генов, кодирующих белки SRP. Подобные примеры, хотя и связанные с активацией транскрипции определенных генов, в литературе известны.

Кроме того, нарушение транспорта белков по SRP-пути приводит к накоплению в цитоплазме предшественников секреторных и мембранных белков, которые могут находиться в несвернугом или неправильно свернутом состоянии, что является токсичным для клетки. Из литературных данных известно, что при накоплении в эндоплазматическом ретикулуме несвернутых белков происходит активация протеинкиназы PERK, которая способна снижать общий уровень трансляции в клетке за счет фосфорилирования а-субъединицы фактора инициации трансляции 2 (eIF2ct). Можно предположить, что накопление предшественников секреторных и мембранных белков в цитоплазме способно приводить к снижению трансляционной активности клетки.

2.3. Влияние нарушения синтеза SRa на взаимодействие SRP с рибосомой.

Клетки штамма ONA11 инкубировали на среде с глюкозой 16 ч и осаждали центрифугированием, при этом клетки находились в логарифмической фазе роста. В качестве контроля выступали клетки штамма ONA11, которые растили на синтетической среде с галактозой также в течение 16 ч. Клетки разрушали механическим перетиранием в жидком азоте, осаждали клеточный дебрис центрифугированием, полученный грубый клеточный экстракт S30 наслаивали на градиент концентрации сахарозы 10-30%. Проводили центрифугирование для распределения компонентов грубого клеточного экстракта в соответствии с коэффициентом седиментации по градиенту концентрации сахарозы. Затем проводили последовательный отбор фракций градиента концентрации сахарозы и анализировали каждую фракцию. Выравниваний между двумя образцами осуществляли по количеству РНК в соответствующих фракциях (по поглощению при 260 нм). Отбирали равные доли из каждой фракции, осаждали белки, проводили белковый гель-электрофорез в денатурирующих условиях, затем вестерн-блотгинг и иммунодетекцию с

18

помощью вторичных иммуноглобулинов кролика, коньюгированных с пероксидазой хрена. Результаты представлены на рис. 9. Поскольку белок 8тр72р входит в состав БЯР, с некоторой долей уверенности можно говорить, что локализация 8гр72р^,52 будет отражать локализацию всей Ж.Р. Скорее всего, нахождение белка 5гр72р-4,5Х во фракциях, соответствующим коэффициенту седиментации около 165, и в рибосом ных фракциях отражает поведение белка 5гр72р-4,52 как компонента свободной 5КР и 5И.Р в комплексе с рибосомой. Как видно на рис. 9, незначительное количество белка 5тр72р-4,52 находится в рибосомной фракции, а основная часть 5гр72р-4,52 находится во фракциях, соответствующе 8100 надрнбосомному экстракту. Сравнение количества белка Sф72p-4,5Z в рибосомных фракциях между клетками штамма СЖА11, выращгнными на среде с галактозой и на среде с глюкозой, показало, что повышенное 12345678 9 К 1« П 12 13 14 15 16 17 18 К

1234567 8 9К W " п 13 14 ts 16 17 I8 к

19 20gl¿2r 23. 24 25^^^

Рис. 9. Анализ количества белка Srp72p-4,5Z во фракциях клеток штамма ONAU, выращенных на среде с галактозой (А, В, Д) и с глюкозой (Б, Г, Е). Цифрами обозначены номера фракций градиента концентрации сахарозы. Фракции 1-7 - полирибосомы, фракции 8-13 - рибосомы, фракции 14-16 — 50S рибосомные субъединицы, фракции 17-20- 30S рибосомные субъединииы, фракции 21-28 - надрибосомный клеточный экстракт S100. К - белок Stp 72р-4,5Z, используемый в качестве контроля при иммуно-блоттинге белка Sip72p-4,5Ze клеточных фракциях.

количество в клетке белка Жа (клетки штамма ОЫА11, выращенные на среде с галактозой) или природное количество в клетке белка SR.cc (клетки штамма ОЫА11 на среде с глюкозой через 16 ч после пересева) не влияет на количество ЖР в рибосомной фракции.

