Влияние мутаций в элементах 23S pPHK на функционирование факторов элонгации Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

БУРАКОВСКИЙ ДМИТРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

Влияние мутаций в элементах 23S рРНК на функционирование факторов элонгации Escherichia coli

02.00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2007 0030ББ609

003066609

Работа выполнена на кафедре Химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им М В Ломоносова и в институте Физической биохимии города Виттен (Германия)

Научные руководители кандидат химических наук,

доцент

Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Донцова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты

доктор химических наук, вед н сотр Уткин Юрий Николаевич, кандидат биологических наук, ст н сотр Катунин Владимир Иванович

Ведущая организация

Институт Молекулярной Биологии им В А Энгельгардта РАН

Защита состоится 29 октября 2007 г в 16 00 на заседании диссертационного совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им MB Ломоносова по адресу 199992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 40, МГУ Лабораторный корпус "А" аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан 28 сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Биосинтез белка во всех живых организмах происходит на рибосомах Рибосома представляет собой сложный рибонуклеопротеид, состоящий из двух субчастиц - большой и малой В состав прокариотической рибосомы входят три молекулы РНК и более 50 белков Помимо самой рибосомы, в синтезе полипептидной цепи участвуют белковые факторы, причем некоторые из них обладают ОТРазной активностью, которая находится под контролем функционального состояния рибосомы Рибосома содержит три участка связывания тРНК (А-, Р- и Е-) и три функциональных центра декодирующий, пептидилтрансферазный и сайт связывания факторов элонгации, включающий в себя сарцин-рициновую петлю (SRJL) и центр, ассоциированный с ОТРазной активностью факторов элонгации (GAC)

Для осуществления биосинтеза белка необходима четкая координация всех функционально важных участков рибосомы и взаимодействующих с ней факторов трансляции Белок-синтезирующий аппарат является одной из важнейших мишеней для действия антибиотиков Ключевую роль в процессе трансляции играют фактор элонгации Tu (EF-Tu) и фактор элонгации G (EF-G) Эти белки необходимы в течение всего процесса трансляции EF-Tu доставляет аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы, после чего происходит аккомодация аминоацил-тРНК, суть которой заключается во встраивании 3'-конца аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы, сопровождающемся изменением конформации тРНК EF-G катализирует процесс транслокации (согласованное перемещение двух тРНК и мРНК) после пептидилтрансферазной реакции

Несмотря на большой прогресс в области биохимических, биофизических и структурных исследований рибосомы и ее комплексов, многие аспекты работы белок-синтезирующего аппарата требуют дальнейшего изучения Большинство открытых вопросов связано именно с изучением взаимодействия факторов элонгации с рибосомой

В данной работе при помощи сайт-направленного мутагенеза спирали 42 23 S рРНК моделировали движение GAC, наблюдаемое в разных функциональных комплексах рибосомы, и исследовали влияние этого движения на функционирование EF-G и EF-Tu Кроме того, в работе исследовали роль нуклеотидов U2492, С2556 и С2573 23S рРНК в доставке аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы в составе комплекса с EF-Tu и GTP Данные нуклеотиды, согласно компьютерной симуляции этого процесса, образуют сужение «коридора аккомодации» и обеспечивают паузу в аккомодации

Цель работы

1 Исследовать влияние конформации центра, ассоциированного с ОТРазной активностью, на работу факторов элонгации трансляции Escherichia coli

2 Выяснить роль нуклеотидов U2492, С2556 я С2573 в аккомодации аминоация-тРНК

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе данной работы при помощи сайт-направленного мутагенеза получены рибосомы Е coli, несущие делецию пары нуклеотидов C1030/G1124 (AC1030/G1124) или вставку дополнительной пары нуклеотидов (InsC1030/Gl 124) в основании спирали 42 23S рРНК, а также рибосомы, несущие мутации UUU2491-3UC, &2573, Д2572, A2572U и С2573А в 23S рРНК Мутации 23S рРНК, описанные в данной работе, не были ранее упомянуты в литературе Рибосомы с мутациями были охарактеризованы с помощью различных тестов in vivo и in vitro

Мутации AC1030/G1124 и InsC1030/Gl 124 имитировали движение GAC, наблюдаемое в разных функциональных комплексах рибосомы Было обнаружено, что вставка пары нуклеотидов сказалась па функционировании EF-G, но не повлияла на работу EF-Tu Таким образом, была сформулирована модель селекции факторов

элонгации рибосомой в зависимости от ее функционального состояния Открытая конформация GAC соответствует претранслокационному комплексу, способному связать EF-G, закрытая - постгранслокационному комплексу, готовому к связыванию EF-Tu Для быстрого и точного синтеза белка в процессе трансляции должна осуществляться координация работы всех функциональных центров рибосомы В связи с этим, важно понять механизм обмена информацией между функциональными центрами рибосомы Структурные исследования рибосом с мутацией InsC1030/G1124 методом химического пробинга позволили предположить, что сигнал от пептидилтрансферазного центра к центру связывания факторов элонгации может передаваться путем конформационных изменений спиралей 39, 89, 42 и 91 23S рРНК и движения элемента, состоящего из спиралей 96/97 23S рРНК

Еще одним важнейшим аспектом функционирования рибосомы является аккомодация аминоацил-тРНК - одна из стадий, определяющих точность синтеза белка Ранее опубликованная компьютерная модель, описывающая работу EF-Tu, выявила ряд универсально-консервативных нуклеотидов 23S рРНК (U2492, С2573, А2572), формирующих «ворота» на пути 3'-конца аминоацил-тРНК во время аккомодации Эти «ворота» располагаются непосредственно перед пептидилгрансферазным центром и, предположительно, могут обеспечивать дополнительную паузу для диссоциации комплекса аминоацил-тРНК и рибосомы в случае несоответствия кодона и антикодона В данной работе размер «ворот» варьировали при помощи сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов, их формирующих или находящиеся в непосредственной близости от них Исследование влияния мутаций UUU2491-3UC, Д2573, Д2572, A2572U и С2573А на скорость аккомодации аминоацил-тРНК при помощи методов быстрой кинетики показало, что нуклеотиды, образующие «ворота», не важны для скорости аккомодации аминоацил-тРНК Однако одна из исследованных мутаций (UUU2491-3UC), изменяющая конформацию спирали 89, не взаимодействующей с пептидилтрансферазным центром, полностью блокировала его активность

Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены важные результаты, позволяющие по-новому рассмотреть функционирование 23 S рРНК, в особенности, взаимодействие пептидилтрансферазного центра и участка связывания факторов элонгации

Комплекс т vivo и т vitro тестов, использованный в данной работе для изучения структурно-функциональных особенностей рибосом с мутациями, может быть с успехом применен для изучения многих других рибонуклеопроаеидных комплексов

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях международной конференции «тРНК-2005», Бангалор, Индия, 2-7 декабря 2005 г , международной конференции «РНК-2006», Сиэтл, США, 20-25 июня, 2006 г , 8-й международной конференции по молекулярной биологии института им Энгельгардта «РНК-белковые взаимодействия», пансионат Буран, Московская обл, Россия, 19-24 августа 2006 г, международном симпозиуме Медицинского института Говарда Хьюза, Эшберн, США, 26-29 сентября 2006 г, международной конференции «Рибосомы форма и функция», Северный Фальмут, США, 3-8 июня 2007 г

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы и выводы Материал иллюстрирован 43 рисунками и 6 таблицами Библиографический указатель включает 197 цитированных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Влияние мутаций в спирали 42 23S рРНК на функционирование факторов элонгации

Рибосома представляет собой большую молекулярную машину, осуществляющую биосинтез белка В процессе элонгации EF-Tu приноси аминоадил-тРНК (аа-тРНК) в А-участок рибосомы Только в случае комплементарного взаимодействия кодона и антикодона в декодирующем центре малой субчастицы происходит стимуляция ОТРазной активности EF-Tu центром связывания факторов элонгации большой субчастицы Вслед за гидролизом GTP происходит аккомодация аа-тРНК в A-участок рибосомы и последующий быстрый перенос пептида с тРНК в Р-участке на аа-тРНК в А-участке После переноса пептида, осуществляемого в пептидилтрансферазном центре (РТС), с рибосомой взаимодействует EF-G EF-G связывается с рибосомой, содержащей деацшшрованную тРНК в Р-участке и пептидил-тРНК в A-участке Известно, что связывание EF-G и стимуляция его ОТРазной активности зависит от состояния ССА-конца тРНК, связанной в Р-участке рибосомы деацилированная тРНК стимулирует многораундовый гидролиз GTP, а пептидил-тРНК - нет Таким образом, сигнал о состоянии тРНК в Р-участке рибосомы должен передаваться из РТС к центру связывания факторов элонгации более чем на 70 Á, что составляет примерно половину диаметра рибосомы

Механизм обмена информацией между рибосомными функциональными центрами до сих пор не изучен Мы предполагаем, что передача сигнала может осуществляться в виде последовательных конформационных изменений подвижных элементов рибосомы Мы решили проверить нашу гипотезу, исследовав передачу сигнала от пептидилтрансферазного и декодирующего центров рибосомы к центру связывания факторов элонгации

Центр связывания факторов элонгации состоит из SRL и GAC Во всех определенных структурах рибосом и рибосомных субчастиц из различных организмов, SRL занимает одинаковое положение GAC, напротив, подвижен Он может двигаться, удаляясь от спирали 89 23S рРНК или приближаясь к ней Эти две конформации в литературе называют, соответственно, «открытой» и «закрытой» В структурах 50S субчастицы Н marismorlui и D radiodurans положение GAC отличается примерно на 20 Á Более того, эти конформации GAC видны в крио-ЭМ реконструкциях различных функциональных комплексов рибосомы Закрытая конформация GAC наблюдается в комплексе рибосом с EF-G*GDPNP и с EF-Tu'GDP'aa-тРНК в присутствии кирромицина, а открытая конформация - в комплексе с EF-G*GDP, стабилизированном фузидовой кислотой

GAC соединяется с остальной частью 23S рРНК посредством спирали 42 23 S рРНК В данной работе при помощи мутагенеза мы моделировали переход GAC в открытую и закрытую конформацию вне зависимости от функционального состояния рибосомы и исследовали влияние изменения положения GAC на функционирование рибосомы и факторов элонгации, а также конформацию 23 S рРНК Для этого мы произвели делецию или удвоение комплементарной пары оснований C1030/G1124, располагающейся в основании спирали 42 Опираясь на базовые знания о структуре РНК, можно предположить, что вставка пары нуклеотидов в основание спирали 42 должна приводить к удлинению спирали на 3 3 Á и повороту на 33°, а удаление пары оснований -к укорочению спирали на 3 3 Á и повороту на 33' в противоположном направлении При этом GAC, присоединенный к спирали 42, при удалении или удвоении пары C1030/G1124 в основании спирали 42 также должен поворачиваться и двигаться вверх или вниз, а, поскольку спираль 42 и присоединенный к ней GAC образуют L-образную структуру, перемещение отдельных районов GAC может быть еще более значительным

Удаление пары C1030/G1124 должно приводить к уменьшению расстояния меяэду спиралью 89 и GAC и движению GAC вверх, что имитирует поведение GAC при связывании EF-G'GDPNP или EF-Tu«GDP«aa-TPHK в присутствии кирромицина

Вставка дополнительной пары C1030/G1124 должна осуществлять движение GAC вниз, удаляя его от положения, занимаемого в комплексах рибосомы с EF-G'GDPNP или EF-Tu»GDP»aa-TpHK в присутствии кирромицина

1 2 Влияние мутаций на скорость роста клеток и точность трансляции т vivo

Делеция C1030/G1124 (AC1030/G1124) не привела к изменению жизнеспособности клеток даже в том случае, если мутантную рДНК экспрессировали в клетке в отсутствие рДНК дикого типа Вставка дополнительной пары нуклеотидов (InsC1030/G1124) оказалась летальной Мутантная рДНК могла экспрессироваться только под контролем регулируемого промотора, при этом жизнь клетки поддерживалась экспрессией рДНК дикого типа Влияние мутаций на точность трансляции гп vivo исследовали с помощью набора репортерных плазмид, экспрессирующих ген (3-галактозидазы

Каждая плазмида из этого набора (кроме конструкции pSG25, которую использовали для контроля) содержит мутацию в гене lacZ, что приводит к синтезу неактивного белка, если трансляция соответствующей мРНК происходит без ошибок (табл 1) Синтез активного фермента возможен только в результате ошибок трансляции, таких как сдвиг рамки считывания, ошибочное прочтение стоп-кодонов или ошибочное включение аминокислотного остатка, компенсирующих мутацию в ДНК

Мутация AC1030/G1124 не сказалась на точности трансляции, в то время как мутация InsC1030/G1124 привела к значительному увеличению частоты прочтения стоп-кодонов как значащих и сдвигу рамки считывания -1 (табл 2) Уровень синтеза р-галактозидазы дикого типа, закодированной на контрольной репортерной плазмиде, также был увеличен в случае мутации InsC1030/Gl 124 Этот эффект характерен для значительно влияющих на жизнеспособность клетки мутаций и объясняется увеличением интенсивности биосинтеза рибосом дикого типа

Таблица 2 Влияние мутаций 1п5С1030Л31124 и ДС1030/01124 на точность трансляции Представлены значения активности Р-галактозидазы в единицах Миллера Чем больше активность фермента, тем больше уровень ошибок трансляции ____

Мутация 23S рРНК Тестовая плазмида

рЬС25 pSG 853 pSG 12-6 pSG 3 М pSG 1ас7 pSG 12DP PCSH 103

Wt 3980 ±700 2 2 ± 0 1 6 8 ±0 3 45 ±3 43 ±4 47 ±4 0 61 ±0 08

ACÍ030/G1124 4500 ± 400 3 5±0 I 76±05 48 ±5 46 ±4 37 ±4 0 47 ± 0 08

InsC1030/G1124 6500 ± 500 9 3 ± 0 8 18±1 8 92 ± 10 72 ±5 119 ± 3 0 71 ±0 08

1.3 Очистка мутантных рибосом

Рибосомы с мутациями АСЮЗО/СТ124 и ЬмСЮЗОЛЛШ были выделены из смеси с рибосомами дикого типа при помощи аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе за РНК-айтамер к стрептавидану, который был клонирован в 23Б рРНК Рибосомы дикого типа, содержащие аналогичный аптамер и очищенные таким же образом, как рибосомы с мутациями, были использованы в качестве контроля во всех дальнейших экспериментах

Таблица 1 Плазмиды, кодирующие ген lacZ с разчичными мутациями _

плазмида мутация

PSG25 Ген 1асг дикого типа

pSG 12-6 Прочтение кодона илО как значащего

pSG 853 Прочтение кодона иАА как значащего

pSG 3/4 Прочтение кодона 1ЮА как значащего

pSG 12DP сдвиг рамки считывания -1

pSG Iac7 сдвиг рамки считывания +1

f CSH 103 Замена 01и46Ю1п в активном центре фермента

1,4 В л цент- мутаций на формацию 23Й р1'НК согласно данным химического

□робннга

Мы обнаружили три района 23К рРНК, в которых изменялась доступность нуклеотидот* для химической модификации в результате мутации ШбСЮЗО/О! 124. Как и ожидалось, наиболее сильно изменяли реакционную способность основания 2472-2483, 2529-2532.2661-2662, повлеченные во взаимодействие спиралей 89, 91 и 95 (рис, 1, 2).

