Изучение взаимодействия эндонуклеаз рестрикции Msp I, Hpa II, Sma I, Xma I и Cfr9 I с синтетическими олигодезоксирибонуклеотидами, содержащими N4-метил- и 5 - метилцитозин тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 647.963.3

ПЯТРАУСКЕНЕ ЛОРЕТА ЮОЗО

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ Мер I, Нра II, Бша I, Хша I И С!г9 I С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ № -МЕТИЛ- И 5-МЕТИЛЦИТОЗИН

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -1992

Работа выполнена в Институте прикладной анзимологш "Fermentes

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Янулайтис A.A.

доктор химических наук Буткус В.В.

Официальные опоненты: доктор'биологических наук

профессор Юодка Б.А.

доктор химических наук Громова Е.С.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский институт

генетики и селекции промышленных организмов

Защита состоится у/у^^г^ 1992 года в//часов на заседавйи Специализнрованшто совета Д 053.Сб.47 по химическим наукам при Уосковском государственном университете ин.М.В.Ломоносова по адресу: 118899, Москва, ГСП-З, В-234, Ленинские горн, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория эо/

С диссертацией моено ознакомиться в библиотеке Химического факультета ШУ.

Автореферат разослан п^¿¿у-Л 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук . —у И.Г.Смйраова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕР2СТ5Ш. РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Способность эндонуклеаз рестрикции II типа узнавать и расщеплять строго определенные последовательности ДНК широко используется в разного рода молекулярно-биологических исследованиях. В этих экспериментах иногда необходимы сведения о чувствительности рестрикционных эндонуклеаз к метилированным основаниям в участке узнавания дик. В основном такие данные были известны только в отношении двух метилированных оснований - 6-метиладенина (иьА) и 5-ыетилцитозина (т С), однако, имелись противоречия, которые нельзя бнло объяснить, основываясь только на эти два вида метилированных оснований.

Обнаружение метилаз нового типа, моди^ицирущих цитозин (С) по акзоциклическоа аминогруппе, образуя Н4-мвтилцгтозаи (¡п^СК^апи- ' 1а111з,19вЗ) вызвало новую волну исследований. Это открытие помогло объяснить накопившиеся противоречия, однако, наряду возник вопрос о чувствительности эндонуклеаз рестрикции к ш4с и ш^С в кано-ниченкоы и неканоническом положениях сайта узнавания (канонической называется моди4шсация участка узнавания, осуществляемая шташо--спецкфической метилазоЯ данной системы рвстригдга-шдкфйкацииСРМ).

Объектами настоящего исследования явилась эндонуклеазы рестрикции Мэр I, Нра II, Бпа I, Хва I, СГг9 I, которые узнают и расцепляет следующие последовательности (места расцепления отаэчеЕЫ стрелкой):

№зр I, Нра И ХтаI, СГГЭ I Зта I

5'...С С в С...З' 5\..С*С С С 0 в ...3' 5\..С С СЧ! в С...З'

3'...С С С С...5' С С С С С ...5' 3'...0 0 СаО С 0...5*

+ $ *

Эндонуклеазы Бша I, Хша I а СГг9 I являются составной часть» РЫ системы нового типа: соответствуюте ид металазы кодифицирует■ первый с 5'-конца участка узнавания остаток С до т4С.

Данвке о чувствительности эндонуклеаз рестрикции к различному метилированию С в каноническом и неканоническом полокенилх в литературе отсутствовали, таким образом настоящей работой т попытались восполнить этот пробел. Тем более, результаты настоящего исследования открывают новые возможности в молекулярно-генеткческях экспериментах и способствует более глубокому пониманию феномена РМ в частности.

Цель» настоящей работа явилось изучение чувствительности эн-' донуклеаз рестрикции Мзр I, Нра II, йпа I, Хта 1-й СГг9 I к т4С и

ДНК.

Субстратами для исследования служили синтетические олигодезок-синуклеотиды, так как применение ДНК соло исключено вследствии отсутствия метилаз, способных создать желаемый набор последовательностей, содержащих т4С и т5С. Олигонуклеотиды содержали сайты узнавания вше указаных эндонуклеаз рестрикции со всеми возможными заменами С на т4С и т5С.

В задачу работы входило I) разработка эффективного метода получения производных дезоксицитидина - ^-ыетилцтидина и 5-метилци-тидина; 2) разработка метода синтеза полностью защищенного N4-mq-тилцитидина и его применение в фосфотриэ^ирном синтезе олигонуклео-тидов; 3) изучение влияния т4С и т5С на стабильносиь ДНК-дуплексов; 4) сравнение влияния т4С и т5С на действие эндонуклеаз рестрикции.

Научная новизна н практическая ценность работы. Разработан удобный и быстрый метод синтеза N4- метилцитидина и 5-метилцити-дина. Предложены защитные группы для Я4-метилщтидина и впервые синтезированы олигодезоксинуклеотиды, содержащие т4С.- Впервые проведено сравнительное исследование влияния т4С и т5С на стабильность ДНК-дуплексов; показано, что ш4С. напротив ш5С, дестабилизирует двойную спираль ДНК.

На основе анализа расщепления дуплексов олигонуклеотидов, содержащих т4С и т5С, впервые показано, что эндонуклеазы рестрикции Мер I, Нра II, Sroa I, Xma I, Cír9 I способны различать эти два вида оснований. На основе полученных результатов была пересмотрена систематика чувствительности ферментов рестрикции в отношении метилированных субстратов. Это впоследствии было отражено в сводных таблицах и обзорах (McClelland, 1988,1989,1990).