Далее решили проверить, как изменяется количество ЖР в рибосомной фракции через 18, 20, 22, 24 ч инкубирования клеток штамма ОМАН после пересева на среду с глюкозой. Разрушение клеток и фракционирование грубого клеточного экстракта в градиенте концентрации сахарозы проводили, как описано выше. В разных образцах объединяли фракции, соответствующие рибосомным, отбирали одинаковое количество рибосом, и проводили иммунодетекцию белка 5гр72р-4,52 с помощью вестерн-блоттинга (рис. 10). Как видно на рис. 10, при уменьшении в клетке количества ЭК.« количество ЖР (точнее 8гр72р-4,52) в рибосомной фракции уменьшается.

ч 18

20

22

24

К

Рис. 10. Анализ количества Srp72p-4,5Z в рибосомных фракциях клеток штамма ONA11 через 18, 20, 22 и 24 ч после пересева на среду с глюкозой. К - белок Srp72p-4,5Z, используемый в качестве контроля при иммуно-блоттинге белка Srp72p-4,5Z в клеточных фракциях.

Как было показано ранее, в клетках S. cerevisiae обнаруживается взаимосвязь между синтезом белка SRa и остальными компонентами SRP. Присутствие в рибосомной фракции белка Srp72p-4.5Z через 24 ч после пересева клеток свидетельствует о том, что в условиях сниженного синтеза компонентов происходит сборка голноценных функциональных снгналузнающих частиц.

Снижение количества SRP в рибосомной фракции при снижении количества SRa можно объяснить разными причинами. Вполне возможно, что уменьшение количества SRP в рибосомной фракции сопряжено с уменьшением общего количества SRP в клетке. Но это лишь одно из возможных объяснений полученных данных. На сегодняшний день остается невыясненым вопрос о том, каким образом происходит остановка трансляции в клетках S. cerevisiae. Взаимодействие SRP с рибосомой полностью блокирует трансляцию предшественника секреторного или мембранного белка, которая может быть восстановлена только в присутствии SRa, или это обратимый процесс, и синтез полноразмерного предшественника может проходить и в отсутствии SRa? При «проходимом» аресте трансляции SRP может оставаться в комплексе с сигнальной последовательностью предшественника и после окончания его трансляции. За счет чего может происходить уменьшение пула свободной SRP. При «строгом» аресте трансляции может происходить накопление в клетке «заторможенных» комплексов SRP/рибосома. А снижение количества SRP в рибосомной фракции сопряжено с деградацией «заторможенных» комплексов SRP/рибосома как опасных или ненужных для клетки объектов.

3. Влияние нарушения синтеза FtsY на биосинтез белкового компонента SRP в клетках Е. coli

В ходе эксперимента было обнаружено, что уровень синтеза белковых компонентов SRP пути зависит от количества SRa в дрожжах 5. cerevisiae. Интересно было узнать, функционирует ли подобный механизм в бактериях.

3.1. Создание бактериального штамма с регулируемой экспрессией белка FtsY.

Необходимо было создать штамм Е. coli с регулируемой экспрессией гена, кодирующего гомолог a-субъединицы SR - белок FtsY. Был сконструирован штамм XDPbadFisY, в котором ген ftsY в геномной ДНК находился под контролем арабинозного промотора, что позволяло регулировать экспрессию гена ftsY, изменяя концентрацию арабинозы в среде. При создании

штамма ХЕ>РваоГйУ в геномную ДНК штамма Х90 ОЕЗ был интегрирован фрагмент ДНК, амплифтированный с помощью ПЦР с плазмвды рЕТ23Ь-Ру-капК-РвАо-РйУ' и содержащий арабинозный промотор, селективный маркер кап К (ген устойчивости к капам ицн ну) и фланкирующие последовательности (Ру и Рь У) длиной 300-400 нуклеотвдных остатков, гомологичные участкам интеграции в гене //5У. Продукт ПЦР интегрировали в геномную ДНК штамма Х90 ОЕЗ с помощью Яес1-рекомбиназы. Наличие в полученном штамме ХОРвао1'Ь У арабинозного промотора перед кодирующей последовательностью генабыло подтверждено с помощью ПЦР с геномной ДНК (рис. 1IX а также неспособностью данного штамма формировать колонии клеток на твердой питательной среде в отсутствие арабинозы. А Б