ОМЭ Ке1 ипт

АСви 1м |«<

| ипт ОМБ Кв( АС01М I чп мл I

сглз ипгп

АСйи ыипм

(ОЭ5Е

(йюгб

А1029

401128 4(31131

ОМЭ КеШпт

АСби 1 нл I

Н__ОМЭ Кс( ипгп

АСОи ни) 1ип

1А2060 52061

462238

с ОМЯ Ке! ОМС Опт

АССи 1** Iм Iчл

4^2454

Ж___и«т

АСби I мл I

V 402529 Щ<*М» -4^2532

* „ ОМЙ Ке» илт

АССи '« | и«

ЩГ

^02250 402256

3 ОМЭ КМ илт

АСби 1*1

422655

4А2057

И

АСОи

□ МБ Кс1 ипт

[ Wt I У**

402472 ^И2477

4С24ЙЗ

4027Й1 ■Л А2764

АСОи ил

1А2856

г

'I ОптКе!

АССи

—

Т' 4С252Э

ипт КИ АСви wt А wt Л

401115

402702 4Д2705

т ипт Ке1

АСОи л

~^402751

- ■■

Рисунок Химический [|р(Х~ЖИГ 235 р РН К н рибосомах с мутациями (пкСЛОЗО/и 1124 (I ЛСЮЗи/О ! ]24г А, С, <1 II и - лорожки снквснса, ипт - бет Модифицирующего агента, 0МЗ - модификация димсгнлсулъфатом, К*' - модификация кетоксалем, ГМС - модификация 1 М' ! V.' [ И д | - ! I дорожки. соотпстстпуюшие рибосомам дикого ~■ ■"г. и рибосомам с му[Т1ИН4М и IпяС 1^03В>/С 1124 и ЛС1 [П !)/<))!24, соотасго! оенно.

Это .согласуется с нашим предположением о том, что в результате мутации 1п5С1030,'01124 ОАС должен двигаться «вниз» и образовывать контакт со спиралью 89, влияя на взаимодействие спирали 89 с соседними спиралями 91 И 95. Важным результатом является то, что конформациояные изменения, индуцируемые контактом С АС со спиралью 89, передаются на сарцй^-рициновую петлю и изменяют ее структуру.

Еще одна группа пукле от и доя, изменяющих реакционную способность в результате мутации 1пзС1030/01524, была обнаружена в спиралях 80 {Р-петля), 39 и 89

(нуклеотиды 2250-2256, 956-960, 2454 и 2491-2493) (рис, 1. 2). Эти спирали соединяют РТС рибосомы (спираль ЯО, Р-петля) через спираль 39 и спираль 89 с САС и ЙРХ (рис, 2),

Также реакционная способность менялась у нуклеотидов. которые образуют третичные контакты стержня, состоящего из спиралей 96 и 97 {нуклеотиды 2702-2705, 2751 и 2764-2766) (рис. 1, 2). Эгот стержень начинается под «локтем» спирали 42 и ОАС и проходит практически через всю 508 субчастицу, причем посередине к стержшо присоединена БКЬ (спираль 95).

Результаты использования химической модификаций для изучения рибосом с мутацией ДС1030/01124 согласуется с предполагаемым движением (ПАС «и вер к», от спирали 89 и Два изменяющих реакционную способность основания расположены в месте контакта спиралей 42 и 97 (нуклеотиды ОI 115 и 02751), еще одно образует контакт между спиралями 89 и 91 (02529),

Результаты химическою иробинга выявили цепочку нуклеотидов, соединяющих Р-петлю через спирали ЗУ, 89, 91 и 42 с центром связывания факторов элонгации, состоящим из ОАС к (рис. 1, 2), и подверженных при этом конформациоиимм изменениям.

Рисунок 2. Нуклеотиды 23К рРНК, изменяющие реакционную способность по отношению к DMS, СМСТ и кетохсалю и результате мутации JibClOJO/Gl 124 н ¿СЮЗО/G1124. А. Схематическое изображение вторичной структуры 23S рРНК. Закрашенными треугольниками показаны нуклеотиды, реакционная способность которых уь;-.'и-<кналась в результате м упиши !nsCI0j0/Gt 124, i-е з&крашеннымн 1рсуГ0лы1.:каки показаны нуклео i И. j :. реакционная способность которых } '.'C '>ii ::.';k '. в результате мутации InsClüíO/fil 124. Закрашенными кружками показаны нуклеотиды. реакционная способность которых увеличивалась и результате мутации ACi030/G' Обведенная прямоугольником пара нуклеотидов C-G обозначает место вставки/делеиии. К. и В. - Расположенно нуклеотидов 23S рГНК, реакционная способность которых изменялась ti pe : те мутации IjisC 3 030/G1124 Í13) или ДСЮЗО/GI124 (В) в третичной структуре 50$ субчастицы. Серыми ван-дер-Ваальсовыми сферами показаны нуклеотиды, реакционная способность которых в результате мутаций увеличивалась, пунктирной стрелкой показаны нуклеотиды, реакционная способность которых в результате кутании iiisCl'JjO/G 1124 уменьшалась. Черной стрелкой обозначено направление предполагаемого движения GAC в результате мутаций.

Химический прооинг рибосом с мутацией lnsEl030/Gl Í24 позволяет обнаружит!, еще один подвижный элемент структуры 23S рРНК, взаимодействующий со спиралью 42, который может быть вовлечён в цепь передачи он нала или Сыть важным для определения движения GAC вниз н вверх. Этот элемент представляет собой длинный стержень, состоящий ич спиралей 9(í и 97, который пронизывает- 50S субчастицу сверху донизу. Этот стержень может двигаться вниз под давлением ОАС, делая нуклеотиды петли на конце спирали 96/97 доступными для химической модификации. Возврат Стержня в исходное положение приводит к защите птих нуклеотидов от химической модификации (в рибосомах диког о типа).

1 5 Влияние мутаций на элонгацию трансляции in vitro

Исследование активности рибосом в полиуридилат-программированном синтезе полифенилаланина ш vitro показало, что мутация InsC1030/G1124 привела к значительному (на 80%) уменьшению синтеза полифенилаланина, в то время как рибосомы с мутацией AC1030/G1124 синтезировали полифенилаланин наравне с рибосомами дикого типа

Чтобы проверить способность мутантных рибосом осуществлять отдельные стадии трансляции, мы исследовали их в системе пошаговой трансляции т vitro с использованием мРНК, кодирующей пептид MFK Эффективность протекания отдельных стадий трансляции определяли методом тоупринтинга (рис 3)

Мы исследовали следующие стадии трансляции связывание инициаторнон fiviei-TPHKfMet с Р-участком рибосомы с образованием инициаторного комплекса (сигнал в положении +16), связывание Phe-TPHKphe с А-участком при добавлении тройного комплекса к инициаторному комплексу (дополнительный сигнал в положении +17), транслокацию при добавлении EF-G'GTP (сигнал в положении +19 и +20) и еще один раунд трансляции при добавлении EF-Tu»GTP«Lys-TPHKLys (сигнал в положении +22) Мутация InsC1030/G1124 не повлияла на образование инициаторного комплекса и связывание аа-тРНК в А-участок (рис ЗБ, дорожки 1 и 2) Она привела уменьшению эффективности транслокации, однако не нарушила ее полностью (рис ЗБ, дорожки 3 и 4)

so

+16 +19 +21

- —; иис г —

-AAGGAG AUAUACC AUG UUC AAG UAC-М F К

wt_str 1 2 3 4 1

ins

2 3 4

ч+1б

■<+17 -<+19 "<+20 -<+22

wt_str 0 1 2 3 4,1

Щ}<

ins

2 3 4

-.+16 "<+17

<+19 <+20

<+22

Рисунок 3 Тестирование т vitro функциональной активности рибосом Е coli с мутацией InsCl030/Gl 124 А Фрагмент нуклеотидной последовательности синтетического аналога мРНК Выделены последовательность Шайна-Дальгарно (SD), транслируемые кодоны и соответствующие сигналы (сверху) тоупринтинга М, F, К. - соответствующие кодонам аминокислотные остатки Б Анализ пошаговой трансляции при помощи тоупринтинга Дорожки 1 - 70S'MFK-MPHK'fMet-TPHKtM", 2 - 70S'MFK-MPHK*fMet-TPHKfMel + EF-Tu'GTP'Phe-TPHKpl"\ 3 - 70S'MFK-MPHK'TPHKfMe,'Met-Phe-TPHKpte + EF-G'GTP, 4 - добавление EF-Tu'GTP'Lys-TPHKLy> к комплексу дорожки 3 Нумерация остановок (указано справа) обратной транскриптазы ведется от А инициаторного колона AUG В Анализ пошаговой трансляции при помощи тоупринтинга в условиях, когда спонтанная транслокация невозможна Дорожки О - MFK-mPHK без рибосом и тРНК, I - 70S'MFK-MPHK'TPHKfVIM, 2 - 70S-MFK-MPHK>TPHKfM" + AcPhe-тРНКРЬе, 3 - 70S'MFK-MPHK>TPHKfM5t •AcPhe-TPHKPhl: + EF-G'GTP, 4 -добавление EF-Tu'GTP'Lys-TPHKLys к комплексу дорожки 3 Нумерация остановок (указано справа) обратной транскриптазы ведется от А инициаторного кодона AUG

Некоторая часть пептидил-тРНК подвергается транслокации до добавления EF-G'GTP в случае рибосом дикого типа, но не в случае рибосом с мутацией InsC1030/Gl 124 (рис ЗБ, дорожка 2) Эта транслокация может быть спонтанной или происходить из-за присутствия примеси EF-G в препарате EF-Tu Мы повторили пошаговую трансляцию в условиях, когда спонтанная трансло-кация невозможна На первой стадии в Р-участок

связывали деацилированную тРНК/"16' (сигнал в положении +16), затем в А-участок связывали ЛсРЬе-тРНКИш без использования ЕР-Ти (дополнительный сигнал в положении +17) Транслокацию индуцировали добавлением ЕР-О'ОТР (сигнал в положении +19 и +20) Как и ожидалось, спонтанная транслокация отсутствовала (рис ЗВ, дорожка 2 ) В случае рибосом с мутацией 1пзС1030Л31124 эффективность транслокации очень мала (рис ЗВ, дорожки 3 и 4) Эти результаты показывают, что мутация 1пзС1030/С1124 не влияет на функционирование ЕР-Ти, однако нарушает функционирование ЕИ-О

1.6 Связывание факторов элонгации с рибосомой

В связи с обнаружением влияния мутации 1пэС1030/01124 на стадии трансляции, связанные с функционированием ЕР-О, было решено исследовать влияние этой мутации на связывание ЕР-в с рибосомой при помощи футпринтинга Известно, что ЕР-О сильно защищает от модификации нуклеотид А2660, расположенный в БЫ,, и слабо защищает нуклеотид А1067, расположенный в ОАС Сравнение интенсивности характеристических полос для рибосом дикого типа и рибосом с мутацией ТпзС1030/01124 (рис 4А, Б) показало, что мутация значительно ухудшает, но не нарушает полностью, связывание ЕР-О^ОБРИР и ЕР-О-вОР в присутствии фузидовой кислоты

При помощи химического футпринтинга мы также изучили влияние мутации 1пзС 1030/01124 на связывание ЕР-Ти с рибосомой Известно, что ЕР-Ти, связываясь с рибосомой после транслокации в составе тройного комплекса ЕР-Ти-СТР-аа-тРИК, защищает от химической модификации нуклеотиды А2660 и А2665, расположенные в ЭКЕ Тройной комплекс ЕР-ТиЮТР«РЬе-тРШСР1ю связывали с рибосомами, программированными МЕК-мРНК и содержащими Ще^тРНК/4" в Р-участке Сравнение характеристических полос (рис 4В) не выявило существенных различий между рибосомами дикого типа и рибосомами с мутацией 1пзС1030/01124 Это означает, что мутация квС1030/01124 не влияет на связывание ЕР-Ти

А Б В

Wl_tfT ins Wt_stf Ins w»_slr ins Wl_stf fr» wt_sfr Ins wl_str Ins w» а ins

К А С © Ü 1 2 3 1 2 3 A S 6 4 5 6 7 в 9 7 6 9 А С © U К \ г з 1 г з 4 5 6 й S 6 7 8 9 7 8 9 К А С G U \ 2 1 2

Ptfi, LJi^ «Mi-j«, ■ЧА106Г

/ Ifl <A26S0 ЗЫ ШЫ ш Iii £ -

tfl il| 8щ

Рисунок 4 Взаимодействие рибосом с мутацией InsC1030/Gl 124 с факторами элонгации согласно данным футпринтинга (модификация DMS) Футпринтинг EF-G на SRL (А) и GAC (Б) Дорожки А, С, G, U -дорожки сиквенса, К - ^модифицированная РНК, 1 - 70S без тРНК, мРНК и EF-G, 2 - 70S + EF-G-GDPNP, 3 - 70S + EF-G-GDP + фузидовая кислота, 4 - 70S-MFK-MPHK>TPHKrMa, 5 - 70S'MFK-MPHK*TPHKfMM + EF-G'GDPNP, 6 - 70S*MFK-MPHK>TPffiCfMM + EF-G'GDP + фузидовая кислота, 7 - 70S*MFK-mPHK* fMet-TPHKfMn, 8 - 70S-MFK-mPHK> £Met-TPHKtMM + EF-G'GDPNP, 9 - 70S'MFK-mPHK> fMet-TPHKfMd + EF-G-GDPNP + фузидовая кислота В Футпринтинг EF-Tu-GDPNP-Phe-TPHKpte на SRL (модификация DMS) Дорожки 1 - 70S-MFK-MPHK' fMet-TPHK,MM, 2 - 70S=MFK-mPHK' fMet-TPHK™" + EF-Tu'GDPNP-Phe-тРНКр|"!

