CG-узнающие C5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

004616454

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Черепанова Наталья Александровна

Св-узнающие С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы ЗзвГ {БриорШта) и Бшт^За (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2010

-9 ЛЕК 2910

004616454

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна

доктор химических наук Туницкая Вера Леонидовна

доктор химических наук Евстафьева Александра Георгиевна

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «21» декабря 2010 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. <

Автореферат разослан 19 ноября 2010 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Метилирование ДНК у эукариот является важной формой эпигенетической информации. В клетках животных и человека метилирование CG-последовательностей в ДНК осуществляется С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазами (С5-МТазами) Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b. С5-МТазы переносят метильную группу с кофактора Б-аденозил-ь-метионина (AdoMet) на атом углерода С5 остатка цитозина, AdoMet в ходе реакции превращается в З-аденозил-ь-гомоцистеин (AdoHcy). Метилированные CG-участки расположены в ДНК определенным образом, формируя профиль метилирования, который создается de novo С5-МТазами Dnmt3a и Dnmt3b, При этом наличие правильного рисунка метилирования чрезвычайно важно для клетки. Его нарушение наблюдается во многих видах опухолей: большое количество генов может быть инактивировано в раковых клетках за счет гиперметилирования их промоторов. В настоящее время выявлена роль функционирования Dnmt3a при развитии таких онкологических заболеваний как меланома и рак толстого кишечника.

В отличие от необратимых изменений в геноме, характерных для опухолевых клеток, гиперметилирование промоторных областей генов как эпигенетический процесс потенциально обратимо. Поэтому актуальной задачей является подбор ингибиторов С5-МТаз, которые позволили бы воздействовать на метилирование клеточной ДНК. Следует отметить, что данные об ингибировании эукариотических С5-МТаз ограничены и относятся, главным образом, к Dnmtl. Вопрос об ингибировании важнейшей эукариотической С5-МТазы - Dnmt3a - ранее практически не изучался. Кроме того, механизм ее взаимодействия с ДНК до сих пор остается малоизученным.

Объектами исследования в настоящей работе стали каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD) и прокариотическая С5-МТаза SssI (M.SssI), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК CG-последовательность и поэтому является привлекательной моделью для изучения эукариотических С5-МТаз.

Цель работы. Целью работы является исследование ингибирования Dnmt3a мыши и M.SssI из Spiroplasma, а также изучение каталитического механизма этих ферментов .

В работе решались следующие задачи: 1) Исследование ингибирования M.SssI и Dnmt3a-CD с помощью соединений ненуклеозидной природы - димерных бисбензимидазолов, и механизмзависимых ингибиторов - ДНК, содержащих остаток пиримидин-2(1Д)-она. 2) Исследование постадийного взаимодействия M.SssI и Dnmt3a-CD с ДНК, изучение роли регуляторного фактора Dnmt3L в каталитическом механизме Dnmt3a и определение роли некоторых аминокислотных остатков на различных стадиях реакции метилирования, проводимой M.SssI.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучено ингибирование С5-МТаз

димерными бисбензимидазолами (DB(n)) - лигандами, способными связываться с малой

3

бороздкой ДНК. Установлено, что DB(n) ингибируют M.SssI и Dnmt3a-CD in vitro (IC50 577 мкМ), и наибольшим ингибирующим эффектом обладает соединение DB(ll) с 11-звенным метиленовым линкером, соединяющим бисбензимидазольные фрагменты. Показано, что DB(n) ингибируют С5-МТазы за счет защиты субстрата от метилирования. Ингибирующая активность DB(n) коррелирует с прочностью комплексов DB(n) с ДНК. Наличие АТ-кластеров в составе ДНК-субстрата и увеличение времени инкубирования DB(n) с ДНК приводят к увеличению эффективности ингибирования. Показано, что DB(n) способны проникать в клетки E.coli и ингибировать в них активность M.SssI. Эти данные позволяют рекомендовать DB(n) в качестве ингибиторов С5-МТаз in vivo.

Показано, что ДНК-дуплексы, содержащие пиримидин-2(1Н)-он (Р-ДНК), способны образовывать ковалентные интермедиаты с M.SssI и Dnmt3a-CD, являясь тем самым ингибиторами этих ферментов (IC50 0,6-1,5 мкМ). Ковалентные интермедиаты M.SssI и Dnmt3a-CD с Р-ДНК оказались не устойчивыми к нагреванию до 65° в 1%-ном SDS, что подтвердило гипотезу об обратимой инактивации С5-МТаз Р-ДНК. Анализ кинетических данных выявил конкурентный механизм ингибирования важнейшей эукариотической С5-МТазы Dnmt3a ДНК, содержащими пиримидин-2(1Я)-он. Показано, что для образования ковалентного интермедиата Dnmt3a с ДНК необходимы контакты С5-МТазы с группами атомов, экспонированными в малую бороздку ДНК. Полученные данные показывают, что терапевтический эффект разрабатываемого в настоящее время противоопухолевого препарата - зебуларина (1-р-0-рибофуранозил-пиримидин-2(1//)-она) - может быть обусловлен в том числе и его действием на С5-МТазу Dnmt3a, а его низкая токсичность - лабильностью ковалентной связи в образующихся ковалентных интсрмедиатах С5-МТазы с ДНК.

Впервые исследована роль регуляторного фактора Dnmt3L на различных стадиях реакции метилирования, катализируемой Dnmt3a. Обнаружено, что в присутствии Dnmt3L происходит увеличение интенсивности флуоресценции комплекса Dnmt3a-CD с ДНК, содержащей 2-аминопурин в позиции цитозина-мишени, а также увеличение выхода ковалентного интермедиата Dnmt3a с Р-ДНК. Все это позволило предположить, что, во-первых, в каталитическом механизме Dnmt3a присутствует стадия «выпетливания» метилируемого основания из двойной спирали ДНК, и, во-вторых, Dnmt3L при связывании с Dnmt3a-CD способствует переходу каталитической петли фермента в «закрытую» конформацию, оптимальную для «выпетливания» метилируемого цитозина из состава двойной спирали ДНК и катализа.

Найдены аминокислотные остатки в составе M.SssI, участвующие в важнейших стадиях реакции метилирования: выведении метилируемого цитозина из двойной спирали

ДНК и его стабилизации (остатки S145, Q147, Т313 и R232), а также в катализе (El86 и R230). Консервативные остатки сернна из мотива IV (Serl45 в M.SssJ) и аргинина из мотива Vfir (Arg230 в M.SssI) могут быть важны для функционирования других С5-МТаз.

Данные, полученные в настоящей работе, могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов действия ДНК-деметилирующих реагентов (ингибиторов С5-МТаз) в эпигенетической терапии рака. Принимая во внимание значительную структурную гомологию С5-МТаз, результаты, полученные для Dnmt3a и M.Sssl, могут быть полезны для анализа принципов организации, структуры и механизма функционирования других С5-МТаз.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи. Результаты работы представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов», (Москва, 2007 г.), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007 г.), международной конференции «Биокатализ-2007» (Санкт-Петербург, 2007 г.), международной конференции FEBS-CNRS (Оссуа, Франция, 2007 г.), IV-m съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.) и 6-ой международной конференции New England Biolabs DNA Restriction and Modification (Бремен, 2010 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (162 цитируемых работы). Материал проиллюстрирован 25 рисунками и 7 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ингпбнрование CG-узнающих ДНК-метилтрансфераз Sssl и Dnmt3a-CD

Первая часть работы посвящена изучению ингибирования Dnmt3a мыши и M.Sssl. Механизм взаимодействия CG-узнающих С5-МТаз с ДНК (и в особенности, важнейшей эукарнотической С5-МТазы Dnmt3a) не был детально изучен, практически отсутствуют данные, характеризующие отдельные стадии взаимодействия этих С5-МТаз с ДНК. Данные об ингибировании этих ферментов также крайне ограничены. Ввиду значительной гомологии всех С5-МТаз, при выборе потенциальных ингибиторов мы руководствовались данными о каталитическом механизме детально изученной прокариотической С5-МТазы M.Hhal. Механизм метилирования включает в себя ряд стадий (Vilkailis el al„ 2001) основные из которых представлены на рис. 1, а. На первой стадии фермент связывается с ДНК-субстратом и AdoMet, образуя специфический комплекс С5-МТаза-Д1 IK'AdoMct (1). Далее метилируемое основание выводится («выпетливается») из состава двойной спирали ДНК (2). Этот процесс сопровождается движением каталитической петли фермента в сторону малой бороздки ДНК (Klimasauskas et al„ 1994).

образование «выпетливание»

специфического цитоэина-мишени

а комплекса из двойной спирали ДНК

МТаза +ДНК + А(1оМе1 ДНК*МТаза-А{ЮМе1 ^ ДНКр-МТаза-АйоМе1

перенос

образование метильнсй группы высвобождение

ювапентной связи на ДНК продуктов реакции

ДНК'ЧЛТаза-АсЮМе!*— ДН^-МТаза-АйоМе* • «ДНКМДТаза-АаоНсу ~ цДНК + МТаза + АйоНсу 3 4 5

AdoHcy

3 fTJ

Ч-Су» O^N-^S-Cy! 0AN'

njVwXvw Motl»lV(PCQ) >wvXw4. ллмХллл. лллл1лпл.

Рис. 1. а. Схема реакции метилирования ДНК M.Hhal. Обозначения: С5-МТаза - M.Hhal; ДНКГ - ДНК-субстрат с «выпетленным» (flipped-out) цитозином-мишенью; мДНКг -метилированный ДНК-субстрат с «выпетленным» цитозином-мишенью; мДНК — метилированная ДНК (продукт реакции); «и — означают нековалентные и ковалентные связи, соответственно. б. Механизм реакции метилирования цитозина по положению С5 (Chen et. al„ 1993).

Важнейшей стадией каталитического механизма является образование ковалентного

интермедиата C5-MTa3a-flHK-AdoMet в результате нуклеофильной атаки атома углерода

С6 метилируемого остатка цитозина высококонсервативным остатком цистеина из

консервативного мотива JV С5-МТазы (3 и рис. 1, б). Затем следует перенос метильной

группы на ДНК И диссоциация комплекса с образованием продуктов реакции (4 и 5).

Димерные бисбензимндизолы как ингибиторы M.SssI и Dnmt3a-CD Соединения, способные связываться с ДНК, могут нарушать контакты каталитической петли и малой бороздки ДНК, действуя как ингибиторы С5-МТаз. В работе в качестве ингибиторов Dnmt3a и M.SssI были опробованы новые ДНК-лиганды, связывающиеся с малой бороздкой двойной спирали - димерные бисбензимидазолы DB(n), а именно DB(1-5,7,11), различающиеся длиной метиленового линкера между бисбензимидазольными фрагментами. Кроме того, был исследован другой димерный бисбензимидазол bis-HT(NMe) (рис. 2), для которого имелись данные о параметрах взаимодействия с ДНК (Streltsov et al„ 2006).

В работе использовался каталитический домен Dnmt3a (Dnmt3a-CD), который в отсутствие N-концевого домена обладает каталитической активностью, сравнимой с активностью полноразмерного фермента (Gowher et al, 2002). Метилирование ДНК анализировали по защите метилированной ДНК от расщепления эндонуклеазой рестрикции Hin6I (R. Hin6I) (рис.3, а).

______.

о

У4"'

.k^-N,

Q

U

5 ■ -fam-ctgAATAcTAcTTgcgctctcTAAcctgAT Время инкубирования димерных 3 ■ -gacTTATgATgAAcocgagagATTggacTA , , ,

~ бисбензимидазолов с дуплексом А (CCi-

участок выделен, метилируемые остатки цитозина подчеркнуты, АТ-пары показаны крупным шрифтом, FAM (О - 6-

карбокеифлуоресцеин) варьировали от 10 минут до 3-х дней.

Соединения bis-HT(NMe) и DB(1-S,7,11) обладают ингибирующей активностью в микромолярных концентрациях (табл. 1). Увеличение времени инкубирования приводит к увеличению ингибирующей активности димерных бисбензимида-золов (табл. 1). Соединение bis-HT(NMe) формирует с АТ-богатыми ДНК три разных комплекса, тип которых преимущественно зависит от времени инкубации с ДНК (Streltsov et ей. 2006). Комплексы типа I формируются bis-HT(NMe) в открытой линейной форме, комплекс типа И образован внутримолекулярным «сэндвичем», а комплекс III - димером из внутримолекулярных сэндвичей. Лиганд bis-HT(NMe) в составе комплексов с ДНК 1-го, 11-го и Ш-го типов занимает на ДНК 10-11,5-6 и 2-3 нуклеотидных пар, соответственно. При добавлении bis-HT(NMe) к большому избытку ДНК происходит образование комплекса типа III. Этот тип комплекса является метастабильным и медленно превращается в смесь комплексов типа I и II. При трехдневном инкубировании bis-HT(NMe) с ДНК (при концентрациях, использованных в наших экспериментах) после установления термодинамического равновесия в растворе преимущественно образуются комплексы типа I и И. Ингибирующий эффект bis-HT(NMe) (табл. 1) был выше в случае комплексов типа 1 и II (3-е суток инкубации), чем в случае комплексов типа III (10 мин инкубации). Можно предположить, что соединения DB(1-5,7,11) также могут образовывать комплексы типа I и II, которые обладают большей (по сравнению с комплексом типа III) ингибирующей активностью.

db[1). п ■ 1: db{2), и" db(3], п • 3; db(4), п>4; 0в(5), п« 5: db(7), п ■ 7; ОВ(11),п-11

Рис.2. Структура бисбензимидазолов DB(n) и bis-HT(NMe), мономерного бисбензимидазола MB, и Hoechst 33258.

JDB<H>j, мкМО 0.1 O S 2 5 15 30 90 200 О

IfwiUfw^UWWi

30-аввмный слипн^ллеотд

кх

?

f 6С с ~

I"

s <

ï 2С О

~îô 35 53 ао то

РХЩмкМ

Рис. 3. Анализ ипгибирующих свойств DB(ll) при Зх суточном инкубировании лигаидов с ДНК. а. Анализ расщепления флуоресцентномеченного ДНК-дуплекса А эндонуклеазой R.Hinôl после метилирования его Dnmt3a-CD в присутствии 0-200 мкМ DB(ll). СДНк ЗООнМ, CAJoMn25 мкМ, C'm.ssst и™ dnmo^cd 2мкМ. Флуорограмма 20%-ного денатурирующего ПААГ. б. Зависимости относительной степени метилирования ДНК (в %) от концентрации DB(ll). (•) - метилирование дуплекса A Dnmt3a-CD; (о) - метилирование дуплекса A M.Sssl; (■) - метилирование дуплекса Б Dnmt3a-CD. Концентрации те же, что и в случае а.

Таблица 1. Ингибирование метилирования дуплекса A Dnmt3a-CD в присутствии димерных бисбензимидазолов

Соединение ICso, мкМ

Время инкубирования с ДНК

10 мин 3 дня

DB(1) 33,9±9,8 12,5±5,5

DB(2) 35,5±9,2 9,8±1,6

DB(3) 150±40 11,2±3,0

DB(4) -300" 38,0±7,0

DB(5) ~700" 77,8±12,0

DB(7) 53,0±9,5 18,7±4,8

DB(ll) 18,0±5,6 5,0±1,5 4,6±0,6б 49,042,0"

bis-HT(NMe) 13,8±3,1 4,6±1,8

' Получены с помощью экстраполяции экспериментальных данных к 50%-ному ингибированиго.6 Метилирование С5-МТазой 5551." Метилирование дуплекса Б. Значения 1С!0 были рассчитаны на основании З-б экспериментов.

Следует Отметить, что мономерный бисбензимидазол МВ (рис. 2) лишь незначительно ингибирует ОптОа-СО (данные не приведены). Именно димеризация молекул МВ приводит к образованию молекул ВВ(п), обладающих большой ингибирующей активностью. Известно, что молекула бисбензимидазола преимущественно связывается с фрагментом ДНК, содержащим две АТ- или ТА-пары. Для связывания молекулы димерного бисбензимидазола требуются два таких фрагмента. В нуклеотидной последовательности дуплекса А есть несколько кластеров из АТ-пар, расположенных на различных расстояниях друг от друга, которые могут участвовать в связывании молекулы БВ(п). Можно предположить, что наиболее эффективное связывание лиганда с ДНК

происходит тогда, когда расстояние между АТ-кластерами соответствует длине линкера между бисбензимидазольными фрагментами. Действительно, наблюдаемые ингибиторные свойства зависят от длины метиленового линкера, соединяющего два бисбензимидазольных фрагмента (табл. 1). ПВ(п) с самыми короткими фВ(1-3)) и самым длинным фВ(11)) метиленовыми линкерами демонстрируют более низкие значения 1С50. Можно предположить, что в этих случаях имеет место наиболее эффективное связывание лиганда с ДНК. БВ(11) и Ыя-НТ^Мс) имеют очень близкие значения ГС50 (табл.1).

