Изучение взаимодействия эндонуклеаз рестрикции Msp 1, Нра II, Sma 1, Xma I и Сfг9 I с синтетическими олигодезоксирибонуклеотидами, содержащими N4-метил- и 5-метилцитозин тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 647.963.3

ПЯТРАУСКЕНЕ ЛОРЕТА ЮОЗО

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ Мер 1, Нра II, Эта I, Хта I И С{г9 1 С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ !М4 -МЕТИЛ- И 5-МЕТИЛЦИТОЗИН

02.00.10 - биоорганмчесная химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -1992

у / » „ у . .

- ! •■ ' .-* , ' V <■' Л ' ' /

Работа выполнена в Институте прикладной энзишлогни "Fermentes"

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Янулайтис A.A.

доктор химических наук Буткус Б.В.

Официальные опопонтн: доктор биологических наук

профессор Юодка Б.А.

доктор химических наук Громова Е.С.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский инстит]

генетика и селекции промышленных организыо]

Защита состоится Чо* 1992 года в^ часов на

заседавши Специализированного ¿овета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 118899, Москва, ГСП-З, В-234, Ленинские гора, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 504,

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан tli" 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат ХЕаческих нзук ^—у ¿у И.Г.Сшфзова

ОБЩАЯ ХАРАКТВРЗНЛКа РАБОТЫ

, Актуальность проблемы.

Способность эндонуклеаз рестрикции II типа узнавать и расщеплять строго определенные последовательности ДНК широко используется в разного рода молакулярно-биологичвсхих исследованиях. В этих экспериментах иногда необходимы сведения о чувствительности рестрикционных эндонуклеаз к метилированным основаниям в участка узнавания ДНК. В основном такие данные били известна только в отношении двух метилированных оснований - 6-метиладенина (пьА) и 5-метилцигозина (и С), однако, имелись противоречия, которые нельзя Сало объяснить, основываясь только на эти два вида метилированных основания.

Обнаружение метилаз нового типа, модаЗЕицирувдих шггозяи (С) по екзошклическоа аминогруппе, образуя Н4-метилцитозкн (т^С^апи- ' 1а1иа, 1983) вызвало новую волну исследований. Это открытие помогло объяснить накопившиеся противоречия, однако, наряду возник вопрос о чувствительности эндонуклеаз рестрикции к го4С и га5С в кано-ниченком и неканоническом положениях сайта узнавания (канонической называется модификация участка узнавания, осуществляемая итагл^о--спецкфнческоа метилазоЯ данной системы рострикщгя-модк(5жации(Ш).

Объектами настоящего исследования явились эндонукдеагы рестрикции Кар I, Нра II, Биа I, Хта I, СГг9 I, которые узнают и расщепляют следующие последовательности (места расщепления отмечены стрелкой):

Мар I, Нра II ХгааI, СГГЭ I Зиа I

5'.. .С С в 0. ..3' 5'...С С С в в С ...3' 5\..С С Сч! 0 {5...3'

3\..С С С.С...5' З'-.Х б О С С с ...5' З'...с в влС С С...5'

♦ ф т

Эндонуклеэзы Бпа I, 7ла I и 0Гг9 I являются составной частью РМ систекн нового типа: соответствуйте им металазы модайщируют первый с 5*-конца участка узнавания остаток С до га^С.

Дзнвке о чувствительности эндонуклеаз рестрикции к различному метилированию С в каноническом и неканоническом полевениях в литературе отсутствовали, таким образом настоящей работой мы попытались восполнить этот пробел. Тем более, результаты настоящего исследования открывают новые возмоаности в молекулярно-генотических экспериментах и способствует боло о глубокому ионимашт феномена ГУ в частности.

Цельв пзсгокдеа работа явилось изучение чувствительности эн- ' донуклеаз рестрикции Мэр I, Нра II, Бва I, йпа 1-й С1г9 I к п4С и

ДНК.

Субстрата,>gî для исследования служили синтетические олигодезок-синуклеотиды, так как применение ДИК было исключено вследствии отсутствия металаз, способных создать желаешь набор последовательностей. содержащих т4С и т5С. Олигонухлеотида содержали свйты узнавания вше указашх эндонуклеаз рестрикции со всеми возможными заменами С на т4С и т5С.

В задачу работы входило I) разработка эффективного штода получения производных дезоксициткдина - Н4-ме тилцтидина и 5-метилци-тидина; 2) разработка метода синтеза по.яностью защищенного К4-ме-тилцитидина и его применение в фосфотрнэфирном синтезе олигонуклео-тидов; 3) изучение влияния го4С и a5С на стабильность ДНК-дуплексов; 4) сравнение влияния т4С и m®С на действие эндонуклеаз рестрикшш.

Научная новизна в практическая ценность работа. Разработан удобный и быстрый метод синтеза N4- метилцитидина и 5-метилшти-дина. Предложены зааитше группы для ^-метилцитидина и впервые синтезированы олигодезоксинуклеотиды, содержащие Впервые проведено сравнительное исследование влияния п4С и т5С на стабильность ДНК-дуплексов; показано, что т4С, напротив и5С, дестабилизирует двойную спираль ДНК.

На основе анализа расщепления дуплексов олигонуклеотидов, содержащих и4С и ш5С, впервые показано, что зндонуклеазы рестрикции Ыср I. Кра II. Sma I, Xma I, CIr9 I способны различать эти два вида оснований. На основе полученных результатов была пересмотрена систематика чувствительности ферментов рестрикции в отношении метилирования субстратов. Это впоследствии было отражено в сводных таблицах и обзорах (McClelland, 1988,1989,1990).