Ру капК Р„д„ Г«У Щ

У.У.У.'.У.'^У-тУ! ~

IX

Рис. 11. Анализ полученных штаммов £ coli. А - схематическое изображение мест отжига прайм еров I, II и III, которые были использованы при ПЦР с геномной ДНК полученных штаммов. Б - результаты ПЦР с геномной ДНК. Дорожки 1, 2, 3 — использовали праймеры П и III, дорожки 4, 5, 6 — использовали праймеры I и III. М - маркер длины. Дорожки 1,4 — ПЦР с геномной ДНК контрольного штамма Х90 DE3. Дорожки 2, 5 - ПЦР с геномной ДНК штамма XDPbadFisY, колония №1. Дорожки 3, 6-ПЦРс геномной ДНК штамма XDPbadFKY, колония №2. Дорожки 2, 3 - ожидаемая длина ПЦР-фрагменга 2900 нукл. ост. Дорожка 4 - ожидаемая длина ПЦР-фрагменга 700 нукл. ост. Дорожки 5, 6 - ожидаемая длина ПЦР-фрагменга 3200 нукл. ост.

3.2. Зависимость количества ЕЯ] от количества ПзУ в клетке.

При пересеве клеток штамма ХЛРваоРйУ на жидкую среду без арабинозы происходит постепенное уменьшение количества белка РйУ (рис. 12, А). Через 4 ч после пересева клеток количество белка БйУ уменьшилось до уровня, при котором белок не удается детектировать с помощью антител. В качестве контроля был использован штамм Х90 БЕЗ. Как видно на рис. 12, А, замена природного промотора Ру перед кодирующей частью гена/Ь У на арабинозный промотор не влечет за собой каких-либо существенных изменений в количестве белка ВзУ (ср. дорожки 0 и К).

А Б

ХРРВЛ^У Х90РЕЗ ХРРа<пП5У Х90 БЕЗ

ч 0 1 4 К ч ""¡5 ; т 1Г

Рис. 12. Результаты имМунодетекции белка РкУ (А) и ПЬ (Б). Дорожки 0, 1 и 4 - суммарный клеточный экстракт, полученный из клеток штамма ХОРваоР^У, которые отбирали через 0, 1 и 4 ч после пересева клеток на среду без арабинозы. К — клеточный экстракт, выделенный из клеток контрольного штамма Х90 БЕЗ.

Эксперименты по иммунодетекции белка Ffh в клетках штамма XDPßAnFtsY при уменьшении количества белка FtsY показали, что количество белка Ffh в клетке не зависит от количества FtsY (рис. 12, Б). Скорее всего, в данный промежуток времени не происходит ни снижения транскрипции гена ffli, ни усиления деградации белка Ffh. Эти результаты позволяют предположить, что экспрессия генов, кодирующих белки Ffh и FtsY, происходит независимо. Измерение количества второго компонента бактериальной SRP - 4.5S РНК - мы не проводили, поскольку известно, что 4.5S РНК выполняет несколько функций в клетке и присутствует в четырехкратном избытке по сравнению с белком Ffh.

На основании полученных нами результатов можно сделать вывод о том, что, в отличие от клеток дрожжей, в бактериальных клетках количество SR не влияет на количество SRP. Регуляторный путь, наблюдаемый нами в клетках S. cerevisiae, по-видимому, появился в эволюции позднее. Возможно, необходимость «выключения» синтеза белковых компонентов SRP в эукариотической клетке является следствием присущей им способности вызывать остановку трансляции. Можно предположить, что накопление «заторможенных» комплексов SRP—рибосома и уменьшение пула работающих рибосом для клетки более губительно, чем накопление предшественников секретируемых и мембранных белков в цитоплазме.