Расстояния между бисбензимидазольными фрагментами в этих молекулах также близки. Вероятно, высокие значения 1С50 можно объяснить неоптимальным для связывания ОВ(4,5) расстоянием между АТ-кластерами в дуплексе А (табл. 1). Чтобы выяснить, зависят ли ингибиторные свойства РВ(п) от присутствия АТ-кластеров в

дуплексом Б (49.0±2.0 мкМ) оказалось на порядок больше такового для DB(ll) в комплексе с дуплексом А (5.0±1.5 мкМ). Поэтому АТ-кластеры в составе ДНК необходимы для эффективного ингибирования метилирования, катализируемого Dnmt3a. Тем не менее, слабое ингибирование возможно для любого нуклеотидного контекста, как это наблюдается с дуплексом Б, когда ингибирующие концентрации все еще находятся в микромолярном диапазоне.

Принцип ингибирующего действия DB(n), Возможно, что молекулы DB(n), адсорбируясь на ДНК, могут напрямую конкурировать с Dnm(3a-CD за места связывания на ДНК. При добавлении DB(ll) к уже преформированному комплексу flHK«Dnmt3a-CD снижения метилирующей активности не наблюдалось (данные не приведены). Это факт подтверждает конкуренцию между молекулами фермента и DB(ll) за связывание в малой бороздке ДНК. Чтобы ответить на вопрос, является ли наблюдаемый ингибирующий эффект DB(n) специфичным по отношению к Dnmt3a-CD, было изучено взаимодействие M.Sssl с дуплексом А в присутствии DB(ll) (табл. 1, рис. 3, б). Из полученных результатов видно, что DB(ll) ингибирует M.Sssl (ГС50 4.6±0.б мкМ) в тех же концентрациях, что и Dnmt3a (IC50 5.0±1.5 мкМ). Можно предположить, что на ингибирующие свойства DB(ii) большее влияние оказывает взаимодействие лиганд-ДНК, чем ДНК-белок.

Известно, что Hoechst 33258, мономерное бисбензимидазольное производное, располагается в малой бороздке двойной спирали d(CGCGAATTCGCG)2 (Teng et al., 1988). Присутствие объемных остатков бенз[а]пирена в малой бороздке ДНК вызывает значительное снижение метилирующей активности С5-МТаз SssI and Hhal из-за нарушения контактов ДНК с каталитической петлей фермента (Subach et al., 2006; Subach et al., 2007). Ввиду схожести конформаций каталитических петель M.Hhal и Dnmt3a-CD (Jia et al, 2007), можно предположить, что наблюдаемый ингибиторный эффект возникает из-за возможного нарушения контактов каталитической петли Dnmt3a с малой бороздкой ДНК в присутствии объемного лиганда. Механизм такого ингибирования можно рассматривать как механизм защиты субстрата от метилирования.

Взаимодействие DB(n) с ДНК-субстратом. Чтобы понять, почему предполагаемые типы комплексов DB(n) с ДНК обладают разными активностями, были

5'-fam-tggacaccacctgcgctctctgacctgac 3' -gacctgtggtggacgcgagagactggactg

Б

ДНК, был использован дуплекс Б, не содержащий АТ-кластеров (рис.3, б и табл. 1). Значение 1Сзо Для ОВ(И) в комплексе с

оценены константы диссоциации (ЛУ этих комплексов на примере ОВ(11). ОВ(п) являются флуорофорами, флуоресценция которых при связывании с ДНК разгорается (Streltsov М о/. 2006). Это позволяет использовать флуоресценцию для оценки К, Исходя из значений интенсивностей флуоресценции ОВ(11) в присутствии различных

концентраций дуплекса В были рассчитаны 5' -СТСААТАСТАСТТСС(ЗСТСТСТААССТСАТ г ' г

3 ' -ОАСТТАТОАТОААСЗСОАСАОАТТСОАСТА значения ^ для КОМПЛекСОВ ОВ(11) С ДНК

типа I (при инкубировании 3 дня) и III (при

инкубировании 10 мин). Комплекс ОВ(11) с ДНК типа 111 характеризуется меньшим

разгоранием флуоресценции и большим значением Кц, чем комплекс типа I (рис. 4). Таким

образом, лиганд в открытой линейной форме (в составе комплекса 1-го типа) обладает

большими ингибирующими свойствами

благодаря большему сродству к ДНК.

Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции (460 нм) ОВ(11) от концентрации ДНК-дуплекса В при временах инкубирования в течение 3 дней {□) и 10 мин (•). Спектры флуоресценции регистрировали в диапазоне 380-630 нм, длина волны возбуждения 350 нм. Свв(п) 50 нМ, Сднк 0-20 мкМ. Рассчитанные значения К& равны 0,47±0,17 и 2,76±0,81 мкМ для комплексов ОВ(11) с ДНК типа 1 и III,

с- и £ Ч й В Ш

г соответственно.

[днк], мкМ

Ингибировиние метилирующей активности Л/..?.«/ в клетках Е.соН. Далее была

исследована способность всех димерных бисбензимидазолов ингибировать М-Бээ! в

клетках Е.соН. Для этого клетки штамма ЕЯ1821 были трансформированы плазмидой

рВШЧв, несущей ген М.Бэз! дикого типа, либо каталитически неактивную мутантную

форму М.вяз! Я230А. Клетки культивировали в

среде, содержащей димерные

бисбензимидазолы. Равные количества

выделенных из клеток плазмид были

подвергнуты расщеплению 11.Нт61 (рис.5).

Рис. 5. Анализ расщепления Я.Нтб! плазмиды рВНИБ, несущей М.йээ! дикого типа (\УТ), либо каталитически неактивную мутантную форму Я230А. Плазмиды выделялись из клеток Е.соН, обработанных 50 мкМ МВ, БВ(п) или bis-HT(NMe).

В отсутствие ДНК-лиганда и при условии, что С5-МТаза в клетках каталитически активна, соответствующая плазмида защищается от расщепления Я.Нт61. Плазмида, несущая ген с заменой 11230А, подвергается расщеплению при обработке Я.Нт61. При ингибировании димерными бисбензимидазолами активности М.Ббэ! ШТ соответствующая плазмида будет также подвергаться расщеплению. Из рис. 5 видно, что присутствие МВ практически не влияет на статус метилирования плазмиды, в то время как присутствие

пигакд, 50 мкм

К.Нтб!

М^!

с. а. а. з. ^

со в т т £ к; сох

^ а о а а о а а А

+ + ++ + + + +

DB(n) и bis-HT(NMe) вызывает значительное расщепление соответствующей плазмидной ДНК, что говорит об их ингибирующей активности в клетках E.coli. Минимум расщепления в ряду DB(n), который соответствует минимальной ингибирующей активности, наблюдается для соединения DB(5). В целом, эти результаты согласуются с результатами, полученными для Dnmt3a-CD при использовании дуплекса А (табл.1). Наибольшую ингибирующую активность DB(1) (практически полное расщепление ДНК), вероятно, можно объяснить большей проникающей способностью через клеточную мембрану за счет минимального линкера, связывающего бисбензимидазольные фрагменты.

Таким образом, было показано, что соединения DB(1-5,7,11) являются ингибиторами Dnmt3a-CD in vitro в низких микромолярных концентрациях. Следует отметить, что использование DB(n) в качестве ингибиторов С5-МТаз in vivo является многообещающим благодаря их способности проникать через клеточные и ядерные мембраны живых клеток и связываться с хроматином (Popov et al., 2008).

Пиримидин-2(1Я)-он-содержащне ДНК-дуплексы как ингибиторы Dnmt3a-CD и

M.SssI

Действие наиболее перспективных, на наш взгляд, механизмзависимых ингибиторов С5-МТаз основано на том, что образующийся ковалентный интермедиат (рис.1, стадия 3) либо не способен к продуктивному распаду, либо его распад сильно замедлен. Остаток пиримидин-2(1//)-она (Р) отличается от остатка цитозина отсутствием

экзоциклической аминогруппы, что способствует замедлению диссоциации образующегося ковалентного интермедиата. Зебуларин (1-P-D-рибофуранозил-пиримидин-2(1Я)-он) - перспективный кандидат для разработки

противоопухолевого препарата среди множества аналогов цитозина-мишени, поскольку показана его частичная избирательность in vivo в отношении опухолевых клеток (Cheng et al, 2004). Потенциально терапевтический эффект зебуларина может быть обусловлен

Таблица 2. Температуры плавления Р-ДНК и константы диссоциации _комплексов Dnml3a-CD и M.SssI с Р-ДНК_

ДНК-дупл екса Обозначения T,„ ±rc Kút HM'

Dnmt3a-CD M.SssI

5'- GAGCCAAGCGCACTCTGA 3 ' - CTCGGTTCGMGTGAGACT CG/GM CG/GMf 67,0 214±20 54±11

5'- GAGCCAAGPGCACTCTGA 3 ' - CTCGGTTCGMGTGAGACT PG/GM PG/GMf 42,5' 57,4 143±16 52±U

5'- GAGCCAAGCGPACTCTGA 3 ' - CTCGGTTCGMGTGAGACT CGP/GM CGP/GMf 56,7 185±20 47±10

S'- GAGCCAAGMGCACTCTGA 3 ' - CTCGGTTCGPGTGAGACT MG/GP ÍMG/GP 56,8 120±14 49±11

"Участок узнавания ОппЛЗа-СО выделен жирным шрифтом, метилируемый цитозин или заменяющий его Р подчеркнут. М - 5-метилцитозин,6 Указана Т™ каждой ступени двуступенчатой кривой плавления. "Константы диссоциации комплексов ОппиЗа-СО и М^бз! с Р-ДНК, содержащих ЯАМ (О, в присутствии А(1оНсу.

pc (mg cgp cg pg fmg cgp GM ^ qp ^gmf ^ gmf gmf gp ^ gmf

4 5 6 7 а 9101.1 12 13 14 15 16 17

ингибирующим действием не только на «поддерживающую» С5-МТазу ОптН, но и на другие эукариотические С5-МТазы. Нас интересовал механизм действия этого соединения на С5-МТазы ОптЙа и Бээ!.

Образование ковалентиых интермедиатов реакции метилирования. Чтобы понять, являются ли Р-ДНК ингибиторами БпггИЗа и М-вээ!, необходимо было выяснить, образует ли ОппиЗа ковалентные интермедиа™ с Р-ДНК, и изучить их свойства. Остаток Р

вводили в состав

3 АйоНсу ♦-»«■-»♦ + +■ + ~

полуметилированного 18-звенного ДНК-дуплекса в позицию цитозина-мишени участка узнавания в верхнюю или нижнюю цепь (Рв/СМ и МЮ/ОР соответственно), а также рядом с участком узнавания (ТОР/СМ) (табл. 2). Были получены кривые УФ-плавления ДНК-дуплексов и определены их температуры плавления (табл. 2). Включение такой модификации в ДНК во всех случаях понижает стабильность двойной спирали примерно на 10°.

При смешивании РАМ-меченных Р-ДНК с ОштиЗа-СЭ и М^э! образовывались конъюгаты, которые затем анализировались в ПААГ, содержавшем 0,1%-ный вББ. Прокариотическая М.НЬа1, для которой стадия образования

CG Р CG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

иятшиммшЁ«............. "ниии

Кокъюгег —>-Dmit3e-CO~flHK:

Harpeaai«« 5 мин при ßS*

(mg

gp ^ GMF GMF GMf GP

1 2 3 ' 4 в' 6 7 lT~9 1ü*~~Ti ITJS uls iFrT

CGP GMF

«wpeaeiwe 5 Mtw при 65е

Рис. 6. Анализ образования конъюгатов M.SssI (а), Dnmt3a-CD (о) и M.Hhal (в) с Р-содержащими ДНК. C'D,m.o.-cd, m.sssi_ MHI.I 2 мкМ, Сднк 200 нМ, CAdoMe, «„Hey 0,1 мМ. Дорожка 1 -ДНК-дуплекс CG/GMf. Дорожки 2-17 содержат Р-ДНК, С5-МТазу, AdoMet или AdoHcy. Смеси инкубировали с 1%-ным SDS 10 мин при комнатной температуре (дорожки 1-9) или при 65° (дорожки 10—17) Флуорограмма 12%-ного денатурирующего ПААГ по Лэммли, содержащего 0,1% ковалентного интермедиата с SDS

ДНК хорошо изучена, была использована в качестве контрольного фермента. Заметные количества FAM-меченного материала, запаздывающего в геле, наблюдаются для всех ферментов только в случае ДНК-субстратов, содержащих остаток Р в позиции цитозина-мишени (рис. б, а-в, дорожки 4-7) в присутствии как AdoMet, так и AdoHcy. При этом ковалентные интермедиаты всех

M.Hhal DnmOa-CO WTM.Sael C141S

С5-МТаз с каноническим ДНК-дуплексом нестабильны и разрушаются при анализе в геле

(рис. 6, а и б, дорожки 2 и 3). Присутствие нековалентных комплексов Dnmt3a-CD, и

M.SssI и M.Hhal с ДНК можно исключить, так как в случае канонического дуплекса

CG/GMf и дуплекса CGP/GMf. содержащего Р рядом с CG-участком, отсутствуют

продукты, запаздывающие в геле (рис. 6, а и б, дорожки 2, 3. 8, 9).

нем » * »< Наиболее вероятным кандидатом на

1 23 4 56789 10 11 Кокъюгат

м тЫт-—DnmOa-cD-днк присоединение к остатку Р является

— - Ч-KOHWorai

Конъюгат » — •""* 11 с:о«1_пНК "

Ы-Hhai—днк инвариантныи остаток цистеина из

мотива IV (рис.1, б). Dnmt3a-CD и M.SssI, как и M.Hhal, инкубированные с N-

Рис. 7. Анализ образования конъюгатов M.Hhal и этилмалеимидом (NEM), селе-

Dnmt3a-CD, M.SssI и ее мутантной формы CI4IS с ,

_„, ктивно модифицирующим остатки

ДНК-дуплексом ÍMG/GP в присутствии NEM - Y г'

реагента, модифицирующего остатки цистеина в цистеина в белках, не образуют

белках. Концентрации реагентов и С5-МТаз те же, что nj^/^r,

, „ , . , конъюгат с дуплексом tMG/ьР

на рис. 5. Дорожки 1, 4 ,7 и 10 - содержат содержат J —

fMG/GP, С5-МТазу и AdoHcy; дорожки 2, 5 и 11 - то (рис. 7, дорожки 2, 5 и 8). При

же самое, но С5-МТазы были инкубированы с 5 мМ - , ^

NEM; дорожки 3, 6 и 9 — NEM был добавлен в Добавлении МЬМ в проЬы уже

реакционную смесь после инкубирования с ДНК. после инкубирования С5-МТаз с Флуорограмма 12%-ного денатурирующего ПААГ по

Лэммли, содержащего 0,1% SDS. ДНК образование конъюгата не

нарушается (рис. 7, дорожки 3 и б). Этот факт еще раз подтверждает то, что образовавшаяся связь фермент-ДНК ковалентная и не разрушается под действием NEM. Это означает также, что для образования конъюгата фермент-ДНК необходимо наличие в молекуле фермента реакционноспособного остатка цистеина. Мутантная форма M.SssI, C141S, благодаря нуклеофильным свойствам остатка серина обладает остаточной каталитической активностью (в 100 раз меньшей чем фермент дикого типа, Ratheii el а!., 2007) и способна образовать ковалентный интермедиат с Р-ДНК (рис. 7, дорожка 10), однако остаток серина не взаимодействует с NEM и блокирования образования конъюгата не происходит (рис. 7, дорожка 11).

Именно высококонсервативный остаток Cys 141 из мотива IV принимает участие в образовании ковалентного интермедиата M.SssI с Р-ДНК. В случае Dnmt3a-CD этим остатком цистеина, скорее всего, является высококонсервативный остаток CysI20 из мотива IV.

Связывание Dnmt3a-CD и M.SssI с Р-содержащими ДНК-дуплексами. Малый выход конъюгатов Dnmt3a-CD с Р-содержащими ДНК по сравнению с аналогичными конъюгатами, образованными M.Hhal (табл. 3) может быть связан с изменением сродства Dnmt3a-CD к модифицированной ДНК по сравнению с канонической. Чтобы это проверить, методом поляризации флуоресценции было изучено связывание FAM-

меченных ДНК-дуплексов, содержащих остаток Р, с Ошт^За-СО в присутствии А(1оНсу (рис. 8). С учетом того, что ранее было выявлено кооперативное взаимодействие ОпгмЗа-СО с 30-звенными модифицированными ДНК (МаЙ^сто а!., 2009) и того, что ШпйЗа способна мультимеризоваться в растворе (КаШа е? о/., 2006), экспериментальные данные были обработаны с помощью уравнения Хилла. В случае М^эв! кривые связывания были обработаны гиперболическим уравнением, описывающим механизм бимолекулярного связывания.

а б

Рис. 8. Кривые связывания флуоресцентно-меченных Р-ДНК с M.SssI (а) или Dnmt3-CD (б) в присутствии AdoHcy.

а. Кривые получены при изучении связывания методом «торможения в геле». [ES]- концентрация комплекса M.SssI*ДЫК-AdoHcy, [S0] - общая концентрация ДНК-дуплекса. Обозначения: (/) -CG/GMf; (2) - PG/GMf; (J) - fMG/GP; (4) - CGP/GMf. Сднк 15 нМ, CM.S!Ii 0-350 нМ, CAdoMitAdo„ey 0,1 мМ.