Эндонуююазы Msp I, Нра II, Sma I, Xma I, СГг9 I являются первыми ферментами, для которых приводятся • данные об эффективности расцепления метилированных субстратов, названы "эффективностью скорости расщепления" (rate efîect) (McClelland 1S88). - • Полученные в этой работе результаты имеют значение для понимания механизма действия эндонуклеаз рестрикции, а также для изучения общих принципов белкого-нукяэшювого взаимодействия. Практическое применение может заключаться в использовании их в мо-лекулярно-генетических экспериментах, например для конструирования новых стцвфичностей анзиматического расщепления ДНК, исследования уровня и профиля метилирования генома и т.д.

После оодбдшсошишя результатов настоящего исследования появились работы и других авторов, касавдихся той же проблемы.

Апробация работа. Результаты работы докладывались на VI Ues-

дународном симпозиуме "Метаболизм и энзнмология нуклеиновых кислот, включая манипуляции с генами" (Братислава, ЧССР, 1987), на Первом рабочем совещании "Биологическая модификация ДНК" (Бостон, ОНА, 1988).

Публняащи. По материалам диссертации' опубликованы 4 статьи.

Структура а объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (121 ссылки), содержит 8 рисунков и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и пагоды.

В работе использованы функционально чисгае препараты эндонук-леаз рестрикции Мзр I, Нра II, Sna I, Xma I, СГг9 I (Fermentas). Синтез, очистка и подтверждение первичной структуры додекануклео-тидов осуществленно лично автором. Установление температуры плавления метилированных олигонуклеотидов проводились Мюттенковой Л.Е. (ИБМ АН СССР). 5'-концевую 32Р-метку вводили с помощью Т4-полинуклеотйидкиказы в присутствии С?-32Р1АТР.

Дуплексные субстраты для .гидролиза эвдонуклеазами рестрикции

rio

готовили следущим образом: раствора 5'- Р-шченых (40СШш/шш/мкл) синтетических субстратов (I пмоль) в 6Fîepax соответствующих эндояуклеаз рестргашии (5-15 мкл) нагревали до 80°С, медленно охлакдали до температура реакции. Реакцию инициировали прибавлением исследуемой-эндонуклеазы (5-15 мкл). Обща объем смеси 20 мкл. Реакции расцепления эвдонуклеазами Unp I и Upa II проводили в буфера 10 ю» Trls-HCl (рН Г,4), 6 rtíí КС1, 10 ml ligClg, 1 Ш DÎT и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина; Хйа I - 10 гпМ Тг1з-НС1 (рН 7,4), 25 mM líaCl, 10 шМ MgCI2. Ю шМ 2-меркаптоэтанола и 100 мкг/мд альбумина; СГг9 1-10 ma Trls-HCl (рН 8,0), 50 m Naol, 5 m!l KgCl2, 5 mï 2-ыеркаптоэта-нола и 0,023 тритона: Sma I - 6 mï ïrls-EOl (рН 8,0), 20 Ш КС1, б шН 2-меркаптоэтанола и 100-мкг/мл альбумина. Реакции проводила в течение 5-22 часов при 4 и 37°С. Анализ продуктов расщепления и степень расцепления определяли следущим образом: после гидролиза реакционна смесь наносили на пластинку целлюлоз &-41и 1ШОО и хроматографзроваж в гсмосмеси VI при 60°С. Радиоактивные пятна, локализованные радаоавтогфафией, соскребали и радиоактивность просчитывала в толуольнон сцштшяторе. Эффективность расщепления расчитывали, исходя из'общаг внесенной радиоактивности я вырзкаля в процентах.

2. Синтез и свойства субстратов

2.1.Синтез иэталированЕих дозсксицстяднесв

В литературе описано насколько способов синтеза кагатированных производных дезоксицитидина, в основе которых лесат замещение 4-оксогрушш дезоксиуршоша или тамщшш на тао- (применяя реагеш P2S5) (Pox,(959), иетилтио- (применяя обработку сначала PgSg. а затем метанолом) (Wang,1982), сульфо- (обработка P2S5, затем окислением поразит анатом кали (ЕМпО^) (Wempen.1967) иди силил-оксигруппы (обработка гекс&метилдисилазаноы (HMDS) в присутствии триыетилхлорсилана (СНз)зБ1С1) (Vorbruggen,19?1). Последующая обработка получаемого дезоксиуридинового производного нуклео-фзльнш реагентом метиламином приводит к образовали Н^-ыетил-цитидина, тимвдивового производного - аммиаком - к 5-штилци-тшшну, а метиламином - к И^.б-даметилштадину. Все упомянутые реакции отличаются общим недостатком - еэсткостьв условий. Е боле о мягких условиях превращается С4-карбонЕЛ в С-азолидную группировку с применением арилсульфззождоз (Heese. 1978);триазола и п-хлорфонилдалорфосфата (Suog,1sei) или Р0С13 (Reese, 1984), На атой основе.Сайтом бал предложен относительна простой катод синтеза Б-метигиезоксицигадина (Sung.1930). 3',5'-1ЕацетилтошдЕН с применением п-хлорфениллихлорфосфата и триазола за 3 дня при комнатной температуре был превращен в тряазольное производное. Последущая одночасовая обработка концентрированным аммиаком при комнатной температуре привела к образованию 5-кетатштклика с выходом 72%.