ЭндонутСяеазы Мэр I, Нра II, Sma I, Xma I, СГг9 I являются первыми ферментами, для которых приводятся данные об эффективности расщепления метилированных субстратов, названы "эффективностью скорости расщепления" (rate eífect) (McClelland 1988). - • Полученные в этой работе результаты имеют значение для понимания механизма действия эндонуклеаз рестрикции, а также для изучения общих принципов, белкого-нуклеинового взаимодействия. Практическое применение может заключаться в использовании их в мо-лекулярно-генетических экспериментах, например для конструирования новых сгоцифячностей энзиыатического расщепления ДНК, исследования уровня и профиля метилирования генома и т.д.

После оадбликоиашш результатов настоящего исследования появились работы и других авторов, касающихся той же проблемы.

Апробация робота. Результаты работы докладывались на VI líes-

дународном симпозиуме "Метаболизм и энзимология нуклеиновых кис. лот, включая манипуляции с генами" (Братислава, ЧССР, 1987), на Первом рабочем совещании "Биологическая модификация ДНК" (Бостон, США, 1988).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи.

Структура в объем работа. Диссертация изложена -на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (121 ссылки), содержит 8 рисунков и б таблиц.

СОДБЙиНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и ыетода.

В работе использованы функционально чистые препараты эндонук-леаз рестрикции Мэр I, Нра II, Sma I, Xma I, СГг9 I (Fermentas). Синтез, очистка и подтверждение первичной структуры додеканукпео-тидов осуществлен®) лично автором. Установление температуры плавления метилированных олигонуиеотидов проводились Минченковой Л.Е. (ИБМ АН СССР). 5'-концевую 32Р-метку вводили с помощью Т4-полинуклеотиидкиназы в присутствии [7-32Р1АТР.

Дуплексные субстраты для .гидролиза эндонуклеазами рестрикции готоеили следущим образом: растворы 5'-32Р-меченых (4000шш/мин/мкл) синтетических субстратов (I пмоль) в буграх соответствующих эндонуклэаз рестрикции (5-15 мкл) нагревали до 80°С, медленно охлакдали до температуры реакции. Реакцию инициировали прибавлением исследуемой-эндонуклеазы (5-15 мкл). Общий объем смеен 20 мкл. Реакции расщепления эндонуклеазамн Мзр I и Нра II проводили в буфере 10 тМ Тг1з-НС1 (рН 7,4-), 6 гоМ КС1, 10 шМ MgCl2, 1 шМ ПИ! и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина; Хша I - 10 шМ Trls-HCl (рН 7,4), 25 mM NaCl, 10 шМ KgCl2, 10 тЫ 2-меркапто8танола и 100 мкг/мл альбумина; СГг9 1-10 шМ Гг1з-НС1 (рН 8,0), 50 mSí Naül, 5 mЯ HgCl2> 5 Ш 2-керкаптоэта-нола и 0,02% тритона; Sma I - б m?í IrlG-HOI (рН 8,0), 20 mH КС1, 6 шМ 2-меркаптсэтанола и 100-мкг/мл альбумина. Реакции проводила в течение 5-22 часов при 4 и 37°С. Анализ продуктов расцепления а степень расщепления определяли следущим образом: после гидролиза реакционную смесь наносили на пластинку целлюлоз D-41H ШЗОО и хроматографировали в гомосмеси VI при 60°С. Радиоактивные пятна, локализованные радиоавто1фз$иеа, соскребали и радиоактивность просчитывали в толуольном сцинтшшяторе. Эффективность рзсщеплегятя расчитывали, исходя из'общей внесенной радиоактивности и выракага в процентах.

2. Синтез в свойства субстрвтов 2.1.Синтез «¿оптированных дазоксЕцитадинов В литературе ошсано несколько способов синтеза метилированных производных дезоксицитидина, в основе которых лвшт замещение 4-оксогруппы дезоксиурадзша или тимижня на тио- (применяя реагент P2S5) (Pox, 1959), метилтио- (применяя обработку сначала PgSg, а затем метанолом) (Wans, 1982), сульфо- (обработка P2S5, затем окислением перманганатом калия (КЫп04) (Wempen.1967) или силил-оксигруппы (обработка гексаметилдисилазаноы (HMDS) в присутствии триыетилхлорсилана (CHgJgSlCl) (Vorbruggen,1971). Последующая обработка получаемого дезоксиурадинового производного нуклео-фяльным реагентом метиламином приводит к образовании ^-метил-цитидина, тимидинового производного - аммиаком -. к 5-ыеталци-тадину, а метиламином - к Н^.б-диметилцнтидину. Все упомянутые реакции отличаются общим недостатком - аесткостью условий. В более мягких условиях превращается С4-карбоннл в С-ззолнднуя группировку с применением арилсульфвзолддов (Reese, 1978);грзазола я п-хлорфениддшигарфосфата (Suns,1981) или Р0С13 (Reese, 19S4-). На этой основе .Сангоы бал предложен относительно простой метод синтеза 5-метнлдезоксицитнднна (Sung, 1930). 3' .б'-ЛиацетиятЕэддия с применением п-хлорфенилдихлорфосфата и триазола за 3 дня npz комнатной температуре был превращен в триазольное производное. Последующая одночасовая обработка концентрированным аммиаком ща комнатной температуре привела к образованию 5-мэтилциткдина с выходом 7255. •