б. Кривые получены при изучении связывания методом поляризации флуоресценции и обработаны с помощью уравнения Хилла. Р - Поляризация флуоресценции, Р0 и Рт - значения поляризации флуоресценции свободной и полностью связанной FAM-меченной ДНК. Обозначения такие же, как и в случае а. Сднк 10 нМ, Свшмз»-сп 0-800 мкМ, CAj0HCy 0,1 мМ.

Рассчитанные значения К^ для тройных комплексов Dnmt3a-CD и M.SssI с дуплексами CG/GMf, CGP/GMf, и PG/GMf и AdoHcy оказались близки (табл. 2). Таким образом, сродство Dnml3a-CD к Р-содержащим субстратам CGP/GMf, fMG/GP и PG/GMf не ухудшается по сравнению с каноническим субстратом CG/GMf. Это означает, что пониженные выходы конъюгатов Dnmt3a-CD с Р-ДНК по сравнению с выходами аналогичных конъюгатов M.Hhal не обусловлены заменой в ДНК остатков цитозина на Р. Скорее, это является особенностью взаимодействия Dnmt3a с ДНК и коррелирует с малой метилирующей активностью Dnmt3a in vitro (см. ниже).

Влияние Dnmt3L на образование ковалентного иитермедиата реакции метилирования. В природе Dnmt3a работает в составе сложного белкового комплекса с регуляторным фактором Dnmt3L. Показано, что при взаимодействии регуляторного фактора Dnmt3L с Dnmt3a образуются комплексы состава 3L-3a-3a-3L, которые характеризуются повышенной каталитической активностью по сравнению с Dnmt3a (Jia el а/., 2007). Учитывая стимулирующее влияние 0nmt3L на Dnmt3a, необходимо было

изучить влияние Dnmt3L на образование ковалентного интермедиата Dnmt3a-CD с Р-ДНК.

нагревание 5 мнн при 65° AdoHcy + ч-gActoMol ♦ б m

1 2 3 4 5 .

__Коньюгот ]

Dnmtia-CD-AHK j

■ ДНК

Dnm!3a-CD/Dnmt3L » 200 5° ^

Концентрация белка, нМ

Рис, 9. а - Анализ образования конъюгата Dnmí3a-CD/Dnmt3L (ЗООнМ) с ДНК-дуплексом fMG/GP (200 нМ) в присутствии 0,1 мМ AdoMet (дорожки 2, 4) или AdoHcy (дорожки J, 5). Смеси инкубировали с 1%-ным SDS 10 мин при комнатной температуре (дорожки 2-3) или при 65° (дорожки 4-5). Дорожка 1 - ДНК-дуплекс fMG/GP. Флуорограмма 12%-ного денатурирующего ПААГ по Лэммли, содержащего 0,1°/» SDS; б - зависимости выхода конъюгатов Dnmt3a-CD (о) и Dnmt3a-CD/Dnmt3L (•) с ДНК-дуплексом fMG/GP (200нМ) в присутствии 0,1 мМ AdoHcy от концентрации фермента. Концентрации ферментов варьировали от 0 до /ООО нМ для Dnmt3a-CD и от 0 до 300 нМ для Dnmt3a-CD/Dnmt3L.

Комплекс Dnmt3a-CD/Dnmt3L образует с ДНК-дуплексом fMG/GP ковалентные интермедиа™ в присутствии AdoMet или AdoHcy (рис. 9, а, дорожки 2 и 3). Эти конъюгаты распадаются при нагревании до 65° (рис. 9, а, дорожки 4 и 5). как и соответствующие конъюгаты, образующиеся в отсутствие Dnmt3L (рис. 6, б, дорожки 14 и 15). Таким образом, Dnmt3L не увеличивает устойчивость ковалентного интермедиата Dnmt3a-flHK. Однако добавление Dnmt3L более чем в 3 раза увеличивает его выход (рис. 9, б).

Молекулярные аспекты образования ковалентного интермедиата Dnmt3a-CD и M.SssI с Р-ДНК. Было обнаружено, что образовавшиеся конъюгаты Dnmt3a-CD и M.SssI с Р-ДНК не устойчивы в условиях нагревания до 65° в огличие от соответствующих конъюгатов с участием M.Hhal (рис. 6). Таким образом, ковалентная связь в таких конъюгатах является лабильной, а Р-содержащие ДНК-дуплексы не вызывают необратимую инактивацию ферментов. Необходимо отметить, что выходы конъюгатов Dnmt3a-CD с Р-ДНК были значительно меньше, чем в случае прокариотических M.Hhal или M.SssI (табл. 3). Каталитические константы (ксм) реакции метилирования дуплекса CG/GM для M.Hhal, M.SssI и Dnmt3a-CD оказались равны 3,7 мин-1, 2,3 мин"' (Subach et al.., 2006) и 3,0 ч"1, соответственно (О.В. Лукашевич, М.В.Дарий, Е.С. Громова, неопубликованные данные). Таким образом, выходы ковалентных интермедиатов этих С5-МТаз коррелируют с эффективностью метилирования (табл. 3). Принимая во внимание низкий выход конъюгата Dnmt3a-CD с Р-ДНК и малую эффективность метилирования ДНК, можно предположить, что в комплексе Dnmt3a-CD с ДНК каталитический остаток цистеина может быть ориентирован не оптимальным образом для нуклеофильной атаки

цитозина-мишени. Увеличение выхода ковапентного интермедиата в присутствии БпгтЗЬ, и, как следствие, увеличение эффективности метилирования можно объяснить тем, что ОпггНЗЬ, связываясь с Опт 13а, способствует переходу каталитической петли в «закрытую» конформацию, оптимальную для катализа (Ла е? а/., 2007).

Таблица 3. Выходы конъюгатов С5-МТаз с Р-ДНК и ингибирующие свойства Р-ДНК

ДНК-дуплекс" Выход конъюгата С5-МТаз с Р-ДНК, %'' 1С5о, мкМ

M.Hhal M.SssI Dnmt3a-CD

AdoMet AdoHcy AdoMet AdoHcy AdoMet AdoHcy M.SssI Dnmt3a-CD"

CG/GM - - - _ - - ■

PG/GM 32 ±7 30±6 27±5 30±5 3,5 ± 1 7 ± 2 0,75±0,08 1,55 ±0,26

CGP/GM - _ - — - -

MG/GP 35 ±6 36 ± 8 24±4 25±7 10±3 11 ±3 0,67±0,07 0,83 ±0,17

"Обозначения дуплексов как в табл. 2.' Максимальные выходы конъюгатов определены в 12%-ном денатурирующем ПААГ методом Лэммли, содержащем 0,1%-ный SDS, с предварительным добавлением SDS в пробы до концентрации 1%. См ны m.sui • мкМ, Сошгиэ.-со 2 мкМ, Сд1ж 200 нМ. Использованы ДНК-дуплексы, содержащие FAM (f).' Определены для комплекса Dnmt3a-CD/Dnmt3L. - Конъюгатов не наблюдалось.

Иигибироваиие M.SssI и Dnmt3a-CD/Dnmt3L Р-содержащими ДНК-дуплексами. Ингибирующая активность Р-содержащих ДНК обусловлена образованием конъюгатов С5-МТаз с Р-ДНК. Была исследована способность ДНК-дуплексов MG/GP и PG/GM, содержащих остаток Р в позиции цитозина-мишени, ингибировать M.Sssl и Dnmt3a-CD в комплексе с Dnmt3L in vitro. ДНК-дуплексы А или В использовали как аналоги природного ДНК-субстрата С5-МТаз. Были измерены зависимости метилирования ДНК от концентрации ингибиторов MG/GP и PG/GM и определены значения IC50 (табл. 3). ДНК-дуплексы MG/GP и PG/GM действуют как ингибиторы реакции метилирования в

Рис. 10. Зависимости начальной скорости реакции метилирования субстрата В (РЬ, нМ/мин) от его концентрации [S] (150-1500 нМ) при различных концентрациях ингибитора MG/GP: 0 нМ (•), 100 нМ (о), 150 нМ (□) и 200 нМ (■), линеаризованные в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Соппоза-со/оппич. 150 нМ, C[CH^mdoMc, 2 мкМ. При этом ДНК-дуплекс MG/GP ингибирует метилирующую активность Dnmt3a-CD/Dnmt3L эффективнее, чем PG/GM. Это коррелирует с более высокой эффективностью образования конъюгата Dnmt3a-CD с fMG/GP, чем аналогичного конъюгата с PG/GMf (табл. 3), что связано с более предпочтительным для Dnmt3a-CD нуклеотидным контекстом вблизи CG-участка (Lin et al., 2002). В случае M.SssI ингибирующие концентрации для MG/GP и PG/GM оказались сравнимы.

микромолярных концентрациях.

Для определения типа ингибирования были найдены зависимости начальной скорости метилирования от концентрации субстрата при различных концентрациях ингибитора (рис. 10). Полученные данные свидетельствуют о конкурентном механизме ингибирования Dnmt3a-CD/Dnmt3L ДНК-дуплексом MG/GP. Значение константы ингибирования составило 240 ± 30 нМ, что коррелирует с величиной Áj, найденной прямым способом при связывании Р-ДНК с Dnmt3a-CD (табл. 2).

Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что олигонуклеотидные дуплексы MG/GP и PG/GM являются ингибиторами С5-МТазы Dnmt3a-CD in vitro. Полученные параметры ингибирования Dnmt3a-CD Р-ДНК помогают лучше понять молекулярный механизм действия зебуларина на С5-МТазы in vivo. Противоопухолевый эффект зебуларина может быть обусловлен ингибированием в том числе и Dnmt3a, а его низкая токсичность - лабильностью ковалентной связи в образующихся ковалентных интермедиатах С5-МТаз с ДНК.

Исследование постадийного взаимодействия M.SssI и Dnmt3a-CD с ДНК «Выпетлившше» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК. Специфической особенностью катализа, проводимого прокариотической С5-МТазой Hhal является стадия «выпетливания» метилируемого остатка цитозина из состава двойной спирали ДНК (рис.1 о, стадия 2). На основании высокой гомологии между С5-МТазами было предположено, что механизм «выпетливания» является общим для всех С5-МТаз (Roberls et al.. 1998).

5 ■ -ctgaatactacttgcgctctctaacctgat эукариотические С5-МТазы этот механизм, ранее

3 ' -gacttatgatgaacgmgagagattggacta

«выпетливания» цитозина-мишени из двойной спирали при взаимодействии М.5зй1 и Ошп13а-СО с ДНК. Использовали набор полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2-аминопурина (В) в различных положениях по отношению к участку узнавания (отмечены стрелками). Флуоресценция В потушена при нахождении его в двойной спирали из-за стекинг-взаимодействий с окружающими основаниями и сильно разгорается при «выпетливании» этого остатка из состава двойной спирали.

Для комплексов М.Бвз! с В-ДНК интенсивное увеличение флуоресценции достигалось только в случае субстрата вВСС/ССМО, содержащего остаток В в позиции цитозина-мишени (рис.11). Это подтверждает то, что в каталитическом механизме С5-МТазы Зяэ! присутствует стадия «выпетливания» и согласуется с данными, полученными методом химической модификации остатков цитозина ДНК в комплексе с М.5зз1 (Ващогу1е е1 а!., 2008).

ш

Однако вопрос о том, используют ли

не изучался.

Методом флуоресценции был изучен процесс

а

б

CGMGAB

□ Dnmt3A

□ Dnmt3A-Dnmt3L g M.Sssl _

Рис.11, Исследование «выпетливания» основания-мишени в процессе метилирования ДНК С5-МТазами Sssl и Dnmt3a-CD с помощью 2-аминопуринсодержащих ДНК (B-ДНК), а. Спектры флуоресценции тройных комплексов С5-МТаз Sssl, Dnmt3a-CD и Dnmt3a-CD/Dnmt3L с ДНК-дуплексом GBGC/CGMG и AdoMet. Длина волны возбуждения 330 нм. б. Разгорание флуоресценции при 370 нм в комплексах M.Sssl Dnmt3a-CD и Dnmt3a-CD/Dnmt3L с ДНК, содержащими 2-аминопурин в различных положениях, в присутствии AdoMet. Сднк 200 нМ, CAdoMcl 0.1 мМ, CM.s„| 2 MKM, CDnmü,-CD 2 MKM, CD„m.3,i.CM>,imi3L 0.4 MKM.

В случае Dnmt3a-CD не наблюдалось значительной разницы в интенсивности

флуоресценции комплексов с GBGC/CGMG но сравнению с остальными ДНК-дуплексами. Но при добавлении Dnmt3L эта разница появлялась, при этом флуоресценция комплекса DnmtSL/DnmtSa-CD'GBGC/CGMG-AdoMet была в 3 раза больше, чем флуоресценция комплекса Dnmt3a-CD»GBGC/CGMG'AdoMet (рис.11). Таким образом, процесс «выпетливания» С5-МТазой Dnmt3a-CD основания-мишени из состава двойной спирали стимулируется в присутствии регуляторного фактора Dnmt3L. Важной особенностью процесса «выпетливания» цитозина-мишени CG-узнающими С5-МТазами Dnmt3a-CD и M.Sssl является то, что разгорания флуоресценции в присутствии аналога кофактора AdoHcy практически не происходит (данные не приведены) в отличие от прокариотических С5-МТаз, узнающих другую нуклеотидную последовательность (Holz et al., 1998). Можно предположить, что связывание правильного кофактора AdoMet способствует конформационным перестройкам и формированию каталитически компетентного комплекса.

Взаимодействие каталитической петли Опт13а-СО с малой бороздкой ДНК при образовании ковалептного интермедиата. В случае М.НЬа1 «выпетливание» остатка цитозина из состава двойной спирали ДНК сопровождается движением каталитической петли фермента в сторону малой бороздки ДНК ('КИтаншказ еI а/., 1994). Интересным представлялось изучить роль малой бороздки ДНК в каталитическом механизме ОтшЗа-СР, а именно при образовании ковалентного интермедиата реакции. Была изучена возможность образования ковалентного интермедиата в случае, когда малая бороздка

h

Г

ДНК занята лигандом ОВ(И). В присутствии возрастающих концентраций ОВ(11) выход ковалентного интермедиата ОппиЗа-СЭ с дуплексом МЮ/СР уменьшается, а затем соответствующая полоса в геле полностью исчезает (рис. 12). ОВ(11), связываясь с малой бороздкой ДНК, препятствует образованию ковалентного интермедиата реакции метилирования.

Концентрация DB(11), мкМ Конъюгат-1

Dnmt3a-CD—ДНК

1 2 3 4 Рис. 12. Образование конъюгата ОппйЗа-СВ с

О 0,5 5 20 1МС/СР в присутствии возрастающих

концентраций йВ(11) (0-20 мкМ) и 0,1 мМ А<1оНсу. Флуорограмма 12%-ного денатурирующего ПААГ по Лэммли, содержащего 0,1%-ный ЭОЗ.

ДНК-

Наблюдаемый эффект можно объяснить нарушением контактов каталитической петли Dnmt3a-CD с группами атомов CG-участка, экспонированными в малую бороздку ДНК, и возможным нарушением выведения основания-мишени из состава двойной спирали. Таким образом, малая бороздка ДНК важна для образования ковалентного интермедиата Dnmt3a с ДНК в процессе реакции метилирования. Это подтверждает предположение о том, что Dnmt3a и M.Hhal имеют сходный каталитический механизм. Исследование роли ряда аминокислотных остатков M.SssI в ее каталитическом механизме. Нас интересовало, какие аминокислотные остатки M.Sssl участвуют в важнейших стадиях реакции метилирования, а именно в выпетливании метилируемого цитозина из состава двойной спирали и собственно в каталитическом акте, т.е. переносе метильной группы на ДНК. Остатки M.Sssl были выбраны на основании построенной в нашей лаборатории Е.В. Кудан компьютерной модели M.Sssl в комплексе с ДНК и AdoHcy (рис. 13), выравнивании первичных структур M.Sssl и ряда прокариотических и эукариотических С5-МТаз, а также экспериментальных данных по мутационному анализу других С5-МТаз.

Рис. 13. Схема контактов M.Sssl с ДНК согласно компьютерной модели комплекса M.Sssl-flHK*AdoHcy

{Kudan et ai, 2004). Показаны аминокислотные остатки M.Sssl,

9 взаимодействующие с ДНК. Контакты,

В ici Гс1 Образованные основной цепью,

• © © © © ©V©7 fMÊHg) 5' обозначены прерывистыми стрелками:

контакты, образованные боковыми цепями - сплошными стрелками.

"А

В рамках данной работы с использованием плазмидных конструкций, любезно предоставленных А. Кишем (Венгрия) был выделен ряд мутантных форм М^в!, которые были протестированы на способность «выпетливать» основание-мишень из двойной спирали ДНК с помощью 2-аминопуринсодержащих ДНК (рис. 14, я) и образовывать

ковалентный интермедиат реакции метилирования (рис. 14, б). В совокупности с данными, полученными М.В.Дарий по связыванию и метилированию ДНК этими мутантными формами, было сделано предположение об участии тех или иных аминокислотных остатков в процессе выпетливания и катализа.