fciu подробно исследовала настоящей реакцию и предлозшли усовершенствование, которое позволяет в значительное степени упростить условия реакции, а такаэ использовать ее для получения Н^чгэ-тилдезоксишгшдина (схема I). Для осуществления превращения ш ио-пользовали смесь ?0С13 и часто прженяеыого в олнгонуклеотквнш синтезе нуклеофпльного катализатора 4-ДЁЫэтидаииЕопиридкна (ШАР) в дихлорэтане. От использования привычного растворителя пиридина m отказались, так как проведение реакции в ней сопровождается образованней сильно окрааанных соединений, удаление которых требует тчательной и продолжительной очистки (на время реакции это ш влияло), этой дополнительной процедуры ш вннувденн-были взбегать, так как образовавшийся npovtesy точный активный интермедиа? без выделения из реакционной смеси обрабатывали метилашвои. Надо оплатить, что при образовании активного штормедиага ш наблюдали две стадии (данные ТСХ). Вероятно, в начала происходит фосфорилирова-ние гетероциклического основании, которое далее превращается в ею

тивное дшетиламинопиримидизовое производное нуклеозида. Такое производное значительно активнее соответствует азолидов нуклео-зидов и хорошо реагирует с другими нуклесфальными реагентвми (аминами, азолидами, метанолом, водной иелочью), образуя соответствующие производные нуклеозидов.

С использованием новой методики из 3',5'-дибензоилдезоксиуря-дина (1а) за 3 часа мы получили Н^-метиддезоксицитшшн (Ша) с выходом более 90%. Таким ке образом из защищенного по дезоксирибозв ■ймидзна (1б) была синтезированы (с применением аммиака) 5-ме-талдезоксшштидин (Шб) и К4,5-диметилдезоксицятаюш (Шв) с общим выходом соответственно 80 и 855!.

Схема I

т,;э=н I 0) (ЬН.8'=СК, ЙТ с,| ГЬН.Г^СН,

" <Г= = сн, -<1 я = сн,Я"= н =

- 2.2.Пояг?еЕкз полшстьз блокгрованвах. кзпинровашгьк куклоо-тадов, крнтодннх для хгамчесшг© сйнтеза олигонуклзотадоз

С целью применения в химическом синтезе олигонуклеотидов основные дезокскнуклеотиды - аденин, гуанозин, тимидин, цитщшн блокируются по аминогруппам гетероциклически оснований', которые способны взаимодействовать с фосфорялирущвмзг и другими элэкт-рофильныш реагентшет, применявшая в олигонуклеотидном синтезе. Блокирование б-метшщезоксицил зша в основном не отличается от блокирования дезоксивдтидина. Для этого применяется бензоильнзя

группа (Ве1ге,1981).

Для выяснения, необходимо ли блокировать вторичную экзоцик-

лическую аминогруппу Н^-метиддезоксицитакана, ш провели ряд экспериментов по определению побочных продуктов взаимодействия производных дезоксищггидкна и К^-штилдезоксшштщдана с реагентами фас-фотриэфирного синтеза. Для этого ш синтезировали 3',5',Н^-трибен-зонддезоксицитидив (А) и метилированные аналога - З'.б'.К^-тря-бензоил-^нютшщезоксшщтидин (Б), З'.б'-дибензоил-^-ализоил--К4-швддззоксиздгашш;(В), 3' .5' .-дгбензоил-г^^етилдезоксицнткдш (Г).

5

ЙГ Obi »i ¿t>i

ь 6 © г

Каадое из этих соединений го отдельности обрабатывали 24 чао при 2QJC следующими реагентами: п-хлорфенилфосфэ-(бис)- триазоли-дом, смесью селективного отщепления (ИшанбтильвоЁ защитной груша (EtgM-Py-HjO), детритапирушим агентом (5« СС13С00Н в CHgClg) и

конденснрущиы агентом (TPSTe) (таб.1).

Таблица I

Стабильность защищенных производных дазсксицитидина в Н^-ыеталдезоксидатидша в присутствии реагентов фосфо-триэфирного синтеза олкгснуклеотидов

Соединение • п-Хлорфенилфос-фо-(бис)-триазолид EtgN-Py-SgO (1:3:1) 5% CCI3COOH (в CHgGlg) . TÍSTe

А 0* 0 0 5

Б 0 .0 . 5 0

В 0 0 -Сяэда Следы

Г 0 0 о-. 90

количество продуктов превращения вырывны в процентах. Данные ТС на силикагеле (в систеие CHClq-HeOH,7:I}.

Результаты эксперимента, представленные в таблице, наглядно демонстрирует, что блокировать алкогрущу К^-метилдезоксицишшн: необходимо, так как она энергично реагирует с конденсирующим реагентом (ТРБТе), образуя около 90% побочных продуктов. Результаты исследования такса показали, что для блокирования этого гетерою® лического основания пригодны как бензоильная, так в анизоильная защитные группы. С другой стороны, было показано, что защищенный ^-метилдезоксиштидин слабо взаимодействует е обычными реагентам фосфотриэфкрного синтеза.

При синтезе И^-анизоил-Н^-кетилдезоксшитидина, мы заметили что привычный негод (Кована ,1963) введения анизоильной защитной группы в этом случае не применим. По этому методу, образовавшийся под воздействием аннзоилхлорида З'.Б'.^-трианизоил-М^-метилдезок

сицитидин долган обрабатываться 2N NaOä в 50% растворе этанола для селективного отщепления 3'- и б'-анизоильных защитных групп. Как оказалось, в этих условиях отщеплялись и N-защитшв группы основания. Не увенчалась успехом также попытка расщепления слоа-ноэфирных групп под воздействием более слабых щелочных агентов.