Выводы

1. Нуклеотидный остаток U84 в 4.5S РНК в присутствии сигнального пептида и белка Ffh образует контакт с нуклеотидными остатками сегмента 2828-2837 23S рРНК. Нуклеотидные остатки сегмента 29-50 4.5S РНК образуют контакт с З'-концевым участком 16S рРНК и белком S1. Образовали; этих контактов не требует присутствия сигнального пептида и белка Ffh.

2. Обнаружение контактов 4.5S РНК с рибосомными РНК позволяет построить модель расположения 4.5S РНК на рибосомных субъединицах.

3. В клетках S. cerevisiae существует взаимосвязь между уровнем синтеза белка мембранного рецептора SRP частиц и компонентов собственно SRP: отсутствие в клетках S. cerevisiae а-субьединицы SR приводит к уменьшению количества белка Srp72p и мРНК белков Srpl4p, Srp21p, Sec65p, ß-субъединицы SR; количество scRl РНК в этих условиях не изменяется.

4. В клетках Е. coli биосинтез белкового компонента SRP и белка рецептора SRP происходит независимо.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Avdeeva O.N., Myasnikov A.G., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Construction of the 'minimal' SRP that interacts with the translating ribosome but not with specific membrane receptors in Escherichia coli. II FEBS Lett., 2002, v. 514, p. 70-73.

2. Rinke-Appel J., Osswald M., von Knoblauch K., Mueller F., Brimacombe R., Sergiev P., Avdeeva O., Bogdanov A., Dontsova O. Crosslinking of 4.5S RNA to the Escherichia coli ribosome in the presence or absence of the protein Ffh. // RNA, 2002, v. 8, p. 612-625.

3. Ковальская O.H., Сергиев П.В., Богданов A.A., Донцова O.A. Влияет ли эффективность функционирования SRP-пути на биосинтез его компонентов в Saccharomyces cerevisiae и в Escherichia соЮ Биохимия, 2006, т. 71, с. 894-901.

4. Авдеева О. Изучение взаимодействия SRP и рибосомы Е. coli. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 2001". // 10-13 апреля 2001, Москва, Сборник тезисов, с. 166.

5. Avdeeva O.N., Myasnikov A.G., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Study of Interaction between SRP and the Ribosome of E. coli. International Conference in Honour of Alexander Spirin "Protein Synthesis". II August 27 - September 1, 2001, Pushchino, Russia, Abstracts, p. 55.

6. Dontsova O.A., Sergiev P.V.. Avdeeva O.N., Shpanchenko O.V. Interaction of RNP with the E. coli Ribosome. // International Conference in Honour of Alexander Spirin "Protein Synthesis". // August 27 - September 1,2001, Pushchino, Russia, Abstracts, p. 12.

7. Sergiev P.V., Avdeeva O.N., Brimacombe R., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. Interaction of SRP with the E. coli Ribosome. // Triennial International Ribosome Conference "The Dynamics of Ribosome Structure and Function". // 27th Januany — 1st February, 2002, Queenstown, New Zealand, Abstracts, p. 45.

8. Ковальская O.H. Изучение взаимодействия стоп-пептида с рибосомой Е. coli. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным паукам "Ломоносов - 2005". //12-15 апреля 2005, Москва, Сборник тезисов, с. 54.

Принято к исполнению 25/05/2006 Исполнено 26/05/2006

Заказ № 437 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Содержание.

Ф Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Строение и функция SRP и SR из клеток животных.11 *

1.1. Структура 7SL РНК.

1.2. Структура Alu-домепа SRP.

1.3. Структура S-домена SRP.

1.4. Структура комплекса рибосома/сигнальный nenmud/SRP.

1.5. Биогенез SRP. ф 1.6. Структура SR.

1.7. Структура комплекса рибосома/сигнальный nenmud/SRP/SR.

1.8. Функция SRP и SR: ранние исследования.

1.9. Функция SRP и SR: сигнальные последовательности.

1.10. Функция SRP и SR: распределение функций между доменами SRP.

1.11. Функция SRP и SR: арест трансляции.

1.12. Функция SRP и SR: длина растущего пептида.

1.13. Функция SRP и SR: SRP - шаперон.

1.14. Функция SRP и SR: SRP54 и сигнальный пептид.