Мы подробно исследовали настояцув реакцию н предлоами усовершенствование, которое позволяет в значительной степени упростить условия реакции, а такгэ использовать ее для получения И^-цэ-тилдезоксицитздина (схема I). Для осуществления превращения ш попользовали смесь Р0С13 и часто применяемого в олигонуклеоткдноы синтезе нуклеофального катализатора 4-диыетнлаыннопирщдаа (ШАР) в дихлорэтане. От использования привычного растворителя пиридина мн отказались, так как проведение реакции в ней сопровождается образованием сально окрашенных сое лишний, удаление которых требует тчательной в продолжительной очистка (на время реакции это не влияло). Этой дополнительной процедур; ш вынуадены-были избегать, так как образовавшийся промежуточный активный ннтеркедаат без выделения из реакционной смеси обрабатывали метиламином. Надо отметить, что при образовании активного интеркедиата т наблюдали две стадии (данные ТСХ). Вероятно, в начале происходит фосфорилирова-ние гетероциклического основания, которое далее превращается в ек-

tzCK I bzOv

ТИВН08 диметиламинопиримщдановое производное нуклеозида. Такое , производное значительно активнее соответствующих азолидов нуклео-зидов и хорошо реагирует с другими нуклеофальнкми реагентами (аминами, азолидами, метанолом, водной щелочью), образуя соответствующие производные нутслеозидов.

С использованием новой методики из 3',5'-дибензоилдезоксиуря-дина (1а) за 3 часа мы получили Ы^-метилдезоксицитидин (Illa) с выходом более 90%. Таким еэ образом из защищенного по дезоксирибозэ Тимидина (10) Сит синтезированы (с применением аммиака) 5-ые-тзлдезоксицитидин (III6) и Н^.б-диметилдезоксицитидин (Шв) с обидам выходом соответственно 80 и 853.

. Схема I

н^ .V*

\„,__/ 1 РОСЦ. омдр ; \_/ 1 Sil ICO g»l ?

Ota гя'мч, ¿Ja 2.nh, он

Т-^Н 1Г С) R = И | ff= СИ, f <,) R * Н . СН,

* «Г'.сн, . " 'flR.CHj.R'.H Ля = сн,.?;*=я

viRrR'iCH, 'i:<=R'=CH)

2.2.Полу?вЕНэ полеостьэ блоксровгшша и8талзроэанЕЫк Еуплао-тадов, прнтоднпх для зшютческсго синтеза олзгонукявотадов

С целью применения в химическом синтезе олигонуклеотидов основные дезоксшуклеотяды - аденин, гуанозин, тимидян, гдтидин блокируются по аминогруппам гетероциклических оснований, которые способны взаимодействовать с фосфорилирухдапг и другими элект-рофилызыми реагентами, применяемыми в олигонуклеотидном синтезе. Блокирование 5-метилдезоксиши дна в основном не отличается от блокирования дезоксицктидкна. Для этого применяется бензоильная

группа (Behe,1981).

Для выяснения, необходимо ли блокировать вторичную экзоцик-

лическую аминогруппу Ь^-метиддезоксицитидгяа* т провели ряд экспериментов по определению побочных продуктов взаимодействия прозз-еодных дезоксицитидина з й^етилдезоксиштадина с реагентами Фос-фотрлэфирного синтеза. Для этого ш синтезировали 3* ,5' ,Ы*-трибен-зоилдезоксицитидин (А) и метилированные аналоги - 3',5',Н4-тря-бензоэд-И^-мвтиддвзокспцитидиз (Б), З'.б'-дибензоил-^-анжзоил-. -1^-матилдезокскшггидкн:(В), 3* ,5' .-жбеЕзоил-^^тклдезоксицнтщш (Г).

5

oto 061 ¿bt

¿ Ь & г

Каждое из этих соединений ш отдельности обрабатывали 24 часа при 20 С следующими реагентами: п-хлорфбкил5осфэ-(бяс)- триазолк-дом, смесью селективного отщепления fS-цианэтильной защитной группы (EtgN-Py-H^O), детриталируюсдам агентом(5« CClgCOOH в CHgClg) и

конденсирующим агентом (TPSTe) (таб.1).

Таблица I

Стабильность защищенных производных дезоксшогтидинв и Н^-ыеталдезоксицитидина в присутствии реагентов фосфо-триэ$ирного синтеза олигонуклеотидов

С!оединение • п-Хлорфенилфос- EtgN-Py-^O 5$ CCI3COOH . TPSTe фо- (бис )-триазолид (1:3:1) (в C^Clg)

А 0* 0 0 5

Б 0 .0 . 5 0

В 0 0 Следы Следа

Г 0 0 0•. 90

количество продуктов превращения Еыражены в процентах. Ленные ТСХ на силикагеле (в системе СНС1~-ЫеОН,7:1).

Результаты эксперимента, представленные в таблице, наглядно демонстрируют, что блокировать аминогруппу Н^-метилдезоксицитидина, необходимо, так как она энергично .реагирует с конденсирующим реагентом (TPSTe), образуя около 90% побочных продуктов. Результаты исследования также показали, что для блокирования этого гетероциклического основания пригодны как бегооильная, -так и анизоильная защитные группы. С другой стороны, было показано, что защищенный ^-метилдезоксивдтидин слабо взаимодействует, с обычными реагентами фосфотраэфирного синтеза.

При синтезе ^-ашзоил-^-метиддезоксицитидина, мы заметили, что привычный метод (Корана,1963) введения анизоильной защитной группы в этом случае не применим. По этому методу, образовавшийся под воздействием анизоилхлорида 3',Б".{^-трианизошЫГ-метилдезок-

сицитидин должен обрабатываться 2N NaOH в 50% растворе этанола для селективного отщепления 3'- и 5'-анизоильных защитных груш. Как оказалось, в этих условиях отщеплялись и N-защитныэ группы основания. Не увенчалась успехом также попытка расщепления слоа-ноэфирных груш под воздействием более слабых щелочных агентов.