Рис.14. а. Спектры флуоресценции тройных комплексов мутантных форм M.SssI с ДНК-дуплексом GBGC/CGMG и AdoMet. Спектры регистрировали в диапазоне 350-400 нм, длина волны возбуждения 330 нм. Концентрации как на рис.11, б. Образование ковалентных интермедиатов мутантных форм M.SssI с ДНК-дуплексом PG/GMf в присутствии AdoMet. Концентрации как на рис. 6.

Ser 145. Флуоресценция S145A в комплексе с дуплексом GBGC/CGMG, содержащим остаток 2-аминопурина в позиии метилируемого цитозина, практически не разгоралась (интенсивность флуоресценции была в 7 раз ниже, чем для фермента дикого типа, рис. 14, а). При этом S145A обладает такой же эффективностью связывания ДНК, как и фермент дикого типа, но сниженной в 12 раз ферментативной активностью. Соответствующий остаток серина в комплексах M.Hhal и M.HaelII с ДНК, по данным РСА, образует водородную связь с фосфатной группой, расположенной с 5'-стороны от метилируемого цитозина (Ktímasauskas el al., 1994; Reinisch et al., 1995). Полученные данные свидетельствуют об участии Ser 145 в «выпетливании» и стабилизации цитозина-мишени. Glnl47. В случае мутантного фермента Q147L интенсивность флуоресценции 2-аминопурина была в 20 раз ниже, чем в случае M.SssI дикого типа, (рис. 14, о), а параметры связывания и метилирования ДНК ухудшились примерно в 12 раз. При сравнении данных РСА комплекса M.HhaI\HHK-AdoHcy (Klimasauskas et al., 1994) с моделью комплекса M.SssI^HK-AdoHcy (рис. 14) было обнаружено, что Glnl47 в паре с Ser300 в M.SssI, как и Ser87 в паре с Gln237 в M.Hhal занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина и стабилизируют неспаренный остаток гуанина. Это свидетельствует о необходимости Gin 147 для «выпетливания» цитозина-мишени.

Arg232. Было показано, что при замене Arg232 на Ala разгорание флуоресценции 2-аминопурина было в 11 раз ниже, чем для фермента дикого типа (рис. 14, а), наблюдалось увеличение сродства фермента к ДНК в 3,5 раза, а каталитическая активность снизилась в 45 раз. Участие соответствующего остатка аргинина в «выпетливании» цитозина-мишени и стабилизации его внеспирального положения было продемонстрировано для M.Hhal (iShich et al., 2006). Arg232 в M.SssI образует, по данным компьютерного моделирования, водородные связи с атомом 02 метилируемого цитозина и с фосфатной группой, примыкающей к нему с 5'-стороны (рис. 14). Можно сделать вывод об участии Arg232 в «выпетливании» цитозина-мишени и/или в поддержании его конформации, необходимой для катализа.

Thr313. Этот консервативный остаток в составе M.SssI, согласно модели, взаимодействует с углеводофосфатным остовом (рис. 13). Было показано, что замена Thr313 на Asp приводит к снижению интенсивности флуоресценции 2-аминопурина в 5 раз по сравнению с ферментом дикого типа (рис. 14, а), снижению сродства фермента к ДНК в 10 раз и к потере каталитической активности. Для Т313А, напротив, интенсивность флуоресценции 2-аминопурина была снижена всего в два раза и не наблюдалось снижения эффективности связывания или метилирования ДНК. С использованием флуоресценции 2-аминопурина и мутантных форм M.Hhal с заменами соответствующего остатка треонина на аминокислоты с различным размером боковых цепей было обнаружено, что этот остаток участвует в конформационных перестройках во время «выпетливания» цитозина и поддерживает правильную конформацию остова ДНК и метилируемого цитозина (Vilkaitis et al, 2000). Экспериментальные данные для M.SssI согласуются с данными, полученными для M.Hhal, поэтому можно предположить, что Thr313 в M.SssI выполняет такую же функцию, т.е. поддерживает необходимую конформацию углеводофосфатного остова и метилируемого цитозина во время его «выпетливания» из ДНК.

Катализ переноса метильной группы на ДНК. На рис. 1, 6 показан механизм реакции метилирования, предложенный для С5-МТаз (Chen et. al., 1993). Он включает протонирование положения N3 метилируемого цитозина остатком Glu из мотива ENV, что вызывает активацию положения Сб для нуклеофильной атаки остатка Cys из мотива PCQ и образование ковалентного интермедиата фермента с ДНК.

Cysl41. С помощью мутантной формы M.SssI с заменой инвариантного остатка Cys 141 из мотива IV на серии было показано, что именно этот остаток образует ковалентную связь с цитозином-мишенью (рис. 8). Таким образом, именно Cysl41 необходим для катализа M.SssI.

Glu!86. Консервативный остаток Glul86 из мотива VI предположительно протонирует положение N3 цитозипа (рис. 14). Замена соответствующего остатка глутаминовой кислоты на аланин в M.Hhal приводила к уменьшению каталитической активности в 500 раз и к отсутствию ковалентного интермедиата с ДНК (Shieh el al., 2007). Мутантный фермент Е186А, сохраняя способность связывать ДНК, полностью теряет каталитическую активность. При этом Е186А не потерял способности образовывать ковалентный интермедиат с ДНК, хотя его выход был значительно снижен по сравнению с ферментом дикого типа (рис. 13, б). Это позволило сделать предположение, что в протонировании положения N3 цитозина, необходимом для образования ковалентного интермедиата, может участвовать и другой аминокислотный остаток M.SssI.

Arg230. Основываясь на данных, полученных методом молекулярной динамики активного центра M.Hhal где была показана возможность остатка аргинина протонировать положение N3 метилируемого цитозина через молекулу воды совместно с остатком глутаминовой кислоты из мотива VI (Lau et а!., 1999), было решено исследовать роль соответствующего остатка аргинина (Arg230 в M.SssI). Оказалось, что замена Arg230 на Ala практически не влияет на сродство фермента с ДНК, но при этом полностью уничтожает каталитическую активность. Кроме того, выход ковалентного интермедиата Я230А с ДНК был значительно снижен, как и в случае Е186А (рис. 13, б). Эти данные свидетельствуют об исключительной важности Arg230 для образования ковалентной связи фермента с ДНК и катализа. И если предположить, что этот остаток участвует в протонировании положения N3 цитозина, становится понятным, почему наблюдалось образование ковалентного аддукта мутантного фермента EI 86А с ДНК. Мы предполагаем, что Arg230 непосредственно участвует в катализе.

Заключение:

Исходя из результатов исследований, проведенных в данной работе, можно сделать вывод, что Р-ДНК обладают большей ингибирующей активностью по отношению к Dnmt3a и M.SssI, чем ингибиторы ненуклеотидной природы — димерные бисбензимидазолы, (табл. 1 и 3). Р-ДНК позволили выявить общие черты в механизме действия Dnmt3a и прокариотических С5-МТаз: в процессе метилирования ДНК с помощью остатка цистеина формируется ковалентный интермедиат, и для его образования необходимы реакционноспособный остаток цистеина и контакты С5-МТазы с малой бороздкой ДНК. Особенностями Dnmt3a являются низкий выход конъюгата, его неустойчивость к нагреванию, повышение выхода конъюгата и разгорание флуоресценции в комплексе с В-ДНК при активации регуляторным фактором Dnmt3L, что коррелирует с низкой метилирующей активностью Dnmt3a in vitro.

С помощью мутантных форм M.SssI удалось выявить остатки, участвующие в «выпетливании» метилируемого цитозина (Serl45, Glnl47, Arg232 и Thr313) и катализе (Cysl41, Glul86 и Arg230). На примере M.SssI была продемонстрирована важность консервативных остатков Serl45 (мотив VI) и Arg230 (мотив VIII) для функционирования С5-МТаз. Важным моментом явилось то, что была показана значимость неконсервативного остатка GInl47, роль которого была предсказана по данным компьютерного моделирования.

ВЫВОДЫ

1. Димерные бисбензимидазолы (DB(n)), локализуясь в малой бороздке ДНК, ингибируют каталитический домен Dnmt3a (Dnmt3a-CD) и M.SssI in vitro (IC50 5-77 мкМ). Наибольшим ингибирующим эффектом обладает соединение DB(ll) с 11-звенным метиленовым линкером, соединяющим бисбензимидазольные фрагменты. Наличие АТ-кластеров в составе ДНК-субстрата и увеличение времени инкубирования DB(n) с ДНК приводят к увеличению эффективности ингибирования. DB(n) способны проникать в клетки E.coli и ингибировать активность M.SssI.

2. ДНК-дуплексы, содержащие механизмзависимый ингибитор пиримидин-2(1 Н)-оа в позиции цитозина-мишени (Р-ДНК), способны образовывать ковалентные интермедиаты с M.SssI и Dnmt3a-CD, причем связь в них является лабильной. В присутствии регуляторного фактора Dnmt3L выход ковалентного интермедиата Dnmt3a-CD с ДНК увеличивается. Обнаружено, что для образования этого интермедиата важны контакты Dnmt3a с группами атомов, экспонированными в малую бороздку ДНК.

3. Р-ДНК способны ингибировать M.SssI и Dnmt3a-CD по конкурентному механизму. Высказано предположение о том, что терапевтический эффект зебуларина может быть обусловлен в том числе и ингибированием Dnmt3a.

4. Dnmt3L стимулирует разгорание флуоресценции комплекса Dnmt3a-CD с ДНК, содержащей 2-аминопурин в позиции цитозина-мишени, что свидетельствует о наличии стадии «выпетливания» метилируемого основания из двойной спирали ДНК в каталитическом механизме Dnmt3a.

5. Замены остатков S145, Q147, Т313 и R232 в M.SssI приводят к значительному уменьшению флуоресцентного сигнала комплекса С5-МТазы с ДНК, содержащей 2-аминопурин, что указывает на участие этих остатков в стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина. Замены остатков Е186 и R230 в M.SssI приводят к снижению выхода ковалентного интермедиата С5-МТазы с ДНК, содержащей пиримидин-2(1#)-он, что позволяет сделать предположение об их участии в активации метилируемого цитозина в процессе катализа.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

Статьи:

1. Кирсанова О. В., Черепанова Н. А.. Громова Е. С. Ингибирование С5-цитозин-ДНК-метилтрансфераз. // Биохимия (2009) 74, 1445-1458.

2. Darn М, Cherepanova N.. Subach О., Kirsanova О., Rasko Т., Slaska-Kiss К., Kiss А., Deville-Bonne D., Reboud-Ravaux M., Gromova E. Mutational analysis of the CG recognizing DNA methyltransferase SssI: insight into enzyme-DNA interactions. // Biochim. Biophys. Acta (2009) 1974, 1654-1662.

3. Cherepanova N.A.. Ivanov A.A., Maltseva D.V., Minero A.S., Gromyko A.V., Streltsov S.A., ZhuzeA.L., Gromova E.S. Dimeric bisbenzimidazoles inhibit the DNA methylation catalyzed by the murine Dnmt3a catalytic domain. // J. Enzyme. Inhib. Med. Chem. (2010) doi:l 0.3109/14756366.2010.499098.

4. Черепанова H.A.. Жузе А.Л., Громова E.C. Ингибирование ДНК-метилтрансферазы мыши Dnmt3a ДНК-дуплексами, содержащими пиримидин-2(1/У)-он. // Биохимия (2010) 75,1244-1256.

Тезисы конференций:

1. Черепанова Н.А.. Субач О.М. Механизм действия ДНК-метилтрансфераз MSssl и Dnmt3a-CD: образуются ли конъюгаты с ДНК? // Материалы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов» (2007), т.2, Химия, с.535.

2. E.S.Gromova, M.V.Darii, N.A.Cherepanova. O.M.Subach, O.V.Kirsanova, Tamds Rask6, Krystyna Slaska-Kiss and A.Kiss. CpG DNA methyltransferase M.SssI: a study of catalytic mechanism by use of the enzyme mutants and modified substrates. // International conference Biocatalysis: fundamentals and applications (2007). Russia, Moscow-St.Petersburg, Abstracts, p.38.

3. Черепанова H.A.. Дарий M.B, Кирсанова О.В., Субач О.М., Громова Е.С. 2-пиримидинон как инструмент для изучения механизма действия CpG-узнающих ДНК-метилтрансфераз. // III Российский симпозиум «Белки и пептиды» (2007). Россия, г.Пущино, Сборник тезисов, с.96.

4. E.S.Gromova, M.V.Darii, N.A.Cherepanova. O.M.Subach, O.V.Kirsanova, T.Rasko, K. Slaska-Kiss and A.Kiss. Study of the catalytic mechanism and DNA recognition of the CpG methyltransferase M.SssI by site-directed mutagenesis and with modified substrates. II FEBS-CNRS Workshop. DNA and RNA MODYFICATION ENZYMES (2007). Aussois, France. Abstracts, p. 16.

5. Дарий M. В., Черепанова H. А.. Субач О. М., Кирсанова О. В., Раско Т., Сласка-Киш К., Киш А., Громова Е. С. Мутационный анализ и механизм-зависимое ингибирование CpG-узнающей ДНК метилтрансферазы M.SssI как инструмент изучения ДНК-белковых взаимодействий. // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (2008). Россия, г. Новосибирск. Сборник тезисов, с.75.

6. E.S.Gromova, N.A. Cherepanova. A.S. Minero, A.L. Zhuze, A.Kolbanovskiy, N.E.Geacintov. Murine DNA methyltransferase Dnmt3a: inhibition and probing of enzymeDNA interaction by fluorescence. // 6th New England Biolabs Meeting on DNA Restriction and Modification (2010), Bremen, Germany. Abstracts, p.16.

Подписано в печать: 16.11.10 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769739 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Ингибирование С5-цитозин-ДНК-метилтрансфераз (Обзор литературы).

1.1. Классификация ингибиторов С5-МТаз.

1.2. Нуклеозидные аналоги 2'-дезоксицитидина-мишени (механизмзависимые ингибиторы).

1.2.1. Необратимые ингибиторы.

1.2.2. Обратимые ингибиторы.

1.3. Применение механизмзависимых ингибиторов в эпигенетической противоопухолевой терапии.

1.4. Использование механизмзависимых ингибиторов для изучения структуры и механизма действия С5-МТаз.

1.4.1. Рентгеноструктурный анализ (РСА).

1.4.2. Взаимодействие с мутантными формами С5-МТаз.

1.5. Ненуклеозидные ингибиторы.

Глава 2. СС-узнающие С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы Бвэ! (вркор^та) и Опт (За (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма (Обсуждение результатов).

2.1.Данные о ферментах.

2.2. Выделение ферментов.

2.3. Используемые олигонуклеотиды.

2.4. Ингибирование Св-узнающих ДНК-метилтрансферазЗБз! и ОппИЗа-СО.

2.4.1 Димерные бисбензимидизолы как ингибиторы М^э! и ОпгМЗа-СО.

2.4.1.1. Действие димерных бисбензимидизолов на каталитическую активность М^в! и ОштиЗа-СБ.

2.4.1.2. Принцип ингибирующего действия БВ(п).

2.4.1.3. Взаимодействие ОВ(п) с ДНК-субстратом.

2.4.1.4. Взаимодействие БВ(п) с Опп^За-СО.

2.4.1.5. Ингибирование метилирующей активности М^ээ! в клетках Е.соН. 50 2.4.2 Пиримидин-2(1Д)-он-содержащие ДНК-дуплексы как ингибиторы ОпгпгЗа-СБ и М^!.:.

2.4.2.1. Образование ковалентных интермедиатов реакции метилирования.

2.4.2.2. Связывание 1ЭптгЗа-СО и М.85я1 с Р-содержащими ДНК-дуплексами.

2.4.2.3. Влияние ОтМЗЬ на образование ковалентного интермедиата реакции метилирования.

2.4.2.4. Молекулярные аспекты образования ковалентного интермедиата ОптгЗа-СЭ и М^ээ! с Р-ДНК.

2.4.2.5. Ингибирование М.йээ! и ОштиЗа-СО/ОшШЬ Р-содержащими ДНК-дуплексами.

2.5. Исследование постадийного взаимодействия М^э! и БппиЗа-СО с ДНК.

2.5.1 «Выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.

2.5.2. Взаимодействие каталитической петли ОпгтЗа-СО с малой бороздкой ДНК при образовании ковалентного интермедиата.

2.5.3. Исследование роли ряда аминокислотных остатков в М.ЗБв! на различных стадиях реакции метилирования.

2.5.3.1 Выбор аминокислотных остатков.

2.5.3.2. Аминокислотные остатки, участвующие в «выпетливании» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.

2.5.3.3. Аминокислотные остатки, участвующие в катализе переноса метильной группы на ДНК.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы и материалы.

3.2. Приборы и методы.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Формирование ДНК-дуплексов.

3.3.2. Плавление ДНК-дуплексов.

3.3.3. Приготовление компетентных клеток.

3.3.4.Выделение плазмид.

3.3.5. Выделение БппПЗа-СО и ЭптЛ.

3.3.6. Выделение М^б! и ее мутантных форм.

3.3.7. Определение Ка комплексов ОптгЗа-СО с ДНК и AdoHcy с помощью метода поляризации флуоресценции.