1.15. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP.

1.16. Функция SRP и SR: взаимодействие рибосомы и SRa.

• 1.17. Функция SRP и SR: роль SR/1.

1.18. Функция SRP и SR: дополнительная функция гетеродимера SRP9/SRP14.

1.19. Функция SRP и SR: SRP в посттрансляционном транспорте белков.

2. Строение и функция SRP и SR из клеток S. cerevisiae.

2.1. Структура scRl РНК.

2.2. Структура Alu-домена SRP.

2.3. Структура S-домена SRP.

2.4. Биогенез SRP.

2.5. Структура SR.

2.6. Функция SRP и SR: общие полоэ/сения.

2.7. Функция БЯР и БЯ: нарушение генов компонентов БЯР.

3. Строение и функция Б ИР и БИ. из клеток Е. соИ.

3.1. Структура /¡уТг.

3.2. Структура 4.5Б РНК.

3.3. Структура комплекса 4.5Б РНК/Р^М.

3.4. Структура

3.5. Структура комплекса Р/ИМС^зУЫС.

3.6. Функция БЯР и БЯ: ранние исследования.

3.7. Функция БЯР и БЯ: взаимодействие Ррх с 4.5Б РНК.

3.8. Функция БЯР и БЯ: общая схема работы БЯР бактерий.

3.9. Функция БЯР и БЯ: взаимодействие БЯР и БЯ, гидролиз йТР.

3.10. Функция БЯР и БЯ: роль БесА.

3.11. Дополнительная функция 4.5Б РНК.

Транспорт белков - один из важнейших процессов в жизнедеятельности клетки.Транслокация белков через мембрану может осуществляться различными путями.Посттрансляционный транспорт белков происходит после завершения трансляцииполной полипентидной цепи и требует участия шанеронов. Альтернативный путьтранслокации протекает котрансляционно. Такой тип транслокации характерен длябелков, транспортируемых из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум(endoplasmic reticulum, ER), и является важным этапом в биогенезе многих белков,включая секреторные и некоторые мембранные белки. Основным участникомкотрансляционного транснорта является цитоплазматическая сигналузнающая частица(signal recognition particle, SRP). Впервые SRP была обнаружена в клетках животных[1]. Было показано, что SRP состоит из шести белков (SRP9, SRP14, SRP19, SRP54,SRP68 и SRP72) и молекулы 7SL РНК длиной около 300 нуклеотидных остатков [1, 2].Открытие SRP в клетках дрожжей [4] и бактерий [5, 6] позволило говорить осуществовании универсального пути котрансляционного транспорта белков во всехорганизмах, а также сравнить структуру и особенности функционирования SRP изразных источников. SRP Saccharomyces cerevisiae имеет некоторые структурныесходства и отличия от SRP из клеток животных. Белки 8ф14р, 8ф54р, Бфбвр и 8ф72р,входящие в состав SRP S. cerevisiae, являются гомологами белков SRP14, SRP54, SRP68и SRP72 из клеток животных, соответственно. Структурные различия заключаются втом, что SRP РНК S. cerevisiae больше по размеру, чем выделенная из клеток животных(ее длина составляет 519 остатков), белок SRP9 отсутствует, белок SRP19 представленгомологичным ему белком Sec65p, а белок Srpl4p присутствует в виде гомодимера.Кроме того, в состав SRP iS". cerevisiae входит белок Srp21p, характерный только длядрожжей [7]. Общая схема работы SRP S. cerevisiae полностью совпадает со схемойфункционирования SRP из клеток животных: дрожжевая SRP снособна узнаватьрастущий сигнальный нентид, экспонированный на рибосоме, взаимодействовать срибосомой, вызывать остановку трансляции и взаимодействовать с а-субъединицей SRGTP-зависимым способом с последующим высвобождением пептида ивосстановлением трансляции белка на рибосоме [3, 8].В бактерии Escherichia соИ SRP содержит только два комнонента: белок Ffh имолекулу 4.5S РНК, и представляет собой так называемую «минимальную» SRP. БелокFfh и 4.5S РНК являются структурными и функциональными аналогами белка SRP54 идомена IV молекулы 7SL РНК соответственно [5, 6]. В клетках Е. coli роль асубъедипицы SR выполняет ее структурный и функциональный гомолог - белок FtsY[9]. SRP Е. coli способна узнавать сигнальный пептид и взаимодействовать с белкомFtsY, причем это взаимодействие также зависит от GTP [9, 10]. Была такжепродемонстрирована способпость бактериальной SRP взаимодействовать с белком L23рибосомы Е. coli [И, 12]. Вопрос о том, может ли SRP Е. coli вызывать остановкутрансляции, пока остается открытым.10Обзор литературы