Эта проблема была решена путем блокирования гвдуоксилов де-зоксирибозы триметилсилильными группами. Предложившие методику ученые <Т1.1982) эти защитные группы использовали для блокирования 3'- и 5'-гидроксильных групп, после чего вводили N-защитные группы в гетероциклическое основание. После завершения реакции лабильные силильные группы удаляли аммонолизом за несколько часов. Мы исследовали способ селективного расщепления сложноэфирных групп и вкс-периментально доказали, что оно происходит за 20 минут даже под действием водного пиридина.

С использованием введенных усовершенствований мы синтезировали Н^-анизоил-^-метил-г' -дезоксицитидин-З' -О- (п-хлорфенил, р-цпанэтил) -фосфат (III). Синтез этого соединения включал следующие стадии (схема 2): на ы^-метилдвзоксиштидин воздействовали свекеперегнаишм триметилхлорсиланом (Ke^SlC!), после чего 3'-,5'-силильнсе производное нуклеозида 'обрабатывали анизоилхлоридом (AnCl). ,Сшшльшэ группы удаляли действием водного пиридина. Таким образом полученный N-замещенный дезоксинуклеознд (I) без дополнительной очистки 5'-защищали 4,4*-дт9Токситритилхлоркдон '(ШТгС1) и тритиларован- • ное производное (II) выделяли хроматографией на силпкагвле. Полностью защищенный ыононуклеотид (III), как и нвмэтилированныв мажорные мононуклеотиды. был синтезирован по стандартному методу фосфорилирования (Itakura,1^5), т.е. воздействием п-хлорфэнилфос-фо-(бис)-триазолидом и последующей обработкой р-циаиэтанолом превращая в полностью защищенный нуклеотид.

Схема 2

о

HfJ<5 осн-

1 Mc,SiCI ?Ang

3 OMTrCI

ОМТгО.

10-OfWI, OMTrO-

\ / 2 NCCH,CH,0H

он

H

2 NCCH,CH,0H

cl-фо "dch^hjcn /

t*

DMTiCi < ^4'-Диметдасит(»т«л»иО(мл

Тп*т(ЧОЮЛМД

AflO * оикэсмлхлорид

2.3.. Синтез н4-иетил- и б-штилдатозинсодергагда

олнгокуклеотадов фосфотриэфгфнш иетодоы в раствора

Полностью защищенные мононуклеотиды были использованы в синтезе динукпеотидов, которые в дальнейшем служили исходными блоками для получения более длинных олигонуклеотидов фосфотри-эфирным методом. Синтез гомологичных олигонуклеотидов упростился благодаря неоднократному использованию больших перекрывающихся блоков (в схеме 3 обведены рамкой.).

Схема 3

Б 15519 (ОСШУЁСС8* . Б'роАл^с Щасютса 5'00АШ5С 1ССШ;ТСС|

5'ЩЩ Ш4СС ^тетсз 5'¡теАС] т5сс Ютотсс!

г 1 ' 3 с_1 I 1

5^ёАС| ст!с Ётетсс! 5'ШШ Ст5с ЩТСЗ

"Здесь и далее префикс й (дезокси) опущен.

Для создания мекнуклеотидшх связей в качестве конденсирующего реагента использовали (ТРБТе). Защитные группы после завершения синтеза удаляли действием концентрированного аггшака и 805» уксусной кислоты.

Деблокированные олигонуклеотиды очищали авионообмэнной

хроматографией на БЕАЕ-Тоуореаг1, затем обращенно-фазовой ВЗШ до

гомогенности не менее 99®. Первичную структуру синтезированных

соединений доказывали методом нуклеотидных карт (Лау,1<ЭТ4).Нуклао-

зидый состав каждого из олигонуклеотидов опредеделяли обращенно-

фазовой ВЭЖХ после гидролиза до мононуклеотидов при помощи фосфо-

днэстеразы змеиного яда (УРБЕ) и дефосфорилирования до дезоксн-

нуклеозидов щелочной фосфатазой (рис.2). .....хс

- | О

Рис.1. Нуклеотидная карта олигонуклео-

о тида (Х1Ат4СССШ}ТСС.

& 32рб(5Ат4сссссотсс Направление Е - электрофорез.

© Н - гомохрсматографшь ХС -

® ■ ксиленшанол Р?

к

0,0 25.0 ¿.чин

Рис.2. Определение нуклеозядного состава додекануклэотида 5' (5(3Аш СССОСЙГСС обращенно-фазовой ВЭЖХ на колоше Шс1еоз11С-8, 25 ш К1^Р04 (рН 4,4), в градиенте

концентрации ацетонитрила(0,6-30%). А - Суй, Б - 4тСуй, В - ТМ, Г - Сио, Д - Айо.

2.4. Определашв температура плавления.

Как известно, субстратом рестрикционных эндонуклеаз является, двуспиральная ДНК (или дуплекс в случае олигонуклеотадов), поэтому, перед проведением знзиматическтк реакций было необходимо убедиться, что в условиях реакций исследуемые олзгонуклеотиды присутствуют в форте дуплекса. В случае субстратов, содержащих 5-метилштозия, известно (Еегпр,1976) что температура их плавления -сдвинута -в сторону более высоких температур. Обсувдавтся и причина такого поведения, а именно - повышенное ;стэкинг* взаимодействие . оснований,которое в свою очередь коррелирует с увеличением полярности молекул (Ботегз,1987).