3.3.8. Определение комплексов М^ээ! с ДНК и AdoHcy с помощью метода «торможения» в геле.

3.3.9. Образование ковалентных интермедиатов С5-МТаз с Р-ДНК.

3.3.10. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по защите метилированной ДНК от рестрикции.

3.3.11. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по включению тритиевой метки.

3.3.12. Исследование «выпетливания» методом флуоресценции.

3.3.13. Определение Ка комплексов ОВ(11) с ДНК методом флуоресценции.

3.3.14. Ингибирование активности бисбензимидазолами в клетках Е.соИ.

4. Выводы.

5. Литература.

Список сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин ДТТ- 1,4-дитиотреитол

ИПТГ — изопропил-р-О-тиогалактопиранозид МТаза - ДНК-метилтрансфераза o.e. - оптическая единица ПААГ - полиакриламидный гель

С5-МТаза - ДНК-метилтрансфераза, метилирующая атом углерода С5 остатка цитозина

Синефунгин — iS-аденозил-ь-орнитин Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан Тпл - температура плавления ХС - ксиленцианол

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия РСА - рентгеноструктурный анализ ЯМР - ядерно-магнитный резонанс AdoMet - £-аденозил-ь-метионин AdoHcy - 5-аденозил-ь-гомоцистеин AzaC - 5-азацитозин В - 2-аминопурин

В-ДНК - ДНК. содержащая 2-аминопурин

ВРВ - бромфеноловый синий

DB(n) - димерный бисбензимидазол

Dnmt3a-CD - каталитический домен Dnmt3a d4HCyd— 1-р-2'-дезокси-0-рибофуранозил-пиримидин-2(1//)-он

DZdCyd — 5,6-дигидро-5-аза-2'-дезоксицитидин

ЕОСв — (-)-эпигаллокатехин-З-галлат

Рс1Сус1 — 5-фтор-2'-дезоксицитидин

РС - 5-фторцитозин,

РАМ - б(5)-карбоксифлуоресцеин т5С - 5-метилцитозин т5(1С (М) - 5-метил-2'-дезоксицитидин

КЕМ — К-этилмалеимид

Р- пиримидин-2(1//)-он

Р-ДНК-ДНК, содержащая пиримидин-2(1//)-он

Р- поляризация флуоресценции

4'-8<ЗСус1 — 4'-тио-2'-дезоксицитидин вББ - додецилсульфат натрия гс1Сус1 — 5-аза-2'-дезоксицитидин гСус! — 5-азацшидин кца{ - каталитическая константа

Ка - константа диссоциации

Кт - константа Михаэлиса

У0 - начальная скорость реакции метилирования

Ртах - максимальная скорость реакции метилирования

WT - фермент дикого типа

Для обозначения нуклеотидных звеньев, олигонуклеотидов использовали символы, рекомендованные комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и Международного союза биохимиков (ШВ).

Метилирование ДНК у эукариот является важной формой эпигенетической информации [1]. От статуса метилирования ДНК в клетках млекопитающих зависят, в частности, их нормальное развитие, регуляция экспрессии генов, геномный импринтинг, поддержание структуры хроматина. В клетках животных и человека метилирование CG-последовательностей в ДНК осуществляется С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазами (С5-МТазами) Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b [2]. С5-МТазы катализируют перенос метальной группы от кофактора, З-аденозил-ь-метионина (AdoMet), к аюму углерода С5 остатка цитозина. AdoMet при этом превращается в З-аденозил-ь-гомоцистепн (AdoHcy). Метилированные CG-участки расположены в ДНК определенным образом, формируя профиль метилирования, который создается de novo С5-МТазами Dnmt3a и Dnmt3b в процессе эмбриогенеза и копируется после каждого раунда репликации [1].

При некоторых заболеваниях, в частности при наличии опухолей, наблюдается изменение профиля метилирования. Тотальное гипометилирование повторяющихся фрагментов ДНК в опухолевых клетках вызывает нестабильность генома [3]. Наряду с этим в первичных опухолях и в опухолевых клеточных линиях происходит гиперметилирование за счет метилирования CG-островков в промоторных областях определенных генов, в том числе генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к их инактивации в процессе канцерогенеза [4-8]. В настоящее время не вызывает сомнений, что С5-МТаза Dnmt3a играет важную роль в различных типах клеток. Выявлена роль функционирования Dnmt3a при развитии таких онкологических заболеваний, как меланома и рак толстого кишечника [9, 10].

В отличие от необратимых изменений в геноме, характерных для опухолевых клеток, гиперметилирование промоторных областей генов как эпигенетический процесс потенциально обратимо. Это делает метилирование ДНК привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. Деметилирование генов-супрессоров опухолей с их последующей реактивацией представляется разумным подходом к лечению злокачественных опухолей. Можно изменять статус метилирования ДНК в клетке путем воздействия на функционирование С5-МТаз с помощью ингибиторов этих ферментов.

Следует отметить, что данные об ингибировании эукариотических С5-МТаз ограничены и относятся, главным образом, к ОппШ. Вопрос об ингибировании важнейшей эукариотической С5-МТазы- ПппиЗа- ранее практически не изучался. Кроме того, механизм ее взаимодействия с ДНК до сих пор остается малоизученным.

Объектами исследования в настоящей работе стали каталитический домен ОппйЗа мыши (Отт^За-СБ) и прокариотическая МТаза Ббб! (М.8б51), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую СС-последовательность и поэтому является привлекательной моделью для изучения эукариотических С5-МТаз.

Целью работы было исследование ингибирования Эпп^За мыши и М.БэзТ из 8р1гор1азта, а также изучение каталитического механизма этих ферментов .

В работе решались следующие задачи: 1) Исследование ингибирования М.ЗзэГ и ОппиЗа-СО с помощью соединений ненуклеозидной природы - димерных бисбензимидазолов, и механизмзависимых ингибиторов - ДНК, содержащих остаток пиримидин-2(1//)-она. 2) Исследование постадийного взаимодействия М^в! и ОштЦЗа-СЭ с ДНК, изучение роли регуляторного фактора ОптОЬ в каталитическом механизме Опт13а и определение роли некоторых аминокислотных остатков на различных стадиях реакции метилирования, проводимой М^Бв!.

4. ВЫВОДЫ

1. Димерные бисбензимидазолы (DB(n)), локализуясь в малой бороздке ДНК, ингибируют каталитический домен Dnmt3a (Dnmt3a-CD) и M.SssI in vitro (IC50 5-77 мкМ). Наибольшим ингибирующим эффектом обладает соединение DB(ll) с 11-звенным метиленовым линкером, соединяющим бисбензимидазольные фрагменты. Наличие АТ-кластеров в составе ДНК-субстрата и увеличение времени инкубирования DB(n) с ДНК приводят к увеличению эффективности ингибирования. DB(n) способны проникать в клетки E.coli и ингибировать активность M.SssI.

2. ДНК-дуплексы, содержащие механизмзависпмый ингибитор ииримидин-2(1//)-он в позиции цитозина-мишени (Р-ДНК), способны образовывать ковалентные интермедиаты с M.SssI и Dnmt3a-CD, причем связь в них является лабильной. В присутствии регуляторного фактора Dnmt3L выход ковалентного интермедиата Dnmt3a-CD с ДНК увеличивается. Обнаружено, что для образования этого интермедиата важны контакты Dnmt3a с группами атомов, экспонированными в малую бороздку ДНК.

3. Р-ДНК способны ингибировать M.SssI и Dnmt3a-CD по конкурентному механизму. Высказано предположение о том, что терапевтический эффект зебуларина может быть обусловлен в том числе и ингибированием Dnmt3a.

4. Dnmt3L стимулирует разгорание флуоресценции комплекса Dnmt3a-CD с ДНК, содержащей 2-аминопурин в позиции цитозина-мишени, что свидетельствует о наличии стадии «выпетливания» метилируемого основания из двойной спирали ДНК в каталитическом механизме Dnmt3a.

5. Замены остатков S145, Q147, Т313 и R232 в M.SssI приводят к значительному уменьшению флуоресцентного сигнала комплекса С5-МТазы с ДНК, содержащей 2-аминопурин, что указывает на участие этих остатков в стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина. Замены остатков Е186 и R230 в M.SssI приводят к снижению выхода ковалентного интермедиата С5-МТазы с ДНК, содержащей пиримидин-2(1Я)-он, что позволяет сделать предположение об их участии в активации метилируемого цитозина в процессе катализа.

Заключение:

Исходя из результатов исследований, проведенных в данной работе, можно сделать вывод, что Р-ДНК обладают большей ингибирующей активностью по отношению к Dnmt3a и M.SssI, чем ингибиторы ненуклеотидной природы - димерные бисбензимидазолы, (табл. 3 и 6). Р-ДНК позволили выявить общие черты в механизме действия Dnmt3a и прокариотических С5-МТаз: в процессе метилирования ДНК с помощью остатка цистеина формируется ковалентный интермедиат, и для его образования необходимы реакционноспособный остаток цистеина и контакты С5-МТазы с малой бороздкой ДНК. Особенностями Dnmt3a являются низкий выход конъюгата, его неустойчивость к нагреванию, повышение выхода конъюгата и разгорание флуоресценции в комплексе с В-ДНК при активации регуляторным фактором Dnmt3L, что коррелирует с низкой метилирующей активностью Dnmt3a in vitro.

С помощью мутантных форм M.SssI удалось выявить остатки, участвующие в «выпетливании» метилируемого цитозина (Serl45, Glnl47, Arg232 и Thr313) и катализе (Cysl41, Glul86 и Arg230). На примере M.SssI была продемонстрирована важность консервативных остатков Serl45 (мотив VI) и Arg230 (мотив VIII) для функционирования С5-МТаз. Важным моментом явилось то, что была показана значимость неконсервативного остатка Gin 147, роль которого была предсказана по данным компьютерного моделирования.

Глава 3. Экспериментальная часть

3.1. Реактивы и материалы

Олигодезоксирибонуклеотиды. Все олигодезоксирибонуклеотиды (табл. 2), а также 18-ти звенные олигодезоксирибонуклеотиды являются коммерческими препаратами (Синтол, Россия). Флуоресцентно-меченные олигодезоксирибонуклеотиды ГвСОС, СОМСгГ, ШАТ(-), МСт^ йМ^ содержали флуоресцентный краситель б(5)-карбоксифлуоресцеин (РАМ,Г), ковалентно присоединенный через аминолинкер -ЫН-(СНг)б- к 5'-концевой фосфатной группе. Соответствующий фосфорамидит для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих пиримидин-2(1 /7)-он, был получен в лаборатории С.Н. Михайлова (Москва, Россия). Все олигодезоксирибонуклеотиды были очищены с помощью гель-электрофореза в 20%-ом денатурирующем ПААГ, элюированы из геля в виде индивидуальных цепей и обессолены в ЗАО «Синтол».

Концентрацию олигодезоксирибонуклеотидов определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера так же, как описано в работе [160]. Молярные коэффициенты экстинкции одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов общей формулой ОрЕрРрС.КрЬ и длиной п рассчитывали с точностью 10% по формуле: ¿СврРрс.к* =[2*(£оре + ЕЕрР + Вррс + . + екрО - еЕ - еР - ес - . - ек]/п. е™ =15.4 о.е./мкмоль, е™с -1А о.е./мкмоль, £™ю =11.5 о.е./мкмоль, с1^ =8.7 о.е./мкмоль, ЕМГ<1Л =13.7 о.е./мкмоль, -10.6 о.е./мкмоль, е^х,а= 12.5 о.е./мкмоль, =11.4 о.е./мкмоль, £™и1л =10.6 о.е./мкмоль, =7.3 о.е./мкмоль, =9.0 о.е./мкмоль,

Срсгг =7.6 о.е./мкмоль, е^рм =12.6 о.еУмкмоль, £™„ас =8.8 о.е./мкмоль, =10.8 о.е./мкмоль, £™р1ГГ =10.0 о.е./мкмоль, =11.7 о.е./мкмоль, =8.1 о.е./мкмоль,

9.5 о.е./мкмоль, £2^р(1Т =8.4 о.е./мкмоль. Для олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих FAM, s были рассчитаны как сумма с соответствующих ^модифицированных цепей и FAM (21000 М-1 см-1).

Ферменты. Препарат M.Hhal (120 мкМ) был любезно предоставлен С.Климашаускасом (Вильнюс, Литва), R.HinóI - коммерческий препарат «Fermentas» (Литва). Препараты рекомбинантных Dnmt3a-CD, Dnmt3L, M.SssI и ее мутантных форм были выделены, как указано ниже.

Плазмиды. Плазмида рЕТ28а, содержащая ген dnmúa, была любезно предоставлена нам профессором А. Елшем (Германия). Плазмида рЕТ41Ь, содержащая ген dnmtSl мыши, была любезно предоставлена Г.Ху (Китай). Плазмида для экспрессии рекомбинантной M.SssI (M.SssI/nH) была сконструирована Друцей В.Л. (Москва, Россия). Плазмида pBHNS-MSssI и сконструированные на ее основе плазмиды с мутациями в гене sssIM получены в лаборатории А. Киша, (Сзегед, Венгрия). Клетки E.coli штамма ER1821 для экспрессии M.SssI, а также исходная плазмида pCAL7, несущая ген M.SssI любезно предоставлены фирмой New England BioLabs (Великобритания). Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически.

Димерные бисбензимидазолы DB(n) и bis-HT(NMe) были синтезированы в лаборатории А.Л. Жузе (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия) Реактивы: бактотритон, дрожжевой экстракт и бактоагар (Difco, США); изопропил-p-D-тиогалактозид (ИПТГ) (Research Organics Inc, США); Со2+-содержащей смола TALON для металлоаффинной хроматографии (Clontech, США); глутатион сефароза (GE Healthcare, Швеция); среда LB (Amresco, США); бычий сывороточный альбумин (БСА) (Biomed, Польша); трис-(гидроксиметил)-аминометан (Трис), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол и персульфат аммония (Merck, Германия); глицерин, 1,4-дитиотреитол, имидазол, тритон Х-100, фенилметансульфонилфторид (PMSF), AdoHcy, НК№,Ы'-тетраметилэтилендиамин (Sigma, St. Louis, МО, США); лейпептин (MP Biomedicals, США); пепстатин A (Serva, Германия); коктейль ингибиторов протеиназ Complete Mini EDTA-free (Roche, США), [CH3-3H]AdoMet (77 Ки/ммоль) (Amersham Biosciences, Великобритания); ¡ 32 мМ AdoMet (New England BioLabs,) формамид (Fluka, Швейцария), этидия бромид (ЭБ) (Fluka, Швейцария); акриламид, арабиноза, Н№метилен-бисакриламид, мочевина, глицин, додецилсульфат натрия (SDS), NaCl, КС1, КН2РО4, NaH2P04, (ДиаЭм, Россия); MgCb (Panrcac, Испания) красители — маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС) (NEB, Англия); маркеры молекулярной массы белков (Fermentas, Литва); SYBR Green I (Sigma, США); ледяная уксусная кислота (ООО Авогадро); 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота (HEPES) (Amresco, США), канамицин (Синтез, Россия), N-этилмалеимид (Россия), ампициллин (Красфарма,Россия), глутатион (AppliChem, Германия), какодилат натрия (AppliChem, Германия), ДМСО (Pierce, США). Буферные растворы:

A) 25 мМ Трис-НзВОз (рН 8.3), 0.5 мМ ЭДТА; Б) 125 мМ Трис-HCl (рН 6.8);

B) 375 мМ Трис-HCl (рН 8.8);

Г) 62.5 мМ Трис-HCl, рН 6.8, 3% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 8 М мочевина, 5% (об/об) глицерин, 0.1% ВРВ;

Д) 40 мМ Трис-СНзСООН, рН 8.5, 2 мМ ЭДТА, 0.5 мкг/мл бромистого этидия; Е) 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 50 мМ NaCl;

Ж) 250 мМ КС1, 10 мМ HEPES (рН 6,7), 15 мМ СаС12, 55 мМ МпС12; 3) 10 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА;

И) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ имидазол;

К) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 20 мМ имидазол;

Л) 20 мМ КН2Р04-К0Н (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 40 мМ имидазол;

М) 20 мМ КН2Р04-К0Н (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 200 мМ имидазол; Н) 20 мМ HEPES-NaOH (рН 7.5), 100 мМ КС1, 1 мМ ЭДТА;

О) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 5%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100;

П) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 5%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ имидазол;

Р) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 200 мМ имидазол;

С) 50 мМ Трис-HCl (рН 7.2), 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50%-ный (об/об) глицерин;

Т) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол;

У) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 10 мМ имидазол;

Ф) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 20 мМ имидазол;

X) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 150 мМ имидазол;

X) 10 мМ Трис-HCl (рН 7.9), 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 10%-ный (об/об) глицерин,

Ч) 10 мМ Трис-HCl (рН 7.9), 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный (об/об) глицерин,

Ш) 10 мМ Трис-HCl (рН 7.9), 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 0.1 мг/мл БСА; Используемые кислоты, щелочи и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации «осч».