Эта проблема была решена путем блокирования гид^ксилов де-зоксирибозы триметилсилильныш группами. Предлокившие методику ученые (Т1,1982) эти запщтные группы использовали для блокирования 3'- и 5'-гидроксильных групп, после чего вводили N-защитные группы в гетероциклическое основание. После завершения реакции лабильные : силилыше группы удаляли аммонолизом за несколько часов. Мы исследовали способ селективного расщепления слояиоэфирных групп и окс-периментально доказали, что оно происходит за 20 минут даже под действием водного пиридина.

С использованием введенных усовершенствований кы синтезировали Н^-анизоил-К^-метил-г* -дезоксицятидиа-3' -О- (п-хлорфенил, ß-цианэтал) -фосфат <111). Синтез этого соединения включал следу тип стада ■ (схема 2): на к^-метилдезоксицитндан воздействовали свекеперегнашшм триметилхлорсиланом (üe-jSlCl), после чего 3'-,5'-силильное производное нуклесзядэ 'обрабатывали анизоилхлорвдом (AnCl). Сшгллышв группы удаляли действием водаого пиридина. Таким образом полученный Н-замещенный дезоксинуклеозид (I) без дополнительной очистки 5'-защищали 4,4'-даетокситритилхлорвдом '(ШТгС1) и тритшшроваи- • . ное производное (II) выделяли хроматографиэй на силикагеле. Полностью защищенный мононукпеотид (III), как и неиетилированшв мажорные мовонуклеотида, был синтезирован по стандартному методу фосфорилирования (Itatoira,1975), т.е. воздействием п-хлорфонилфос-фо-(бис)-триазолвдом и последующей обработкой ß-цианэтанолом превращая в полностью защищенный нуклеотвд.

Схема 2

с-О ^

н.

OMTrCt > и'-Дижегокситрмтхгеоск«»

Тп^триамлид

АпО«оикюгатэдид

р

2,3.. Синтез Я4-иетаа- и Б-^таихитозансодарггетх

олагонуклэотидов ©осфэтраэ$аршы ыатодои в раствора

Полностью защищенные мононуклеотады оылз использованы в синтезе динуклеотидов, которые в дальнейшем слукшш исходными блокад для получения более длинных олигонуклеотидов фосфотри-ефирнш методом. Синтез гомологичных олигонуклеотидов упростился благодаря неоднократному использованию больших перекрывающихся блоков (в схеме з (><3ведены рамкой).

Схема 3

б'^аЁСЩТС^ 5'йдАП14С ШООСТСС} 5'С,0Ага5С ЩКСТСС!

m^CC gGpCg 5 ТОЩ tnaCC )(XX3TCti * -, С..—j

S'jGGpl Cffl4C jSGGTCd 5'fWp Cm5C ?GGTC<j

*3десь и далее префикс d (дезскси) опущен.

Для создания межнуклеотидшх связей в качестве кондечси-рущего реагента использовала (TPSTe). Защитные группы после завершения синтеза удаляли действием концентрированного ашвдса и 60% уксусной кислоты.

Деблокированные олигонуклаотиды очщали ашкшообшзнной хроматографией на DEAE-Toyopearl, затем обращенно-фазовой ВЭ2Х дс гомогенности не мекее 99%. Первичную структуру синтезированных соединений доказывали методом нуклеотидных карт (Jay,1974).Hyiuie<: видый состав каждого из олигонуклеотидов опредэделяли обращенно-фазовой ВЭХХ после гидролиза до мояонуклеотилов при помов® фосфо-даэсторазы змеиного яда (7PDE) и дефосфоршшрованкя до дезоксн-

вуклеозидов_щэлочаой фосфатазой (рис.2).

"" хс в .

q Рис.1. Нуклеотидная карта олиговуклес

О тцда GGto4CCCGGGTCO.

6 32pbGAm4cccGGGT<:c Направление Е - электрофорез,

® Н - гомохроматографзя., ХС -

" ■ ксиленцаанол F?

О,О 25,0 t.u¡m

Рис.2. Определение тпигаозидного состава додэкакуклвотада 5'GGAm CCCGGGTCC обраценно-фазовой ВЭЖХ на колонке Nucleosll С-6, 25 км KKgK^ (pH 4.4), в градиенте .

концентрации здатопитрила(0.в-30£)." А - Cyd. В - 4mCyl, В - TM, Г - Guo. Д - Ado.

2.4. Определение теггператури плзвлзняа..

Как известно, субстратом рестрикционных эндонуклеаз является", двуслиральная ДНК (или дуплекс в случае олигонуклеотидов), поэтому, перед проведением знзиматичесюн реакций было необходимо убедиться, что в условиях реакций исследуемые олигонуклеотиды присутствуют в форме дуплекса. В случае субстратов, содержашзх 5-метилцитознн, известно (Кешр,197б) что температура их плавления ■ сдвинута-в сторону более высоких температур. Обсуздаотся и причини такого поведения, а именно - повышенное ?стшшг" взаимодействие . оснований.которое в свою очередь коррелирует с увеличением полярности ыодекул (Sowers,1987).