Сигналы футпринтинга EF-Tu и EF-G в случае рибосом с мутацией AC1030/G1124 не отличаются от соответствующих сигналов для рибосом дикого типа Тот факт, что мутация InsC1030/G1124 не влияет на функционирование EF-Tu, но значительно нарушает связывание EF-G, говорит о том, что данная мутация, по-видимому, фиксирует положение GAC, благоприятное для взаимодействия с EF-Tu, но неблагоприятное для взаимодействия с EF-G

1.7 Стимуляция вТРазной активности ЕР-Ти при соответствии кодона мРНК и

антикодона тРНК

Стимуляция ОТРазной активности ЕР-Ти при связывании тройного комплекса с рибосомой в постгранслокационном состоянии происходит только в том случае, если кодон мРНК в А-участке и антикодон тРНК комплементарны Мы изучили влияние мутации 1пзС 1030/СЗ1124 на стимуляцию ОТРазной активности ЕР-Ти с использованием комплекса рибосомы с МРК-мРНК и Ше{-тРНК(Мм в Р-участке, моделирующего поспранслокационное состояние, к которому добавляли тройной комплекс ЕР-Ти*[7-32Р]СТР'РЬе-тРНКР1,с с соответствующим кодону антикодоном аа-тРНК Связывание тройного комплекса с рибосомой сопровождалось гидролизом ОТР как в случае рибосом дикого типа, так и в случае рибосом с мутацией ЬиС 1030Л31124 (рис 5А) При добавлении тройного комплекса ЕР-Ти»[у-згР10ТР*Ьуз-тРНК''у5, антикодон которого не соответствовал кодону, стимуляция гидролиза ОТР не наблюдалась ни в случае рибосом дикого типа, ни в случае мутантных рибосом (рис 5А) Таким образом, движение ОАС не влияет на стимуляцию гидролиза ОТР фактором ЕР-Ти

1.8 Стимуляция СТРазной активности Е^в деацилированной тРНК в Р-участке

рибосомы

В то время как ОТРазная активность ЕР-Ти регулируется кодон-антикодоновыми взаимодействиями в декодирующем центре рибосомы, связывание ЕР-О с рибосомой и стимуляция его ОТРазной активности находятся под контролем тРНК, связанной в Р-участке рибосомы Известно, что деацилированная тРНК в Р-участке имитирует ситуацию после переноса пептида и стимулирует связывание ЕР-в и его вТРазную активность

А

00-1 >,65-

§80- _ -

1§ 70- в _г --—-----

о. 65 - ' ^—1

2 60- —----"

0. 55 - 1

о : 1

0 1

1 35- 5 8 зо- > 8 25- !

I:

а <5"

а: ю- * _ _-----— _

^ о!—I , I—,—,—,—,—,—,—т-

0 5 10 15 20 25 30

Время мин

Рисунок 5 Измерение стимуляции ОТРазной активности факторов элонгации рибосомами дикого типа и рибосомами с мутацией 1п5С1030/&1124 А Временная диаграмма гидролиза ОТР тройным комплексом ЕР-Ти-[у-32Р]СТР-Ьуз-тРШС1-у8(квадраты) или ЕР-Ти-[у-32Р]ОТР-РЬе-тРНКг,1е (круги), стимулированного комплексом 708-ШК-мРШ>£МемРНК/,,!' Б Скорость гидролиза [у-32Р]ОТР фактором ЕР-О, стимулированная рибосомами без мРНК и тРНК (квадраты) и комплексом 708-(полии)-мРНК,тРНК1'1"! (круги) в зависимости от концентрации ЕР-О В (А) и (Б) Черные цветом обозначены кривые, соответствующие рибосомам дикого типа, серым цветом обозначены кривые, соответствующие рибосомам с мутацией 11«>С1030/431124

Мы решили проверить, влияет ли мутация 1пзС1030/01124 на такой тип регуляции Сначала мы измерили гидролиз вТР фактором ЕР-О в присутствии рибосом без тРНК (рис 5Б) Рибосомы, несущие мутацию 1шС1030/01124, стимулировали гидролиз ОТР фактором ЕР-О слабее, чем рибосомы дикого типа, что согласуется с ухудшением

Б

00 02 04 0,6 08

связывания фактора рибосомами с мутацией Однако нельзя исключить, что и другие этапы функционирования EF-G также могут быть нарушены

Далее, был исследован гидролиз GTP фактором EF-G в присутствии полиуридилат-программированных рибосом, содержащих деацилированную тРНКРЬе в Р-участке Как и ожидалось, деацилированная тРНК в Р-участке рибосом дикого типа стимулировала ОТРазную активность EF-G (рис 5Б) Рибосомы с мутацией ЛСЮЗО/Gl 124 стимулировали гидролиз GTP фактором EF-G наравне с рибосомами дикого типа (данные не показаны), что также согласуются с данными экспериментов по связыванию EF-G с мутантными рибосомами Однако в случае рибосом с мутацией InsC1030/G1124 не наблюдалось различий в стимуляции ОТРазной активности EF-G рибосомами без тРНК и рибосомами, несущими тРНК в Р-участке (рис 5Б)

Таким образом, мутация InsC1030/Gl 124 повлияла только на функционирование EF-G Другие этапы трансляции не были нарушены Рибосомы с мутацией InsC1030/Gl 124 способны связывать тРНК в Р- и А- участки наравне с рибосомами дикого типа Связывание EF-Tu с рибосомами дикого типа и рибосомами с мутацией InsC1030/G1124 тоже происходило с одинаковой эффективностью Рибосомы дикого типа и рибосомы с мутацией InsC1030/G1124 стимулировали гидролиз GTP фактором EF-Tu с одинаковой интенсивностью при комплементарном кодон-антикодоновом взаимодействии Можно предположить, что мутация InsC1030/Gl 124 изменяет структуру рибосомы таким образом, что нарушаются функции рибосомы, связанные с EF-G -Наблюдаемое т vivo увеличение сдвига рамки считывания -1 в клетках, экспрессирующих 23S рДНК с мутацией InsC1030/G1124, согласуется с моделью сдвига рамки считывания, согласно которой сдвиг рамки считывания -1 связан с претранслокационным состоянием, и, соответственно, замедление транслокации должно увеличивать вероятность сдвига рамки считывания -1

Несмотря на то, что рибосомы с мутацией InsC1030/Gl 124 не полностью утратили способность связывать EF-G, они полностью утратили способность стимулировать гидролиз GTP фактором элонгации G при связывании деацилированной тРНК в Р-участок Такой эффект можно ожидать, если нарушена система передачи сигнала, которая стимулирует ОТРазную активность EF-G при связывании в Р-участок деацилированной тРНК Конформационный сигнал о том, что пептидилтрансферазная реакция завершилась, наиболее вероятно исходит от Р-петли Эта петля взаимодействует с ССА-концом тРНК в Р-участке, но не взаимодействует с деацилированной тРНК в гибридном Р/Е-участке По-видимому, именно тРНК в гидрибном Р/Е-участке, а не в классическом Р/Р-участке, стимулирует многораундовый гидролиз GTP фактором EF-G

2 Изучение влияния мутаций 23S рРНК на скорость аккомодации аминоацил-тРНК

Прогресс методов компьютерного моделирования в настоящее время позволяет применять их даже для изучения таких сложных биологических процессов, как трансляция Важным преимуществом компьютерной симуляции является возможность изучать промежуточные состояния, которые нельзя зафиксировать при помощи различных биохимических методов Тем не менее, на данный момент уровень компьютерного моделирования сложных систем еще не настолько высок, чтобы полностью избавить ученых от экспериментальной работы, поэтому любые полученные т silico данные требуют экспериментальной проверки

Сравнительно недавно (Sanbonmatsu et al (2005) PNAS 102 15854-15859) было осущес1влено компьютерное моделирование одной из самых важных стадий трансляции -аккомодации аа-тРНК Аккомодация происходит после того, как произошел гидролиз GTP фактором элонгации Tu При этом положение антикодона практически не изменяется, а

ССА-конец аа-тРНК перемещается примерно на 70 А в РТС, где происходит включение остатка аминокислоты в растущую пептидную цепь В случае соответствия кодона и антикодона аккомодация аа-тРНК происходит достаточно быстро и эффективно, и диссоциация комплекса аа-тРНК с рибосомой практически не происходит В случае частично комплементарного кодон-антикодонового взаимодействия аа-тРНК диссоциирует из комплекса с рибосомой как вследствие нестабильного связывания антикодона в декодирующем центре, так и из-за низкой скорости аккомодации Таким образом, скорость аккомодации аа-тРНК играет очень важную роль в обеспечении точности трансляции

Согласно компьютерной симуляции, аа-тРНК продвигается в сторону РТС по «коридору» из 20 высококонсервативных нуклеотидов Непосредственно перед тем, как попасть в РТС, ССА-конец аа-тРНК взаимодействует с тремя высококонсервативными основаниями 23Э рРНК С2573, С2556 и 112492, причем это взаимодействие на некоторое время задерживает его движение Первая остановка происходит при взаимодействии ССА-конца тРНК с основаниями С2556 и 112492, сахарофосфатный остов которых образует своеобразные «ворота» на входе в РТС Движение продолжается, когда расстояние между основаниями значительно возрастает («ворота открываются») Вторая остановка обусловлена взаимодействием ССА-конца тРНК с нуклеотидом С2573 238 рРНК Согласно литературным данным, два из трех нуклеотидов, участвующих в образовании «ворот», располагаются в районах 23Б рРНК, мутации в которых влияют на точность трансляции (рис 6)

Можно предположить, что любые изменения размера «ворот» будут влиять на скорость аккомодации В данной работе мы решили изучить влияние взаимодействия аа-тРНК с образующими ворота нуклеотидами на скорость аккомодации аа-тРНК Для этого мы подвергли сайт-направленному

мутагенезу нуклеотиды, участвующие в образовании «ворот», а также нуклеотиды, которые могут влиять на размер ворот

Первая пауза в аккомодации связана с нуклеотидами С2556 и и2492 В образовании ворот участвуют не гетероциклические основания этих нуклеотидов, а их сахарофосфатный остов Это означает, что сузить или расширить «коридор аккомодации» в районе этих оснований можно только, влияя на вторичную структуру элементов рибосомы, в состав которых входят эти нуклеошды

Расположение нуклеотида С2556 во вторичной структуре 23Э рРНК и тот факт, что гетероциклическое основание этого нуклеотида развернуто в сторону от «коридора аккомодации», делает невозможным предсказуемое изменение размера «ворот аккомодации» при заменах этого нуклеотида

Нуклеотид Ш492 расположен в спирали 89 23 Э рРНК, для которой предложено существование двух альтернативных вторичных структур (рис 7А, Б) Существование структуры А подтверждается с помощью РСА, а существование альтернативной структуры Б, в которой происходит спаривание нуклеотидов Ш491-А2459, предсказывается с помощью ковариационного анализа, проведенного Гуттелом Есть основания полагать, что образование альтернативной структуры временно происходит на каких-то стадиях трансляции Так, во многих живых организмах нуклеотиды в

РТС

1124600 вл<1 J Спираль 69

„ „е си «»Д2493

™4 :л иг49ЭС

СА Спираль 89

РТС

^-'л | Сгшраль 91

-

Рисунок 6 Расположение нуклеотидов важных для обеспечения точности трансляции (А), и нуклеотидов, образующих ворота аккомодации (Б), во вторичной структуре 23 Э рРНК

ACCeCCCAASAßUu GGC 4! GAUACCGCCCAAGAG0

I I I I I I ¡I С I p I 1 1 I llllll 11

UGGCGGCAGCU А „А CCOO, UUGUGGCGGCAGC U

Cm

2490

положениях, эквивалентных U2491 и A2459, могут образовывать комплементарные пары Чаще всего это именно A-U или G-C пара, но иногда, очень редко, возможно возникновение неканонической пары G-U

Структура, наблюдаемая Альтернативная структура МуТ£ЩИЯ UTJU2491-3UC

, с должна стабилизировать

"" / „ только структуру Б и

AUACCGCCCAAGAG n г ^

исключать образование структуры А Замена G2458C / / должна дестабилизировать

Рисунок 7 Возможные варианты структуры спирали 89 23S рРНК структуру Б, не влияя

на структуру А, а двойная мутация U2491C/G2458C должна еще больше дестабилизировать структуру Б Для проверки образования комплементарной пары нуклеотидами 2491 и 2459 были сделаны одиночные мутации U2491C и A2459G, препятствующие образованию структуры Б и не влияющие на структуру А, а также двойная мутация U2491C/A2459G, которая должна возвращать способность к образованию структуры Б В структуре Б диаметр спирали 89 должен быть меньше, чем в структуре А, следовательно, пауза при продвижении аа-тРНК в A-участок должна уменьшаться при стабилизации структуры Б

Вторая пауза в аккомодации связана со взаимодействием с нуклеотидом С2573 Гетероциклическое основание нуклеотида С2573 развернуто в сторону «коридора аккомодации» Можно предположить, что замена цитозина на более объемное пуриновое основание приведет к сужению «коридора аккомодации» и, соответственно, к уменьшению скорости аккомодации, а делеция этого нуклеотида - к уширению «коридора аккомодации» и увеличению скорости аккомодации Для проверки этой гипотезы были сделаны замены C2573U, С2573А, C2573G, а также делеция Д2573

Большой интерес как объект для мутагенеза вызывает нуклеотид А2572 Хотя этот нуклеотид не участвует в образовании «ворот», а его гетероциклическое основание развернуто в сторону от «коридора аккомодации», данный нуклеотид обладает рядом интересных свойств Согласно данным РСА, этот нуклеотид взаимодействует с петлей белка L3, мутации в котором приводят к сдвигу рамки считывания Кроме того, петля белка L3 располагается недалеко от РТС и в структурах 70S рибосом встречается в двух конформациях по разные стороны от плоскости гетероциклического основания нуклеотида А2572 Многочисленные литературные данные свидетельствуют о конформационной подвижности нуклеотида А2572 Можно предположить, что нуклеотиды А2572 и С2573 участвуют в передаче кояформационного сигнала между РТС и «коридором аккомодации», влияя на скорость аккомодации аа-тРНК Чтобы проверить эту гипотезу, были сделаны замены A2572U и А2572С, а также делеция Д2572

2.1 Влияние мутаций на скорость роста и точность трансляции ш vivo

Для исследования влияния мутаций на скорость роста клеток использовали штамм AVS69009, в котором все опероны рибосомной ДНК удалены из хромосомы, а единственным источником рДНК в клетке является плазмида pLK1192U, несущая оперон ггпВ с исследуемой мутацией В качестве контроля использовали тот же штамм, несущий плазмиду pLKl 192U без мутации