3.2. Приборы и методы

Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов или плазмид в УФ-области записывали на спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían) при комнатной температуре. Оптические измерения проводили в кварцевых кюветах (длина опт. пути 1 см) фирмы «Hellma» (Германия) или «Starna Cell» (США).

Измерения поляризации флуоресценции проводили при 25°С на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían, США) при длине волны возбуждающего света 495 нм и испускаемого -— 520 нм. Значение поляризации флуоресценции (Р) определялось -gl, согласно уравнению: Р =- , где /у и /ь — вертикальная и горизонтальная

Iv+GIh составляющие испускаемого света соответственно, a G — поправочный коэффициент. Спектры флуоресценции. Флуоресценцию 2-аминопурина регистрировали при 25°С на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían) при длине волны возбуждающего света 330 нм с щелями для испускания и поглощения 10 нм. Флуоресценцию DB(11) и его комплексов с ДНК регистрировали при 25°С на спектрофлуориметре «FluoroMax-3» (Jobin Yvon) при длине волны возбуждающего света 350 нм с щелями для испускания и поглощения 5 и 10 нм, соответственно. Все измерения проводились в кювете объемом 45 мкл с длиной опт. пути 0,5 см «Hellma» (Германия).

Препаративное микроцентрифугирование проводили на микроцентрифуге «Eppendorf-5414S» (Германия). Для упаривания микроколичеств водных растворов, а также для \далення следовых количеств этанола и ацетона использовали прибор «Speed Vac» (США). Микрообъёмы растворов дозировали автоматическими дозаторами фирмы Gilson (Франция) и Eppendorf (Германия) с точностью 5%. pH растворов измеряли на потенциометре Model 701А фирмы Orion (США) с точностью до 0,005 pH.

Отмывку фильтров DE81 проводили на шейкере «SciEra» при частоте качаний 8. Стерилизацию буферных растворов и растворов антибиотиков проводили с помощью фильтрования на фильтрах «Milli Por» с размером пор 0,22 мкм. Электрофорез. а) Электрофорез комплексов ДНК-метилтрансферы Sssl с синтетическими субстратами в неденатуриругощих условиях (метод «торможения в геле» или гель-электрофорез) проводили в 8%-ном ПААГ (8% акриламида, 0.4% И^'-метиленбисакриламида в буфере А) при напряженности поля 8.5 В/см. Пробы наносили в объёме 20 мкл. б) Электрофорез Dnmt3a-CD и M.SssI, а также их конъюгатов с Р-ДНК проводили в плоском (10x10x0.075 см) ПААГ по Леммли. Концентрирующий гель: 4% акриламид, 0.104% КТчР-метиленбисакриламид, 0.1% ДСН в буфере Б; разделяющий гель: 12.5% акриламид, 0.33%"Ы,>Г-метиленбисакриламид, 0.1% SDS в буфере В. Пробы наносили в 510 мкл буфера Г.

Прокрашивали гель раствором Кумасси R-250 (СНзС00Н:С2Н50Н:Нг0=1:1:2 и 0.25% Кумасси R-250). Сначала раствор доводили до кипения, затем качали на шейкере «SciEra» при частоте качаний 6 в течение 5-7 мин. Гель отмывали 10%-ным раствором СНзСООН до обесцвечивания фона. Гели сушили на приборе Gel Slab Dryer фирмы Iloefer Scientific Instruments (США).

Для полимеризации всех акриламидных гелей к соответствующим растворам добавляли свежеприготовленный 10%-ный раствор персульфата аммония (из расчёта 50 мкл на 10 мл ПААГ) и НМ,>]',М'-тетраметилэтилендиамин (из расчёта 10 мкл на 10 мл ПААГ). в) Электрофорез плазмид проводили в 0.8%-ном агарозном геле толщиной 3 мм (0.8% агароза в буфере Д) при напряженности поля 5 В/см. г) Электрофорез реакционных смесей после расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Hinöl проводили в 20%-ном ПААГ (20% акриламида, 0.66% К.Ы'-метиленбисакриламида, 7 М мочевина в буфере А) толщиной 0.75 мм при напряженности поля 50 В/см. Пробы наносили в 10 мкл 80%-ного формамида, содержащего 1 М ЭДТА и красители-маркеры ХС (0.1 %) и ВРВ (0.1%).

Положение FAM-меченных соединений определяли флуорографией. Для этого использовали прибор FUJIFILM FLA-3000 (длина волны возбуждения 480 нм, испускания 520 нм). После регистрации флуоресценции гели обсчитывали с помощью программы ImageQuant 5.2.

Радиоактивность эН-меченных препаратов измеряли методами жидко-сцинтиляциоиного счёта, в импульсах в минуту, на счётчике Analytic Tracor Delta 300 (Нидерланды). Для измерения гетерогенного счёта 3Н-меченных препаратов, сорбированных на DE81 фильтрах (Whatman, Berntford, Великобритания), к пробе добавляли 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 (Россия) или Optiphase HiSafe 3 (Perkin Elmer, США). Ошибка счёта не превышала 5%.

3.3. Общие методики 3.3.1. Формирование ДНК-дуплексов

При формировании ДНК-дуплексов FAM-меченная цепь (или цепь, содержащая 2-аминопурин) смешивалась с 1,3-кратным избытком немеченной цепи (или цепи, не содержащей 2-аминопурина) в буфере Е. При формировании остальных субстратов цепи смешивались в соотношении 1:1 в буфере Е. Смеси олигодезоксирибонуклеотидов нагревали до 80-90°С и медленно охлаждали до комнатной температуре.

3.3.2. Плавление ДНК-дуплексов

Плавление проводили в 200 мкл раствора 1 мкМ ДНК-дуплекса в буфере Е (18-ти звенные ДНК-дуплексы) на спектрофотометре «Hitachi», Model 150-20 (Япония). Образец нагревали от 40°С до 95°С с шагом 0,5 градуса/мин. Изменение оптической плотности фиксировали при длине волны 260 нм. Кривые плавления всех используемых ДНК-дуплексов были кооперативными. Значение Тпл определяли как температуру, соответствующую половине высоты кривой плавления.

3.3.3. Приготовление компетентных клеток

На чашку Петри с LB-агаром, переносили небольшое количество клеток из музея BL21(DE3) Е. coli (или ER1821 Е. coli) и растили в течение ночи при 37°С. Затем небольшим количеством клеток с чашки Петри инокулировали 30 мл среды SOB, содержащей 300 мкл 2М раствора Mg2+ (стерильный водный раствор IM MgCl2 и 1М MgS04). Клетки выращивали при 18°С с интенсивной аэрацией (частота вращения шейкера 200-250 об/мин) до достижения мутности раствора 0,6 OD600, после чего клеточную культуру охлаждали во льду в течение 10 мин и осаждали клетки центрифугированием в течение 10 мин при 2500 g (при 4°С), как описано в [161]. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 10 мл охлаждённого буфера Ж, инкубировали 10 мин во льду и осаждали клетки центрифугирование (10 мин, 2500 g, 4°С). Супернатант удаляли, клетки осторожно ресуспендировали в 2,5 мл охлаждённого ТВ и добавляли ДМСО до конечной концентрации 7%. Всё осторожно перемешивали вращением пробирки и инкубировали 10 мин во льду. Полученную суспензию расфасовывали по 200 мкл в охлаждённые пробирки и немедленно замораживали в жидком азоте (хранили при -70°С) или сразу же проводили трансформацию. Для трансформации к компетентным клеткам добавляли 10-30 нг плазмиды в объёме 1-5 мкл и инкубировали 30 мин во льду, периодически встряхивая. После этого проводили «heat shock» (инкубировали клетки 90 сек при 42°С), помещали пробирку с клетками в лед на 5 мин и добавляли 800 мкл среды SOB, 10 мкл 2М раствора Mg2+ и 20 мкл 1М глюкозы. Клетки инкубировали в течение одного часа при 37°С. Затем растирали 20-200 мкл клеточной культуры на чашке Петри с LB-агаром, содержащим подходящий антибиотик (концентрации 50 мкг/мл ампициллина или 75 мкг/мл канамицина), и растили при 37°С в течение ночи. Затем скалывали 1-2 колонии с чашки Петри и инокулировали 20 мл среды LB с антибиотиком. Клетки выращивали в течение ночи.

3.3.4.Выделсние плазмид

Клеточную культуру Е.coli BL21 (DE3) или ER1821 выращивали до мутности 0,8 ODéoo при 37"С при интенсивном перемешивании. Откручивали при 10000g 1-2 мин, тщательно отбирали супернатант и ресуспендировали в растворе для ресуспендирования (GeneJet Plasmid Miniprep Kit, Fermentas, Литва), добавляли последовательно лизисный и нейтрализующий растворы, центрифугировали осадок при 10000g 5 мин, далее наносили раствор на колонку с сорбентом, промывали этанол содерл<ащим буфером, и смывали плазмиду 50 мкл буфера 3.

3.3.5. Выделение Dnmt3a-CD и DnmtL

Выделение каталитического домена Dnmt3a, содержащего шесть аминокислотных остатков гистидина на tV-коицс, проводили в клетках BL21(DE3) Е. coli с использованием плазмиды рЕТ28а (Novagen), содержащей ген Dnmí3a-CD, как описано в [101]. «Ночную культуру» (20 мл) Е. coli BL21(DE3) с плазмидой, содержащей ген Dnmt3a-CD в среде LB с канамицином (75 мкг/мл) разбавляли в ~50 раз средой LB с тем же антибиотиком.

Клеточную культуру выращивали при 30°С с интенсивной аэрацией. Экспрессию белка инициировали добавлением 1 мМ раствора ИПТГ при достижении мутности раствора 0.5

OD600. Затем клеточную культуру растили в течении 4-х часов при 30°С, после чего клетки осаждали центрифугирование на центрифуге Beckman Coulter J2-21 (США) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE Sonifier (Crawley,

Великобритания) в 15 мл буфера И. Выделение белка проводили в присутствии ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонилфторида (PMSF) (17 мкг/мл) и коктейля ингибиторов протеиназ Complete Mini EDTA-free (Roche) в соответствии с инструкцией.

Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4°С (30 мин, 13000 об/мин) на центрифуге Eppendorf MiniSpin. Супернатант пропускали через колонку с 600 мкл Со2 содержащей смолы TALON, для аффинной хроматографии (BD Biosciences Clontech), уравновешенную буфером И. Колонку промывали 20 мл буфера И, 20 мл буфера К и 10 мл буфера JI. Белок элюировали 1 мл буфера М. Элюированный белок диализовали при

4°С в буфере Н в течение ночи, и добавляли глицерин до конечной концентрации 40%.

После диализа препарат фермента хранили при -20°С. Чистота конечного препарата

Dnmt3a-CD определялась с помощью гель-электрофореза в 12.5% ПААГ в присутствии

0.1% SDS и составляла >95% (рис.6). Концентрацию Dnmt3a-CD определяли по методу

87

Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта, концентрацию фермента рассчитывали как концентрацию мономерной формы.

Экспрессию Dnmt3L, содержащего кластер Hiss на N-конце белка и GST-таг на С-конце проводили точно так же, как экспрессию Dnmt3a-CD.

Выделение Dnmt3L с помощью металлоафиной хроматографии проводили аналогично Dnmt3a-CD с той разницей, что клеточную культуру разрушали в 15 мл буфера О, колонку с Со2+-содержащей смолой TALON уравновешивали также буфером О. Колонку промывали 80 мл О, и 40 мл буфера П. Белок элюировали 1 мл буфера Р. Элюированный белок диализовали при 4°С в буфере С в течение ночи.

3.3.6. Выделение M.SssI и ее мутантных форм

Ночную культуру» (10 мл) Е. coli ER1821, трансформированную плазмидой pCAL/nH (несущую ген M.SssI) или pBHNS-MSssI в среде LB с ампициллином (50 мкг/мл) разбавляли в 50 раз средой LB с тем же антибиотиком. Выращивали при 37°С с интенсивной аэрацией в течение ~3 ч до мутности 0,6 OD600, после этого проводили индукцию 1 мМ ИПТГ или 0,1% арабинозы и растили клетки ещё около 4 ч при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге Beckman Coulter J2-21 (США) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE Sonifier (Crawley, Великобритания) в 15 мл буфера Т с добавлением ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонилфторида (17 мкг/мл), лейпептина (5 мкг/мл) и пепстатина А (1 мкг/мл). Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4°С на микроцентрифуге. Все стадии выделения белка проводили при 4°С. Супернатант пропускали через колонку с 650 мкл Со2+-содержащей смолы TALON для аффинной хроматографии (BD Biosciences Clontech). Колонку промывали последовательно 10 мл буфера Т, затем 20 мл буфера У и 20 мл буфера Ф. Белок элюировали 1 мл буфера X.

Далее проводили диализ против буфера Ц при 4°С в течение ночи, затем против буфера Ч и добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при -20°С.

3.3.7. Определение Ка комплексов Dnmt3a-CD с ДНК и AdoHcy с помощью метода поляризации флуоресценции

Изучение связывания Dnmt3a-CD с ДНК проводили методом поляризации флуоресценции путем прямого титрования FAM-меченных олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов С5-МТазой Dnmt3a-CD, как описано ранее [141]. Значение поляризации флуоресценции (Р) определяли согласно уравнению Р = (/v -G/h)/(/v + 1ь), где Iv и 1ь - вертикальная и горизонтальная составляющие испускаемого света соответственно, С - поправочный коэффициент. ДНК-дуплекс (10 нМ), содержащий FAM-метку в одной из цепей, инкубировали с 0,1 мМ AdoHcy в буфере Н и измеряли значение поляризации флуоресценции ДНК-дуплекса в отсутствие фермента (/о). Затем к смеси добавляли аликвоты раствора Dnmt3a-CD и через 2 мин после добавления фермента фиксировали значение поляризации флуоресценции. Измерения проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse («Varían»). Полученные данные представляли в виде зависимости Р от концентрации Dnmt3a-CD. Кривые титрования каждого ДНК-дуплекса С5-МТазой воспроизводили не менее 3 раз и анализировали в программе Origin 7.5 соответствии уравнением Хилла:

Р-Р0) [£]" (Рт-Р0) [£]" + ' где Ро и Рт - значения поляризации флуоресценции свободной и полностью связанной FAM-меченной ДНК; [Е] - концентрация Dnmt3a-CD; п - коэффициент Хилла.

3.3.8. Определение К& комплексов М.Звв! с ДНК и АйоНсу с помощью метода торможения» в геле

РАМ меченные ДНК Св/вМГ, РС/ОМГ, ГМС/СР, ССР/СМГ (15 нМ) инкубировали с 0.1 мМ Лс1оНсу и М.Бэз! (0-350 нМ) в буфере Ш, содержащем 8% глицерин и 0.1 мМ Ас1оНсу в объеме 20 мкл в течение 5 мин при 20°С и затем 30 мин при 4°С. После электрофоретического разделения тройных комплексов от свободных ДНК-дуплексов (условия см. выше) проводили радноавтографию геля. Константы диссоциации рассчитывали методом нелинейной регрессии по уравнению (2) [51], в качестве параметров которого использовали экспериментальные зависимости степени образования комплекса от общей концентрации фермента:

У = Г[Я]0 + [Е]0 + Ка - д/([5]0 + [Е]0 + К, )2 - 4 • [Е]0 - [5]01 (2) где у - экспериментально определяемая по «торможению» в геле степень связывания

ГГС1

ДНК-дуплекса (у = ■——),

Э]о и [Е]о - общие концентрации ДНК-дуплекса и фермента соответственно, - константа диссоциации комплекса М.ЗээЬДНК-АсЬНсу.

3.3.9. Образование ковалентных интермедиатов С5-МТаз с Р-ДНК

Реакционные смеси содержали 100-200 нМ Р-содержащего РАМ-меченного дуплекса, 0,1 мМ Ас1оМе1 или АёоНсу, 2 мкМ М.Зээ! (ее мутантную форму), 2 мкМ Опт13а-СБ, 300 нМ

ОпгШЗа/ОпгЩЗЬ или 1 мкМ М.НЬа1 в буфере Н или Ш . В экспериментах с КЕМ С5

МТазы преинкубировали в присутствии 5 мМ КЕМ 10 мин при комнатной температуре, и только потом добавляли в реакционные смеси. В экспериментах с ОВ(11) соответствующий ДНК дуплекс был преинкубирован с различными концентрациями

ОВ(11) в течение 3 суток. После инкубирования при 4 °С в течение 60 мин и при комнатной температуре 10 мин в смеси был добавлен БОБ до концентрации 1%. Далее

90 половину каждой смеси нагревали при 65°С 5 мин. Образцы наносили в 12.5%-ный ПААГ по Лэммли, содержащий 0.1% SDS и анализировали с помощью электрофореза. Выходы конъюгатов были рассчитаны как соотношение интенсивности флуоресценции полосы конъюгата к общей интенсивности флуоресценции (связанного и не связанного ДНК-дуплекса).