Относительно субстрвтоз, содэраазмх ^-кеталцетозот, литературных данных о влиянии этого метилированного основания на стабильность олигонуклеотидвых дуплексов не било обнаружено. Таким образом, определение температуры плавления метилированы* олягонуклеотд-дов было необходимо перед проведением энэш,»логических исследований.

й^-иотальная группа цитозинэ по своем сторосхкмкческпм признакам имеет большое сходство с К^-^етилытой группой адеиина, так . как обе они замещает; один из двух атомов водорода в экзоциюшчес-кой аминогруппе, участвующих в образовании Watson-Orícfc пары комплементарных оснований (Engel,1978).

Как известно из литературы (Engel,1978), значение Тт олигонук-леотидов,содержащих Н^-штиладешш, намного mise Tm неметилиро-ванных дуплексов, кривые имеют и меньшую {»оперативность перехода. Метальная группа в т^А предпочитает cls-полояенив по отнокгавию к N1. Это препятствует образованию комплементарной пары (которая

требует ггаив-конформации) с тишном, и следовательно, дает поникание скорости образования А-Т пара.

С1з-полоЕбние И-металыюй группы по отношению к N3 наблюдается и у т4С (Ра2акег1еу,1987). Отсутствие имидазольного кольца, есл: сравнивать с ш6А, облегчает вращение вокруг N4-04 оси и исключает сторическое затруднение в Н-меты-Н7 области. Таким образом можно окадать, что т4С будет спариваться с С легче по сравнению с и6А. Однако, пониженные статистические возмокности ш4С принять требуемую 1;гапз-конформаци» по сравнению с С для образования двойной спирали (Б!юир,197?.> будут сдвигать равновесие спираль - дуплекс в сторону однонитевой спирали.

Все ето лтаь теоретические обсуждения, однако, они указывают аа возможное значительное понижение температуры плавления дуплексов, содержащих }{4-метйлшггозин. Для проверки этих рассуадений была проведено сравнительное исследование температуры плавления оли-годезоксинуклеотщов-дуплексов, содержащих разные типы метилирования шиозшш: «ЗАССХХМСТСС, СйАга5СССО(ХйСС и «¡Ат4СССа<}СТСС.

Температура плавления(Тт) дуплексов устанавливалась методом УФ сюксроскохши и соответственно выше указанному порядку равна 60, (Н.ц>, 55,5° С. Кривые плавления исследованных додекадезоксинук-леотидов представлены на рис.3 .

Полученные результаты позволяют делать вывод, что данные эшщрмента полностью согласуются с ваше излокбншы теоретическим обсудаэдаем, т.е. ^-метилцитозин снижает Тт олигонуклэ отидов, дестабилизируя двойную спираль. После завершения наших экспериментов аналогичные данные были опубликованы и другими авторами (РагеХеПеу, 1987 5 Опо, 1987).

Как видно, исследуемые додекануклеотнды имеют относительно 'шсокке значения Тт> Как будет показано далее, реакции расщепления рестрдашоннищ вндонуклеазами йар I, Нра II ж Баа I ыы проводили при; 4°С( поэтому мошю утверждать, что в этих условиях все олиго-нуклеотаи присутствуют в форма дуплексов. Для эндонуклеаз сгг9 I и ХЩ I температура проведения реакции равнялась 37°С. Ыы не провода® сдецяального расчета, какая доля двуспиральных субстратов при а.той температуре находится в односшральном состояние, однако, из представленных кривых плавления ыозшо предпологать, что более чем 903 олигояуклеотидов находятся в форме дуплекса.

*

t

i do6*arcoctcc to 2dOG***amcnr ну мси&сахястк etj-

Рис.3. Кривые плавления додехануклеотядных душшсов

IjGGACCCGGGTCC; 2 )GGAm GCCGGGTCC; 3)§GAm CCCGGGTCC. Раствор олигонуклеотидов-дугшексов 0,23-0,25 мМ в 0,1 М НаС1, 0,2 },iM EDTA, температурный градиент 0,7 град/мин, кювета 0,1 см.

3. Чувствительность рвстршшгошшх эндонуклаай нзр I, Нра II, Sraa I, Xma I, Cir9 I R ^4-«етил- и 5-иетшщитозипу в различных пояснениях узнаваемой последовательности

ЗЛ.Рассепление неиеталированных субстратов

Результаты расщепления неметшшровашых самокомплементарных дуплексов олитонуклеовдов показали, что все исследованы эндонук-леазы рестрикции образовывали ожидаемые продукта расщепления. Эндо-нуклеазы 01г9 I и Xma I образовывали меченый тетрануклеотид (pGGAG), t£sp I и Нра II - пентануклеотид (pGGACC), Sma I - гекса-нуклеотид (pSGACCC) (рис.4).'

Рис.4. Анализ'продуктов расщепления додекадезоксинуклеотида-(ХАСССОССТСС рестрикщонвши эндонуклеазами методом гомохроматографии параллельно с УРОЕ-гидролазатом того же субстрата

(а)-исходный субстрат; (б)-ТРВК гидролизат субстрата; ГвЬЗта I; (гЛйвр I; Ш-Нра II; I; (з)-ст I.

ХС-ксиленшанол Й В дальнейшем, с использованием того «енеметилированного

а б в г д

ж з

субстрата йС-АСССОООТСС, проводили ооттаизащш условий гидролиза для каадого отдельного ферментного препарата с цель» подобрать условия, в которых достигалось максимальное расцепление субстрата за самое короткое время(таб.3).