Мутации UUU2491-3UC, А2573 и Д2572 оказались летальными, мутация C2573U привела к значительному замедлению скорости роста, влияние остальных мутаций на скорость роста оказалось незначительным Далее мы изучили влияние мутаций на точность трансляции in vivo с помощью набора репортерных плазмид, экспрессирующих ген ß-галактозидазы (табл 3)

Таблица 3 Влияние мутаций 23S рРНК галактозидазы в относительных единицах

на точность трансляции Представлены значения активности р-Активность р-галактозидазы в штаммах, экспрессирующих рДНК

Мутация 23 S рРНК Тестовая плазмида

pSG25 pSG 853 pSG 12-6 pSG 3/4 pSG 1ас7 pSG 12DP fCSH 103

UUU2491-3UC 1 68*0 24 1 73±0 85 3 07±0 35 0 99±018 1 38±0 24 I 97*0 29 1 08*0 20

2491С 1 10±0 12 1 05±0 19 2 96*0 10 1 34*0 32 1 35±0 25 1 71±0 90 1 12*0 30

2458С 0 98*0 11 0 98*0 14 2 73*0 53 0 82*0 15 1 64±0 07 1 76*0 77 1 01*0 31

2459G 1 23*0 28 1 58*0 08 3 92±0 59 126*019 1 69*0 04 2 49*0 38 1 01*0 34

2491С/2458С 1 76*0 36 0 80±0 05 1 29±0 40 0 87*0 21 0 86±0 15 1 73*0 61 0 84*015

2491 С/24590 1 39±0 47 1 43±0 30 1 16*0 14 1 39*0 44 0 92±0 13 1 76*0 62 1 14*0 24

2572С 1 26*0 02 1 10±0 43 2 97±0 74 0 68*0 10 1 35±0 03 1 95*1 30 1 02±0 24

2572U 2 39±0 59 3 4б±1 56 4 04*0 59 0 92*0 03 1 20±0 12 212*1 00 0 97±0 16

2572del 1 18*0 57 2 83±0 41 2 18*0 97 1 47*0 67 1 39±0 35 1 54*0 62 0 91*018

2573А 1 38±0 50 1 43±0 44 4 33±0 65 1 06*0 29 1 17±0 10 2 21*1 34 0 73*0 18

2573G 1 45±0 21 1 42±0 42 3 78*0 61 1 42*0 65 1 28±0 18 1 74±0 41 0 93*0 14

2573 U 1 73±0 32 2 69*1 06 1 76*0 10 1 19*0 21 1 07*0 12 1 61*0 58 107*0 26

2573del 1 38±0 55 2 52±1 16 1 39*0 19 151*0 81 1 06*0 12 1 54*0 09 0 95*0 08

pfvL1192wt 1 1 1 1 1 1 1

wt str 0 92±0 44 1 10*0 18 0 78±0 20 1 11*0 29 I 03±0 02 1 07*0 19 1 08*0 12

На основании данных о скорости роста и точности трансляции мы выбрали 5 типов рибосом, несущих мутации, для измерения скорости аккомодации и других тестов Прежде всего, интерес представляют летальные мутации UUU2491-3UC, Д2573 и Д2572 Среди мутаций с нелетальным фенотипом мы решили остановиться на заменах нуклеотидов A2572U и С2573А, которые характеризуются повышенной частотой прочтения стоп-кодонов и сдвига рамки считывания -1

2.2 Выделение и очистка мутантных SOS субчастид

Выделение и очистку 50S субчастиц дикого типа со стрептавидиновым аптамером («wt_str») и 50S субчастиц с нелетальными мутациями A2572U и С2573А проводили по стандартной методике По этой же методике были выделены 50S субчастицы дикого типа, не содержащие аптамер к стрептавидину («wt»), которые были использованы в качестве дополнительного контроля, а также 30S субчастицы дикого типа, которые были использованы для получения 70S рибосом во всех дальнейших экспериментах

50S субчастицы с летальными мутациями UUU2491-3UC, Д2573, Д2572 выделяли из смеси с 50S и 30S субчастицами дикого типа при помощи аффинной хроматографии на стрептавидин-сефарозе за счет аптамера к стрептавидину, который был клонирован в 23S рРНК

2.3 Исследование способности рибосом образовывать инициаторный комплекс и синтезировать дипептид

Чтобы убедиться в качестве полученных рибосомных субчастиц, мы исследовали их способность образовывать инишшорный комплекс 70S*[3H]fMet-TPHKfMet*MFTI-MPHK in vitro, те связывать инициаторную [3H]fMet-TPHKfMe' в Р-участок 70S рибосом, программированных синтетическим аналогом мРНК, кодирующим пептид MFTI (MFTI-мРНК) Выход образования инициаторного комплекса определяли как отношение 70S рибосом, связавших [3H]fMet-TPHKfMa к общему количеству 70S рибосом (рис 8А) Эффективность образования инициаторного комплекса в случае мутаций A2572U, С2573А, Д2573 и Д2572 незначительно отличалась от значений, полученных для рибосом дикого типа, однако в случае мутации UUU2491-3UC эффективность образования инициаторного комплекса была несколько ниже

Далее, мы исследовали способность рибосом синтезировать дипептид при связывании EF-Tu*GTP»Phe-TPHKplB в A-участок Выход образования дипептида определяли как отношение количества синтезированного дипептида к количеству

инвдиаторного комплекса, Рибосомы, имеющие мутация Л25121!, С2573А, ¿2573 и Л2572, синтезировали дипептид наравне с рибосомами дикого типа, однако синтез дипептида был практически полностью нарушен у рибосом, несущих мутацию 1Л \ 11249) -ЗиС (рис. 8Б).

А Б

100%

ai ва% £

С

X 40*

I

I 204

ШИН;

wt wt Л- 36?rj 14TÍA UU№UC AZS7i I

2372U ?S?íA

11

лг5?г 42SÍ3

Рисунок 8. А. Эффективность образования инициаторного комплекса 70S-fMct-TPHKfM"'MFTI-MPHIC Б, Эффективность образования дипептида íMet-Phe. Черные стапбики - расчет no [3H)Met, серые столбики -по ГС]Ptie.

uL

wtsfr

Рисунок

сахарозы

Z573A Д2&72

IL

Р. Цстрн фугирован не 10-40% SOS субчастиц

через ¡радиепт дикого типа и

мутанты* 5 OS субчасгш.

Центрифугирование 50S субчастиц через градиент сахарозы 10-40% не выявило отличий в форме и подвижности пика 50S субчастиц для всех исследуемых 50S су Счастии

с мутациями (рис. 9). Таким образом, наблюдаемое у рибосом с мутацией UUU2491-3UC нарушение синтеза дипептида, по-видимому, не связано е дефектами сборки 50S субчасти:; или ошибками ири их выделении и может быть объяснено либо нарушением связывания и/или аккомодации аа-тРНК, либо нарушением структуры РТС рибосомы.

2.4 Влияние мутаций на эффективность стадий элонгации in vitro

Мы исследовали способность мугантных рибосом осуществлять отдельные стадии трансляций in vitro с использованием синтетического аналога мР1Ж, кодирующего пептид MF и сигнал к остановке трансляции (Ml-'Stop-мРНК). Эффективность каждой стадии определяли методом тоупринтинга (рис. 10).

Связывание инициат орной ÍMet-TpHKf№l с Р-участком рибосомы с образованием ишпшаторного комплекса и связывание Phe-jFHK''hc с A-участком при добавлении тройного комплекса ЕР- Tu-GTP*Phe-TPHKph° к ииициагорному комплексу происходит с хорошей эффективностью у рибосом дикого типа со стрешавиди новым аптамером и без него и у рибосом, несущих мутации ШД J249UUC, 2572U. 2573А, Д2572 и Д2573 (рис. J ОБ. В, дорожки 1 и 2), При добавлений EF-G'GTP к претрансло кап ионным комплексам, образованным рибосомами дикого nina со стрелтавидиновым аптамером и без него if рибосомами, несущими мутации 2572U, 2573А, Д2572 и Д2573, происходит эффективная транслокация (рис. 10Б. дорожка 3), Однако, в случае рибосом, несущих мутацию UUU249I-31JC, транслокацня практически не происходит (рис, 10В, дорожка 3). Появление незначительного сигнала в положении +19 можно объяснить присутствием

примеси дсацнлированиой тРНКг в препарате ÍMet-TPMKf"".

+16 +13 -»21

-A4GG4G AUAUACC AUG 1ШС UAAUAC-m f stop

wl

j г з 3?

1

:i1f IS

wt uuuiuc

1 2 3 1 г з

ЯБ :. ЕЛ -

3«

19

Рисунок 10. Тестирование функциональной активности мутантных рибосом Ш vitro А. Часть нухлеопщной последовательности синтетическою аналог мРНК. SD - последовательность Шайна-Дадыар]о транслируем hte колоны н соответствующие сигналы (сверху) тоупринтинга. М, F - соответотеуюптис колонам аминокислотные остатки. Stop - стоп-колон. Б. Анализ пошаговой трансляции при помощи тоупринтннга. Дорожки соответствуют: ! 70S- М FStop-м PI [К • ftiet-тРНК г""; 2 - 70S-MFSIop-MpMK>fMei-тРНКг1(а + EF-Tu-GTP-Pht-TPHK^; 3 _ 70S-М FRtop-мРНК-тРН KrMt'- tMel-Phc-iPT I KPlt + ШЧЗ-GTP. ft. Диализ пошаговой трансляции при помощи тоупрпнтпнга. Дорожки соответствуют: Дорожки соответствуют: I - 70S*MFStop-MPHK*fMet-TPH Кг ; 2 - 70S- MFStop-и PBK-fMel-TPHKr"* + EF-Tu'GTP'Phe-TPHK^"; 3 - 70S-MFStop-MpHK*TPHKfM"-{Me!-Phe-TPHK!4*+ EF-G'GTP. Нумерация остановок в (Б) и (В) [указано справа) обратной транСкрятгазы ведется от А инициатор но i"o кодона AUG.

2.5 Влияние мутаций на скорость аккомодации амипоацнл-тРНК

Из литературы известно, что в случае соответствия кодона мРНК в А-участке рибосомы и антикодона аа-тРНК в составе тройного комплекса аккомодация аа-тРНК происходит со скоростью около 7-8 с*1 и лимитирует скорость последующей с тали и образования пептидной связи, скорость которой составляет >300 с'1. В случае соответствия кодона и антикодона вся аккомодировавшая ай-тРНК количественно вступает в пептид и лтрансферазную реакцию, что позволяет изучать влияние мутаций 23Й рРНК на скорость аккомодации по скорости образования дипептида.

Для измерения скорости образования ди пептида нами был выбран метод погашенного потока (диепсЬей-Дочг), широко использующийся для зтик целей. В установке потащенного потока фермент и субстрат после смесителя попадают в реакционную петлю, а через заданное время реакция останавливается добавлением «стоп-раетвора». Продукты реакции затем анализируют подходящими методами, например, при помощи хроматографии. Несомненным преимуществом этого метода являются сравнит ел ыт небольшие затраты препаратов аа-тРНК и рибосом, а также простота интерпретации результатов. Для измерения скорости образования дииептида в установке для метода погашенного потока смешивали раствор инициатора ого комплекса 708*[3Н]Ще(-тР11КгМа-МРТ1-мРНК и тройного комплекса ЕР-Ти-ОТР-['4С)Р11е-тРЕ1К^ Реакцию останавливали добавлением раствора щелочи через 0.005 с, О.ОЮ с, 0.025 с, 0.050 с, 0.100 с, 0.200 с, 0.350 с, 0.600 с, 1.000 с. 2.000 с, 3.000 с, 5.000 с и 10.000 с. Инкубация при 37"С после добавления щелочи приводит к гидролизу ал-тРНК и пептндил-тРНК. Образующийся в результате реакции дипептид [°Н]Ше1-['4С]РЬе отделяли от свободных аминокислот [3Ц]£Ме1 и [14С]РЬа при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, фракции анализировали При помощи ецинтилляционпого счетчика с использованием программы обсчета двойной метки ¡?Й]/[14С]. На рис, И приведены кинетические кривее образования дипетгаща. Для определения наблюдаемой константы скорости реакции кагТ1 данные кинетические кривые аппроксимировали экспоненциальной функцией вида С=С1)+С1ехр(-каго*1). Полученные нами значения наблюдаемых констант скорост и реакции находятся в согласии с литературными данными.

Скорость аккомодации РЬе-тРНК бьша примерно одинакова для рибосом дикого типа и рибосом с мутациями

A2572U, С2573А, Д2573 и Д2572 Таким образом, замена нуклеотидов, образующих «ворота аккомодации», не оказала существенного влияния на скорость аккомодации Phe-тРНКРЬе Отсутствие влияния мутаций на скорость аккомодации можно объяснить несколькими причинами Во-первых, гибкость спиралей рРНК может позволять рибосоме преодолеть изменение размера «ворот аккомодации», вызываемое мутациями Во-вторых, реальная траектория аа-тРНК при аккомодации может отличаться от рассчитанной, в этом случае тРНК может просто не взаимодействовать с нуклеотидами U2492, С2556 и С2573, образующими «ворота аккомодации», или же это взаимодействие может быть намного слабее, чем предсказанное в результате компьютерной симуляции

2.6 Детальное исследование рибосом, имеющих мутацию UUU2491-3UC 23S рРНК

Нарушение синтеза дипептида, наблюдаемое у рибосом с мутацией UUU2491-3UC, может быть вызвано нарушением связывания аа-тРНК в A-участок, аккомодации аа-тРНК или нарушением структуры РТС рибосомы Прежде всего, мы решили исследовать влияние мутации UUU2491-3UC на связывание аа-тРНК в A-участок и образование дипептида при двух концентрациях ионов Mg2+ 7мМ и 14 мМ Известно, что увеличение концентрации ионов магния улучшает связывание тРНК с А- и Р- участками рибосомы Образование инициаторного комплекса осуществляли в обоих случаях при концентрации ионов магния; 7 мМ Как и в предварительных экспериментах эффективность образования инициаторного комплекса 70S*[3H]fMet-TPHKfMe,'MFTl-MPHK у рибосом с мутацией UUU2491-3UC была несколько меньше, чем у рибосом дикого типа (рис 12А) Связывание [14С]РЬе-тРНКР1ю в A-участок в составе тройного комплекса EF-Tu«GTP>[14C]Phe-TPHKPbe в пересчете на иншщаторный комплекс составило 77% (wt) и 27% (UUU2491-3UC) при 7мМ Mg2+ и 100% (wt) и 61% (UUU2491-3UC) при 14мМ Mg2+ (рис 12Б) Для рибосом дикого типа увеличение связывания [14С]РЬе-тРНКр|ю с А-участком при повышении концентрации ионов Mg2"1" привело к увеличению синтеза дипептида, однако двукратное увеличение связывания [14С]РЬе-тРНКр|1е с А-участком рибосом с мутацией UUU2491-3UC при повышении концентрации магния не повлияло на количество синтезированного дипептида (рис 12В)

Чтобы проверить, связано ли ингибирование синтеза дипептида мутацией UUU2491-3UC с нарушением аккомодации, мы решили использовать реакцию с пуромицином Пуромицин представляет собой антибиотик, имитирующий 3'-концевой аденозин с присоединенным к нему остатком аминокислоты Как и аа-тРНК, пуромицин может участвовать в пептидилтрансферазной реакции, однако вследствие его небольших размеров аккомодация не влияет на ее скорость Мы измерили эффективность взаимодействия 70S-[3H]fMet-TPHKfMM»MFTI-MPIíK с пуромицином за 1 минуту для рибосом дикого типа и всех мутаятных рибосом (рис 13)

а б

310-1 310.