3.3.10. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по защите метилированной ДНК от рестрикции а. Ингибирование M.SssI и Dnmt3a-CD дгшерньши бисбензимидазолами. FAM-меченные дуплексы fGCGC/CGCG или fuAT(-)/dAT(-) (300 нМ) инкубировались в присутствии различных концентраций бисбензимидазолов (0,1-200 мкМ) в буфере Н или UI, в течении трех суток при 4°С или 10 минут при 25°С. В реакционную смесь добавлялись Dnmt3a-CD (или M.SssI)) и AdoMet до концентрации 2 мкМ и 25 мкМ, соответственно. Смесь инкубировали 40 мин при 37°С. б. Ингабировачие M.SssI ДНК, содержащими пиргшидгш-2(1 Н)-он. Реакционные смеси содержали 300 нМ FAM-меченного дуплекса fGCGC/CGCG, 700 нМ немеченого дуплекса GCGC/CGCG, 0-2,5 мкМ ингибиторов PG/GM и MG/GP, 80 нМ M.SssI и 25 мкМ AdoMet в буфере III. Смесь инкубировали 30 мин при 37°С.

Далее ДНК высаживали из реакционной смеси этанолом в присутствии 0,4 М ацетата натрия. Осадок промывали 80%-ным этанолом, остатки этанола упаривали на SpeedVac. Степень метилирования определяли по защите от рестрикции прометилированных дуплексов эндонуклеазон Hin6I, ДНК расщепляли 1 ед.акт R.Hin6I в течение ночи в 20 мкл Tango-буфера (Fermentas, Литва). Реакционные смеси упаривали на SpeedVac и ресуспендировали в 10 мкл 80%-ном формамиде. Продукты реакции разделяли в 20%-ном денатурирующем ПААГ с 7М мочевиной. Полученные гели анализировали с помощью прибора FILIIFILM FLA-3000. Степень метилирования (М) определяли как соотношение количества метилированной ДНК к общему количеству

ДНК, основываясь на интенсивностях флуоресценции соответствующих полос в программе Image Quant 5.2. Для того, чтобы определить концентрацию, снижающую активность фермента на 50% (IC50) были построены зависимости относительной степени метилирования (R, %) от концентрации ингибитора. Значения R были рассчитаны по формуле R=(M-Menzyme free)/(Mmh,b,tor free - Menzyme frcc)xl00, где Menz>mo free и Mmhlbltor free -значения M для реакционных смесей, не содержащих фермента или ингибитора, соответственно. Кривые были подвергнуты регрессионному анализу в программе Origin 6.0 с использованием экспоненициальной функции R - R0+ А-е[П" , где вводными параметрами являлись R и концентрация ингибитора [I] (мкМ); a Ro и t являлись зависимыми параметрами для регрессионного анализа. Все данные демонстировали высокие коэффициенты корреляции (более 0,95). Значения IC50 были найдены с использованием полученных параметров. Для DB(4,5), когда предполагаемое значение IC50 превышало используемый диапазон концентраций ингибитора, его оценивали с помощью экстраполяции экспоненциальной функции к 50%-ному ингибированию. Значения стандартных ошибок были рассчитаны на основе 3-6 измерений.

3.3.11. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по включению тритиевой метки

Уровень метилирования ДНК (% метилирования) определяли по включению тритиевой метки, происходящему в процессе переноса метальной группы от [СНз-3H]AdoMet к ДНК в ходе ферментативной реакции. Реакции проводили в течение 30 мин при 37° в 10 мкл буфера Н. Реакцию инициировали добавлением фермента. Реакционные смеси наносили на ионообменные фильтры DE81 (Whatman), которые обрабатывали, как описано ранее [51], и определяли количество перенесенных метальных групп, как описано в [162].

1. Определение 1С$о. ДНК, содержащими пиримидин-2(1Н)-он. Реакционные смеси содержали 0,5 мкМ ДНК-дуплекса 30ÇG/30GÇ, 50 нМ Dnmt3a-CD/Dnmt3L, 1,3 мкМ

CH3-3H]AdoMet и 0-3 мкМ ингибитора PG/GM или MG/GP. Были построены кривые зависимости метилирования (в %) от концентрации ингибитора. Значения IC50 определяли как концентрации ингибиторов, вызвавшие 50%-ное уменьшение выхода реакции метилирования.

2. Определение К,. Реакционные смеси, содержащие 150-1500 нМ ДНК-дуплекса 30CG/30GC, 150 нМ Dnmt3a-CD/Dnmt3L, 2 мкМ [CH3-3H]AdoMet, инкубировали в присутствии 0-200 нМ ДНК-дуплекса MG/GP. Количество перенесенных метальных групп определяли, как описано выше. Из этих данных рассчитывали начальные скорости реакции метилирования (Fq). Зависимости Vq от концентрации субстрата были построены и подвергнуты регрессионному анализу в программе Origin 8.0, из них были получены значения констант Михаэлиса Кт и максимальной скорости Fmax. Далее эти данные были линеаризованы в двойных обратных координатах для нахождения К,.

3.3.12. Исследование «выпетливания» методом флуоресценции Способность С5-МТаз «выпетливать» основание-мишень была оценена с помощью флуоресцентной спектроскопии. Реакционные смеси, содержащие В-ДНК, исследовали на спектрофлуориметре «Сагу Eclipse» (Varían) с щелями возбуждения и испускания 10 нм. Флуоресценцию измеряли при 25 °С в кварцевой кювете «Hellma» с длиной оптического пути 5 мм с длиной волны возбуждения 330 нм в случае. Реакционные смеси содержали 200 нМ соответствующего ДНК-дуплекса, 0,1 мМ AdoMet, и соответствующую С5-МТазу. Использовали буфер Н в случае Dnmt3a-CD и буфер Ш в случае M.SssI и ее мутантных форм. Различные концентрации С5-МТаз (См Sssi 2 мкМ, Соштза-сп 2 мкМ, CDnmt3acD/Dnmt3L 0.4 мкМ) инкубировали с В-ДНК (200 нМ) в присутствии AdoMet или AdoHcy (0.1 мМ) при 37 °С 20 мин, и затем записывали спектр флуоресценции (350-400 нм). Спектры флуоресценции корректировались вычитанием из них контрольного спектра, полученного для реакционной смеси, в которой вместо В-содержащего ДНК-дуплекса использовался дуплекс GCGC/CGMC.

3.3.13. Определение^ комплексов DB(ll) с ДНК методом флуоресценции

Реакционные смеси содержащие 50 нМ DB(ll) и 0-20 мкМ ДНК-дуплекса GCGC/CGCG в буфере Е., инкубировали при 4° 3 суток или при 25° 10 мин. Спектры флуоресценции регистрировали в диапазоне 380-630 нм с длиной волны возбуждения 350 нм. Из значений флуоресценции при 460 нм по гиперболическому уравнению были рассчитаны константы диссоциации для комплексов DB(11) с ДНК 1-го и Ш-го типов.

3.3.14. Ингибирование активности M.SssI бисбензимидазолами в клетках E.coli Клетки штамма ER1821 были трансформированы плазмидой pBHNS, несущей M.SssI дикого типа, либо мутантную форму M.SssI R230A. Ночная культура разбавлялась 1:50 LB средой, содержащей 50 мкМ димерных бисбензимидазолов и L-арабинозу для индукции экспрессии С5-МТаз. Рост клеток фиксировали, снимая значение А600 после двух часов культивирования при 37°С при интенсивном перемешивании. Далее клетки инокулировали в 3 мл среды, содержащей 50 мкМ димерных бисбензимидазолов. Клетки культивировали до мутности 0,8 СЮбоо при 37°С при интенсивном перемешивании. Из этих клеточных культур выделялись плазмиды, как описано в 3.3.4, равные количества которых были подвергнуты расщеплению 10 ед. акт. R.HinóI в 20 мкл Tango-буфера (Fermentas) в течение 30 минут и проанализированы с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

1. Bird, А. (2002). DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 16, 6-21.

2. Hermann, A., Gowher, H., and Jeltsch, A. (2004). Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cell Mol Life Sci 61, 2571-2587.

3. Eden, A., Gaudet, F., Waghmare, A., and Jaenisch, R. (2003). Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation. Science 300, 455.

4. Jones, P.A., and Baylin, S.B. (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet 3, 415-428.

5. Baylin, S.B., Esteller, M., Rountree, M.R., Bachman, K.E., Schuebel, K., and Herman, J.G. (2001). Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer. Hum Mol Genet 10, 687-692.

6. Baylin, S.B., and Herman, J.G. (2000). DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics. Trends Genet 16, 168-174.

7. Jones, P.A., and Laird, P.W. (1999). Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet 21, 163-167.

8. Jones, P.A., and Baylin, S.B. (2007). The epigenomics of cancer. Cell 128, 683-692.

9. Deng, Т., Kuang, Y., Wang, L., Li, J., Wang, Z., and Fei, J. (2009). An essential role for DNA methyltransferase 3a in melanoma tumorigenesis. Biochem Biophys Res Commun 557, 611-616.

10. Ng, E.K., Tsang, W.P., Ng, S.S., Jin, H.C., Yu, J., Li, J.J., Rocken, C., Ebert, M.P., К wok, T.T., and Sung, J.J. (2009). MicroRNA-143 targets DNA methyltransferases ЗА in colorectal cancer. Br J Cancer 101, 699-706.

11. Jeltsch, A. (2002). Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem 3, 274-293.

12. Kumar, R., Srivastava, R., Singh, R.K., Surolia, A., and Rao, D.N. (2008). Activation and inhibition of DNA methyltransferases by S-adenosyl-L-homocysteine analogues. Bioorg Med Chem 16, 2276-2285.

13. Zingg, J.M., Shen, J.C., Yang, A.S., Rapoport, H., and Jones, P.A. (1996). Methylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosine-5)-DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res 24,3267-3275.

14. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2004). Mechanism of inhibition of DNA methyltransferases by cytidine analogs in cancer therapy. Cancer Biol Ther 3, 1062-1068.

15. Christman, J.K. (2002). 5-Azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene 21, 5483-5495.

16. Gabbara, S., and Bhagwat, A.S. (1995). The mechanism of inhibition of DNA (cytosine-5-)-methyltransferases by 5-azacytosine is likely to involve methyl transfer to the inhibitor. Biochem J 307 (Ptl), 87-92.

17. Osterman, D.G., DePillis, G.D., Wu, J.C., Matsuda, A., and Santi, D.V. (1988). 5-Fluorocytosine in DNA is a mechanism-based inhibitor of Hhal methylase. Biochemistry 27, 5204-5210.

18. Taylor, C., Ford, K., Connolly, B.A., and Hornby, D.P. (1993). Determination of the order of substrate addition to Mspl DNA methyltransferase using a novel mechanism-based inhibitor. Biochem J 291 (Ft 2), 493-504.

19. Hurd, P.J., Whitmarsh, A.J., Baldwin, G.S., Kelly, S.M., Waltho, J.P., Price, N.C., Connolly, B.A., and Hornby, D.P. (1999). Mechanism-based inhibition of C5-cytosine DNA methyltransferases by 2-H pyrimidinone. J Mol Biol 286, 389-401.

20. Zhou, L., Cheng, X., Connolly, B.A., Dickman, M.J., Hurd, P.J., and Hornby, D.P. (2002). Zebularine: a novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. J Mol Biol 321, 591-599.

21. Kumar, S., Horton, J.R., Jones, G.D., Walker, R.T., Roberts, R.J., and Cheng. X. (1997). DNA containing 4'-thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res 25, 2773-2783.

22. Flynn, J., Fang, J.Y., Mikovits, J.A., and Reich, N.O. (2003). A potent cell-active allosteric inhibitor of murine DNA cytosine C5 methyltransferase. J Biol Chem 278, 8238-8243.

23. Knox, J.D., Araujo, F.D., Bigey, P., Slack, A.D., Price, G.B., Zannis-Hadjopoulos, M., and Szyf, M. (2000). Inhibition of DNA methyltransferase inhibits DNA replication. J Biol Chem 275, 17986-17990.

24. Milutinovic, S., Knox, J.D., and Szyf, M. (2000). DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAFl/CIPl/sdil). J Biol Chem 275, 6353-6359.

25. Evdokimov, A.A., Zinov'ev, V.V., Kuznetsov, V.V., Netesova, N.A., and Malygin, E.G. (2009). Design of oligonucleotide inhibitors of the human DNA-methy ¡transferase 1. Mol Biol (Mosk) 43, 418-425.

26. Fang, M.Z., Chen, D., Sun, Y., Jin, Z., Christman, J.K., and Yang, C.S. (2005). Reversal of hypermethylation and reactivation of pl6INK4a, RARbeta, and MGMT genes by genistein and other isoflavones from soy. Clin Cancer Res 11, 7033-7041.

27. Siedlecki, P., Garcia Boy, R., Musch, T., Brueckner, B., Suhai, S., Lyko, F., and Zielenkiewicz, P. (2006). Discovery of two novel, small-molecule inhibitors of DNA methylation. J Med Chem 49, 678-683.

28. Suzuki, Т., Tanaka, R., Hamada, S., Nakagawa, H., and Miyata, N. (2010). Design, synthesis, inhibitory activity, and binding mode study of novel DNA methyltransferase 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 20, 1124-1127.

29. Villar-Garea, A., Fraga, M.F., Espada, J., and Esteller, M. (2003). Procaine is a DNA-demethylating agent with growth-inhibitory effects in human cancer cells. Cancer Res 63, 4984-4989.

30. Lee, B.H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., and Nelson, W.G. (2005). Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. J Biol Chem 280, 40749-40756.

31. Castellano, S., Kuck, D., Sala, M„ Novellino, E., Lyko, F., and Sbardella, G. (2008). Constrained analogues of procaine as novel small molecule inhibitors of DNA methyltransferase-1. J Med Chem 51, 2321-2325.

32. Lin, R.K., Hsu, C.H., and Wang, Y.C. (2007). Mithramycin A inhibits DNA methyltransferase and metastasis potential of lung cancer cells. Anticancer Drugs 18, 1157-1164.

33. Yokochi, Т., and Robertson, K.D. (2004). Doxorubicin inhibits DNMT1, resulting in conditional apoptosis. Mol Pharmacol 66, 1415-1420.

34. Adams, R.L., and Rinaldi, A. (1987). Effect of echinomycin on DNA methylation. FEBS Lett 215, 266-268.

35. Shvachko, L.P. (2008). Alterations of constitutive pericentromeric heterochromatin in lymphocytes of cancer patients and lymphocytes exposed to 5-azacytidine is associated with DNA-hypomethylation. Exp Oncol 30, 230-234.

36. Киселева, Н.П., Киселев, Ф.Л. (2005). Деметилирование ДНК и канцерогенез. Биохимия 70, 900-911.

37. Vilkaitis, G., Merkiene, Е., Serva, S., Weinhold, E., and Klimasauskas, S. (2001). The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhai methyltransferase. J Biol Chem 276, 20924-20934.

38. Cheng, X., and Roberts, R.J. (2001). AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Res 29, 3784-3795.

39. Bender, C.M., Zingg, J.M., and Jones, P.A. (1998). DNA methylation as a target for drug design. Pharm Res 15, 175-187.

40. Wu, J.C., and Santi, D.V. (1987). Kinetic and catalytic mechanism of Hhai methyltransferase. J Biol Chem 262,4778-4786.

41. Chen, L., MacMillan, A.M., and Verdine, G.L. (1993). Mutational Separation of DNA Binding from Catalysis in a DNA Cytosine Methytransferase. J. Am. Chem. Soc. 115, 5318-5319.

42. Subach, O.M., Khoroshaev, A.V., Gerasimov, D.N., Baskunov, V.B., Shchyolkina, A.K., and Gromova, E.S. (2004). 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction. Eur J Biochem 271, 2391-2399.

43. Jones, P.A., and Taylor, S.M. (1980). Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell 20, 85-93.

44. Constantinides, P.G., Jones, P.A., and Gevers, W. (1977). Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature 267, 364366.

45. Cheng, J.C., Matsen, C.B., Gonzales, F.A., Ye, W., Greer, S., Marquez, V.E., Jones, P.A., and Selker, E.U. (2003). Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine. J Natl Cancer Inst 95, 399-409.

46. Lee, W.J., and Kim, H.J. (2007). Inhibition of DNA methylation is involved in transdifferentiation of myoblasts into smooth muscle cells. Mol Cells 24, 441-444.

47. Santi, D.V., Norment, A., and Garrett, C.E. (1984). Covalent bond formation between a DNA-cytosine methy transferase and DNA containing 5-azacytosine. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 6993-6997.

48. Abeles, R.H., and Alston, T.A. (1990). Enzyme inhibition by fluoro compounds, J Biol Chem. 265, 16705-16708.

49. Chen, L., MacMillan, A.M., Chang, W., Ezaz-Nikpay, K., Lane, W.S., and Verdine, G.L. (1991). Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methytransferase. Biochemistry 30, 11018-11025.

50. Friedman, S., and Ansari, N. (1992). Binding of the EcoRII methyltransferase to 5-fluorocytosine-containing DNA. Isolation of a bound peptide. Nucleic Acids Res 20, 3241-3248.

51. Smith, S.S., Kaplan, B.E., Sowers, L.C., and Newman, E.M. (1992). Mechanism of human methyl-directed DNA methyltransferase and the fidelity of cytosine methylation. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 4744-4748.

52. Klimasauskas, S., Kumar, S., Roberts, R.J., and Cheng, X. (1994). Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell 76, 357-369.