Относительно субстратов, содержащих ы^-шталцктозин, литературных данных о влиянии этого метилированного основания на стзбняь-ность олигонуклеотадвых дуплексов не было обнаружено,, Таким образом, определение температуры плавления метилированы, олагощпслеотя-дов было необходимо перед проведением зизнмологических исследовашзй.

Н4~метильная груша цитозипа по свои,! ствреозсеотческпн признакам имеет большое сходство с ^-штильной группой адепкна, таге . как обе они замещает один из двух атомов водорода в экзощжшчес-кой аминогруппе, участвующих в образовании $а1;зоп-Сг1с1: пара комплементарных оснований (Еп£е1,1978).

Как известно из литературы (Епйе1,1978), гначешю Ти олигонуклеотадов, содеряащгх Н^-метиладенкн, наьгаого нга» Тт нештшшро-ванных дуплексов, кривые тлеют и меньшую кооперативность перехода. Метальная груша в т6А предпочитает с^-полокение по отношению к N1. Это препятствует образованию комплементарной пары (которая

требует ггапз-конформащш) с тимином, и следовательно, дает понижение скорости образования А-Т пары.

С1з-положение И-метильной группы по отношению к N3 наблюдается и у ю4С (Рагакег1еу,1987>. Отсутствие имидазольного кольца, если сравнивать с ш6А, облегчает вращение вокруг N4-04 оси и исключает сферическое затруднение в Н-метил-ОТ области. Таким образом мохно Окидать, что т4С будет спариваться с С легче по сравнению с ш^А. Однако, пониженные статистические возможности т4С принять требуемую tгan8-кoнфopмaцию по сравнению с С для образования двойной спирали (81шр,19Т?.) будут сдвигать равновесие спираль - дуплекс в сторону одаонитевой спирали.

Все это лишь теоретические обсуждения, однако, они указывают аа возможное значительное понижение температуры плавления дуплексов, содержащих И4-метилцитозин. Для проверки этих рассуждений была проведено сравнительное исследование температуры плавления оли-годезоксинуклеотадов-дуплексов, содержащих разные типы метилирования цитозина: «ЗАСССОМТСС, С0Ат5СССС(}0ТСС и ССАп^СССССЮТСС.

Температура плавления(Тт) дуплексов устанавливалась методом УФ спектроскопия и соответственно выше указанному порядку равна 60, 64,6, 55,5° С. Кривые плавления исследованных додекадезоксинук-леогадов представлены на рис.3 .

Полученные результаты позволяют делать вывод, что данные эксдар&ента полностью согласуются с выше изложенным теоретическим обсуждением, т.е. 1Г*-метилцитозин снижает Тш олигонуклеотидов, дестабилизируя двойную спираль. После завершения наших экспериментов аналогичные данные были опубликованы и другими авторами (Раг&КеПеу, 1987; Оно, 1987}.

Как видно, исследуемые додекануклеотиды икают относительно ■ высокие значения Как будет показано далее, реакции расщепления растрикционшдш, ендонуклеазами Пар I, Нра II и Бта I мы проводили при 4°С, поэтому ыолшо утверждать, что в этих, условиях все олиго-ауклеотады присутствуют в форме дуплексов. Для эвдонуклеаз сгг9 I и йгд. I температура проведения реакции равнялась 37°С. ш не проводили специального расчета, какая доля двуспиральных субстратов при мой температуре находится в односпиральном состоянии, однако, из представленных, кривых плавления «окно предпологать, что более чем 90% олигонуклеотидов находятся в форме дуплекса.

Рис.3. Кривые плавления додекануклеогидных дуплексов

iTggaCCCGGGTCC; 2 )GGAm 43CCGGGTCC; 3)GGAnpGCCGGGTCC. Раствор олигонуклеотидов-дуплексов 0,23-0,25 мМ в 0,1 М Nací, 0,2 да EDIA, температурный градиент 0,7 град/мин, кювета 0,1 см.

3. Чувствительность рестрикционных эндонуклеа^ Цвр I, Нра II, Sma I, Хгаа I, Cír9 I к »4-ивтил- и Б-иетилдатозину в различных положениях узнаваемой последовательности

3.1.Расцепление наиетилированных субстратов

Результаты расщепления неметилированных самокомплементарных дуплексов олигонуклеотндов показали, что все исследованы эндонук-леазы рестрикции образовывали оамдаемые' продукты расщепления. Эндо-нуклеазы Cír9 I и Xma I образовывали меченый тетрануклеотид (pGGAC), asp I и Нра II - пентануклеотид (pGGACC), Sma I - гекса-нуклеотид (pSGACCC) (рис.4).'

© ®

© ©

о

ж з

Рис.4. Анализ'продуктов расщепления додекадезоксинуклеотида ССАСССй(КЛ!СС рестрикционныш эндонуклеазами методом гомохроматографиа параллельно с УРЬЕ-гидролизатом того ве субстрата

.(а)-исходный субстрат; (б)-УРБЕ гидролизат субстрата; Св^-Эта I; (гЛЬзр I; Ш-Нра II; («)-Хюа I; (з.)~СГг9 I. ХС-ксиленцианол РЕ В дальнейшем, с использованием того же'неметилированного

И-

субстрата GGACCCGGGTCC, проводили оптимизацию условий гидролиза для кавдого отдельного ферментного препарата с целью подобрать условия, в которых достигалось максимальное расщепление субстрата за самое короткое время(таб.3).