Рисунок Я Кинетические кривые образования дипептида РЬе рибосомами дикого типа с аптамером к стрептавидину (1) и рибосомами, несущими мутации А2573 (2), С2573А (3), А2572 (4) и А257211 (5) (А) и (Б) — линейные и логарифмические координаты, соответственно Кривые аппроксимировали функцией вида С=С0+С1ехр(-карр*1) Наблюдаемые константы скорости аккомодации составили к,рр(«^_5Ь-)=2 3±0 2 с карр(Д2573)=2 0±0 2 с"', к,рр(С2573А)=21±0 2 с"', кяв„(Д2572)=2 8±0 3 скярр(А2572ЦН 9±0 2 с"1

£ 5 di

S 20%

e

UUU/UC

w

N-

tn 60%

o

ív

í 40% Cu

| 20%

I

UIÍU/UC

ÍO 100*

«0%

-ф 5 шк

ф 10%

¿ 20%

о. ОТ,

wt ÜUUíUC

г

uuu/uc

uuu/uc

Рисунок 12. А и í>: Эффективность образования ншициоторного комплекса 70S.fMcSTP] ÍKf4:1.MrTI-MpHK при концентрации М.1ГНИЯ 7 мМ 11 и Г: Эффективность связывания PÍk-tPII, A-участок рибосом при концентрации магния 7 мМ и 14 мN' соответственно. ,[ и Е: Мффектиикость образования ::, ' 1('i!!л . fMWPhe ifcpH концентрации магния 7 мМ и 34 мМ, соответственно. Черные столбики - расчет по |1'JMet, серые столбики - nf> ["C]Phe.

В случае рибосом дикого типа и рибосом и мутациями A2572U, С257ЭА, Д2573 и А2572 практически весь инициаторный комплекс вступает в реакцию с пуромицином за одну минуту, однако в случае рибосом с мутацией UUU2491-3UC

fMet-TPIIKf практически не взаимодействует с пуромицином при данных временах инкубации. Таким образом, мутация UUU2491-3UC, скорее псе го, приводит к нарушению пептшшлтрансферазной реакции, но нрн этом не сильно влияет на связывание Внициаторной ÍMet-TPHKf а в Р-участок и связывание РЬе-тРНКР||е в составе тройного

комплекса G А-участок,

Катализ образования пептидной связи - важнейшая функция, Осуществляемая РТС рибосомы. РТС располагается на 50S субчастице и. согласно данным РСА, состоит только из рРНК. Рибосома ускоряет образование пептидной связи примерно в W1 роз по сравнению со скоростью реакции модельных субстратен в растворе. Наиболее близко к месту переноса пептида располагаются нуклеитиды А2451, U2506, U2585 и А2602, которые составляют внутреннюю оболочку РТС (активный центр) (рис. 14Д). Кроме того, в правильной ориентации ССА-концов взаимодействующих тРНК принимают участие иуклеотид G2553 A-петли (спираль 9?, 23S рРНК) и нуклеотиды G2251 и G22S2 Р-петли (спираль 8D 25S рРНК), составляющие внешнюю оболочку РТС. Все замены нуклеотидов внутренней оболочки (А2451, U2506,

Рисунок 13. Эффективность взаимодействия рибосом дикого типа, несущих атттэмер к сфептавидину (обозначены «wt stm). н рибосом с мутациями A2572U, С2573А, Д2572, Д3573 и UUU249I-3UC (обозначены gJUUAJC») с пуроницнном

U2585 и А2602) приводят к летальному фенотипу у штамма с удаленными хромосомными оперонами ггпВ дикого типа Исследование пепгидилтрансферазной активности этих рибосом т vitro показало, что мутации значительно (в 30 - 9400 раз) уменьшают скорость реакции пептидил-тРНК в Р-участке с пуромицином, однако не влияют на скорость пептидилтрансферазной реакции, если субстратом в А-участке является аа-тРНК При этом интерпретация результатов затруднена вследствие лимитирующей скорость переноса пептида аккомодации аа-тРНК

Активное изучение нуклеотидов внутренней оболочки РТС привело к заключению, что пептидилтрансферазная реакция не катализируется функциональными группами нуклеотидов 23 S рРНК, но может зависеть от конформационных изменений РТС Функция рибосомы заключается в сближении и правильной взаимной ориентации реагирующих субстратов, создании благоприятного электростатического окружения, уменьшающего свободную энергию образования высокополярного переходного

состояния, а также в защите реагирующих групп от молекул воды (или комбинации этих эффектов)

Мутация UUU2491-3UC находится в спирали 89 недалеко от нуклеотидов, участвующих в формировании РТС, однако связь данного района 23 S рРНК с пептидилтрансферазной активностью рибосомы не описана в литературе Теоретически, данная мутация должна приводить к исчезновению выпетливания уридинов 2491-2492, делая спираль более компактной (рис 14Б, В), и не должна приводить к значительным конформационным изменениям в других районах 23S рРНК Тем более удивительно, что данная мутация приводит к нарушению взаимодействия пептидил-тРНК в Р-участке как с пуромицином, так и с аа-тРНК, тогда как мутагенез нуклеотидов, образующих внутреннюю сферу РТС, приводит только к нарушению переноса пептида на пуромицин В ходе нашей работы мы выяснили, что причина летальности рибосом с мутацией UUU2491-3UC заключается в неспособности этих рибосом катализировать пептидилтрансферазную реакцию Однако мы не выявили существенных нарушений функционирования рибосом с мутациями Д2572 и Д2573 на стадии инициации и одного раунда элонгации, поэтому причина летального фенотипа этих мутаций не ясна

Возможно, причина существенного влияния мутаций в «коридоре аккомодации» на жизнеспособность клеток обусловлена нарушениями на стадии терминации трансляции В терминации трансляции участвуют факторы RF1 и RF2, узнающие стоп-кодоны в А-участке и стимулирующие гидролиз связи между пептидом и тРНК в Р-участке, а также факторы RF3, RRF, EF-G и IF3, которые нужны для дальнейшей диссоциации посттерминационного комплекса и подготовки рибосомных субчастиц для трансляции следующего белка Белки RF1, RF2 и RRF имеют структуру, напоминающую по форме молекулу тРНК, и в процессе своего функционирования проникают в А-участок сходным путем Можно ожидать, что рибосомы с мутациями A2572U, С2573А, Д2572 и Д2573 обнаружат дефект в осуществлении отдельных стадий терминации

Спираль В9

A26CG ,

РТС

U2585 (|;f

GCwA UACCGCCCAAGAG I I 1 1 I 1 I 1 I I I CGG U GUGGCGGCAGCUA

GGCuGAUACCGCCCAAGA

111 I 11)1)1 11 CCGGCUGUGGC GGCAGCU

Рисунок 14 А Расположение нуклеотидов внутренней оболочки пептидилтрансферазного центра на вторичной структуре 238 рРНК (показаны красным цветом) Е Структура спирали 89, наблюдаемая при помощи РСА В Предполагаемое изменение структуры спирали 89 в результате мутации ииШ491-

зис

ВЫВОДЫ

1 Мобильный элемент, состоящий из спиралей 96/97 23S рРНК, сдвигается при движении центра, ассоциированного с ОТРазной активностью, в сторону сарцин-рициновой петли

2 Изменение положения центра, ассоциированного с ОТРазной активностью, приводящее к его сближению с сарцин-рициновой петлей, не влияет на функционирование EF-Tu, но нарушает связывание EF-G с рибосомой и стимуляцию его ОТРазной активности деацилированной тРНК в Р-участке рибосомы

3 Мутации по консервативным нуклеотидым остаткам U2492, С2556 и С2573 23S рРНК, образующим сужение «коридора аккомодации» 50S субчастицы, не влияют на скорость аккомодации аминоацил-тРНК

4 Стабилизация структуры спирали 89 23S рРНК, альтернативной наблюдаемой с помощью РСА, приводит к полному ингибированию пептидилтрансферазной реакции

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Бураковский Д Б, Смирнова А С , Лесняк Д В , Кипарисов С В , Леонов А А, Сергиев П В , Богданов А А, Донцова О А Взаимодействие спиралей 89 и 91 23S рибосомной РНК Escherichia coll способствует функционированию IF2, но не важно для работы факторов элонгации (2007) Молекулярная биология том 41, №6, стр 1031-1041

2 Sergiev Р V , Kiparisov S V , Burakovsky D Е, Lesnyak D V , Leonov A A, Bogdanov A A, Dontsova О A The conserved A-site finger of the 23S rRNA just one of the mtersubunit bridges or a part of the allostenc communication pathway9 (2005) J Mol Biol 353, 116-23

3 Sergiev P V , Lesnyak D V , Burakovsky D E, Kiparisov S V , Leonov A A, Bogdanov A A, Brimacombe R, Dontsova О A Alteration in location of a conserved GTPase-associated center of the ribosome induced by mutagenesis influences the structure of peptidyltransferase center and activity of elongation factor G (2005) J Biol Chem 280,31882-9

4 Petr Sergiev, Dmitry Lesnyak, Dmitry Burakovsky, Anna Simrnova, Alexey Bogdanov, Olga Dontsova, Conformation signals that determine the activity of translational factors site-directed mutagenesis and biochemical studies (2007) "Ribosome form & function", Abstract book, p 22

5 D E Burakovsky, D V Lesnyak, S V Kiparisov, P V Sergiev, A A Bogdanov, and О A Dontsova Mutagenesis of helix 42 of E coh rRNA influences the activity of elongation factor G and shows putative allostenc signal pathway connecting nbosomal P-site with the binding site of the elongation factors (2006) The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protem Interactions", Abstract book, p 60

6 Sergiev P V , Lesnyak D V , Kiparisov S V , Burakovsky D V , Bogdanov A A, Dontsova О A Function of Ribosomal E-site Effect of the C2394G Substitution m the 23S rRNA of the Escherichia coh (2005) 21st International tRNA Workshop "tRNA-2006", Abstract book, p 173

7 Petr Sergiev, Dmitry Lesnyak, Dmitry Burakovsky, Sergey Kiparisov, Andiei Leonov, Alexey Bogdanov, Olga Dontsova Communication Between the Ribosomal P- and E-sites and Elongation Factor Binding Sites (2006) The 11th annual meeting of the RNA society "RNA-2006", Abstract book, p 274

8 P V Sergiev, D E Burakovsky, D V Lesnyak, S V Kiparisov, A A Bogdanov, О A Dontsova Mutations in nbosomal RNA that affect communication between the functional centers of the ribosome (2006) HHMI Meeting of International Research Scholars, Abstract book, p 70

\ ~7 //

Отпечатано в копицеитре «СТ ПРИНТ» Москва Ленинские горы, Ml У, 1 Гуманитарный корпус www, stpimtru e-mail zakaz'Sstpnnt ru тел 939-33-38 '1 ираж 100 экэ Подписано в печать 27 09 2007 г

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ФАКТОРЫ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Фактор элонгации Tu

1.1.1 Структура фактора элонгации Tu

1.1.2 Связывание аминоацил-тРНК фактором элонгации Tu

1.1.3 Структура комплекса EF-Tu'EF-Ts

1.1.4 Расположение фактора элонгации Tu на рибосоме

1.1.5 Функционирование фактора элонгации Tu

1.1.5.1 Начальное связывание

1.1.5.2 Узнавание кодона

1.1.5.3 Стимуляция гидролиза GTP

1.1.5.4 Гидролиз GTP

1.1.5.5 Высвобождение фосфата и конформационные перестройки фактора элонгации Tu

1.1.5.6 Аккомодация аминоацил-тРНК

1.2 Фактор элонгации G

1.2.1 Структура фактора элонгации G

1.2.2 Расположение фактора элонгации G на рибосоме

1.2.3 Взаимодействие факторов элонгации со стеблем L7/L

1.2.3.1 Роль белка L7/L12 в связывании факторов элонгации с рибосомой

1.2.3.2 Роль L7/L12 в стимуляции ОТРазной активности факторов элонгации

1.2.4 Транслокация

1.2.4.1 Структурные изменения рибосомы при транслокации

1.2.4.2 Структурные изменения фактора элонгации G при транслокации

1.2.5 Кинетика функционирования фактора элонгации G

1.2.6 Транслокация и ретротранслокация

1.2.7 Участие фактора элонгации G в диссоциации посттерминационного комплекса

2 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1 Влияние мутаций в спирали 42 23S рРНК на функционирование факторов элонгации

2.1.1 Постановка проблемы

2.1.2 Влияние мутаций на скорость роста клеток и точность трансляции in vivo

2.1.3 Очистка мутантных рибосом

2.1.4 Влияние мутаций на конформацию 23S рРНК согласно данным химического пробинга

2.1.5 Влияние мутаций на элонгацию трансляции in vitro

2.1.6 Связывание факторов элонгации с рибосомой

2.1.7 Стимуляция ОТРазной активности EF-Tu при соответствии кодона мРНК и антикодона тРНК

2.1.8 Стимуляция ОТРазной активности EF-G деацилированной тРНК, связанной с Р-участком рибосомы

2.1.9 Обсуждение

2.2 Изучение влияния мутаций 23S рРНК на скорость аккомодации аминоацил-тРНК

2.2.1 Постановка проблемы

2.2.2 Влияние мутаций на скорость роста и точность трансляции in vivo

2.2.3 Выделение и очистка мутантных 50S субчастиц

2.2.4 Исследование способности мутантных рибосом образовывать инициаторный комплекс и синтезировать дипегттид