53. Gabbara, S., Sheluho, D., and Bhagwat, A.S. (1995). Cytosine methyltransferase from Escherichia coli in which active site cysteine is replaced with serine is partially active. Biochemistry 34, 8914-8923.

54. Champion, C., Guianvarc'h, D., Senamaud-Beaufort, C., Jurkowska, R.Z., Jeltsch, A., Ponger, L., Arimondo, P.B., and Guieysse-Peugeot, A.L. (2010). Mechanistic insights on the inhibition of c5 DNA methyltransferases by zebularine. PLoS One 5. el2388.

55. Dong, A., Yoder, J.A., Zhang, X., Zhou, L., Bestor, T.H., and Cheng, X. (2001). Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methy¡transferase homolog that displays dénaturant-résistant binding to DNA. Nucleic Acids Res 29, 439-448.

56. Sorm, F., Piskala, A., Cihak, A., and Vesely, J. (1964). 5-Azacytidine, a new, highly effective cancerostatic. Experientia 20, 202-203.

57. Issa, J.P. (2005). Optimizing therapy with methylation inhibitors in myelodysplastic syndromes: dose, duration, and patient selection. Nat Clin Pract Oncol 2 Suppl I, S24-29.

58. Herman, J.G., and Baylin, S.B. (2003). Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med 349, 2042-2054.

59. Juttermann, R., Li, E., and Jaenisch, R. (1994). Toxicity of 5-aza-2'-deoxycytidine to mammalian cells is mediated primarily by covalent trapping of DNA methy transferase rather than DNA demcthylation, Proc Natl Acad Sci U S A 91,11797-11801.

60. Li, L.H., Olin, E.J., Buskirk, H.H., and Reineke, L.M. (1970). Cytotoxicity and mode of action of 5-azacytidine on L1210 leukemia. Cancer Res 30, 2760-2769.

61. Yoo, C.B., Jeong, S., Egger, G., Liang, G., Phiasivongsa, P., Tang, C., Redkar, S., and Jones, P.A. (2007). Delivery of 5-aza-2'-deoxycytidine to cells using oligodeoxynucleotides. Cancer Res 67, 6400-6408.

62. Beisler, J.A. (1978). Isolation, characterization, and properties of a labile hydrolysis product of the antitumor nucleoside, 5-azacytidine. J Med Chem 21, 204-208.

63. McGregor, D.B., Brown, A.G., Cattanach, P., Shepherd, W., Riach, C., Daston, D.S., and Caspary, W.J. (1989). TFT and 6TG resistance of mouse lymphoma cells to analogs of azacytidine. Carcinogenesis 10, 2003-2008.

64. Cheng, J.C., Weisenberger, D.J., Gonzales, F.A., Liang, G„ Xu, G.L., Hu, Y.G., Marquez, V.E., and Jones, P.A. (2004). Continuous zebularine treatment effectively sustains demethylation in human bladder cancer cells. Mol Cell Biol 24, 1270-1278.

65. Cheng, J.C., Yoo, C.B., Weisenberger, D.J., Chuang, J., Wozniak, C., Liang, G., Marquez, V.E., Greer, S., Orntoft, T.F., Thykjaer, Т., and Jones, P.A. (2004). Preferential response of cancer cells to zebularine. Cancer Cell 6, 151-158.

66. Newman, E.M., and Santi, D.V. (1982). Metabolism and mechanism of action of 5-fluorodeoxycytidine. Proc Natl Acad Sci U S A 79, 6419-6423.

67. O'Gara, M., Roberts, R.J., and Cheng, X. (1996). A structural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. J Mol Biol 263, 597606.

68. O'Gara, M., Klimasauskas, S., Roberts, R.J., and Cheng, X. (1996). Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. J Mol Biol 261, 634-645.

69. Громова, E.C., Хорошаев. A.E. (2003). Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. Молекуляр. биология 37, 300-314.

70. Wyszynski, M.W., Gabbara, S., and Bhagwat, A.S. (1992). Substitutions of a cysteine conserved among DNA cytosine methylases result in a variety of phenotypes. Nucleic Acids Res 20, 319-326.

71. Robert, M.F., Morin, S., Beaulieu, N., Gauthier, F., Chute, I.C., Barsalou, A., and MacLeod, A.R. (2003). DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat Genet 33, 61-65.

72. Brueckner, В., and Lyko, F. (2004). DNA methyltransferase inhibitors: old and new drugs for an epigenetic cancer therapy. Trends Pharmacol Sci 25, 551-554.

73. Lyko, F., and Brown, R. (2005). DNA methyltransferase inhibitors and the development of epigenetic cancer therapies, J Natl Cancer Inst 97, 1498-1506.

74. Stresemann, C., Brueckner, B., Musch, T., Stopper, H., and Lyko, F. (2006). Functional diversity of DNA methyltransferase inhibitors in human cancer cell lines. Cancer Res 66, 2794-2800.

75. Kim, D., Lee, I.S., Jung, J.H., Lee, C.O., and Choi, S.U. (1999). Psammaplin A, a natural phenolic compound, has inhibitory effect on human topoisomerase II and is cytotoxic to cancer cells. Anticancer Res 19,4085-4090.

76. Goll, M.G., and Bestor, T.H. (2005). Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem 74, 481-514.

77. Chen, S.M., Leupin, W., Ranee, M., and Chazin, W.J. (1992). Two-dimensional NMR studies of d(GGTTAATGCGGT).d(ACCGCATTAACC) complexed with the minor groove binding drug SN-6999. Biochemistry 31,4406-4413.

78. Adams, A., Leong, C., Denny, W.A., and Guss, J.M. (2005). Structures of two minor-groove-binding quinolinium quaternary salts complexed with d(CGCGAATTCGCG)(2) at 1.6 and 1.8 Angstrom resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61, 1348-1353.

79. Patel, K., Dickson, J., Din, S., Macleod, K., Jodrell, D., and Ramsahoye, B. Targeting of 5-aza-2'-deoxycytidine residues by chromatin-associated DNMT1 induces proteasomal degradation of the free enzyme. Nucleic Acids Res 38, 4313-4324.

80. Brana, M.F., Cacho, M., Gradillas, A., de Pascual-Teresa, B., and Ramos, A. (2001). Intercalators as anticancer drugs. Curr Pharm Des 7, 1745-1780.

81. Carter, S.K. (1975). Adriamycin-a review. J Natl Cancer Inst 55, 1265-1274.

82. Hickman, J.A. (1992). Apoptosis induced by anticancer drugs. Cancer Metastasis Rev 11, 121-139.

83. Kiechle, F.L., and Zhang, X. (2002). Apoptosis: biochemical aspects and clinical implications. Clin Chim Acta 326, 27-45.

84. Hsieh, C.L. (2005). The de novo methylation activity of Dnmt3a is distinctly different than that of Dnmtl. BMC Biochem 6, 6.

85. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2001). Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG sites. J Mol Biol 309, 1201-1208.

86. Kumar, S., Cheng, X., Klimasauskas, S., Mi, S., Posfai, J., Roberts, R.J., and Wilson, G.G. (1994). The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res 22, 1-10.

87. Posfai, J., Bhagwat, A.S., Posfai, G., and Roberts, R.J. (1989). Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res 17, 2421-2435.

88. Xie, S., Wang, Z„ Okano, M., Nogami, M„ Li, Y„ He, W.W., Okumura, K„ and Li, E. (1999). Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene 236, 87-95.

89. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2002). Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases. J Biol Chem 277, 20409-20414.

90. Bourc'his, D., Xu, G.L., Lin, C.S., Bollman, B., and Bestor, T.H. (2001). Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Science 294, 2536-2539.

91. Hata, K., Okano, M., Lei, H., and Li, E. (2002). Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice. Development 129, 1983-1993.

92. Chedin, F., Lieber, M.R., and Hsieh, C.L. (2002). The DNA methyltransferase-like protein DNMT3L stimulates de novo methylation by Dnmt3a. Proc Natl Acad Sci U S A 99,16916-16921.

93. Suetake, I., Shinozaki, F., Miyagawa, J., Takeshima, H., and Tajima, S. (2004). DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J Biol Chem 279, 27816-27823.

94. Gowher, H., Liebert, K., Hermann, A., Xu, G., and Jeltsch, A. (2005). Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3A and Dnmt3B DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases by Dnmt3L. J Biol Chem 280. 13341-13348.

95. Kareta, M.S., Botello, Z.M., Ennis, J.J., Chou, C., and Chedin, F. (2006). Reconstitution and mechanism of the stimulation of de novo methylation by human DNMT3L. J Biol Chem 281, 25893-25902.

96. Jia, D., Jurkovvska, R.Z., Zhang, X., Jeltsch, A., and Cheng, X. (2007). Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature 449, 248-251.

97. Lin, I.G., Han, L., Taghva, A., O'Brien, L.E., and Hsieh, C.L. (2002). Murine de novo methyltransferase Dnmt3a demonstrates strand asymmetry and site preference in the methylation of DNA in vitro. Mol Cell Biol 22, 704-723.

98. Cheng, X., and Blumenthal, R.M. (2008). Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective. Structure 16, 341-350.

99. Nur, 1., Szyf, M., Razin, A., Glaser, G., Rottem, S., and Razin, S. (1985). Procaryotic and eucaryotic traits of DNA methylation in spiroplasmas (mycoplasmas). J Bacteriol 164, 19-24.

100. Pradhan, S., and Roberts, R.J. (2000). Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain. Embo J 19, 2103-2114.

101. Дарий, М.В., Кирсанова, О.В., Друца, В.Л., Кочетков, С.Н., Громова, Е.С. (2007). Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы Sssl. Молекулярная биология 41, 121-129.

102. Teng, M.K., Usman, N., Frederick, C.A., and Wang, A.H. (1988). The molecular structure of the complex of Hoechst 33258 and the DNA dodecamer d(CGCGAATTCGCG). Nucleic Acids Res 16, 2671-2690.

103. Streltsov, S.A., Gromyko, A.V., Oleinikov, V.A., and Zhuze, A.L. (2006). The Hoechst 33258 covalent dimer covers a total turn of the double-stranded DNA. J Biomol Struct Dyn 24, 285-302.

104. Громыко, A.B. (2009). ДНК-специфичные лиганды на основе димеров Хёхста 33258. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.

105. Pjura, P.E., Grzeskowiak, К., and Dickerson, R.E. (1987). Binding of Hoechst 33258 to the minor groove of B-DNA. J Mol Biol 197, 257-271.

106. Streltsov, S.A., and Zhuze, A.L. (2008). Hoechst 33258-poly(dG-dC).poly(dG-dC) complexes of three types. J Biomol Struct Dyn 26, 99-114.

107. Chen, A.Y., Yu, C., Gatto, В., and Liu, L.F. (1993). DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proc Natl Acad Sei U S A 90, 8131-8135.

108. Link, A., and Tempel, К. (1991). Inhibition of 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase and DNase I activities in vitro by some alkylating substances and antineoplastic agents. J Cancer Res Clin Oncol 117, 549-555.

109. Selby, C.P., and Sancar, A. (1991). Noncovalent drug-DNA binding interactions that inhibit and stimulate (A)BC excinuclease. Biochemistry 30, 3841-3849.

110. Ivanov, A.A., Strel'tsov, S.A., Prikazchikova, T.A., Gottikh, M.B., and Zhuze, A.L. (2008). Synthesis and properties of a symmetric dimeric bisbenzimidazole, a DNA-specific ligand. Bioorg Khim 34, 285-288.

111. Королев, С.П., Ташлицкий, B.H., Смолов, M.A., Громыко, A.B., Жузе, A.JI., Агапкина, and Готтих, М.Б. (2010). Ингибирование интегразы ВИЧ-1 димерными бисбензимидазолами с различной структурой линкера. Молекуляр. биология 44, 718-727.

112. Turner, P.R., and Denny, W.A. (1996). The mutagenic properties of DNA minor-groove binding ligands. Mutat Res 355, 141-169.

113. Кирсанова, O.B., Черепанова, H.A., Громова, E.C. (2009). Ингибирование C5-цитозин-ДНК-метилтрансфераз. Биохимия 74, 1445-1458.

114. Billam, М., Sobolewski, M.D., and Davidson, N.E. (2009). Effects of a novel DNA methyltransferase inhibitor zebularine on human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat.

115. Baubec, Т., Pecinka, A., Rozhon, W., and Mittelsten Scheid, O. (2009). Effective, homogeneous and transient interference with cytosine methylation in plant genomic DNA by zebularine. Plant J 57, 542-554.

116. Gildea, В., and McLaughlin, L.W. (1989). The synthesis of 2-pyrimidinone nucleosides and their incorporation into oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 17, 2261-2281.

117. Zhou, Y., and Ts'o, P.O. (1996). Solid-phase synthesis of oligo-2-pyrimidinone-2'-deoxyribonucleotides and oligo-2-pyrimidinone-2'-deoxyriboside methylphosphonates. Nucleic Acids Res 24, 2652-2659.

118. Kaluzhny, D.N., Mikhailov, S.N., Efimtseva, E.V., Borisova, O.F., Florentiev, V.L., Shchyolkina, A.K., and Jovin, T.M. (2003). Fluorescent 2-pyrimidinone nucleoside in parallel-stranded DNA. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22, 1499-1503.

119. Rathert, P., Rasko, Т., Roth, M., Slaska-Kiss, K., Pingoud, A., Kiss, A., and Jeltsch, A. (2007). Reversible inactivation of the CG specific SssI DNA (cytosine-C5)-methyltransferase with a photocleavable protecting group. Chembiochem 8, 202-207.

120. Maltseva, D.V., Baykov, A.A., Jeltsch, A., and Gromova, E.S. (2009). Impact of 7,8-dihydro-8-oxoguanine on methylation of the CpG site by Dnmt3a. Biochemistry 48, 1361-1368.

121. Мальцева, Д.В., Громова, E.C. (2010). Взаимодействие Dnmt3a мыши с ДНК, содержащей Об-метилгуанин. Биохимия 75, 214-223.

122. Ford, K., Taylor, C., Connolly, В., and Hornby, D.P. (1993). Effects of co-factor and deoxycytidine substituted oligonucleotides upon sequence-specific interactions between Mspl DNA methyltransferase and DNA. J Mol Biol 230, 779-786.

123. Евдокимов, A.A., Зиновьев, B.B., Кузнецов, B.B., Нетесова, H.A., Малыгин, Э.Г. (2009). Конструирование олигонуклеотидных ингибиторов ДНК-метилтрансферазы 1 человека. Молекуляр. биология 43, 455-463.

124. Roberts, R.J., and Cheng, X. (1998). Base flipping. Annu Rev Biochem 67, 181-198.

125. Holz, В., Klimasauskas, S., Serva, S., and Weinhold, E. (1998). 2-Aminopurine as a fluorescent probe for DNA base flipping by methyltransferases. Nucleic Acids Res 26, 1076-1083.

126. Allan, B.W., and Reich, N.O. (1996). Targeted base stacking disruption by the EcoRI DNA methyltransferase. Biochemistry 35, 14757-14762.

127. Martin, C.T., Ujvari, A., and Liu, C. (2003). Evaluation of fluorescence spectroscopy methods for mapping melted regions of DNA along the transcription pathway. Methods Enzymol 371, 13-33.

128. Daujotyte, D., Liutkeviciute, Z., Tamulaitis, G., and Klimasauskas, S. (2008). Chemical mapping of cytosines enzymatically flipped out of the DNA helix. Nucleic Acids Res 36, e57.

129. Reinisch, K.M., Chen, L., Verdine, G.L., and Lipscomb, W.N. (1995). The crystal structure of Haelll methytransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell 82, 143-153.

130. Sharma, V., Youngblood, B., and Reich, N. (2005). Residues distal from the active site that alter enzyme function in M.Hhal DNA cytosine methyltransferase. J Biomol Struct Dyn 22, 533-543.

131. Koudan, E.V., Bujnicki, J.M., and Gromova, E.S. (2004). Homology modeling of the CG-specific DNA methyltransferase SssI and its complexes with DNA and AdoHcy. J Biomol Struct Dyn 22, 339-345.

132. Vilkaitis, G., Dong, A., Weinhold, E., Cheng, X., and Klimasauskas, S. (2000). Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. J Biol Chem 275, 38722-38730.

133. Estabrook, R.A., Lipson, R., Hopkins, B., and Reich, N. (2004). The coupling of tight DNA binding and base flipping: identification of a conserved structural motif in base flipping enzymes. J Biol Chem 279, 31419-31428.

134. Daujotyte, D., Serva, S., Vilkaitis, G., Merkiene, E., Venclovas, C., and Klimasauskas, S. (2004). Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine. Structure 12, 1047-1055.

135. Shieh, F.K., Youngblood, B., and Reich, N.O. (2006). The role of Argl65 towards base flipping, base stabilization and catalysis in M.Hhal. J Mol Biol 362, 516-527.

136. Lau, E.Y., and Bruice, T.C. (1999). Active site dynamics of the Hhal methyltransferase: insights from computer simulation. J Mol Biol 293, 9-18.

137. Cantor, C.R., Warshaw, M.M., and Shapiro, H. (1970). Oligodeoxynucleotide interactions: III. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligodeoxynucleotides. Biopolymers 9, 1059-1077.

138. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.