Таблица 3

Экспериментально установленные оптимальные условия реакции синтетического субстрата ССАССССССТСС с эндонуклеазамк рестрикция Ызр I, Нра II, Бпа I, Хта I и СГг9 I

Рестрякциокная Температура Время Соотношение Фермента и субстрата эвдонувлааза (С) (ч) (ед.экт./пмоль)

Иер I Нра II Бюа I йпа I СГГ9 Г

4 4 4 37 37

22 22 5 18 20

1

2

0,5

3

3

3.2, Расщепление 'пояеостьэ ¡¿этадйровшшых субстратоа ■ Каздый из двусгшральных Метилированы! субстратов (шэщих одинаковые метилирование цетюобрабатывали фэрмэнтоы в условиях, оптимальных, для неиетилированного субстрата. Полученные результата представлены в табл.4.

Таблица 4

Взаимодействие рестрикциошк эщшуклеаз с немэташрованнш! и метилированными субстратами

РестржцЕонная андонукдваза

Мер I Яра II . База I Хта I СГг9 I

Субстрат 5*....3'

С С С С О О И50 с с о о с С в5С с о о о О С т50 О О О т^С ОСОбО

с и4с с о о а

С О т4С О О О

94* 97- 92 . 91 51

96 32 5 I б

1 о Г 53 70 • 30 8

50 [ 0 1 0 23 46

89 80 0 0 0

31 0 С 0 1 ( 0 1 { 0 1

16 • 0 0 0 0

* Степень расцепления выражала й процентах (в целях упрощен®

12

проценты приведении в цели числах).

**Квадратными сковками выделены сайты канонического метили. рования соответствующих эндонуклеаз рестрикции.

***Цепи двуспирального субстрата одинаковы.

Как видно из таблицы 4, метилированный сайт п5СССОСО был плохим субстратом для ресгрикционных эндонуклеаз эиа I, Хгаа I и СГг9 I, так как расщеплялся на 5, I и 5% соответственно. Значительно лучше эти три ресгрикциошше эидонуклеазы, гидролизиро-вали Ст5ССтео сайт, т.е. на 70, 30 и в%. Введение 5-метилцитозкна в крайнее 3'положение сайта придало ему устойчивости к действию Б.Бта I. Оставшиеся две эндонуклеазы - Хша I и СГг9 I - расщепляла отот сайт на 23 и 463 соответственно, ни одна из трех рестрикцн-онных эндонуклеаз не расщепляла сайты, содержащие Н4-метилцитозйа.

Наличие как т4с, так и ш5С в крайнем 5' положении СССвСС последовательности не препятствовали расщеплению сайта эндонук-леазам Мер I и Нра II. Этого и следовало ожидать, так как эти основания находятся за пределам узнаваемых участков. Эти хе ферменты не взаимодействовали с субстратами, имеющими каноническую метальную метку - щ5ССОО (Мяр I) и Ст5ССС (Нра II). Введение т5С . в полокение, соседнее каноническому (спг'с&о, затрудняло расщепление рестрикционной эндонуклеазой Изр I (502). То гэ замечалось и в случае Бра II при гидролизе сайта пгСССК (53%). В. Нра II не растопляла ей одного сайга, содерзищего т^С.

Однако, по некоторым аспектам взаимодействия эндонуклеаза НгрТ отличалась от других исследованных эндонуклеаз. Так, она хотя и мещве активно, йо расщепляла субстраты, содержащие Н^-кетшщитозин - т4СССЙ л Са4ССО, (на 31 и 16% соответственно). Таким образом., НЛ£зр I оказалась единственной среди исследованных, которая расщепляла субстраты, содержащие ш4С. Такое исключительное поведение . Д.йБр I макет означать, что в отличив от большинства ДНК-узнающих белков, основные детерминанты взаимодействия с этим ферментом расположены не в большом, а в малом велобе В-ДНК.

3.3 Расщепление полуштнлированшх субстратов

Полностью метилированные олигодуплексы, которые слабо или совсем не расщеплялись какой-либо из эндонуклеаз рестрикции, до-' полнительно исследовали готовя из них полуметилированные субстраты. Полуметилированные дуплексы готовили гибридизацией метилированного и неметилированного олигонуклеотидов. Результаты настоящего исследования представлены в'табл.5.

Таблица 5

Взаимодействие рестрикционных вндонуклеаз с полуметиларованныма субстратами

Рестрикционные' андонуклеазы Субстрат Мэр I Нра II Эта I Хюа I СГг9 I

5' Ш5С С С С с с . {+++) <+++) + - —

3' а в о с с с <+++) (+++> ++ - -

5' С т5С С С в с- £♦+1* • +++ ++ +

3' б С й с с с 1 -] ++ ■Н-+ -и- ■м-

5* С С в5С 0 0 б <+++> 1—] — +-Н- •и-

3' й с ОС с с (+++) [—1 - ++ ++

5' т4С С С б 0 0 (+++> (+++) - -

3' С б с с с с (+++). (+++) - - -

5' С И4С с с с й (++) + [ -1 с—] ' .(—]

3» ч со с с с ■И- 1 +1 1 +) 1 -1

5' С С а4С о с й +++ _ _ — -

3' с э с с с с ++ +4 . • - - -

Результата расщепления канонических полумегилированных сайго шделэнн квадратными скобками. Для наглядности выраженное в процентах расщепление каздой цепи обозначено схематически: (+++)- более чем на 50%; <+*) - 20-50%; (+) - 5-20%; (-) - 1-58; (—) -отсутствие расщепления. Данные в скобках взята из таблицы 4.