2.2.5 Влияние мутаций на эффективность стадий элонгации in vitro

2.2.6 Влияние мутаций на скорость аккомодации аминоацил-тРНК

2.2.7 Детальное исследование рибосом, имеющих мутацию UUU2491-3UC 23S рРНК

2.2.8 Обсуждение

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Реактивы и биопрепараты

3.2 Буферы и растворы

3.3 Создание штаммов для экспрессии рибосом с мутацией в 23S рРНК

3.4 Измерение скорости роста клеток

3.5 Измерение точности трансляции

3.6 Выделение компонентов для экспериментов in vitro

3.6.1 Выделение рибосом

3.6.2 Получение S100 экстракта без тРНК

3.6.3 Получение аминоацил-тРНК

3.6.3.1 Получение [3H]fMet-TPHKfMet Е. coli

3.6.3.2 Получение [14С]РЬе-тРНКРЬе Е. coli

3.6.3.3 Получение Lys-TPHKLys Е. coli

3.6.4 Получение мРНК

3.7 Тестирование способности мутантиых рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro при помощи тоупринтинга

3.8 Эффективность полии-зависимого синтеза полиРЬс

3.9 Стимуляция вТРазной активности фактора элонгации G

3.10 Стимуляция СТРазиой активности фактора элонгации Tu

3.11 Химический пробииг

3.11.1 Модификация дим етилсульфатом

3.11.2 Модификация кетоксалем

3.11.3 Модификация карбодиимидом

3.11.4 Выделение суммарной рибосомной РНК

3.11.5 Реакция обратной транскрипции

3.12 Футприитинг

3.13 Образование иницнаторных комплексов, связывание аминоацил-тРНК в A-участок и синтез дипептида

3.13.1 Формирование инициаторных комплексов

3.13.2 Формирование тройного комплекса

3.13.3 Образование дипептида и пуромициновая реакция

3.13.4 Связывание аминоацил-тРНК в A-участок рибосом с мутацией UUU2491-3UC

4 ВЫВОДЫ

Рибосома представляет собой молекулярную машину, осуществляющую биосинтез белка во всех живых организмах. Это сложный рибонуклеопротеид, состоящий из двух субчастиц - большой и малой, которые в соответствии с их коэффициентами седиментации называются 50S и 30S у прокариот или 60S и 40S у эукариот. Большая субчастица Escherichia coli состоит из двух рибосомных РНК 23S и 5S и 34 белков, малая же субчастица включает в себя лишь одну 16S рРНК и 21 белок. Именно на рибосомах в процессе трансляции происходит перевод генетической информации из первичной структуры матричной РНК (мРНК) в первичную структуру белка. Открытие рибосом (1950-е гг) связано с именем Д.Э. Палладе. С момента открытия рибосома привлекает внимание физиков, химиков и биологов, для ее исследования применялся практически весь спектр методов исследования макромолекул в растворе [1]. Однако большой прорыв в исследовании рибосомы и ее функциональных комплексов стал возможен благодаря успехам рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии. Структура 50S субчастицы была определена с разрешением 2.4 А [2] (Haloarcula marismortui), 30S субчастица исследована с разрешением 3.0 А [3] (Thermus thermophilus). Также недавно были получены структуры 70S рибосом с разрешением 3.5 А [4] (Escherichia coli) и 2.8 А [5] (Thermus thermophilus). При таком разрешении видны многие детали структуры рибосомы, ее контакты с мРНК и тРНК, молекулы воды, ионы металлов и модификации оснований. Однако подвижные элементы рибосомы, такие как L1-стебель и 17/112-стебель, на рентгенограмме с высоким разрешением неструктурированы. В настоящий момент многочисленные функциональные комплексы рибосомы изучены с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) с разрешением до 7 А.

Основные структурные элементы рибосомных субчастиц представлены на рис. 1. В 30S субчастице это голова, плечо, тело, платформа и шпора, в 50S -центральный протуберанец, L1-стебель и 17/112-стебель. Рибосома содержит три участка связывания тРНК (А-, Р- и Е-), сформированных обеими субчастицами. В процессе трансляции антикодоновая и акцепторная части тРНК могут находиться в разных участках связывания на 30S и 50S субчастицах. При этом считается, что молекулы тРНК находятся в «гибридных» А/Р-, Р/Е- участках [6].

Голова

Р-участок

А-участок

Е-участок

Е-у часто к

U-стебель

А-участок

Плечо

Платформа

Шпора

Центральный протуберанец

Р-участок

17/L12-стебель

Основание стебля

Рисунок 1. Расположение основных структурных элементов и функциональных центров в рибосоме (данные крио-ЭМ). L7/L12-стебель, обычно невидимый из-за своей подвижности, показан пунктиром [7].

У рибосомы различают три функциональных центра. Декодирующий центр образован исключительно малой субчастицей и осуществляет выбор молекулы аа-тРНК, соответствующей кодону мРНК. Он расположен на малой субчастице в районе, где голова 30S субчастицы соединена с телом.

В состав большой субчастицы входят два функциональных центра: пептид и лтрансферазный и центр связывания факторов элонгации. Пептидилтрансферазный центр (РТС) расположен на 50S субчастице на дне большого ущелья в межсубчастичной области. ССА-концы тРНК в А- и Р-участках, с которыми связаны пептид и аминокислота, участвующие в образовании пептидной связи, сближены в пептидиптрансферазном центре. За этим центром расположен туннель, выход из которого находится на 50S субчастице с противоположной от 30S субчастицы стороны.

Центр связывания факторов элонгации включает в себя центр, ассоциированный с СТРазной активностью факторов элонгации (GAC) и сарцин-рициновую петлю (SRL). С этим центром взаимодействуют факторы элонгации и другие белки - йТРазы, участвующие в трансляции. Центр связывания факторов элонгации стимулирует гидролиз GTP, связанного с факторами, на определенных этапах трансляции, а также провоцирует конформационные перестройки как самих факторов, так и отдельных районов рибосомы.

В процессе трансляции участвуют 4 G-белка: фактор инициации 2 (IF2), фактор терминации 3 (RF3), фактор элонгации Tu (EF-Tu) и фактор элонгации G (EF-G). Причем первые два используются только на стадиях инициации и терминации, соответственно, a EF-Tu и EF-G действуют на протяжении всего синтеза пептидной цепи и являются важнейшими участниками процесса трансляции. Функционирование EF-Tu и EF-G лежит в основе элонгационного цикла рибосомы. Именно с механизмами работы этих ферментов и их регуляцией и связано большинство пока еще не раскрытых загадок функционирования рибосомы.

Суперсемейство G-белков, или GTPaa, к которому принадлежат EF-Tu и EF-G, характеризуется сходством структуры и механизма действия [8]. Члены этого суперсемейства используют гидролиз GTP в процессе своего функционирования для изменения аффинности к различным макромолекулам. Каждый белок данного семейства представляет собой молекупярный переключатель, "включающийся" при связывании GTP и "выключающийся" при год релизе GTP на GDP и фосфат (Pi). Все СТРазы содержат высококонсервативный G-домен, который ответственен за связывание и гидролиз GTP и связанные с этим изменения в структуре белка. Типичный пример организации G-домена встречается у р21габ (рис. 2).

1J7

141 * .43 \ соон 41 * 4« 111 •1 9% Y. G-S

77 К

74 М И V .; ч-v0^ « оГ^Л « О-Р •lost

Рисунок 2. Структура р21га5 в комплексе с СТР [8]. Петли - С5 обозначены: - оранжевым, (52 - голубым, йЗ - красным, С4 - зеленым, Э5 - желтым.

Гидрофобная основа нуклеотид-связывающего кармана образована шестью (3-листами, соединенными между собой гидрофильными петлями и а-спиралями. Отдельного внимания заслуживают петли G1-G5, которые ответственны за связывание GTP/GDP и гидролиз GTP [8]. Для удобства изложения, консервативные функциональные элементы G-белков обозначают как Р-петля и переключатели I и II. Р-петля (соответствует петле G1) состоит из нескольких консервативных аминокислот, которые взаимодействуют с р-фосфатом связанного нуклеотида и координируют ион Мд2+, необходимый для связывания нуклеотида. Переключатель I (соответствует петле G2) и переключатель II (соответствует петле G3 и части следующей за ней а-спирали) [9] представляют собой области, которые значительно изменяет свою конформацию в зависимости от связанного нуклеотида.

Цикл работы всех СТРаз включает в себя три различные конформации белка - активную GTP-конформацию, неактивную GDP-конформацию и свободное состояние без нуклеотида. У многих (но не у всех) GTPa3 скорость диссоциации GDP и собственная скорость гидролиза GTP невелики, поэтому ключевыми участниками циклов функционирования практически всех GTPa3 являются факторы обмена нуклеотида, осуществляющие обмен GDP на GTP и переключение вТРазы в активное состояние, и факторы, стимулирующие вТРазную активность, значительно увеличивающие скорость гидролиза GTP [8] (рис. 3).

Рисунок 3. Цикл работы GTPa3.

Для EF-G и EF-Tu фактором, стимулирующим гидролиз GTP является рибосома в соответствующем функциональном состоянии. Роль фактора, обменивающего GTP на GDP, играет фактор элонгации Ts (EF-Ts) для EF-Tu. Обмен нуклеотида у EF-G происходит без участия других факторов. Предполагают, что внутренним фактором обмена нуклеотида у EF-G может служить свойственная только этому белку часть G-домена, которая называется G'-доменом [10,11].

4 ВЫВОДЫ

1. Мобильный элемент, состоящий из спиралей 96/97 23S рРНК, сдвигается при движении центра, ассоциированного с вТРазной активностью, в сторону сарцин-рициновой петли.

2. Изменение положения центра, ассоциированного с СТРазной активностью, приводящее к его сближению с сарцин-рициновой петлей, не влияет на функционирование EF-Tu, но нарушает связывание EF-G с рибосомой и стимуляцию его вТРазной активности деацилированной тРНК в Р-участке рибосомы.

3. Мутации по консервативным нуклеотидым остаткам U2492, С2556 и С2573 23S рРНК, образующим сужение «коридора аккомодации» 50S субчастицы, не влияют на скорость аккомодации аминоацил-тРНК.

4. Стабилизация структуры спирали 89 23S рРНК, альтернативной наблюдаемой с помощью РСА, приводит к полному ингибированию пептидилтрансферазной реакции.

1. Sergiev, P.V., Dontsova, O.A., and Bogdanov, A.A. (2001). Study of ribosome structure using the biochemical methods: judgment day., Mol Biol (Mosk) 35, 559-583.

2. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289,905-920.

3. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T., and Ramakrishnan, V. (2000). Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407, 327-339.

4. Schuwirth, B.S., Borovinskaya, M.A., Hau, C.W., Zhang, W., Vila-Sanjurjo, A., Holton, J.M., and Cate, J.H. (2005). Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310,827-834.

5. Selmer, M., Dunham, C.M., Murphy, F.V.t., Weixlbaumer, A., Petry, S., Kelley, A.C., Weir, J.R., and Ramakrishnan, V. (2006). Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313,1935-1942.

6. Moazed, D., and Noller, H.F. (1989). Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature 342,142-148.

7. Frank, J. (2003). Toward an understanding of the structural basis of translation. Genome Biol 4, 237.

8. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1991). The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature 349,117127.

9. Czworkowski, J., Wang, J., Steitz, T.A., and Moore, P.B. (1994). The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7 A resolution. Embo J 13, 3661-3668.

10. Yokota, T., Sugisaki, H., Takanami, M., and Kaziro, Y. (1980). The nucleotide sequence of the cloned tufAgene of Escherichia coli. Gene 12, 25-31.

11. An, G., and Friesen, J.D. (1980). The nucleotide sequence of tufB and four nearby tRNA structural genes of Escherichia coli. Gene 12, 33-39.

12. Berchtold, H., Reshetnikova, L„ Reiser, C.O., Schirmer, N.K., Sprinzl, M., and Hilgenfeld, R. (1993). Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365,126-132.

13. Kjeldgaard, M., Nissen, P., Thirup, S., and Nyborg, J. (1993). The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure 1, 35-50.

14. Abel, K„ Yoder, M.D., Hilgenfeld, R., and Jurnak, F. (1996). An alpha to beta conformational switch in EF-Tu. Structure 4,1153-1159.

15. Polekhina, G., Thirup, S., Kjeldgaard, M., Nissen, P., Lippmann, C., and Nyborg, J. (1996). Helix unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP. Structure 4,1141-1151.

16. Leberman, R.( Schulz, G.E., and Suck, D. (1981). Crystallization and preliminary x-ray diffraction data of the EF-Tu . EF-Ts (EF-T) complex of Escherichia coli. FEBS Lett 124, 279-281.

17. Kawashima, T., Berthet-Colominas, C., Wulff, M„ Cusack, S„ and Leberman, R. (1996). The structure of the Escherichia coli EF-Tu.EF-Ts complex at 2.5 A resolution. Nature 379, 511-518.

18. Nissen, P., Kjeldgaard, M„ Thirup, S., Clark, B.F., and Nyborg, J. (1996). The ternary complex of aminoacylated tRNA and EF-Tu-GTP. Recognition of a bond and a fold. Biochimie 78,921-933.

19. Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B.F., and Nyborg, J. (1995). Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270,1464-1472.

20. Sanderson, L.E., and Uhlenbeck, O.C. (2007). Directed mutagenesis identifies amino acid residues involved in elongation factor Tu binding to yeast Phe-tRNAPhe. J Mol Biol 368,119-130.

21. Louie, A., Ribeiro, N.S., Reid, B.R., and Jurnak, F. (1984). Relative affinities of all Escherichia coli aminoacyl-tRNAs for elongation factor Tu-GTP. J Biol Chem 259, 5010-5016.

22. LaRiviere, F.J., Wolfson, A.D., and Uhlenbeck, O.C. (2001). Uniform binding of aminoacyl-tRNAs to elongation factor Tu by thermodynamic compensation. Science 294,165-168.

23. Asahara, H., and Uhlenbeck, O.C. (2005). Predicting the binding affinities of misacylated tRNAs for Thermus thermophilus EF-Tu.GTP. Biochemistry 44, 11254-11261.

24. Asahara, H„ and Uhlenbeck, O.C. (2002). The tRNA specificity of Thermus thermophilus EF-Tu. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3499-3504.

25. Dale, T., Sanderson, L.E., and Uhlenbeck, O.C. (2004). The affinity of elongation factor Tu for an aminoacyl-tRNA is modulated by the esterified amino acid. Biochemistry 43, 6159-6166.