Выводы

Нуклеотидный остаток Ш4 в 4.58 РНК в присутствии сигнального пептида и белка ИЛ образует контакт с нуклеотидными остатками сегмента 2828-2837 238 рРНК. Нуклеотидные остатки сегмента 29-50 4.58 РНК образуют контакт с 3'-концевым участком 168 рРНК и белком Б1. Образование этих контактов не требует присутствия сигнального пептида и белка РЙ1.

Обнаружение контактов 4.58 РНК с рибосомными РНК позволяет построить модель расположения 4.58 РНК на рибосомных субъединицах. В клетках 5. сегеушае существует взаимосвязь между уровнем синтеза белка мембранного рецептора ЭИР частиц и компонентов собственно 8ИР: отсутствие в клетках & сегеушае а-субъединицы 8Я приводит к уменьшению количества белка Эгр72р и мРНК белков 8гр14р, 8гр21р, 8ес65р, р-субъединицы ЭЯ; количество зсШ РНК в этих условиях не изменяется.

В клетках Е. соИ биосинтез белкового компонента ЭЯР и белка рецептора 811Р происходит независимо.

1. Walter, P., and Blobel, G. (1980) Purification of a membrane-associated protein complex required for protein translocation across the endoplasmic reticulum. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77: 7112-7116.

2. Walter, P., and Blobel, G. (1982) Signal recognition particle contains a 7S RNA essential for protein translocation across the endoplasmic reticulum. Nature 299: 691-698.

3. Pool, M.R. (2005) Signal recognition particles in chloroplasts, bacteria, yeast and mammals. Mol. Membr. Biol. 22: 3-15.

4. Brennwald, P., Liao, X., Holm, K., Porter, G., and Wise, J.A. (1988) Identification of an essential Schizosaccharomyces pombe RNA homologous to the 7SL component of signal recognition particle. Mol. Cell Biol. 8: 1580-1590.

5. Poritz, M.A., Strub, K., and Walter, P. (1988) Human SRP RNA and E. coli 4.5S RNA contain a highly homologous structural domain. Cell 55: 4-6.

6. Romisch, K., Webb, J., Herz, J., Prehn, S., Frank, R., Vingron, M., and Dobberstein, B. (1989) Homology of 54K protein of signal-recognition particle, docking protein and two E. coli proteins with putative GTP-binding domains. Nature 340: 478-482.

7. Brown, J.D., Hann, B.C., Medzihradszky, K.F., Niwa, M., Burlingame, A.L., and Walter, P. (1994) Subunits of the Saccharomyces cerevisiae signal recognition particle required for its functional expression. EMBOJ. 13: 4390-4400.

8. Mason, N., Ciufo, L.F., and Brown, J.D. (2000) Elongation arrest is a physiologically important function of signal recognition particle. EMBOJ. 19: 4164-4174.

9. Miller, J.D., Bernstein, H.D., and Walter, P. (1994) Interaction of E. coli Ffh/4.5S ribonucleoprotein and FtsY mimics that of mammalian signal recognition particle and its receptor. Nature 367: 657-659.

10. Muller, M., Koch, H.G., Beck, K., and Schafer, U. (2001) Protein traffic in bacteria: multiple routes from the ribosome to and across the membrane. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66: 107-157.

11. Gu, S.Q., Peske, F., Wieden, H.J., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2003) The signal recognition particle binds to protein L23 at the peptide exit of the Escherichia coli ribosome. RNA 9: 566-573.13