Как вацщо, цепи гетеродуплэксов расщеплялись с разног эффективность». Обычно метилированная цепь расщеплялась хугэ -т5ССС«х;:ССССК}С - андонуклеазой Бта I; Сп5СС«Кг:СССС(Х; - СГг9 I; сш4сс<хй:сссас<} - Ера II ; ССт%ХК :СССШ5 - Нра II, или совсеы не расщеплялась - ССт5СШ;:СССШ} - Бша '1;. В некоторых случаях обе цепи гидролизовались с одинаковой эффективностью: т5СОС(ХХ5:ССС(Х& - Хйа I, С£г9 I; Ст5СС(ХХ}:СССС{Ю - Ера II, Бта I, Йпа I; ССт5ССОО:ССШХЗ - СГг9 I; п4СССШ}:С0СШ] и ССт4С(ХХ}:ССС(ХХ} - 5па1 Хгоа , СМ I. Единственный субстрат - ССт5СС<Х>: ССССКХ! - зндо-нуклеаза Хта 1 расщепляла преимущественно по метилированной дани. Подобным свойством в отношении котилированных цепей отличалась и

рестрикционная эндонуклеаза Hsp I.

Как и ожидалось, СГг9 I, Sna I. Хва Г и Нра II на растопляли модифицированной цепи подуметилироваиннх дуплексов, имевдих ка- • ионическую метальную метку (Cm4CCGGG:CCCGGC) и соответственно (Cm5CGG:CCGG)

R.Msp I более эффективно расщепляла метилированную цепь канонически метилированного гетеродуплекса m5ccGG:CCGG.To re самое было отмечено и в случае гетеродуплекса Cn4CGG:CCGG. Такой способ взаимодействия с модифицированными сайтами также наблюдался у ряда эн-донухлеаз рестрикции, узнающих шестизвенвде последовательности Bgl II МП I (Опо,1987). Наиболее просто это можно объяснить тем, что й.Ывр I при связывании с неметилированнсй цепью расщепляет метилированную цепь. Но однозначно твердить этого не решаемся, так как не сыли проведены дополнительные исследования по изучению параметров связывания фермента с каждой цепью полуметилярованого субстрата.

Обобщая результаты сравнения взвашюдзйствия РУ ферментов с субстратами, содержа!цгми а'с или щ&С, иозшо сказать, что п4С, как правило, блокирует действие большинства исследованных эндонуклеаз (Нра II, Sma I, Soa I, СГг9 I). Ингабирушй эффект m5C выракен значительно слабее.

Полученные результаты указывает на то, что ферменты строго дафференшшруют оба положения и проявляет различную чувствительность к соответствущим основаниям. Объяснение атоыу моано искать, анализируя расположение этих метальных груш в двойной спираю* ДНК. По этому признаку метилирование К^-пологгния существенно отличается от такого по Сб. Тек, хотя обе метальные группы находятся в больном хелобе В-ДНК, ¡Г^-метильнач группа находятся в центральной, т.е. наиболее выступающей части иэлоба, а С5 - в боковой. В дополнение, ыетилярсвание цдтозина по К^-полокзнм создает но только стеряческие затруднения при взаимодействии с ферментами, что возможно имеет место и в случае Сб-штилированая. ко такгэ блокирует NHg-rpynny - вааный контакт опознованая C:G пары, находящийся в большом желобе ДНК. Вероятно, эти различия в основном и обуславливают более сильный ингибнругашй эффект г^-метащатозша в отношении действия ферментов.

Эффективность расг^плааяд в&мвошгчвсяа цататарозгннш субстратов. Полученное нами результаты показали, что некоторые эндонуклеаз« рестрикции менее активно расцепляют неканонически метилированные субстраты. Уровень ингибирования, однако, для как-, дой андонуклеазы существенно варьирует (см.табл. 4), и зависит от

природа метилированного основания и его пологения в сайте. Этот факт не снл отракен в таблицах чувствительности UcClellana, где любой метилированный сайт относили к расщепляемым или нет, т.е. таблица была организована по "плюс - минус" принципу. Хотя для большинства рестрикционных эндонуклеаз кинетические параметр! взаимодействия с метилированными субстратами не исследованы, однако уже имеющиеся данные указывали на несовершенство организации таблицы. В слузае слабо расцепляемых метилированных сайтов стали поступать противоречащие друг другу данные. Все они в итоге включались в таблицу. В результате оказалось неясным, например, расцепляет или не расщепляет R.Hpa II m5CCGG, R.Sma I - nTCCCGCG последовательность. Аналогично, в таблицу были включены.сведения о том, что CCmsCttGG сайт расщепляется R.Xma I в эукариотической ДНК, но не расщепляется в ДНК H.p&ratnfluenzae (McClelland, 1988).

Основываясь на полученных результатах, мы попытались разобраться в этих противоречивых данных. Как видна из таблицы 4, расщепление обсувдаемых метилированных -сайтов эндонуклеазами рестрикции Бра II и Хва I значительно ингибируется и они расщепляются примерно в пять раз менее эффективно по сравнению с неметилирован-ным сайтом. Таким образом одной из причин противоречивых результатов, получэных разными исследователями, могло зависеть от условий проведения реакции: времени ее протекания, концентрации эндо-нуклеазы.

В настоящее время, с поступлением данных об эффективности расщепления метилированных субстратов, они стали включаться в таблицы чувствительности эндонуклеаз рестрикции й получили название "эффекта скорости расщепления" (rate effect) (McClelland,1988). Первыми ферментами, для которых были определены эти характеристики специфичности являются Map I, Нра II, Sma I, Xma I и Cfr9 I, исследованные в настоящей работе.