Таблица 3

Экспериментально установленные оптимальные условия реакции синтетического субстрата GGACCCGGGTCC с эндонуклеазаш рестрикция Map I. Нра II, Sma I, Xma I и Cir9 I

рестрикционная Температура Время Соотношение фермента и субстрата эвдонуклеаза (С) (ч) (ед.акт./пыоль)

Map I 4 22 1

Нра II 4 22 2

Sma I 4 5 0,5

Sma I 37 . 18 . 3

СГГ9 t • 37 20 3

3.2. Расщэпдошш noxsoctbs шишфовашаа субстратов

■ Каздыа из двуспнральных йэтшшрованых субстратов (инещих одинаковые метилирование цепи Обрабатывала ферментом в условиях, оптимальных, для неметилированного субстрата. Полученные результаты прэдставлены в табл.4.

Таблица 4

Взаимодействие рестршсционных эндонуклеаз с веыетилцровавнаы е метилированными субстратами

Рестрикционная зндонуклеаза

Субстрат***' Мер I Нра II . Sma I Xma I СГг9 I

& ....3*

0 С С G G G 94* 97' 92 . 91 61

Ю5С С С 0 G G 96 92 5 I 5

0 ю5С С 0 G G [ 0 ]" 53 70 . 30 8

С С т5С 0 G G 50 [ 0 ] 0 23 46

т4С С 0 а G 0 89 80 0 0 0

С т4С С о G а 31 0 [ 0 ] ( 0 ] [ 0 1

С 0 ш^С G G G 16 • 0 0 0 0

* Степень расщепления выражали в процентах, (в целях упрощения

12

проценты приведенш в целых числах).

"'Квадратными скобками выделены сайты канонического метили. рования соответствующих эндонуклеаз рестрикции.

***Цепи двуспирального субстрата одинаковы.

Как видно из таблицы 4, метилированный сайт m5CCCGGG был плохим субстратом для рестрикционных эндонуклеаз Sma' I, Xma I и Cír9 I,- так как расщеплялся на 5, I и Ъ% соответственно. Значительно лучше эти три рестрикционные эндонуклеазы, гидролизиро-вали Cm5CCGGG сайт, т.е. на 70, 30 и 8%. Введение 5-метидцитозина в крайнее 3'положение сайта придало ему устойчивости к действию ñ.Sma I. Оставшиеся две эндонуклеазы - Xma I и СГг9 I - расщепляли этот сайт на 23 и 46% соответственно. Ни одна из трех рестрикционных эндонуклеаз не расщепляла сайты, содержащие И4-метилцитозин.

Наличие как т4С, так и ш5С в крайнем 5' положении CCCGGG последовательности не препятствовали расщеплению сайта эндонук-леазам Мер I и Нра II. Этого и следовало ожидать, так как эти основания находятся за пределами узнаваемых участков.' Эти же ферменты не взаимодействовали с субстратами, имеющими каноническую метальную метку - m5CCGG (Msp I) и Cm5CGG (Нра II). Введение m5C . в полокение, соседнее каноническому (Cm^CGG), затрудняло расщепление рестрикционной эндснуклеазой Нар I (50%). То ке замечалось и з случае Нра II при гидролизе сайта nrCCGG (53%). R. Нра II не расцепляла нй одного casга, содержащего т4С.

Однако, по некоторым аспектам взаимодействия эндонуклеаза üspj отличалась от других исследованных эндонуклеаз. Так, она хотя и менее активно, йо расщепляла субстраты, содеркащие Н^метилцитозин - m^CCGG и Cm4CGG, (на 31 и 16% соответственно). Таким образом, R.Msp I оказалась единственной среди исследованных, которая расщепляла субстраты, содержащие т4С. Такое исключительное поведение . Я.lisp I может означать, что в отличие от большинства ДНК-узнавдих белков, основные детерминанты взаимодействия с этим ферментом расположены не в большом, а в малом желобе В-ДНК.

3.3 Расщаплеше полунетнлированЕзл субстратов

Полностью метилированные олигодуплексы, которые слабо или совсем не расщеплялись какой-либо из эндонуклеаз рестрикции, до-' полштельно исследовали готовя из них полумет&лированныэ субстраты. Полуметилированные дуплексы готовили гибридизацией метилированного и неметилированного олигонуклеотидов. Результаты настоящего исследования представлены в'табл.5.

Таблица 5

Взаимодействие рестрикционных эвдонуклеаз с полуметилированными субстратвми

рестрикционные"эндонуклеазы Субстрат Мер I Нра II. Бта I Хта I СГг9 I

5' ш5С С С С в в . (+++) (+++) + - -

3* в в б С С С (+++) (+++) ++ - -

5* С ш5С С С в С- ++ +++ ++ +

3* в с с с' С С С -] ++ +++ ++ ++

5' С С ш5С 0 в в (+++) С—3 — +++ ++

3' с с с с с С (+++) [—1 - ++ ++

5* т4С С С в С б <+++) <+++> - — •-

3' 0 С й С С С (+++) - -

5* С т4С С С С в <++) + [ -) [—] ' .{—}

3' в С С С С С ++ 1 +] [ +] 1 -1

5' С С т4С в в в +++ _ - — -

3' в б в С С С ++ ++ . • - - -

Результаты расщепления канонических полуметилированных сойтоц выделены квадратными скобками. Для наглядности выраженное в процентах расщепление каздой цепи обозначено схематически: {+++)- более чем на 50%; (++) - 20-50%; (+) - 5-20$; (-) - 1-5%; (—) -отсутствие расщепления. Данные в скобках взяты из таблицы 4.