26. Sanderson, L.E., and Uhlenbeck, O.C. (2007). Exploring the specificity of bacterial elongation factor Tu for different tRNAs. Biochemistry 46,6194-6200.

27. Sanderson, L.E., and Uhlenbeck, O.C. (2007). The 51-63 base pair of tRNA confers specificity for binding by EF-Tu. Rna 13, 835-840.

28. Roy, H., Becker, H.D., Mazauric, M.H., and Kern, D. (2007). Structural elements defining elongation factor Tu mediated suppression of codon ambiguity. Nucleic Acids Res 35,3420-3430.

29. Abel, K., and Jurnak, F. (1996). A complex profile of protein elongation: translating chemical energy into molecular movement. Structure 4,229-238.

30. Arai, K., Arai, N. Nakamura, S., Oshima, T., and Kaziro, Y. (1978). Studies on polypeptide-chain-elongation factors from an extreme thermophile, Thermus thermophilus HB8.2. Catalytic properties. Eur J Biochem 92, 521-531.

31. Parmeggiani, A., and Swart, G.W. (1985). Mechanism of action of kirromycin-like antibiotics. Annu Rev Microbiol 39, 557-577.

32. Rodnina, M.V., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1994). Transient conformational states of aminoacyl-tRNA during ribosome binding catalyzed by elongation factor Tu. Biochemistry 33,12267-12275.

33. Rodnina, M.V., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1995). Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome. Embo J 14, 2613-2619.

34. Stark, H., Rodnina, M.V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R„ Wintermeyer, W., and van Heel, M. (1997). Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389,403-406.

35. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., Zemlin, F., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (2002). Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex. Nat Struct Biol 9,849-854.

36. Valle, M., Zavialov, A., Li, W„ Stagg, S.M., Sengupta, J., Nielsen, R.C., Nissen, P., Harvey, S.C., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2003). Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy. Nat Struct Biol 10, 899-906.

37. Tapprich, W.E., and Dahlberg, A.E. (1990). A single base mutation at position 2661 in E. coli 23S ribosomal RNA affects the binding of ternary complex to the ribosome. Embo J 9,2649-2655.

38. Moazed, D., Robertson, J.M., and Noller, H.F. (1988). Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature 334, 362364.

39. Vorstenbosch, E., Pape, T., Rodnina, M.V., Kraal, B., and Wintermeyer, W. (1996). The G222D mutation in elongation factor Tu inhibits the codon-induced conformational changes leading to GTPase activation on the ribosome. Embo J 15, 6766-6774.

40. Swart, G.W., Parmeggiani, A., Kraal, B., and Bosch, L. (1987). Effects of the mutation glycine-222—aspartic acid on the functions of elongation factor Tu. Biochemistry 26, 2047-2054.

41. Rodnina, M.V., Gromadski, K.B., Kothe, U., and Wieden, H.J. (2005). Recognition and selection of tRNA in translation. FEBS Lett 579, 938-942.

42. Blanchard, S.C., Gonzalez, R.L., Kim, H.D., Chu, S., and Puglisi, J.D. (2004). tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nat Struct Mol Biol 11, 1008-1014.

43. Kothe, U., Wieden, H.J., Mohr, D., and Rodnina, M.V. (2004). Interaction of helix D of elongation factor Tu with helices 4 and 5 of protein L7/12 on the ribosome. J Mol Biol 336,1011-1021.

44. Ogle, J.M., Brodersen, D.E., demons, W.M., Jr., Tarry, M.J., Carter, A.P., and Ramakrishnan, V. (2001). Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292, 897-902.

45. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. (1999). Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome. Embo J 18,3800-3807.

46. Ogle, J.M., Carter, A.P., and Ramakrishnan, V. (2003). Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structures. Trends Biochem Sci 28,259-266.

47. Ogle, J.M., Murphy, F.V., Tarry, M.J., and Ramakrishnan, V. (2002). Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell 111, 721-732.

48. Ogle, J.M., and Ramakrishnan, V. (2005). Structural insights into translational fidelity. Annu Rev Biochem 74,129-177.

49. Hilgenfeld, R. (1995). Regulatory GTPases. Curr Opin Struct Biol 5, 810-817.

50. Powers, Т., and Noller, H.F. (1994). Selective perturbation of G530 of 16 S rRNA by translational miscoding agents and a streptomycin-dependence mutation in protein S12. J Mol Biol 235,156-172.

51. Powers, Т., and Noller, H.F. (1994). The 530 loop of 16S rRNA: a signal to EF-Tu? Trends Genet 10, 27-31.

52. Piepenburg, О., Pape, Т., Pleiss, J.A., Wintermeyer, W., Uhlenbeck, O.C., and Rodnina, M.V. (2000). Intact aminoacyl-tRNA is required to trigger GTP hydrolysis by elongation factor Tu on the ribosome. Biochemistry 39,1734-1738.

53. Yarus, M., Valle, M„ and Frank, J. (2003). A twisted tRNA intermediate sets the threshold for decoding. Rna 9,384-385.

54. Hirsh, D. (1971). Tryptophan transfer RNA as the UGA suppressor. J Mol Biol 58, 439-458.

55. Cochella, L., and Green, R. (2005). An active role for tRNA in decoding beyond codon:anticodon pairing. Science 308,1178-1180.

56. Sanbonmatsu, K.Y. (2006). Alignment/misalignment hypothesis for tRNA selection by the ribosome. Biochimie 88,1075-1089.

57. O'Connor, M., and Dahlberg, A.E. (1995). The involvement of two distinct regions of 23 S ribosomal RNA in tRNA selection. J Mol Biol 254, 838-847.

58. Daviter, Т., Wieden, H.J., and Rodnina, M.V. (2003). Essential role of histidine 84 in elongation factor Tu for the chemical step of GTP hydrolysis on the ribosome.1. J Mol Biol 332, 689-699.

59. Knudsen, C.R., and Clark, B.F. (1995). Site-directed mutagenesis of Arg58 and Asp86 of elongation factor Tu from Escherichia coli: effects on the GTPase reaction and aminoacyl-tRNA binding. Protein Eng 8,1267-1273.

60. Mansilla, F., Knudsen, C.R., Laurberg, M., and Clark, B.F. (1997). Mutational analysis of Escherichia coli elongation factor Tu in search of a role for the N-terminal region. Protein Eng 10, 927-934.

61. Rattenborg, Т., Nautrup Pedersen, G., Clark, B.F., and Knudsen, C.R. (1997). Contribution of Arg288 of Escherichia coli elongation factor Tu to translational functionality. Eur J Biochem 249,408-414.

62. Wiborg, O., Andersen, C., Knudsen, C.R., Clark, B.F., and Nyborg, J. (1996). Mapping Escherichia coli elongation factor Tu residues involved in binding of aminoacyl-tRNA. J Biol Chem 271, 20406-20411.

63. Vetter, I.R., and Wittinghofer, A. (1999). Nucleoside triphosphate-binding proteins: different scaffolds to achieve phosphoryl transfer. Q Rev Biophys 32,156.

64. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2002). GTPase activation of elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry 41,12520-12528.

65. Knudsen, C., Wieden, H.J., and Rodnina, M.V. (2001). The importance of structural transitions of the switch II region for the functions of elongation factor Tu on the ribosome. J Biol Chem 276, 22183-22190.

66. Pape, Т., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (1998). Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome. Embo J 77, 7490-7497.

67. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H., and Noller, H.F. (2001). Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292, 883-896.

68. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassuccl, R.A., and Frank, J. (1998). Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6134-6138.

69. Guex, N., and Peitsch, M.C. (1997). SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18,27142723.

70. Agrawal, R.K., Heagle, A.B., Penczek, P., Grassucci, R.A., and Frank, J. (1999). EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. Nat Struct Biol 6, 643-647.

71. Clark, B.F., and Nyborg, J. (1997). The ternary complex of EF-Tu and its role In protein biosynthesis. Curr Opin Struct Biol 7,110-116.

72. Nyborg, J., Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., and Clark, B.F. (1996). Structure of the ternary complex of EF-Tu: macromolecular mimicry in translation. Trends Biochem Sci 21, 81-82.

73. Liljas, A., A, A.E., al-Karadaghi, S., Garber, M., Zheltonosova, J., and Brazhnikov, E. (1995). Crystallographic studies of elongation factor G. Biochem Cell Biol 73,1209-1216.

74. Moore, P.B. (1995). Molecular mimicry in protein synthesis? Science 270,14531454.

75. Hansson, S., Singh, R., Gudkov, A.T., Liljas, A., and Logan, D.T. (2005). Structural insights into fusidic acid resistance and sensitivity in EF-G. J Mol Biol 348, 939-949.

76. Hansson, S., Singh, R., Gudkov, A.T., Liljas, A., and Logan, D.T. (2005). Crystal structure of a mutant elongation factor G trapped with a GTP analogue. FEBS Lett 579, 4492-4497.

77. Laurberg, M., Kristensen, O., Martemyanov, K., Gudkov, A.T., Nagaev, I., Hughes, D., and Liljas, A. (2000). Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the fusidic acid binding site. J Mol Biol 303, 593-603.

78. Girshovich, A.S., Bochkareva, E.S., and Gudkov, A.T. (1982). Specific interaction of the elongation factor EF-G with the ribosomal 23 S RNA from Escherichia coli. FEBS Lett 150, 99-102.

79. Girshovich, A.S., and Kurtskhaiia, T.V. (1978). Elongation factor G interacts with both ribosomal subparticies. FEBS Lett 92, 203-206.

80. Girshovich, A.S., Bochkareva, E.S., and Ovchinnikov, Y.A. (1981). Elongation factor G and protein S12 are the nearest neighbours in the Escherichia coli ribosome. J Mol Biol 151,229-243.

81. Skold, S.E. (1982). Chemical cross-linking of elongation factor G to both subunits of the 70-S ribosomes from Escherichia coli. Eur J Biochem 127, 225-229.

82. Skold, S.E. (1983). Chemical crosslinking of elongation factor G to the 23S RNA in 70S ribosomes from Escherichia coli. Nucleic Acids Res 11,4923-4932.

83. Girshovich, A.S., Kurtskhaiia, T.V., Ovchinnikov Yu, A., and Vasiliev, V.D. (1981). Localization of the elongation factor G on Escherichia coli ribosome. FEBS Lett 130, 54-59.

84. Lucas-Lenard, J. (1971). Protein biosynthesis. Annu Rev Biochem 40,409-448.

85. Hausner, T.P., Atmadja, J„ and Nierhaus, K.H. (1987). Evidence that the G2661 region of 23S rRNA is located at the ribosomal binding sites of both elongation factors. Biochimie 69,911-923.

86. Wilson, K.S., and Noller, H.F. (1998). Mapping the position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by directed hydroxyl radical probing. Cell 92,131-139.

87. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R.A., Li, Y., Leith, A., Nierhaus, K.H., and Frank, J. (1996). Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science 271,1000-1002.

88. Stark, H., Orlova, E.V., Rinke-Appel, J., Junke, N., Mueller, F., Rodnina, M„ Wintermeyer, W., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1997). Arrangement of tRNAs in pre- and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy. Cell 88,19-28.

89. Valle, M., Zavialov, A., Sengupta, J., Rawat, U., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2003). Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell 114,123-134.

90. Agrawal, R.K., Spahn, C.M., Penczek, P., Grassucci, R.A., Nierhaus, K.H., and Frank, J. (2000). Visualization of tRNA movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle. J Cell Biol 150,447-460.

91. Penczek, P.A., Frank, J., and Spahn, C.M. (2006). A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. J Struct Biol 154,184-194.

92. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., van Heel, M., and Wintermeyer, W. (2000). Large-scale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation. Cell 100,301-309.

93. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Katunin, V.I., Semenkov, Y.P., and Wintermeyer, W. (1999). Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 9586-9590.

94. Ramakrishnan, V. (2002). Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572.

95. Hamman, B.D., Oleinikov, A.V., Jokhadze, G.G., Traut, R.R., and Jameson, D.M. (1996). Rotational and conformational dynamics of Escherichia coli ribosomal protein L7/L12. Biochemistry 35,16672-16679.

96. Bocharov, E.V., Gudkov, A.T., Budovskaya, E.V., and Arseniev, A.S. (1998). Conformational independence of N- and C-domains in ribosomal protein L7/L12 and in the complex with protein L10. FEBS Lett 423,347-350.

97. Oleinikov, A.V., Perroud, B., Wang, B„ and Traut, R.R. (1993). Structural and functional domains of Escherichia coli ribosomal protein L7/L12. The hinge region is required for activity. J Biol Chem 268, 917-922.

98. Savelsbergh, A., Katunin, V.I., Mohr, D., Peske, F., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2003). An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol Cell 11,1517-1523.

99. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1996). Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J Biol Chem 271, 646-652.

100. Datta, P.P., Sharma, M.R., Qi, L., Frank, J., and Agrawal, R.K. (2005). Interaction of the G' domain of elongation factor G and the C-terminal domain of ribosomal protein L7/L12 during translocation as revealed by cryo-EM. Mol Cell 20,723731.

101. Helgstrand, M., Mandava, C.S., Mulder, F.A., Liljas, A., Sanyal, S., and Akke, M. (2007). The ribosomal stalk binds to translation factors IF2, EF-Tu, EF-G and

102. RF3 via a conserved region of the L12 C-terminal domain. J Mol Biol 365,468479.

103. Savelsbergh, A., Mohr, D., Wilden, B., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000). Stimulation of the GTPase activity of translation elongation factor G by ribosomal protein L7/12. J Biol Chem 275, 890-894.

104. Frank, J., and Agrawal, R.K. (2000). A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature 406, 318-322.

105. Zavialov, A.V., and Ehrenberg, M. (2003). Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translation factors. Cell 114,113-122.

106. Mueller, F., and Brimacombe, R. (1997). A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA. I. Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20 A. J Mol Biol 271, 524-544.

107. Agrawal, R.K., Lata, R.K., and Frank, J. (1999). Conformational variability in Escherichia coli 70S ribosome as revealed by 3D cryo-electron microscopy. Int J Biochem Cell Biol 31,243-254.

108. Taylor, D.J., Nilsson, J., Merrill, A.R., Andersen, G.R., Nissen, P., and Frank, J. (2007). Structures of modified eEF2 80S ribosome complexes reveal the role of GTP hydrolysis in translocation. Embo J 26, 2421-2431.

109. Davydova, E.K., and Ovchinnikov, L.P. (1990). ADP-ribosylated elongation factor 2 (ADP-ribosyl-EF-2) is unable to promote translocation within the ribosome. FEBS Lett 261, 350-352.