Чувствительность ацдокуклваз рестрикции к неканоническое? щтаянровашя и исследование эукарЕотачзскоЗ ДНК.

За последнее время появилось много публикаций указывающих на взаимосвязь уровня метилирования генома и отдельных генов с такими биологическими процессами как экспрессия генов, рост., деление и злокачественное перерождение клеток (Razliv,l984). По этой причине изучение профилей и уровней метилирования эукариотического генома заинтересовали-многих исследователей.

В качестве аналитических инструментов для таких исследований стали использоваться и рестрикционные эндонуклеазы.Так как метилирование эукариотической ДНК в основном сосредоточено в C:G да-

нуклеотздах (Doerfler.1981), иг применение основывается на подборе двух изошизомеров,узнающих сайт, содержаний C:G динуклеотид, но различавшихся чувствительностью к его метилированию. Наиболее часто применяются пары эндонуклевз рестрикции Хша I-Sma I (Youssoui-ilan.1981) и Ызр I-Hpa II (Ehrlich,1981). Применение этих пар основывается на том, что первый Сермент в кахаой паре расщепляет метилированный CCm5CGGG (Си CGG) сайт, а второй нет. Расцепление исследуемой ДНК отдельно двумя зндонуклеазами и последующее сравнение видов электрофоретического разделения фрагментов мокет выявить этилированные C:G динуклеотида в участках, перекрывахящхся с сайтами* эндонуклеаз рестрикции.

Проведенное нами исследование четырех эндонуклеаз рестрикции.' входящих в упомянутые пары, в принципе подтвердило правомерность • их применения для изучения метилирования IHK, однако с целью получения достоверных результатов необходимо применять избытки эндонуклеаз. Особенно зто относится к эндовуклеазе Xma I, которая характеризуется низкой эффективность!) расщепления CCo^CGGG сайта.

4.Вывода

1. Разработан удобный и простой метод синтеза метилированных дезоксицитадинов - я^-металцнтядиЕа, 5-метнлцитадина и Н*,5- . дикетилцнтидина.

2. Подобраны защитные группы для N^-датилцитидпна и показано,, что таким образом полностью блокирован нуклеотад пригоден для фос-фотриэфйфного а фэсфоемадитного синтеза олигодезоксирибонуялеотя-дов, содергадщх это основание. :

3. Синтезирована серия олигонуюзэотидов, включающих. метилированные я нецетклированные сайты ряда эндонуклеаз рестрикции типа II; впервые получены олигодезоксгнуклеотады, содержащие т*С.

4. Определены температура плавления дуплексов додекануклео-тндоя, содбргаяих и4С г т5С, Показано, что о5С повышает Т0 дуплексов, а о С вызывает значительную дестабилизация двойной .спирали. . ri:

5. йсслйдоваш взаимодействие эндонуклеаз рестрикции Нзр I, Бра II, йза I, Sa^'t, Cfr9 I с субстратами, содержащими т40 п т5С в узнаваемой участке, на основе чего показано, что: а) все эндо-нуклвазы чувствительны к замене С на ила т5С не только в каноническом, но и в другом цолоеоши сайта: б) введение п4С в любое полоаэше участка узнавания блокирует действие R. Нра II, йга I, Sma I, Cfr9 I. R.Kap I, напротив, расщепляет такие субстраты, что позволяет сделать предаолокение о ее контактах в минорном желобе В-фсриы ДНК.

6. Выдвинуто предполохание, что метилирование штозина то Я^-оыу пологенив не только создает стерические затруднения ври взаимодействии с ферментами, но и блокирует важный контакт опознавания C:G пары оснований, находяаейся в основном велобе ДНК.

Основное содержание диссертационной работы излсявн© в пубяшшвях:

1. Пятраускене JI.D.. Климашвускас С.И., Буткус В.В., Янулайтис

А. А. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содеркаших К^-метилци-Т03ИН. - Виоорг.химия, 1986, т.12, К 12, с.1597-1602.

2. Butkus V.V., Kllma&iuskas S.J., Petrausklene L.J., lianellene Z.P., Jamilaltls A.A., Mlnchenkoya L.E., Schyolklna Д.К. Synthesis and physical characterization oi DNA fragments containing K4-methylcytoelne and 5-DethylcytosLne. - Nucleic AcIda Пев., 19!37, V.I5, N 20, p.8767-8778.

3. Butkus V.V., PetrausKlene I.J., Kanellene Z.P.,.Kllma£auslca3 S.J, LauSys V.S., Janulaltts A.A. Cleavage оf methylated CCCGGC sequences containing either b^-toethylcytcalns and 5-mathylcyto-slne with Kcp I, Нра II, База I, Xma I, Cfr9 I restriction endo-nucleases. - Kucleic Acids Res., 1937, т.15, H 17, p.7091-7102.

4. Butkus V.V., KllraSauskas S.J., Petrauaklena L.J., lianellene Z.P., HlnchenKoya I.E., Schyolklna Л.К. Janulaltis A.A. The effects of Я4- and C5-osthylatlon of cytoolEe on ША physical properties and restriction endonuclease action. - In: ЫеШюШ and Еп21ш1обУ of Nucleic Acids Including Gene Manipulations, Institute of Molecular Biology, Slovac Acadeay of Sciences, Bratislava, 1937, p.119-127.