Как видно, цепи гетеродуплексов расщеплялись с разной эффективностью. Обычно метилированная цепь расщеплялась хугэ -т5ССС(Хл;:ССС0СС - эндонуклеазой Бта I; Ст5СС«}0:СССЩ} - СГг9 I; Ст4ССШ}:СССШ) - Нра II ; ССа4СШ}:СССШ; - Нра II, или совсем нэ расщеплялась - ССт5СШЗ:СССШ} - Бта '1;. В некоторых случаях обе цепи гидролизовались с одинаковой эффективность!): т5ССС(ХК;:ССС(ХХ; - Хша I, С1г9 I; Сп^ШКХиссссКЮ - Нра II, Бта I, Хта I; ССга5СШ}:СССШ5 - СГг9 I; т4СССШ5:ССС(ХХ} и ССш4С(ХХ;:ССС(}(}0 - Бюа1,

Хта , СГг9 I. Единственный субстрат - ССт5С(3(Х}:СССС(К; - эндо-нуклеаза Хта I расщепляла преимущественно по метилированной цепи. Подобным свойством в отношении метилированных цепей отличалась и

рестрикционная эцдонуклеаза Мвр I.

Как и ожидалось, СГг9 I, Бша I, Хта I и Нра II на расщепляли модифицированной цепи полуметилированных дуплексов, имеющих каноническую метальную метку (Ст4СССС0:СССССС) и соответственно (Ст5<ХХ5:СС<Х})

И.Мер I более эффективно расщепляла метилированную цепь канонически метилированного гетеродуплекса и5СССС:ССССло же самое было отмечено и в случае гетеродуплекса Ст4ССС:СШ}. Такой способ взаимодействия с модифицированными сайтами также наблюдался у ряда эн-донуклеаз рестрикции, узнающих иестизвенные последовательности Вв1 II МГ1 I (0по,1987). Наиболее просто это можно объяснить тем, что И.йвр I при связывании с неметилированнсй цепью расщепляет мвтида-рованнув дапь. Но однозначно твердить этого не решаемся, так как не были проведены дополнительные исследования по изучению параметров связывания формента с каждой цепью полуметилированого субстрата. -

Обобщая результаты сравнения взваимодействия га ферментов с субстратами, содержащими п4С или ш5С, можно сказать, что а4С, как правило, блокирует действие большинства исследованных эндонуклеаз (Нра II, Бта I, Хта I, СГг9 I). Ингибируюший эффект т5С варакеа значительно слабее.

Полученные результаты указывают на то, что ферменты строго даМярекшофуют оба положения и проявляют различную чувствительность к соответствувдим основаниям. Объяснение этому могло искать» анализируя расположение этих метальных груш в двойной спирали ДНК. По этому признаку метилирование И^-положония существенно отличается от такого по С5. Так, хотя оба метальные группы находятся в болыаом хелобе В-ДНК, ^-метальная груша находится в центральной, т.е. наиболее выступающей части желоба, а С5 - в боковой. В дополнение, метилирование цитозина по Ы^-положению создает не только стерическиа затруднения при взаимодействии с ферментами, что возможно имеет место и в случае С5-метилирования, но такга блокирует Ш^-грушу - важный контакт опознования пар!, находящийся в большом желобе ДНК. Вероятно, эти различия в основном и обуславливают более сильный ипгабируиций эффект гг^-мвтидцатозвна в отношении действия ферментов.

Эффективность рбсгзепяашя некаковичесвя матаыровгшшх субстратов. Получение нами результаты показали, что некото-рае эндонуклеазы рестрщада менее активно расщепляют неканонически метилированные субстраты. Уровень пнгибирования, однако, для каждой эндонуклеазы существенно варьирует (см.табл. 4), и зависит от

природа метилированного основания и его половения в сайте. Этот факт не сыл отражен в таблица! чувствительности McClelland, где любой метилированный сайт относили к расщепляемым или нет, т.е. таблица была организована по "плюс - минус" принципу. Хотя для большинства рестрикционных эндонуклеаз кинетические параметры взаимодействия с метилированными субстратами не исследованы, однако уже имевшиеся данные указывали на несовершенство организации таблицы. В случае слабо расщепляемых метилированных сайтов стали поступать противоречащие друг другу данные. Все они в итоге включались в таблицу. В результате оказалось неясным, например, расщепляет или не расщепляет R.Hpa II e5CCGG . R.Sma I - m CCCGGG последовательность. Аналогично, в таблицу были включены.сведения о том, что CCm5CGGG сайт расщепляется R.Xma I в эукариотической ДНК, • но не расщепляется в ДНК H.paralníluenzae (McClelland,1988).

Основываясь на полученных результатах, мы попытались разобраться в этих противоречивых данных. Как'видно из таблицы 4, расщепление обсукдаемых метилированных сайтов эндонуклеазами рестрикции Нра II и Хша I значительно ингибируется и они расщепляются примерно в пять раз менее эффективно по сравнению с неметилированным сайтом. Таким образом одной из причин противоречивых результатов, полученых разными исследователями, могло зависеть от условий проведения реакции: времени ее протекания, концентрации эндо-нуклеазы.

В настоящее время, с поступлением данных об эффективности расщепления метилированных субстратов, они стали включаться в таблицы чувствительности эндонуклеаз рестрикции и получили название "эффекта скорости расщепления" (rate eííect) (McClelland,1988). Первыми ферментам, для которых были определены эти характеристики специфичности являются Msp I, Нра II, Sma I, Xma I и Cír9 I, исследованные в настоящей работе.

Чувстаатеяьность эндонуклеаз рестрикция к поканошмеспоиу иэтакароваша и исследований эукариоетчаской ДНК.

За последнее время появилось много публикаций указывающих на взаимосвязь уровня метилирования генома и отдельных генов с такими биологическими процессами как экспрессия генов, рост., деление и злокачественное перерождение клеток (Razln,1984). По этой причине изучение профилей и уровней метилирования эукариотического генома заинтересовали ■ многих исследователей.