110. Phan, L.D., Perentesis, J.P., and Bodley, J.W. (1993). Saccharomyces cerevisiae elongation factor 2. Mutagenesis of the histidine precursor of diphthamide yields a functional protein that is resistant to diphtheria toxin. J Biol Chem 268,8665-8668.

111. Kimata, Y., and Kohno, K. (1994). Elongation factor 2 mutants deficient in diphthamide formation show temperature-sensitive cell growth. J Biol Chem 269, 13497-13501.

112. Ortiz, P.A., Ulloque, R., Kihara, G.K., Zheng, H., and Kinzy, T.G. (2006). Translation elongation factor 2 anticodon mimicry domain mutants affect fidelity and diphtheria toxin resistance. J Biol Chem 281, 32639-32648.

113. Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2000). Role of domains 4 and 5 in elongation factor G functions on the ribosome. J Mol Biol 300, 951-961.

114. VanLoock, M.S., Agrawal, R.K., Gabashvili, I.S., Qi, L., Frank, J., and Harvey, S.C. (2000). Movement of the decoding region of the 16 S ribosomal RNA accompanies tRNA translocation. J Mol Biol 304,507-515.

115. Tanaka, M., Iwasaki, K„ and Kaziro, Y. (1977). Translocation reaction promoted by polypeptide chain elongation factor-2 from pig liver. J Biochem (Tokyo) 82, 1035-1043.

116. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Katunin, V.I., and Wintermeyer, W. (1997). Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385, 37-41.

117. Borowski, C., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (1996). Truncated elongation factor G lacking the G domain promotes translocation of the 3' end but not of the anticodon domain of peptidyl-tRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 93,4202-4206.

118. Johanson, U., and Hughes, D. (1994). Fusidic acid-resistant mutants define three regions in elongation factor G of Salmonella typhimurium. Gene 143,55-59.

119. Johanson, U., Aevarsson, A., Liljas, A., and Hughes, D. (1996). The dynamic structure of EF-G studied by fusidic acid resistance and internal revertants. J Mol Biol 258,420-432.

120. Modolell, J., and Vazquez (1977). The inhibition of ribosomal translocation by viomycin. Eur J Biochem 81,491-497.

121. Cundliffe, E. (1972). The mode of action of fusidic acid. Biochem Biophys Res Commun 46,1794-1801.

122. Wilden, B., Savelsbergh, A., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2006). Role and timing of GTP binding and hydrolysis during EF-G-dependent tRNA translocation on the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 103,13670-13675.

123. Seo, H.S., Abedin, S., Kamp, D., Wilson, D.N., Nierhaus, K.H., and Cooperman, B.S. (2006). EF-G-dependent GTPase on the ribosome. conformational change and fusidic acid inhibition. Biochemistry 45, 2504-2514.

124. Savelsbergh, A., Mohr, D., Kothe, U., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2005). Control of phosphate release from elongation factor G by ribosomal protein L7/12. Embo J 24,4316-4323.

125. Katunin, V.I., Savelsbergh, A., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2002). Coupling of GTP hydrolysis by elongation factor G to translocation and factor recycling on the ribosome. Biochemistry 41,12806-12812.

126. Mohr, D„ Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000). Arginines 29 and 59 of elongation factor G are important for GTP hydrolysis or translocation on the ribosome. Embo J 19, 3458-3464.

127. Zavialov, A.V., Hauryliuk, V.V., and Ehrenberg, M. (2005). Guanine-nucleotide exchange on ribosome-bound elongation factor G initiates the translocation of tRNAs. J Biol 4, 9.

128. Kaziro, Y. (1978). The role of guanosine 5-triphosphate in polypeptide chain elongation. Biochim Biophys Acta 505, 95-127.

129. Rohrback, M.S., and Bodley, J.W. (1976). Steady state kinetic analysis of the mechanism of guanosine triphosphate hydrolysis catalyzed by Escherichia coli elongation factor G and the ribosome. Biochemistry 15,4565-4569.

130. Konevega, A.L., Fischer, N., Semenkov, Y.P., Stark, H., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2007). Spontaneous reverse movement of mRNA-bound tRNA through the ribosome. Nat Struct Mol Biol 14,318-324.

131. Qin, Y., Polacek, N. Vesper, O., Staub, E„ Einfeldt, E., Wilson, D.N., and Nierhaus, K.H. (2006). The highly conserved LepA is a ribosomal elongation factor that back-translocates the ribosome. Cell 127, 721-733.

132. Shoji, S., Walker, S.E., and Fredrick, K. (2006). Reverse translocation of tRNA in the ribosome. Mol Cell 24, 931-942.

133. Wintermeyer, W., Peske, F., Beringer, M., Gromadski, K.B., Savelsbergh, A., and Rodnina, M.V. (2004). Mechanisms of elongation on the ribosome: dynamics of a macromolecular machine. Biochem Soc Trans 32, 733-737.

134. Hirokawa, G., Nijman, R.M., Raj, V.S., Kaji, H., Igarashi, K., and Kaji, A. (2005). The role of ribosome recycling factor in dissociation of 70S ribosomes into subunits. Rna 11,1317-1328.

135. Karimi, R., Pavlov, M.Y., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (1999). Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol Cell 3,601-609.

136. Zavialov, A.V., Hauryliuk, V.V., and Ehrenberg, M. (2005). Splitting of the posttermination ribosome into subunits by the concerted action of RRF and EF-G. Mol Cell 18, 675-686.

137. Gao, N., Zavialov, A.V., Li, W., Sengupta, J., Valle, M., Gursky, R.P., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2005). Mechanism for the disassembly of the posttermination complex inferred from cryo-EM studies. Mol Cell 18,663-674.

138. Peske, F., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2005). Sequence of steps in ribosome recycling as defined by kinetic analysis. Mol Cell 18,403-412.

139. Hirokawa, G„ Demeshkina, N., Iwakura, N., Kaji, H., and Kaji, A. (2006). The ribosome-recycling step: consensus or controversy? Trends Biochem Sci 31, 143-149.

140. Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Hirokawa, G„ Kaji, A., and Liljas, A. (1999). Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic. Science 286, 2349-2352.

141. Lancaster, L„ Kiel, M.C., Kaji, A., and Noller, H.F. (2002). Orientation of ribosome recycling factor in the ribosome from directed hydroxyl radical probing. Cell 111,129-140.

142. Hirokawa, G., Kiel, M.C., Muto, A., Selmer, M., Raj, V.S., Liljas, A., Igarashi, K„ Kaji, H., and Kaji, A. (2002). Post-termination complex disassembly by ribosome recycling factor, a functional tRNA mimic. Embo J 21, 2272-2281.

143. Lill, R., Robertson, J.M., and Wintermeyer, W. (1989). Binding of the 3' terminus of tRNA to 23S rRNA in the ribosomal exit site actively promotes translocation. Embo J 8, 3933-3938.

144. Klein, D.J., Schmeing, T.M., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2001). The kink-turn: a new RNA secondary structure motif. Embo J 20,4214-4221.

145. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F., and Yonath, A. (2001). High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107, 679-688.

146. Agrawal, R.K., Linde, J., Sengupta, J., Nierhaus, K.H., and Frank, J. (2001). Localization of L11 protein on the ribosome and elucidation of its involvement in EF-G-dependent translocation. J Mol Biol 311, 777-787.

147. Asai, T., Zaporojets, D., Squires, C., and Squires, C.L. (1999). An Escherichia coli strain with all chromosomal rRNA operons inactivated: complete exchange of rRNA genes between bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 96,1971-1976.

148. O'Connor, M., and Dahlberg, A.E. (1993). Mutations at U2555, a tRNA-protected base in 23S rRNA, affect translational fidelity. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 9214-9218.

149. Cupples, C.G., and Miller, J.H. (1989). A set of lacZ mutations in Escherichia coli that allow rapid detection of each of the six base substitutions. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 5345-5349.

150. Moine, H., and Dahlberg, A.E. (1994). Mutations in helix 34 of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA have multiple effects on ribosome function and synthesis. J Mol Biol 243,402-412.

151. Leonov, A.A., Sergiev, P.V., Bogdanov, A.A., Brimacombe, R., and Dontsova, O.A. (2003). Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. J Biol Chem 278, 25664-25670.

152. Blaha, G„ Stelzl, U„ Spahn, C.M., Agrawal, R.K., Frank, J„ and Nierhaus, K.H. (2000). Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol 317, 292-309.

153. Bergemann, K., and Nierhaus, K.H. (1983). Spontaneous, elongation factor G independent translocation of Escherichia coli ribosomes. J Biol Chem 258, 15105-15113.

154. Harger, J.W., Meskauskas, A., and Dinman, J.D. (2002). An "integrated model" of programmed ribosomal frameshifting. Trends Biochem Sci 27,448-454.

155. Gregory, S.T., and Dahlberg, A.E. (1999). Mutations in the conserved P loop perturb the conformation of two structural elements in the peptidyl transferase center of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 285,1475-1483.

156. Belova, L., Tenson, T., Xiong, L„ McNicholas, P.M., and Mankin, A.S. (2001). A novel site of antibiotic action in the ribosome: interaction of evernimicin with the large ribosomal subunit. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3726-3731.

157. Arnold, R.J., and Reilly, J.P. (1999). Observation of Escherichia coli ribosomal proteins and their posttranslational modifications by mass spectrometry. Anal Biochem 269,105-112.

158. Peltz, S.W., Hammell, A.B., Cui, Y., Yasenchak, J., Puljanowski, L., and Dinman, J.D. (1999). Ribosomal protein L3 mutants alter translational fidelity and promote rapid loss of the yeast killer vims. Mol Cell Biol 19, 384-391.

159. Meskauskas, A., Petrov, A.N., and Dinman, J.D. (2005). Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol Cell Biol 25,10863-10874.

160. Gregory, S.T., and Dahlberg, A.E. (1999). Erythromycin resistance mutations in ribosomal proteins L22 and L4 perturb the higher order structure of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 289, 827-834.

161. Chan, Y.L., Dresios, J., and Wool, I.G. (2006). A pathway for the transmission of allosteric signals in the ribosome through a network of RNA tertiary interactions. J Mol Biol 355,1014-1025.

162. Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (1995). GTP consumption of elongation factor Tu during translation of heteropolymeric mRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 92,1945-1949.

163. Bieling, P., Beringer, M„ Adio, S., and Rodnina, M.V. (2006). Peptide bond formation does not involve acid-base catalysis by ribosomal residues. Nat Struct Mol Biol 13,423-428.

164. Wohlgemuth, I., Beringer, M., and Rodnina, M.V. (2006). Rapid peptide bond formation on isolated 50S ribosomal subunits. EMBO Rep 7,699-703.

165. Katunin, V.I., Muth, G.W., Strobel, S.A., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2002). Important contribution to catalysis of peptide bond formation by a single ionizing group within the ribosome. Mol Cell 10,339-346.

166. Gromadski, K.B., and Rodnina, M.V. (2004). Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Mol Cell 13,191-200.

167. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289, 920930.

168. Hansen, J.L., Schmeing, T.M., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2002). Structural insights into peptide bond formation. Proc Natl Acad Sci U S A 99,11670-11675.

169. Schlunzen, F., Zarivach, R., Harms, J., Bashan, A., Tocilj, A., Albrecht, R., Yonath, A., and Franceschi, F. (2001). Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyi transferase centre in eubacteria. Nature 413, 814821.

170. Sievers, A., Beringer, M., Rodnina, M.V., and Wolfenden, R. (2004). The ribosome as an entropy trap. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7897-7901.

171. Youngman, E.M., Brunelle, J.L., Kochaniak, A.B., and Green, R. (2004). The active site of the ribosome is composed of two layers of conserved nucleotides with distinct roles in peptide bond formation and peptide release. Cell 117, 589599.

172. Brunelle, J.L., Youngman, E.M., Sharma, D., and Green, R. (2006). The interaction between C75 of tRNA and the A loop of the ribosome stimulates peptidyi transferase activity. Rna 12, 33-39.

173. Polacek, N. Gaynor, M., Yassin, A., and Mankin, A.S. (2001). Ribosomal peptidyi transferase can withstand mutations at the putative catalytic nucleotide. Nature 411,498-501.

174. Beringer, M., Adio, S., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. (2003). The G2447A mutation does not affect ionization of a ribosomal group taking part in peptide bond formation. Rna 9,919-922.

175. Beringer, M., Bruell, C., Xiong, L., Pfister, P., Bieling, P., Katunin, V.I., Mankin, A.S., Bottger, E.C., and Rodnina, M.V. (2005). Essential mechanisms in the catalysis of peptide bond formation on the ribosome. J Biol Chem 280, 3606536072.

176. Rodnina, M.V., Beringer, M., and Wintermeyer, W. (2007). How ribosomes make peptide bonds. Trends Biochem Sci 32, 20-26.

177. Rawat, U.B., Zavialov, A.V., Sengupta, J., Vaile, M., Grassucci, R.A., Linde, J., Vestergaard, B., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2003). A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421,87-90.

178. Rawat, U., Gao, H., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2006). Interactions of the release factor RF1 with the ribosome as revealed by cryo-EM. J Mol Biol 357,1144-1153.

179. Kunkel, T.A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A 82,488-492.

180. Powers, T., and Noller, H.F. (1990). Dominant lethal mutations in a conserved loop in 16S rRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 87,1042-1046.

181. Bartetzko, A., and Nierhaus, K.H. (1988). Mg2+/NH4+/polyamine system for polyuridine-dependent poiyphenylalanine synthesis with near in vivo characteristics. Methods Enzymol 164,650-658.

182. Stern, S., Moazed, D„ and Noller, H.F. (1988). Structural analysis of RNA using chemical and enzymatic probing monitored by primer extension. Methods Enzymol 164,481-489.

183. Kirillov, S.V., Makhno, V.l., Odinzov, V.B., and Semenkov, Y.P. (1978). The mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Heterogeneity of tRNA complexes with 70-S ribosomes of Escherichia coli. Eur J Biochem 89,305-313.

184. Gromadski, K.B., Wieden, H.J., and Rodnina, M.V. (2002). Kinetic mechanism of elongation factor Ts-catalyzed nucleotide exchange in elongation factor Tu. Biochemistry 41,162-169.

185. Wieden, H.J., Gromadski, K., Rodnin, D., and Rodnina, M.V. (2002). Mechanism of elongation factor (EF)-Ts-catalyzed nucleotide exchange in EF-Tu. Contribution of contacts at the guanine base. J Biol Chem 277, 6032-6036.