В качестве аналитических инструментов для таких исследований стали использоваться и рестрнкционные эндонуклеазы.Так как метилирование эукариотической ДНК в основном сосредоточено в C:G да-

нуклеотядах (Doerfler.1981), их применение основывается на подборе двух изотизомеров,узнающих сайт, содержащий C:G динуклеотид, но различающихся чувствительностью к его метилированию. Наиболее часто применяются пары эндонуклеаз рестрикции Sna I-Sma I (Youusouf-Г1ап,1981) и Мэр I-Hpa II (Ehrlich,1981). Применение этих пар основывается на том, что первый фермент в каждой паре расщепляет.метилированный CCn5CGGG (Cm CGG) сайт, а второй нет. Расщепление исследуемой ДНК отдельно двумя эндонуклеазаш и последующее сравнение видов электрофоретического разделения фрагментов может выявить метилированные C:G дннуклеотиды в участках, перекрывающихся с сайтами" эндонуклеаз рестрикции.

Проведенное наш исследование четырех эндонуклеаз рестрикция,• входящих в упомянутые пары, в принципе подтвердило правомерность' их применения для изучения метилирования ДНК, однако с целью получения достоверных результатов необходимо применять избытки эндонуклеаз. Особенно это относится к эндонуклеазе Xma I, которая характеризуется низкой эффективностью расщепления Cftn5CGGG сайта.

4.Еувол1

1. Разработан удобный и простой метод синтеза метилированных дезоксицитидЕШоз - Н^-иетилцитидина, 5-металцнтидина и К4,5- , ДЕ»8 талщгшша.

2. Подобрана защитные группы для К^нмтилцитщцша н показано, что таким обрезом полностью блокирован нуклеотзд пригоден для фос-фо три эфирного а фосфоамздитного синтеза олигоде зоксарибснуклэ ота-дов, содергащих это основание. :

3. Синтезирована серия олигонуклеотндов, включающих метилированные и неметашрованные сайты ряда эндонуклеаз рестрикции типа Ш впервые подучены олигодезоксинуклеотдды, содеркащие п4С.

4. Определены температура плавления дуплексов додекануклео-тилоя, содержащих т4С и т50. Показано, что ш5С повышает Ти дуплексов, а а С вызывает значительную дестабилизации двойной спирает. .

5. Исследовано взаимодействие эндонуклеаз рестрикции Мзр I. Нра II, йва I, Sms^i, Cfr9 I с субстратами, содержащими т4С и т С в узнаваемом участке, на основе чего показано, что: а) все эндо-нуклеаза чувствительны к замене С на ш4С или ш5С не только в канонической, но и в другом положении сайта: б) введение т4С в любое положение участка узнавания блокирует действие R. Нра II, Xma I, Sea I, Cfr9 I. R-Изр I, напротив, расщепляет такие субстраты, что позволяет сделать предположение о ее контактах в мшорном желобе В-фсриы ДНК.

6. Выдвинуто предположение, что метилирование цитозина по N^-ому положению не только создает стерические затруднения при взаимодействии с ферментами, но и блокирует важный контакт опознавания C:G пари оснований, находящейся в основном желобе ДНК.

Основное содержание диссертационной работы нзлогено в публикациях:

1. Пятраускене Л.Ю., Климашаускас С.И., Буткус В.В., Янулайтис

А.А. Синтез олигодезоксирибонуклеотвдов, содержащих Н^-метилци-тозин. - Биоорг.химия, 1986, т.12, N 12, с.1597-1602.

2. Butlcus V.?., КИда^аивкав S.J., Petrausklene L.J., Maneliene Z.P., Janulaltls A.A., Mlnchenkova L.E., Schyolklna A.K. Synthesis and physical characterization of DKA frasnents containing N4-methylcytosine and 5-oethylcytoslne. - Nucleic Acids Res., 1987, V.15, N 20, p.8767-8778.

3. Butkus V.V., Petrausklene L.J., Maneliene Z.P.,.Kllma5auskas S.J. LauSys Y.S., Janulaltls A.A. Cleavage oi methylated CCCGGG sequences containing either H^-toethylcytosine and 5-mathylcyto-eine with Мер I, Нра II, Sea I, Sma I, СГг9 I restriction endo-nucleases. - Nucleic Acids Res., 1987, v.15, N 17, p.7091-7102.

4. Butkus V.V., KllmaSauskas S.J., Petrausklene L.J., Maneliene Z.P., Mlnchenkova L.E., Schyolldna A.K. Janulaltls A.A. The effects of N4- and C5-osthylatlon of cytoslne on DKA physical properties and restriction endonuclease action. - In: Metabolism and Enzinsology of Nucleic Acids Including Gens Manipulations, Institute of Molecular Biology, Slovac Academy of Sciences, Bratislava, 1987, p.119-127.

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАС1ЮГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ иЬ. М.В.ЛОМОНОСОВА ПЯТРАУСКЕНЕ ЛОРЕТА ЮОЭО

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ Мер 1, Нро, 11, Зта1, Хма 1 И С (г9 1 С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ОЛИГОДЕЭОКСИРИЮНУКЛЕОТИДАМИ. СОДЕРЖАЩИМИ К4 -МЕТИЛ- И 5-МЕТИ ЛЦИТОЗИН

БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 60x84 1/16. ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ЗАКАЗ 51. УСЛЛЕЧ.ЛЛ.ОО. ОТПЕЧАТАНО РОТАПРИНТОМ ЦИНСТИТУТЕ ИНФОРМАЦИИ ЛИТВЫ.2000, ВИЛЬНЮСДОТОРЮ 27.